Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Характер немедленной эффекторной реакции микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови здоровых и больных вульвовагинальным кандидозом

На правах рукописи

САМЫШКИНА Наталья Евгеньевна

ХАРАКТЕР НЕМЕДЛЕННОЙ ЭФФЕКТОРНОЙ РЕАКЦИИ МИКОЦИДНОГО ОТВЕТА ЛЕЙКОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЗДОРОВЫХ И БОЛЬНЫХ ВУЛЬВОВАГИНАЛЬНЫМ КАНДИДОЗОМ

14 00 36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2008

003168819

Работа выполнена на кафедре микробиологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинский государственный университет»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация:

Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской Академии наук, г Екатеринбург

Защита диссертации состоится « 27 » мая 2008 года в _ часов на

заседании диссертационного совета Д 208 117 03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», по адресу 454092, г Челябинск, ул Воровского, 64

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Автореферат разослан « 26 » апреля 2008 г

Бурмистрова Александра Леонидовна

Колесников Олег Леонидович Брюхина Елена Владимировна

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Телешева Л.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Вульвовагинальный кандидоз (ВВК) является оппортунистической инфекцией слизистых нижнего отдела генитального тракта, вызванной грибами рода Candida (Прилепская В Н, 2007) Наиболее частым возбудителем является вид Candida albicans, который с легкостью демонстрирует свои дуалистические способности с одной стороны - это уверенный комменсал (временный или постоянный) вагинальной слизистой, ротовой полости, желудочно-кишечного тракта, кожных покровов, а с другой — успешный оппортунист этих же анатомических мест (Бурмистрова АЛ, 2007, Calderone RA., 2001, Gow NA, 2002; Sturtevant J, 1997, Verstrepen К J , 2004)

Начиная со второй половины XX столетия, во всем мире отмечен рост не только системных, но и поверхностных форм кандидоза, в том числе, вульвовагинального (Fidel PL, 2004, Flanagan PG, 1998) Несмотря на значительные успехи в диагностике и лечении, у 75% женщин, по крайней мере, однократно в течение репродуктивного периода жизни наблюдается ВВК (Ashman RB, 1995, Sobel JD, 1998) И хотя количество работ, посвященных изучению поверхностных кандидозов, постоянно возрастает, многие вопросы и проблемы остаются не решенными

До конца не определены формы иммунной защиты при вагинальном кандидозе - клеточный/гуморальный, врожденный/адаптивный иммунный ответ Часть авторов отводят главную роль Т-клеточному иммунитету (Calderone R А, 2001, Nawrot U, 2000, Romany L, 2004, Tuite A, 2004) Однако при иммунодефицитах, в частности при ВИЧ-инфекции, частота вагинального кандидоза не повышается, а СПИД-ассоциированной инфекцией является орофарингеальный кандидоз (Fidel PL, 1999, Gruber А, 2003, Lewandowski D, 2006) Многие исследователи указывают на важную роль клеток врожденной иммунной системы, что определяется анатомическими особенностями строения нижнего отдела генитального тракта (Ashman R.B, 1995, Bellocchio S, 2004, Bernardis F, 2006; Fidel P.L, 1999, Romany L, 2004) Важнейшим механизмом защиты вагинальной слизистой считается выселение в толщу эпителия и на его поверхность лейкоцитов, в основном, нейтрофилов, которые первыми и очень рано выходят из циркулирующей крови в очаг инфекции (Долгушин И И, 2001, Лебедев К А, 2006, Маянский Д Н, 1996, Телешева Л Ф, 2000, Fidel Р L, 2003; Nathan С F, 2006; Wira С R, 2005) Особый интерес представляют данные, подтверждающие функциональную гетерогенность популяции нейтрофильных гранулоцитов Показано, что часть нейтрофилов отвечает немедленной эффекторной реакцией на встречу с инфекционным агентом, осуществляя фагоцитоз, секреторную дегрануляцию бактерицидных продуктов во внеклеточную среду и формируя NETs - нейтрофильные экстраклеточные ловушки (Brinkmann V, 2004, Martinelh S, 2004, Mayer-Scholl А, 2004; Urban С F, 2006) А другая часть нейтрофилов становится продуцентами различных медиаторов, цитокинов и хемокинов, играя связующую иммунорегуляторную

роль между врожденным и адаптивным иммунитетом (Ellis Т N, 2002, Ethuin F , 2004, Yeaman G R.,1998)

До сих пор нет четких представлений не только об инициаторах различных клинических форм вагинального кандидоза, но и о патогенетических механизмах, определяющих развитие острых и хронических форм ВВК Известно, что острые формы ВВК характерны для молодых, сексуально-активных женщин, у которых манифестация вагинального кандидоза связана, в основном, с эстрогенными факторами риска, либо острый ВВК развивается у иммунокомпрометированных лиц (Гейро О А, 2006; Прилепская В H, 2007) Тогда как хронические формы ВВК, в том числе рецидивирующие, более чем в половине случаев не связаны с предрасполагающими факторами и встречаются у иммунокомпетентных женщин детородного возраста (Шабашова H В , 2006, Fidel Р L , 2004, Romany L , 2000, Sobel J.D, 2002, Tuite A, 2004) Остается не достаточно изученным и влияние патогенетических факторов риска, таких как бактериальный вагиноз или системная нейтропения, на течение различных клинических форм вульвовагинального кандидоза

Существует еще одна проблема За последние два десятилетия среди возбудителей ВВК доля грибов Candida non-albicans увеличилась до 15-30%. Многие авторы объясняют данный факт ростом во всем мире популяции иммунокомпрометированных лиц, для которых характерен довольно высокий процент колонизации ротовой полости, кишечника, кожи, в том числе промежности, грибами non-albicans видов - С glabrata, С tropicalis, С krusei, С guilliermondii (Сергеев А Ю, 2000, Fidel Р L , 2003, Flanagan Р G, 1998, Sullivan D, 1998), способных выступать в качестве эндогенных источников вагинального кандидоза В связи с тем, что механизмы иммунной защиты нижнего отдела генитального тракта до конца не ясны, особенно в отношении грибов Candida non -albicans, но хорошо известна устойчивость последних к современным антифунгальным препаратам, то перед клиницистами стоят серьезные проблемы, связанные с разработкой методов профилактики и лечения таких оппортунистических инфекций

Цель исследования

Оценить профиль изменений иммунных параметров, характерных для немедленной эффекторной реакции микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови здоровых и больных вульвовагинальным кандидозом в отношении живых изолятов грибов рода Candida различных экологических ниш (клинические вагинальные С albicans и природные С guilliermondii) в условиях in vitro, с целью выделения иммунологических маркеров острых и хронических клинических форм вульвовагинального кандидоза

Задачи исследования

1 Изучить характер немедленной эффекторной фазы (показатели фагоцитарной реакции, экстраклеточный киллинг непоглощенных фагоцитами грибов, уровень цитокинов в супернатантах экстраклеточной среды) микоцидной активности лейкоцитов периферической крови здоровых лиц при

культивировании с живыми клиническими вагинальными изолятами С albicans в условиях in vitro

2 Оценить иммунные параметры немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови здоровых лиц при культивировании с живыми природными изолятами С guilliermondn в условиях т vitro

3 Определить иммунные параметры немедленной эффекторной фазы (показатели фагоцитарной реакции, экстраклеточный киллинг непоглощенных фагоцитами грибов, уровень цитокинов в супернатантах экстраклеточной среды) микоцидной активности лейкоцитов периферической крови больных вульвовагинальным кандидозом при культивировании с живыми клиническими вагинальными изолятами С albicans

4 Изучить профили иммунных параметров, характеризующие немедленную эффекторную реакцию микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови больных в зависимости от клинических форм вульвовагинального кандидоза - острые и хронические с редкими и частыми рецидивами, при культивировании с живыми клиническими вагинальными изолятами С albicans

5. Оценить влияние патогенетического фактора риска — наличие вагинальных бактериальных ассоциантов в этиологически значимых титрах, на реализацию немедленной эффекторной фазы микоцидной активности лейкоцитов периферической крови больных при различных клинических формах вульвовагинального кандидоза

Научная новизна

Впервые в условиях т vitro при культивировании лейкоцитов периферической крови (ЛПК) здоровых лиц с живыми изолятами грибов рода Candida различных экологических ниш (природные С guilliermondn и клинические вагинальные С albicans) и контрольным штаммом С albicans АТСС10231 определены особенности немедленной эффекторной реакции (с 15 по 60 минуту) микоцидного ответа показатели этапов фагоцитоза, выживаемость непоглощенных фагоцитами грибов в экстраклеточной среде, содержание основных цитокинов с про- и противовоспалительным эффектом в супернатантах экстраклеточной среды

Установлено, что киллинг живых непоглощенных фагоцитами природных грибов С guilliermondn и клинических вагинальных изолятов С albicans происходит, в основном, внеклеточно - в среде культивирования с лейкоцитами периферической крови здоровых и больных ВВК в ходе развития немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа (с 15 по 60 минуту) Выживаемость клинических вагинальных изолятов С albicans в среде культивирования с ЛПК здоровых лиц достоверно выше, чем природных изолятов С guilliermondn, достоверно нарастает к 60 минуте инкубации и сопровождается достоверно более высокими показателями индекса поглощения лейкоцитами во все сроки наблюдения

Установлены профили иммунных параметров, характеризующие особенности начального этапа развития (в течение первых 15 минут) немедленной эффекторной фазы микоцидной активности лейкоцитов периферической крови больных в зависимости от клинических форм ВВК -острые и хронические с редкими и частыми рецидивами, при культивировании с живыми клиническими изолятами С albicans

Показано, что профиль иммунных параметров немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа ЛПК имеет различия по содержанию цитокинов в экстраклеточной среде в зависимости от наличия/отсутствия у больных с различными клиническими формами ВВК вагинальных бактериальных ассоциантов в этиологически значимых титрах При наличии бактериальных ассоциаций у больных острым ВВК наблюдается достоверное снижение уровня IFN-y и повышение уровня IL-IRa, а при хроническом ВВК с редкими и частыми рецидивами наблюдается достоверное повышение уровней TNF-a, IFN-y, и снижение уровня IL-IRa по сравнению с имеющими кандидозную моноинфекцию

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты оценки характера немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови больных ВВК в отношении живых клинических вагинальных изолятов С albicans (показателей этапов фагоцитоза, экстраклеточного киллинга непоглощенных фагоцитами грибов, уровней основных цитокинов с про- и противовоспалительным эффектом в супернатантах экстраклеточной среды) позволили установить наличие ассоциаций между клиническими формами ВВК и профилем изменений отдельных иммунных параметров (в первые 15 минут после контакта ЛПК с грибами С albicans), что позволяет считать их иммунологическими маркерами острых и хронических клинических форм заболевания

Полученные данные могут быть использованы не только в качестве информативных диагностических тестов в лабораторной практике при дифференциальной диагностике хронических форм вульвовагинального кандидоза, но и служить лабораторными маркерами, позволяющими определить подходы к лечению острых и хронических форм ВВК

Основные положения, выносимые на защиту

1 Киллинг живых непоглощенных фагоцитами грибов природных С guilliermondn и клинических вагинальных С albicans изолятов происходит внеклеточно — в среде культивирования с лейкоцитами периферической крови здоровых и больных вульвовагинальным кандидозом в ходе развития немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа (с 15 по 60 минуту)

2 Определенные профили иммунных параметров, характеризующие немедленную эффекторную фазу микоцидного ответа (показатели фагоцитарной реакции, экстраклеточный киллинг не фагоцитированных грибов, уровень основных цитокинов в супернатантах среды культивирования) лейкоцитов периферической крови больных вульвовагинальным кандидозом при культивировании с живыми клиническими вагинальными изолятами С albicans в

условиях in vitro, могут использоваться в качестве патогенетически значимых иммунологических маркеров острых и хронических форм вульвовагинального кандидоза

Апробация работы

Основные положения работы доложены и обсуждены на III конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2003), Научно-практической конференции «Актуальные проблемы микологии» (Челябинск, 2004), TV конференции иммунологов Урала (Уфа, 2005), юбилейной конференции с международным участием «Современные проблемы науки и образования», посвященной 10-летию Российской Академии Естествознания (Москва, 2005), V конференции иммунологов Урала (Оренбург, 2006), Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной памяти профессора Н Н Кеворкова «Иммунитет и аллергия от эксперимента к клинике» (Пермь, 2006) Участие в работе Всероссийского конгресса по медицинской микологии (Москва, 2003, 2004, 2005 и 2006), научной конференции «Климат и окружающая среда» (Амстердам, 2006), конференции, посвященной 25-летию ЦНИЛ Челябинской государственной медицинской академии (Челябинск, 2006); Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006), Российском национальном конгрессе аллергологов и иммунологов (Москва, 2006) XI Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007)

Публикации

По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ

Внедрение результатов исследования

Результаты работы используются в учебном процессе при преподавании вопросов инфекционной иммунологии, как в лекционном материале, так и на практических занятиях на кафедре микробиологии ГОУ ВПО «Челябинский государственный университет»

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, включает 11 рисунков, 8 таблиц Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы исследования, 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов, библиографического списка литературы, включающего работы 52 отечественных и 84 иностранных авторов, и приложения, включающего 2 рисунка и 4 таблицы

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Характеристика обследованных лиц. Контрольная группа была сформирована случайным образом среди практически здоровых доноров крови ОГУП «Челябинская областная станция переливания крови», состояла из 15

мужчин (средний возраст 35,07 ± 1,36 лет) и 21 женщины (средний возраст 39,75 ± 2,75 лет)

Группа больных была сформирована за период с 2003г по 200бг совместно с врачами-гинекологами женской консультации МУЗ ГКБ №6 и гинекологического отделения МУЗ Городской поликлиники №7 г Челябинска, состояла из 55 женщин в возрасте 18-45 лет (средний возраст 30,52±1,28 лет) с клиническим диагнозом вульвовагинальный кандидоз в стадии обострения, установленным на основании анамнестических, клинических и лабораторных данных У всех больных исследуемой группы исключены сексуально-трансмиссионные заболевания (Приказ №286 от 07 12 1993г МЗ РФ «О совершенствовании контроля за заболеваниями, передающимися половым путем»), беременность и период менопаузы, отсутствовала эндокринная и выраженная соматическая патология

С целью количественной оценки микробиоценоза и подтверждения клинического диагноза всем больным ВВК было проведено микробиологическое (бактериологическое и микологическое) исследование нижнего отдела генитального тракта (Приказ №535 от 22 04.1985г. МЗ СССР «Об унификации микробиологических/ бактериологических методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях ЛПУ») на базе бактериологической лаборатории МУЗ ГКБ №6 г Челябинска У 46 (84%) женщин грибы Candida spp были выделены из исследуемого материала более 104 КОЕ/мл, у остальных пациенток - элементы грибов обнаруживались только при микроскопии (менее 103 КОЕ/мл) Среди идентифицированных культур возбудитель был представлен видом С albicans в 90%, в остальных случаях выделялись виды Candida non-albicans С krusei (4%), С tropicalis (2%), С zeylanoides (2%), С catenulate (2%) В качестве моно-возбудителя грибы рода Candida были выделены у 32 (58%) пациенток, различные бактериальные ассоциации в этиологически значимых титрах наблюдались у 23 (42%) пациенток (различия не значимы, р>0,10) Из них у одной пациентки (1,8%) выявлена бактериальная ассоциация с двумя условно-патогенными микроорганизмами. Gardnerella vaginalis (106 КОЕ/мл) и Staphylococcus saprophytics (104 КОЕ/мл) У остальных 22 (98,2%) пациенток - с одним бактериальным ассоциантом G vaginalis (23%), Streptococcus spp (23%), S saprophytics (14%) Sepidermidis (14%), S aureus (9%), Enterococcus durans (14%), Escherichia coll (3%)

Оценка выраженности местной лейкоцитарной реакции больных ВВК проводилась при микроскопии исследуемого материала нижнего отдела генитального тракта по Анкирской А С (2001)

В соответствии с классификацией Прилепской В Н (1997) больные ВВК разделены на три основных клинических группы в зависимости от формы и течения заболевания острый ВВК, хронический ВВК с редкими рецидивами, хронический рецидивирующий ВКК с частыми эпизодами рецидивов в течение года

Больные с острой формой ВВК - 14 (25,5%) женщин в возрасте 25,17±1,43 лет (около 80% в раннем репродуктивном возрасте 18-25 лет), с дебютом ВВК

(отсутствие анамнестических данных об эпизодах генитального кандидоза), длительностью заболевания не более двух месяцев, с установленными факторами риска, имеющие местную лейкоцитарную реакцию умеренной (10-15 лейкоцитов в поле зрения) - 57% и слабой степени (единичные лейкоциты в поле зрения) -36%, практически без выраженной степени (30-50 и более лейкоцитов в поле зрения) - 7%, грибы рода Candida выделены в качестве моно-инфекции - 57%, бактериальные ассоциации - 43% (различия не значимы, р>0,10)

Больные хроническим ВВК с редкими эпизодами рецидивов - 25 (45,5%) женщин в возрасте 31,40±2,09 лет (около 30% в возрасте 18-25 лет), с длительностью заболевания более 6 месяцев при наличии не более 3-х рецидивов в течение года, без установленных факторов риска, имеющие местную лейкоцитарную реакцию преимущественно слабой степени (64%), реже умеренной (20%) и выраженной (16%) степени, частота выделения грибов рода Candida в качестве моно-возбудителя - 60%, в бактериальных ассоциациях - 40% (различия не значимы, р>0,10)

Больные хроническим ВВК с частыми эпизодами рецидивов - 16 (29%) пациенток в возрасте 30,56±1,35 лет (25% в возрасте 18-25 лет), с рецидивирующим течением хронического ВВК, установленным на основании наличия 4-х и более клинически выраженных обострений воспалительного процесса в течение года, длительностью заболевания от 6 месяцев до 10 лет, без установленных факторов риска, с местной лейкоцитарной реакцией преимущественно слабой степени (62%), реже умеренной (19%) и выраженной (19%) степени, грибы рода Candida выделены в виде моно-инфекции - 56%, в виде микст-инфекции - 44% (различия не значимы, р>0,10)

Отбор изолятов грибов рода Candida. В работе были использованы живые грибы рода Candida из различных экологических ниш. 1) клинические вагинальные изоляты С albicans (п-2); 2) природные С gutlhermondii (п=2), 3) контрольный штамм С albicans АТСС10231 (American Type Culture Collection, «Becton Dickinson»)

Клинические вагинальные изоляты С albicans были выделены и идентифицированы в ходе предварительно проведенного микробиологического исследования отделяемого заднего свода влагалища небеременных женщин репродуктивного возраста с различной генитальной патологией (кольпиты, эндоцервициты, дисплазии шейки матки, сальпингиты, аднекситы) совместно с ассистентом кафедры Хомич Ю С (Бурмистрова A JI, 2003, Заврина О А, 2003, Хомич Ю С, 2005) Среди всех исследованных 28 клинических вагинальных изолятов С albicans (10-10' КОЕ/мл) мы отбрали два вагинальных штамма с альтернативными адгезивными свойствами к буккальным эпителиоцитам одного и того же донора штамм С albicans-8 характеризовался высокой адгезивной способностью (более 10 бластоконидий на один эпителиоциг), штамм С albicans-11 характеризовался низкими адгезивными свойствами (менее 5 бластоконидий на один эпителиоциг) (Бурмистрова AJI, 2003, 2005, Самышкина НЕ, 2003; Хомич Ю С, 2006) Данные штаммы нами определены как экспертные изоляты С albicans

Природные изоляты грибов были любезно предоставлены кафедрой биологии почв факультета почвоведения Московского Государственного Университета имени М В Ломоносова (д б н , профессор Чернов Ю И), ре-идентифицированы нами совместно с ассистентом кафедры Хомич Ю С. как С guilliermondu Штамм С guilliermondu КБП-3198 выделен от имаго (взрослая особь) комара Aedes dianteus (тип членистоногие, класс насекомые) Штамм С guilliermondu КБП-3206 выделен из кишечного тракта кивсяка Pachyiulus flavipes (тип членистоногие, класс диплоподы)

Все изоляты грибов поддерживали на плотной среде Сабуро, пересевая каждые две недели В эксперименте использовали суточную культуру грибов, выращенную на среде Сабуро Оценивали жизнеспособность дрожжевых клеток при окрашивании 0,01% раствором метиленового синего и определяли концентрацию при подсчете в камере Горяева

Иммунологические методы исследования. В периферической крови определялось абсолютное число лейкоцитов, относительное и абсолютное число эозинофилов, нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов

Оценка показателей, характеризующих немедленную эффекторную фазу микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови здоровых и больных ВВК в отношении различных изолятов грибов рода Candida, проводилась на экспериментальной модели «адгезированные ЛПК - живые бластоконидии грибов Candida spp» в условиях in vitro в пределах 1 -часового временного промежутка (через 0,15 и 60 минут) Лейкоциты периферической крови здоровых и больных лиц в концентрации 1x106 клеток/мл вносили по 1 мл в стерильные пробирки-«сапожки» с половинками покровных стекол на дне и инкубировали в течение 1 часа при 37°С для получения адгезированных к стеклу клеток (Хейфец Л Б , 1973, Эберт Л Я , 1983) Адгезия к стеклу в условиях взаимодействия всех лейкоцитов и плазменных факторов периферической крови считается фактором неспецифической стимуляции, приводящим в состояние повышенной готовности и увеличению активности каждой функции клетки (Ellis Т N, 2004, Nathan С F , 1987, 2006), обозначена нами как антиген-независимая активация ЛПК (AHA) К полученному монослою прилипающей фракции лейкоцитов, более чем на 95% состоящему из фагоцитов периферической крови (нейтрофилов, моноцитов, эозинофилов), добавляли живые бластоконидии грибов рода Candida в соотношении 50 дрожжевых клеток на один потенциальный фагоцит (контролем являлись пробы без добавления грибов) и культивировали при 37°С в течение 0, 15 и 60 минут (Дуглас С Д, Кун П Г, 1983) По истечении времени инкубации из каждой пробы 0-, 15-, 60-минутного фагоцитоза после ре-суспендирования отбирали культур альную среду для оценки экстраклеточного киллинга непоглощенных фагоцитами грибов и содержания цитокинов в экстраклеточной среде Фагоцитарную реакцию адгезированных ЛПК на живые грибы рода Candida оценивали при окрашивании по Май-Грюнвальду, подсчитывая не менее 200 клеток, потенциально способных к фагоцитозу Рассчитывали показатели 0-, 15- и 60-минутной общей фагоцитарной реакции лейкоцитов и дифференцированные показатели фагоцитарной реакции нейтрофилов,

моноцитов, эозинофилов — активность фагоцитоза, интенсивность фагоцитоза, индекс адгезии, ивдекс поглощения

Экстраклеточный киллинг оценивали по выживаемости (%) во внеклеточной среде культивирования непоглощенных фагоцитами грибов рода Candida Из каждой пробы 0-, 15-, 60-минутного фагоцитоза отбирали культуральную среду и после серийных разведений проводили ее количественный посев в объеме 10 мкл (10"6) на агар Сабуро (инкубация 48 часов при 37°С) Подсчитывали количество выросших колоний грибов, исходя из того, что одна образовавшаяся колония соответствует одной живой бластоконидии (Vazquez-Torrez А, Balish Е , 1997), и определяли процент выживаемости грибов из числа непоглощенных фагоцитами бластоконидии (количество поглощенных фагоцитами грибов определено, исходя из показателей активности фагоцитоза и индекса поглощения)

Уровень цитокинов (TNF-a, IL-8, IFN-y, IL-IRa) в супернатангах экстраклеточной среды ЛПК, отобранной в ходе 0-, 15-, 60-минутного фагоцитоза, определяли количественно методом твердофазного иммуноферментного анализа, используя стандартные наборы реагентов (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) Результаты учитывали на спектрофотометре Multiskan EX («Labsystems», Финляндия) при длине волны 450 нм

Статистическая обработка результатов. Полученные результаты исследований подвергнуты статистической обработке стандартными методами описательной статистики с определением средней арифметической вариационного ряда (М) и ошибки средней (ш) При анализе количественных признаков для оценки достоверности различий между группами использовали t-критерий Стьюдента и непараметрический U-критерий Манна-Уитни При анализе качественных признаков проводили построение таблиц сопряженности с вычислением критерия х (для таблиц сопряженности 2x2 вводилась поправка Иейтса) Во всех случаях различия считали значимыми при р<0,05, незначимыми при р>0,10, промежуточных значений 0,05<р<0,10 обсуждали тенденции к различиям (ГланцС , 1999)

Результаты исследования и их обсуждение

В качестве контроля была набрана группа практически здоровых доноров, состоящая из мужчин и женщин При сравнительном анализе иммунных параметров немедленной эффекторной фазы микоцидной активности ЛПК в отношении живых клинических вагинальных изолятов С albicans, мы установили значимые различия при реализации фагоцитарной реакции лейкоцитов здоровых мужчин и женщин Индекс поглощения грибов нейтрофилами мужчин был в два раза достоверно ниже на 15 минуте, и индекс поглощения грибов нейтрофилами и моноцитами мужчин на 60 минуте был в два раза достоверно ниже по сравнению с показателями ЛПК женщин (рис 1) Поэтому в дальнейшей работе мы использовали клетки, полученные от доноров только женского пола.

Для решения первых двух задач мы определили иммунные параметры немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа ЛПК здоровых лиц в отношении живых природных С guilliermondn и клинических вагинальных

С albicans гоолятов Чтобы исключить разбросы показателей, обусловленные индивидуальными особенностями доноров, микоцидный ответ лейкоцитов на природные и клинические изоляты грибов рода Candida мы оценивали на клетках того же донора

15 минут инкубации I 5 п 60 минут »«убации

I'-

Е

о с

Ö 05

Л

1'° Е о с

" 05 J

IllL

JZhnL

Рис 1 Показатели фагоцитарной реакции ЛПК здоровых мужчин и женщин

Примечание светлые столбики - показатели ЛПК мужчин темные столбики - показатели ЛПК женщин Здесь и далее на рис 2 и рис 4 1 - общие показатели ЛПК, 2 - показатели нейтрофилов, 3 - показатели моноцитов, 4 - показатели эозинофилов * - различия статистически значимы, р<0 05

Из всех изученных показателей фагоцитарной реакции наиболее яркие различия наблюдались по показателям индексов адгезии и поглощения (рис 2) Индексы адгезии грибов природных изолятов С guilliermondn к лейкоцитам доноров были достоверно выше, а индексы поглощения достоверно ниже, чем клинических изолятов С albicans Следовательно, несмотря на высокую адгезию, основная часть грибов природных изолятов оставалась во внеклеточной среде, что может свидетельствовать о неспецифическом характере адгезии природных изолятов В экстраклеточной среде культивирования грибы природных изолятов С guilliermondn выживали достоверно меньше на 60 минуте инкубации, чем клинических вагинальных изолятов С albicans (рис 3) Уровень цитокинов в супернатантах экстраклеточной среды практически не различался при стимуляции ЛПК грибами природных и клинических изолятов рода Candida Все исследования были проведены на клетках одних и тех же доноров при культивировании с двумя клиническими вагинальными изолятами (штамм С albicans-8 и штамм С albicans-11) и двумя природными изолятами (штамм С guilliermondn КБП-3198 и штамм С guilliermondn КБП-3206) При сравнении показателей общей фагоцитарной реакции ЛПК, выживаемости непоглощенных фагоцитами грибов в среде культивирования и уровней цитокинов в ней мы не обнаружили достоверных различий между штаммами, поэтому рассматривали их как экспертные изоляты С albicans и природные изоляты С guilliermondn

Полученные нами результаты свидетельствуют, что киллинг живых непоглощенных фагоцитами природных изолятов С guilliermondn и клинических вагинальных изолятов С albicans происходит внеклеточно — в среде культивирования с лейкоцитами периферической крови здоровых лиц в ходе развития немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа ЛПК (с 15 по 60 минуту), что соответствует данным других авторов (Дуглас С Д, 1983, Янченко В В , 2003, Ashman R В , 1995, Lehrer R1,1969, Tuite А, 2004, Urban С F, 2006)

15п 15 MiHyT инкубации 15, 60 минут инкубации

1 2 3 4 1 2 3 4

Рис 2 Показатели фагоцитарной реакции ЛПК здоровых лиц в отношении экспертных изолятов С albicans и природных изолятов С guilliermondn

Примечание светлые столбики - экспертные изоляты С albicans темные столбики- природные изоляты С guilliermondn * - различия статистически значимы р<0 05

Рис 3 Выживаемость непоглощенных фагоцитами экспертных С albicans и природных С guilliermondn изолятов в среде культивирования ЛПК здоровых лиц

Примечание светлые столбики - экспертные изоляты С albicans, темные столбики - природные изоляты С guilliermondn, *-различия статистически значимы р<0,05 |-по сравнению с показателями 15-минутного наблюдения р<0 05

В соответствии с третьей задачей исследования мы оценили иммунные параметры немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа ЛПК всей группы больных ВВК при культивировании с живыми клиническими вагинальными изолятами С albicans Сравнительный анализ показателей фагоцитарной реакции ЛПК больных и здоровых показал различия по индексам поглощения - грибы поглощаются почти в два раза достоверно хуже нейтрофилами на 15 минуте контакта, и в полтора раза достоверно хуже нейтрофилами и моноцитами больных ВВК на 60 минуте по сравнению с ЛПК здоровых лиц (рис 4) Выживаемость непоглощенных грибов в среде культивирования с фагоцитами больных ВВК достоверно ниже и на 15 минуте и

на 60 минуте (по сравнению с ЛПК здоровых), и не изменяется во времени с 15 по 60 минуту инкубации (рис. 5) Следовательно, киллинг непоглощенных фагоцитами клинических вагинальных изолятов С аШсапя происходит внеклеточно (в среде культивирования) в ходе развития немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа ЛПК больных ВВК (с 15 по 60 минуту), и эффективность его достоверно выше по сравнению с внеклеточным киллингом вагинальных изолятов лейкоцитами здоровых лиц

15 шн/г »«убации 3 0-] 60 минут инкубации

ГйГ^СЖ

у 1 о

Рис 4 Показатели фагоцитарной реакции ЛПК больных ВВК и здоровых лиц

Примечание светлые столбики - показатели ЛГПС здоровых, темные столбики - показатели ЛПК больных ВВК * - различия статистически значимы, р<0 05

Рис 5 Выживаемость непоглощенных фагоцитами грибов в среде культивирования ЛПК больных ВВК и здоровых лиц

Примечание светлые столбики - ЛПК здоровых, темные столбики - ЛПК больных ВВК, * - различия статистически

значимы р<0 05

При сравнении уровней цитокинов в супернатантах экстраклеточной среды лейкоцитов больных ВВК и здоровых лиц наблюдались значимые различия, регистрируемые уже через 15 минут контакта (табл 1) Уровни цитокинов TNF-a и IFN-y в супернатантах ЛПК больных ВВК были в 3 раза достоверно выше, чем уровни здоровых Уровень цитокина IL-IRa в культуральной среде лейкоцитов больных ВВК и здоровых статистически не различался, однако среди больных было достоверно больше лиц со следовьми концентрациями IL-IRa (неопределяемыми используемой тест-системой) Исходя из полученных нами данных, можно предположить, что в экстраклеточной среде ЛПК больных ВВК при культивировании с живыми С albicans формируется выраженный провоспалительный цитокиновый потенциал по сравнению с клетками здоровых лиц Представленные данные характеризуют общую группу больных ВВК, которая включала пациенток с острыми и хроническими формами ВВК с редкими и частыми рецидивами

Таблица 1

Сравнение уровней цитокинов в экстраклеточной среде ЛПК доноров и больных ВВК при стимуляции экспертными изолятами С albicans

Время, мин Здоровый контроль (п= 18) Больные ВВК (п=39) Уровень значимости

Цитокин АНА М±т пг/мл № %) С albicans М ± т пг/мл (Nx %) АНА М ± т, пг/мл №.%) С albicans М ± т пг/мл №,%)

0 0 950*0,356 0,962±0 361 3,253*0 315 3,420*0 268 р<0,001

TNF-a 15 0 936*0 208 1,457±0,192 3 259*0 201 3,632*0 250 р<0,001

60 1,030*0,113 1,683±0,246 3 264*0236 4,203*0 327 р<0,001

0 49 192*11 340 52 845*14 983 51 311*8,291 53 643*8 853

IL-8 15 49,506±9 327 55 570*10 160 51 943*8 263 56 939±7 032

60 50 255±10 706 125 436*16,970 52,039*8 279 137 878*14 909

0 25 43612 019 26,289*2 805 98 484*12 097 102,408*12 050 р<0,001

IFN-y 15 26 061 ±3 414 27,298*2,110 100 349*11,880 104,841*14,016 р<0,001

60 28 723*1,919 29,902*3 495 101,739*12 494 101,115*14288 р<0,001

IL-IRa 0 15 60 88 274±11,640 3% 92,072*12 567 5% 93,235*12 889 2% 89 452*10 674 4% 100 028*13 950 3% 142 517*20 310 0% 89 648*8 588 22% 90 880*8 604 20% 93 660*8 450 21% 93,740*8 764 21% 96 484*8,848 22% 126,119*9,436 17% р<0,М р<0,01 р<0,01

Примечание АНА - антиген-независимая активация ЛПК, % - процент обследованных лиц со следовым уровнем цитокина в эксграхлеггочной среде ЛПК, жирным шрифтом отмечены статистически значимые различия с показателями здоровых, р<0,05

Для решения четвертой задачи исследования мы провели сравнительный анализ иммунных параметров немедленной эффекторной реакции микоцидного ответа ЛПК больных в зависимости от клинической формы ВВК Исследования, проведенные нами, показали, что наиболее значимые различия между группами сравнения отмечаются на 15 минуте культивирования

Больные острой формой ВВК 1) достоверно низкий индекс поглощения грибов фагоцитами по сравнению с показателями групп сравнения через 15 минут инкубации (рис 6), 2) выживаемость оставшихся не поглощенными грибов С albicans соответствует контролю и достоверно выше показателей больных с частыми рецидивами хронического ВВК на 15 минуте, но снижается к 60 минуте и становится равной показателям групп сравнения больных (рис 7), 3) уровни провоспалительных цитокинов TNF-а и IFN-y достоверно выше, a противовоспалительного цитокина IL-IRa достоверно ниже в супернатантах экстраклеточной среды по сравнению с уровнями групп сравнения (табл 2)

Больные хроническим ВВК с редкими эпизодами рецидивов 1) все показатели 15-минутной фагоцитарной реакции ЛПК, кроме индекса поглощения, отличаются достоверно низкими значениями по сравнению с показателями групп сравнения (рис 6), 2) выживаемость непоглощенных грибов достоверно ниже контроля, но достоверно выше показателей больных хроническим часто рецидивирующим ВВК (рис. 7) на 15 минуте, и не изменяется во времени с 15 по 60 минуту контакта, 3) уровни цитокинов TNF-a и IFN-y достоверно ниже уровней больных острым ВВК, но достоверно выше контроля, а уровень IL-IRa равен контролю, но достоверно выше уровня больных острым ВВК (табл 2), то есть по сравнению с больными острой формой ВВК наблюдается слабый провоспалительный цитокиновый потенциал экстраклеточной среды

Ё

е rt ■е-

Ь

## „ #

t t f t

время инкубации (мин)

e ' «

-e-

u 1,0 x

D

fe

##

1

##

время инкубации (мин)

e' d

##

3 i.o

# * # — 1 ## * —

к А В С к А В с

## * *

время инкубации (мин)

время инкубации (мин)

Рис.б. Показатели общей фагоцитарной реакции ЛПК больных в зависимости от клинической формы вульвовагинального кандидоза

Примечание: К - показатели ЛПК здоровых лиц; А - показатели ЛПК больных острым ВВК; В показатели ЛПК больных хроническим ВВК с редкими рецидивами; С показатели ЛПК больных хроническим ВВК с частыми рецидивами; * - при сравнении с показателями К, р<0,05; # - при сравнении с показателями А, р<0,05; Ш - при сравнении с показателями С, р<0,05; |Ц) - при сравнении с 15-минутными показателями, р<0,05

Больные хроническим рецидивирующим ВВК с частыми эпизодами рецидивов: 1) достоверно высокий на 15 минуте индекс поглощения по сравнению с аналогичными показателями групп сравнения больных (рис. 6). Для этой группы были характерны различия в поглотительной способности моноцитов и нейтрофилов - индекс поглощения грибов моноцитами был равен контролю, в отличие от групп сравнения больных (достоверно ниже показателей контрольной группы), а индекс поглощения нейтрофилами — достоверно ниже контроля. О роли моноцитов/макрофагов в защите от кандидозной инфекции существуют противоречивые мнения. Многие авторы считают, что микоцидная активность моноцитов/макрофагов чрезвычайно низка, и в определенных условиях они могут служить резервуаром бластоконидий С.albicans (Romany L., 2004; Tuite A., 2004). Но все авторы отмечают, что кандидацидная способность этих лейкоцитов резко активируется под влиянием TNF-a и IFN-y (Ashman R.B., 1995; Ellis T.N., 2004; Romany L., 2000, 2002); 2) выживаемость непоглощенных фагоцитами грибов достоверно ниже показателей групп сравнения на 15 минуте, но к 60 минуте контакта возрастает и становится равной показателям групп сравнения больных (рис. 7); 3) уровни TNF-a и IFN-y достоверно выше контроля, равны уровням больных хроническим ВВК с редкими рецидивами, но достоверно ниже уровней больных острым ВВК, а уровень TL-IRa равен контролю и достоверно выше уровня больных острым ВВК (табл. 2), то есть по сравнению с

больными острой формой ВВК наблюдается слабовыражекный провоспалительный цитокиновый потенциал экстраклеточной среды

о

##

15 60

время инкубации

Рис 7 Выживаемость непоглощенных фагоцитами грибов в среде культивирования ЛПК больных ВВК разных клинических групп

Примечание К - показатели ЛПК здоровых женщин А - показатели ЛПК больных острым ВВК, В - показатели ЛПК больных хроническим ВВК с редкими рецидивами С - показатели ЛПК больных хроническим ВВК с частыми рецидивами * - при сравнении с показателями К, р<0 05 # - при сравнении с показателями А р<0 05, ## - при сравнении с показателями С рО,05 ТШ - при сравнении с 15-минутными показателями, р<0 05

Таблица 2

Уровни цитокинов в экстраклегочной среде ЛПК здоровых и больных ВВК разных групп сравнения при 15-минутной стимуляции экспертными изолятами С albicans

TNF-a 1L-8 IFN-y IL-IRa

Группа M±m, пг/мл М±т, пг/мл М±т, пг/мл М±т, пг/мл

Nx,% Nx,% Nx,% Nx,%

1 Здоровые 1,457±0,192 36% 55,570±10,160 27,298±2,110 100,028±13,950 3%

2 Острый ВВК 6,116±0,658 0% 85,865±34,351 243,845*31,182 47,480±10,777 80%

р2 ¡<0,001 <0,05 Pi ,<0,001 р2 ¡<0,05 <0,001

3 Хронический 3,228±0,287 56,593±8,457 76,873± 17,798 111,981±13,705

ВВК с редкими 5% 13%

рецидивами Рз ,<0,001 <0,01 Рз ¡<0,01

Рз 2<0,01 Рз_2< 0,001 р32<0,01 <0,001

4 Хронический 3,249±0,403 51,500*11,173 93,933*21,984 80,585±10,276

ВВК с частыми 10% 13%

рецидивами р4 ,<0,001 <0,05 р41<0,01 p«<O,0J <0,001

р42<0,001 р, 2<0 001 р43<0,07

Примечание % - процент лиц со следовыми концентрациями цитокина в экстраклеточной среде ЛПК (для расчета достоверности различий между группами использован критерий Р:,, рз /, Рзи т п - уровень значимости различий между группами (критерий Манна-Уитни), жирным шрифтом отмечены статистически значимые различия с показателями здоровых, р<0,05

В соответствии с пятой задачей исследования мы оценили влияние сопутствующих вагинальных бактериальных ассоциантов в этиологически значимых титрах на реализацию немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа ЛПК при различных клинических формах ВВК Наличие сопутствующих бактериальных ассоциаций не оказывало значимого влияния на показатели фагоцитарной реакции лейкоцитов и выживаемость непоглощенных фагоцитами

грибов Однако в экстраклеточной среде культивирования изменялись уровни основных цитокинов в зависимости от наличия/отсутствия при различных клинических формах ВВК бактериальных ассоциантов в этиологически значимых титрах При сравнении больных ВВК, у которых при микробиологическом исследовании выявлены бактериальные ассоцианты в этиологически значимых титрах, с больными кандидозной моно-инфекцией установлено 1) при остром ВВК с сопутствующими бактериальными ассоциациями — уровень ПТ^-у достоверно ниже, уровни 1Ь-8 и 1Ь-1Яа достоверно выше (рис 8), 2) при хроническом ВВК с редкими и частыми рецидивами - уровни ТОТ-а и ПТЧ-у достоверно выше, а уровень ГЬ-Ша достоверно ниже по сравнению с имеющими моно-инфекцию (рис 9)

15 минут инкубации

■

й.

1S минут инкубации

П

IL-8 НО

CFNY /100

IL-tRa ЛО

IL-8

го

IFN-y IL-IRa

/го ЙО

60 мжут инкубации

■

*

73

60 минут инкубации

J

(L-в /20

IFNy /100

IL-IRa ПО

ILi /20

IFNy /20

IL-IRa

И о

Рис 8 Сравнение уровней цитокинов в супернатантах экстраклеточной среды ЛПК больных острой формой ВВК при наличии кандидозной моно-инфекции и

сопутствующих бактериальных ассоциантах Примечание светлые столбики — уровни цитокинов при моно-инфекции, темные столбики - уровни цитокинов при микст-инфекции, * - при сравнении различия статистически значимы, р<0,05

Рис 9 Сравнение уровней цитокинов в супернатантах экстраклеточной среды ЛПК больных хроническим ВВК с редкими рецидивами при кандидозной моно-инфекции и сопутствующих бактериальных ассоциантах Примечание светлые столбики - уровни цитокинов при моно-инфекции, темные столбики - уровни цитокинов при микст-инфекции, * - при сравнении различия статистически значимы, р<0,05

Таким образом, анализ показателей (этапов фагоцитарной реакции, внеклеточного киллинга непоглощенных фагоцитами грибов, уровней основных цитокинов с про- и противовоспалительными эффектами в экстраклеточной среде культивирования), характерных для немедленной эффекторной реакции ЛПК в отношении живых изолятов грибов рода Candida различных экологических ниш - природные С guilliermondn и клинические вагинальные С albicans, позволил выделить отличительные признаки начального этапа (в течение первых 15 минут)

микоцидного ответа лейкоцитов здоровых и больных вульвовагинальным кандидозом лиц, которые ассоциируются не только с экологической нишей изолята (природные/клинические) и состоянием организма хозяина — здоровый/больной ВВК, но и с формой клинического течения вульвовагинального кандидоза, что позволит использовать эти показатели в качестве информативных показателей при лабораторной диагностике острых и хронических форм ВВК Проведенные исследования показали, что в зависимости от наличия/отсутствия у больных с различными клиническими формами ВВК вагинальных бактериальных ассоциантов в этиологически значимых титрах профиль иммунных параметров немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа ЛПК имел различия по содержанию цитокинов в экстраклеточной среде При наличии бактериальных ассоциаций у больных при остром ВВК наблюдалось достоверное снижение уровня IFN-y и повышение уровня IL-IRa, а при хроническом ВВК с редкими и частыми рецидивами наблюдалось достоверное повышение уровней TNF-a и IFN-y, и снижение уровня IL-IRa по сравнению с имеющими кандидозную моно-инфекцию.

Полученные нами результаты свидетельствуют о перспективности проведения дальнейших исследований в данном направлении, а расширение спектра лабораторных иммунологических методов позволит оптимизировать диагностику хронических клинических форм вульвовагинального кандидоза

ВЫВОДЫ

1 Киллинг живых непоглощенных фагоцитами грибов природных С guilliermondu и клинических вагинальных изолятов С albicans происходит, в основном, внеклеточно - в среде культивирования с лейкоцитами периферической крови здоровых лиц, в ходе развития немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа (с 15 по 60 минуту) Внеклеточная выживаемость клинических вагинальных изолятов С albicans достоверно выше, чем природных изолятов С guilliermondu, достоверно нарастает к 60 минуте инкубации и сопровождается достоверно более высокими показателями индекса поглощения лейкоцитами во все сроки наблюдения

2 Немедленная эффекторная фаза (с 15 по 60 минуту) микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови больных вульвовагинальным кандидозом при культивировании с живыми клиническими вагинальными изолятами С albicans характеризуется низкими показателями поглотительной способности фагоцитов, высоким уровнем провоспалительных цитокинов (TNF-a и IFN-y) в экстраклеточной среде культивирования и выживаемостью менее 50% оставшихся непоглощенными грибов (по сравнению с аналогичными показателями, характеризующими ответы лейкоцитов здоровых лиц)

3 При остром вульвовагинальном кандидозе начальный этап (на 15 минуте) немедленной эффекторной реакции микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови характеризуется следующими особенностями достоверно сниженными показателями индекса поглощения грибов С albicans, достоверно высоким уровнем провоспалительных цитокинов (TNF-a и IFN-y) и низким уровнем IL-IRa в среде культивирования по сравнению с аналогичными

показателями у больных с хроническими формами и здоровых лиц; показателями выживаемости непоглощенных фагоцитами грибов, равными контролю на 15 минуте и достоверно снижающимися к 60 минуте наблюдения.

4 При хроническом вульвовагинальном кандидозе с редкими эпизодами рецидивов профиль иммунных параметров немедленной эффекторной фазы микоццдного ответа лейкоцитов характеризуется, низкими значениями всех показателей фагоцитарной реакции, за исключением поглотительной способности (при сравнении с показателями здоровых и больных другими формами вульвовагинального кандидоза), отсутствием динамики выживаемости непоглощенных фагоцитами грибов (с 15 по 60 минуту), слабовыраженным провоспалительньш цитокиновым потенциалом экстраклеточной среды по сравнению с острой формой заболевания.

5 При хроническом вульвовагинальном кандидозе с частыми эпизодами рецидивов иммунные параметры немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови имеют наиболее значимые различия, регистрируемые на 15 минуте инкубации с живыми клиническими вагинальными гаолятами С albicans достоверно высокие показатели индекса поглощения, особенно моноцитами периферической крови, на фоне достоверно низкой выживаемости непоглощенных фагоцитами грибов и достоверно низких уровней провоспалительных цитокинов (TNF-a и IFN-y) по сравнению с аналогичными показателями больных острой формой ВВК

6. Профиль иммунных параметров немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови имеет различия по содержанию цитокинов в экстраклеточной среде в зависимости от наличия у больных с различными клиническими формами вульвовагинального кандидоза вагинальных бактериальных ассоциантов в этиологически значимых титрах- при наличии бактериальных ассоциаций у больных в острой форме достоверно снижен уровень IFN-y и повышен IL-IRa, а при хронических формах с редкими и частыми рецидивами достоверно повышены уровни TNF-a, IFN-y и снижен уровень IL-IRa, по сравнению с имеющими кандидозную моно-инфекцию.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Бурмистрова, АЛ Некоторые характеристики генитального кандидоза / АЛ Бурмистрова, OA Заврина, ЛИ Бахарева, НЕ Самышкина, М.А Попова, А В Поспелова // Успехи медицинской микологии- Материалы Первого Всероссийского Конгресса по Медицинской Микологии -М,2003. -Т.2 - С 20-22

2 Заврина, О А. Генитальный кандидоз / О А Заврина, Н Е Самышкина, А В Поспелова, ЮС. Рамина, Т.И Лесина, ЛИ Бахарева, МА Попова, АЛ. Бурмистрова // Иммунология Урала: Материалы III конференции иммунологов Урала - Челябинск,2003.-№1(3).-С 30.

3 Бурмистрова, АЛ. Фунгицидная функция нейтрофилов периферической крови женщин с кандидозным вагинитом / АЛ Бурмистрова, НЕ Самышкина, Ю С. Рамина, А В Поспелова, Л.И Бахарева, Е А Мокринская, Н М Захарова // Успехи медицинской микологии Материалы Второго Всероссийского Конгресса по Медицинской Микологии - М, 2004 - Т.4. - С 43-44

4 Самышкина, Н Е Сравнение фагоцитарной активности лейкоцитов доноров в отношении клинических и природных штаммов Candida spp /НЕ Самышкина, A JI Бурмистрова, Ю И Чернов, Ю С Рамина, JIИ Бахарева, Е А Мокринская, Н М Захарова // Успехи медицинской микологии Материалы Третьего Всероссийского Конгресса по Медицинской Микологии -М,2005 — Т5 -С 105-108

5 Самышкина, Н Е Характер фагоцитарной активности нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов периферической крови женщин с вульвовагинальным кандидозом /НЕ Самышкина, АЛ Бурмистрова, Ю С Хомич, А В Поспелова, Е А Мокринская, Н М Захарова// Иммунология Урала Материалы IV конференции иммунологов Урала - Уфа, 2005 -№1(4) - С 88-89

6 Самышкина, Н Е Особенности партнерских взаимоотношений клинических и природных изолятов грибов рода Candida с фагоцитами здоровых лиц / НЕ Самышкина // Всероссийский конкурс инновационных проектов «Живые системы» 24-26 ноября 2005г Тезисы докладов / ВятГУ.- Киров, 2005 -С 256-259

7 Самышкина, Н Е Влияние клинических и природных изолятов Candida spp на активность фагоцитирующих клеток здоровых лиц /НЕ Самышкина, AJI Бурмистрова, Ю С Хомич, А В Поспелова, А С Букова // Успехи современного естествознания Материалы Юбилейной научной общероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы науки и образования» - М, 2006 -№3 -С 45-46

8 Самышкина, Н Е Характер фагоцитоза клеток Candida albicans в зависимости от иммуногенетической принадлежности донора лейкоцитов по локусу DR системы HLA, его гомеостаза - вульвовагинальный кандидоз/здоровье и вирулентно-ассоциированных свойств штаммов Candida /НЕ Самышкина, AJI Бурмистрова, Ю С Хомич, А.В Поспелова, А С Букова, Е А Мокринская, Н М Захарова // Успехи современного естествознания Материалы научной конференции с международным участием «Климат и окружающая среда», 20-23 апреля 2006г. Амстердам (Голландия) -М,2006 -№4 - С 80-82

9 Samyshkina, N Е Features of phagocytosis of Candida albicans cells depending of the immunogenetic attribute of a leukocyte donor at HLA-DR locus, his homeostasis — vulvovaginal candidiasis/healthy status and virulence-associated properties of Candida strains /NE Samyshkina, A L Burmistrova, Yu S Khomich, A V Pospelova, A S Bukova, EA Moknnskaya, N M Zakharova//EUROPEAN JOURNAL of NATURAL HISTORY -2006 —No 3 -p 121-123

10 Самышкина, H E Сравнение фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови здоровых и больных вульвовагинальным кандидозом женщин в отношении экспертных штаммов Candida albicans /НЕ Самышкина, A JI Бурмистрова, Ю С Хомич, А В Поспелова, Е А Мокринская, Н М Захарова // Новые лабораторные технологии в диагностике и лечении заболеваний человека Материалы конференции, посвященной 25-летию Центральной научно-исследовательской лаборатории Челябинской государственной медицинской академии - Челябинск, 2006 - С 84-86

11 Самышкина, НЕ Характер фагоцитарной реакции лейкоцитов периферической крови здоровых и больных вульвовагинальным кандидозом женщин в зависимости от выраженности вирулентно-ассоциированных свойств живых клинических штаммов Candida albicans /НЕ Самышкина, А Л Бурмистрова,

Ю С Хомич, А В. Поспелова, ЕЛ Мокринская, Н М Захарова // Успехи медицинской микологии- Материалы Четвертого Всероссийского Конгресса по Медицинской Микологии.-М, 2006 -Т8 - С 55-57

12 Самышкина, НЕ Особенности фагоцитоза бластоконидий Candida albicans DR4+ и DR4~ лейкоцитами женщин с вульвовагинальным кандидозом /НЕ Самышкина, AJI Бурмистрова, Т.А Суслова, А С Букова, Ю С Хомич, А В Поспелова // Russian Journal of IMMUNOLOGY Российская научно-практическая конференция «Современные технологии в иммунологии иммунодиагностика и иммунотерапия», вводные лекции и тезисы докладов - 2006 - Vol 9 - Sup 3 - С 117

13 Бурмистрова, AJI Иммуногенетический фенотип и штаммовые особенности грибов рода Candida в регуляции кандидацидных свойств лейкоцитов периферической крови / АЛ Бурмистрова, Н.Е Самышкина, А С Букова, Т А. Суслова, Ю С. Хомич, А В. Поспелова // Аллергология и иммунология - М, 2006 -Т7 -№3 -С 383-384

14 Самышкина, Н Е Влияние штаммовых свойств С albicans на фагоцитарную реакцию лейкоцитов периферической крови больных вульвовагинальным кандидозом женщин в зависимости от аллельных полиморфизмов генов локуса HLA-DRB1 / НЕ. Самышкина, А Л Бурмистрова, Т А Суслова, А С Букова, Е А Мокринская, НМ. Захарова // Иммунология Урала Материалы V конференции иммунологов Урала - Оренбург, 2006 -№1(5)-С 67-69

15 Самышкина, НЕ Влияние иммуногенетического фенотипа индивидуума и штаммовых особенностей грибов рода Candida на регуляцию кандидацидных свойств лейкоцитов периферической крови здоровых и больных вульвовагинальным кандидозом в системе in vitro /НЕ Самышкина, АЛ Бурмистрова, Т А Суслова, Ю С Хомич, А С Букова, Ю Ю. Филиппова // Вестник Уральской Медицинской Академической Науки Всероссийская конференция молодых ученых, посвященная памяти НН Кеворкова «Иммунитет и аллергия, от эксперимента к клинике» -Екатеринбург, 2006 -№3-1(14) - С 212-215

16 Бурмистрова, АЛ Частота встречаемости антигенов главного комплекса гистосовместимости у больных вульвовагинальным кандидозом / АЛ Бурмистрова, А С Букова, Т А. Суслова, Н Е Самышкина // Аллергология и иммунология - М, 2007.-Т 8, №1.-С 120

17. Бурмистрова, АЛ Влияние на продукцию цитокинов состояния донора лейкоцитов (вульвовагинальный кандидоз/здоровье) / АЛ Бурмистрова, Н Е Самышкина, А С Букова, Ю С. Хомич, Ю Ю Филиппова // Медицинская иммунология - СПб: Издательство «Человек», 2007. - Т 9, №2-3 -С 217

18 Бурмистрова, АЛ Полиморфизм генов HLA I класса у женщин, больных вульвовагинальным кандидозом / А.Л Бурмистрова, А.С Букова, Т А Суслова, Н Е Самышкина, Ю С Хомич // Медицинская иммунология - СПб . Издательство «Человек»,2007 -Т9,№2-3 -С 216-217.

19. Бурмистрова, А Л Модификация кандидацидных свойств лейкоцитов периферической крови здоровых лиц клиническими и природными изолятами грибов рода Candida / АЛ Бурмистрова, Н Е Самышкина, В А Черешнев, Ю.С Хомич, Ю И. Чернов, А С Букова, Ю Ю Филиппова // Аллергология и иммунология - М, 2007 - Т 8, №4 - С 394-399

САМЫШКИНА Наталья Евгеньевна

ХАРАКТЕР НЕМЕДЛЕННОЙ ЭФФЕКТОРНОЙ РЕАКЦИИ МИКОЦИДНОГО ОТВЕТА ЛЕЙКОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЗДОРОВЫХ И БОЛЬНЫХ ВУЛЬВОВАГИНАЛЬНЫМ КАНДИДОЗОМ

14 00 36 — аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2008

Подготовлено к печати в издательстве «Челябинская государственная медицинская академия» Лицензия № 01906 Отпечатано в типографии «ПРИНТМЕД» Подписано к печати 24 04 08г Объем 1 п л. Формат 64x84 Гарнитура «Times New Roman суг» Бумага для офисной техники, 80 мг/м2 Тираж 100 экз

Актуальность проблемы

Вульвовагинальный кандидоз (ВВК) является оппортунистической инфекцией слизистых нижнего отдела генитального тракта, вызванной грибами рода Candida. Наиболее частым возбудителем является вид Candida albicans, который с легкостью демонстрирует свои дуалистические способности: с одной стороны - это уверенный комменсал (временный или постоянный) вагинальной слизистой, ротовой полости, желудочно-кишечного тракта, кожных покровов, а с другой — успешный оппортунист этих же анатомических мест [7, 22, 63, 82, 116, 126].

Начиная со второй половины XX столетия, во всем мире отмечен рост не только системных, но и поверхностных форм кандидоза, в том числе, вульвовагинального [74, 80]. Несмотря на значительные успехи в диагностике и лечении, у 75% женщин, по крайней мере, однократно в течение репродуктивного периода жизни наблюдается ВВК [53, 115]. И хотя количество работ, посвященных изучению поверхностных кандидозов, постоянно возрастает, многие вопросы и проблемы остаются не решенными.

До конца не определены формы иммунной защиты при вагинальном кандидозе — клеточный/гуморальный, врожденный/адаптивный иммунный ответ. Часть авторов отводят главную роль Т-клеточному иммунитету [63, 102, 112, 122]. Однако при иммунодефицитах, в частности при ВИЧ-инфекции, частота вагинального кандидоза не повышается, а СПИД-ассоциированной инфекцией является орофарингеальный кандидоз [75, 76, 84, 95]. Многие исследователи указывают на важную роль клеток врожденной иммунной системы, что определяется анатомическими особенностями строения нижнего отдела генитального тракта [53, 59, 60, 78, 79, 112]. Важнейшим механизмом защиты вагинальной слизистой считается выселение в толщу эпителия и на его поверхность лейкоцитов, в основном, нейтрофилов, которые первыми и очень рано выходят из циркулирующей крови в очаг инфекции [14, 24, 46, 74, 101, 132]. Особый интерес представляют данные, подтверждающие функциональную гетерогенность популяции нейтрофильных гранулоцитов [121]. Показано, что часть нейтрофилов отвечает немедленной эффекторной реакцией на встречу с инфекционным агентом, осуществляя фагоцитоз, секреторную дегрануляцию бактерицидных продуктов во внеклеточную среду и формируя NETs - нейтрофильные экстраклеточные ловушки [62, 97, 98, 123]. А другая часть нейтрофилов становится продуцентами различных медиаторов, цитокинов и хемокинов, играя связующую иммунорегуляторную роль между врожденным и адаптивным иммунитетом [71, 72, 135].

До сих пор нет четких представлений не только об инициаторах различных клинических форм вагинального кандидоза, но и о патогенетических механизмах, определяющих развитие острых и хронических форм ВВК. Известно, что острые формы ВВК характерны для молодых, сексуально-активных женщин, у которых манифестация вагинального кандидоза связана, в основном, с эстрогенными факторами риска, либо острый ВВК развивается у иммунокомпрометированных лиц [12, 22]. Тогда как хронические формы ВВК, в том числе рецидивирующие, более чем в половине случаев не связаны с предрасполагающими факторами и встречаются у иммунокомпетентных женщин детородного возраста [51, 74, 111, 113, 114, 122]. Остается не достаточно изученным и влияние патогенетических факторов риска, таких как бактериальный вагиноз или системная нейтропения, на течение различных клинических форм вульвовагинального кандидоза.

Существует еще одна проблема. За последние два десятилетия среди возбудителей ВВК доля грибов Candida non-albicans увеличилась до 15-30%. Многие авторы объясняют данный факт ростом во всем мире популяции иммунокомпрометированных лиц, для которых характерен довольно высокий процент колонизации ротовой полости, кишечника, кожи, в том числе промежности, грибами поп-albicans видов — C.glabrata, C.tropicalis, C.krusei, C.guilliermondii [3, 30, 43, 75, 80, 118], способных выступать в качестве эндогенных источников вагинального кандидоза. В связи с тем, что механизмы иммунной защиты нижнего отдела генитального тракта до конца не ясны, особенно в отношении грибов Candida поп-albicans, но хорошо известна устойчивость последних к современным антифунгальным препаратам, то перед клиницистами стоят серьезные проблемы, связанные с разработкой методов профилактики и лечения таких оппортунистических инфекций.

Цель исследования

Оценить профиль изменений иммунных параметров, характерных для немедленной эффекторной реакции микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови здоровых и больных вульвовагинальным кандидозом в отношении живых изолятов грибов рода Candida различных экологических ниш (клинические вагинальные С.albicans и природные C.guilliermondii) в условиях in vitro, с целью выделения иммунологических маркеров острых и хронических клинических форм вульвовагинального кандидоза.

Задачи исследования

1. Изучить характер немедленной эффекторной фазы (показатели фагоцитарной реакции, экстраклеточный киллинг непоглощенных фагоцитами грибов, уровень цитокинов в супернатантах экстраклеточной среды) микоцидной активности лейкоцитов периферической крови здоровых лиц при культивировании с живыми клиническими вагинальными изолятами C.albicans в условиях in vitro.

2. Оценить иммунные параметры немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови здоровых лиц при культивировании с живыми природными изолятами C.guilliermondii в условиях in vitro.

3. Определить иммунные параметры немедленной эффекторной фазы (показатели фагоцитарной реакции, экстраклеточный киллинг непоглощенных фагоцитами грибов, уровень цитокинов в супернатантах экстраклеточной среды) микоцидной активности лейкоцитов периферической крови больных вульвовагинальным кандидозом при культивировании с живыми клиническими вагинальными изолятами C.albicans.

4. Изучить профили иммунных параметров, характеризующие немедленную эффекторную реакцию микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови больных в зависимости от клинических форм вульвовагинального кандидоза — острые и хронические с редкими и частыми рецидивами, при культивировании с живыми клиническими вагинальными изолятами C.albicans.

5. Оценить влияние патогенетического фактора риска — наличие вагинальных бактериальных ассоциантов в этиологически значимых титрах, на реализацию немедленной эффекторной фазы микоцидной активности лейкоцитов периферической крови больных при различных клинических формах вульвовагинального кандидоза.

Научная новизна

Впервые в условиях in vitro при культивировании лейкоцитов периферической крови (ЛПК) здоровых лиц с живыми изолятами грибов рода Candida различных экологических ниш (природные C.guilliermondii и клинические вагинальные С.albicans) и контрольным штаммом С.albicans АТСС10231 определены особенности немедленной эффекторной реакции (с 15 по 60 минуту) микоцидного ответа: показатели этапов фагоцитоза, выживаемость непоглощенных фагоцитами грибов в экстраклеточной среде, содержание основных цитокинов с про- и противовоспалительным эффектом в супернатантах экстраклеточной среды.

Установлено, что киллинг живых непоглощенных фагоцитами природных грибов C.guilliermondii и клинических вагинальных изолятов С. albicans происходит, в основном, внеклеточно — в среде культивирования с лейкоцитами периферической крови здоровых и больных ВВК в ходе развития немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа (с 15 по 60 минуту). Выживаемость клинических вагинальных изолятов C.albicans в среде культивирования с ЛПК здоровых лиц достоверно выше, чем природных изолятов C.guilliermondii, достоверно нарастает к 60 минуте инкубации и сопровождается достоверно более высокими показателями индекса поглощения лейкоцитами во все сроки наблюдения.

Установлены профили иммунных параметров, характеризующие особенности начального этапа развития (в течение первых 15 минут) немедленной эффекторной фазы микоцидной активности лейкоцитов периферической крови больных в зависимости от клинических форм ВВК

- острые и хронические с редкими и частыми рецидивами, при культивировании с живыми клиническими изолятами C.albicans.

Показано, что профиль иммунных параметров немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа ЛПК имеет различия по содержанию цитокинов в экстраклеточной среде в зависимости от наличия/отсутствия у больных с различными клиническими формами ВВК вагинальных бактериальных ассоциантов в этиологически значимых титрах. При наличии бактериальных ассоциаций у больных острым ВВК наблюдается достоверное снижение уровня IFN-y и повышение уровня IL-IRa, а при хроническом ВВК с редкими и частыми рецидивами наблюдается достоверное повышение уровней TNF-a, IFN-y, и снижение уровня IL-IRa по сравнению с имеющими кандидозную моно-инфекцию.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты оценки характера немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови больных ВВК в отношении живых клинических вагинальных изолятов C.albicans (показателей этапов фагоцитоза, экстраклеточного киллинга непоглощенных фагоцитами грибов, уровней основных цитокинов с про-и противовоспалительным эффектом в супернатантах экстраклеточной среды) позволили установить наличие ассоциаций между клиническими формами ВВК и профилем изменений отдельных иммунных параметров (в первые 15 минут после контакта ЛПК с грибами C.albicans), что позволяет считать их иммунологическими маркерами острых и хронических клинических форм заболевания.

Полученные данные могут быть использованы не только в качестве информативных диагностических тестов в лабораторной практике при дифференциальной диагностике хронических форм вульвовагинального кандидоза, но и служить лабораторными маркерами, позволяющими определить подходы к лечению острых и хронических форм ВВК.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Киллинг живых непоглощенных фагоцитами грибов природных C.guilliermondii и клинических вагинальных C.albicans изолятов происходит внеклеточно — в среде культивирования с лейкоцитами периферической крови здоровых и больных вульвовагинальным кандидозом в ходе развития немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа (с 15 по 60 минуту).

2. Определенные профили иммунных параметров, характеризующие немедленную эффекторную фазу микоцидного ответа (показатели фагоцитарной реакции, экстраклеточный киллинг не фагоцитированных грибов, уровень основных цитокинов в супернатантах среды культивирования) лейкоцитов периферической крови больных вульвовагинальным кандидозом при культивировании с живыми клиническими вагинальными изолятами C.albicans в условиях in vitro, могут использоваться в качестве патогенетически значимых иммунологических маркеров острых и хронических форм вульвовагинального кандидоза.

Апробация работы

Основные положения работы доложены и обсуждены на III конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2003); Научно-практической конференции «Актуальные проблемы микологии» (Челябинск, 2004); IV конференции иммунологов Урала (Уфа, 2005); юбилейной конференции с международным участием «Современные проблемы науки и образования», посвященной 10-летию Российской Академии Естествознания (Москва, 2005); V конференции иммунологов Урала (Оренбург, 2006); Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной памяти профессора Н.Н. Кеворкова «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (Пермь, 2006). Участие в работе Всероссийского конгресса по медицинской микологии (Москва, 2003, 2004, 2005 и 2006); научной конференции «Климат и окружающая среда» (Амстердам, 2006); конференции, посвященной 25-летию ЦНИЛ Челябинской государственной медицинской академии (Челябинск, 2006); Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006); Российском национальном конгрессе аллергологов и иммунологов (Москва, 2006). XI Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ.

Внедрение результатов исследования

Результаты работы используются в учебном процессе: при преподавании вопросов инфекционной иммунологии, как в лекционном материале, так и на практических занятиях на кафедре микробиологии ГОУ ВПО «Челябинский государственный университет».

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, включает 11 рисунков, 8 таблиц. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы исследования, 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов, библиографического списка литературы, включающего работы 52 отечественных и 84 иностранных авторов, и приложения, включающего 2 рисунка и 4 таблицы.

ВЫВОДЫ

1. Киллинг живых непоглощенных фагоцитами грибов природных C.guilliermondii и клинических вагинальных изолятов C.albicans происходит, в основном, внеклеточно - в среде культивирования с лейкоцитами периферической крови здоровых лиц, в ходе развития немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа (с 15 по 60 минуту). Внеклеточная выживаемость клинических вагинальных изолятов C.albicans достоверно выше, чем природных изолятов C.guilliermondii, достоверно нарастает к 60 минуте инкубации и сопровождается достоверно более высокими показателями индекса поглощения лейкоцитами во все сроки наблюдения.

2. Немедленная эффекторная фаза (с 15 по 60 минуту) микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови больных вульвовагинальным кандидозом при культивировании с живыми клиническими вагинальными изолятами C.albicans характеризуется низкими показателями поглотительной способности фагоцитов, высоким уровнем провоспалительных цитокинов (TNF-a и IFN-y) в экстраклеточной среде культивирования и выживаемостью менее 50% оставшихся непоглощенными грибов (по сравнению с аналогичными показателями, характеризующими ответы лейкоцитов здоровых лиц).

3. При остром вульвовагинальном кандидозе начальный этап (на 15 минуте) немедленной эффекторной реакции микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови характеризуется следующими особенностями: достоверно сниженными показателями индекса поглощения грибов C.albicans-, достоверно высоким уровнем провоспалительных цитокинов (TNF-a и IFN-y) и низким уровнем IL-IRa в среде культивирования по сравнению с аналогичными показателями у больных с хроническими формами и здоровых лиц; показателями выживаемости непоглощенных фагоцитами грибов, равными контролю на 15 минуте и достоверно снижающимися к 60 минуте наблюдения.

4. При хроническом вульвовагинальном кандидозе с редкими эпизодами рецидивов профиль иммунных параметров немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа лейкоцитов характеризуется: низкими значениями всех показателей фагоцитарной реакции, за исключением поглотительной способности (при сравнении с показателями здоровых и больных другими формами вульвовагинального кандидоза); отсутствием динамики выживаемости непоглощенных фагоцитами грибов (с 15 по 60 минуту); слабовыраженным провоспалительным цитокиновым потенциалом экстраклеточной среды по сравнению с острой формой заболевания.

5. При хроническом вульвовагинальном кандидозе с частыми эпизодами рецидивов иммунные параметры немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови имеют наиболее значимые различия, регистрируемые на 15 минуте инкубации с живыми клиническими вагинальными изолятами C.albicans: достоверно высокие показатели индекса поглощения, особенно моноцитами периферической крови, на фоне достоверно низкой выживаемости непоглощенных фагоцитами грибов и достоверно низких уровней провоспалительных цитокинов (TNF-a и IFN-y) по сравнению с аналогичными показателями больных острой формой ВВК.

6. Профиль иммунных параметров немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови имеет различия по содержанию цитокинов в экстраклеточной среде в зависимости от наличия у больных с различными клиническими формами вульвовагинального кандидоза вагинальных бактериальных ассоциантов в этиологически значимых титрах: при наличии бактериальных ассоциаций у больных в острой форме достоверно снижен уровень IFN-y и повышен IL-IRa, а при хронических формах с редкими и частыми рецидивами достоверно повышены уровни TNF-a, IFN-y и снижен уровень IL-IRa, по сравнению с имеющими кандидозную моноинфекцию.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Вульвовагинальный кандидоз (ВВК) является инфекционно-воспалительным заболеванием нижнего отдела генитального тракта женщин, вызванным оппортунистическими грибами рода Candida. Широкая распространенность у здоровых сексуально-активных женщин асимптоматической колонизации влагалища грибами Candida spp. (от 20 до 40%) и высокая частота рецидивов симптоматического генитального кандидоза у иммунокомпетентных пациенток репродуктивного возраста делают ВВК актуальной медицинской проблемой [53, 74, 77, 115].

Основываясь на данных ряда работ [53, 79, 111, 112], демонстрирующих важность клеточных компартаментов врожденной иммунной системы в защите вагинальной слизистой от Candida-инфекции, в частности, полиморфно-ядерных лейкоцитов, дендритных клеток, тканевых макрофагов и моноцитов, мы обратили наше внимание на раннюю, быструю эффекторную фазу (в течение первых 15-60 минут) воспалительного ответа клеток, которая включает фагоцитоз, формирование NETs и секреторную дегрануляцию микробицидных продуктов и различных медиаторов, в том числе цитокинов и хемокинов [33, 48, 49, 52, 61, 62, 72, 73, 97, 123, 135]. В условиях in vitro мы провели оценку иммунных параметров немедленной эффекторной реакции микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови при встречи с антигенами живых изолятов грибов рода Candida, а именно — фагоцитоз и его этапы (показатели фагоцитарной реакции лейкоцитов), дегрануляцию (опосредовано через оценку киллинговых свойств экстраклеточной среды ЛПК в отношении живых грибов, то есть через оценку выживаемости непоглощенных фагоцитами грибов в экстраклеточной среде культивирования лейкоцитов), и цитокиновый ответ этих клеток на встречу с антигеном (содержание основных цитокинов с про- и противовоспалительным эффектом в супернатантах среды культивирования). В работе мы использовали ЛПК - моноциты периферической крови, являющиеся секреторными клетками и активными продуцентами цитокинов, и гранулоциты (нейтрофилы, эозинофилы), так как в свете современных данных нейтрофильные гранулоциты рассматриваются как иммунорегуляторные клетки, являющиеся, в частности, источниками цитокинов IFN-y, TNF-a, IL-8, IL-IRa, и тесно взаимодействующие, в том числе, с моноцитами [61, 72, 73, 92, 135].

Определение всех параметров немедленной эффекторной фазы микоцидной активности (показателей фагоцитарной реакции, экстраклеточного киллинга непоглощенных фагоцитами грибов, уровня основных цитокинов в супернатантах среды культивирования) проводили на лейкоцитах, адгезированных к стеклу в условиях взаимодействия всех клеток и плазменных факторов периферической крови в течение часа инкубации. Получение адгезированных ЛПК, несомненно, являлось фактором праймирования, то есть фактором неспецифической стимуляции, приводящим в состояние повышенной готовности и увеличению активности каждой функции клетки на действие нового стимула - контакт с живыми грибами рода Candida [70, 100, 101]. Адгезия, в общем, и связывание интегринов, в частности, является одним из законов клеточной биологии - поведение клетки контролируется интегриновыми и не-интегриновыми рецепторами. Контроль над полномасштабной активацией нейтрофила при инфекции или повреждении осуществляется через два сигнала: через сигнал, поступивший от связывания интегринов с белками внеклеточного матрикса на клеточных или неклеточных поверхностях, и через сигнал, переданный с поверхностных клеточных рецепторов для воспалительных факторов, цитокинов и хемокинов [100, 101, 136].

Известно, что грибы рода Candida экспрессируют поверхностные молекулы адгезии и инвазивные биомолекулы, которые оказывают влияние на фагоцитировавшие их клетки, повреждая или подавляя метаболизм кислородного взрыва и секрецию перекиси водорода, и способны защищать себя от фагоцитоза, пенетрируя клеточные мембраны фагоцита прорастающими гифами [53, 59, 111, 112]. Инактивация грибов нагреванием исключает их влияние на лиганд-рецепторные взаимодействия с клетками хозяина и фагоцитарную реакцию, поэтому в нашей работе мы использовали живые изоляты грибов рода Candida.

Все исследования были проведены на клетках одних и тех же доноров женского пола при культивировании с двумя клиническими вагинальными изолятами (штамм C.albicans-8 и штамм C.albicans-11) и двумя природными изолятами (штамм C.guilliermondii КБП-3198 и штамм C.guilliermondii КБП-3206). При сравнительном анализе показателей, характеризующих немедленную эффекторную фазу (с 15 по 60 минуту) микоцидной активности ЛПК, мы не обнаружили достоверных различий между штаммами, поэтому рассматривали их как клинические экспертные изоляты C.albicans и природные изоляты C.guilliermondii.

В результате оценки характера немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа ЛПК при культивировании с живыми изолятами грибов рода Candida различных экологических ниш (природные C.guilliermondii, клинические вагинальные C.albicans) мы установили, что киллинг живых непоглощенных фагоцитами природных изолятов

C.guilliermondii и клинических вагинальных изолятов C.albicans происходит внеклеточно — в среде культивирования с лейкоцитами доноров, что соответствует данным других авторов [15, 53, 94, 122, 123]. Наиболее ярким свидетельством этого являются природные изоляты C.guilliermondii, в отношении которых наблюдалась достоверно низкая поглотительная активность лейкоцитов доноров, даже при достоверно высокой, возможно, неспецифической адгезии грибов к ЛПК, и достоверно низкая выживаемость непоглощенных фагоцитами грибов в экстраклеточной среде по сравнению с клиническими вагинальными изолятами C.albicans. Следовательно, чем меньше индекс поглощения, тем больше бластоконидий грибов остается во внеклеточной среде, где они больше погибают под действием кандидацидных продуктов экстраклеточной среды, содержащей агрессивные кислородные радикалы и антимикробных субстанции [2, 14]. Возможно, данные события объяснимы малыми ко-эволюционными связями между природными изолятами и макроорганизмом, так как организм человека не являлся для них хозяином.

Клинические вагинальные изоляты, в отличие от природных грибов C.guilliermondii, демонстрировали более успешную тактику сосуществования с клетками макроорганизма, проявляя вирулентные свойства в отношении ЛПК: достоверно больше поглощались лейкоцитами, достоверно меньше погибали в экстраклеточной среде культивирования, и выживаемость непоглощенных фагоцитами грибов достоверно нарастала к 60 минуте. Вероятно, благодаря тесным эволюционным связям и жесткому селективному отбору клинические изоляты приобрели способность легко адаптироваться к жизни в условиях физиологических экстримов хозяина, обеспечивая себе явные преимущества перед природными изолятами. Нарастание выживаемости с 15 по 60 минуту) непоглощенных клинических изолятов C.albicans в среде культивирования ЛПК доноров может свидетельствовать о хороших адаптационных возможностях C.albicans, а если это так, то стратегия возбудителя должна строится на включении механизмов, обеспечивающих наименьший воспалительный потенциал в месте инвазии при встречи с клетками врожденного иммунитета и гуморальными факторами. Работами многих авторов показана как иммуномодулирующая способность грибов C.albicans или их антигенов индуцировать продукцию множества провоспалительных цитокинов (TNF-a, IL-ф, IL-6, IL-2, GM-CSF, IFN-y), так и иммуносупрессирующая способность маннана, большого гликопротеина микотической клеточной стенки, подавлять воспалительный ответ, приводя к экспрессии генов IL-4, IL-5, IL-IRa и IL-10 [53, 111]. По нашим данным уровни основных цитокинов в супернатантах экстраклеточной среды ЛПК доноров, стимулированных грибами природных изолятов и клинических вагинальных изолятов, в ходе развития немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа (с 15 по 60 минуту) были одинаково низкими.

При оценке характера немедленной эффекторной фазы микоцидной активности ЛПК в качестве контрольного живого объекта мы использовали штамм C.albicans АТСС10231, в отношении которого наблюдалась достоверно высокая поглотительная активность лейкоцитов и достоверно низкая выживаемость непоглощенных фагоцитами грибов по сравнению с клиническими вагинальными изолятами C.albicans. Штамм C.albicans АТСС10231 являлся коллекционным, культивируемым in vitro на питательных средах, не был пассирован через организм человека и, возможно, утратил некоторые вирулентные свойства по сравнению с клиническими изолятами, а поэтому не отвечал критериям экспертного изолята для изучения характера начального этапа микоцидного ответа ЛПК больных вульвовагинальным кандидозом. Поэтому в качестве экспертных были выбраны клинические вагинальные изоляты C.albicans.

Сравнительный анализ немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа ЛПК больных ВВК показал, что грибы живых экспертных изолятов C.albicans поглощаются лейкоцитами достоверно хуже по сравнению с ЛПК здоровых лиц на 15 минуте и на 60 минуте, и индекс поглощения грибов лейкоцитами больных не нарастает к 60 минуте. Выживаемость непоглощенных фагоцитами грибов в среде культивирования с лейкоцитами больных ВВК достоверно ниже через 15 и 60 минут инкубации (по сравнению с ЛПК здоровых), и не изменяется во времени с 15 по 60 минуту. Исходя из наших данных, можно предположить, что основным механизмом киллинга грибов клетками врожденной иммунной системы является внеклеточное убийство в экстраклеточной среде окружения. Усиленный экстраклеточный киллинг грибов лейкоцитами больных, возможно, свидетельствует о повышенной реактивности ЛПК, обеспечивающей немедленный ответ на C.albicans в виде выброса микоцидных продуктов и секреции БАВ, в том числе цитокинов и хемокинов. В результате, в экстраклеточной среде формируется выраженный провоспалительный цитокиновый потенциал (достоверно высокий уровень IFN-y и TNF-a по сравнению с ЛПК доноров). По нашим данным, развитие немедленной эффекторной реакции микоцидной активности ЛПК больных ВВК в отношении клинических вагинальных изолятов C.albicans имеет общие черты с развитием микоцидной активности ЛПК здоровых лиц в отношении природных изолятов - достоверно низкие показатели поглощения грибов, достоверно низкая выживаемость непоглощенных грибов во внеклеточной среде (процент выживаемости как у природных изолятов) без положительной динамики с 15 по 60 минуту.

При сравнительном анализе немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа ЛПК больных в зависимости от клинической формы ВВК, мы установили характерные различия начального этапа (на 15 минуте) микоцидного ответа ЛПК больных с острыми и хроническими фрмами вагинального кандидоза с редкими и частыми эпизодами рецидивов.

Больные острой формой ВВК: 1) достоверно низкая поглотительная способность лейкоцитов по сравнению с показателями групп сравнения больных и здоровых на 15 минуте инкубации, которая имеет положительную динамику во времени (с 15 по 60 минуту); 2) выживаемость непоглощенных фагоцитами грибов в экстраклеточной среде соответствует контролю и достоверно выше показателей больных с частыми рецидивами хронического ВВК на 15 минуте, но достоверно снижается к 60 минуте, становясь равной показателям групп сравнения больных. Возможно, данный феномен связан с нарастанием микоцидной агрессивности экстраклеточной среды к 60 минуте, что определяет положительную динамику внеклеточного киллинга непоглощенных грибов и, в то же время, положительную динамику повышения их поглощения, возможно, активно создаваемого самими грибами. Об агрессивности экстраклеточной среды свидетельствует ее выраженный провоспалительный цитокиновый состав; 3) уровни TNF-a и IFN-y достоверно выше, а уровень IL-IRa достоверно ниже по сравнению с уровнями групп сравнения больных ВВК и здоровых доноров. Развитие острой воспалительной реакции у больных данной группы, возможно, обусловлено встречей с большой дозой и (или) необычным штаммом грибов рода Candida. При наличии сопутствующих вагинальных бактериальных ассоциантов в этиологически значимых титрах - уровень IFN-y в среде культивирования ЛПК достоверно ниже, а уровни IL-8 и IL-IRa достоверно выше по сравнению с имеющими моно-инфекцию. Следовательно, добавление дополнительного стимулирующего фактора в виде сопутствующей микст-инфекции у больных острым ВВК сопровождалось снижением провоспалительного цитокинового потенциала экстраклеточной среды ЛПК. Данная клиническая группа, как мы считаем, не требует назначения иммунокорригирующей терапии, выбор тактики лечения достаточно ограничить назначением антифунгальных препаратов.

Больные хроническим ВВК с редкими эпизодами рецидивов: 1) все показатели фагоцитарной реакции ЛПК, кроме индекса поглощения, отличаются достоверно низкими значениями на 15 минуте инкубации по сравнению с показателями групп сравнения больных и здоровых лиц; 2) отсутствует динамика выживаемости непоглощенных фагоцитами грибов (с 15 по 60 минуту контакта); 3) наблюдается слабовыраженный провоспалительный цитокиновый потенциал экстраклеточной среды по сравнению с больными острой формой ВВК (уровни TNF-a и IFN-y достоверно ниже уровней больных острым ВВК, но достоверно выше контроля, а уровень IL-IRa равен контролю, но достоверно выше уровня больных острым ВВК). Анализ полученных данных позволяет предположить, что для этой группы характерен невысокий потенциал общей микоцидной активности, включающей не только цитокины, но и микробицидные факторы, уровень которых во внеклеточной среде определяется активностью таких процессов, как дегрануляция нейтрофилов, эозинофилов и секреция моноцитов. О недостаточной активности этих клеток может свидетельствовать снижение всех показателей фагоцитарной реакции при наличии положительной динамики поглощения грибов. Такая инертность и низкая реактивность раннего воспалительного ответа клеток врожденного иммунитета, а также достаточно высокие концентрации противовоспалительного цитокина IL-IRa (на одном уровне со здоровыми) в экстраклеточной среде, вероятно, обеспечивают персистенцию хронического воспалительного специфического ответа и поддерживают состояние равновесного паразитизма, что, возможно, сопровождается селекцией устойчивых штаммов грибов и/или сменой возбудителей на виды Candida поп-albicans. При наличии сопутствующих вагинальных бактериальных ассоциантов в этиологически значимых титрах - уровни TNF-a и IFN-y достоверно выше, а уровень IL-IRa достоверно ниже по сравнению с имеющими моно-инфекцию. Следовательно, наличие сопутствующей микст-инфекция у больных хроническим ВВК с редкими эпизодами рецидивов сопровождалось повышением провоспалительного цитокинового потенциала экстраклеточной среды ЛПК. Возможный выбор тактики лечения больных данной клинической группы необходимо направить на стимуляцию фагоцитарной активности лейкоцитов и их микоцидного потенциала.

Больные хроническим рецидивирующим ВВК с частыми эпизодами рецидивов: 1) достоверно высокий на 15 минуте индекс поглощения по сравнению с аналогичными показателями групп сравнения больных. Для этой группы были характерны различия в поглотительной способности моноцитов и нейтрофилов — индекс поглощения грибов моноцитами был равен контролю, в отличие от групп сравнения больных (достоверно ниже показателей контрольной группы), а индекс поглощения нейтрофилами - достоверно ниже контроля. О роли моноцитов/макрофагов в защите от кандидозной инфекции существуют противоречивые мнения. Многие авторы считают, что микоцидная активность моноцитов/макрофагов чрезвычайно низка, и в определенных условиях они могут служить резервуаром бластоконидий C.albicans [88, 96, 112, 122, 125]. Но все авторы отмечают [53, 70, 111, 113], что кандидацидная способность этих лейкоцитов резко активируется под влиянием TNF-a и IFN-y; 2) выживаемость непоглощенных фагоцитами грибов достоверно ниже показателей групп сравнения на 15 минуте, но к 60 минуте контакта возрастает и становится равной показателям групп сравнения больных; 3) уровни TNF-a и IFN-y достоверно выше контроля, равны уровням больных хроническим ВВК с редкими рецидивами, но достоверно ниже уровней больных острым ВВК, а уровень IL-IRa равен контролю и достоверно выше уровня больных острым ВВК, то есть по сравнению с больными острой формой ВВК наблюдается слабовыраженный провоспалительный цитокиновый потенциал экстраклеточной среды. Следовательно, особенностью немедленной эффекторной реакции ЛПК больных данной группы, как мы можем предполагать, является ранняя агрессивность экстраклеточной среды (на 15 минуте), о чем свидетельствует высокий индекс поглощения грибов и низкая выживаемость непоглощенных грибов во внеклеточной среде в данный промежуток времени по сравнению с группами сравнения больных. Чрезмерно быстрая ответная реакция ЛПК, вероятно, не особенно продуктивна, так как нами показано, что к 60 минуте выживаемость грибов повышается, а цитокиновый потенциал среды не изменяется и остается слабо провоспалительным. Развитие такой непродуктивной реакции обусловлено, возможно, низким порогом возбудимости полиморфно-ядерных гранулоцитов на антигены грибов рода Candida. Моноциты больных данной группы, поглощая бластоконидии C.albicans на одном уровне со здоровыми клетками становятся, возможно, своего рода резервуаром для выживания и ускользания грибов от экстраклеточного киллинга. Последующее прорастание и выход грибов Candida spp. через клеточную мембрану моноцита/ макрофага вызывает, даже в низкой дозе, очередное развитие воспалительной реакции со стороны нейтрофилов, находящихся в состоянии высокой реактивности. Такой дисбаланс иммунорегуляторных взаимоотношений между нейтрофилами и моноцитами, возможно, приводит к рецидивирующему характеру течения ВВК в данной группе больных., При наличии сопутствующих вагинальных бактериальных ассоциантов в этиологически значимых титрах — уровень TNF-a и IFN-y в среде культивирования ЛПК выше, а уровень IL-IRa достоверно ниже по сравнению с имеющими моно-инфекцию. Следовательно, наличие сопутствующей микст-инфекции сопровождалось повышением провоспалительного цитокинового потенциала экстраклеточной среды ЛПК. Данная группа больных требует выбора тактики лечения, направленного на снижение реактивного состояния нейтрофилов, стабилизацию клеточных мембран клеток с целью предотвращения чрезмерной дегрануляции и продления ранней фазы воспалительного ответа, нормализацию взаимоотношений между фагоцитами.

Таким образом, анализ показателей (этапов фагоцитарной реакции, внеклеточного киллинга непоглощенных фагоцитами грибов, уровней основных цитокинов с про- и противовоспалительными эффектами в экстраклеточной среде культивирования), характерных для немедленной эффекторной реакции ЛПК в отношении живых изолятов грибов рода Candida различных экологических ниш — природные C.guilliermondii и клинические вагинальные C.albicans, позволил выделить отличительные признаки начального этапа (в течение первых 15 минут) микоцидного ответа лейкоцитов здоровых и больных вульвовагинальным кандидозом лиц, которые ассоциируются не только с экологической нишей изолята природные/клинические) и состоянием организма хозяина — здоровый/больной ВВК, но и с формой клинического течения вульвовагинального кандидоза, что позволит использовать эти показатели в качестве информативных показателей при лабораторной диагностике острых и хронических форм ВВК. Проведенные исследования показали, что в зависимости от наличия/отсутствия у больных с различными клиническими формами ВВК вагинальных бактериальных ассоциантов в этиологически значимых титрах профиль иммунных параметров немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа ЛПК имел различия по содержанию цитокинов в экстраклеточной среде. При наличии бактериальных ассоциаций у больных при остром ВВК наблюдалось достоверное снижение уровня IFN-y и повышение уровня IL-IRa, а при хроническом ВВК с редкими и частыми рецидивами наблюдалось достоверное повышение уровней TNF-a и IFN-y, и снижение уровня IL-IRa по сравнению с имеющими кандидозную моноинфекцию.

Полученные нами результаты свидетельствуют о перспективности проведения дальнейших исследований в данном направлении, а расширение спектра лабораторных иммунологических методов позволит оптимизировать диагностику хронических клинических форм вульвовагинального кандидоза.