Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Гистологические и иммуногистохимические особенности структуры селезенки у больных апластической анемией

'ф-0034ииэ.*

На правах рукописи

УДК: 616.155.194.7:616.411-018-07

Дьяконов Дмитрий Андреевич

ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ СЕЛЕЗЕНКИ У БОЛЬНЫХ АПЛАСТИЧЕСКОЙ АНЕМИЕЙ

14.00.29 - гематология и переливание крови 14.00.36 - аллергология и иммунология

2 2 ОПТ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2009

003480971

Диссертация выполнена в ФГУ "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови ФМБА России" (директор - д-р мед. наук, проф. С.Л. Шарыгин) в лаборатории патоморфологии крови (руководитель - канд. мед. наук Н.С. Федоровская).

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Федоровская Нина Афанасьевна кандидат медицинский наук Федоровская Надежда Станиславовна

Официальные оппоненты:

доктор мед. наук, профессор Ругаль Виктор Иванович

доктор мед. наук, профессор Калинина Наталья Михайловна

Ведущая организация: Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова

Защита диссертации состоится «/.^ » Н^-РДл^с^ 2009 года в^? часов на заседании Диссертационного совета Д 208.074.01 Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии МЗ РФ по адресу: 193024, г. Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии.

Автореферат разослан «_»_2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Т.В. Глазанова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Апластическая анемия (АА) редкое и тяжелое заболевание системы крови с высокой летальностью, характеризующееся замещением клеточного костного мозга (КМ) жировым и, как следствие, костномозговой недостаточностью и панцитопенией в периферической крови [Ано-шина М.Ю. и др., 2005; Розанова O.E., 2005].

Спленэктомия (СЭ) входит в программу комбинированной иммуносу-прессивной терапии (ИСТ) больных АА. Известно, что удаление селезенки у этих пациентов рассматривается как альтернативный антилимфоцитарному глобулину метод лечения нетяжелой АА (НАА). При тяжелой форме заболевания операция применяется с целью преодоления резистентности к проводимой терапии или в случае непереносимости антилимфоцитарного глобулина, а также временного отсутствия препарата [Михайлова Е.А. и др., 2006]. Эффективность хирургического вмешательства, возможно, предопределена удалением большой массы активированных клеток, ответственных за выработку негативных регуляторов гемопоэза [Семикина E.JL и др., 1990]. Однако вопросы сроков выполнения оперативного вмешательства, зависимости результатов операции от тяжести патологического процесса не решены.

Имеются лишь единичные работы, посвященные описанию структуры селезенки при А А. Установлено, что белая пульпа редуцирована, выявлена атрофия лимфоидных фолликулов (ЛФ), фиброадения красной пульпы, огрубение стенок синусов с неравномерным расширением и увеличением их количества [Абдулкадыров K.M., 1966; Лагутина Н.Я. и др., 1976]. Однако выявленные гистологические аспекты изменения структуры лимфоидного органа не отражают в полном объеме характер его вовлечения в патологические процессы при АА. Понимание данных механизмов требует дальнейшего исследования с использованием современных методов, позволяющих изучать не только гистологическую структуру селезенки, но и ее клеточный состав.

Одним из важных звеньев патогенеза АА является дизрегуляция популя-ционных пулов Т- и B-клеточной системы иммунитета. Исследование различных групп лимфоцитов и их функционального состояния при данной патологии многими авторами проводилось преимущественно в костном мозге и периферической крови [Шишина Р.Н. и др., 2009]. Попытки проанализировать состав, выделенных из селезенки лимфоцитов и оценить их иммунологическую активность предпринимались рядом авторов [Семикина Е.Л. и др., 1990]. Однако до сих пор не решен вопрос о роли селезенки в процессе депрессии кроветворения.

Многогранна также роль макрофагов в селезенке. Они обладают мощной фагоцитарной функцией, а также непосредственно участвуют в иммунном ответе. В пульпарных тяжах органа происходит превращение моноцитов в макрофаги. Известно, что число макрофагальных элементов в селезенке величина непостоянная и зависит от многих причин [Барта И., 1976]. Тем не менее, работ по изучению их содержания в лимфоидном органе больных АА не достаточно, чтобы дать характеристику этого важного звена иммунитета у таких пациентов.

Известно, что дендритные клетки ответственны за захват и предоставление антигенов Т- и В-лимфоцитам [Пащенков М.В. и др., 2002]. Анализ дендритных клеток, как одного из компонентов йммуно-опосредованного механизма развития АА имеет значение для оценки функционального состояния лим-фоидного микроокружения в селезенке.

Изучение микроскопического состояния структуры селезенки и ее клеточного состава при АА с помощью гистологического и иммуногистохимиче-ского (ЙГХ) методов позволит более широко раскрыть общее представление о патогенетических процессах при данной патологии и особенностях вовлечения селезенки в развитие этого тяжелого заболевания. Анализ изменений структуры органа в зависимости от тяжести АА и сроков выполнения операции даст возможность обосновать необходимость хирургического лечения, что имеет большое практическое значение.

Цель работы явилось изучение гистологических и ИГХ особенностей структуры селезенки и ее клеточного состава у больных АА.

Задачи исследования:

1. Установить роль удаления селезенки в комплексном лечении больных АА.

2. Определить изменения белой пульпы селезенки и ее структурных составляющих у пациентов с АА в зависимости от тяжести течения и длительности патологического процесса до СЭ.

3. Оценить состояние красной пульпы селезенки в зависимости от степени тяжести заболевания, сроков выполнения операции от начала лечения.

4. Изучить содержание Т- и В-лимфоидных популяций в селезенке.

5. Исследовать особенности системы мононуклеарных фагоцитов и дендритных клеток в селезенке.

Научная новизна. С помощью ИГХ исследования выявлены новые данные, касающиеся морфофункциональных особенностей селезенки у лиц с различными формами АА и длительностью течения заболевания до СЭ.

Анализ клеточного состава показал, что в лимфоидном органе иммуногенеза содержатся иммунокомпетентные клетки, участвующие в продукции цито-кинов, относящихся к регуляторам гемопоэза. Увеличение содержания Т-клеточного звена иммунитета обусловлено значительной выработкой (или накоплением) цитотоксических СБ8+ положительных клеток. Повышение В-клеточной популяции у пациентов с продолжительностью заболевания менее 2 месяцев свидетельствуют об активации гуморального звена иммунитета на начальных этапах развития заболевания и истощении защитных свойств организма в процессе А А.

Уменьшение числа гранулоцитов и клеток моноцитарно-гистиоцитарного ряда у лиц с АА на ранних этапах течения заболевания в селезенке выражено в большей степени, чем тканевых макрофагов.

Повышение уровня дендритных клеток (8-100 и СБ35) у всех больных АА с преобладанием С035+ субпопуляции у обследуемых с более длительным течением заболевания, вероятно, свидетельствует о выраженности активности иммунного процесса в селезенке среди пациентов с поздним сроком выполнения СЭ.

Огрубление стромы и деформация синусов определялись при любой степени тяжести и в разные сроки выполнения операции. Изменения красной пульпы в виде отека стромы наблюдались преимущественно у лиц с наиболее ранним удалением селезенки и тяжелой формой АА, не имеющих в анамнезе хронических очагов инфекции (хронический тонзиллит) и хронического гепатита.

Практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований впервые позволили установить морфологические особенности и изменения структуры селезенки у больных в зависимости от тяжести и продолжительности АА до СЭ. Определена взаимосвязь между сроком консервативного предоперационного периода и последующим исходом АА.

Повышение количества цитотоскических Т-лимфоцитов и популяции дендритных клеток косвенным образом доказывает участие иммунно-опосредованного механизма и вовлечение селезенки в патогенез АА.

Полученные данные обосновывают показания для проведения СЭ и указывают на определенные преимущества раннего хирургического вмешательства.

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Изменения гистологической структуры селезенки и клеточного состава зависят от тяжести АА и продолжительности течения заболевания до СЭ.

2. Редукция белой пульпы в виде уменьшения площади ЛФ более характерно для пациентов с НАА, получавших иммуносупрессивное лечение до операции. Увеличение размеров периартериальных лимфоидных влагалищ (ПАЛВ) у лиц с тяжелой формой АА по сравнению с больными НАА указывает на выраженность активности иммунного процесса. Также об этом свидетельствует и повышение размеров маргинальной зоны (МЗ), выявленное при тяжелой АА (ТАА) вне зависимости от сроков выполнения хирургического вмешательства.

3. Нарушение соотношения количества популяционного клеточного состава при аплазии гемопоэза касаются Т- и В-лимфоцитов, мононуклеарных фагоцитов, а также популяции дендритных клеток.

4. Изменения красной пульпы в виде огрубения стромы и деформации синусов определялись при любой степени тяжести заболевания и в разные сроки выполнения СЭ. В этой группе преобладали лица, в анамнезе которых отмечались хронические очаги инфекции и хронический гепатит. Отек стромы наблюдался преимущественно у пациентов с АА с минимальным предоперационным периодом и тяжелой формой болезни.

Внедрение результатов работы. Результаты работы могут использоваться в гематологической клинике при определении резервной способности КМ в ходе диагностики АА, тактики лечения и прогноза заболевания.

Апробация работы. Результаты исследований и основные положения работы доложены на областном научном обществе гематологов и трансфузио-логов (Киров, 2006г.), на научно-практических конференциях молодых ученых "Вопросы трансфузиологии и клинической медицины" (Киров, 2007 и 2008 гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе в зарубежной и центральной печати.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 127 страницах компьютерного текста, включает следующие разделы и главы: введение, обзор литературы, описание клинической характеристики больных и методов исследования, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации и список литературы, состоящий из 161 названий работ отечественных и зарубежных авторов. Работа содержит 34 таблицы и 11 рисунков.

Личный вклад автора. Автором лично обработаны истории болезни больных АА, проведен сбор гистологического материала и ИГХ окрашивание препаратов, выполнены все исследования по изучению морфометрических особенностей гистологической структуры селезенки и ее клеточного состава у всех обследованных больных и группы сравнения. Проведен анализ, статистическая обработка и обобщение полученных результатов исследования.

Содержание работы. Материалы исследования. В настоящей работе произведен анализ 33 больных АА, которые находились на лечении в гематологической клинике Кировского НИИ гематологии и переливания крови за период 1992-2008 гг. Возраст пациентов на момент установления диагноза варьировал от 4 до 71 года (медиана 21 год). Основная масса обследуемых была молодого и среднего возраста (18-60 лет, п=20), детей до 18 лет - 10, лиц старше 60 лет - 3. Количество лиц мужского пола было в 2 раза больше, чем женского (22 против 11 соответственно).

Из 33 обследуемых у 13 больных (39,4%) установлена НАА и у 20 (60,6%) - ТАА. Медиана возраста среди этих пациентов была практически одинаковой и составила 20,0 лет (15,5;29,0) и 22,0 года (19,0;44,0) соответственно. В зависимости от тяжести АА не было выявлено существенных отличий по массе удаленных селезенок: 92,5г (78,5; 136,2) при нетяжелой и 120,Ог (100,0;157,0) при ТАА. Процент умерших был выше в группе лиц с тяжелым течением заболевания: 15,4% против 45,0% с НАА.

В зависимости от длительности предоперационного периода все больные были разделены на две группы: с продолжительностью от начала заболевания до СЭ 2 месяца (1-я группа, п=23) и более 2 месяцев (2-я группа, п=10). Медиана возраста в обеих группах имела аналогичные показатели. Из 23 лиц 1-й группы, у 15 (65,2%) была установлена ТАА и только у 8 (34,8%) - нетяжелая АА. Пациенты 2-й группы по тяжести заболевания распределялись равномерно:

5 больных с нетяжелой и 5 - с тяжелой степенью АА. Процент умерших был выше в группе лиц с более длительным течением заболевания до СЭ: 21,7% в 1-й группе и 60,0% - во второй.

Из возможных причин развития АА было установлено, что преобладали больные с острыми инфекциями верхних дыхательных путей в анамнезе: 12 пациентов - 36,4%. У 6 (18,2%) удалось выявить сочетание острой инфекции с хроническим гепатитом и у 3 (9,1%) - с хроническим тонзиллитом. В единичных случаях была обнаружена связь АА с лекарственными и химическими веществами. В 24,2% случаев вероятную причину, способствующую развитию данной патологии, установить не удалось.

Предвестниками заболевания явились общее недомогание, слабость, повышенная утомляемость при физической нагрузке, бледность кожных покровов и единичные петехии на коже. Клиническая картина в развернутой фазе характеризовалась наличием у всех больных геморрагического синдрома различной степени выраженности в виде множественных кровоизлияний на коже, слизистых оболочках полости рта, десневых и носовых кровотечений.

В гемограмме пациентов с АА на момент диагностики заболевания отмечалась панцитопения, более выраженная при ТАА. У больных НАА было повышено содержание ретикулоцитов.

При анализе миелограмм у всех пациентов с АА отмечена выраженная костномозговая гипоплазия со снижением клеточности КМ, редукцией гранулоци-тарного и эритроидного ростков кроветворения, уменьшением содержания (или отсутствие) мсгакариоцитов, относительным лимфоцитозом вне зависимости от тяжести заболевания. Снижение числа сегментоядерных нейтрофилов и увеличение количества плазматических клеток было более характерно для лиц с ТАА.

При гистологическом изучении срезов трепанобиоптатов подвздошной кости у всех 33 больных, независимо от степени тяжести заболевания, в костномозговых полостях наблюдалось почти полное исчезновение гемопоэтиче-ских элементов паренхимы и замещение их жировой тканью. В некоторых случаях в КМ отмечались очаги кроветворения, в которых выявлялись единичные нормоциты, лимфоциты, зрелые гранулоциты. Мегакариоциты в препарате отсутствовали. Имели место признаки нарушения микроциркуляции - отек, плазматическое пропитывание, поля кровоизлияний.

До удаления селезенки все больные АА принимали глюкокортикостеро-идные гормоны в дозе 1мг/кг массы тела, а 14 из них параллельно получали циклоспорин А и циклофосфан. После операции пациенты продолжали получать ИСТ в зависимости от иммунного ответа и клинического состояния.

Сравнительный анализ проводили с образцами селезенок (судебно-медицинские вскрытия), взятыми от 20 лиц, скончавшихся скоропостижно и не имевших в анамнезе заболеваний системы крови. Медиана возраста составила 55 лет. Мужчин было 12, женщин - 8.

Методы исследования. У всех 33 пациентов с АА проводились следующие исследования: гемограмма, стернальная пункция и трепанобиопсия под-

вздошной кости. Морфологию клеток крови и костного мозга изучали с использованием метода световой микроскопии, препараты окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. Гемограмма включала в себя определение содержания гемоглобина, эритроцитов, ретикулоцитов, лейкоцитов с подсчетом лейкоформулы и тромбоцитов. Стернальную пункцию выполняли по общепринятой методике.

Материалом для гистохимического и ИГХ исследования послужили образцы ткани участков селезенки 33 больных АА, которые получали от пациентов после хирургических операций и от 20 практически здоровых лиц, скончавшихся скоропостижно и не имевших в анамнезе заболеваний системы крови. Исследования материала проводились на парафиновых блоках, из которых с помощью микротома готовили гистологические срезы толщиной 3-5 мкм. При изучении гистологических структур селезенки применялись специфические методы окраски гематоксилином и эозином и пикрофуксином по ван Гизону, проводившиеся по стандартным методикам. Для ИГХ исследований использовали тканевые срезы из парафиновых блоков толщиной 3-5 мкм. Иммунореакгивность первичных антител ("Dako") выявляли с помощью вторичных антител, коньюгированных с перокси-дазной системой, составляющей набор реактивов EnVISION+ ("Dako"). Постановку ИГХ реакций выполняли стандартно в соответствии с протоколом систем визуализаций "Dako". Морфологическую оценку результатов окрашивания осуществляли в световом микроскопе со встроенной фото- и видеокамерой фирмы "Leica" с помощью программного обеспечения анализа изображений ImageScope Color, версии М с окуляром хЮ, при объективах х20 и хЮО. Анализ гистологических срезов проводили в 20 полях зрения для каждого образца.

Статистические методы. Статистической обработки результатов выполняли с помощью программы SPSS for Windows Version 17.0. Достоверность различий между показателями в сравниваемых группах оценивали с использованием непараметрических двусторонних критериев Краскела-Уоллеса, Манна-Уитни и учетом поправки Бонферони при множественных сравнениях. Различия считали статистически значимыми при уровне р<0,05. Результаты исследований представлены с указанием медианы, а также верхнего и нижнего квартиля для каждой группы.

Результаты исследования и их обсуждение. Известно, что наиболее информативными показателями периферической крови, характеризующими тяжесть АА, являются содержание гранулоцитов и лимфоцитов [Федоровская H.A., 1986]. С целью изучения влияния СЭ на характер течения заболевания у 33 больных проанализировано абсолютное количество гранулоцитов и лимфоцитов при диагностике, перед операцией, на 1-2 сутки и через 1 и 2 месяца после удаления селезенки.

В зависимости от тяжести процесса установлено, что на 1-2 сутки после операции уровень гранулоцитов статистически значимо увеличивался как при нетяжелой (3,2х109/л (2,1;3,6)), так и тяжелой форме АА (0,8х109/л (0,4;2,6)) по сравнению с данными при диагностике: 1,3х109/л (0,6; 1,9) и 0,4x109/л (0,2;0,7)

соответственно. Причем, этот показатель был больше у обследуемых с нетяжелой формой, чем с ТАА (р<0,05). Такая динамика содержания этих клеток в периферической крови в первые двое суток после операции отражает резервные способности КМ, которые выше при НАА. Спустя 1 месяц после хирургического вмешательства у пациентов с нетяжелой формой заболевания показатели снижались практически до того же уровня, что и перед СЭ. У больных ТАА за этот период времени отмечено статистически значимое их увеличение с 0,4x109/л (0,2;0,9) до 0,9х109/л (0,6; 1,3), р<0,05. Вероятно, такие изменения абсолютных значений гранулоцитов можно объяснить тем, что большинству лиц с ТАА в этот период времени назначалась более интенсивная ИСТ, а у обследуемых с нетяжелым течением заболевания чаще всего применялась выжидательная тактика. Через 2 месяца с момента удаления селезенки уровень гранулоцитов вне зависимости от формы АА был одинаков и не отличался от исходных данных.

При исследовании абсолютного количества лимфоцитов периферической крови у лиц с АА выявлено, что более низкий их уровень определялся при ТАА (р<0,05). Это указывает на глубокие угнетения не только гранулоцитопоэза, но и лимфопоэза у этих больных. На 1-2 сутки после операции установлено снижение уровня этих клеток как при нетяжелой (1,0х109/л (0,7;1,8)), так и при тяжелой степени заболевания (1,1х109/д (0,6;1,5)) по сравнению с данными перед СЭ: 2,0x109/л (1,7;3,1) и 1,7х109/л (0,9;2,3) соответственно, р<0,05. Полагаем, что это связано с удалением органа, являющегося источником лимфоцитов. Тем не менее, уже в течение первого месяца с момента хирургического вмешательства у всех пациентов показатели вернулись к исходным значениям, что и до операции и не изменялись при дальнейшем наблюдении. Это обосновывает необходимость проведения последующих курсов ИСТ.

В зависимости от длительности течения АА в обеих группах больных выявлена тенденция к повышению абсолютного количества гранулоцитов на 1-2 сутки с момента удаления селезенки по сравнению с данными до операции (р>0,05). Это отражает равные резервные возможности КМ вне зависимости от длительности течения болезни. Вместе с тем, через 1 и 2 месяца после удаления лимфоидного органа показатели снижались до исходных значений.

При изучении содержания лимфоцитов периферической крови установлено достоверное уменьшение их уровня среди обследуемых 2-й группы в первые сутки после СЭ (0,5х109/л (0,5;0,7)) по отношению к данным до операции: 1,8х109/л (1,5;2,4) при диагностике и 1,7х109/л (1,0;2,0) перед удалением селезенки. У больных 1-й группы в этот период времени выявлена лишь тенденция к снижению количества лимфоидных клеток (р>0,05). Спустя 2 месяца после хирургического вмешательства вне зависимости от продолжительности патологического процесса до СЭ показатели вернулись к исходным значениям.

Обсуждая полученные данные, можно заключить, что СЭ имеет свое положительное влияние на течение АА в зависимости от тяжести и продолжительности заболевания. Увеличение в периферической крови количества грану-

лоцитов на 1-2 сутки после операции отражает резервные способности КМ, которые выше при НАА. Кроме того, это создает условия для проведения ИСТ, что позволяет назначить адекватную ее дозу и при тяжелой форме болезни. Тенденция к повышению уровня гранулоцитов у лиц с различными сроками выполнения СЭ указывает на равные резервные способности КМ в обеих группах. Кроме того, эффективность хирургического вмешательства выражается в снижении количества лимфоцитов у всех больных АА. Это происходит за счет удаления органа, являющегося источником данных клеток.

При анализе количества достигнутых ремиссий у обследуемых с АА было установлено, что наибольший процент ремиссий (100%) определялся в 1-й группе больных НАА. Если пациенты с нетяжелой формой заболевания подвергались СЭ в более поздний срок, то вероятность возникновения ремиссии снижалась до 60%. У лиц с ТАА наиболее неблагоприятный результат отмечался во 2-й группе (20%). Следовательно, больные тяжелой АА, прооперированные в ранние сроки от начала заболевания, имеют лучший прогноз, чем пациенты с более длительным предоперационным периодом вне зависимости от получаемой ИСТ.

Таким образом, несмотря на положительный эффект хирургического вмешательства на дальнейшее течение заболевания, остается не изученным вопрос, вследствие чего наступает клиническое улучшение. Для его изучения был проведен анализ гистологической структуры селезенки и ее популяционного состава с использованием современных методов исследования.

При оценке площади белой пульпы селезенки и ее основных элементов, состоящих из ПАЛВ, ЛФ и МЗ, с помощью гистологических методов установлено следующее. В зависимости от тяжести АА выявлена статистически значимая редукция белой пульпы у больных НАА, получавших иммуносупрессивное лечение до СЭ, по сравнению с пациентами, имеющими тяжелое течение АА и нормой - 53,4мм2 (35,7;87,3)к 123,3мм2 (96,9;136,2) и 98,4мм2 (76,2;158,1) соответственно, р<0,05.

Аналогичные изменения в этих же группах были определены и при исследовании площади ЛФ (см. табл. 1). Полученные данные отражают большее влияние ИСТ на структуру селезенки у обследованных с нетяжелой формой заболевания, чем при ТАА. Достоверных различий в группах больных в зависимости от продолжительности заболевания до хирургического вмешательства отмечено не было (см. табл. 2).

При изучении площади ПАЛВ выявлены статистически значимые отличия между показателями у пациентов с нетяжелой и тяжелой степенью заболевания, получавших в обоих случаях иммуносупрессивное лечение до СЭ (р<0,05). Это указывает на выраженность активности процесса у больных ТАА. В зависимости от сроков выполнения хирургического вмешательства была отмечена тенденция к увеличению площади ПАЛВ у обследуемых 2-й группы, не получавших предоперационное иммуносупрессивное лечение.

Таблица 1

Сравнительная оценка площади (в) структурных элементов белой пульпы селезенки у больных АЛ в зависимости от тяжести заболевания_^_

Группы исследования Б ПАЛВ, мм2 в ЛФ, мм2 в МЗ, мм2

Группа сравнения (п=20) 8,1 (0,9;38,4) 64,5"(53,4;105,6) 9,9' (5,4;20,1)

НАА (п=13) - НАА с ИСТ (п=4) -НАА без ИСТ (п=9) 6,9(6,9;15,6) 3,6"(1,8;6,0) 9,3 (5,4; 18,9) 48,0*/"(29,7;58,8) 40,5*/" (27,9;57,0) 51,6 (28,8;67,8) 16,8 (4,8;23,4) 11,1 (4,2;24,0) 17,4 (6,9;30,9)

ТАА (п=20) - ТАА с ИСТ (п=10) - ТАА без ИСТ (п=10) 9,3 (5,7;16,8) 9,3**(6,9;17,7) 9,3 (2,1;18,3) 85,2"(48,0;108,6) 93,9**(73,5;103,5) 56,1 (41,1;119,1) 19,5*(12,0;27,0) 19,2 (12,0;20,4) 25,5*(12,0;34,2)

Примечание: * - статистическая значимость различий по отношению к данным группы сравнения; ** - статистическая значимость различий между данчъши НАА и ТАА

Таблица 2

Сравнительная оценка площади (в) структурных элементов белой пульпы селезенки у больных АА в зависимости от длительности течения заболевания доСЭ____

Группы исследования Б ПАЛВ, мм2 в ЛФ, мм2 Б МЗ, мм2

Группа сравнения (п=20) 8,1 (0,9;38,4) 64,5(53,4:105,6) 9,9(5,4;20,1)'

1-я группа (п=23) - 1-я группа с ИСТ (п=8) - 1-я группа без ИСТ (п=15) 7,8 (5,4;14,4) 7,8 (4,2; 14,4) 10,2 (5,4;18,0) 60,0 (42,3;96,6) 93,9 (64,2;99,9) 51,6(38,1:92,7) 19,5(12,0;27,0)" 19,5 (12,9;23,4) 19,5(12,0;33,6)*

2-я группа (п=10) - 2-я группа с ИСТ (п=6) - 2-я группа без ИСТ (п=4) 11,1(4,2;21,3) 6,6 (3,6;20,1) 16,5 (7,5;24,6) 56.4 (27,3;77,1) 55.5 (27,3;97,5) 56,4 (29,7;73,5) 17,1 (5,4:21,6) 14,4 (5,4; 19,5) 20,7(6,0;37,2)*

Примечание: * — статистическая значимость различий по отношению к данным группы сравнения

При оценке площади МЗ показано статистически значимое ее увеличение у лиц с ТАА, не получавших ИСТ в отличие от группы сравнения (р<0,05). Кроме того, достоверное повышение размеров МЗ наблюдалось у обследованных без иммуносупрессивного лечения, независимо от продолжительности болезни до операции. Вероятно, такие изменения связаны с перераспределением популяции В-клеток из ЛФ в МЗ, что также является отражением активности иммунного процесса.

Следовательно, при исследовании структурных компонентов белой пульпы установлено, что редукция ее площади связана преимущественно с изменениями, происходящими непосредственно в ЛФ. Детальное изучение их функциональных зон выявило уменьшение объема зоны мантии (ЗМ) у лиц с нетя-

желой степенью заболевания, получавших ИСТ, по сравнению с нормой: 36,3мм2 (26,1*,47,7) и 58,8мм2'(50,7;93,9) соответственно, при р<0,05. Кроме того, отмечены статистически значимые различия площади ЗМ между лицами с нетяжелой и тяжелой формами АА, получавших в обоих случаях иммуносу-прессию до операции: 36,3мм2 (26,1;47,7) и 85,2мм2 (61,2;97,5) соответственно, р<0,05. Полученные данные в большей степени обусловлены влиянием ИСТ на эту зону ЛФ при нетяжелой степени АА, чем при ТАА. Отличий при изучении ЗМ в зависимости от длительности патологического процесса в данных группах определить не удалось.

При оценке площади герминативного центра (ГЦ) не выявлено достоверной разницы между показателями в группе сравнения и пациентами с АА. Однако установлены статистически значимые различия среди обследованных 1-й и 2-й группы больных, получавших ИСТ перед удалением селезенки: 9,0мм2 (4,8; 13,2) и 0,0мм2 (0,0;3,0) соответственно, р<0,05. Возможно, такая редукция центров размножения у пациентов с длительностью течения АА более 2 месяцев связана с угнетением активности иммунных процессов в селезенке по мере течения заболевания и/или с более продолжительным приемом иммуносупрес-сивных лекарственных препаратов.

Рядом авторов отмечены изменения центральных артерий у больных АА [Лагутина Н.Я. и др., 1976]. Тем не менее, установленные изменения не в полном объеме отражают нарушения сосудистой стенки в зависимости от тяжести заболевания и длительности течения патологического процесса.

При сравнении стенок центральных артерий селезенки у лиц с АА прослеживались изменения сосудов за счет неравномерного утолщения, разволок-нения мышечного слоя и набухания основного вещества. С помощью гистохимической окраски пикрофуксином по ван Гизону у 10 пациентов (43,5%) с продолжительностью течения заболевания до СЭ менее 2 месяцев и у всех обследуемых 2-й группы выявлена гомогенизация среднего слоя. Это было связанно с накоплением в стенках артерий белков плазмы. Кроме того, более выраженные изменения наблюдались у 2 больных 2-й группы (20%): образование гиалиновых масс в стенке сосудов, нарушение всех ее трех слоев, которые имели дистрофический характер с вторичными склеротическими изменениями, гиперплазия эпителия вплоть до полной облитерации просвета. Зависимости выявленных нарушений центральных артерий от тяжести аплазии гемопоэза установить не удалось.

При морфометрическом анализе площади толщины стенки центральных артерий не было получено достоверных различий между группой сравнения и больными АА как в зависимости от тяжести заболевания, так и продолжительности течения болезни до проведения СЭ (р>0,05). Однако определено значительное сужение просвета сосудов у всех пациентов с АА: 141,9мкм2 (28,7;2140,0) у лиц с нетяжелой формой заболевания и 99,3мкм2 (49,3;180,5) при ТАА; 140,8мкм2 (49,0;233,4) в 1-й группе и 75,4мкм2 (24,8;157,5) - во вто-

рой. Показатели имели статистически значимые различия по сравнению с нормой - 313,3 мкм2 (182,9;672,9), р<0,05.

Таким образом, результаты анализа центральных артерий селезенки позволяют сделать вывод, что при АА в них имеются структурные изменения. Вероятно, они связаны не только с отеком соединительной ткани и гиперплазией клеток эндотелия, но и с дистрофией стенки сосудов, что может иметь значение в нарушении микроциркуляции органа.

Обсуждая полученные данные можно заключить, что при изучении структурных элементов белой пульпы отмечены признаки изменения их площади, зависящие, прежде всего, от тяжести заболевания, проводимой ИСТ, и, в меньшей степени, обусловлены продолжительностью заболевания до СЭ. Для возможности более полного понимания роли селезенки в патогенезе АА, дальнейшие исследования были направлены на изучение красной пульпы органа.

При ИГХ методе исследования с помощью поликлонального антитела Factor VIII, маркирующего клетки эндотелия сосудов, установлены структурные изменения венозных синусов красной пульпы разной степени выраженности у всех пациентов АА. У больных, преимущественно с ранним сроком оперативного вмешательства и тяжелой формой заболевания поражение характеризовалось отеком стромы, синусы в этих случаях были спавшиеся. Огрубение стромы и деформация синусов красной пульпы определялись при любой степени тяжести и в разные сроки выполнения операции. В большей степени эти нарушения были отмечены у лиц, имеющих в анамнезе хронические очаги инфекции (хронический тонзиллит) и хронический гепатит. Выявление выраженных деструктивных изменений венозных синусов красной пульпы в ранний период проводимого оперативного лечения может свидетельствовать о начале появления патологических признаков в селезенке на фоне хронических очагов инфекции до клинической манифестации АА.

При морфометрической оценке красной пульпы селезенки установлено, что наибольшая ее площадь была определена у больных НАА, получавших ИСТ до удаления селезенки - 915,0мм2 (894,0;944,1). Полученные значения достоверно отличались как от нормальных показателей, так и от данных у пациентов при тяжелой форме АА с предоперационной иммуносупрессией: 882,0мм2 (839,1;904,5) и 858,0мм2 (844,5;884,1) соответственно. В зависимости от продолжительности заболевания размер красной пульпы не имел статистически значимых различий в показателях во всех группах исследования (р>0,05). Полученные морфометрические данные соотносятся с результатами, отмеченными при анализе белой пульпы органа у больных А А. Это подчеркивает редуцирующее влияние ИСТ на структуру белой пульпы селезенки в большей степени у лиц с нетяжелой формой аплазии гемопоэза, чем при ТАА.

Таким образом, структурные изменения белой и красной пульпы селезенки различной степени выраженности определены у всех пациентов с АА. Дальнейшее исследование особенностей структуры этого органа было направлено на изучение его субпопуляционного состава.

Оценка различных групп лимфоцитов и их функционального состояния при АА многими авторами выполнялось преимущественно в КМ и периферической крови [Абдулкадыров K.M. и др, 1995; Реук В.Д., 1970]. Первые попытки проанализировать состав клеточных элементов в селезенке были проведены в 1990 году [Семикина Е.Л. и др.]. Авторами изучалась взвесь клеток, полученных из селезенки.

Настоящее исследование было направлено на анализ субпопуляционного состава в гистологических срезах селезенки с использованием соответствующих клеточных маркеров. Было установлено, что у больных АА и группы сравнения В-лимфоидная популяция превалировала в белой пульпе органа. Причем, большее количество этих клеток выявлялось в ЛФ, меньшая доля локализовалась в МЗ и в периферической части ПАЛВ. В красной пульпе обнаруживались единичные клетки. В результате анализа В-лимфоидных элементов установлено статистически значимое увеличение содержания CD20+ и С079а+-экспрессирующих клеток в селезенке у лиц с АА как при нетяжелой, так и при тяжелой форме заболевания по отношению к норме, р<0,05 (см. табл. 3).

Таблица 3

Процентное содержание в селезенке популяции В-лимфоцитов у больных АА в зависимости от тяжести заболевания

Группы исследования CD20+ CD79a+

Группа сравнения (п=20) 8,7' (6,5;14,8) 14,1* (10,2;18,3)

НАА (п=13) - НАА с ИСТ (п=4) -НАА без ИСТ (п=9) 18,7' (13,7;24,4) 18,2*(11,1;24,5) 18,7' (15,6;22,7) 22,0" (17,7;27,8) 22,7* (16,3;30,4) 22,0* (17,7;27,6)

ТАА (п=20) — ТА А с ИСТ (п=10) - ТАА без ИСТ (п=10) 21,7'(15,9;26,0) 19,Г (15,5;28,3) 22,1* (16,7;25,7) 22,8" (18,1;28,9) 19,7* (16,8;33,9) 23,0* (20,0;28,6)

Примечание: * - статистическая значимость различий по отношению к данным группы сравнения Таблица 4 Процентное содержание в селезенке популяции В-лимфоцитов у больных АА в зависимости от длительности течения заболевания до СЭ

Группы исследования CD20+ CD79a+

Группа сравнения (п=20) 8,7' (6,5;14,8) 14,1' (10,2;18,3)

1-я группа (п=23) - 1-я группа с ИСТ (п=8) - 1-я группа без ИСТ (п=15) 22,4*'" (19,9;26,1) 24,Г'" (21,0;29,2) 21,8* (17,8;25,6) 26,7''" (20,9;29,0) 29,f" (22,4;35,2) 23,1* (20,2;28,5)

2-я группа (п=10) - 2-я группа с ИСТ (п=6) - 2-я группа без ИСТ (п=4) 15,8" (13,1;17,2) 14,9" (12,6;16,3) 16,5 (13,5;18,3) 17,0" (16,1;18,5) 17,2" (16,0;18,5) 17,0 (15,8;26,4)

Примечание:* - статистическая значимость различий по отношению к данным группы сравнения; ** - статистическая значимость различий между данными I и 2 групп

Исследование В-клеточной популяции у пациентов с различными сроками проведения операции показало повышение С020+ и СЭ79а+ лимфовдных элементов у больных 1-й группы, р<0,05 (см. табл. 4). Данные достоверно отличались как от нормы, так и от обследуемых с продолжительностью заболевания до СЭ более 2 месяцев. Возможно, полученные результаты отражают активацию В-клеточного звена гуморального иммунитета в первые месяцы АА с последующим истощением данной популяции клеток в селезенке в процессе болезни вне зависимости от тяжести.

Анализ Т-лимфоидных элементов установил, что у лиц с АА и группы сравнения общая популяция этих клеток (СБЗ+) доминировала в ПАЛВ, ближе к центру, окружая сосуд в виде ободка. В меньшей степени их количество было распределено в ГЦ, МЗ и красной пульпе селезенки. При морфометрической оценке Т-лимфоидных клеток было определено, что процент общей популяции Т-лимфоцитов (СЭЗ+) достоверно увеличен у всех обследованных, не получавших ИСТ до операции (см. табл. 5 и 6).

Таблица 5

Процентное содержание в селезенке Т- и ГЧК-клсточных субпопуляций у больных АА в зависимости от тяжести заболевания

Группы исследования CD3+ CD8+ CD4+ NK+

Группа 10,2' 0,3* 7,1* 3,2

сравнения (п=20) (8,6; 12,3) (0,2;0,5) (5,1;8,0) (2,3 ;4,7)

НАА (п=13) 15,3''" 4,6* 5,9 3,4

(13,5;20,4) (4,1;6,0) (3,3;8,5) (2,7;4,8)

- НАА с ИСТ (п=4) 13,6 4,Г 5,6 3,8

(9,9;18,0) (3,6;4,8) (3,7;9,3) (2,0;5,5)

-НАА без ИСТ (п=9) 15,3* 5,0* 6,4 3,4

(13,7;21,6) (4,6;7,1) (3,3;8,5) (2,7;4,6)

ТАА (п=20) 11,6" 4,4- 3,5- 3,6

(10,2; 15,4) (2,8;5,7) (2,9;6,5) (2,2;4,9)

- ТАА с ИСТ (п=10) 10,8 3,6* 3,5* 3,0

(9,4; 14,1) (2,7;6,0) (2,6;6,9) (1,9;5,6)

-ТАА без ИСТ (п=10) 11,8* 4,7* 3,4* 3,6

(11,3;17,7) (4,2;5,5) (ЗД;6,2) (2,9;4,6)

Примечание:* - статистическая значимость различий по отношению к данным группы сравнения; ** - статистическая значимость различий между данными НАА и ТАА

Увеличение количества СОЗ+-лимфоидных элементов у пациентов с АА зависело в основном от содержания в селезенке CD8+ цитотоксических лимфоцитов, которые преимущественно были рассеяны в красной пульпе органа, а также выявлялись в ПАЛВ. Содержание этих клеток было значительно повышено во всех группах больных АА (р<0,05).

Таблица 6

Процентное содержание в селезенке Т- и 1ЧК-клеточных субпопуляций у больных А А в зависимости от длительности течения заболевания до СЭ

Группы исследования CD3+ CD8+ CD4+ NK+

Группа 10,2' 0,3* 7,1* 3,2

сравнения (п=20) (8,6;12,3) (0,2:0,5) (5,1:8,0) (2,3:4,7)

1-я группа (п=23) 13,6* 4,9* 4,1" 3,4

(11,2; 18,0) (4,4;5,6) (3,2:8,3) (2,5:4,6)

- 1-я группа с ИСТ (п=8) 12,9 4,7* 5,0 2,6

(Ю,0;15,7) (3,1:5,8) (3,1:8,4) (1,9:4,9)

- 1-я группа без ИСТ (п=15) 15,3* 4,9* 4,1* 3,6

(11,3:18,0) (4,4;5,6) (3,2:8,3) (3,0:4,2)

2-я группа (п=10) 13,5 4,0* 3,3* 4,2

(9,4:14,6) (2,8;6,2) (3,0;5,7) (1,9:5,6)

- 2-я группа с ИСТ (п=6) 10,4 3,2* 3,1* 4,7

(9,2:14,1) (2,7;4,3) (2,6:5,8) (1,8:6,1)

- 2-я группа без ИСТ (п=4) 14,2* 5,5* 4,4 3,8

(13,6:15,1) (4,4;7,5) (3,3:6,3) (2,1;4,9)

Примечание: * - статистическая значимость различий по отношению к данным группы сравнения

Субпопуляция СБ4-экспрессирующих клеток у всех обследуемых преобладала в ПАЛВ, в красной пульпе определялась в меньшем количестве. Уменьшение содержания в селезенке Т-хелперов (CD4+) установлено у пациентов с ТАА по отношению к группе сравнения (р<0,05). У больных с нетяжелой степенью АА выявлена тенденция к уменьшению их количества в отличие от нормы (р>0,05). Полученные результаты отражают значительное снижение субпопуляции Т-хелперов в селезенке при тяжелом течении АА. Это можно объяснить тем, что данные больные изначально имели более глубокую абсолютную лимфопению в отличие от лиц с НАА. Снижение процента С04+-лимфоидных элементов в зависимости от продолжительности заболевания до удаления селезенки определялось как среди лиц с минимальным сроком заболевания до СЭ, так и при более длительном предоперационном периоде (р<0,05). Таким образом, на динамику уменьшения количества С04-положительных клеток продолжительность заболевания не влияла.

НК+-позитивные клетки локализовались преимущественно в МЗ и красной пульпе селезенки. Единичные клетки с экспрессией CD57 определялись в ПАЛВ. Различия в содержании этих лимфоидных элементов среди всех исследуемых групп не были достоверны (р>0,05).

Многогранна роль в селезенке мононуклеарных фагоцитов и дендритных клеток. Они непосредственно участвуют в иммунном ответе, а также обладают выраженной фагоцитарной функцией. В пульпарных тяжах органа происходит

превращение моноцитов в макрофаги. Известно, что число макрофагальных элементов в селезенке величина непостоянная и зависит от многих причин [Барта И., 1976]. Для более полного понимания особенностей этого важного звена иммунитета у лиц с АА целесообразен был анализ данных субпопуляций.

Для оценки состояния системы мононуклеарных фагоцитов селезенки были изучены клетки, экспрессирующие МАС387 (гранулоциты и клетки мо-ноцитарно-гистиоцитарного ряда). У лиц с АА и нормы основная их часть была локализована в красной пульпе органа, преимущественно по периферии МЗ в виде ободка, окружая ЛФ. Единичные клетки определялись в белой пульпе. Количество МАС387-полжительных элементов было достоверно снижено у всех больных АА в отличие от группы сравнения (см. табл. 7 и 8) Причем более низкие показатели отмечались у пациентов, оперированных позднее 2-х месяцев от начала лечения, р<0,05.

Таблица 7

Процентное содержание в селезенке субпопуляции мононуклеарных фагоцитов у больных А А в зависимости от тяжести заболевания_

Группы исследования МАС387+ CD68+

Группа сравнения (п=20) 17,6* (11,9;21,6) 7,4 (6,5;10,2)

НАА (п=13) - НАА с ИСТ (п=4) - НАА без ИСТ (п=9) 9,9* (7,7; 14,9) 11,3 (8,3;17,0) 9,9* (7,4; 14,9) 6,0 (4,7;8,8) 6,0 (3,3;7,7) 6,0 (4,7;9,4)

ТАА (п=20) - ТА А с ИСТ (п=10) - ТАА без ИСТ (п=10) 10,5* (5,8; 15,6) 9,8* (5,7;16,2) 11,6* (8,5;15,2) 7,2 (5,3;8,4) 6,4 (5,1;8,3) 7,9 (6,0;8,7)

Примечание: * — статистическая значимость различий по отношению к данным группы сравнения Таблица 8 Процентное содержание в селезенке субпопуляции мононуклеарных фагоцитов у больных АА в зависимости от длительности течения заболевания до СЭ

Группы исследования МАС387+ CD68+

Группа сравнения(п=20) 17,6* (11,9;21,6) 7,4 (6,5; 10,2)

1-я группа (п=23) - 1-я группа с ИСТ (п=8) - 1-я группа без ИСТ (п=15) 11,3*'**(9,4;15,2) 10,5* (6,3;15,1) 12,0* (9,5; 15,2) 7,7" (6,0;8,6) 6,6 (5,7;8,1) 8,0" (6,0;9,4)

2-я группа (п=10) - 2-я группа с ИСТ (п=6) - 2-я группа без ИСТ (п=4) 7,7*'** (5,3; 11,7) 8,8 (5,9; 16,9) 5,8*'" (2,2;9,3) 4,6*'" (3,8;8,1) 5,3 (3,8;8,3)

Примечание: * - статистическая значимость различий по отношению к данным группы сравнения; ** - статистическая значимость различий между данными 1 и 2 групп

При исследовании тканевых макрофагов (СБ68) выявлено, что большая их часть равномерно распределялась по всей красной пульпе органа как в норме, так и у больных АА. В единичном количестве они определялись по периферии центральных артерий, в мантийной и маргинальной зонах. При морфомет-рической оценке содержания С068-экспрессирующих клеток, у пациентов, как с нетяжелой, так и с тяжелой формой АА показатели не имели достоверных различий по отношению к группе сравнения. Однако выявлено значительное снижение количества данной популяции у лиц, которым СЭ была произведена позднее 2-х месяцев в отличие от нормальных показателей и данных в 1-й группе (р<0,05). Анализ полученных данных показал, что у больных АА на ранних этапах течения заболевания в селезенке снижено число гранулоцитов и клеток моноцитарно-гистиоцитарного ряда в большей степени, чем тканевых макрофагов. Это явление, возможно, объясняется патогенезом самого заболевания, т.е. процессами костномозговой недостаточности, отражающимися на количестве поступающих из крови клеток.

Дендритные клетки у лиц с АА и группы сравнения располагались рассеяно в МЗ, ПАЛВ и в красной пульпе селезенки. Содержание СБ35+-позитивных дендритных клеток в лимфоидном органе у больных было статистически значимо увеличено во всех группах: 2,6% (1,9;5,1) и 2,9% (1,1;3,9) при нетяжелой и тяжелой степени АА соответственно; 2,2% (1,1;3,4) в 1-й группе и 5,2% (3,7;8,0) - во второй, в отличие от нормальных значений - 1,0% (0,7;1,3), р<0,05. Наибольший процент данной популяции выявлен у обследуемых с продолжительностью заболевания до СЭ более двух месяцев (р<0,05). Достоверные различия показателей у данных пациентов по сравнению с лицами 1-й группы свидетельствуют о накоплении этих клеток в органе, что указывает на активность процесса. Повышение количества дендритных клеток подтверждено и увеличением 8-100+-экспрессирующих интердигитальных элементов у всех больных АА относительно группы сравнения (р<0,05). Увеличение процента дендритных клеток (СБ35+ и Б-100+) при АА в определенной степени отражает мобилизацию возможностей иммунной системы относительно индукции антиген-специфического иммунного ответа.

Таким образом, обобщая представленные данные, можно заключить, что изменения гистологической структуры селезенки и ее клеточного состава зависят от тяжести и продолжительности течения заболевания до СЭ. Так, анализ морфометрических данных гистологических исследований белой пульпы у больных АА свидетельствует о наличии ее редукции. Преимущественно это происходит вследствие атрофии ЛФ, а именно ЗМ. В большей степени такие изменения определяются у лиц с нетяжелой формой депрессии кроветворения, получавших ИСТ до удаления селезенки. Сравнение показателей между пациентами с ТАА и нормой не выявило статистически значимых различий. Это указывает на активацию патологических процессов в данных структурных элементах органа и меньшую эффективность медикаментозного лечения у лиц с более тяжелой формой аплазии гемопоэза.

Увеличение площади ПАЛВ у обследуемых с тяжелой степенью АА по сравнению с больными НАА отражает выраженность активности иммунного процесса. Также об этом свидетельствует и повышение размеров МЗ, выявленное при ТАА вне зависимости от сроков выполнения хирургического вмешательства.

При изучении центральных артерий установлены определенные структурные изменения ее стенки у ряда пациентов с АА. К тому же, у всех обследуемых с депрессией кроветворения определено достоверное уменьшение просвета центральных артерий. Результаты данных исследований позволяют заключить, что при АА имеются структурные изменения в сосудах селезенки на уровне микроциркуляции.

Однако нарушения происходят не только в белой, но и в красной пульпе селезенки. Так, выявлены изменения венозных синусов разной степени выраженности у всех лиц с АА, с последующей деформацией их структуры по мере течения заболевания. Причем, для больных ТАА с ранним сроком СЭ свойственны отек стромы и спавшиеся венозные синусы. Огрубение стромы, деформация и расширение синусов более характерны дня лиц с хроническими очагами инфекции.

Анализ популяционного клеточного состава, а именно В- и Т-лимфоцитов показал, что селезенка у пациентов с АА, как крупный периферический лимфо-идный орган, содержит иммунокомпетентные клетки, участвующие в продукции цитокинов, относящихся к регуляторам гемопоэза. При депрессии кроветворения в ней прослеживается повышение содержания Т-клеточного звена иммунитета со значительным увеличением количества цитотоксических СЭ8+-позитивных клеток. Вероятно, селезенка является не только своеобразным барьером, задерживающим и/или накапливающим в себе активированные Т-лимфоидные элементы, но и служит источником образования С08+-лимфоцитов с последующим выбросом их в кровоток. Удаление органа иммуногенеза способствует редукции данной популяции в организме и снижению негативных регуляторов гемопоэза, которые вырабатываются этими клетками.

Увеличение количества В-клеточной популяции у больных 1-й группы свидетельствует об активации гуморального звена иммунитета на начальных этапах развития заболевания и истощении защитных свойств организма в течение АА. Это обосновывает подключение к ИСТ препаратов иммуноглобулинового ряда.

Анализ клеточного состава популяции мононуклеарных фагоцитов селезенки показал, что на ранних этапах течения заболевания в лимфоидном органе снижены популяции гранулоцитов и клеток моноцитарно-гистиоцитарного ряда в большей степени, чем тканевых макрофагов.

Повышение уровня дендритных клеток (Б-100 и СЭ35) у всех больных АА с преобладанием СБ35+ субпопуляции среди лиц 2-й группы указывает на выраженность иммунного процесса в селезенке среди пациентов с более продолжительным течением заболевания до СЭ. Учитывая их стимулирующее действие на Т- и В-звенья иммунной системы, увеличение количества лимфоидных элементов в структуре органа, вероятно, связанно именно с активацией дендритных клеток. Это в определенной степени подтверждает иммунно-

опосредованный механизм развития аплазии гемопоэза и вовлечение селезенки в патогенез АА, а также влияние ее на течение болезни.

Таким образом, результаты проведенных исследований позволяют значительно расширить представления о патоморфофункциональных нарушениях в структуре селезенки в зависимости от степени тяжести и длительности течения заболевания до СЭ. Все эти структурные изменения не могут не отражаться на функциях лимфоидного органа у больных АА и обосновывают показания для проведения операции. Причем, полученные результаты указывают на определенные преимущества раннего удаления селезенки не только как источника активированных клеток, но и как части патологически трансформированной ретикулоэн-дотелиальной системы, оказывающей негативное действие на исход заболевания.

Клиническая эффективность хирургического вмешательства отражается в повышении показателей гранулоцитов периферической крови на 1-2 сутки после СЭ. В большей степени такие изменения зависят от тяжести патологического процесса. Они свидетельствуют о резервной способности КМ, которые более выражены у больных НАА вне зависимости от длительности течения заболевания до операции. Повышение числа гранулоцитов после удаления селезенки у пациентов с тяжелой формой заболевания позволяет провести достаточную ИСТ. Абсолютная лимфопения, выявляющаяся в первые двое суток с момента хирургического вмешательства, свидетельствует об удалении органа, который служит источником цитотокстических лимфоцитов.

ВЫВОДЫ

1. Изменения гистологической структуры селезенки и клеточного состава органа зависят от тяжести АА и продолжительности течения заболевания до СЭ. Это значительно расширяет общие представления о патоморфофункциональных нарушениях лимфоидного органа и позволяет оптимизировать лечение пациентов с данной патологией.

2. Установлено увеличение количества общей популяции Т-лимфоцитов (CD3) в селезенке, обусловленное повышением в лимфоидном органе числа CD8 цитотоксических лимфоцитов у всех больных АА вне зависимости от тяжести патологического процесса и сроков выполнения СЭ. Уменьшение содержания Т-хелперов (С04+-позитивных клеток) не связано с продолжительностью болезни до операции, и в большей степени характерно для лиц с тяжелой формой заболевания.

3. Содержание В-лимфоидной популяции в селезенке увеличено как при нетяжелой, так и при тяжелой степени АА и, преимущественно, в первые 2 месяца течения заболевания.

4. На ранних этапах течения заболевания в селезенке снижены популяции гранулоцитов и клеток моноцитарно-гистиоцитарного ряда в большей степени, чем тканевых макрофагов.

5. Содержание дендритных клеток (CD35+ и S-100*) в селезенке у больных АА увеличено вне зависимости от тяжести и длительности патологического

процесса. Наибольший процент популяции С035-положительных клеток характерен для лиц с продолжительностью заболевания более 2-х месяцев.

6. Установлены изменения венозных синусов красной пульпы селезенки разной степени выраженности у всех лиц с АА. Причем, для больных ТАА с ранним сроком СЭ свойственны отек стромы и спавшиеся венозные синусы. Огрубление стромы, деформация и расширение синусов встречаются при любом сроке проведения операции и более характерны для лиц с хроническими очагами инфекции.

7. Выявлена редукция белой пульпы селезенки, обусловленная уменьшением площади ЛФ. В большей степени такие изменения характерны для лиц с нетяжелой формой АА, получавших ИСТ до удаления органа.

8. Установлены структурные изменения центральных артерий селезенки у больных АА. Вероятно, они связаны не только с отеком соединительной ткани и гиперплазией клеток эндотелия, но и с дистрофией стенки сосудов, что имеет значение в нарушении микроциркуляции органа.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные данные показали значимость и необходимость определения уровня гранулоцитов периферической крови на 1-2 день после удаления селезенки. По их уровню в определенной степени можно судить о резервной способности КМ. Увеличение количества гранулоцитов после СЭ позволяет проводить адекватную ИСТ пациентам вне зависимости от тяжести процесса.

2. Проведенные исследования дают гистологическое обоснование для использования хирургического лечения АА в сочетании с другими видами имму-носупрессии. Анализ результатов подчеркивает необходимость проведения СЭ у больных с тяжелой степенью депрессии кроветворения в более ранний срок заболевания. При нетяжелой форме болезни операция может рассматриваться как альтернативный метод иммуносупрессивного лечения.

3. При определении показаний к СЭ важно учитывать имеющиеся у больных в анамнезе хронические очаги инфекции (хронический тонзиллит, хронический гепатит). При наличии последних, выполнение хирургического вмешательства является обоснованным.

4. Для проведения дальнейших курсов ИСТ после СЭ следует учитывать изменения не только в КМ и периферической крови, но и признаки нарушения гистологической структуры селезенки с перераспределением клеточных популяций.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Федоровская H.A., Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А. Влияние спленэк-томии на характер течения апластической анемии в зависимости от тяжести процесса на фоне иммуносупрессивной терапии // Новое в гематологии и трансфузиологии. - 2006. - Вып. 4. - С. 144-148.

2.' Фёдоровская Н.С., Дьяконов Д.А., Федоровская H.A., Щеголева P.A., Югов Ю.И. Влияние иммуносупрессивной треапии на структуру селезенки при апластической анемии // Вестник гематологии.-2007,-Т. 3.,№ 2.-С. 63.

3. Дьяконов Д.А., Федоровская Н.С., Федоровская H.A., Щеголева P.A. Особенности структуры селезенки в зависимости от длительности течения апластической анемии до спленэктомии на фоне иммуносупрессивной терапии // Вопросы трансфузиологии и клинической медицины: Материалы научно-практической конференции молодых ученых. - Киров, 2007.-С. 63-64.

4. Федоровская „Н.С., Югов Ю.И., Щеголева P.A., Дьяконов Д.А. Способ ускоренной щадящей декальцинации трепанобиоптатов костного мозга // Пермский медицинский журнал. - 2007. - Т. 24, № 3. - С. 73-75.

5. Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А., Федоровская H.A., Югов Ю.И. Особенности структуры красной пульпы селезенки при апластической анемии // Сибирский консилиум. - 2007.

6. Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А., Федоровская H.A. Количество достигнутых ремиссий у больных апластической анемией в зависимости от сроков проведения спленэктомии // Всероссийское совещание. Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины (Епифановские чтения). - Киров, 2008. - С. 136.

7. Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А., Федоровская H.A. Состояние звена мононуклеарных фагоцитов в селезенке у больных апластической анемией // Здравоохранение Таджикистана. - 2008. - № 2. - С. 138-139.

8. Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А., Федоровская H.A. Состав Т-клеточных элементов селезенки у больных апластической анемией // Здравоохранение Таджикистана. - 2008. - № 2. - С. 139-141.

9. Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А., Федоровская H.A. Содержание Т-клеточных элементов в селезенке у больных апластической анемией // Вестник гематологии. - 2009. - Т. 4., № 2. - С. 63-64.

Список сокращений:

АА - апластическая анемия

ГЦ - герминативный центр

ЗМ - зона мантии

ИГХ — иммуногистохимия

ИСТ - иммуносупрессивная терапия

КМ — костный мозг

ЛФ - лимфоидный фолликул

МЗ - маргинальная зона

НАА - нетяжелая апластическая анемия

ПАЛВ - периартериальное лимфоидное влагалище

СЭ - спленэктомия

ТАА - тяжелая апластическая анемия

Российский НИИГиТ 191024 Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, 16

Подписано в печать 01.10.2009 г. Усл.печл. 1,5. Бумага офсетная. Печать цифровая. Заказ 904. Тираж 100.

Текст напечатан с оригинал-макета, изготовленного ООО «Фирма «Полекс» по электронной версии, предоставленной заказчиком.

Изготовлено - ООО "Фирма "Полекс" 610000, г. Киров, ул. Дрелевского, 55; тел./факс (8332) 64-23-56

Актуальность проблемы.

Апластическая анемия (АА) редкое и тяжелое заболеваний системы крови с высокой летальностью, характеризующееся тотальным угнетением костномозгового кроветворения и, как следствие, панцитопенией в периферической крови [3, 49].

Спленэктомия (СЭ) входит в программу комбинированной иммуносу-прессивной терапии больных АА. Известно, что удаление селезенки у этих пациентов рассматривается как альтернативный антилимфоцитарному глобулину (АЛГ) метод лечения нетяжелой АА. При тяжелой форме заболевания операция применяется с целью преодоления резистентности к проводимой терапии или в случае непереносимости АЛГ, а также временного отсутствия препарата [30]. Эффективность хирургического вмешательства, возможно, предопределена удалением большой массы активированных клеток, ответственных за выработку негативных регуляторов гемопоэза [58]. Однако вопросы сроков выполнения оперативного вмешательства, зависимости результатов операции от тяжести заболевания не решены.

Известно, что селезенка представляет лишь промежуточное звено в патогенезе АА, как орган иммуногенеза, а тяжесть заболевания обусловлена глубиной поражения кроветворения [65]. Это гемолимфатический орган, участвующий в гуморальном и клеточном иммунитете, ответственный за продукцию лимфоидных клеток и выброс их в периферическую кровь [126].

Имеются лишь единичные работы, посвященные описанию структуры селезенки при АА. Установлено, что белая пульпа редуцирована, выявлена атрофия лимфоидных фолликулов (ЛФ), фиброадения красной пульпы, огрубение стенок синусов с неравномерным расширением и увеличением их количества [1, 25]. Однако выявленные гистологические аспекты изменения структуры лимфоидного органа не отражают в полном объеме характер его вовлечения в патологические процессы при АА. Понимание данных механизмов требует дальнейшего исследования, используя современные методы, позволяющие изучать не только гистологическую структуру селезенки, но и ее клеточный состав.

Одним из важных звеньев патогенеза АА является дизрегуляция популя-ционных пулов Т- и В-клеточной системы иммунитета. Исследование различных групп лимфоцитов и их функционального состояния при данной патологии многими авторами проводилось преимущественно в костном мозге и периферической крови [69 ]. Попытки проанализировать состав, выделенных из селезенки лимфоцитов и оценить их иммунологическую активность предпринимались рядом авторов [58]. Однако до сих пор не решен вопрос о роли селезенки в процессе депрессии кроветворения.

Многогранна также роль макрофагов в селезенке. Они обладают мощной фагоцитарной функцией, а также непосредственно участвуют в иммунном ответе. В пульпарных тяжах органа происходит превращение моноцитов в макрофаги. Известно, что число макрофагальных элементов в селезенке величина непостоянная и зависит от многих причин [7]. Тем не менее, работ по изучению их содержания в лимфоидном органе больных АА не достаточно, чтобы дать характеристику этого важного звена иммунитета у таких пациентов.

Известно, что дендритные клетки ответственны за захват и предоставление антигенов Т- и В- лимфоцитам [43]. Анализ дендритных клеток, как одного из компонентов иммуно-опосредованного механизма развития АА, возможно, имеет значение для оценки функционального состояния лимфоидного микроокружения в селезенке.

Изучение микроскопического состояния структуры селезенки и ее клеточного состава при АА с помощью гистологического и иммуногистохимиче-ского (ИГХ) методов позволит более широко раскрыть общее представление о патогенетических процессах при данной патологии и особенностях вовлечения селезенки в развитие этого тяжелого заболевания. Анализ изменений структуры органа в зависимости от тяжести АА и сроков выполнения операции позволит обосновать необходимость хирургического лечения, что имеет большое практическое значение.

Цель исследования.

Изучить гистологические и ИГХ особенности структуры селезенки и ее клеточного состава у больных АА.

Задачи исследования.

1. Установить роль удаления селезенки в комплексном лечении больных АА.

2. Определить изменения белой пульпы селезенки и ее структурных составляющих у пациентов с АА в зависимости от тяжести течения и длительности патологического процесса до СЭ.

3. Оценить состояние красной пульпы селезенки в зависимости от степени тяжести заболевания, сроков выполнения операции от начала лечения.

4. Изучить содержание Т- и В-лимфоидных популяций в селезенке.

5. Исследовать особенности системы мононуклеарных фагоцитов и дендритных клеток в селезенке.

Научная новизна.

С помощью ИГХ исследования выявлены новые данные, касающиеся морфофункциональных особенностей селезенки у лиц с различными формами АА и длительностью течения заболевания до СЭ.

Анализ клеточного состава показал, что в лимф оидном органе иммуногенеза содержатся иммунокомпетентные клетки, участвующие в продукции цито-кинов, относящихся к регуляторам гемопоэза. Увеличение содержания Т-клеточного звена иммунитета обусловлено значительной выработкой (или накоплением) цитотоксических CD8+ положительных клеток. Повышение В-клеточной популяции у больных с продолжительностью заболевания менее 2 месяцев свидетельствуют об активации гуморального звена иммунитета на начальных этапах развития заболевания и истощении защитных свойств организма в процессе АА.

Уменьшение гранулоцитов и клеток моноцитарно-гистиоцитарного ряда у лиц с АА на ранних этапах течения заболевания в селезенке выражено в большей степени, чем тканевых макрофагов.

Повышение уровня дендритных клеток (S-100 и CD35) у всех больных АА с преобладанием CD35+ субпопуляции у лиц более длительным течением заболевания, вероятно, свидетельствует о выраженности активности иммунного процесса в селезенке среди пациентов с поздним сроком выполнения СЭ.

Огрубление стромы и деформация синусов определяются при любой степени тяжести и в разные сроки выполнения операции. Изменения красной пульпы в виде отека стромы наблюдались преимущественно у лиц с наиболее ранним удалением селезенки и тяжелой формой АА, не имеющих в анамнезе хронических очагов инфекции (хронический тонзиллит) и хронических гепатитов.

Положения, выносимые на защиту.

1. Изменения гистологической структуры селезенки и клеточного состава зависят от тяжести АА и продолжительности течения заболевания до СЭ.

2. Редукция белой пульпы в виде уменьшения площади ЛФ более характерно для пациентов с НАА, получавших иммуносупрессивное лечение до операции. Увеличение размеров ПАЛВ (зона накопления Т-лимфоцитов) у лиц с тяжелой формой АА по сравнению с больными НАА указывает на выраженность активности иммунного процесса. Также об этом свидетельствует и повышение размеров МЗ, выявленное при ТАА вне зависимости от сроков выполнения хирургического вмешательства.

3. Нарушение соотношения количества популяционного состава при АА касаются Т- и В-лимфоцитов, мононуклеарных фагоцитов, а также популяции дендритных клеток.

4. Изменения красной пульпы в виде огрубления' стромы и деформации синусов определялись при любой степени тяжести и в разные сроки выполнения СЭ. В этой группе преобладали лица, в анамнезе которых отмечались хронические очаги инфекции и хронический гепатит. Отек стромы наблюдался преимущественно у больных АА с минимальным предоперационным периодом и тяжелой формой заболевания.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Результаты проведенных исследований впервые позволили установить морфологические особенности и изменения структуры селезенки у больных в зависимости от тяжести течения АА и продолжительности заболевания до СЭ. Определена взаимосвязь между сроком консервативного предоперационного периода и последующим исходом АА.

Повышение количества цитотоскических Т-лимфоцитов и популяции дендритных клеток косвенным образом доказывает участие иммунно-опосредованного механизма и вовлечение селезенки в патогенез АА.

Полученные данные обосновывают показания для проведения СЭ и указывают на определенные преимущества раннего хирургического вмешательства.

Апробация диссертационного материала.

Результаты исследований и основные положения работы доложены на областном научном обществе гематологов и трансфузиологов (Киров, 2006г.), на научно-практических конференциях молодых ученых "Вопросы трансфу-зиологии и клинической медицины" (Киров, 2007 и 2008 гг.).

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе в зарубежной и центральной печати.

Реализация работы (внедрение в практику).

Результаты работы могут использоваться в гематологической клинике при определении вероятной причины развития АА и прогноза заболевания.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 127 страницах компьютерного текста, включает следующие разделы и главы: введение, обзор литературы, описание клинической характеристики больных и методов исследования, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации и список ли

выводы

1. Изменения гистологической структуры селезенки и клеточного состава органа зависят от тяжести АА и продолжительности течения заболевания до СЭ. Это значительно расширяет общие представления о па-томорфофункциональных нарушениях лимфоидного органа и позволяет оптимизировать лечение пациентов с данной патологией.

2. Установлено увеличение количества общей популяции Т-лимфоцитов (CD3) в селезенке, обусловленное повышением в селезенке числа CD8 цитотоксических лимфоцитов у всех пациентов АА вне зависимости от тяжести заболевания и сроков выполнения СЭ. Уменьшение содержания Т-хелперов (СБ4+-позитивных клеток) не связано с продолжительностью болезни до операции, и в большей степени характерно для пациентов с тяжелой формой заболевания.

3. Содержание В-лимфоидной популяции в: селезенке увеличено как при нетяжелой, так и при тяжелой степени АА и, преимущественно, в первые 2 месяца течения заболевания.

4. На ранних этапах течения заболевания в селезенке снижены популяции гранулоцитов и клеток моноцитарно-гистиоцитарного ряда в большей степени, чем тканевых макрофагов.

5. Содержание дендритных клеток (CD35+ и S-100+) в селезенке у больных АА увеличено вне зависимости от тяжести и длительности патологического процесса. Наибольший процент популяции CD35-положительных клеток характерен для лиц с продолжительностью заболевания более 2-х месяцев.

6. Установлены изменения венозных синусов красной пульпы селезенки разной степени выраженности у всех лиц с АА. Причем, для больных ТАА с ранним сроком СЭ свойственны отек стромы и спавшиеся венозные синусы. Огрубление стромы, деформация и расширение синусов встречаются при любом сроке операции и более характерны для лиц с хроническими очагами инфекции.

7. Выявлена редукция белой пульпы селезенки, обусловленная уменьшением площади ЛФ. В большей степени такие изменения характерны для лиц с нетяжелой формой АА, получавших ИСТ до удаления органа.

8. Установлены структурные изменения центральных артерий селезенки у больных АА. Вероятно, они связаны не только с отеком соединительной ткани и гиперплазией клеток эндотелия, но и с дистрофией стенки сосудов, что имеет значение в нарушении микроциркуляции органа.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные данные показали значимость и необходимость определения уровня гранулоцитов периферической крови на 1-2 день после удаления селезенки. По их уровню в определенной степени можно судить о резервной способности КМ. Увеличение количества гранулоцитов после СЭ позволяет проводить адекватную ИСТ пациентам вне зависимости от тяжести процесса.

2. Проведенные исследования дают гистологическое обоснование для использования хирургического лечения АА в сочетании с другими видами иммуносупрессии. Анализ исследований подчеркивает необходимость проведения СЭ у больных с тяжелой степенью депрессии кроветворения в более ранний срок заболевания. При нетяжелой форме заболевания операция может рассматриваться как альтернативный метод иммуносупрессив-ного лечения.

3. При определении показаний к СЭ важно учитывать имеющиеся у больных в анамнезе хронические очаги инфекции (хронический тонзиллит, хронический гепатит). При наличии последних, выполнение хирургического вмешательства являются обоснованным.

4. Для проведения дальнейших курсов ИСТ после СЭ следует учитывать изменения не только в КМ и периферической крови, но и признаки нарушения гистологической структуры селезенки с перераспределением клеточных популяций.