Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Изучение эффекторных свойств белков γ-глобулиновой фракции плазмы крови, модифицированных катионами меди и цинка

На правах рукописи

Юшковец Евгения Николаевна

Изучение эффекторных свойств белков у-глобулиновой фракции плазмы крови, модифицированных катионами меди и цинка

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

2 О ДЕК 2012

005047477

Москва-2012

005047477

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель: заведующий лабораторией

ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России доктор медицинских наук Сергей Борисович Чекнёв.

Официальные оппоненты: заведующий отделом

ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

доктор медицинских наук, профессор Борис Владимирович Пинегин,

заведующий лабораторией ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России доктор медицинских наук Анатолий Петрович Суслов.

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им.Н.И.Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится 21 декабря 2012 г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.130.01 при ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России (123098, г.Москва, ул.Гамалеи, 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России.

Автореферат разослан 14 ноября 2012 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Е.В.Русакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Известно, что катионы меди и цинка оказывают существенное влияние на основные процессы иммунопоэза и иммуногенеза.

Медь обеспечивает нормальное развитие миелоидного и лимфоидного ростков кроветворения, реализацию механизмов противоинфекционной защиты, регулирует фагоцитарную активность нейтрофилов и пролиферацию Т-лимфоцитов, влияет на синтез антител, продукцию цитокинов, определяет активность тимуса [Hopkins R.G., Failla M.L., 1997, 1999; Percival S.S., 1995, 1998]. Участие металла в иммунных реакциях во многом связано с его способностью ослаблять активацию фактора транскрипции NF kappa В и генерацию свободных радикалов, обеспечивать транспорт железа.

Цинк обусловливает биологическую активность тимулина, контролирует ранние стадии созревания Т-лимфоцитов, апоптоз, играет важную роль в обеспечении выработки и рецепции иммуноактивных цитокинов, непосредственно участвует в основных иммунных реакциях [Вао В. et al., 2003; Carpentieri U. et al., 1988; Flynn, 1984; Hopkins R.G., Failla M.L., 1997; Lukasewycz O.A. et al., 1985; Percival S.S., 1995, 1998; Rink L., Kirchner H., 2000; Rink L., Haase H., 2007; Ventura M.T. et al, 1986].

Процессы обмена катионами цинка или меди между биомакромолекулами в окружении лимфоцита имеют большое значение для регуляции функции клетки, так как в ходе такого обмена содержание металла в примембранном пространстве может изменяться. Одновременно, связывающие или донорствующие металл белки будут претерпевать конформационные преобразования, что может сказываться на реализации их эффекторных функций в отношении клеток иммунной системы.

Работами лаборатории межклеточных взаимодействий НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи обнаружена способность катионов меди и цинка связываться с белками у-глобулиновой фракции плазмы крови [Бабаева Е.Е. и др., 2006;

Чекнёв С.Б . и др., 2006]. Установлено, что это связывание приводит к изменениям конформации белковой глобулы [Чекнёв С.Б. и др., 2005]. Получены первые указания на то, что преимущественным изменениям при этом подвергаются Fc фрагменты молекул антител [Чекнёв С.Б. и др., 2006, 2007]. В результате, меняется их взаимодействие с Fc рецепторами (FcR) на поверхности клеток, что приводит к изменению способности индуцировать выработку интерферона (ИФН). Эти изменения оказываются металлоспецифическими, а пул индуцируемого ИФН, по результатам биологического тестирования, характеризуется преимущественным содержанием ИФН-у [Чекнёв С.Б. и др., 2008].

Поскольку выработка ИФН связана с индукцией каскада ассоциированных с ней иммуноактивных цитокинов, определяющих Thl/Th2 направленность иммунного ответа, изучение механизмов и оценка возможностей регуляции цитокинового каскада на уровне физиологических реакций, определяемых вектором транспорта и обмена катионов металлов в микроокружении лимфоцита, представляют не только теоретический, ной практический интерес.

С таких позиций эффекторные свойства белков у-гаобулиновой фракции плазмы крови, хелатирующих металлы из периглобулярного пространства, до сих пор не исследовались; закономерности выработки ИФН и ассоциированных цитокинов в условиях индукции у-глобулинами, конформационно измененными связыванием катионов металлов, остаются не изученными.

Целью работы явилось: изучение конформационных преобразований белков у-глобулиновой фракции плазмы крови при взаимодействии с катионами меди и цинка, получение образцов модифицированного металлом белка и оценка эффекторных функций трансформированных связыванием меди и цинка у-птобулинов в индукции выработки основных иммуноактивных цитокинов.

Решались следующие задачи:

1. Изучить взаимодействие человеческого сывороточного у-глобулина с катионами меди и цинка в растворе; оценить оптические эффекты связывания металлов с белками; определить параметры связывания.

2. Получить образцы человеческого сывороточного у-глобулина, модифицированного связыванием катионов меди и цинка; оценить конформационное состояние белка.

3. Оценить антигенные характеристики металлокомплексов у-гаобулина в реакциях иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием низких концентраций образцов.

4. Оценить эффекторные свойства трансформированных металлами белков в отношении клеток периферической крови (КПК) человека, вырабатывающих ИФН-а, ИФН-у, интерлейкин-1Р (ИЛ-1(3) и ИЛ-2.

Научная новизна исследования.

В работе впервые описаны »информационные преобразования человеческого сывороточного у-глобулина, вызываемые связыванием катионов меди и цинка в умеренном молярном избытке металла по отношению к белку, оценены оптические эффекты взаимодействия у-глобулина с катионами металлов в растворе, определены параметры связывания.

Получены оригинальные образцы человеческого сывороточного у-глобулина, трансформированного связыванием катионов меди и цинка (в автореферате - БМКМи БМКЦ). Оценено конформационное состояние полученных металлокомплексов.

В целях комплексного исследования конформационных преобразований и антигенных характеристик трансформированных связыванием катионов меди и цинка у- глобулинов, в работе впервые использован метод ИФА на низких концентрациях образцов, позволяющий оценить динамику формирования монослоя белком, сорбирующимся на твердой фазе.

В клеточных системах обнаружено, что в пуле иммуноакгивных цитокинов, вырабатываемых КПК человека в присутствии металлокомплексов у-гаобулина с цинком и медью, содержатся ИФН-а, ИФН-у, ИЛ-1р и ИЛ-2. Катионы меди и цинка, связанные белками у-глобулиновой фракции, определяют оппозитные свойства БМКМ и БМКЦ в индукции выработки КПК человека ИФН-а, ИФН-у, ИЛ-1р и ИЛ-2.

В работе впервые описана выработка КПК человека, индуцированными в режимах, близких к физиологическим, ранних (24 час инкубации клеток) ИФН-у и ИЛ-2.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Процессы комплексообразования с катионами металлов могут служить важным фактором, определяющим и поддерживающим конформацию белков у-глобулиновой фракции плазмы крови.

2. В результате хелатирования катионов меди и цинка у- глобулины претерпевают металлоспецифические конформационные преобразования, которые преимущественно затрагивают Бс регионы молекул антител.

3. Модификация катионами металлов приводит к изменению эффекторных функций антител, реализующихся в индукции выработки основных иммуноактивных цитокинов.

4. Трансформированные связыванием катионов меди и цинка у-шобулины оппозитно регулируют активность клеток; при этом белковый комплекс с медью смещает иммуногенез в направлении ТЫ.

Теоретическая значимость работы определяется получением данных о возможной локализации сайтов связывания металла в молекулах белков у-глобулиновой фракции, об изменениях конформации и антигенных характеристик молекул антител, происходящих в результате хелатирования у-глобулинами катионов металлов, которое может осуществляться в ходе нормального, физиологического обмена металлом между биомакромолекулами плазмы крови.

С использованием оригинальной технологии постановки реакций ИФА в работе доказано первичное изменение при связывании металла структуры Бс регионов молекул антител, что формирует основу проявления новых эффекторных свойств белков у-шобулиновой фракции, реализующихся через семейство БсЯ в отношении экспрессирующих БсЯ клеток иммунной системы.

Реализация новых эффекторных свойств у-глобулинов, трансформированных связыванием катионов металлов, металлоспецифически меняет содержание в пуле иммуноактивных цитокинов, индуцированных в присутствии металлокомплексов у-глобулина, ИФН-а, ИФН-у, ИЛ-10 и ИЛ-2.

БМКМи БМКЦ реципрокно регулируют выработку 1ШК человека ИФН-а, ИФН-у, ИЛ-1Р и ИЛ-2.

В работе получены первые убедительные свидетельства возможности индукции в режимах, близких к физиологическим, выработки КПК человека ранних (24 час инкубации клеток) ИФН-у и ИЛ-2.

Практическая значимость результатов состоит в экспериментальном подтверждении принципиальной возможности разработки алгоритмов для получения (путем модификации катионами металлов) иммуноглобулинов с заданными эффекторными функциями, реализующимися на базальных уровнях регуляции активности КПК человека и связанными с индукцией выработки в режимах, близких к физиологическим, цитокинов раннего ответа, значимых в последующей ТЫ/ТЬ2 поляризации иммуногенеза.

В работе предложена и впервые применена для оценки конформационных преобразований Рс фрагментов молекул антител технология постановки реакций ИФА (прямой и «сэндвич» варианты) с использованием низких концентраций исследуемых образцов белка.

Внедрение полученных результатов.

По материалам исследования подготовлены методические рекомендации «Использование иммуноферментного анализа для оценки

5

конформационных преобразований Бс фрагментов молекул антител». Утверждены на основании решения Совета по внедрению научных достижений в практику ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России от 15 ноября 2011 г. (протокол №18).

Апробация работы.

Результаты исследования доложены на Научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (Томск, 2008), XIII Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2009), VII конференции иммунологов Урала (Архангельск, 2009).

Апробация диссертации состоялась на научной конференции отделов иммунологии и интерферонов ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России 29 мая 2012 г.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объем и структура работы.

Диссертационная работа изложена на 139 страницах, иллюстрирована 20 рисунками и таблицей, состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы (191 источник, из которых 62 отечественных и 129 иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований.

Для получения образцов у-глобулина, трансформированного связыванием катионов меди и цинка (БМКМ и БМКЦ), использовали препарат человеческого сывороточного у-глобулина (1С1Ч) в 0.15 М растворе №С1 (рН 7.12-7.19) с концентрацией белка по навеске 100 мкг/мл. Освобожденные от крупных ассоциатов белка пропусканием через

6

мембранные фильтры с диаметром пор 0.45 мкм (Millipore) образцы инкубировали в течение 1 час при 37°С с осветленными (мембраны 0.22 мкм, Millipore) хлоридом цинка или водным сульфатом меди (Merc); концентрация металла составляла 0.25, 0.5 или 2.5 мкг/мл. В качестве контроля использовали образцы у- глобулина, инкубированные в тех же условиях, но без солей указанных металлов.

По истечении срока инкубации образцы белков в объеме 7.0 или 10.0 мл двукратно (с промежуточным восстановлением в исходном объеме 0.15 М раствора NaCl) подвергали молекулярной ультрафильтрации на конусах CF-25 (Amicon) в режиме 300 g, 10-15 мин или в ячейках "Ultracel-30k" (Millipore) в режиме 1700 g, 5 мин, с умеренным охлаждением.

По окончании фракционирования супернатанты поднимали из конусов или ячеек, доводили до исходного объема 0.15 М раствором NaCl и (как на всех этапах исследования) анализировали спектрофотометрически в ультрафиолете (УФ) в диапазоне длин волн от 190 до 320 нм с шагом 10 нм, в полуавтоматическом режиме с использованием дифференцирующего спектрофотометра PU 8730 UV/VIS (Philips).

Определение концентрации белка и расчет молярных отношений в растворе осуществляли на основании результатов спектрофотометрического исследования при длине волны 280 нм (коэффициент экстинкции 0.7).

Кислотность растворов контролировали с помощью электронного рН-метра-иономера Эксперт-001 (Эконикс-Эксперт).

Количество связавшегося с у-глобулипом металла определяли, исходя из содержания свободных катионов в фильтрате, полученном при ультрацентрифугировании связавших металл белков.

Содержание свободного цинка оценивали реакцией комплексообразования с о-фенантролином (от 5.5x10"5 до 7.5х10"5 М) в 0.15 М растворе NaCl при нейтральном pH, с использованием спектрофотометрии при длине волны 226 нм. Содержание свободной меди оценивали реакцией комплексообразования с диэтилдитиокарбаматом натрия (10_3М) в 0.15 М растворе NaCl при pH 9.0-9.2 с использованием спектрофотометрии при длине волны 440 нм.

Иммунохимическое исследование БМКМ и БМКЦ включало постановку прямого и «сэндвич» вариантов ИФА.

Анализ проводили с использованием меченных пероксидазой кроличьих анти-IgG (H+L) человека антител (Медгамал). В качестве субстрата применяли ортофенилендиамин (Sigma) - 0.05% раствор в 30 мМ цитратном буфере (рН-5.0), с перекисью водорода (4.0 мкл 30%-ной перекиси на 10 мл раствора). Учет результатов производили с использованием ELISA Processor II (Behring) при длине волны 450 нм.

В прямом варианте ИФА планшеты сенсибилизировали исследуемыми и контрольными образцами у- глобулина в фосфатном буферном растворе (PBS) в течение 18 час при комнатной температуре. Места возможного неспецифического связывания антител блокировали раствором, содержавшим

бычий сывороточный альбумин (Диа М) и 10%-ные тритон Х-100 или твин 80 (оба Serva) в PBS. Меченные пероксидазой анти-IgG (H+L) человека антитела применяли в разведении коммерческого препарата 1:1000.

В «сэндвич» варианте ИФА планшеты сенсибилизировали козьими анти-TgG (H+L) человека антителами (Медгамал), примененными в конечном разведении 1:500. Сорбцию антител на твердой фазе проводили в условиях, аналогичных прямому варианту ИФА. Исследуемые и контрольные образцы у-пюбулина наносили на содержавшую анти-IgG (H+L) человека антитела твердую фазу и инкубировали в принятом режиме. Разведение конъюгата составляло 1:250.

С учетом возможности изменения в растворах БМКМ и БМКЦ коэффициента экстинкции, разведения экспериментальных образцов для реакций ИФА, как и для всех последующих экспериментов , готовили на основании концентраций, определенных спектрофотометрическим исследованием контрольных белков. Концентрацию БМКМ и БМКЦ принимали как соответствующую таковой контрольного белка.

Правомерность использованного подхода определялась результатами предшествующих спектрофотометрических исследований контрольных и опытных образцов, в которых полученные данные уточняли применением методики определения белка по Брэдфорду [Чекнёв С.Б. и др., 2007].

Полученные препараты применяли в диапазоне низких концентраций белка - от 0.125 до 1.0 мкг/мл.

При использовании прямого варианта ИФА опыты сопровождали исследованием образцов нативного у-глобулина. Их приготовление ограничивалось получением необходимой концентрации в 0.15 М растворе NaCl и последующим осветлением через мембранные фильтры с диаметром пор 0.45 мкм (Millipore).

Индукцию ИФН и ассоциированных цитокинов проводили в суспензиях клеток лейкомассы или цельной периферической венозной крови (в работе применена общая аббревиатура - КПК), полученных от 16 здоровых доноров. Суспензии содержали 10б клеток в 1 мл полной питательной среды, приготовленной на основе среды Игла с двойным набором аминокислот и витаминов (ФГУП Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова РАМН), дополненной 2% плазмы донорской крови, L-плутамином, гентамицином и гепарином.

Исследуемые образцы модифицированных и контрольных белков вносили в суспензию КПК до получения конечных концентраций 5.0; 0.5 и 0.05 мкг/мл или только 0.5 мкг/мл с последующим совместным инкубированием в течение 24 и 48 час или 24, 48 и 72 час при 37°С во влажной атмосфере, содержавшей 5% COj.

Параллельно оценивали действие солевых растворов цинка (хлорид) и меди (водный сульфат, Merc) в 0.15 М NaCl, содержание катионов в которых соответствовало количеству металла, связавшегося с белком на стадии получения БМКМ и БМКЦ.

В качестве стандартных индукторов выработки ИФН и ассоциированных цитокинов применяли вирус болезни Ньюкасла (ВБН, 10 ЦПД на клетку) и фитогемагглютинин Р (ФГА, Difco, 1.0 мкг/мл).

Титрование ИФН проводили на монослойной культуре диплоидных фибробластов эмбриона человека (получена из лаборатории клеточных культур Медико-генетического научного центра РАМН) против 1-10 ЦПД50 вируса энцефаломиокардита (ВЭМК) мышей. Исходная концентрация клеток составляла 2 х 105 в 1 мл суспензии.

За титр ИФН принимали последнее (максимальное) разведение содержащего ИФН супернатанта, обеспечивающее защиту 50% клеток от цитопатического действия ВЭМК.

В независимых экспериментах проводили оценку возможного прямого противовирусного действия исследуемых образцов.

Для определения кислотолабильности или стабильности ИФН содержащие ИФН супернатанты клеток, отобранные после 24 или 48 час инкубации КПК с исследуемыми образцами, подвергали обработке 20% НС1 до получения рН-2.0 с последующей экспозицией в течение 24 час при 4°С и восстановлением рН до 7.2-7.4 добавлением 40% раствора NaOH. Далее проводили титрование ИФН. Контролем служила вторая часть отобранных супернатантов, не подвергавшаяся обработке кислотой и поддерживавшаяся в тех же экспериментальных условиях, что и опытная.

Постановку реакции нейтрализации ИФН проводили с использованием анти-ИФН-а IgG антител (НПФ Интекор или ГИСК им.Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора).

К исследуемым пробам, содержавшим по 10 ЕД/мл активности ИФН, добавляли равный объем нейтрализующих антител в разведении от 1:800 до 1:3200 с последующей инкубацией в течение 2 час при 37°С. Затем проводили титрование ИФН.

В качестве контролен использовали: референс-препарат ИФН-а (НПФ Интекор) в дозе 10 ЕД/мл и исследуемые супернатанты с активностью ИФН 10 ЕД/мл, которые не подвергали обработке анти-ИФН-а антителами.

Иммуноферментный анализ цитокинов.

Содержание ИФН-а, ИФН-у, ИЛ-lp и ИЛ-2 в супернатантах индуцированных КПК определяли методом ИФАс использованием ELISA Processor II (Behring). Наборы для ИФА (Протеиновый контур или ЗАО Вектор-Бест) применяли согласно инструкции фирмы-производителя, с дополнительными технологическими контролями.

Для того, чтобы убедиться в чувствительности и специфичности тест-систем (Протеиновый контур) при работе с предположительно низкими концентрациями ИФН-а и ИФН-у, наборы предварительно «калибровали» сериями двукратных последовательных разведений коммерческих препаратов (все - НПО Фермент) рекомбинантных человеческих ИФН-а2Ь (реаферон), ИФН-у (гаммаферон) и ИФН-Р (бетаферон, контроль специфичности), оттитрованных по биологической активности в стандартных условиях.

Содержание ИФН в коммерческих образцах доводили разведением исходного материала с определенной активностью до уровня реакции ИФА, соответствовавшего концентрации 15 пг/мл. Линейность полученной зависимости свидетельствовала о возможности использования наборов (Протеиновый контур) для определения ИФН в диапазоне концентраций, выходящих за пределы стандартной калибровки - меньших, чем 50 пг/мл.

В ходе основных экспериментов каждый образец полученных супернатантов тестировали в исходном состоянии и в разведении 1/10 или 1/20 питательной средой ЯРМ1-1640 (С1Ьсо). Каждое разведение каждого образца и всех использованных контролей экспериментальной системы (ВБН, ФГА, нативный у-глобулип, спонтанная продукция) тестировали в 2-х или 3-х параллельных лунках микропланшетов.

Математическую обработку результатов исследования проводили с использованием общепринятых методов вариационной статистики. Достоверность различия средних величин устанавливали с помощью I-критерия Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение.

Взаимодействие человеческого сывороточного у-глобулина с катионами меди и цинка в растворе.

Особенности взаимодействия у-глобулина с катионами меди и цинка в растворе и конформационное состояние модифицированного белка оценивали с использованием дифференциальной спектрофотометрии в УФ-свете (рис.1).

Рисунок 1.

Спектры поглощения в УФ-свете БМКМ (3), БМКЦ (2) и контрольного у-глобулина (1) в диапазоне длин волн 190-320 нм.

Рисунок получен объединением данных по меди и цинку.

0,00

190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 длина волны, нм

Как видно на рис.1, связывание белком катионов цинка вызывает изменения спектра поглощения у- глобулина, проявляющиеся выраженной гипохромией на всем диапазоне измерения. Модификация у-глобулина катионами меди вызывает гипохромиюв коротковолновой (210-230 нм) и гиперхромию в длинноволновой (240-320 нм) области спектра поглощения (рис.1).

Анализ дифференциальных спектров, полученных отнесением показателей поглощения БМКЦ к оптической плотности раствора контрольного белка, позволяет установить, что наиболее выраженная гипохромия регистрируется в диапазоне длин волн 250-270 нм.

Дифференциальные спектры БМКМ и контрольного белка обнаруживают выраженную гиперхромию с пиком при 260 нм. При этом для БМКМ характерна гипсохромия спектра (сдвиг длинноволновой полосы поглощения с 280 нм в область более коротких волн - на 260 нм), которую рассматривают как следствие перемещения гидрофобных хромофоров из гидрофобной среды в белковой матрице в водную или солевую среду раствора [Мартин Р., 1966; Чанг Р., 1980].

Следовательно, трансформация у-глобулина металлом способствует повышению степени упорядоченности внутриглобулярных структур молекулы белка. Вместе с тем, БМКЦ характеризуется компактизацией части внешних структур белковой глобулы, а БМКМ - развертыванием (экспонированием) во внемолекулярное пространство части скрытых в нативной конформации аминокислотных радикалов и углеводов.

Оценка параметров связывания катионов металлов у-гаобулином с использованием молекулярной ультрафильтрации позволила определить, что полученные белковые металлокомплексы содержали от 14 до 17 катионов цинка и от 6 до 8 катионов меди на молекулу белка. Константы связывания (порядка 105 М"1) описывают такое взаимодействие как неспецифическое.

Но даже в условиях такого относительно непрочного связывания, вследствие участия в хелатировании катионов частично экспонированных на

11

поверхности глобулы олигосахаридов талии молекулы белка, значительное количество металла оказывается погруженным во внутриглобулярные компартменты шарнирной области [Чекнёв С.Б. и др., 2006].

Следовательно, в результате связывания катионов металлов белки у-гаобулиновой фракции плазмы крови переходят в новое, динамично меняющееся конформационное состояние. Если при этом оказываются задействованными Fab фрагменты молекул антител, возможны изменения в протекании реакций антиген-антитело, а если структуры Fc региона -следует ожидать изменений в клеточных реакциях, замкнутых на активацию FcR.

Иммуноферментный анализ модифицированного катионами металлов у-глобулина на низких концентрациях образцов.

Для проверки предположения о преимущественном вовлечении в трансформацию металлом Fc регионов молекул антител в работе произведена постановка реакций ИФА с использованием низких концентраций БМКМ и БМКЦ. Мы полагали, что использование в ИФА низких концентраций образцов позволит описать динамику формирования монослоя на «чистой» и покрытой специфическими антителами твердой фазе, которая могла бы способствовать локализации первичных преобразований белковой глобулы, происходящих в результате трансформации молекулы связыванием катионов металлов.

Как видно на рис.2, в прямом варианте ИФА тенденция к насыщению твердофазного монослоя для всех контрольных образцов (точка перехода) отмечается при использовании у-глобулина в дозе 0.5 мкг/мл.

У БМКЦ эта тенденция проявляется в динамике формирования монослоя раньше - при концентрации белка 0.25 мкг/мл (рис.2). БМКМ в использованном диапазоне концентраций заполняет, но не насыщает твердую фазу: зависимость интенсивности реакции со специфическими антителами на

всем диапазоне остается практически линейной (рис.2).

12

Рисунок 2.

Илшунохимическая характеристика образцов БМКМ и БМКЦ в прямом варианте ИФА.

Использованные образцы у-пюбулина: линия I - нативный; линии 2 - контрольный по цинку (темные кружки) и БМКЦ (светлые кружки); линии 3 - контрольный по меди (темные кружки) и БМКМ (светлые кружки).

В «сэндвич» варианте ИФА, как и в ходе прямой постановки, контрольные у-глобулины обнаруживают тенденцию к насыщению активных центров сорбированных на твердой фазе антител при концентрации 0.5 мкг/мл; у БМКЦ эта тенденция проявляется раньше - в дозе 0.25 мкг/мл;

концентрация белка, мкг/мл

Рисунок 3.

Иммунохимическая характеристика образцов БМКМ и БМКЦ в «сэндвич» варианте ИФА.

Использованные образцы у-гаобулина: линии 1 -контрольный по цинку (темные кружки) и БМКЦ (светлые кружки); линии 2 - контрольный по меди (темные кружки) и БМКМ (светлые кружки).

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 концентрация белка, мкг/мл

БМКМ в использованном диапазоне концентраций заполняет, но не насыщает сорбированный на твердой фазе монослой специфических антител.

Таким образом, динамика заполнения исследуемыми образцами белка монослоя сорбированных на твердой фазе антител против IgG (H+L) человека в «сэндвич» постановке практически полностью воспроизводит результаты прямого варианта ИФА (см. рис.2 и 3).

Полученные данные согласуются с результатами предшествующих исследований. Действительно, если цинк, как стабилизатор биомакромолекул и биомембран, стабилизирует молекулу белка в новом конформационном состоянии [Чекнёв С.Б., 2006; Чекнёв С.Б. и др., 2006, 2007], то такие белки, с конформационно более «жесткими» Fc и Fab фрагментами, должны испытывать стерические затруднения при формировании монослоя. И тогда насыщающей окажется меньшая концентрация у-глобулина (см. рис.2 и 3). Медь, наоборот, может дестабилизировать Fc регион [Чекнёв С.Б . и др., 2006]; модифицированный ею у-глобулин, с отчасти деструктурированным и измененным по степени поляризации Fc фрагментом, будет сорбироваться хуже, а для насыщения монослоя потребуется его значимо большая концентрация (см. рис.2 и 3).

Полученное полное «динамическое» соответствие результатов прямой и «сэндвич» постановок может возникать только на основе первичных преобразований, происходящих в Fc регионе.

Таким образом, правомерно ожидать, что в ходе физиологического хелатирования катионов меди или цинка и выраженной трансформации Fc регионов входящих в состав у-глобулиновой фракции молекул антител, последние будут иначе распознаваться FcR клеток и запускать внутриклеточные сигнальные пути, не реализуемые в случае активации рецептора Fc фрагментом в его нативной конформации.

Обнаружение ИФН-а, вырабатываемого в присутствии модифицированных медью и цинком у-глобулинов.

Индукция и характеристика пула ИФН, вырабатываемого КПК в присутствии трансформированного связыванием катионов металлов у-

14

глобулина, показывают, что на ранние (24 час) сроки индукции в культуральной жидкости стимулированных КПК определяется, в среднем, 16-32 ЕД/мл ИФН.

Модификация у-глобулина цинком приводит к снижению ИФН-индуцирующей активности белка по сравнению с катионами цинка и с контрольным у-глобулином. Комплекс у-глобулина с медью, наоборот, реализует более высокий потенциал: титры вырабатываемого в его присутствии ИФН превышают показатели меди и контрольного белка. При этом БМКМ оказывается более активным, чем БМКЦ.

Оценка чувствительности ИФН к обработке кислотой обнаруживает присутствие во всех исследованных образцах кислотолабильной и стабильной составляющих. При этом пул раннего (24 час индукции) ИФН содержит до 60% кислотостабильной фракции и до 40% лабильного материала.

С целью установления типа индуцируемого ИФН проводили постановку реакции его нейтрализации с использованием антител к ИФН-а. Обнаружено, что примененные антитела в разведениях от 1:800 до 1:3200 связывают и нейтрализуют ИФН, вырабатываемый в условиях индукции контрольными и опытными белками, а также изолированно катионами меди и цинка (см.таблицу).

Определение типа ИФН, индуцированного образцсши связавшего металл у-глобулина, в реакции нейтрализации анти-ИФН-а антителами.

Образец ИФН Разведение анти-ИФН-а антител

1:400 1:800 1:1600 1:3200

Референс ИФН-а ++++ ++++ ++++ -

Референс ИФН-а (стандарт антител) +++ +++ ± -

После индукции: ВБН ++++ ++++ - -

ФГА - 1111 ++++ ++++

После индукции: у-глобулином - ± ++ +++

у-гаобулином с цинком - ± ++ +++

цинком - ± ++ +++

у-глобулином с медью - + ++ +++

медью - + ++ +++

Знаки в таблице - степень дегенерации клеток в инфицированной ВЭМК культуре.

Протективное действие ИФН-содержащих супернатантов в культуре клеток полностью отменяется при достижении эквивалентной концентрации нейтрализующих антител - 1:3200.

Потребность в высоких разведениях анти-ИФН-а антител, позволяющих зарегистрировать эффект нейтрализации, определяется, по-видимому, относительной слабостью полученного ИФН, в сравнении с ИФН-а, который содержится в коммерческих референс-препаратах.

Результат позволяет заключить, что в общем пуле ИФН, вырабатываемого в присутствии контрольных и конформационно измененных белков у-гсюбулиновой фракции, присутствует не только ИФН-у, как было показано ранее [Чекнёв С.Б. и др., 2008], но и ИФН-а.

Применение ИФА подтверждает факт выработки ИФН-а. Концентрация ИФН-а, вырабатываемого на ранние сроки индукции, составляет до 60-90 пг/мл.

При этом результаты ИФА коррелируют с данными по биологической активности исследованного материала. БМКЦ индуцирует в 1.7 раза меньше ИФН-а, чем контрольный белок, и в 2.0 раза меньше ИФН-а, чем катионы цинка (рис.4). БМКМ в 1.2 раза более активен, чем контрольный белок, ив 1.3 раза - чем медь (рис.4). Корреляция с биологической активностью оценивается как сильная положительная.

Рисунок 4.

пг/мл

Содержание ИФН-а в кулътуралъной жидкости КПК, индуцированных БМКМ и БМКЦ в течение 24 час.

60,0 -|

з

! 11Р1 I 1111

50,0

1 - контрольный по цинку у-гаобулин; 2 - БМКЦ; 3 - цинк; 4 — контрольный по меди у-глобулин; 5 - БМКМ; 6 - медь.

Из этого следует, что наличие в пуле раннего ИФН, вырабатываемого в присутствии белков у- глобулииовой фракции, ИФН-а во многом определяет противовирусную активность образцов. А поскольку основные сигнальные пути, замкнутые на FcR клеток, ранее не считали связанными с механизмами индукции ИФН-а, можно полагать, что в работе впервые описаны взаимодействия, обеспечивающие выработку ИФН-а в присутствии белков у-глобулиновой фракции плазмы крови.

Эти взаимодействия правомерно рассматривать с позиций физиологической иммунорегуляции, способствующей (за счет конформационных преобразований Fc регионов молекул антител и контроля таким образом внутриклеточной сигнализации, замкнутой на FcR) наведению и поддержанию в клетке определенного уровня антивирусного состояния.

Динамика выработки ИФН-а и ИФН-у в присутствии модифицированного металлом у-глобулина.

Результаты исследования показывают, что на ранние (24 час) сроки индукции в общем пуле вырабатываемого ИФН, наряду с ИФН-а, присутствует ИФН-у (до 180 пг/мл). Как и в отношении ИФН-а, модификация цинком ослабляет, а медью - усиливает реализацию ИФН-индуцирующих свойств связавшего металл у- глобулина (рис.5). БМКМ в индукции ИФН-у активнее БМКЦ. Эта разница особенно заметна с учетом

пг/мл

200,0

0 150,0

5 125,0 Ш

£ 100,0 I

§ 75.0

50,0 25,0 0.0

Рисунок 5.

Содержание ИФН-у в кулыпуральной жидкости КПК, индуцированных БМКМ и БМКЦ в течение 24 час.

1 - контрольный по цинку у-глобулин; 2 - БМКЦ; 3 - цинк; 4 - контрольный по меди у-глобулин; 5 - БМКМ; 6 - медь.

различий в активности контрольных по меди и цинку белков (рис.5).

В динамике наблюдения выработка ИФН-а и ИФН-у КПК человека увеличивается. При этом на сроки индукции 48 час содержание ИФН-у в образцах, индуцированных БМКМ, значимо не отличается от соответствующих контролей. В индукции ИФН-а, а также в реализации противовирусного потенциала на 48 час пик активности БМКМ сохраняется.

Следовательно, несмотря на преимущественное содержание в общем пуле ИФН, вырабатываемого в условиях индукции металлокомплексами у-глобулина, ИФН-у, противовирусная активность материала определяется присутствующим в культуральной жидкости клеток ИФН-а.

Оценка выработки цитокинов раннего ответа.

Полученные данные обнаруживают, что в общем пуле ранних цитокинов, ассоциированных с выработкой ИФН и вырабатываемых в примененной экспериментальной системе, содержится от 428.25±37.07 до 807.0±7.56 пг/мл ИЛ-10 (рис.6). БМКЦ индуцирует в 1.2 раза (р<0.01) больше ИЛ-1(3, чем контрольный у-глобулин, ив 1.4 раза (р<0.001) больше ИЛ-1(3. чем примененные изолированно катионы цинка (рис.6). БМКМ в индукции раннего ИЛ-1(3 оказывается в 1.4 раза (р<0.1) слабее контрольного у-глобулина и в 1.6 раза (р<0.01) слабее катионов меди, примененных изолированно (рис.6).

В отличие от описанных нами закономерностей индукции ИФН. металлокомплекс у-глобулина с медью оказывается в 1.6 раза (р<0.001) менее активным, чем белок, трансформированный связыванием катионов цинка (рис.6). Далее, в условиях пролонгирования инкубации КПК до 72 час, и цинк, и медь снижают активность связывающего их у-глобулина в индукции выработки ИЛ~1|3. Следовательно, в сопоставлении с контрольными белками, БМКМ и БМКЦ действуют на ранних сроках индукции оппозитно, а на поздних - сонаправленно.

пг/мл 1000,0

с

ж 600,0 -I

X

и та

£ 400,0 ■ §

х

8 200,0 -0,0

1 2 3

4 5

*

I

Рисунок 6.

Выработка ИЛ-1р КПК человека в присутствии БМКМ и БМКЦ (М±т, п=8). Индукция в течение 24 час.

1 - контрольный по цинку у-глобулин; 2 - БМКЦ; 3 - цинк; 4 - контрольный по меди у-глобулин; 5 - БМКМ; 6 - медь.

*р<0.1 по сравнению с показателями контрольного по меди у-глобулина (4); **р<0.01 по сравнению с показателями БМКЦ (2) или БМКМ (5); ***р<0.001 по сравнению с показателями БМКЦ (2); ****р<0.001 по сравнению с показателями БМКМ (5).

Результаты исследования показывают, что в раннем (24 час индукции) пуле цитокинов, вырабатываемых в присутствии полученных образцов у-гаобулина, их белковых контролей, а также свободных катионов металлов, содержится от 1.3±0.05 до 2.9±0.33 пг/мл ИЛ-2 (рис.7). При этом спонтанная продукция цитокина КПК отсутствовала.

БМКЦ индуцирует в 1.4 раза (р<0.01) меньше ИЛ-2, чем контрольный у-глобулин, и в 2.0 раза (р<0.01) меньше цитокина, чем катионы цинка, примененные изолированно (рис.7).

пг/мл 4,0

см 3,0

Б х к

§ 2,0

та

а

I

а)

? 1,0

0,0

I

О

**

|П

Рисунок 7.

Выработка ИЛ-2 КПК человека в присутствии БМКМ и БМКЦ (М±т, п=8). Индукция в течение 24 час.

1 - контрольный по цинку у-глобулин; 2 - БМКЦ; 3 - цинк; 4 — контрольный по меди у-глобулин; 5 - БМКМ;

/С ..^тт.

6 - медь.

*р<0.05 по сравнению с показателями контрольного у-глобулина (1); <*>р<0.01 по сравнению с показателями цинка (3) и контрольного у-глобулина (1);

**р<0.01 по сравнению с показателями меди (6).

БМКМ в индукции раннего ИЛ-2 оказывается в 1.2 раза активнее контрольного у-гаобулина и в 1.3 раза (р<0.01) более активным, чем свободные катионы меди (рис.7). Одновременно, БМКМ индуцирует в 1.2 раза (р>0.1) больше ИЛ-2, чем БМКЦ (рис.7).

Именно такие закономерности регуляции характеризуют действие металлокомплексов у- глобулина с цинком и медью в индукции выработки ранних ИФН-у и ИФН-а. Следовательно, выработка раннего ИЛ-2 регулируется механизмами, общими для него, ИФН-а и ИФН-у.

В целом, полученные в работе данные позволяют обоснованно предполагать, что физиологические процессы обмена катионов металлов, протекающие в примембранном пространстве лимфоцита с участием белков у-глобулиновой фракции плазмы крови, поддерживают на базальном уровне совокупность регуляторных воздействий, замкнутых на активацию БсК, и одновременно - способны рационально ограничивать реализацию механизмов индукции.

ВЫВОДЫ

1. В работе получены образцы человеческого сывороточного у-глобулина, модифицированного связыванием катионов меди и цинка в умеренном молярном избытке металла по отношению к белку. Связывание у-глобулином цинка приводит к компактизации белковой глобулы; связывание меди - к повышению степени упорядоченности внутриптобулярных структур с одновременным развертыванием внешних участков гаобулы во внемолекулярное пространство.

2. Показано, что возникающее в результате связывания катионов металлов новое конформационное состояние у- глобулина преимущественно затрагивает пространственную организацию Бс фрагментов молекул антител.

3. Установлено, что связывание катионов меди и цинка приводит к металлоспецифическому изменению индукции у-глобулином выработки ИФН КПК человека. Модифицированный цинком белок обладает менее выраженной, а модифицированный медью - более выраженной ИФН-индуцирующей активностью, чем контрольный у-глобулин.

4. Впервые показано, что пул ИФН, вырабатываемого в присутствии конформационно измененных белков у-глобулиновой фракции, характеризуется содержанием значительных количеств ИФН-а.

5. Определено, что присутствующий в индуцированном пуле цитокинов ИФН-у появляется в культуральной жидкости КПК уже на ранние (24 час) сроки индукции. Трансформированный медью у- глобулин оказывается при этом активнее белка, связавшего катионы цинка.

6. В присутствии металлокомплексов у-глобулина обнаружена выработка КПК человека ИЛ-1Р и ИЛ-2. Содержание ИЛ-1Рв общем пуле вырабатываемых цитокинов достигает 840 пг/мл, содержание ИЛ-2 составляет до 5 пг/мл.

7. Установлено, что ИЛ-2 продуцируется КПК человека уже на ранние (24 час) сроки индукции. Закономерности индукции ИЛ-2 в присутствии металлокомплексов у- глобулина соответствуют эффектам, наблюдаемым в ходе выработки ИФН-у. Модификация цинком снижает, а медью - усиливает реализацию способности у-глобулина индуцировать выработку раннего ИЛ-2.

8. В отличие от ИФН-у и ИЛ-2, выработка раннего (24 час инкубации клеток) ИЛ-1Р усиливается у-глобулином, трансформированным связыванием катионов цинка, и ослабляется в присутствии белка, модифицированного катионами меди.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Чекнёв С.Б., Ефремова И.Е., Денисова Е.А., Юшковец Е.Н. Иммуноферментный анализ модифицированного катионами металлов у-глобулина на низких концентрациях образцов // Росс, иммунол. журнал. -2008. - Т.2(11), №1. - С.55-62.

2. Чекнёв С.Б., Ефремова И.Е., Юшковец E.H., Бабаянц A.A. Противовирусная составляющая в пуле интерферона, вырабатываемого в присутствии модифицированного катионами металлов у- глобулина // Росс, иммунол. журнал. - 2008. - Т.2(11), №2-3. - С.137.

3. Чекнёв С.Б., Бабаянц A.A., Ефремова И.Е., Юшковец E.H., Денисова Е.А. Комплексная характеристика пула интерферона, вырабатываемого в присутствии белков у- пюбулиновой фракции плазмы крови // Сибирский медицинский журнал. - 2008. - Т.23, №3, вып.1. - С.123.

4. Чекнёв С.Б., Бабаянц A.A., Ефремова И.Е., Юшковец E.H. Обнаружение ИФН-а, вырабатываемого в присутствии белков у-гпобулиновой фракции плазмы крови // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. - 2009. - Т. 147, №5. - С.544-548.

5. Юшковец E.H., Ефремова И.Е., Бабаянц A.A., Чекнёв С.Б. Участие катионов меди и цинка в регуляции выработки интерферона (IFN) лейкоцитами человека // Мед. иммунология. - 2009. - Т.11, №4-5. - С.344.

6. Юшковец E.H., Ефремова И.Е., Бабаянц A.A., Чекнёв С.Б. Выработка пула раннего и позднего интерферона в условиях индукции белками гамма-глобулиновой фракции плазмы крови и взаимодействующими с ними катионами металлов // Вестник Уральской медиц. академич. науки. Тематический выпуск по аллергологии и иммунологии. - 2009. - №2/1 (24). -С.66-67.

7. Юшковец E.H., Ефремова И.Е., Бабаянц A.A., Чекнёв С.Б. Динамика выработки интерферона-у в условиях индукции белками у-глобулиновой фракции плазмы крови, трансформированными катионами металлов // Росс, иммунол. журнал. - 2010. - Т.4(13), №1. - С.41-47.

8. Чекнёв С.Б., Ефремова И.Е., Писковская JI.C., Юшковец E.H., Бабаянц A.A. Определение IL-Iß, вырабатываемого клетками крови человека в присутствии белков у-гаобулиновой фракции и их металлокомплексов // Мед. иммунология. - 2010. - Т.12, №6. - С.497-502.

9. Чекнёв С.Б Ефремова И.Е ., Писковская JIC ., Мездрохина А.С Юшковец E.H., Бабаянц A.A. Металлокомплексы человеческого сывороточного у- глобулина индуцируют выработку раннего IL-2 // Росс, иммунол. журнал. -2012. - Т.6(15), №2. - С.147-154.

10. Чекнёв С.Б., Ефремова И.Е., Писковская JI.C., Юшковец E.H., Бабаянц A.A. Выработка раннего ИЛ-lß, индуцированного металлокомплексами человеческого сывороточного у-гпобулина // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. - 2012. - Т.154, №9. - С.326-329.

Список основных использованных сокращений.

БМКМ - белок, модифицированный катионами меди.

БМКЦ - белок, модифицированный катионами цинка.

ВБН — вирус болезни Ньюкасла.

ИЛ — интерлейкин.

ИФА - иммуноферментный анализ.

ИФН - интерферон.

КПК — клетки периферической крови.

УФ - ультрафиолет.

ФГА — фитогемагглютииин.

ЦПД - цитопатическая доза (вируса).

РсЯ - Бс рецептор.

Автор выражает искреннюю признательность и благодарность кандидату медицинских наук А.А.Бабаянц за обучение современным методам исследований, помощь в планировании и выполнении работы, ценные замечания и рекомендации, высказанные в ходе обсуждения результатов.

Автор благодарит научных сотрудников И.Е.Ефремову, Л.С.Писковскую, А.С.Мездрохину и М.А.Апресову за помощь в постановке отдельных экспериментов, обработке полученных данных и оформлении работы.