Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Гистологическая и цитологическая диагностика степени злокачественности различных вариантов рака молочной железы

На правах рукописи

ФИЛАТОВ АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

Гистологическая и цитологическая диагностика степени злокачественности различных вариантов рака молочной железы

14.00.15 - патологическая анатомия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2008

003451441

Работа выполнена в Федеральном Государственном учреждении «Центральный Клинический Военный Госпиталь ФСБ России»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, Зайратьянц

профессор Олег Вадимович

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, Франк

профессор Георгий Авраамович

доктор медицинских наук Рябоштанова

Елена Ивановна

Ведущее учреждение:

Государственное учреждение Научно-исследовательский институт морфологии человека Российской академии медицинских наук.

Защита состоится « ¿г» _2008 г. в /Ц часов на

заседании диссертационного совета Д 208.041.02 при ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Росздрава 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д.20/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава по адресу 125206, Москва, ул. Вучетича, д. 10а.

Автореферат разослан «» 2008г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессо

Б.М. УРТАЕВ

Список сокращений

АПТИ - аспирационная пункция тонкой иглой

ГЯСЗ - гистологическая ядерная степень злокачественности

РМЖ - рак молочной железы

ИГХ - иммуногистохимическое исследование

СЗ - степень злокачественности

НСБ - Ноттингемская сумма баллов

ЦЯСЗ - цитологическая ядерная степень злокачественности ЯСЗ - ядерная степень злокачественности ЕЛ - рецепторы эстрогенов Р11 - рецепторы прогестерона

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Рак молочной железы (РМЖ) в России, странах Европы и Америки занимает первое место в структуре заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований среди женщин. Ежегодно в мире выявляется 1 млн. новых случаев РМЖ. В России в 2002 г. было диагностировано 45857 случаев заболевания РМЖ, смертность составила 22,1 тыс. (Летягин В.П. и соавт.., 2002; Аксель Е.Л. 2002, Althuis M.D. 2005). Это третья по значимости причина смерти женского населения, после болезней системы кровообращения и летальных исходов от несчастных случаев.

Ведущую роль в диагностике РМЖ и выборе методов лечения играет врач-патологоанатом. Заболевание верифицируется на основании цитологического исследования материала, полученного на дооперационном этапе при аспирационной пункции тонкой иглой (АПТИ) новообразования молочной железы, а также при интраоперационном и плановом гистологическом исследовании биопсийного и операционного материала. Частое использование хирургами-онкологами интраоперационных, так называемых «срочных», биопсий связано с тем, что дооперационные методы диагностики нередко не дают четкого ответа на вопрос, с каким видом патологии имеет дело клиницист. Морфологическая верификация патологического процесса как злокачественного новообразования, недостаточна для индивидуального прогноза РМЖ. Для клинициста, назначающего лечение и определяющего прогноз течения заболевания таких больных, важную роль играют многие факторы. В первую очередь оценивается клиническая стадия, учитывающая размер опухоли, состояние лимфатических узлов и наличие или отсутствие отдаленных метастазов, далее следует определение степени злокачественности (СЗ) опухоли, ее гистологическая форма, наличие инвазии сосудов, рецепторный статус и ряд других прогностических факторов. Определение СЗ большинством исследователей ставится на третье место по значимости. В зарубежной литературе для оценки степени дифференцировки различных вариантов инвазивных форм РМЖ (кроме медуллярного) предлагается использовать термин «Histologic grade» - гистологическая степень злокачественности (ГСЗ), а для медуллярного, протокового и долькового рака in situ используется термин «Nuclear grade» - ядерная степень злокачественности (ЯСЗ).

Степень дифференцировки или СЗ оценивается по сумме отдельных качественных и количественных признаков, выраженных в баллах. «Золотым стандартом» для определения гистологической СЗ является рекомендованная ВОЗ и Всемирным противораковым союзом (2004) Ноттингемская сумма баллов (НСБ). При определении ядерной СЗ в настоящее время применяются различные схемы. Чаще упоминается методика, предлагаемая Американским противораковым комитетом, основанная на оценке размеров ядер опухолевых клеток.

В современных отечественных руководствах по морфологической диагностике РМЖ для оценки СЗ предлагается использовать схему H.J.G Bloom - W.W. Richardson (1957), причем только для инфильтрирующих протоковых карцином. Несмотря на большое количество исследований, посвященных РМЖ, в отечественной литературе отсутствуют четкие критерии определения СЗ его различных гистологических форм. Схема НСБ в последнее время все чаще подвергается критике из-за своей низкой воспроизводимости (Автандилов Г.Г., Григорьева С.Г., 2007; Dalton L. W. и соавт., 2000; Meyer J.S. и соавт., 2005; Tawfik О. и соавт., 2007). Причиной ее является недостаточная детализация ряда критериев, что приводит в отдельных случаях к малоинформативным заключениям патологоанатомов с формулировками: «рак молочной железы I-II (вариант II-III) степени злокачественности», нередко СЗ вовсе не указывается. Параметры ядерной СЗ, приводимые разными авторами (Robbins Р. и соавт., 1995; Fitzgibbons P.L. и соавт., 2005; Damjanov I., Fan F., 2007) часто не совпадают.

До настоящего времени не разработано объективных общепризнанных критериев цитологической оценки СЗ. Гистологическая и цитологическая оценка СЗ достаточно часто не совпадают.

Таким образом, существует реальная необходимость разработки отечественных стандартов для объективизации определения дифференцировки РМЖ морфологическими методами исследования, в частности гистологическим и цитологическим. На основании вышеизложенного определены цель и задачи настоящего исследования.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Повысить точность диагностики степени злокачественности различных вариантов рака молочной железы гистологическим и

цитологическим методами на основании сравнительного изучения ряда общих морфологических признаков.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Изучить в сравнительном плане степень тканевого и клеточного атипизма при различных вариантах рака молочной железы гистологическим и цитологическим методами исследования.

2. Определить уровень пролиферативной активности опухолевых клеток различных вариантов рака молочной железы иммуногистохимическим методом с использованием моноклональных антител Кл-67.

3. Изучить экспрессию рецепторов эстрогенов и прогестерона, а также онкобелка НЕ112 опухолевыми клетками различных вариантов рака молочной железы иммуногистохимическим методом.

4. Разработать критерии цитологической диагностики степени злокачественности различных вариантов рака молочной железы.

Научная новизна

На основании комплексного морфологического исследования предложены объективные критерии, определения СЗ при гистологическом исследовании операционного материала, основанные на кариометрических показателях, которые могут применяться для всех гистологических форм РМЖ.

Разработана схема определения цитологической СЗ РМЖ, в основу которой положены кариометрические показатели.

Проведено сопоставление между определением СЗ гистологическими и цитологическими методами. Статистическим анализом подтверждена высокая достоверность предложенных критериев.

Показано, что рак молочной железы характеризуется относительно высоким уровнем пролиферативной активности опухолевых клеток, определяемой по экспрессии Кл-67, который статистически значимо ассоциирован как с митотической активностью клеток опухоли, так и с гистологической ядерной степенью злокачественности. Рак молочной железы высокой степени злокачественности отличается, преимущественно, негативным статусом рецепторов половых гормонов и гиперэкспрессией НЕИ2, однако эти признаки не могут расцениваться как самостоятельные критерии опухолевой анаплазии.

Практическая значимость.

Детализация ряда критериев традиционной методики НСБ

позволяет более точно оценивать СЗ различных форм РМЖ по операционному материалу. Предложенная схема определения ядерной СЗ применима к использованию для материала пункционных биопсий молочной железы толстой иглой и АПТИ. Оценка СЗ по ядерной атипии обеспечит лучшую согласованность результатов цитологического и гистологического методов. Разработанные цитологические и гистологические схемы определения СЗ РМЖ позволяют выработать тактику лечения больных разными формами РМЖ на дооперационном этапе.

Основные положения, выносимые па защиту

1. Система градации степени злокачественности рака молочной железы (Ноттингемская сумма баллов) обладает низкой воспроизводимостью и требует включения объективных критериев ядерного полиморфизма. При гистологических исследованиях наиболее важными признаками ядерного полиморфизма являются диаметр ядер опухолевых клеток, особенности контура ядерной мембраны и структуры хроматина, наличие атипических ядрышек.

2. Параметры ядерной атипии опухоли позволяют выделить отдельную систему градации всех гистологических форм рака молочной железы - ядерную степень злокачественности, которая может использоваться как при гистологическом, так и цитологическом исследованиях. Ядерная степень злокачественности, определенная различными методами, коррелирует с гистологической степенью злокачественности.

3. Ядерная степень злокачественности рака молочной железы согласуется с митотической активностью клеток опухоли и уровнем их пролиферативной активности, определяемым по экспрессии Кл-67.

Внедрение результатов исследования в практику Результаты исследования используются в практической работе патологоанатомических отделений ЦКВГ ФСБ России, ГКБ № 33 им. проф. А.А.Остроумова Департамента здравоохранения г. Москвы, 2 ЦВЕТ им. П.В. Мандрыка МО РФ.

Апробация материалов диссертации Результаты и основные положения работы доложены и обсуждены на научно-практической конференции ЦКВГ ФСБ России (Москва, 2008); Всероссийской юбилейной научно-практической конференция патологоанатомов (Красноярск, 2008); заседании кафедры патологической анатомии ГОУ ВПО МГСМУ Росздрава (2008).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы, из них 2 -в журналах «Хирург» и «Медицинская визуализация», включенных в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание доктора и кандидата наук».

Объем и структура работы Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 77 работ отечественных и 148 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 35 рисунками, 30 таблицами. Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.

Содержание работы Материалы и методы исследования Исследования выполнены на операционном материале от 110 больных, проходивших лечение по поводу инвазивного РМЖ, в Центральном Клиническом военном госпитале ФСБ России в 20052008 гг. Во всех случаях проводилось гистологическое и цитологическое исследование операционного материала, в 100 наблюдениях выполнено ИГХ. Женщин было 109, мужчина -1. Пациенты были в возрасте от 35 до 85 лет, в 33% случаев новообразование было выявлено в период 51-60 лет. У 40 (36,3%) пациенток болезнь обнаружена в пременопаузе, у 69 (62,7%) -постменопаузе. В 66 (60%) случаях заболевание верифицировано на дооперационном этапе по результатам АПТИ. Большинству этих больных сразу выполнялась радикальная мастэктомия по Пейти и Мадцену, только у двух объем операции ограничивался секторальной резекцией и аксиллярной лимфоаденэктомией. Четырем пациенткам назначалась неоадъювантная полихимиотералия. В 44 (40%) случаях проводилось срочное интраоперациошюе гистологическое исследование резецированного сектора молочной железы.

Морфологическое исследование выполнялось сразу после его поступления в патологоанатомическое отделение, в пределах 30-60 минут после проведения операции. Опухоли размером до 3 см на гистологическое исследование брались полностью, при больших размерах новообразования выбирались наиболее репрезентативные участки преимуществешю из его периферических отделов с окружающей опухоль тканью.

Гистологическое исследование. После вырезки и изготовления цитологических мазков материал помещался в 10% раствор нейтрального формалина и фиксировался в течение 1- 1,5 суток. В дальнейшем проводилась обработка по стандартным методикам, гистологический материал заливался в парафиновые блоки, го которых изготавливали гистологические препараты с окраской гематоксилином и эозином, а также срезы для иммуногистохимических реакций.

Кариометрия. Измерения размеров ядер клеток проводились при помощи окулярной сетки фирмы «Leica», откалиброванной с помощью объект-микрометра. В результате для каждого объектива была определена цена деления шкалы окулярной сетки, что позволило проводить измерения с точностью до 0,5 мкм.

Измерения диаметров ядер в наибольшем измерении проводились при гистологическом исследовании на срезах толщиной 5мкм, исследовались только те ядра, которые попали в срез целиком. Для измерения отбирались опухолевые клетки с ядрами наибольших размеров, как сферической, так и эллипсоидной формы. Такой подход был продиктован концепцией отбора клеток по схеме НСБ (наиболее выраженные признаки полиморфизма), а также с учетом фактора формы круга и эллипса ядра в гистологических срезах. Измерения ядер проводились при большом увеличении микроскопа (х400: объектив «40х»; окуляр «10х»). Исключались из оценки клетки вытянутой формы, напоминающие миоэпителиальные; ядра в состоянии митоза, а также структуры, подозрительные на наслоения нескольких ядер, многоядерные клетки и отдельные разбросанные клетки с крупными ядрами, если таковых было меньше десяти в препарате.

В качестве эталона кратности использовали ядра клеток нормального эпителия концевых отделов протоков молочной железы.

Цитологическое исследование. В работе проведено цитологическое исследование мазков операционного материала, полученного от 110 больных.

Для изготовления цитологического препарата с поверхности разреза опухоли до ее фиксации скальпелем производили соскоб, материал аккуратно распределялся по поверхности сухого обезжиренного стекла максимально тонким и равномерным слоем при помощи специального шпателя. Для окраски мазков использовалась методика Мая-Грюнвальда-Гимзы.

Измерение ядер опухолевых клеток проводились по тем же принципам, что и при гистологическом исследовании, кроме того, с соблюдением обязательного условия - наличия у клетки сохраненной цитоплазмы, с исключением голоядерных элементов и плохо окрашенных клеток в мазке.

Иммуногистохимическое исследование. Для ИГХ использовались парафиновые блоки с предварительно отобранными наиболее репрезентативными образцами опухоли. Исследование проводили на серийных парафиновых срезах толщиной 4 мкм, которые наносили на высокоадгезивные стекла, с полилизиновым покрытием. Далее материал обрабатывался по стандартной методике. Применялись готовые к использованию моноклональные антитела фирмы «DAKO» к эстрогенам (ER) clone 1D5, прогестерону (PgR) clone PgR 636, к ядерному белку пролиферирующих клеток (Ki-67) clone MIB-1, поликлональные антитела к онкогену рецептору эпидермального фактора роста (HER2 (c-erbB-2/neu), «Dako», разведение 1:300). В качестве детекционной системы применяли систему EnVision (Dako), в качестве хромогена - диаминобензидин, во всех случаях проводили докрашивание ядер гематоксилином.

Оценка реакции с антителами к HER2 проводилась по общепринятой шкале от 0 до 3+ (Jacobs T.W. и соавт., 1999). Выраженность экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону определяли по проценту клеток, имеющих рецепторы, и «показателю экспрессии» (Петров C.B., 2000). Было оценено 420 препаратов с иммуногистохимическими реакциями.

Статистический анализ данных выполнялся с использованием пакета программ Statistica 6.1 (StatSoft, Inc., США) в соответствии с рекомендациями Ребровой О.Ю. (2002). Описательная статистика количественных признаков представлена средними и среднеквадратическими отклонениями либо медианами и квартилями. Описательная статистика качественных признаков представлена абсолютными и относительными частотами.

Для сравнения несвязанных групп по количественным признакам выполнялся непараметрический дисперсионный анализ Краскел-Уоллиса, а затем множественные сравнения групп. Сравнение групп по качественным признакам проводилось с использованием теста Хи-квадрат и точного критерия Фшпера. Согласие оценок признаков анализировалось с использованием критерия К (каппа), вычислялись 95% доверительные интервалы.

Согласие количественных признаков оценивалось с использованием непараметрической корреляции Спирмена. При проверке гипотез статистически значимыми результаты считались при достигнутом уровне значимости р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

При анализе 110 наблюдений выявлены следующие инфильтрирующие формы РМЖ: протоковый рак - 78 (71%), дольковый рак -17 (15,4%), муцинозный рак - 7 (6%), по 2 случая медуллярного и метапластического рака - (по 2,2%) и по 1 случаю (1%) апокринового, нейроэндокринного, папиллярного и рака с гигантскими клетками типа остеокластов.

Определение СЗ РМЖ проводилось в соответствии с рекомендациями ВОЗ и Всемирного противоракового союза по схеме НСБ, параллельно проводилось определение СЗ по признакам ядерного полиморфизма. Были изучены следующие параметры.

Образование железистых структур. Формирование железистых структур закономерно преобладало при инфильтрирующем протоковом раке - 29 случаев (26,3%), однако отмечено их наличие при дольковом - 6 (5,4%), при муцинозной карциноме -3 (2,7%). При дольковом раке этот признак в пяти случаях набрал по два балла по НСБ, Была отмечена умеренно выраженная тенденция к утрате возможности опухолевых клеток образовывать железистые структуры в гистологических препаратах, от высокодифференцированных опухолей к

низкодифференцированным.

Гетерогенное строение большинства РМЖ обусловило необходимость внести уточнения в этот раздел НСБ. В тех случаях, когда опухоль имеет диспропорциональное строение по образованию железистых структур, в расчет следует принимать усредненное значение всех исследованных образцов.

При изучении цитологических мазков .операционного материала анализировалось расположение клеток в препарате. По аналогии с железистыми структурами, выявляемыми при гистологических исследованиях, оценивалась способность опухолевых клеток к адгезии и образованию различного вида клеточных скоплений. Последние обнаруживались в виде папиллярных и железистоподобных структур, солидных комплексов и т.п. Выделены три основные группы, на которые можно было разделить опухоли по этому признаку. Первая группа - опухолевые клетки располагаются

преимущественно в клеточных скоплениях; вторая - клеточные скопления и разрозненные опухолевые клетки находятся в равных соотношениях; третья - в основном разрозненные клетки опухоли. В цитологических мазках тенденция к образованию клеточных скоплений прослеживалась в меньшей степени, чем образование железистых структур при гистологических исследованиях. Сравнение доли клеточных скоплений при цитологическом исследовании с балльной оценкой «тубулообразования» при гистологическом исследовании выявило существенную несогласованность этих параметров (Карра~- 0.101). Статистический анализ сопоставления выраженности критериев «расположения клеток в мазке» с ЯСЗ показал отсутствие корреляции (%2~7,632; р=0,106).

Ядерный полиморфизм. При проведении исследования было отмечено, что критерии, указанные в схеме НСБ в отношении этой категории, недостаточно конкретизированы, уязвимы в отношении воспроизводимости (Dalton L. и соавт., 2000; Meyer J. и соавт., 2005; Tawfik О. и соавт., 2007) и могут трактоваться патологами по разному. Поэтому при проведении определения СЗ по известной схеме целесообразно использовать ряд уточняющих критериев. Для объективизации критериев «ядерного полиморфизма» были отобраны признаки, на основании которых в дальнейшем была разработана система оценки СЗ по ядерному полиморфизму - ЯСЗ применительно как к гистологическим, так и цитологическим методам исследования. С этой целью изучались минимальный и максимальный диаметры ядер опухолевых клеток, форма контура ядерной мембраны, морфологические особенности ядрышек, структура хроматина, внутриядерные включения, а также ряд других признаков.

Оценка размеров ядер опухолевых клеток. При помощи окулярного микрометра проводились измерения наиболее крупных и мелких ядер. По размеру самых крупных размеров ядер, опухоли были разделены на три основные группы. Первая группа - с диаметром ядер, не превышающих более чем в два раза ядро нормальной клетки эпителия протока (эталон); вторая - опухоли с диаметром ядер, превышающим эталон в два - три раза; третью группу составили опухоли с диаметром ядер, превышающим эталон более чем в три раза.

Наибольший диаметр ядер опухолевых клеток был расценен как важнейший признак, позволяющий объективно оценивать степень ядерного полиморфизма.

Максимальный диаметр ядер опухолевых клеток при изучении цитологических мазков составил 20-75 мкм. Распределение опухолей по группам показало отчетливую связь между СЗ и увеличением диаметра ядра (Табл. 1). При статистической обработке материала была выявлена четкая взаимосвязь между максимальным диаметром ядра в цитологических препаратах и ЦЯСЗ (критерий Кгизка^^ЫНБ, №=69,91; р<0,001).

Таблица 1. Соотношение диаметров ядер опухолевых клеток и

Признак цитология ев Степень дифференцировки

Л и 1ЦЯСЗ II ЦЯСЗ III ЦЯСЗ

Максимальный диаметр ядра х эталон 1 8* - -

2 - 41" -

3 - - 61*"

Всего 8 41 61

Примечание:

из них: 4<2*.4-2*: из них: 13=2х.

- из них: 7<3х

Наибольший диаметр ядер опухолевых клеток при гистологическом исследовании во всех наблюдениях составил 10-31,5 мкм. Сравнение групп с распределением новообразований по СЗ (НСБ и ГЯСЗ) показало их достаточно выраженную согласованность Табл.2). Максимальный диаметр ядра в гистологических препаратах ГЯСЗ выявили хорошую согласованность (Н = 81,35; р <0,001).

Таблица 2. Соотношение диаметра ядер опухолевых клеток и истологической ядерной степени злокачественности (ГЯЗС).

^--^Максимальный диам. 1 группа, 2 группа, 3 группа, Всего

опухоли <2* 2-3х >?х

^^-хэталон

СЗ

1 8* 2 1 11

СЗ (по НСБ) 2 - ' 44" 8 52

3 - - 47'" 47

1 8* - - 8

ГЯСЗ 2 - 40"" - 40

3 - - 62*"" 62

Примечания: * - все =2х

** - из них 7=2х. 7=3 х *** - из них 12=3* **** - из них б~2х, 1=3х ***** -из них 8^3*

Вариабельность формы контура ядерной мембраны. По

форме контура ядра опухоли были разделены так же на три группы. К первой группе отнесены новообразования с округлыми или овальными ядрами правильной формы. Ядра с неровным контуром, проявляющимся плавными изгибами, волнистостью относились ко второй группе. Третью группу составили опухоли с клетками, контуры ядра которых имели выраженную деформацию в виде отчетливых вырезов; глубоких борозд, проникающих вглубь ядра; выпячиваний различной формы (лопастьевидной, угловатой, в виде «песочных часов», дочерних или почкующихся ядер и т.п.); разрывов, резких утолщений.

При изучении цитологических мазков опухоли с монотонным клеточным составом и округлым контуром ядерной мембраны встречались крайне редко (1 наблюдение - 0,9% от числа всех опухолей). Во всех случаях помимо округлых ядер обнаруживалось диагностически значимое количество клеток с большей выраженностью этого признака. Контур ядра с небольшими плавными изгибами встретился в 15 случаях при II ЦЯСЗ (13,6%), а при третьей степени - выявлен лишь в 3-х (2,7%). В остальных 84 (76%) опухолях деформация контура мембраны ядра была наиболее выражена.

При анализе этого признака в гистологических препаратах его распределение практически полностью совпадало с данными цитологических исследований. При I ГЯСЗ в 1 наблюдении контур ядра был правильной формы; с плавными изгибами при I ГЯСЗ было 7(88%) наблюдений; при П ГЯСЗ -22(55%); при III ГЯСЗ - 8(13%). Максимально деформированный контур при I ГЯСЗ отсутствовал, при II ГЯСЗ наблюдался в 18(45%) случаях, при III ГЯСЗ - в 54 (87%).

Полученные данные свидетельствуют о том, что вариабельность формы контура ядерной мембраны нарастает по мере увеличения степени клеточной анаплазии, выявляемой при обоих методах исследования, что было подтверждено статистической обработкой материала. Отмечена статистически достоверная согласованность изменения контура ядерной мембраны при цитологическом и гистологическом исследованиях (карра= 0,512), а также их связь с ГЯСЗ и ЦЯСЗ (%2=35,62395; р<0,001 и /2=43,029; р<0,001). В то же время, его нельзя признать достаточно значимым и специфичным в качестве самостоятельного диагностического критерия при определении ЯСЗ, однако изменения контуров мембран

ядер могут оцениваться в качестве дополнительного признака определения ЯСЗ.

Ядрышки. В качестве ядрышек рассматривались округлые структуры с четкими границами, диаметром около 1 мкм и крупнее. По изменению ядрышек были выделены три группы опухолей: Первая - ядрышки не определялись при увеличении микроскопа х400 или обнаруживались редко, правильной формы, размером не более 2,5 мкм при гистологическом и не более 5 мкм при цитологическом исследованиях. Вторая группа - ядрышки были аналогичных параметров, определялись при увеличении микроскопа *200. Третью группу составили ядрышки, выявляемые при увеличении микроскопа хЮО, независимо от размера и количества, а также ядрышки более 2,5 мкм гистологически и более 5 мкм цитологически (макронуклеолы) при увеличении микроскопа *400 или атипические ядрышки (одновременно множественные и вариабельные по размеру и беспорядочно разбросанные по ядру).

При гистологическом исследовании атипические ядрышки обнаруживались только при II ГЯСЗ в 11(28%) случаях и при III ГЯСЗ - в 36 (58%). В цитологических препаратах атипические ядрышки обнаруживались при II ЦЯСЗ в 11(27%) наблюдениях, при 1П ЦЯСЗ - в 31 (51,6%). Отсутствие ядрышек при опухолях любой степени злокачественности было достаточно редким явлением. Статистическая обработка результатов гистологического и цитологического исследований показала удовлетворительную степень согласованности между проявлениями этого признака (карра=0,225). Ассоциация изменений ядрышек с ГЯСЗ (%2=19,03, р<0,001) и ЦЯСЗ (%2=28,275, р<0,001) была также статистически значима.

Полученные данные свидетельствуют о том, что вариабельность изменений ядрышек не имеет убедительной идентичности соответствующей ядерной СЗ при обеих методиках исследования и не может рассматриваться в качестве самостоятельно значимого критерия для разграничения между II и III ЯСЗ. Для оценки ядерного олиморфизма по НСБ в 3 балла по изменениям ядрышек, должны читываться только макронуклеолы и атипические ядрышки.

Хроматин. При оценке характера распределения хроматина в драх опухолевых клеток выделены три группы: первая группа -пухоли с тонкодисперсным, однородным хроматином, вторая -неравномерным хроматином с участками просветления, третья -

с грубодисперсным, крупноглыбчатым. Исследоваше проводилось только на больших увеличениях, лучше всего структура хроматина идентифицировалась при использовании иммерсионного объектива «100х». Распределение опухолей по состоянию хроматина при гистологическом исследовании в группах по СЗ (схема НСБ) было следующим: при I СЗ все 11 случаев были с неравномерным хроматином. При II СЗ всего в одном случае (2%) он имел однородную структуру, в 39 (75%) - неравномерную, в 12 (23%) -крупноглыбчатую. В III СЗ, в подавляющем большинстве - 39 (83%) хроматин имел наиболее выраженные признаки атипии, в 7 (15%) -относился ко второй группе оценки, в одном наблюдении был тонкодисперсным.

По сравнению с гистологическими препаратами структура хроматина в цитологических мазках выглядела более представительной. При распределении опухолей по структуре хроматина наиболее частые совпадения отмечались по 1П ЦЯСЗ (грубодисперсный - 82%), хорошая корреляция была во II ЦЯСЗ (69% - неравномерный). В меньшей степени признак проявился в I ЦЯСЗ (было равное количество случаев с однородным хроматином и неоднородным). Необходимо отметить, что однородный тонкодисперсный хроматин при РМЖ наблюдается достаточно редко (2% при гистологическом и 6% при цитологическом исследовании). В то же время оценка хроматина как крупноглыбчатого является достаточно сложной задачей, поэтому должна проводиться в последнюю очередь, когда исчерпан поиск других признаков, позволяющих выявить наибольший ядерный полиморфизм. Тем не менее, он важен в случаях сложных для разграничения между II и Ш СЗ. В целом при статистической обработке материала была получена статистически достоверная связь между структурой хроматина и ГЯСЗ и ЦЯСЗ (х2=49,863; р<0,001 /2=43,456; р<0,001), а также между изменениями хроматина при гистологическом и цитологическом исследованиях (карра=0,6). Обнаружение одного лишь «крупноглыбчатого» хроматина для оценки ядерного полиморфизма по НСБ в 3 балла недостаточно.

Внутриядерные включения. Этот критерий привлек внимание потому, что в некоторых модификациях НСБ его наличие (пузырьковидные внутриядерные включения) позволяет оценить ядерный полиморфизм в 3 балла. Следует отметить, что в нашем исследовании внутриядерные включения в гистологических

препаратах достоверно обнаруживались лишь в шести случаях (5 %), они относились ко II и III гистологической СЗ. Внутриядерные включения представляли собой пузырьковидные структуры разной величины, их количество варьировало от одного до нескольких. Наиболее выражен этот признак был в трех наблюдениях, у больных после неоадъювантной химиотерапии. Напротив, в цитологических препаратах внутриядерные включения выявлялись в большинстве случаев - 96%. Признак был признан неспецифичным в отношении цели исследования, при статистической обработке была отмечена его плохая согласованность, как с гистологической степенью злокачественности (%2=5,459; р>0,05), так и с его выраженностью при цитологическом исследовании (карра=0.026). Изучение этого признака может представлять интерес при оценке лекарственного патоморфоза опухолевых клеток в гистологических препаратах.

Таким образом, распределение новообразований по ГЯСЗ почти с абсолютной точностью совпало с ЦЯСЗ (карра=0,934) и статистически значимо (карра= 0.688) согласовано с гистологической СЗ по НСБ (Табл. 3).

Таблица 3. Распределения опухолей по СЗ при использовании

разных методов.

~~—---_ Метод —— IC3 II СЗ шсз Всего

Гистологическая СЗ (НСБ) 11 52 47 110

Гистологическая ядерная СЗ 8 40 62 110

Цитологическая ядерная СЗ 8 41 61 110

Количество митозов. Поскольку митозы не относятся к признакам ядерного полиморфизма, они не входят в систему градации ГЯСЗ и должны учитываться отдельно. Был проведен подсчет количества митозов и оценен в баллах по НСБ, результаты сопоставлены с ЯСЗ. Для высокодифференцированных (в!) опухолей была характерна низкая степень митотической активности, во всех наблюдениях они набирали 1 балл, при низкодифференцированных (03) напротив высокая - в 81% случаев 3 балла, при умеренно ифференцированных (02) признак распределился практически авномерно: одна часть набрала 1 балл - 21 (40%), другая 2 балла - 24 (46%) соответственно. При анализе взаимосвязи митотической активности и ЯСЗ была отмечена высокая согласованность этих признаков(х2=45,361; р<0,001).

Митозы в цитологических мазках, в отличие от гистологических препаратов обнаруживались гораздо реже. Это обстоятельство связано, прежде всего, с меньшим количеством клеток в мазке, вероятно, играет роль тот факт, что в состоянии митоза ядро не имеет мембраны, и в ^ результате механического воздействия при приготовлении мазка с подсушиванием на воздухе эти структуры легко разрушаются и становятся недоступными для верификации. Оценка митозов проводилась только в клетках с сохраненной цитоплазмой. При отсутствии и единичных митозах в препарате опухоли оценивали в один балл, при 3 -5 митозах - в 2 балла, при обнаружении шести и более митозов в микропрепарате - в 3 балла.

Полученные данные показали, что при I ЦЯСЗ митозы отсутствовали - опухоли набирали 1 балл; при II ЦЯСЗ 28 опухолей оценено в 1 балл, 4 опухоли в 2 балла. При III ЦЯСЗ 35 опухолей оценены в 1 балл, 13 - в 2 балла, 12 - в 3 балла. Несмотря на то, что признак показал плохую согласованность с гистологическим исследованием (карра= 0.026), при просмотре цитологических мазков в ряде случаев прослеживается тенденция увеличения количества митозов в опухолях с более низкой дифференцировкой. При статистическом анализе была отмечена корреляция митотической активности клеток при цитологическом исследовании с гистологической ядерной степенью злокачественности (%2=25,175; р<0,001).

Дополнительно был рассмотрен ряд клеточных и тканевых признаков злокачественности. К ним относятся: клеточный полиморфизм, ядерно-цитоплазматическое соотношение в опухолевых клетках, лимфоцитарная инфильтрация стромы, кальцинаты. Статистическая обработка материала показала, что значимым признаком явился только клеточный полиморфизм. При гистологическом исследовании степень его согласованности с ЯСЗ составила %2=51,034; р<0,001, при цитологическом %2=115,737; р<0,001. Однако определение этого критерия достаточно субъективно и может оцениваться различными исследователями не одинаково. Поэтому этот признак не может быть рекомендован для определения СЗ. Другие признаки имели плохую статистическую согласованность с аналогичными гистологическими критериями (карра= -0.0034 и ниже), а также ассоциативную корреляцию с цитологической и гистологической СЗ (р значительно больше 0,05).

Таким образом, для оценки ядерной степени злокачественности

все критерии могут быть разделены на 3 категории в порядке убывания их значимости (рис.1): к первой можно отнести диаметр ядер самых крупных опухолевых клеток; ко второй - форму контура ядра, наличие и морфологические особенности строения ядрышек, структура хроматина; к третьей - количественное определение митозов. Базисной является первая категория. К особенностям методики следует отнести тот факт, что во многих случаях, при оценке опухолей, занимающих промежуточное положение между I и II, а также II и III СЗ, помимо размера ядра, необходимо одновременное выявление не менее 2 дополнительных признаков (рис.2). Отличием определения ЦЯСЗ от ГЯСЗ является наличие дополнительного критерия - количества митозов. Этот признак при определении гистологической СЗ рассматривается отдельно, а при ЦЯСЗ может играть роль лишь в пограничных случаях, как дополнительный критерий. Обнаружение шести и более митозов в мазке в большей степени свидетельствует о наличии высоко злокачественной карциномы. Опухоли I ЯСЗ и небольшая часть II > СЗ обладают минимальными признаками ядерной атипии и трудноотличимы от дисгормональных пролиферативных процессов в эпителии молочной железы. Они наиболее сложны для орфологической верификации («серая зона»), особенно при АПТИ срочной интраоперационной биопсии с использованием (замороженных срезов», являясь одной из главных причин шибочных заключений и снижения показателей чувствительности тих методик. Практически все карциномы, диаметр ядра которых ревышают ядро эпителия нормального эпителия протоков молочной елезы более чем в 3 раза, являются низкодифференцированными пухолями.

Иммуногистохимическое исследование.

ИГХ с моноклональными антителами к рецепторам стероидных ормонов показало, что в целом позитивное и умеренно позитивное крашивание ЕЯ было отмечено в 53%, а № в 32% случаях. При гализе взаимосвязи СЗ с гормональным статусом опухолей было тмечено, что по мере нарастания СЗ снижалась их чувствительность ЕЛ (при в1 - в 72% случаев позитивная и умеренно позитивная еакция, при 02 - в 61%, при 03- в 40%). По сравненшо с ЕЫ ависимость экспрессии РЛ от СЗ была менее выражена: позитивное умеренно позитивное окрашивание отмечалось при 01- в 36%, 0241%, 03 -16% случаев. Вместе с тем, не было отмечено какой-либо

взаимосвязи между гистологической формой и степенью выраженности экспрессии рецепторов стероидных гормонов. При ИГХ с поликлональными антителами к рецепторам эпидермального фактора роста HER2, позитивное и умеренно позитивное окрашивание было выявлено у 28%, с гиперэкспрессией 10% больных РМЖ. Набольшее количество опухолей с гиперэкспрессией HER2 отмечалось в группе G3 - 17,8%, в группе G1 они отсутствовали, а в G2 составили 4,6%. Еще более четко видна связь экспрессии HER2 со СЗ при определении ее по ядерным признакам. При I ЯСЗ все опухоли имели отрицательную или слабо положительную экспрессию HER2. Не было обнаружено корреляции; между гиперэкспрессией HER2 и поражением лимфатических узлов, менструальным статусом и возрастом пациенток. Сопоставление гиперэкспрессии HER2 и гормонального статуса опухолей показало обратную зависимость этих показателей. В в подавляющем большинстве случаев (70% с ER и 80% с PR) экспрессия рецепторов эстрогенов и прогестерона была отрицательной. Гиперэкспрессия HER2 также сочеталась с высоким уровнем пролиферативной активности.

При анализе в группах с отрицательной, слабо или умеренно позитивной реакцией с HER2, подобных закономерностей выявлено не было.

ИГХ с моноклональными антителами к Ki-67 показало, что пролиферативная активность клеток увеличивается по мере нарастания СЗ. Наибольшее количество опухолей с высоким уровнем пролиферативной активности отмечалось при G3 (80%), при G2 их количество было в два раза меньшим (42%), а при G1 они отсутствовали. При статистическом анализе была отмечена хорошая согласованность экспрессии Ki-67 с ЯСЗ (%2=11,57308; р<0,05), и количеством митозов при гистологическом исследовании (Карра= 0.497). Анализ взаимосвязи уровня пролиферативной активности клеток с гормональным статусом показал обратную зависимость этих показателей: при низком уровне пролиферативной активности большая часть опухолей (66,7% и 50%) давали позитивную и умеренно позитивную реакцию с ER и PR, при высоком - негативная реакция отмечалась в 55,6% (ER) и 77,8% (PR) случаев. При умеренном уровне пролиферации какой-либо закономерности выявить не удалось.

Основной критерий Дополнительные признаки

сз Превышение 0 ядра эталона в храз Ядерная мембрана Хроматин Ядрышки Митозы

I ! Округлая, росная О Однородный тонкодишерсный О Редкие, на увеличении х40, мелкие О Не определяются О

II §11 Ир Неровная, с ш большими плавными изгибами Неравномерно распределен по ядру Обюруаоваютси да увеличении Могут быть обнаружены 2-5 в препарате

III С глубокими бороздами, вырезами, утолщениями, шш&тг -яшшш бшштшш Крупно шь&шт крупные, атипичные >6

Рис.1. Схема определения ядерной степени злокачественности.

1СЗ

Рис.2. Схема определения ядерной степени злокачественности для пограничных случаев.

Выводы

1. Система градации степени злокачественности рака молочной железы (Нотгингемская сумма баллов) обладает низкой воспроизводимостью и требует включения объективных критериев ядерного полиморфизма. Максимальный диаметр ядер опухолевых клеток статистически значимо различен в опухолях разной степени злокачественности и является наиболее важным критерием ядерной атипии при гистологическом исследовании. Другими важными критериями ядерного полиморфизма, ассоциированными со СЗ, являются контуры ядерной мембраны, атипические и крупные ядрышки, хроматин.

2. Кариометрические показатели опухолевых клеток и другие параметры ядерной атипии позволяют выделить отдельную систему градации рака молочной железы — ядерную степень злокачественности, которую необходимо указывать отдельно в патоморфологических заключениях.

3. Рак молочной железы характеризуется относительно высоким уровнем пролиферации опухолевых клеток, определяемой по экспрессии Ю-67, который статистически значимо ассоциирован как с митотической активностью клеток опухоли, так и с гистологической ядерной степенью злокачественности.

4. Негативный статус рецепторов половых гормонов и гиперэкспрессия НЕЛ2 преимущественно наблюдаются при раке молочной железы высокой степени злокачественности, однако эти признаки не могут расцениваться как самостоятельные критерии опухолевой анаплазии.

5. Количественные и качественные признаки ядерной атипии, выявленные при гистологическом исследовании, статистически значимо согласованы с аналогичными признаками при цитологическом исследовании. Определение цитологической ядерной степени злокачественности следует проводить на основании оценки тех же критериев ядерной атипии, что и при гистологическом исследовании.

6. Цитологическая ядерная степень злокачественности рака молочной железы полностью совпадает с гистологической и статистически значимо ассоциирована с гистологической степенью злокачественности, определяемой по Ноттингемской сумме баллов.

Практические рекомендации

1. Формулировка патологоанатомического заключения по операционному материалу рака молочной железы должна проводиться с указанием С3 опухоли в виде детального отображения слагаемых НСБ в баллах. Дополнительно должна указываться ЯСЗ.

2. При формулировке патологоанатомического заключения по материалу толстоигольной пункции или в случаях медуллярного рака, протоковых и дольковых карцином in situ должна использоваться схема ядерной СЗ.

3. Для более объективной оценки уровня пролиферативной активности клеток опухоли - по биопсийному и операционному

атериалу целесообразно дополнительно к подсчету количества итозов использовать ИГХ с моноклональными антителами к Ki-67.

4. При формулировке заключения по материалам АПТИ в лучаях верификации рака необходимо указывать ЯСЗ.

5. Определение СЗ на дооперационном этапе позволяет фименять более дифференцированный подход к выбору схем еоадъювантной химио - и лучевой терапии. Разработанная методика

перспективе поможет более объективно оценивать степень ечебного патоморфоза опухолевых клеток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации . Филатов A.B. Определение степени злокачественности различных юрфологических форм рака молочной железы. //Сборник работ Современные проблемы клинической цитоморфологии» - Санкт-етербург - 2007 - стр.115-116.

. Нуднов Н.В., Самойленко В.М., Буткевич А.Ц., Кальченко Б.Л., учин A.M., Юдин А.Л., Михайлов М.М., Вуйцик Н.Б., Филатов .В. Диагностические биопсии под контролем ультразвуковой и омпьютернои томографии. //Медицинская визуализация -№2008- стр.122-128. Филатов A.B., Зайратьянц О.В. Морфологические критерии ределения степени злокачественности и факторов прогноза ака молочной железы //Хирург № 8- 2008 - стр.58-65. Филатов A.B. Методы определения степени злокачественности ка молочной железы. //Сборник работ посвященных всероссийской билейной научно-практической конференции патологоанатомов к 0-летию со дня рождения профессора П. Г. Подзолкова -асноярск - 2008 - стр.85-88.

\\

Формат А5

Бумага офсетная N1-80 г/м2 Усл. печ. л. о,7 Тираж i о о экз. Заказ № 6S

Отпечатано в РИО МГМСУ Изд. лицензия ИД № 04993 от 04.06.01 года Москва, 103473, Делегатская ул., 20/1