Автореферат и диссертация по медицине (14.01.17) на тему:Гидроколлоидное раневое покрытие с иммобилизованным протеолитическим комплексом на основе гепатопанкреазы краба и хитозана в лечении гнойных ран

На правах рукописи

Шикунова Анна Юрьевна

Г ИДРОКОЛЛОИДНОЕ РАНЕВОЕ ПОКРЫТИЕ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИМ КОМПЛЕКСОМ НА ОСНОВЕ ГЕПАТОПАНКРЕАЗЫ КРАБА И ХИТОЗАНА В ЛЕЧЕНИИ ГНОЙНЫХ РАН

14.01.17-хирургия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 2 ДПР 2012

Москва-2012

005019906

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального. образования «Московский государственный медико-стоматологический . университет» (ректор - Заслуженный врач РФ, профессор О.О. Янушевич) Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, ГАЛЛЯМОВ

доцент Эдуард Абдулхаевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, ДЕРБЕНЕВ

профессор Валентин Аркадьевич

доктор медицинских наук, ЯКОВЕНКО

профессор Игорь Юрьевич

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздравсоцразвития России

Защита состоится 1Г илаЛ 2012 года в 14:00 часов на заседа-

нии Диссертационного совета Д 208.041.02 при ГБОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России по адресу: 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России по адресу: 125206, г. Москва, ул. Вучетича, д. 10а.

Автореферат разослан «

012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, старший научный сотрудник,

кандидат медицинских наук , О.В. Данилевская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Лечение ран относится к числу наиболее древних и не стареющих проблем хирургии. Несмотря на внедрение разнообразных методов и средств их лечения, результаты предпринимаемых усилий довольно скромны - нагноение раны гарантировано увеличивает сроки лечения, всегда ухудшает косметические, иногда - функциональные результаты (Луцевич О.Э., 2011). Основными методами лечения, позволяющими быстро очистить рану от некротических тканей, полноценно дренировать и создать условия для заживления, являются: некрзктомия, промывание растворами антисептиков, дренирование и раннее закрытие оперативным путем (Гостищев В.К., 2011; Толстых П.И., 2010).

Однако эти принципы хирургического лечения выполнимы далеко не всегда. Так, клиническая практика показывает, что полная хирургическая обработка раны возможна у 70-80% больных. При этом лишь в 35% случаев наблюдений после такого рода обработки можно наложить первичные швы. У остальных же больных проводится местное лечение (Кузин М.И., 2002).

В современной хирургии- получил развитие метод местного лечения раневыми покрытиями - терапевтическими системами с различными комплексами ферментов протеолиза, обеспечивающими ферментативный дебридеман (Ме-душева Е.О., 2010). Такое лечебное покрытие, наряду со способностью разрушать путем гидролиза белки нежизнеспособных тканей и медиаторы воспаления, нормализует в гнойной ране кровообращение благодаря антимикробной и антиоксидантной активности, стимулирует репаративные процессы и тем самым сокращает сроки заживления (Луцевич О.Э. и соавт., 2011). К недостаткам лечения данным методом относятся низкие водопоглощение и капиллярность.

Частично проблему абсорбции и удаления токсинов решает использование нерастворимых полимеров с гидрофильными центрами, способными удерживать в своей структуре значительное количество воды. Однако установлено, что в этом случае требуется прикрытие системной антибиотикотерапией (Williams С., 1995; Назаренко Г.И., 2002).

В этой связи представляется целесообразным изучить гидроколлоидную раневую повязку с иммобилизованным протеолитическим комплексом на основе гепатопанреазы краба и хитозана, обладающим мощным некролитическим эффектом (препарат гепатопанреазы краба), с гидроколлоидным компонентом, впитывающим атравматичным слоем из перфорированного двуслойного нетканого материала на основе модифицированного полиэтилена для нарастающего эпителия.

Цель исследования заключается в изучении свойств гидроколлоидной раневой повязки с иммобилизованным протеолитическим комплексом на основе гепатопанреазы краба и хитозана (далее также -модифицированное раневое покрытие), которые будут способствовать улучшению результатов лечения гнойных ран мягких тканей.

Задачи исследования

1. Изучить физико-механические и гигиенические свойства модифицированного раневого покрытия.

2. Оценить возможность применения модифицированного раневого покрытия для лечения гнойных ран посредством проведения токсикологических исследований и изучения мутагенной активности.

3. Провести комплексную сравнительную оценку антибактериального действия модифицированного раневого покрытия на клинические штаммы микроорганизмов, неспорообразующие анаэробы и микробные ассоциации.

4. Экспериментально по данным морфологических, функциональных, планиметрических, микробиологических методов исследований изучить влияние модифицированного раневого покрытия на течение раневого процесса.

Научная новизна

Впервые в ходе исследования:

изучены физико-механические и гигиенические свойства модифицированного раневого покрытия;

- доказано, что модифицированное раневое покрытие не обладает токсическим и гемолитическим эффектом;

- доказано, что модифицированное раневое покрытие усиливает фагоцитоз; нормализует микроциркуляцию в мягких тканях, формирующих гнойную рану; усиливает макрофагальную реакцию и пролиферацию фибробластов и ангиогенез; способствует ускорению образования и созреванию нормальной грануляционной ткани.

Практическая значимость работы

Доказано преимущество применения модифицированной раневой повязки для лечения гнойных ран мягких тканей в сравнении с применяемыми методами лечения современными биологически активными раневыми покрытиями.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Модифицированное раневое покрытие не оказывает общетоксического действия и не обладает гемолитическим эффектом.

2. Модифицированное раневое покрытие отвечает требованиям ГОСТов №3816-18; 10550-75; 12088-77, вследствие чего может быть рекомендовано для применения в клинике для лечения гнойных ран мягких тканей.

3. Модифицированное раневое покрытие высокоэффективно и патогенетически обосновано в лечении экспериментальных гнойных ран.

Внедрение результатов исследования

По результатам экспериментального исследования подготовлена документация для получения разрешения на клиническую апробацию модифицированного раневого покрытия.

Апробация работы

Результаты и основные положения исследования доложены и обсуждены

на:

Областной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 5-летию открытия кафедры общей факультетской хирургии ГКА им. Маймонида на базе МУЗ «Видновская районная клиническая больница» (г. Видное, Московская обл., 20 мая 2011);

объединенной научно-практической конференции кафедр хирургических болезней ГБОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России и НИИТМ РИА, проведенной 24 июня 2011 года.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 3 работы в научных журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, где должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук.

Подана заявка в Институт патентной экспертизы о признании изобретением гидроколлоидного раневого покрытия с иммобилизованным протеолитическим комплексом на основе гепатопанкреазы краба и хитозана.

Степень личного участия в работе

Основана на самостоятельном участии в проведении серии экспериментов на 60 беспородных крысах и 40 белых беспородных мышах, включенных в исследование.

В ходе сбора материала для диссертационной работы обоснованы методики моделирования гнойной раны, оценки мутагенных, антибактериальных свойств раневых покрытий in vitro и in vivo, а также методики оценки физико-химических и гигиенических свойств.

Лично выполнены: планирование и статистический анализ, оформление научных статей, написание и оформление диссертационной работы.

Состоялись неоднократные личные выступления на научных конгрессах и конференциях в Российской Федерации и за рубежом.

Структура и объём диссертации

Диссертационное исследование изложено на 107 страницах машинописного текста; состоит из введения, трёх глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы (108 литературных источников: 55 - отечественных и 53 - зарубежных). Текст иллюстрирован 18 таблицами и 19 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

С целью научно аргументировать возможность лечения гнойных ран модифицированным раневым покрытием проведены экспериментальные исследования in vitro и in vivo, сопоставимый анализ санитарно-гигиенических, патоморфологических, микробиологических данных современных методов лечения гнойных ран мягких тканей.

Проведенные исследования подразделяются на следующие 3 группы.

1. Исследование физических свойств модифицированного раневого покрытия: водопоглощения, капиллярности, жёсткости при изгибе, воздухопроницаемости, протеолитической активности, устойчивости свойств к методам стерилизации.

2. Санитарно-технологические и токсикологические испытания, доказывающие его безопасность в практическом применении.

3. Исследование влияния на процесс заживления посредством микробиологических, морфологических и гистологических методов испытания. .

При.:;- этом водопоглощение и капиллярность определялись по ГОСТу 3816-18. С целью определения водопоглощения из подготовленных образцов испытуемых текстильных материалов вырезали пробы размером 3x3 см2, взвешивали их на торсионных весах, погружали в емкость с дистиллированной водой на 60 сек. После выдерживания в воде пробы вынимали, помещали на сложенную в три слоя фильтровальную бумагу, сверху покрывали тремя слоями фильтровальной бумаги и отжимали валиком, взвешивали. Водопоглощение вычислялось по формуле:

B=100*(mb-mc)/mc,

где Шь- масса влажной пробы в г, тс - масса пробы до увлажнения в г.

Для определения капиллярности (исследовалась ее кинетика) готовились пробы материала в виде полосок размером 50x300 мм2, накладываемые на горизонтальную планку. К нижнему концу испытуемой полоски материала подвешивали груз в виде стеклянных палочек, масса которого менялась

в зависимости от поверхностной плотности материала. Нижний конец пробы опускали в сосуд с раствором бихромата калия в количестве, необходимом для покрытия стеклянных палочек. В момент опускания пробы в раствор включали секундомер. Показателем капиллярности считали высоту подъема жидкости по образцу за 60 минут.

Жесткость перевязочного материала определялась в соответствии с ГОСТом 10550-75 на гибкометре ПТ-2 отдельно для разных направлений полотна (по основе и утку). Испытуемую полоску материала определенного размера помещали на горизонтальную опорную площадку и закрепляли грузом. Полочки площадки постепенно опускали, полоска материала свисала. Смещение свободного конца полоски (абсолютный прогиб) принимали за меру деформации изгиба.

Воздухопроницаемость определяли по ГОСТу 12088-77 на приборе ВПТМ-2 при перепаде давлений 49+0,1 Па. Для испытания применяли съемный столик с отверстием площадью 2 см2. По показаниям прибора для каждого полученного значения с помощью таблиц перевода определяли расход воздуха, протекающего через испытуемую пробу.

Определение протеолитической активности проводилось в соответствии с ФС 42-3008-93. Протеолитическая активность 1 г материала должна быть не менее 0,1 ПЕ. При этом в образцах исследуемого модифицированного раневого покрытия показатель составлял 0,6±0,03 ПЕ/г. Количество белка в раневом покрытии определяли по методу Лоури в модификации Гартли, основанном на образовании в присутствии белка биуретового комплекса, дающего с реактивом Фолина характерную окраску, пропорциональную количеству белка. К навеске раневого покрытия добавляли по 1 мл дистиллированной воды и 0,9 мл реактива А (раствор К-Ыа-тартрата и карбоната в NaOH). Смесь выдерживали 10 минут при температуре 20°С, после чего быстро (в течение 3-5 секунд) добавляли 3 мл реактива Фолина, разведенного перед опытом дистиллированной водой в соотношении 1:15; перемешивали и вновь выдерживали в термостате при температуре 50°С в течение 10 минут. После охлаждения до комнат-

ной температуры (t°=20°C) содержимое пробирок фильтровали через бумажный фильтр и доводили объём до 10 мл дистиллированной водой. Оптическую плотность раствора измеряли на спектрофотометре при длине волны 650 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против контроля. Для контроля брали образцы матрицы без иммобилизованных ферментов и проводили через всю методику, описанную выше. Количество иммобилизованного на текстильной матрице фермента определяли по калибровочной кривой в мг на г матрицы.

В рамках метода стерилизации модифицированного раневого покрытия полученные модифицированные повязки запаивались в двойные полиэтиленовые пакеты и подвергались стерилизации посредством у-облучения в дозе 25 кГрей, обеспечивающей достаточный для безопасного применения уровень микробиологической чистоты. Биологическая активность иммобилизованных гепатопанкреазы краба и хитозана оставалась неизменной после у-обработки; протеолитическая активность протеолитического комплекса практически не менялась.

Изучение физико-химических свойств материалов проводилось с-ПИИТМ РИА (генеральный директор - доктор технических нау,-с, профессор, лауреат государственных премий СССР В.Н. Филатов) совместно с кандидатом биологических наук В.В. Рыльцевым; заместителем директора по науке, доктором медицинских наук Е.О. Медушевой. Статистическая обработка результатов исследования проведена с помощью программ Microsoft Excel 2007, Statistic 5.773 методом вариационной статистики, включающим вычисление средних величин (М), стандартных величин (±т). Для оценки достоверности (значимости) различий двух средних величин применяли критерий Стьюдента (t). Приемлемой считали значимость р<0,05. Эксперименты in vivo выполнены в соответствии с приказом МЗ СССР от 12 сентября 1977 г. № 755 на 60 беспородных крысах массой 180±20 г (в их числе 50 крыс-самцов использовались для получения модели раны; 10 крыс обоего пола-для оценки сенсибилизирующего действия вытяжек) и 40 белых беспородных мышах весом 16±0,9 г для изучения токсичности в условиях общего лекарственного наркоза (Sol. Ketamini

hydrochloridi 0,05% - 0,4 ml + Sol. Relanii 0,2 ml) при температуре в помещении в пределах 20°С. Режим содержания и питания был одинаковым во всех группах. Плоскостную кожно-мышечную рану получали по методике А.В. Николаева (1979) в модификации М.П. Толстых (2002), которая заключалась в следующем. За 30-40 минут перед опытом in vivo в стерильную чашку Петри помещалась ровная круглая поролоновая губка толщиной 0,5 см и диаметром 2 см, предварительно простерилизованная и высушенная в термостате; заливалась 1 мл суточной взвеси культур Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa (1 мл взвеси - 108 КОЕ). Размеченный квадратным трафаретом 2x2 см2 (4 см2), кожно-фасциальный лоскут иссекался острыми глазными ножницами. Мышечное дно раны раздавливали зажимом Кохера. Для предупреждения контракции раны за счёт эластичности, стандартизации условий лечения к краям раны подшивалась пластмассовая рамка, соответствующая размеру раны, внутрь которой укладывалась круглая инфицированная поролоновая губка. Рамка, в свою очередь, укрывалась полиэтиленовым «капюшоном» для удержания инфицированной поролоновой губки на дне и предупреждения высыхания раневой поверхности. Через 48 часов развивалась картина гнойного воспаления. С этого момента начинали местное лечение ран животных. Испытуемое раневое покрытие, предварительно смоченное в изотоническом растворе NaCl 0,9%, накладывали на рану, фиксируя салфетку 2-3 швами к ее краю. В зависимости от метода лечения все животные были разделены на 3 группы: основную и 2 контрольных.

В основной группе (п=20) лечение животных проводилось модифицированным раневым покрытием на основе целлюлозы (ТУ 9281-009-11734126-00). Состав повязки: в 100 г салфетки содержалось протеолитического комплекса из гепатопанкреазы - 1,8 г, хитозана - 0,5 г, целлюлозы - 98,7 г. Особенностью раневого покрытия являлось введение в его состав гидроколлоидного компонента, обеспечивающего атравматичность.

В первой контрольной группе (п=20) применялось раневое покрытие «Мультиферм», ранее апробированное в клинике и разрешенное к применению. По составу салфетка «Мультиферм» близка к усовершенствованному раневому

покрытию. Вместе с тем различие заключается в иной основе, на которую иммобилизован протеолитический комплекс.

Во второй контрольной группе животных (п=10) лечение ран проводилось под медицинской марлей. Крыс забивали декапитацией на 3-й, 7-е и 14-е сутки. Время экспозиции испытуемой модифицированной салфетки на раневую поверхность составляло трое суток, когда часть животных выводилась из эксперимента для забора и изучения гистологического материала. В дальнейшем на раны накладывали повязки, смоченные стерильной дистиллированной водой.

При выполнении исследований in vivo использованы гистологический, гистохимический, планиметрический и бактериологический методы. Материалом для гистологических и гистохимических исследований стали полоски ткани, вырезанные от края до середины раны и до подлежащих мышц сразу после выведения из опыта животных на 3-й, 7-е, и 14-е сутки. Биопсий-ный материал фиксировали в жидкости Корнуа в течение 2-х часов и заливали в парафин. Срезы толщиной 5-7 микрон окрашивали гематоксилином-эозином, микрофуксином по Ван-Гизону - на коллагеновые. -олокна, фукселином -на эластические волокна, импрегнировали серебром по Гомори - для выявления аргирофильных структур. Также использовали гистохимические методы: окраску толуидиновым синим, выявление гликозаминогликанов и их комплексов с белками (протеогликанов), ПАС-реакцию - для выявления гликогена и гликопротеинов, реакцию Браше - для выявления РНК и реакцию Фельгена - для выявления ДНК в клетках. Данные исследования проводились совместно с доктором медицинских наук, профессором В.И. Елисеенко. Планиметрические исследования выполняли на 10-е, 15-е и 20-е сутки.

Испытание антимикробной активности in vitro проводилось на твёрдых и жидких питательных средах, на твёрдых питательных средах - по методикам «агаровых пластин» и «погружённого в агар волокна». Изучение антимикробной активности перевязочных материалов in vivo и in vitro проводилось совместно с кандидатом медицинских наук А.Н. Памбухчаном.

Результаты санитарно-химических испытаний. Содержание в водных вытяжках из образца модифицированного раневого покрытия восстановленных примесей, выраженное в объёме 0,02% раствора тиосульфата натрия, затраченного на их определение, составляло от 0,2 до 0,8 мл (допустимое - 1 мл). Изменение рН вытяжек в сравнении с контролем - от 0,12 до 0,85 (допустимое -1,00); рН вытяжек - от 5,06 до 6,24 (допустимое - 3,0-9,0). Максимальная оптическая плотность в интервале длин волн 220-360 нм - от 0,088 до 0,14 (допустимое - 0,3); рН вытяжек из опытных раневых покрытий - от 4,76 до 6,71. Таким образом, результаты санитарно-химических испытаний позволяют отнести указанные материалы к категории химически достаточно стабильных.

Определение на мышах острой токсичности вытяжек из материалов-носителей и из раневого гидроколлоидного раневого покрытия. Белым мышам обоего пола вытяжки из используемых образцов материалов, характеризовавшихся более высокими интегральными санитарно-химическими показателями, вводили внутрибрюшинно в количестве 50 мл/кг массы тела (количество сухого вещества гепатопанкреазы краба и хитозана в салфетке 10x10 см2 весом 1,5 г составляло 0,0024 г). Контрольным животным вводили модельную среду, то есть дистиллированную воду. На протяжении всего периода наблюдения (2 недели) не отмечено гибели подопытных животных, а также изменений внешнего вида, поведения, двигательной активности по сравнению с контрольной группой животных. По окончании эксперимента животных забивали декапитацией, изучали гематологические и биохимические показатели периферической крови, определяли весовые коэффициенты внутренних органов. Анализ результатов показал, что однократное внутрибрюшинное введение вытяжек не оказывает существенного влияния на показатели крови. На вскрытии макроскопически не выявлено патологических изменений внутренних органов и тканей. Коэффициенты масс внутренних органов подопытных животных не имеют статистически достоверных отличий от аналогичных показателей животных контрольных групп.

При гистологическом исследовании местной тканевой реакции у мышей на введение вытяжек и внутренних органов животных никаких половых отличий в характере и степени ответной реакции обнаружено не было.

С целью изучения хронической токсичности для выявления токсического действия модифицированного раневого покрытия при повторных контактах с организмом был проведен хронический эксперимент. Количество животных в каждой группе составило 16; перед началом введения вытяжек у них были сняты фоновые показатели. Учитывая назначение изучаемых материалов, вытяжки вводили подкожно через день по 0,2 мл. Общая продолжительность эксперимента составила 16 недель. На протяжении 12 недель животным вводили вытяжки, после чего половина крыс выводилась из опыта, другая половина в группе была оставлена на «восстановительный период» продолжительностью 4 недели. Контрольная группа крыс получала в тех же условиях дистиллированную воду. В рамках результатов обследования животных после окончания введения вытяжек на протяжении всего периода наблюдения не отмечено гибели подопытных животных, а также изменений внешнего вида, поведения, поедае-мости корма, двигательной активности по сравнению с животными контрольной группы. Еженедельное взвешивание животных не показало выраженного отличия в прибавке массы тела опытных и контрольных крыс: прибавка массы тела контрольных крыс составила 52% и 21% от исходного соответственно для самцов и самок. В группах крыс, получавших вытяжки из испытуемого материала, аналогичные показатели имели значения 45% и 23% соответственно. По окончании введения вытяжек животных забивали декапитацией, изучали гематологические и биохимические показатели крови, определяли весовые коэффициенты внутренних органов, проводили гистологическое изучение местной реакции и внутренних органов. Анализ результатов обследования животных на этом этапе эксперимента не выявил отличий в показателях крыс опытных и контрольных групп ни по одному из наблюдаемых тестов. Весовые коэффициенты внутренних органов подопытных животных не имели статистически достоверных отличий от аналогичных показателей животных контрольных групп.

Результаты обследования животных после восстановительного периода. На протяжении наблюдения в течение всех 4 недель за оставленными животными их гибели, а также изменений внешнего вида, поведения, поедаемости корма, двигательной активности по сравнению с животными контрольной группы не отмечено. По окончании восстановительного периода животных забивали декапитацией, изучали гематологические и биохимические показатели крови, определяли весовые коэффициенты внутренних органов, проводили гистологическое изучение местной реакции и внутренних органов. Полученные результаты свидетельствуют, что ни по одному из наблюдаемых показателей отличий в опытных группах от контроля не отмечено. Весовые коэффициенты внутренних органов подопытных животных также не имели статистически достоверных отличий от аналогичных показателей животных контрольных групп.

Гистологическое исследование внутренних органов и мягкой тканевой реакции у крыс. После окончания восстановительного периода хронического опыта во внутренних органах животных опытных групп и местно не было обнаружено никаких изменений по сравнению с животными контрольных групп.

С целью изучения сенсибилизирующего воздействия возможное аллергенное действие вытяжек изучали в опытах на белых крысах обоего пола при предварительной внутрикожной (в ухо) сенсибилизации животных, многократных подкожных введениях с применением провокационной внутрикожной пробы и проведением серологической диагностической реакции с сывороткой крови с целью выявления наличия комплекса «антиген-антитело» по реакции дегрануляции тучных клеток. Дополнительным тестом служило определение коэффициента массы иммунокомпетентных органов - тимуса и селезёнки, их соотношение. Анализируя все показатели, по которым оценивали сенсибилизирующее воздействие вытяжек: отрицательная провокационная внутрикожная проба; процент дегрануляции тучных клеток - 4,0% у самцов и 2,4% - у самок (при значениях 10-15% дегрануляции, рассматриваемых как слабая реакция); отсутствие отличий от контроля весовых коэффициентов тимуса и селезёнки; соотношения тимус/селезёнка во всех проведённых сериях эксперимента,

можно сделать вывод, что животные не проявили гиперчувствительности к протеолитическому комплексу на основе гепатопанкреазы краба и хитозана. При вскрытии этих животных макроскопически не обнаружено отличий внутренних органов и тканей от крыс контрольных групп. Весовые коэффициенты внутренних органов также не имели статистически достоверных отличий.

Изучение гемолитического действия вытяжек из материалов-носителей и материалов с протеолитическим комплексом на основе гепатопанкреазы краба и хитозана in vitro проводилось в соответствии со стандартной методикой по 100% гемолизу. Вытяжки из всех испытуемых образцов материалов не проявили гемолитическое действие в опытах in vitro с изолированными эритроцитами кроликов: гемолиз от 0 до 0,34% - для вытяжек из материалов-носителей и от 0 до 0,44% - для вытяжек из гидроколлоидных раневых покрытий с иммобилизованным протеолитическим комплексом на основе гепатопанкреазы краба и хитозана при допустимом значении показателя - не менее 2%.

Изучение цитотоксической мутогенной активности вытяжек из модифицированного раневого покрытия. Клетки опухоли человека (карцинома шейки

Í7Í

матки Hela) культивировали во флаконах Карреля в среде Игла с добавлением глютамина и 10% сыворотки крупного рогатого скота. Экстракцию проводили в среде Игла; 1 см2 помещали в 0,5 мл среды и инкубировали в течение 7 суток при температуре 37°С. Вытяжки из перевязочных материалов добавляли к клеткам на 24 часа. Во флаконы обычно высевали по 106 клеток, помещали их в термостат при температуре 37°С. на 48 часов. Затем добавляли вытяжки и выдерживали клетки в течение 24 часов. Далее среду с экстрактом сливали, клетки промывали, добавляли свежую среду с сывороткой и оставляли клетки для роста в течение 3-х суток. Затем подсчитывали число выросших клеток в опытной группе по отношению к контрольной. Мутагенную активность определяли при помощи бактериальной .тест-системы Эймса (Arnes et al., 1975). Индикаторные штаммы Salmonella typhirmirium ТА1535, ТА1538, ТА100, TA98, AG262 несут мутацию ауксотрофности по. гистидину. Тест Эймса - один из основных методов, применяющихся в «просеивающих» программах, когда нужно сравнитель-

но быстро проанализировать большое количество химических соединений и отобрать обладающие мутагенной активностью; позволяет выявить не только прямые мутагены, но и промутагены. Наличие мутагенного эффекта у исследуемых препаратов определялось по индукции обратных мутаций от ауксотроф-ности по гистидину и прототрофности. Такие бактерии приобретают способность расти на агаре, не содержащем гистидина. Однако в верхний слой агара, куда помещали бактерии-тестеры и испытуемый препарат, добавляли гистидин в концентрациях, обеспечивающих несколько циклов деления клеток на селективной среде. Внесение этих добавок необходимо, так как некоторые мутагены индуцируют мутации, способные проявиться только в процессе репликации ДНК с первичными повреждениями. Все эти штаммы содержат другие мутации (rfa - нарушение синтеза липополисахаридов, в результате чего возрастает проницаемость клеточной стенки; uvrB - нарушение эксцизионной репарации (делеция участка gal-bio-uvrB) и штаммы с этой мутацией нуждаются в биотине), повышающие их чувствительность к действию мутагенов. Штаммы ТА98, ТА 100 и ТА 1535 - плазмиды устойчивости к ампициллину; штамм. А'3262 - дополнительную мутацию ауксотрофности по аргинин;:; Штаммы ТА 1535 и ТА 100 под действием ряда соединений (например, нит-розометилмочевины) ревертируют к прототрофности путем замены пар соединений. Штаммы ТА 1538 и ТА 98 позволяют обнаружить мутационный эффект соединений, действующих по типу сдвига рамки считывания (например, 2-ацетаминофлюрен); штамм AG262 - оба типа мутаций.

В опытах с метаболической активацией in vitro использовали сухой препарат микросомальной фракции печени кур, полученный из ИЭРЖ УрО РАН (общий белок 20,8 мг/мл). Применяли следующие три метода выявления генетической активности экстрактов.

1. Полуколичественный метод учёта генных мутаций с получением градиента концентраций препарата на твёрдых средах. В этом случае тест-культуры вносили в слой верхнего агара, который выливали на поверхность чашек Петри с 1,5% агаром. Через 30 минут на поверхность агара помещали

диски фильтровальной бумаги (диаметром 2 см), на которые наносили испытуемую жидкость. Учёт результатов проводили через 48 часов, сравнивая распределение колоний бактерий на опытных и контрольных чашках.

2. Полуколичественный метод с внесением препарата в слой полужидкого агара вместе с тест-культурой (без метаболической активации). В этом варианте в пробирку с 0,6% агаром вносили суспензию бактерий и испытуемый раствор. В качестве чистого контроля использовали воду, в качестве позитивного - нитрозометилмочевин. Сравнивали число колоний - ревертактов на опытных и контрольных чашках.

3. Полуколичественный метод учёта генных мутаций с внесением препарата и гомогената печени кур в слой полужидкого агара (метаболическая активация in vitro). В данном варианте в пробирку с 0,6% агаром вносили тест-культуру, испытуемый препарат и микросомальную активирующую смесь (MAC), состоящую из микросомальной фракции печени кур и кофакторов. В качестве чистых контролей использовали варианты с внесением в слой верхнего агара с бактериями растворителя мутагена (в данном случае - этиловый спирт (контроль 1), MAC без мутагена (контроль 2) и 2-ацетаминофлуорен без MAC (контроль 3). В качестве позитивного контроля использовали 2-ацетаминофлуорен с MAC. Результаты изучения представлены в таблице 3.

При исследовании полуколичественным методом учета генных мутаций (табл. 2) оказалось, что на контрольных чашках без мутагена рост культуры вокруг дисков отсутствует; только отдельные колонии спонтанных ревертантов были разбросаны по всей поверхности чашек. Вокруг диска с нитрозометилмо-чевиной (НММ) образовалась зона роста культуры диаметром 3-5 см в зависимости от концентрации НММ. Вокруг дисков с экстрактами зоны роста отсутствовали. При исследовании данным методом с внесением препарата в слой полужидкого агара вместе с тест-культурой (табл. 2, 3) обнаружено, что количество колоний на чашках с используемыми экстрактами при исследовании разных штаммов практически не превышает таковое на чашках с водой.

В то же время в чашках с НММ их количество на 1-2 порядка выше, чем в контроле в зависимости от концентрации НММ.

При исследовании указанным методом учета генных мутаций с метаболической активацией (табл. 3) обнаружено, что среднее число колоний на чашках с испытуемыми экстрактами практически не отличается от их количества на чашках с чистыми контролями. В то же время на чашках с позитивным контролем их число оказалось на 2 порядка выше, чем в чистых контролях. Таким образом, изучение мутагенной активности экстрактов текстильных материалов-носителей с помощью бактериальных тест-систем с использованием 5 штаммов бактерий, позволяющих регистрировать различные типы мутаций (замены пар оснований и сдвиг рамки считывания), показало, что испытанные образцы мутагенной активностью не обладают.

Таблица 1

Результаты оценки мутагенной активности при внесении экстрактов

в слой полужидкого агара с бактериальной суспензией _и микросомальной активирующей смесью (МАС)_

Группа опыта Объём на чашку, ' мл Среднее число колоний на чашку при использовании штаммов Результаты оценки мутагенной активности на штаммах

ТА 1538 ТА 100 ТА 98 ТА 1538 ТА 100 ТА 98

Марля, окисленная перйодатом натрия 0,2 22 23

Марля медицинская 0,2 70 50 - -

Растворитель мутагена (спирт) (контроль 1) 0,2 9 24 20 - - -

МАС без мутагена (контроль 2) 0,5

Ацетаминофлуо-рен без МАС (контроль 3) мкг/чашку 50 10 76 44

Ацетаминофлуо-рен с МАС (позитивный контроль) 50 1200 700 1000 +++ +++ +++

Примечание: + положительный результат, - отрицательный результат

Таблица 2

Полуколичественный метод учёта мутагенной активности

модифицированного раневого покрытия с получением градиента кот1ентра11ии на твёрдых средах

Группа опыта Объём на диск, мл Эффект на штаммах

ТА 1535 ТА 100 Ав 262

Марля, окисленная перйодатом натрия 0,05 - - -

Вода 0,05 - - -

Нитрозометилмоче-вина мет/диск 100 500 2+ 3+ 2+ 3+ 2+ 3+

Примечание: - отсутствие зоны роста вокруг дисков, + наличие зоны роста бактерий вокруг дисков

Таблица 3

Результаты оценки мутагенной активности экстрактов перевязочных материалов методом внесения в слой полужидкого агара

Группа опыта Объём на чашку, мл Среднее число колоний на чашку при использовании штаммов Результаты оценки мутагенной активности на штаммах

ТА 1535 ТА 100 ТА 1535 ТА 100

Марля, окисленная перйодатом натрия 0,4 37 75 - ■ -

Марля медицинская 0,4 16 20 - -

Вода 0,4 27 53 - -

Нитрозометилмочевина мкг/чашку 10 50 100 500 20 50 600 3000 40 63 112 1800 ++ +++ + ++

Примечание: + положительный результат, - отрицательный результат

Оценка мутагенной активности и цитотоксичности экстрактов из модифицированных раневых покрытий. Существует несколько методов оценки мутагенной активности различных химических веществ, многие из которых дороги и громоздки. Тесты с использованием микроорганизмов обладают рядом преимуществ: быстрота проведения эксперимента и возможность учета генных мутаций разного типа. Создан ряд штаммов бактерий, способных

выявлять мутагенный эффект низких концентраций химических веществ (10"2-Ю"4 г). В настоящем исследовании использована бактериальная тест-система сальмонелла тифимуриум (Salm. Typhimurium), тест-система Эймса (Ames et all., 1975). Испытания проводили на 4 штаммах бактерий: ТА 1538 и ТА 98 -регистрировавшие мутации по типу сдвига рамки считывания; ТА 1535 и ТА 100 - по типу замены пар оснований. Известно, что кроме «прямых» мутагенов существуют «косвенные», мутагенный эффект которых связан с их дальнейшим преобразованием в организме животного или человека, требующие «метаболической активации». Поэтому использовано два метода выявления мутагенной активности экстрактов экспериментальных тканей: без метаболической активации и с метаболической активацией. Экстракция: кусочки стерильной экспериментальной ткани заливали стерильным физиологическим раствором из расчёта 0,5 мл на 1 см2 и инкубировали 7 суток при температуре 37°С.

1. Полуколичественный метод определения мутагенной активности с внесением препарата в слой полужидкого агара вместе с тест-культурой (без метаболической активации! пробирку с 0,6% агаром вносили суспензию бактерий и испытуемый раствор. В каждом опыте обязательно ставили позитивный контроль - вещество, заведомо обладающее мутагенной активностью - нитрозометилмочевина (НММ) и нитрофлюорен (НФ). В качестве чистых контролей использовали растворители мутагенов (вода, спирт или диметилсульфоксид (ДМСО). При учёте результатов сравнивали число колоний бактерий на контрольных и опытных чашках: чем больше колоний, тем выше мутагенная активность.

2. Полу количественный метод с внесением препарата и метаболического активатора в слой полужидкого агара с тест-культурой (метаболическая активация). При наличии нескольких способов метаболической активации в настоящем исследовании использовали метод метаболической активации экстрактами печени кур или крыс (крысам предварительно вводили совел) - микросомальная фракция печени - S9.

В пробирку с 0,6% агаром вносили тест-культуру, испытуемый препарат и микросомальную смесь (МАС), состоящую из микросомальной фракции и кофакторов. В качестве позитивного контроля использовали 2-ацетаминофлюорен (АФ) или бензопирен (БП). В качестве чистого контроля -ДМСО.

Цитотоксическое действие активированных носителей и препаратов на их основе изучали по тесту выживаемости клеток в культуре. Приготовление вытяжек из образцов модифицированных раневых покрытий проводили в среде Игла в течение 7 суток при температуре 37°С. Соотношение образца и объёма жидкости (питательной среды) составляло 1 см2:1 мл; длительность обработки клеток экстрактом - 24 часа. Эксперименты проводили на культуре клеток линии Hela, растущих в монослое, в стадии логарифмического роста. Для этого суспензию одиночных клеток высевали в чашки Карреля в концентрации 200.000 клеток/чашка и инкубировали в течение 3 суток. На 3-й сутки культивирования питательную среду заменяли экстрактом и оставляли на 24 часа при температуре 37°С. После окончания экспозиции монослой клеток Hela трипсинизировали, разводили в свежей питательной среде и высевали в концентрации 200.000 клеток в новые чашки Карреля. Через 4 суток инкубации культуру снимали со стекла, определяли коэффициент прироста популяции: отношение количества выросших клеток к числу посеянных (величина коэффициента прироста является хорошим показателем цитотоксического действия любого повреждающего агента, так как гибель клеток всегда сопровождается снижением коэффициента прироста). Результаты показали, что цитотоксический эффект не наблюдался при воздействии экстрактов из образцов модифицированных раневых покрытий. Фракцию S9 выделяли из гомогената печени мышей. Содержание белка в использованном препарате -8 мг/мл, хранилась фракция S9 при t°—77°С. Результаты проведённых экспериментальных исследований позволяют сделать вывод, что 'изученные образцы не обладают токсическим, гемолитическим, аллергенным действием, а также цитотоксическим эффектом и мутагенной активностью.

Для оценки санитарно-гигиенических свойств модифицированных раневых покрытий были исследованы показатели водопоглощения и капиллярности. Рассматривалось влияние на эти свойства окисления целлюлозы и наличия иммобилизованного вещества. Определяли уровень качества вновь разработанных материалов с иммобилизованными протеиназами гепатопанкре-азы краба и хитозана в сравнении с контролем - марлей медицинской. Водопоглощение медицинской марли; марли, окисленной перйодатом натрия; а также окисленной целлюлозы с присоединенными биологически активными веществами изменялось от минимального значения - 67% до максимального -73%. Очевидно, что включение в раневое покрытие гидрогеля значительно улучшает показатели водопоглощения с изменением от минимального значения - 69,2% до максимального - 175%.

Оценка механических свойств раневых покрытий. Жёсткость модифицированного раневого покрытия и раневого покрытия «Мультиферм», представляющих собой материал на хлопчатобумажной основе, определялась по основе и по утку методом консоли. В качестве контроля использованы: марля медицинская, диальдегидцеллюлоза,Результаты исследований показали, что жёсткость исследуемых материалов колеблется около определенного статистического уровня и не снижается по отношению к соответствующим показателям исходного материала - медицинской марли.

Наряду с определением механических свойств проведено исследование гигроскопических свойств модифицированного раневого покрытия. В качестве контроля использовали апробированные и широко применяемые в медицинской практике материалы: медицинскую марлю, диальдегидцеллюлозу, «Мультиферм». Отмечено незначительное улучшение капиллярности в модифицированном раневом покрытии: до 111,4±8,4 против групп «целлюлозных» покрытий, в частности в сравнении с медицинской марлей 94,0±6,0 (р<0,05). Улучшение капиллярности нового раневого покрытия очевидно связано с тем, что в состав гидроколлоидного покрытия введены протеолитические комплексы гепатопанкреазы краба и хитозана. Таким образом, раневое покрытие

с биологической активностью на текстильной основе, содержащее ковалентно связанные ферменты, ферментные комплексы, и гидроколлоидное раневое покрытие с иммобилизованным протеолитическим комплексом на основе гепатопанкреазы краба и хитозана сохраняют свои санитарно-гигиенические свойства. Модификация носителя и последующая иммобилизация лекарственного вещества в минимальных дозах (от 2 мг/г до 8 мг/г носителя) не ухудшают, наоборот - улучшают свойства материала, необходимые для проявления дренирующей способности при использовании в качестве раневого покрытия.

Результаты клинических исследований лечения крыс с экспериментальными гнойными ранами модифицированным раневым покрытием представлены в таблице 4, где средние сроки очищения ран от гнойно-некротических масс и начало эпителизации в основной группе животных составили 3,1±1,5 суток; в случае использования повязки «Мультиферм» - 4,2±0,6; при аппликации медицинской марли - 14,2±0,5 суток. Соответственно сроки заживления сократились в 1,5 по сравнению с 2 контролем при покрытии раны медицинской марлей ив 1,28 - по сравнению с 1 контролем (рана покрывалась «Мультифермом»).

Таблица 4

Результаты лечения экспериментальных гнойных ран___

Раневые покрытия Средние сроки

Очищение в сутках М±ш Ускорение относительно контроля 2 Заживление в сутках М±ш Ускорение относительно контроля 1 Появление грануляций (в сутках) Начало эпителизации

Новое раневое покрытие 3,1±0,5 358% 20,1±1,2 27,4% 3,2±1,3 5,2±1,5

«Мульти ферм» 4,2±0,6 238% 25,6± 1,6 - 4,3±0,5 7,0± 1,3

Медицинская марля 14,2±0,5 - 30,2± 1,8 - 7 14

Параллельно с клиническими наблюдениями проведено изучение динамики раневого процесса по данным морфологических исследований.

Доказано, что применение для лечения гнойных ран гидроколлоидных раневых покрытий в значительно большей степени, чем лечение традиционными методами, способствует ускоренному очищению ран

от фибринозно-некротического экссудата, сокращению экссудативной фазы воспаления, нормализации микроциркуляторных расстройств, активизации пролиферативной фазы за счет стимуляции процессов ангиогенеза, синтеза коллагена и фиброзной трансформации грануляционной ткани.

Проведенное исследование позволяет сделать следующее заключение.

1. Модифицированное раневое покрытие не уступает покрытию на текстильной основе «Мультиферм» по критерию способности очистить экспериментальную гнойную рану (3,1±0,5 и 4,2±0,6 суток соответственно).

2. Не угнетает появления и скорость созревания грануляций (3,2±1,3 и 4,3±0,5 суток, соответственно).

3. Достоверно (р<0,05) лучше влияет на следующие показатели:

1) Скорость заживления ран (20,1±1,2 суток в сравнении с 25,6±1,6, соответственно).

2) Появление краевой эпителизации (5.7.^-1,5 и 7,0±1,3 суток соответственно), что вероятно объясняется значительно меньшей травматичностью смены гидроколлоидной повязки в сравнении с любой повязкой исключительно на целлюлозной основе.

ВЫВОДЫ

1. Модифицированное раневое покрытие обладает достаточными санитарно-гигиеническими, антибактериальными свойствами, не вызывает аллергических реакций и отвечает требованиям, установленными ГОСТами 3816-18; 10550-75; 12088-77.

2. Модифицированное раневое покрытие не оказывает общетоксического действия и не обладает гемолитическим эффектом.

3. Модифицированное раневое покрытие безопасно и не обладает мутагенной активностью.

4. Применение модифицированного раневого покрытия в лечении экспериментальных гнойных ран способствует достоверному (р<0,05) ускорению их заживления по сравнению с имеющимися методами лечения.

5. Модифицированное раневое покрытие может быть рекомендовано для лечения гнойных ран мягких тканей различных этиологии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать для клинической апробации метод лечения гнойных ран с использованием модифицированного раневого покрытия. Метод прост, патогенетически обоснован и доступен для применения в хирургических отделениях стационаров и хирургических кабинетах поликлиник.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Луцевич О.Э., Тамразова О.Б., Шикунова А.Ю., Плешков A.C., Исмаилов Г.И.-О., Воротилов Ю.В., Толстых П.И. Современные взгляды на патогенез и лечение гнойных ран // Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова. -2011.-№5.-С. 72-77.

2. Луцевич О.Э., Толстых М.П., Тамразова О.Б., Соловьева А.Б., Кулешов H.H., Романова A.C., Шикунова А.Ю., Ширинский В.Г., Старичков И.Г. Комплексное лечение длительно незаживающих ран и трофических язв венозного генеза с использованием фотодинамической терапии и современных биологически активных раневых покрытий // Московский Хирургический Журнал.-2011.-№ 1(17).-С. 13-18.

3. Луцевич О.Э., Тамразова О.Б., Кулешов И.Ю., Сорокатый A.A., Шикунова А.Ю., Усмонов У.Д., Старичков И.Г. Воздушно-плазменные потоки в режиме коагуляции, NO-терапии в комплексном лечении длительно незаживающих и хронических ран (язв) нижних конечностей // Московский Хирургический Журнал. - 2011. 2(18). - С. 9-13.

Подписано в печать: 14.03.2012 Тираж: 100 экз. Заказ №755 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.74, корп.1 (495) 790-47-77; www.reglet.ru