Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Гистологическое и иммуноморфологическое исследование аллотрансплантированных почек в раннем постоперационном периоде

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ .ИНСТИТУТ ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ И ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ

; и , На правах рукописи

м,!; ^ УДК [67.083.3+616-091.8]:616-089.843:611.6

ЗАЙДЕНОВ Владимир Анатольевич

ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ И ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ АЛЛОТРАНСПЛАНТИРОВАННЫХ ПОЧЕК В РАННЕМ ПОСТОПЕРАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ

14.00.41 - Трансплантология и искусственные органы

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1997

Работа выполнена в Научно-Исследовательском Институте

Трансплантологии и Искусственных органов Министерства-

здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук И.М. Ильинский

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Л.В. Белецкая Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.Н. Блюмкин член-кор. РАЕН, доктор медицинских наук,-профессор А.П. Милованов

Ведущее учреждение: Научный Центр Хирургии РАМН

Защита диссертации состоится 26 мая 1997 г. в 14 ч. на заседании Диссертационного Совета Д.074.34.01 при НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ, по адресу: 123182 , Москва, ул. Щукинская, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ.

Автореферат диссертации разослан апреля 1997 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат медицинских наук Е.А.Селезнева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

До настоящего времени остается сложной проблемой клиническая дифференциальная диагностика различных видов осложнений в раннем посттрансплантационном периоде, к которому условно можно отнести первые три месяца после операции. Все трупные донорские почки имеют ту или иную степень ишемического повреждения, которое снижает функциональную полноценность трансплантата именно в раннем постоперационном периоде. В эти же сроки возможно развитие острого отторжения трансплантата. Сочетание ишемического повреждения с острым отторжением почки требует выяснения взаимного влияния этих осложнений и тщательного подхода к выбору протокола иммуносупрессивной терапии. Кроме этих основных осложнений не исключено и наличие предсуществутощей патологии донорской почки

(гломерулопефрит, интерстициальный нефрит и др.). Интраоперационно, иногда в течение первых суток после трансплантации, хотя и редко, но возможно развитие сверхострого отторжения аллотрансплантированной трупной почки (АТТП).

В дифференциальной диагностике различных видов патологии АТТП ведущую роль играют результаты морфологического и иммуноморфологического исследования пункционных биоптатов, которые позволяют проводить коррекцию протокола иммуносупрессивной терапии, осуществить контроль ее эффективности и прогнозировать результат лечения. Вместе с тем роль гуморальных факторов (в частности, фиксированных в тканях трансплантата иммуноглобулинов

классов О, М, А и комплемента) при различных видах осложнений, развивающихся в АТТП, остается неяснойг Противоречивы сведения о влиянии ишемических повреждений на вероятность развития в последующем острого отторжения АТТП. Значительное место в патологии" АТТП в раннем постоперационном периоде занимают нарушения в микродиркуляторном русле, причины и механизмы развития которых остаются предметом исследований и дискуссий. Настоящая работа посвящена изучению этих вопросов путем анализа и сопоставления результатов гистологического и иммуноморфологического исследования биоптатов АТТП.

Цель исследования: Изучить особенности патологических процессов в раннем посттрансплантационном периоде на основании анализа и сопоставления результатов гистологического и

иммуноморфологического исследования пункционных биоптатов аллотрансплантированных почек.

Зада чи исследования:

1. Определить значимость гистологических и иммуноморфологических изменений, выявляемых в АТТП при различных степенях их ишемического повреждения.

2. Изучить гистологические и иммуноморфо логические особенности патологического процесса при различных формах острого отторжения АТТП.

3. Выявить особенности фиксации СЗ компонента комплемента в тканях при различных видах осложнений в АТТП.

4. Провести иммуноморфологическое исследование локализации фибрина при различной патологии в тканях АТТП в раннем посттрансплантационном периоде.

Научная новизна исследования: На большом материале с применением статистических методов сопоставлены и проанализированы результаты гистологического и иммуноморфологического методов исследования пункционных биоптатов аллотрансплантированных почек в раннем посттрансплантационном периоде. Анализ гистологических и пммуноморфологических данных позволил установить, что ишемические повреждения донорской почки не увеличивают риск развития острого отторжения.

Впервые обнаружена статистически значимая более частая фиксация иммуноглобулинов класса О в тканях трансплантата почки при интерстициальной форме отторжения по сравнению со смешанной и сосудистой формой отторжения, что свидетельствует о сложном патогенезе данной формы отторжения.

Впервые установлена высокая частота изолированной фиксации СЗ компонента комплемента в структурах аллотрансплантированной почки, независимо от вида ее патологии.

Впервые найдена статистически значимая корреляция между отложением СЗ компонента комплемента и выпадением фибрина в стенках сосудов микроциркуляторного русла аллотрансплантированных почек при патологии в раннем постоперационном периоде.

_Практическая ценность исследования:

На основании проведенных исследований рекомендуется использовать иммуноморфологические методы в комплексном изучении пункционных биоптатов аллотрансплантированных почек, что обеспечивает более точную диагностику патологии.

Установлено, что ишемическое повреждение не увеличивает риск развития острого отторжения аллотрансплантированных почек. Поэтому большом с отсроченной функцией при отсутствии клинических и морфологических проявлений острого отторжения рекомендуется проведение щадящей иммуносупрессивной терапии для более быстрой регенерации и восстановления функции почки.

Результаты исследований свидетельствуют в пользу проведения плановых пункционных биопсий

аллотрансплантированных почек в раннем постоперационном периоде (первые 3 месяца) в связи с высоким риском развития в этот период субклинических эпизодов острого отторжения.

Показана высокая информативность

иммуноморфологического метода выявления фибрина, своевременное обнаружение которого в микроциркуляторных сосудах аллотрансплантированной почки позволит осуществлять у больных соответствующую коррекцию антикоагулянтной и фибринолитической терапии.

Реализация результатов исследования:

Результаты исследования нашли клиническое применение в отделениях пересадки почки НИИТ и ИО МЗ РФ, в Московском нефрологическом центре, МОНИКИ, Республиканской детской клинической больнице, 7-ой городской больнице.

Апробация работы:

Материалы и основные положения работы были доложены и обсуждены на заседании Научного общества трансплантологов г.Москвы и Московской области ( 29 марта 1996 г.), на первом Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, октябрь 1996г.), на конференции в лаборатории трансплантационной иммунологии НИИТ и ИО МЗМП РФ (декабрь 1996 г.)

Публикации:

По теме диссертации опубликовано 7 печатных научных трудов.

Объем и структура работы:

Диссертация состоит из введения, трех глав (обзор литературы, материал и методы исследования, собственные исследования), выводов, практических рекомендаций и указателя

использованной литературы. Работа изложена на ____ страницах

машинописи, иллюстрирована .... таблицами и ____рисунками, из

них .... микрофотографий. Список литературы включает .... названий на русском и .... на иностранных языках.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

С октября 1992 по декабрь 1995 гг. проведено исследование 336 пункционных биоптатов АТТП у 230 пациентов, среди которых было 139 мужчин и 91 женщина. Средний возраст пациентов был 34 года ( от 14 до 63 лет). У подавляющего большинства больных по клиническим данным терминальная стадия ХПН развилась вследствие хронического гломерулонефрита, гораздо реже причиной ХПН были другие заболевания (хронический пиелонефрит, почечнокаменная

болезнь, поликистоз почек, врожденная дисплазия почек и др.). Количество пункционных биопсий, проведенных одному больному, было различным: 1 - у 159 (69,2%), 2 - у 47 (20,4%), 3 - у 15 (6,5%), 4 - у 7(3,0%), 5 - у 2-х (0,9%) пациентов .

Для гистологического исследования один образец материала пункционных биопсий фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали в спиртах восходящей крепости и заливали в парафин. Из парафиновых блоков готовили срезы толщиной 4-5 мкм и окрашивали их гематоксилином и эозином, а в случае необходимости производили дополнительную обработку срезов (по Ван-Гизону и . Шифф-реактивом). Исследование гистологических препаратов проводили в световом микроскопе при увеличениях хЮО, х400 и хЮОО.

Второй биоптат помещали в среду Tissue-Tek (Miles) и замораживали в жидком азоте. В криостате делали серийные срезы толщиной 6 мкм, переносили их на предметные стекла и подсушивали препараты 30 минут при комнатной температуре. После этого на срезы на 2 минуты наносили PBS , а затем обрабатывали меченными FITC антителами кролика к Ig G, М, А, СЗ и фибрину. После инкубации срезов во. влажной камере в течение 30 минут при комнатной температуре их трижды промывали в PBS и заключали в 60% нейтральный глицерин (Л.В.Белецкая и Т.А. Данилова, 1977).

Материал иммуноморфологического исследования включает 203 пункционных биоптата АТТП, полученных у 145 больных в различные сроки после пересадки почки.

Препараты исследовали в люминесцентном микроскопе Laborlux S (Leika) при увеличениях х400, хбЗО, хЮОО. Оценка степени фиксации иммуноглобулинов и комплемента в срезах

осуществлялась полуколичественным методом по градации интенсивности свечения: отрицательная реакция (-), слабая степень (1+), средняя степень (2+) и высокая степень (3+). При статистической обработке материала применяли критерий "%2", который для Р<0,05 принимали > 3,841, для р<0,02 - > 5,412, для р<0,01 - S 6,635, а для р<0,001 - > 10,8.

Фотографирование препаратов осуществляли на пленку РФ-3 с использованием фотоаппаратуры фирмы Leika.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Гистологическое и иммуноморфологическое исследование пункционных биоигатов аллотравсилантированных почек при их ишемическом повреждении.

При использовании световой микроскопии различные степени ипхемического повреждения АТТП были выявлены во всех пункционных биоптатах (181 из 336), полученных в сроки от 1 часа до 1 месяца после операции, т.е. более чем в половине (53,8 %) исследованного материала. Однако в 139 пункционных биоптаптах (76,7 %) была легкая степень ишемического повреждения, и только в 42 (23,30 %) диагностирована 2-4 степень ишемического повреждения АТТП.

Минимальные проявления ишемического повреждения были найдены практически во всех случаях (9 больных), когда пункционные биопсии брались через один час после включения почки в кровоток. Морфологической особенностью ишемического повреждейия в этих биоптатах являлось наличие в просвете канальцев кортикального слоя и, особенно, в просвете собирательных трубочек мозгового слоя десквамированных комплексов эпителиальных клеток с пикнотичными

гиперхромными ядрами. Однако это не является признаком,_

определяющим степень ишемического повреждения донорской почки, так как такие комплексы десквамированных эпителиальных клеток встречаются и при немедленной и при отсроченной функции трансплантатов, а также в первично нефункционирующих почках. Оценка степени ишемического повреждения по данным исследования таких пункционных биоптатов не является достоверной - из 9 больных, которым были выполнены одночасовые пункционные биопсии и гистологически определены минимальные проявления ишемического повреждения, у 2-х больных была отсроченная функция АТТП. В повторных пункционных биоптатах, выполненных у этих 2-х больных через 4 и 7-суток было найдено ишемическое повреждение средней степени, и восстановление функции трансплантатов наступило лишь к концу 1-ого месяца после операции. По нашему мнению, это объясняется тем, что на светооптическом уровне ишемические изменения в эпителиальных клетках канальцев почки выявляются не ранее, чем через 6-12 часов после включения ее в кровоток.

В пункционных биоптатах, выполненных в течение 1-ой послеоперационной недели, при легкой степени ишемического повреждения гистологически имели место незначительные дистрофические изменения в эпителиальных клетках извитых канальцев трансплантата. Часто эта степень ишемического повреждения характеризовалась по данным клиницистов ранней полиурической фазой при сниженной в первые недели концентрационной способности.

Вторая (средняя) степень ишемического повреждения АТТП была диагностирована в 26 пункционных биоптатах и

гистологически характеризовалась дистрофическими

изменениями в эпителиальных клетках канальцев кортикального слоя, которые по сравнению с первой степенью были более выражены по распространенности (диффузность поражения) и по степени - преобладали гиалиново-капельная и даже гидропическая формы дистрофических изменений. Функционально это проявлялось олигоурией или анурией. Восстановление функции АТТП наступало к концу 4-6 недели после операции.

Третья (тяжелая ) степень ишемического повреждения имела место в 12 пункционных биоптатах, в которых гистологически выявлены резко выраженные дистрофические изменения. Гидропическая дистрофия, вызывающая резкий отек эпителия, приводила к исчезновению просветов в извитых канальцах, часть эпителиальных клеток при этом была некротизирована, отдельные десквамированные клетки эпителия попадали в просвет канальцев. При хорошей выраженности регенерации 5 трансплантатов у этой группы больных восстановили функцию через 5-7 недель, а один трансплантат даже к концу 2-го месяца после операции. У 2-х больных в связи с необратимыми ишемическими повреждениями функция не восстановилась, и была произведена трансплантатэктомия.

Четвертая (очень тяжелая) степень ишемического повреждения АТТП диагностирована в 4 пункционных биоптатах, в них гистологически выявлен острый канальцевый некроз. В функциональном отношении это были первично нефункционирующие трансплантаты, которые были удалены.

Уже в сроки примерно через неделю после трансплантации возможно развитие острой циклоспориновой нефротоксичности с

появлением особого вида дистрофии эпителиальных клеток кортикального слоя, получившей название изометрической вакуолизации. При выраженной острой циклоспориновой нефротоксичности гистологическая диагностика не вызывает затруднений. Однако при сочетании ишемического повреждения АТТП с острой циклоспориновой нефротоксичностью могут возникнуть определенные трудности и для точной диагностики требуется тщательный клинико-морфологический анализ.

Частота развития острого отторжения при 2-4 степенях ишемического повреждения АТТП выше, чем при 1 степени. Однако эти различия статистически не значимы.

Выявляемость иммуноглобулинов различных классов, фиксированных в тканях АТТП, во всех 203 пункционных биоптатах, полученных как в ранний, так и в поздний период после трансплантации, равнялась для - 62,5% , 1йМ - 60,1% и 1§А-2Э,0%. Чаще всего они выявлялись в области базальных мембран клубочков, несколько реже в стенке артерий, капиллярах интерстиция и значительно более редко встречались в базальных мембранах канальцев кортикального слоя АТТП.

При ишемическом повреждении АТТП иммуноглобулины различных классов также чаще всего выявлялись в капиллярах клубочков, реже в стенке артерий и еще реже в стенке перитубулярных капилляров и интерстиции. Также как и при других осложнениях в АТТП при ишемическом повреждении чаще имело место отложение иммуноглобулинов классов в яМ. Отмечено статистически значимое (р<0,05) более частое выявление иммуноглобулинов класса в по сравнению с иммуноглобулинами класса А.

Статистический анализ не выявил различия частоты отложения иммуноглобулинов в зависимости от степени ишемического повреждения и от наличия или отсутствия сочетания с острым отторжением. Не выявлено различий в частоте выявления иммуноглобулинов при остром отторжении в ранние сроки (до 1мес. после операции), когда она сочетается с ишемическим повреждением АТТП, и при остром отторжении в более поздние (>1мес.) сроки.

При ишемическом повреждении АТТП в значительной части пункционных биоптатов (82 %) найдена фиксация СЗ-компонента комплемента в структурах микроциркуляторного русла почки. Между частотой фиксации СЗ и выявлением выпадения фибрина в микроциркуляторных структурах имеется высокая степень корреляции (р<0,01). Наличие в сосудистых стенках фибрина свидетельствует о повышении сосудистой проницаемости. Можно полагать, что отложение комплемента в сосудистой стенке является одним из важных факторов в нарушении сосудистой проницаемости.

Таким образом при исследовании пункционных биоптатов АТТП с применением гистологических и

иммуноморфологических методов установлено, что ишемическое повреждение не увеличивает риск развития острого отторжения. Поэтому при 2-3 степенях ишемического повреждения (отсроченная функция трансплантата) при отсутствии клинических и морфологических проявлений острого отторжения следует рекомендовать щадящую иммуносупрессивную терапию для уменьшения токсического действия препаратов, что будет способствовать ускорению регенераторных процессов в трансплантированной почке.

Гистологическое и иммуиоморфологическое исследование пункционных биоптатов АТТПпри остром отторжении

Результаты анализа нашего материала подтвердили, что острое отторжение АТТП - самое частое осложнение, приводившее к снижению функции трансплантата. Эта патология была выявлена в 44,4% от всех исследованных пункционных биоптатов.

В условиях традиционной иммуносупрессивной терапии опасность развития острого отторжения АТТП зависит от сроков после операции. В первую неделю после операции острое отторжение развивается достоверно реже (23,8 %), чем в более поздний (от одной недели до трех месяцев) период (61,5 % и 71,7 % при р<0,001), т.е. наибольший риск острого отторжения существует в ранний постоперационный период, исключая первую постоперационную неделю. Позднее наступает значительное снижение опасности развития острого отторжения: в сроки от трех месяцев до одного года - 37,5 % ( р<0,001), а в сроки более года еще большее снижение (14,5 %) по сравнению с предыдущим периодом (р<0,01).

В связи с тем, что не у всех больных острое отторжение АТТП проявляется клинически и может протекать скрыто, а опасность его развития особенно высока в раннем посттрансплантационном периоде, мы считаем необходимым даже при удовлетворительной функции трансплантата при выписке больных в сроки первых 3-6 месяцев после операции проводить контрольные пункционные биопсии АТТП. Целесообразность такого подхода подтверждается данными D.N. Rush et al. (1994, 1995), которые установили, что субклинические кризы острого отторжения позднее приводят к

снижению функции трансплантатов. По данным этих авторов субклинические кризы выявляются в 30% АТТП с удовлетворительной функцией.

Результаты исследования показали, что частота развития разных форм острого отторжения варьирует в зависимости от сроков, прошедших после операции. Интерстициальная форма, как правило, развивается в ранние сроки после операции. Наибольший риск развития интерстициалъной формы острого отторжения существует в первые три месяца после аллотрансплантации почки. В более поздние сроки (до 1 года) частота интерстициалъной формы, по нашим данным, снижается примерно в два раза, однако статистически это различие не достоверно (р >0,05). В сроки более поздние, чем 1 год, интерстициальная форма острого отторжения АТТП не встречалась (р < 0,01).

Интерстициально-сосудистая форма острого отторжения в первую неделю после операции встречалась реже, чем в сроки от 0,25 - 3 месяцев (р < 0,001). В более поздние сроки вновь происходит снижение риска развития интерстпциально-сосудистой формы острого отторжения (р < 0,05).

Сосудистая форма острого отторжения имеет тенденцию к нарастанию частоты с увеличением сроков после операции, однако эти различия статистически не значимы (р > 0,05).

При повторных АТТП острое отторжение развивается достоверно чаще (р<0,02), чем при первичных АТТП. Причем это происходит за счет увеличения частоты развития интерстициально-сосудистой формы острого отторжения, а интерстициальная форма отмечена в обеих группах наблюдений примерно с одинаковой частотой. Различия в частоте выявления

иммуноглобулинов различных классов при первичной и повторных АТТП статистически не значимы (р>0,05).

Возможно, в патогенезе интерстициальной формы острого отторжения АТТП определенную роль играют иммуноглобулины (антитела). Иммуноглобулины класса О , были выявлены в стенках интерстициальных сосудов и капилляров клубочков в 86,3% наблюдений при интерстициальной форме, а при интерстициально-сосудистой форме острого отторжения иммуноглобулины этого класса встречались достоверно реже (р<0.05) - в 61,5%. Отложение иммуноглобулинов в в стенках капилляров клубочков при интерстициальной форме острого отторжения имело линейный характер, а интенсивность свечения была от слабой (+) до выраженной (+++).

Иммуноглобулины класса М в стенках сосудов при интерстициальной форме острого отторжения встречались статистически достоверно реже (р<0.05), чем иммуноглобулины класса в. Однако различия в частоте выявления иммуноглобулинов класса М при различных формах острого отторжения статистически не достоверны (р>0.05): интерстициальная -52.1%, интерстициально-сосудистая - 69,2%, сосудистая форма -42,8%. Отложения иммуноглобулинов класса М в клубочках и сосудах часто имели гранулярный характер и интенсивность свечения была умеренной.

Иммуноглобулины класса А встречались примерно с одинаковой частотой при интерстициальной и интерстициально-сосудистой формах (43,4% и 41,3% соответственно), но отсутствовали при сосудистой форме острого отторжения (р<0.05). Особенностью локализации иммуноглобулинов класса

было их присутствие преимущественно в мезангии клубочков.

Известно, что фиксация иммуноглобулинов в стенках сосудов АТТП при различных формах острого отторжения может сопровождаться активацией каскада реакций комплемента. Продукты расщепления первых компонентов комплемента влияют на локализацию, активацию и эффекторные функции тромбоцитов, гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов, а образование мембраноатакующих комплексов может вызывать повреждение клеток.

По нашим данным, частота фиксации СЗ-компонента комплемента при остром отторжении весьма высокая. Однако не было выявлено статистически значимых различий частоты отложения СЗ-компонента комплемента в зависимости от формы острого отторжения (р>0.05).

Таким образом, в связи с тем, что рнск развития острого отторжения АТТП наибольший в первые три месяца после операции и у части больных оно протекает в субклинической форме, считаем необходимым проведение плановых пункционных биопсий трансплантатов даже при их удовлетворительной функции в раннем постоперационном периоде (в сроки от одной недели до трех месяцев). Это позволит своевременно проводить соответствующую терапию. При интерстициальной форме острого отторжения

аллотрансплантированной почки иммуноглобулины класса О выявляются чаще, чем при интерстициально-сосудистой и сосудистой формах (р<0.05). При сосудистой форме острого отторжения аллотрансплантированной почки иммуноглобулины класса А не были выявлены (р<0,05).

Изолированная фиксация СЗ компонента комплемента Третий компонент комплемента (СЗ) является мультифункциональным гликопротеином, который

взаимодействует с различными сывороточными белками, рецепторами клеток и мембраноассоциированными регуляторными белками. Эти взаимодействия ведут к различным биологическим эффектам, включая иммунный цитолиз, увеличение проницаемости сосудов, сокращение гладкой мускулатуры, солюбшшзацию иммунных комплексов и многие другие (J.L. Platt et al., 1991; H.S. Murphy et al., 1992). Общеизвестен процесс связывания компонентов комплемента с комплексами антиген-антитело in situ шги в кровяном русле с последующей фиксацией в тканях. При этом комплемент может реализовать цитотоксические и анафилактогенные эффекты, что является одним из главных звеньев в цепи разворачивающихся патофизиологических событий. Как уже говорилось, при иммунофлюоресцентном исследовании пункционных биоптатов АТТП нами была обнаружена характерная картина фиксации иммуноглобулинов, СЗ компонента комплемента и фибрина , что отражало разнообразную иммунопатологию, описанную в литературе. Наряду с этим мы часто находили фиксацию СЗ компонента комплемента в различных структурах АТТП при отсутствии в них иммунных комплексов, то есть иммуноглобулины в этих структурах не были выявлены. Отмечено три варианта такой изолированной фиксации СЗ компонента комплемента:

1) в стенке капилляров клубочков, преимущественно на эвдотелиальных клетках, но также и в области базальных мембран капилляров;

2) в стенках артерий разного калибра и артериолах, причем СЗ локализовался преимущественно в мышечном слое, хотя его можно было обнаружить и в интиме, и в адвентиции сосудов;

3) в клетках эпителия канальцев (преимущественно у основания) и по тубулярным базальным мембранам.

Данный феномен наблюдался как в ранние, так и в поздние сроки после трансплантации почки. Статистический анализ показал отсутствие значимого различия частоты фиксации СЗ компонента комплемента в структурах

алллотрансплантированной почки в зависимости от сроков, прошедших после операции. Чаще всего изолированную фиксацию СЗ компонента комплемента наблюдали в области канальцев кортикального слоя (35,7%), реже в стенке сосудов трансплантата (17,1%) и еще реже (5,5%) в стенке капилляров клубочков (р<0,001).

Изолированная фиксация СЗ компонента комплемента встречалась с различной частотой в зависимости от вида патологии аллотрансплантированных почек. Однако статистический анализ не выявил достоверности различия в большинстве групп, за исключением того, что при хроническом отторжении фиксация СЗ компонента комплемента на эпителиальных клетках извитых канальцев происходила достоверно чаще, чем при ишемическом повреждении и хронической циклоспориновой нефротоксичности(р<0,05).

Сведения о локализации СЗ в почечных аллотрансплантатах разнородны. В одной из обзорных работ упоминается о наблюдении изолированной фиксации СЗ в стенках сосудов и связи этого явления со стероидрезистентными кризами отторжения ("\¥.М.Ва1сЬуи1 et а!., 1995). В работе С. 8уа1апс1ег с

соавт. (1993) описывается фиксация СЗ компонента в отсутствии иммуноглобулинов в биопсиях почек у больных в ранние сроки после пересадки. Авторы отмечают преимущественную локализацию СЗ в капиллярах гломерул. Этот феномен наблюдался в сочетании с интрагломерулярным скоплением макрофагов. Авторы считают, что это прогностически плохой признак, т.к. он сопровождался значительным ухудшением функции почек и у многих больных впоследствии трансплантат был удален. В наших наблюдениях мы не обнаруживали заметного количества интрагломерулярных макрофагов, и в гломерулах аналогичного явления не отмечали, что может быть связано с частой фиксацией в их структурах иммунных комплексов различного генеза и соответствующей маскировкой изолированного СЗ.

Выявление СЗ компонента без связи с иммуноглобулинами может иметь несколько вариантов объяснения. Возможно участие в фиксации СЗ иммуноглобулинов, количество которых столь незначительно, что их не удавалось выявить методом иммунофлюоресценции. В ряде работ (Е. Johnson et G. Hetland, 1991; R.A.Brooimans et al., 1991) показана возможность синтеза СЗ in situ гломерулярными и тубулоинтерстициальными клетками почек в условиях модулирующего эффекта определенных цитокинов . Нельзя исключить и экспрессию СЗ-рецепторных сайтов определенными структурами почки при развитии той или иной патологии (B.Wahlin et al., 1983; Н. Rosen et S.K. Law, 1990).

Наличие СЗ может вести к активации каскада реакций с образованием анафилатоксинов и/или мембранатакующего комплекса, что может приводить к увеличению сосудистой

проницаемости, сокращениям гладкомышечных клеток и спазму сосудов трансплантата, а также к цитотоксическим эффектам (J.L. Platt et al., 1991; H.S.Murphy et al., 1992). Однако известно, что активация и многочисленные эффекты системы комплемента хорошо контролируются. Специфические ингибиторы присутствуют в плазме и на клеточных мембранах (М.С. Carrol et al., 1988). В аллотрансплантированной почке такая регуляция функции комплемента может нарушаться по целому ряду причин (ишемия, криз отторжения). Для оценки генеза и значения этого феномена при остром и хроническом отторжении необходимо дальнейшее изучение всех звеньев каскада реакций комплемента в структурах АТТП и клинпко-морфологический анализ.

Таким образом, как в раннем, так и в позднем посттрансплантационном периоде в различных структурах АТТП нередко встречается изолированная фиксация СЗ компонента комплемента; наиболее часто это наблюдается в эпителиальных клетках канальцев (35.7% наблюдений), реже в стенках артерий и артериол (17.1% наблюдений) и еще реже в капиллярах клубочков (5,5% наблюдений) . Патофизиологическое значение изолированной фиксации СЗ компонента комплемента в тканях трансплантата почки остается неясным, но следует полагать, что это явление может влиять на функцию трансплантированной почки.

Нарушение микроциркуляции

В сложной проблеме нарушения микроциркуляции при патологии АТТП важное место занимает вопрос о формировании фибрина в в артериолах, капиллярах и венулах трансплантата.

По представлению ряда исследователей (Y. Wang et al, 1996) нарушения в системе тромбообразования связаны в основном с реакцией отторжения гуморального типа, которое развивается в наиболее выраженной форме в ранние сроки после пересадки (Е. Hammond et al., 1992).

При исследовании пункционных биоптатов АТТП в раннем послеоперационном периоде методом иммунофлюоресценции с использованием антител к фибрину мы часто находили отложения фибрина в фибриллярной форме в интерстициальной ткани трансплантата, реже в клубочках ( в просвете боуменовой капсулы и мезангии), а также в просвете канальцев. Более редкой находкой было обнаружение фибрина в просвете артерий различного калибра. Эти наблюдения, как правило, совпадали с данными гистологического исследования, хотя

иммунофлюоресцентное исследование выявляло фибрин более селективно. Однако наше внимание привлекло выявление фибрина в виде гранул шаровидной формы различного диаметра в просвете капилляров ингерстиция и клубочков и реже в просвете артериол, боуменовой капсулы и канальцев. Когда мы первоначально обнаружили гранулы фибрина в микроциркуляторном русле АТТП были определенные сомнения в достоверности этого явления, так как традиционно при иммуногистохимическом исследовании фибрин наблюдался в виде фибрилл. Для подтверждения результатов иммунофлюоресцентного исследования был проведен гистохимический анализ с использованием а -плазмина. Предварительная обработка срезов этим ферментом в течение различного времени от 20 мин до 18 час при 37°С приводила к гидролизу гранулярного материала в просвете капилляров и

артериол трансплантата и отменяла последующее выявление фибрина. Фибрин в интерстнциалыкж ткани поддавался гидролизу значительно труднее, что связано, по-видимому, с более высокой степенью полимеризации фибрина. Это наблюдение совпадает со сведениями о том, что высокополимерный фибрин тромбов крупных сосудов подвергается гидролизу в течение нескольких дней.

Следует отметить, что фибрин в виде гранул в мпкроциркуляторном русле АТТП обнаруживался только при иммунофлюоресцентиом исследовании, в то время как при исследовании гистологических препаратов его выявить не удавалось. Таким образом, обнаружение гранул фибрина в микроциркуляторном русле иммуногистохимическим методом может служить маркером ранних проявлений коагулопатии в АТТП.

Исходя из современных представлений об эффекторных механизмах повреждения аллотрансплантированных органов следует полагать, что процесс тромбообразования носит местный характер и происходит in situ в тканях трансплантата. Активированные Т-клетки и антитела, направленные против HLA антигенов, а также продукты активированиых макрофагов, вызывают нарушение равновесия в системе плазмпноген-плазмин, что завершается полимеризацией фибрина и образованием гранулярного материала и микротромбов. Это ведет к ишемизации тканей аллотрансплантата. Для профилактики развития и лечения таких нарушений необходимы поиски путей местной коррекции системы, препятствующей образованию фибрина и микротромбов.

ВЫВОДЫ

__V

1. При иммуиоморфологическом исследовании 203 пункционных биоптатов, полученных от 145 больных в различные сроки после пересадки почки, фиксированные в тканях в были выявлены в 62,5% случаев, М - в 60,1%, ^ А - в 29,0%. При интерстициальной форме острого отторжения фиксация иммуноглобулинов класса " в в тканях аллотрансплантированной трупной почки выявляется чаще, чем при интерстнциально-сосудистой и сосудистой формах (р<0.05). При сосудистой форме острого отторжения фиксация иммуноглобулинов класса А не выявляется (р<0.05).

2. По данным морфологического исследования пункционных биоптатов развитие острого отторжения аллотрансплантированной почки наиболее вероятно в первые три месяца после операции (р<0.05). Ишемическое повреждение донорских почек не увеличивает риск ' развития острого отторжения аллотрансплантированых почек, т.к. различие в количестве эпизодов острого отторжения в группах больных с отсроченной и немедленной функцией трансплантатов было статистически не значимым (р>0.05).

3. Как в раннем, так и в позднем посттрансплантационном периоде наблюдается изолированная фиксация СЗ компонента комплемента в различных структурах аллотрансплантированной почки: наиболее часто в эпителиальных клетках (35.7%), реже -в стенках артерий и артериол (17.1%), и еще реже (5.5%) - в капиллярах клубочков (р<0,001).

4. Существует высокая степень (р<0,001) корреляции между отложением СЗ-компонента комплемента и выпадением фибрина в стенках сосудов микроциркуляторного русла

аллотрансплантированных почек при патологии в раппем постоперационном периоде.

5. Иммуноморфологический метод позволяет выявить в биоптатах аллотрансплантированных почек в большом числе случаев наличие фибрина в просвете сосудов микроциркуляторного русла в виде гранул шаровидной формы различного диаметра, что рассматривается нами, как маркер ранних проявлений коагулопатии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для обеспечения более точной диагностики патологии аллотрансплантированных трупных почек в комплексном исследовании пункционных биоптатов трансплантатов рекомендуется использовать иммуноморфологпческие методы.

2. В связи с тем, что ишемическое повреждение не увеличивает риск развития острого отторжения аллотрансплантированных почек, больным с отсроченной функцией при отсутствии клинических и морфологических проявлений острого отторжения рекомендуется назначение щадящей иммуносупрессивной терапии, способствующей регенерации тканей органа.

3. Риск развития острого отторжения аллотрансплантированной почки наибольший в первые три месяца после операции и у части больных оно протекает в субклинической форме. Поэтому считаем необходимым проведение плановых пункционных биопсий трансплантатов даже при их удовлетворительной функции в раннем постоперационном периоде (в сроки от одной недели до трех месяцев).

4. Иммуноморфологическое исследование позволяет обнаруживать ранние признаки коагулопатии в аллотрансплантированных почках в раннем постоперациониом периоде (появление шаровидных гранул фибрина в мпкроциркуляторном русле трансплантата), до того, как их удается выявить при применении обычных гистологических методов. Поэтому рекомендуется проводить это исследование для своевременной терапии микроциркуляторных нарушений в аллотрансплантированной почке.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Гистологическое и иммуноморфологическое исследование пункционных биоптатов аллотрансплантированных трупных почек при их ишемическом повреждении. Трансплантология и искусственные органы, 1996, N.3, С.30-34. (соавт. В.И. Шумаков, И.М. Ильинский, Л.В. Белецкая, Ф.С. Баранова, В.В.Тырин, Я.Г. Мойсюк).

2. Гистологическое и иммуноморфологическое исследование пункционных биоптатов аллотрансплантированных трупных почек при острой реакции отторжения. Трансплантология и искусственные органы, 1996, N.4, С.82-87. (соавт.И.М. Ильинский, Л.В. Белецкая, Ф.С. Баранова, В.В. Тырин, Я-Г. Мойсюк, Е.С. Столяревич, H.A. Томилина).

3. Изолированная фиксация СЗ компонента комплемента в структурах почечных аллотрансплантатов. Трансплантология и искусственные органы, 1997 (принято в печать) (соавт. В.И. Шумаков, Л.В. Белецкая, И.М. Ильинский, Ф.С. Баранова, В.В. Тырин, Я.Г. Мойсюк, H.A. Томилина)

4. Выявление гранул фибрина и микротромбов в микроциркуляторном русле аллотрансплантата сердца и почки. Трансплантология и искусственные органы, 1997 (принято в печать) (соавт. JI.B. Белецкая, А.Б. Косарез, Н.А. Арефьева, А.Я. Кормер, В.В. Тырин, Б.Н. Морозов, Ф.С. Баранова).

5. Клинико-морфологическце сопоставления после трансплантации почки. Первый российский съезд нефрологов. Тезисы докл. Казань, октябрь 1994. (соавт. И.М. Ильинский, JI.C. Бирюкова, Л.В. Белецкая, В.В. Тырин, С.М. Арутюнян)."

6. Myocardial vessels in the late period after human heart allotransplantation. Intern. Symp. on the Etiology and Pathobiology of Transplant Vascular Sclerosis. March 1995.(соавт. А.Я. Кормер, Е.И. Рябоштанова, З.А. Халимова, Л.В.Белецкая).

7. Клеточная и молекулярная биология хронического отторжения. Первый российский конгресс по патофизиологии. Тезисы докл. Москва, 17-19 октября 1996, С.313. (соавт.Ф.С. Баранова, Л.В. Белецкая, С.Д. Борозденкова, И.М. Ильинский).

Работа выполнена в лаборатории клинической иммунологии НИИТ и ЙО. Автор выражает глубокую благодарность зав. лабораторией кандидату биологических наук Ф.С. Барановой за оказание постоянной помощи в исследованиях и обсуждение материала диссертации.