Автореферат и диссертация по медицине (14.00.06) на тему:Гетерогенность липопротеидов плазмы крови: роль в атерогенезе

РГ8 ОД

2 3 МАЙ 'да

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ . ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ

На правах рукописи УДК 57. 015. 3:577.112. 856: 591. 111. 1.

МЕТЕЛЬСКАЯ Виктория Алексеевна

ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ЛИПОПРОТЕИДОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ: РОЛЬ В АТЕРОГЕНЕЗЕ

14.00.06 - кардиология 03.00. 04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва - 1994 год

j

Работа выполнена в Государственном научно-исследовательском Центре профилактической медицины Минздрава РФ

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук. профессор В. В. Кухарчук

Доктор биологических наук, профессор В. А. Ткачук

Доктор биологических наук, профессор Г. А. Яровая

Ведущая организация: Институт экспериментальной медицины РАМН.

Защита состоится " * Г. в 7.3 часов

на заседании Специализированного совета Д 074.18.01 при Государственном научно-исследовательском Центре профилактической медицины Минздрава РФ (101953, Москва. Петрове-ригский пер.. 10).

С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале Государственного научно-исследовательского Центра профилактической медицины Минздрава РФ.

Научный доклад разослан 1994 г

Ученый секретарь

Специализированного совета. / /

кандидат медицинских наук < ¡^'/^■V/ ' Н. В. Киселева

-Ж-7

Burke D.. 1982). Обнаружена обратная взаимосвязь между размером частиц и их гидратированной плотностью (Nichols A. et al.. 1986). С помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности даже один класс ЛН11 разделяют на два подкласса: легкие и тяжелые ЛНП (Teng В. et al., 1983). Еще большей вариабельностью отличаются ЛНП крови больных с гиперхолестеринемией (ГХС) и/или гипертриглицериде-мией (ГТГ) (Fisher W. et al.. 1972). В ряде работ показана ассоциация полиморфизма ЛНП с риском развития инфаркта миокарда (Austin М. et al.. 1986; 1988).

Подобно апопротеину AI. апобелок В распределен мевду различными по составу липопротевдными частицами: это частицы, содержащие только ano В (ЛП В), содержащие помимо ano В еще ano Е, т.е. ЛП В: Е, ano CHI - ЛП В:CHI, ano'(а) - ЛП В: (a) (Alaupovlc Р.. 1982; Fruchart J.-С. et al.. 1988).

(а) - это ЛП плазмы, который содержит в себе все компоненты ЛНП и молекулу специфического гликопротеина - ano (а). На основании обнаруженной высокой степени гомологии этого белка с плазми-ногеном полагают, что ano (а) представляет собой огромную мутант-ную форму плазминогена, в которой фрагмент с определенной аминокислотной последовательностью (так называемый "крингл 4") многократно повторяется (McLean J. et al., 1987). Числом этих повторов и определяется молекулярная масса ano (а), которая у разных индивидуумов варьирует в пределах 300-700 кД , что в значительной мере объясняет наследственную детерминацию концентрации ЛП (а) в плазме крови (Dlepllnger Н. et al., 1992); при этом высокое содержание ЛП (а) в крови ассоциируется с низкой молекулярной массой ало (а). Показана прлояительная ассоциация высокого уровня ЛП (а) с наличием заболеваний, обусловленных атеросклерозом (Schrlewer Н. et al., 1984; Dahlen G. 1986; Utermann G., 1989).

Аполипопротеин E является функционально важным апобелком, входящим в состав ЛОНП и ЛЛ промежуточной плотности (ЛПП), хиломик-ронов (ХМ) и их ремнантов, а также отдельных подфракций ЛВП. Он обеспечивает в качестве лиганда взаимодействие этих липопротеидов с ano В,Е (ЛНП)- и ano E-рецепторами на поверхности многих клеток организма (Mahley R., 1988). Этим обусловлена ключевая роль ano Е в перераспределении ХС мевду клетками органов и тканей.

Ano Е - генетически полиморфный белок ; этот феномен обусловлен наличием в гене, кодирующем ano Е, локуса с тремя общими аллелями, которые детерминируют 3 основные изоформы белка: Е2, ЕЗ и

Е4 (Шегтапп й. еЬ а1., 1977; Юагсп1ск а. е1 а1., 1979; гапп1з V. е1 а1.. 1981; 1982). Показано . что аллель Е2 играет защитную ан-тиатерогенкую роль в отсутствие генетических и/или средовых аномалий. И наоборот, аллель Е4 сопряжен с гиперхолестеринемией. и при наличии неблагоприятных условий предрасполагает к развитию атеросклероза (Оау1йпоп J. е1 а!.. 1988; Шегтапп в.. 1988).

Анализ результатов исследований отечественных и зарубежных авторов позволил нам сформулировать предположение о том. что молекулярная гетерогенность ЛП может быть существенным фактором, обеспечивающим биологическую активность ЛП в норме и обусловливающим ее нарушения при атеросклерозе.

В связи с этим очевидно, что назрела необходимость проведения систематических комплексных исследований, включающих параллельное изучение тех или иных форм гетерогенности ЛП и их функциональных свойств в нормальных физиологических состояниях и в процессе развития атеросклероза. Неясным, в частности, было, какие именно вида полиморфизма, или гетерогенности ЛП, связаны с проявлением атерогенных свойств апо В-содержащих ЛП и с антиатерогенными свойствами апо М-содержащих ЛП; в какой мере особенности распределения апобелков А1 и В детерминированы генетически, а в какой -обусловлены внешними воздействиями; зависит ли возможность коррекции атерогенных дислипидемий от специфики гетерогенности системы ЛП у отдельных индивидуумов. Важным с практической точки зрения представлялось провести поиск биохимических маркеров атерогенных нарушений молекулярной гетерогенности ЛП, дающих возможность на ранних стадиях обнаружить патологические изменения в функционировании липид-транспортной системы организма.

Таким образом, актуальным представлялось изучить характер гетерогенности ЛП крови, сопряженной с их атерогенными свойствами, включая комплексный анализ липидно-белкового состава ЛП отдельных классов, вариации по размеру и гидратированной плотности частиц, характеристику полиморфизма их апобелков, в широком диапазоне физиологических и патологических' состояний.

Цель исследования. Выявить и изучить виды молекулярной гетерогенности ЛП высокой и низких плотностей, которые сопряжены с проявлениями ими атерогенных свойств; выяснить, какие характеристики ЛП обусловливают атерогенность выраженных и латентных форм ДЛП; разработать критерии дифференцированной диагностики отдельных видов атерогенного полиморфизма ЛП.

- 5 -

Основные задачи исследования:

1. Изучить ассоциацию отдельных видов ДЛП (выраженной или скрытой) с наличием и спецификой гетерогенности ЛП по плотности и скорости флотации, размеру частиц, белковому составу и функциональной активности.

2. Выяснить, проявляется ли гетерогенность ЛП, специфичная для больных ИБС с атеросклерозом венечных сосудов сердца, у их детей. Выявить те биохимические параметры гетерогенности ЛП и апобелков. которые с детства яеляются маркерами или предвестниками атероген-ных изменений в системе ЛП плазмы крови.

3. Изучить параметры гетерогенности ЛВП у представителей российской популяции мужчин с гиперальфахолестеринемией. у которых ранее было выявлено отсутствие отрицательной корреляции уровня ХС ЛВП со смертностью от ИБС.

4. Изучить роль распределения ano AI между частицами, содержащими только ano AI, или ano AI вместе с ano All. в детерминации функциональной активности ЛВП по обратному транспорту ХС.

5. Изучить роль распределения ano В между частицами ЛП низких плотностей, содержащими только ano В, или ano В вместе с ano Е. ano CHI, ano (а), в проявлении ими атерогенных свойств.

6. Изучить зависимость от фенотипа ano Е реакции системы ли-попротеидов на внешние воздействия, модифицирующие уровень триг-лицерид-богатых ЛП кишечного и печеночного происхождения.

Для решения поставленных задач целесообразным представлялось использование двух методологических подходов:

- сравнительные исследования на группах лиц разного пола и возраста с клиническими - проявлениями коронарного атеросклероза или без этих проявлений, с Тем чтобы получить сведения о взаимосвязи гетерогенности ЛП с их функционированием в норме и при развитии патологии;

- проведение экспериментов In vitro с использованием клеточных культур, с тем чтобы выяснить возможные специфику и механизмы участия отдельных субфракций системы ЛП крови в направленном транспорте липидов в организме.

Научная новизна работы. Научная новизна полученных данных определяется тем, что впервые работа была направлена на изучение физиологической роли молекулярной гетерогенности ЛП в функционировании липид-транспортной системы и клинического значения ее нарушений, возможности применения параметров гетерогенности в

диагностике ранних или скрытых нарушений процессов, обеспечивающих транспорт ХС.Обнаружена ассоциация ИБС и наследственной предрасположенности к ней со сниженной концентрацией частиц ЛВП. содержащих только ano AI, и относительным обогащением ЛВП подф-ракцией частиц, содержащих ano AI и ano АН. Выяснена по крайней мере одна из причин отсутствия отрицательной корреляции между уровнем ХС ЛВП и смертностью от ИБС в российской мужской популяции: при высоком ХС ЛВП показано накопление в составе ЛВП фракции частиц ЛП AI: АН. В работе доказано, что как раз эта фракция неактивна в отношении инициации выхода холестерина из его внутриклеточного пула; показано, что лишь частицы ЛП AI способны активировать этот процесс.

Обнаружено, что повышенная концентрация ano В у больных ИБС и их детей сопряжена с перераспределением популяции ЛП низких плотностей с увеличением доли высокоатерогенных частиц ЛП В: (а). Показано. что, зная фенотип ano Е. можно предвидеть характер реакции холестерин-транспортной системы человека на воздействия, модифицирующие уровень липидов крови, и учитывать его при выборе путей коррекции нарушений липидного спектра.

Научно-практическая значимость работы. В работе убедительно продемонстрирована возможность использования параметров гетерогенности ЛП в качестве нового диагностического инструмента, характеризующего транспорт липидов в норме и в процессе развития атеросклероза. Для практического использования могут быть предложены следующие разработанные в работе параметры: границы нормальных значений содержания в крови ano AI и ano В, величина дискриминантной функции, ДФ, позволяющая более адекватно, чем на основе уровня липидов, формировать группы детей высокого риска развития атерогенных изменений в системе ЛП. В качестве маркеров нарушения функционирования системы ЛП могут быть предложены: сдвиг профиля частиц ЛВП в сторону уменьшения доли ano А1-содер-жащих частиц и профиля ЛНП в сторону уменьшения доли частиц, в состав которых входит только ano В, с увеличением доли частиц ЛП В:(а), фенотип ano Е. Эти подходы и конкретные показатели могут быть использованы при прогнозировании вероятности формирования атерогенных сдвигов, при мониторировании эффективности диетических и медикаментозных вмешательств, особенно при испытании действия новых гиполипидемических препаратов.

Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности вклю-

чения указанных параметров в число ранних предшественников или маркеров нарушений в системе транспорта ХС и, следовательно, повышенного риска формирования атерогенных ДЛП.

Внедрение. Модифицированный метод количественного определения в плазме крови аполипопротеинов В и А1 (Рац. предложение N 409 от 10.05.1934) внедрен в практику работы НИИ терапии СО РАМН, каф. клинической фармакологии Курского мед. института. Результаты работы, экспонировавшиеся на ВДНХ СССР в 1985 г.. отмечены бронзовой медалью (постановление N 953-Н от 03.12.1985, удостоверение N 58433).

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации были доложены и обсуждены на: Международных конференциях по профилактической кардиологии (Москва, • 1Э85; Вашингтон, США, 1989; Осло, Норвегия. 1993); Симпозиуме Американской Ассоциации Сердца (Вашингтон. США, 1988); XI Всемирном кардиологическом конгрессе (Манила, Филиппины, 1990); Международных симпозиумах по атеросклерозу (Мельбурн. Австралия, 1985; Рим, Италия. 1988; Роземонт. США. 1991); 9 Конгрессе по клинической химии (Краков, Польша, 1991); 14 Конгрессе Европейского общества кардиологов (Барселона. Испания, 1992); Конгрессах Европейского общества по изучению атеросклероза (Ницца. Франция, 1992; Иерусалим, Израиль, 1993), а также на научных конференциях и семинарах в лаборатории по изучению липопротеидов и атеросклероза в институте Пастера (Лилль, Франция, 1987, 1989, 1992); в Северно-Западной.липидной клинике Университета штата Вашингтон (Сиэттл, США. 1988); в Национальном институте здравоохранения (Хельсинки, Финляндия. 1990); в Кардиологическом научном центре РАМН (Москва, 1990); ГНИЦ профилактической медицины МЗ РФ (Москва, 1989; 1994).

Апробация диссертации состоялась 16.02.1994 г. на заседании Ученого совета ГНИЦ профилактической медицины МЗ РФ.

Публикации. Из 90 работ, опубликованных автором, по теме диссертации опубликовано 40: 15 в отечественной и 25 в зарубежной литературе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основные исследования проведены в ГНИЦ профилактической медицины МЗ РФ согласно плану научно-исследовательских работ. Больные

ИБС были обследованы в 1-м клинико-профилактическом отделении сердечно-сосудистых заболеваний, мужчины и дети из популяционных выборок, соответственно, в отделе эпидемиологиии и в отделе профилактики факторов риска иеинфекционных заболеваний среди детей и подростков ГНИЦ ПМ МЗ РФ, дети групп риска и контроля- в НИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ.

Исследования по сравнительному изучению субфракционного состава ЛВП в группах мужчин с высоким уровнем ХС ЛВП из популяций Москвы и Стэнфорда (США), включая аналитическое ультрацентрифугирование. были выполнены в Доннеровской лаборатории Университета Беркли (Калифорния, США): количественное определение в крови фракций ЛВП ЛП AI и ЛП AI:AII, эксперименты по анализу влияния частиц ЛВП разного апобелкового состава на выход ХС из эндотели-альных клёток, а также анализ способности мутантного ano В взаимодействовать с ЛНП-рецепторами были проведены на базе 325 отделения ИНСЕРМ в институте Пастера в Лилле (Франция). Часть исследований по сравнительному анализу содержания апопротеинов AI. АН, В. ЛП (а) и изоформ ano Б была проведена в Северно-Западной липидной клинике Университета штата Вашингтон, Сиэттл (США) и в Национальном институте здравоохранения Финляндии, Хельсинки.

Объектом исследований были:

1. Группы мужчин 35-50 лет (п=350, средний возраст 44.1+0.8 лет) и детей 10-15 лет (п=947. 675 мальчиков и 272 девочки, средний возраст 13.4+0.3 лет), непреднамеренно отобранные из популяционных выборок г. Москвы, а также группы мужчин с высоким уровнем ХС ЛВП>50 мг/дл, проживающих в Москве - Россия (п=21), Стэнфорде - США (п=21) и Лилле - Франция (п=50). По данным анкеты Rose и результатам ЭКГ включенные в обследование мужчины не имели признаков ИБС.

Для определения границ нормальных значений содержания в крови апопротеинов AI и В обследованы 309 мужчин в возрасте 20-59 лет и 1155 детей (820 мальчиков и 335 девочек) 10-15 лет, представляющих репрезентативные выборки из соответствующих популяций.

2. Мужчину 35-50 лет. страдающие клинически выраженной ИБС (п=200, средний возраст 43.7+0.7 лет), у 160 из которых имелся атеросклероз коронарных сосудов, верифицированный ангиографией.

3. Дети 11-16 лет, чьи родители в возрасте до 45 лет перенесли инфаркт миокарда на фоне ангиографически документированного атеросклероза коронарных артерий (дети группы риска. п=100, 64 маль-

- 9 -

чика и 36 девочек, средний возраст 13.7+0.5 лет).

4. Здоровые дети 11-16 лет. чьи родители до 45 лет не имели признаков ИБС (контроль. п=100, 60 мальчиков и 40 девочек, средний возраст 13.6+0.4 лет).

5. 26 ядерных семей, включая пробандов с ИБС. их жен и детей (11=41, 20 мальчиков и 21 девочка, средний возраст 13.0+0.4 года), которых сравнивали с детьми родителей, не имевших ИБС. Для исключения колебаний уровней липидов и апобелков в период пубертата. в контрольную группу подбирались дети, соответствующие по возрасту, полу и степени полового созревания детям группы риска.

В исследование не включались лица с заболеваниями, ассоциирующимися со вторичными гиперлипидемиями (заболевания печени, почек, сахарный диабет).

Сравниваемые группы взрослых и детей не различались ни по возрасту. ни по значению индекса массы тела (Metelskaya V. et al., 1988; Perova N. et al.. 1989), т.е. по тем факторам, которые, как известно, влияют на уровень липидов крови.

Определение содержания в крови ХС общего и входящего в состав ЛВП, расчет концентрации ХС ЛНП, определение уровня ТГ проводилось в группе Олферьева A.M.; качественный контроль липидных исследований осуществляли по программе Отдела стандартизации ГНИЦ ПМ МЗ России.

ЛП выделяли из плазмы крови методом препаративного ультрацентрифугирования (Havel R. et al., 1985). Аналитическое'ультрацентрифугирование осуществляли по методу (Lindgren F., 1972); обработку полученных результатов проводили двумя методами (Andersen D. et al., 1978). Для препаративного выделения апопротеинов AI. АН и В использовали образцы, ЛВП и ЛНП, соответственно, после их делипидации органическими растворителями. Очистку апобелков проводили методом колоночной1 хроматографии, включая гель-фильтрацию на сефадексах, анионообменную и аффинную хроматографию. Поликло-нальные антитела к аттобелкам получали иммунизацией кроликов; специфичность антител проверяли в реакции иммунопреципитации с соответствующими антителами.

Содержание в крови апопротеинов AI, АН и В определяли методом иммуноэлектрофореза ("ракетного") на пластинах с агарозой, содержащей соответствующие антитела (Curry M. et al., (1976; 1978). Для качественного контроля определения уровня апопротеинов использовали калибровочный материал, предоставленный Центром по

- 10 -

контролю за заболеваемостью (Атланта, США).

ЛП AI и ЛП AI: АН выделяли методом аффинной хроматографии (Cheung М. & Albers J.. 1984; Koren Е. et al., 1987). Содержание в плазме крови ЛП AI определяли методом иммуноэлектрофореза на пластинах фирмы Sebla (Франция) (Parra Н.-J. et al., 1990); концентрацию частиц ЛП AI: АН, а также частиц ЛП В, ЛП В: СНГ, ЛП В: (а) и ЛП В:Е определяли иммуноферментным методом (Koren Е. et al.. 19987; Fruchart J.-С. et al.. 1985; Vu Dac N. et al., 1989).

Характеристику ЛП по размеру частиц проводили методом электрофореза в градиентном (2-16% для ЛП низких плотностей и 4-30% для ЛВП) полиакриламидном геле (Blanche P. et al, 1981) с последующей денситометрией фиксированных и окрашенной Кумасси G-250 гелей при длине волны 605 нм. В качестве калибраторов использовали белки с известным диаметром: тиреоглобулин, 17.0 нм, апоферритин, 12.2 нм, каталазу. 10.4 нм, лактатдёгидрогеназу, 8.2 нм и бычий сывороточный альбумин (БСА), 7.1 нм, а также частицы латекса (38 нм). Обработку результатов проводили планиметрически. Процент вклада каждого пика в суммарную площадь кривой распределения ЛВП принимали за относительную долю идентифицируемой подфракции.

Фенотипирование апо Е проводили по методу Havekes L. et. al. (1987). Ацетилирование ЛНП осуществляли как описано Basu S. et al. (1976). Иодирование нативных и ацетилированных (Ац) ЛНП проводили иодидмонохлоридным методом (Bllhelmer et al. 1972).

В модельных экспериментах для изучения выхода ХС из клеток были использованы эндотелиальные клетки аорты быка. В работе использовали клетки 3-8 пассажей, которые выращивали в пластиковых чашках на подложке из желатина (0.2%) в модифицированной среде Игла (DMEM)1 с добавлением 1% глутаминовой кислоты, 0.5% ген-тамицина и 10% сыворотки теленка в инкубаторе (5% С02, 37*С).

Клетки нагружали холестерином посредством их инкубации в течение 48 часов в присутствии Ац-ЛНП (30 мкг/мл). Деградацию нативных и модифицированных ЛНП в клетках оценивали по методу Basu S. et al. (1976). Дифференциальное мечение плазматической мембраны клеток (ЗН-холестерином) и внутриклеточного пула ХС (ЗН-мевалоно-лактоном) осуществляли по методу Oram J. (1983; 1986), инкубируя клетки в течение 6 часов при 15*С.

Содержание ХС в клетках определяли хроматографией высокого давления (HPLC) после экстракции липидов (Folch et al., 1957).

Способность апо AI-содержащих ЛП стимулировать выход ХС из

предварительно нагруженных им клеток определяли по снижению содержания радиоактивной метки в клетках после их инкубации с соответствующими ЛП или в их отсутствие (контроль). Выход ХС в контроле не превышал 2-5% и 1-1.2% при анализе выхода ХС из наружной мембраны и внутриклеточного пула, соответственно. После экстракции липидов из клеток ХС отделяли методом тонкослойной хроматографии на пластинах с силикагелем в среде гептан: диэтиловый эфир: метанол: уксусная кислота (80:30:10:2); в качестве стандартов использовали ХС. холестенон и олеат холестерина.

Для оценки функциональной активности дефектного ano В использовали культуру клеток опухоли человека (HeLa). Способность му-тантного ano В взаимодействовать с ЛНП-рецепторани оценивали по конкурентному вытеснению меченого 125-1 нативного ЛНП, предварительно связанного с ЛНП-рецепторами на HeLa клетках, ЛНП, полученными от носителя мутации ano В-3500. Во всех экспериментах с клетками каждую серию опытов проводили не менее трех раз с разными клонами клеток.

Результаты представлены как среднее М±ш. Достоверность результатов оценивали по непарному t-критерию Стыодента, а также использовали непараметрический тест Манн-Витни. Пошаговый анализ множественной дискриминантной функции был выполнен на ЭВМ с помощью программ BMDP-7D с отбором информативных признаков. Под информативностью понимали степень значимости того или иного признака из учтенных в исследовании; в качестве критерия информативности использован критерий F.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Многофакторность атерогенных свойств системы ЛП крови

Гетерогенность системы ЛП обусловлена физиологическим функционально необходимым каскадом реакций, имеющих место на пути транспорта липидов в кровотоке в составе ЛП. В то же время, продемонстрированная рядом исследователей множественность нарушений в системе ЛП. сопряженных с проявлениями атерогенных свойств, в значительной мере связана с дефектами в разных, иногда одновременно в нескольких звеньях сложного процесса взаимопревращений ЛП. Таким образом, многообразие проявлений атерогенных свойств липид-транспортной системы определяется гетерогенностью отдельных липопротеидных параметров. В таком случае возникает вопрос, можно ли показатели, характеризующие гетерогенность ЛП, рассматривать

как способствующие нарушениям в системе ЛП. ассоциирующимся с заболеваниями атеросклеротического генеза. или как маркеры таких нарушений.

Проведенные нами ранее сравнительные исследования на группах больных ИБС с коронарным атеросклерозом и лицах без клинических признаков ИБС (Перова Н. В., 1982; Метельская В. А. и др.. 1983; Перова Н.В. и др., 1987) продемонстрировали, что наиболее информативным независимым параметром, в 92% случаев правильно разделяющим обследуемых на две указанные группы, оказалась величина отношения уровней в плазме крови основных апобелков ЛП низкой и высокой плотности - ano В/апоА1>1.0. Примечательно, что величина этого отношения была информативной и при идентификации больных ИБС из разных регионов мира (Москва. Бордо, Брюгге. Прага. Пльзень) и не зависела от особенностей липидного спектра у жителей каждого региона (Перова Н.В. и др., 1986; Метельская В.А. и др.. 1988; 1989; Stelnerova A. et al, 1989).

Среди множества причин, вызывающих нарушения в функционировании липид-транспортной системы, наряду с пищевыми, гормональными и другими воздействиями важное место принадлежит генетической или наследственно детерминированной предрасположенности. С тем чтобы выяснить, в какой степени по количественным параметрам системы ЛП можно судить о предрасположенности к атерогенным изменениям, был проведен сравнительный анализ спектра ЛП в группе детей риска, чьи родители в молодом возрасте страдали ИБС на фоне коронарного атеросклероза, и в контрольной группе детей, чьи родители не имели ИБС.

Выбор включенных в анализ групп детей был обусловлен тем известным фактом, что наличие, ранней ИБС у родителей является независимым фактором риска развития ранней ИБС у их детей (Rlssanen А., 1979; Barrett С.& Khaw К.. 1984; Goldbourt U.&Neufeld Н., 1986). Кроме того, в детском возрасте уровень других хорошо известных у взрослых факторов риска ИБС (курение, избыточная масса тела, артериальная гипертензия и т.д.О обычно ниже, чем у взрослых, поэтому изучение ЛП у детей из семей с положительным анамнезом по наличию ИБС может, по-видимому, внести определенный вклад в понимание механизмов атерогенеза и позволит выяснить, реализуется ли наследственная предрасположенность к ИБС у детей через те же нарушения в системе ЛП, что характерны для взрослых больных ИБС.

Рис. 1. Профиль ЛП в группах больных ИБС и их .детей: сравнительный анализ со случайными выборками

МУЖЧИНЫ ЛЕТИ

_ Больные ИБС, их дети

_ Контроль

* Р«0.05

У детей группы риска, как и у их больных ИБС родителей, профиль отклонений липидных и апобелковых показателей системы ЛП от среднепопуляционных был смещен по сравнению с соответствующим контролем в направлении, считающемся атерогенныи: выше были средние уровни ХС ЛНП, ТГ, ano В и отношение апоВ/апо AI, при одинаковом уровне ano AI, ниже содержание ХС ЛВП (Рис. 1). Аналогичные данные были ранее получены в работах Frledlander Y. et al.. 1985; De Backer G. et al., 1986). Однако, по величине отношения ano В/АШ.О правильно идентифицировать принадлежность детей к группе риска удается лишь в 74.4%, т.е. эта величина оказалась у детей менее информативной, чем для идентификации больных ИБС.

С тем чтобы выявить наиболее информативные показатели нарушений спектра ЛП, характерные для детей, с помощью шагового анализа •множественной дискриминантной функции (ДФ) была проведена оценка независимого вклада каждого из исследуемых показателей в дискриминацию между детьми в зависимости от наличия или отсутствия ИБС у их отцов. Наиболее информативным показателем на 0 шаге оказа-

лась концентрация в крови ano В (F=8.255). на следующем шаге -уровень ХС ЛВП (F=4.701). После исключения вклада этих параметров величина F для всех оставшихся показателей была ниже критического значеция.

Полученное нами уравнение дискриминантной функции (ДФ), или "решающее правило", которое позволяет с наибольшей точностью разделять включенных в анализ детей на группы лиц, имеющих наследственный риск развития ИБС или не имеющих его, выглядело следующим образом:

ДФ - [ало В] х 0.03 - [ХС ЛВП] х 0.04 - 0.81 - 0.

Подставляя соответствующие значения для ano В и ХС ЛВП в это уравнение, можно рассчитать величину ДФ для каждого ребенка. При ДФ>0 ребенок должен относиться к группе риска, при ДФ<0 - к группе детей здоровых родителей (Метельская В. А. и др.. 1989; Perova N. et al., 1989).

Биологический смысл полученной нами ДФ, в которую входят уровни ano В и ХС ЛВП, состоит в том, что она характеризует баланс между процессами доставки ХС к тканям в составе ano В-содержащих ЛП и его обратным транспортом в печень в составе ЛВП. В таком случае ДФ>0 свидетельствует о более или менее выраженном нарушении этого баланса, проявляющемся в накоплении ano В-содержащих ЛП и/или в снижении содержания ХС, входящего в состав ЛВП.

Поскольку у детей воспроизводимость ДЛП в период полового созревания значительно варьирует (от 18 до 60%; Freedman D. et al., 1985; Oganov R. et al., 1988), мы поставили вопрос, является ли положительная величина ДФ маркером только наличия ДЛП или может быть и прогностическим тестом их развития у подростков.

В проспективном 2-летнем исследовании, включающем выборку из популяции московских школьников (п=947), была оценена прогностическая значимость предложенного ДФ-теста в предсказании направления динамики уровней липидов. Выраженную для подросткового возраста ДЛП (ГХС, ГТГ, гипоальфахолестеринемию) диагностировали по унифицированным критериям, близким к 90% (для ХС и ТГ) и 10% (для ХС ЛВП) отрезным точкам распределения по этим показателям популяции московских школьников (Perova N. et al.. 1988): ХС>200мг/дл, ТГ>90 мг/дл,. ХС ЛВП<40 мг/дл.

По результатам определения содержания ano В и ХС ЛВП на I визите у обследованных детей рассчитывали величину ДФ, по которой на II визите через 2 года, определяя уровни липидов, оценивали.

правильно ли был сделан прогноз вероятности стабилизации или формирования нормолипидемии или ДЛП. Оказалось, что правильный прогноз динамики липидного профиля плазмы крови у детей составил 80.5% (763 случая из 947). Чтобы рекомендовать величину ДФ в качестве скрининг-теста, было показано, что его специфичность составила 89.2% (из 749 случаев нормолипидемии на II визите 668 было предсказано по отрицательной величине ДФ на I визите), а чувствительность - 48% (из 198 детей, имевших на II визите ДЛП, у 95 на I визите величина ДФ была положительной).

Для поиска причин невысокой чувствительности ДФ-теста при его высокой специфичности был проведен детальный анализ характеристик липидного спектра в тех_ подгруппах, где прогноз оказался ложным. При этом у детей было обнаружено нбсколько вариантов проявления атерогенных свойств ЛП:

На I визите у 57 детей при нормальном уровне липидных показателей, у которых ко II визиту сформировалась выраженная ДЛП, был выявлен высокий уровень ano В (114+0.14 мг/дл), который и определил положительное значение у них величины ДФ (Metelskaya V. et al., 1988; 1992). На этом основании те 57 детей с нормолипидемией на II визите, у которых ДФ>=0 за счет высокого содержания ano В, более правильно должны быть отнесены к группе риска.

Среди 103 случаев с ДФ<0 на I визите, но имевших ДЛП на II, мы обнаружили ДЛП, которые сопровождались наличием неатерогенных характеристик: у 50 детей отмечена либо ГХС, сопряженная с высоким уровнем ХС ЛВП, либо гипоальфахолестеринемия, сочетающаяся с низким уровнем ХС плазмы, либо умеренная ГТГ (95<ТГ<120 мг/дл) с нормальным уровнем ХС ЛВП. Уровни ХС ЛНП и ano В во всех 50 случаях не превышали соответствующих 90% отрезных точек. Поэтому при окончательной оценке правильности прогноза эти случаи были отнесены к нормолипидемии (Metelskaya V. et al., 1992).

В итоге оказалось, что с учетом множественности форм ДЛП у детей, которые удается различить с помощью предложенного ДФ-теста, его чувствительность составила 74.1% (это 152 имевших на I визите ДФ>0 ребенка из 205 с ДЛП и гиперапо В-липопротеинемией на II визите), его специфичность - 96.8% (это 718 из 742 случаев предсказанной по ДФ<0 нормолипидемии, включая случаи неатерогенных ДЛП), а правильность прогноза достигла 91.955 (870 из 947 детей).

Результаты дискриминантного анализа, проведенного в группах мужчин и детей, свидетельствовали о различиях в атерогенных сдви-

гах в системе ЛИ у больных ИБС с одной стороны, и у их детей, наследственно предрасположенных к ИБС, с-другой. Так, если о функционировании системы транспорта ХС в составе ЛОНП и ЛНП в обоих, случаях можно судить по концентрации в крови ало В, которая была выше по сравнению с соответствующим контролем и у больных ИБС (138+7.9 и 108+4.4 мг/дл. PCO.01). и у детей (87+1.9 и 82+2.1 мг/дл, PCO.05), то показателем активности функционирования системы обратного транспорта ХС у больных ИБС более информативной была концентрация ano AI, а у детей - уровень ХС ЛВП. Этим и объясняется, что в уравнение дискриминантной функции у детей, кроме уровня ano В, входит ХС ЛВП, но не ano AI, как у взрослых.

Для изучения причин такого расхождения целесообразно было прежде всего найти количественные критерии дисаполипопротеинемий. По результатам эпидемиологического обследования были установлены следующие унифицированные (для взрослых мужчин и детей обоего пола) критерии уровней апобелков в плазме крови, соответствующие 10% и 90% отрезным точкам распределения соответствующих мужской и детской популяций г. Москвы по этим показателям (Табл.1).

Таблица 1. Отрезные точки распределения популяционных выборок по уровню апопротеинов AI и В

Ano AI. мг/дл Ano В, мг/дл

10% 90% 10% 902

Мужчины (п=309) 90 160 60 160

20-59 лет

Дети (П=1155) 100 160 60 120

10-15 лет

Обращает на себя внимание, что установленные наш эмпирические критерии "нормальных" значений уровней апопротеина AI оказались близкими для мужчин 20-59 лет и детей 10-15 лет. а для уровня апо В у детей выявлено более низкое значение верхней отрезной точки. Полученные значения близки к "нормальным" величинам, принятым в Западцо-Европейских странах: 110-160 мг/дл для апо AI и 70-130 мг/дл для апо В (Fruchart, J.-С. Ь Shepherd J., 1989).

Итак, обнаруженные нами особенности проявления атерогенных свойств ЛП у больных ИБС и у их детей позволили поставить вопрос

о необходимости на основе детального анализа молекулярной гетерогенности ЛП плазмы крови в широком диапазоне физиологических и патологических состояний провести поиск маркеров, пригодных для дифференцированной диагностики специфичных форм атерогенных нарушений в системе ЛП плазмы крови.

Глава 2. Гетерогенность апо Л1-содержащих липопротсидов

2.1. Гетерогенность ЛВП по гидратированной плотности

С целью дифференцированной диагностики специфичных форм атерогенных сдвигов в системе ЛП. ассоциирующихся с ИБС или повышенным риском ее развития, была проведена качественная и количественная характеристика белковых и липидных компонентов апо AI-содерхащих липопротеидов.

Спектр ЛП больных ИБС характеризуется низким уровнем ХС ЛВП, что показано многими клиническими исследованиями (Miller G.& Miller N.. 1981; Scanu A. et al.. 1982; Akhmeteli M.& Zhukovsky G.. 1982).

Для США и стран Западной Европы показана независимая отрицательная корреляционная связь между уровнем ХС ЛВП и смертностью от ИБС (Tyroler Н. et al.. 1988). В то же время,, согласно результатам исследования двух советских липидных клиник (ВКНЦ АМН СССР, Москва, и НИИЭМ АМН СССР. Ленинград), в российской популяции мужчин за 7.8 лет наблюдения такой взаимосвязи не выявлено (Shestov D. et al.. 1988), хотя проведенные в 1973-1978 гг. Российско-Американские эпидемиологические исследования продемонстрировали, что уровень ХС ЛВП в российских мужских популяциях выше, чем в США.

С тем чтобы выявить возможные детерминанты нарушений антиате-рогенной функции ЛВП у мужчин российской популяции, в совместной работе с американскими и французскими исследователями нами был проведен сравнительный анализ особенностей системы обратного транспорта ХС в 4-х группах мужчин: 1) группа мужчин-москвичей (п =21) с высоким - более 50 мг/дл - содержанием в плазме крови ХС ЛВП; 2) подобранная к ней по возрасту и уровню ХС ЛВП>50 мг/дл группа мужчин (п=21). проживающих в Стэнфорде (США); 3) группа мужчин-французов того же возраста (п=50) с высоким уровнем ХС ЛВП>50 мг/дл; и 4) группа непреднамеренно отобранных из московской популяции мужчин (п=90). Уровень 50 мг/дл взят как критерий относительно высокого содержания ХС ЛВП, т.к. он соответствует отрезной точке верхнего терциля распределения мужской популяции

- 18 -

американцев по этому показателю.

Группы мужчин-москвичей и жителей Стэнфорда, имевшие одинаково высокий уровень ХС ЛВП (56+2.1 мг/дл), не различались по возрасту и индексу массы тела, а также по липидным и белковым показателям спектра ЛП плазмы крови. В то же время, по данным аналитического ультрацентрифугирования, в группе москвичей отмечена тенденция к более низкой концентрации частиц общей фракции ЛВП (283+11.3 против 316+13.8 мг/дл. 0.1<Р<0. 05).

Таблица 2. Характеристика субфракционного спектра ЛВП

(по данным аналитического ультрацентрифугирования)

Грехкомпонентный анализ Подклассы ЛВП (двухкомпонентный анализ)

Группа ЛВП2Ь ЛВП2а ЛВПЗ ЛВП2 ЛВПЗ

1.Москва 2.Стэнфорд 43.3+7.5 31. 2+5. 2 94.5+5.5 144.8+6.5 * 73.9+8.9 95.5+8.9 189.2+7.4 63. 0±7.5 208.6+6.8 * 252. 0+9. 7

* - Р<0.05

Как при двух-, так и при трехкомпонентном анализе шлиреновских кривых, полученных при аналитическом ультрацентрифугировании ЛП, было обнаружено, что несколько сниженное содержание общей фракции ЛВП (РО-9) в группе москвичей по сравнению с группой жителей Стэнфорда было обусловлено достоверно более низкой концентрацией частиц подфракции ЛВПЗ (РО-З.5) (Табл. 2). При этом достоверных различий в количестве частиц ни общего подкласса ЛВП2, ни его подфракций (ЛВП2а и ЛВП2Ь) обнаружено не было.

Подтверждением этому служат наши данные по анализу субфракционного спектра ЛВП по размеру частиц, определенному методом градиентного электрофореза в ПААГ (Регоуа N. е1 а1., 1992): более низкое у москвичей содержание подкласса ЛВПЗ (ГО- 3.5) обусловлено, в основном, тенденцией к более низкому относительному содержанию подфракции ЛВПЗЬ в спектре частиц ЛВП (15.1+1.29% против 18.8+1.55%. 0.1<Р<0.05): относительное содержание самых мелких частиц 'ЛВПЗс у москвичей также было несколько ниже, чем у жителей Стэнфорда, но различия .не достигли статистической значимости (6.1+0.94 и 7.6+0.94%, соответственно).

Активный обратный транспорт ХС, характерный для лиц с гипе-

ральфахолестеринемией, предполагает значительный ■синтез и поступление в кровоток мелких частиц подфракции ЛВПЗс и ЛВПЗЬ и их активное превращение по мере захвата ХС в более крупные частицы ЛВП2Ь. что должно отражаться в нарастании концентрации последних. Обнаруженный нами факт, что при довольно высоком содержании ХС ЛВП более низкая у москвичей по сравнению с американцами концентрация мелких частиц ЛВПЗ не была сопряжена с более высоким содержанием крупных частиц ЛВП2Ь, свидетельствует, скорее всего, о недостаточной продукции и поступлении в кровоток мелких частиц, являющихся предпочтительным субстратом реакции этерификации ХС с образованием его эфиров и их транспортом в печень при участии Фермента лецитин:холестерин-ацилтрансферазы (ЛХАТ) (Glomset J., 1972; Hamilton R. et al., 1976).

2.2. Гетерогенность ЛВП по размеру частиц ■Характеризуя субпопуляции апо AI-содержащих ЛП по размеру частиц, мы планировали ответить на вопрос, в какой степени функциональная активность ЛВП определяется вариациями их субфракционного спектра, т.е. выяснить, могут ли параметры субфракционного спектра служить маркерами нарушений в системе обратного транспорта ХС. опосредуемого ЛВП.

Анализ, проведенный на группе мужчин без признаков ИБС. продемонстрировал существование по крайней мере 5 субфракций с довольно постоянным диаметром частиц. Это ЛПВ2Ь (средний диаметр 10.1-10.3 нм), и ЛВП2а (8.8-9.0) нм), составляющие охарактеризованный в ультрацентрифуге,подкласс ЛВП2, а также ЛВПЗа (8.2-8.3 нм), ЛВПЗЬ (7.8 нм) и ЛВПЗс (7.5 нм), входящие в ЛВПЗ (Рис. 2). Вариации субфракционного профиля ЛВП в зависимости от уровня ХС ЛВП (Рис. 3) в основном, обусловлены подфракцией ЛВП2Ь: при нормальном содержании ХС ЛВП основной пик принадлежит подфракции ЛВПЗа, тогда как при гиперальфахолестеринемии основной пик представлен подфракцией ЛВП2Ь, а при гипоальфахолестеринемии. особенно сочетающейся с ГТГ, субфракционный спектр ЛВП сдвинут в сторону преобладания более мелких и плотных частиц ЛВПЗЬ.

Сравнение относительного содержания каждой подфракции в общем пуле.ЛВП у больных ИБС (п=85) и лиц без признаков заболевания (п=94) (Табл.- 3) выявило существенный вклад подфракции ЛВП2Ь и в детерминацию низкого уровня ХС ЛВП. При этом сниженная доля частиц подфракции ЛВП2Ь у больных ИБС была сопряжена с повышенной

Рис. 2. Типичная денситограмма ЛВП при нормолипидемии (размер частиц указан в нм)

8.3

1 11111

тиреоглоОулин 2в 2а За Зв Зс альбумин

50% 40

30

20 10 0

Рис. 3. Субфракционный спектр ЛВП при нормолипидемии и ДЛИ

□ Гипер ХС ЛВП С] Нормолипидемия Ш Гипо ХС ЛВП Ш Гипер ТГ

вп3а - лвп3б лвп3с

Таблица 3. Процентное распределение частиц ЛВЙ по подфракциям

Группа Подфракции ЛВП, процент

от всех ЛВП от ЛВПЗ

ХС ЛВП ЛВП2Ь ЛВП2а ЛВПЗ ЛВПЗа ЛВПЗЬ ЛВПЗс

Больные 39+1.3* 18+0.8* 24±0. 2 58+0.8* 60+0.8* 33+0.6*7. 0+0. 34* ИБС

Мужчины 46+0.8 26±0.8 25+0.1 49+0.8 67+0.8 29+0.6 3.9+0.37 без ИБС

* - Р<0.05

долей частиц подфракции ЛВПЗ, внутри которой отмечался сдвиг в сторону увеличения доли самых мелких частиц ЛВПЗЬ и ЛВПЗс.

Относительное накопление в плазме крови больных ИБС мелких плотных частиц подфракций ЛВПЗЬ и ЛВПЗ'с наряду со снижением доли крупных частиц ЛВП2Ь может быть обусловлено по крайней мере двумя причинам!. Во-первых, это нарушение физиологического каскада реакций, сопряженных с укрупнением частиц подкласса ЛВПЗ в процессе акцепции и этерификации ХС и обеспечивающих функциональную активность ЛВП в обратном транспорте ХС (Stein Y. et al., 1975; Scann A. et al., 1982). Во-вторых, это характерная для больных ИБС и лиц с низким уровнем ХС ЛВП сниженная активность липопро-теидлиполиза, приводящая к повышенному уровню в крови ТГ, что в свою очередь индуцируе? обогащение ТГ ядра частиц ЛВП2, которые становятся хорошим субстратом для печеночной липазы, обладающей и фосфолипазной активностьй (Patsch J.. et al., 1984; Barter P. et al., 1986;- 1987). Связываясь с гепатоцитом, такие ЛВП2 наряду с ТГ теряют и фосфолипиды, уменьшаются в размерах и вновь поступают в кровоток, но в виде дефектных частиц (по размерам соответствующих ЛВПЗЬ). которые обеднены фосфолипидами. но не освободились от ХС и поэтому не способны к дальнейшему активному захвату избытка ХС из периферических тканей и его этерификации.

Таким образом, анализ специфики субфракционного спектра в группах больных ИБС и у лиц без ее клинических проявлений в зависимости от их липидного профиля, в частности уровня ХС ЛВП, позволяет не только идентифицировать те формы гетерогенности ЛП, которые сопряжены с нарушениями функционирования системы обрат-

ного транспорта ХС. но к судить о механизмах этих нарушений.

2.3. Гетерогенность ЛВП по апобелковому составу

Результаты проведенного нами дискриминантного анализа у взрослых мужчин и их детей указывают на различие взаимоотношений между ano AI и ХС ЛВП в зрелом и детском возрасте и свидетельствуют о том, что концентрация ano AI не является ведущим фактором, определяющим холестерин-транспортную функцию ЛВП. Согласно имеющимся в литературе данным, вариации уровня ХС могут быть обусловлены разными механизмами, в частности, различными по направленности отклонениями в концентрации частиц ЛВП, содержащих только ano AI (ЛП AI) или ano AI вместе с ano АН (ЛП AI: All). Однако, неясно, сопряжены ли вариации распределения ano AI между двумя типами частиц ЛВП с наследственной предрасположенностью к ИБС.

Для ответа на этот вопрос был проведен сравнительный анализ распределения ano AI между двумя типами частиц ЛВП, т.е. ЛП AI и ЛП AI:All у больных ИБС и их детей по сравнению с мужчинами, отобранными из московской популяции, и детьми, чьи родители не страдали клинически выраженной ИБС.

Больные ИБС и их дети отличались от соответствующего контроля более низким абсолютным содержанием частиц ЛП AI (Табл. 4). При этом, если больные ИБС, имевшие более низкий, чем в группе сравнения, уровень ano AI, отличались от последней лишь по относительному содержанию частиц ЛП AI:AII (67.4% против 59.8%, Р<0.05), то дети группы риска имели достоверно более высокое абсолютное содержание ЛП AI:AII, чем подобранные по полу и возрасту дети контрольной группы.

Таким образом. анализ иммунохимической гетерогенности ЛВП позволил выявить определенную специфику нарушений в системе обратного транспорта ХС. Один из независимых факторов риска ИБС -положительный семейный анамнез - уже с детства'ассоциируется не только с низким содержанием частиц ЛП AI, но и с преимущественным перераспределением ano AI в частицы ЛП AI:AII. Примечательно, что накопление ЛП AI:AII в спектре ЛВП было обнаружено нами у детей группы риска весьма в раннем возрасте - еще до вступления в период пубертата (85.8+4.9 мг/дл в группе риска против 65.1+6.8 мг/дл в контроле, Р<0. 02).

Результаты проведенного сравнительного анализа детей группы риска и контроля свидетельствуют о том, что в отличие от уровня

- 23 -

Таблица 4. Распределение апо А1 в ЛВП

Группа Апо А1 ЛП А1 ЛП А1: АН

мг/дл плазмы

Больные ИБС Мужчины без ИБС 126+3.7 * 138+2.2 43.7+2.8 * 48.4+1.2 85.0+3.7 82. 5+2. 2

Дети группы риска Дети-контроль 134+2.6 130+3.4 42.5+1.8 # 49.7+2.8 75.4+2.5 # 60.3+3.7

* - Р<0.05 при сравнении взрослых;

# - Р<0.05 при сравнении детей.

апо В, который действительно отражает вариации концентрации ЛНП и ЛОНП в плазме крови, суммарный апо А1 не только не отражает, но иногда и "маскирует" изменения содержания отдельных фракций ЛВП. Очевидно, этим объясняется тот факт, что в уравнение ДФ у детей входит уровень ХС ЛВП, как более интегральный показатель обратного транспорта ХС. Однако, когда в число параметров, анализируемых методом шагового анализа, мы включили показатели иммунохимической гетерогенности ЛВП, т.е. данные о концентрации в плазме крови частиц ЛП А1 и ЛП А1: АН, полученные для детей группы риска и соответственно подобранного контроля, оказалось, что наиболее информативным показателем, позволяющим правильно разделить детей на две группы, оказался уровень ЛП А1:АП (Р = 7.21), за ним следовал показатель концентрации ЛП А1 (Г=5.05).

Полученные результаты, таким образом, дают основание полагать, что выявленные сдвиги в соотношении ЛП А1 и ЛП А1:АП в составе ЛВП у детей из семей с положительным анамнезом по наличию ИБС и имеющие тот же характер, что у их больных ИБС отцов, могут быть включены в комплекс параметров, отражающих нарушения каскада реакций обратного транспорта ХС из периферических тканей в печень, которые сопряжены с повышенной подверженностью к развитию атеросклероза.

Анализ особенностей распределения апо А1 в подфракции ЛП А1 и ЛП А1:АП у лиц с клиническими проявлениями ИБС, сопряженной с низким уровнем ХС ЛВП, выявил типичный для них полиморфизм ЛВП с абсолютным или относительным снижением содержания в плазме фрак-

ции частиц ЛП AI. Если этот тип полиморфизма способствует нарушению физиологических антиатерогенных свойств ЛВП, то возникает вопрос, связан ли повышенный уровень ХС ЛВП, который рассматривается как защитный от атеросклероза фактор, с противоположным распределением частиц ЛВП по апобелковому составу.

Для ответа на этот вопрос был проведен анализ распределения апо AI между двумя типами частиц ЛВП в группах российских мужчин (п=21) и мужчин-французов (п=50) с одинаково повышенным уровнем ХС ЛВП>50 мг/дл, по сравнению с популяционной выборкой мужчин-москвичей (п=90). Полученные результаты свидетельствовали о том, что высокий уровень ХС ЛВП в группе российских, но не французских мужчин сопряжен с самым высоким из трех сравниваемых групп содержанием апо AI, который оказался распределен преимущественно в частицы ЛП AI: АН (Рис. 4). Согласно литературным данным, у мужчин-французов самое высокое относительное содержание частиц ЛП AI: АН характерно для больных ИБС с низким уровнем ХС ЛВП (Puchols P. et al., 1987). -Полученные же в данном исследовании результаты показали, что среди российских мужчин самое высокое относительное содержание частиц ЛП AI.-AII, менее функционально активных, как полагают (Barbaras R. etal., 1988), отмечено как раз у лиц с высоким уровнем ХС ЛВП.

В совокупности полученные результаты позволили заключить, что относительно высокий (более 50 мг/дл) уровень ХС ЛВП у российских мужчин сопряжен с накоплением в составе ЛВП неактивной в отношении обратного транспорта ХС, как полагают (Barbaras R. et al.. 1988), подфракции ЛП AI: АН. имеющем место на фоне низкой концентрации частиц подкласса ЛВПЗЬ, которые физиологически доллны быть хорошим субстратом ЛХАТ-реакции (Fielding С.& Fielding P., 1981). Такая специфика гетерогенности ЛВП при довольно . высоком уровне ХС ЛВП, характерном для популяции российских мужчин, может быть одной из причин сниженного защитного действия высокого содержания ХС ЛВП. лежащего-в основе отрицательной взаимосвязи между его высокой концентрацией в крови и смертностью от связанных с атеросклерозом заболеваний.

Примечательно, что ферментативные активности, обеспечивающие функционирование ЛВП в плазме крови (ЛХАТ, белок, переносящий зфиры ХС), ассоциированы, в основном с подфракцией ЛП AI (Cheung М. et al., 1986; Castro G.& Fielding С.. 1988). ЛП AI отличаются от ЛП AI:AII тем, что. являясь лучшим субстратом реакции с

Рис. 4. Распределение апо AI между частицами ЛП AI и ЛП AlrAli

200

150

100

ЕЗНоскваДС ЛВП>50 ЕЗЛиаль, ХС ЛВП*60 □Москва, выборка ** РсО.05

участием фермента ЛХАТ, очевидно, играет более значительную роль как форма обратного транспорта ХС из тканей в печень. Поэтому и относительное, и особенно абсолютное сниезняз их уровня в составе ЛВП наряду с накоплением фракции ЛП AI: АН моя» считать фактором, повышающим атерогенкые свойства липид-транспортяой системы. Базируясь на этих данных, следувщеа задачей работы было исследовать In vitro функциональную роль каздоЯ из этих шдфрахций ЛВП в обратном транспорте ХС.

2Л.. Влияние ЛП AI и ЛП.А1.:_АН. на вьссод холестерину мз клеток

Обратный транспорт ХС - процесс слогный и многоступенчатый; одним из его начальных ключевых этапов является, по-видимому, транслокация ХС из внутриклеточного пула к плазматической мембране (Slotte J. et al., 1987) с его последующей десорбцией на соответствующий акцептор (Oram J., 1S83). Было показано, что увеличение содержания ХС в клетке индуцирует экспрессию ЛВП-свлзывающих центров на клеточной мембране периферических клеток (Graham D.&

Oram J.. 1987); Эти же авторы обнаружили зависимость транслокации внутриклеточного ХС к плазматической мембране от связывания ЛВП сс специфическими центрами на мембране периферических клеток, тогда как удаление ХС с наружной плазматической мембраны не требовало специфического взаимодействия акцептора ХС с клеткой.

Один из подходов к изучению функциональной роли апо AI-содержащих ЛП заключается в анализе In vitro их способности влиять на выход избытка ХС из мембран периферических клеток. В качестве экспериментальной модели нами была использована культура эндоте-лиальных клеток (ЭК) аорты быка, поскольку: а) монослой ЭК служит первичным местом взаимодействия между артериальной стенкой и ЛП плазмы; б) известно, что конфлуентные в культуре ЭК обладают так называемыми "скавенджер" рецепторами, удаляющими модифицированные ЛП из кровотока (Stein 0.& Stein У.. 1981; Baker D. et al., 1984) и поэтому могут быть в значительной степени нагружены холестерином. доставляемым в составе этих измененных ЛП; в) ЭК способны взаимодействовать с ЛВП через специфические ЛВП-связывающие центры. которые при накоплении в клетках значительного количества ХС активируются.

В предварительных экспериментах мы показали, что содержание ХС в клетках, инкубировавшихся в присутствии Ац-ЛНП, более чем в 2.5 раза превышало его содержание в контрольных клетках, которые инкубировали в отсутствие ЛП (32.2+0.58 мкг и 13.4+0.24 мкг свободного ХС. соответственно). Более того, оказалось, что ЭК способны поглощать и деградировать ацетилированные 1251-ЛНП со скоростью, в 20 раз превышающей скорость деградации нативных 1251-ЛНП; т.е. было подтверждено, что используемые ЭК нагружаются ХС через нерегулируемые "скавенджер" рецепторы. Эти результаты показали, что ЭК, нагруженные значительным количеством ХС, могут служить моделью для изучения биологической активности отдельных фракций ЛВП в отношении активации процессов обратного транспорта ХС. j Функциональную активность частиц ЛВП оценивали по их способности ускорять выход ХС из двух'его клеточных пулов: вновь синтезированного внутриклеточного ХС и ХС, содержащегося в наружной плазматической мембране клеток. Радиоактивное мечение клеток осуществляли дифференциально (Oram J. et al., 1986): внутриклеточный пул ХС метили с помощью биосинтетического его предшественника ЗН-мевалонолактона, 'а ХС плазматической мембраны - с помощью ЗН-ХС. Включение метки в соответствующие пулы контролировали при

инкубации меченых клеток с холестериноксид&зой. При соответствующим образом подобранных условиях этот фермент способствует окислению до холестенона лишь ХС плазматической мембраны, но не ХС из внутриклеточного пула (Lange Y. et al., 1983; 1984).

Таблица 5. Распределение радиоактивности между пулами холестерина в клетке при различных условиях введения метки

Метка Холестерин- Холестерин_Холестенон

оксидаза процент клеточного ЗН-стерола

ЗН-мевалоно- 92% 8%

лактон + 93% 7%

ЗН-холестерин - 72% 28%

17% 83%

Результаты, приведенные в табл. 5, показывают, что обработка холестериноксидазой клеток, меченых ЗН-мевалонолактоном, не.изменила соотношения холестерин/холестенон. т. е. метка в основном включилась во вновь синтезированный внутриклеточный пул ХС. В то же время, в клетках, меченых ЗН-ХС, более 80% клеточного ХС при воздействии холестериноксидазы окислялось в холестенон, что свидетельствовало о преимущественном включении метки в плазматическую мембрану.

Результаты экспериментов по влиянию ano Al-содержащих ЛВП на выход ХС из плазматической мембраны ЭК, предварительно нагруженных ХС представлены на Рис. 5А. Оказалось, что ЛП AI и ЛП AI: АН в равной мере способствовали выходу избытка ХС, входящего в состав наружной клеточной мембраны. В концентрации 100 мкг/мл ano AI они стимулировали выход 25-30% ХС из мембран клеток. При низких концентрациях ЛП (до 10 мкг/мл) обе ano Al-содержащие подф-ракции вызывали одинаковый выход ХС из нарухяой мембраны клеток, тогда как в более высокой концентрации частицы ЛП AIrAII оказались несколько более эффективными, чем ЛП AI.

Полученные результаты согласуются с данными других авторов, показавших одинаковый эффект частиц ЛВП двух типов на суммарный выход ХС из клеток (Johnson W. et al., 1991) или даже больший эффект ЛП AI:AII (Olkawa A. et al., 1991).

Рис. 5Б. демонстрирует влияние ano Al-содержащих ЛП на выход ХС из биосинтетически меченых внутриклеточных мембран. Эффектив-

ними в отношении стимуляции выхода ХС из его внутриклеточного пула оказались только ЛП AI, но не ЛП AI: АН. Эффект был такве до-зо-зависикым; при максимальных концентрациях (100 мкг ало А1/мл) JOT AI способствовали выходу 8-12% ХС из внутриклеточных мембран.

Ранее выход ХС из клеток, опосредованный апопротеином AI, входящим в состав ЛП AI и 1Щ AI: АН. исследовали с использованием в качестве модели культуры адипоцитов мыш после их предварительной нагрузки ХС в составе нативных ЛЯП (Barbaras R. et al.. 1987); было показано, что длительная инкубация клеток в присутствии ЛП AI приводила к заметному выходу суммарного ХС из клеток, тогда как частицы ЛП AI: АН оказались неэффективны. На этих же клетках было показано, что только ano AI-содержащие фосфолипидные комплексы индуцировали зависимую от протеинкиназы С транслокацию Х-С из тестируемых клеток (Theret N. et al., 1990). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что только процесс транслокации ХС к нарувкой мембране клетки является энергетически-зависимым и требует специфического связывания ЛП с мембраной (Kaplan М. & Slraonl R., 1985), тогда как собственно акцепция ХС с мембраны протекает как его десорбция или диффузия (Rothblat G.& Phillips HL, 1982; Karlin J. et al., 1987) и не требует затрат энергии.

В рвете данных, полученных на специфических жировых клетках, .наш результаты о различном влияний ЛП AI и ЛП AI: АН на выход ХС из внутриклеточного пула свидетельствуют о том. что именно фракция ЛП AI. но не ЛП AI: АН, является функционально активной, связываясь ер специфическим центром на плазматической мембране артериальных клеток и обеспечивая, тем самым, транслокацию ХС из внутриклеточного пула. В то se время данные об одинаковой эффективности ЛП AI и ЛП AI: АН в удалении ХС с наружной плазматической мембраны согласуются с полученными на адипоцитах результатами о той. что этот процесс и в клетках артериальной стенки не зависит от энергии и ыовет быть опосредован лвбым акцептором, способным связывать ХС. вклачая ЛП AI: АН.

Наша 3. Гетерогенность ало В-содеряацах шпопротендоз 3.1. Гетерогенность ano В-содерааших ЛП по размеру частил

Задачей следующего раздела работы было выяснить, имеется ли специфика субфракционного спектра ЛНП, характеризуемого по размеру частиц, у больных ИБС с ангиографически документированным ате-

Рис. 5, Влияние ano Al-содержащих частиц на выход холестерина из клеток

зн-хс зн-хс

А. Плазматическая мембрана Б. Внутриклеточный пул

Рис. б. Типичные денситограммы ЛНП

больного ИБС и здорового мужчины (размеры частиц указаны в нм)

!

26

29

27

Больной ИБС

Контроль

- 30 -

росклерозом и лиц без клинических признаков ИБС.

Проведено сравнительное исследование субфракционного спектра ЛНП у больных ИБС (п=120) и мужчин без признаков ИБС, не имевших по данным ангиографии коронарного атеросклероза (п=40). Было показано, что для больных ИБС характерна более выраженная гетерогенность по размеру частиц, чем для мужчин без признаков заболевания (Рис. 6).

У больных ИБС профиль ЛНП представлен в виде широкого дисперсного основного пика, состоящего из более мелких частиц, чем у лиц без ИБС, и обычно двумя-тремя минорными пиками более крупных по размеру частиц. У лиц без ИБС основной пик более узок, чем у больных ИБС, т.е. представлен более гомогенными и крупными частицами; минорные пики менее выражены и представлены еще более крупными частицами, чем в основном пике.

В литературе описано два типа индивидуального профиля ЛНП, различающихся по размеру. Диаметр частиц основного пика ЛНП типа А равен или превышает 25.5 нм: присутствует и второй минорный пик более мелких частиц. Основной пик частиц ЛНП типа В имеет меньший диаметр, т.е. менее 25.5 нм, а минорные пики более мелких частиц представлены в значительно меньшем количестве (Austin М. et al., 1988). Этими же авторами показана ассоциация профиля ЛНП типа В, т.е. преобладание мелких частиц, с наличием ИБС.

Проведенный нами анализ гетерогенности ЛНП по размеру частиц выявил специфику по субфракционному спектру ЛНП между больными ИБС и здоровыми мужчинами. Так, спектр ЛНП больных ИБС четко можно отнести к описанному в литературе типу В, для которого характерно преобладание мелких плотных частиц ЛНП-Ш , диаметр которых равен 24.2-25.2 нм (Musliner Т. & Krauss R., 1988). В то же время, профиль ЛНП по размеру частиц у лиц без ИБС - жителей Москвы нельзя отнести ни к типу А. когда в спектре преобладают более крупные и легкие частицы ЛНГЫ и ЛНП-II (диаметр. соответственно, 26-27.5 и 25.5-27.0 нм), ни к типу В. Следовательно, группы больных ИБС и лиц без признаков заболевания. различаются не только по количеству частиц ЛНП (более высокий у больных уровень ХС ЛНП (163+6.2 против 137+5.5мг /дл. Р<0.05) и аш В (138+ 3.5 против 117^3.4 мг/дл, Р <0.05), но и по характеру полиморфизма субфракционного спектра ЛНП.

Присутствие в спектре ЛНП мелких частиц связывают с высоким

уровнем ТГ и низким содержанием ХС ЛВП (McNamara J, et al.. 1987; Teng В. et al.. 1983). Предполагают, что различия частиц ЛНП по размеру обусловлены жлидаым составом их метаболических предшественников (Musllner Т. et al.. 1987) и активностью процессов липо-лиза ЛОНП и катаболизма ЛПП и ЛНП (Krauss.R. et al.. 1989).- В норме ЛОНП представлены относительно мелкими частицами с диаметром до 35.0 нм, в результате липолиза которых образуются преимущественно ЛНП-П. имеющие более высокую скорость катаболизма, чем более мелкие и плотные ЛНП-Ш. являющиеся продуктом липолиза характерных для больных ИБС крупных, обогащенных триглицеридами ЛОНП, имеющих диаметр частиц более 35.0 нм. При этом мелкие плотные ЛНП хуже взаимодействуют с апо В, Е-рецепторами и медленнее катаболизируют. вследствие чего дольше подвергаются процессам окисления в плазме, модифицируются и утилизируются через "ска-венджер" рецепторы, способствуя образованию пенистых клеток (Deckelbaum R. et al., 1984; Shepherd J., 1993).

На основании данных о том, что профиль ЛНП, определяемый присутствием ЛП типа А или В. детерминирован генетически (Austin М. et al., 1990), а также базируясь на наших данных о соответствии профиля ЛНП больных ИБС атерогенному типу В, можно полагать. что гетерогенность ЛНП по размеру частиц свидетельствует о тех нарушениях транспорта липидов в составе ЛНП. которые способствуют накоплению мелких частиц ЛНП, обладающих выраженными атерогенными свойствами. Следовательно, при оценке эффективности воздействий, направленных на коррекцию нарушений .в системе ЛНП, видимо, следует контролировать не столько степень снижения концентрации этих ЛП. сколько нормализация показателей их гетерогенности по размеру частиц.

3.2. Гетерогенность ЛП низких плотностей по апобелковому

составу

Задачей следующего раздела исследований было выяснить, сопряжено ли содержание различных форм апо В-содержащих ЛП с реализацией ранней ИБС у родителей как фактора риска у их детей. Был проведен анализ распределения апобелка В между частицами разного

состава в плазме крови лиц из 26 ядерных московских семей, где отцы в возрасте до 45 лет страдали ИБС (Табл. 6). Здесь же приведены результаты аналогичного анализа в группе контрольных детей, подобранных к детям группы риска по полу, возрасту и степени полового созревания.

Таблица 6. Распределение ano В в ЛП низких плотностей

Группа Апо В ЛП В ЛП В:Е ЛП В: CIII ЛП В: (а)

мг/дл процент от суммарного апо В

Больные ИБС 136+6.6 * 32.7 *# 18.6 23.8 24.9 *

(ОТЦЫ) 11 = 26

Матери 94+2.9 58.1 11.3 22.1 8.5 #

п = 26

Дети-риск 85+3.4 & 44.2 & 15.3 20.0 20.5 А=

п - 41

Дети-контроль 76+3.4 51.6 21.2 13.5 13.7

п = 41

* - достоверные различия (р<0.05) между отцами и матерями;

# - достоверные различия (р<0.05) между родителями и детьми в

семьях;

& - достоверные различия (р<0. 05) между детьми группы риска и контроля.

Высокий уровень апо В в ппазме крови больных ИБС (отцов) и их детей сопряжен с более гетерогенным его распределением в частицы разного апобелкового состава, чем соответственно у матерей и детей контрольной группы. Если у матерей и у контрольных детей более половины всего апо В находится в частицах, содержащих только этот апопротеин (ЛП В), то для больных ИБС-отцов и их детей характерно относительное накопление частиц ЛП В:(а) при одинаковой доле в спектре ЛП низких плотностей частиц ЛП В:Е и ЛП В:CIII.

Таким образом, содержание апо В. входящего в состав частиц ЛП В и ЛП В:(а) в значительной мере, по-видимому, детерминировано влиянием наследственного фактора. В отличие от ЛП В. частицы ЛП В: (а) обладают очень слабым сродством к ЛНП-рецептору (Krempler R. et al.. 1983; Bard J.-M. et al., 1989), поэтому обогащение ими

ЛНП больных ИБС и их детей свидетельствует об атерогенном сдвиге в их липопротеидном спектре. В го не время, содержание частиц ЛП В:CIII скорее всего, обусловлено семейно-средовым фактором, поскольку оно оказалось одинаковым у всех членов обследованных семей, а у детей контрольной группы было самым низким, хотя различия между детьми групп риска и контроля не достигли статистической значимости'.

Содержание частиц ЛП В:Е у членов семьи значительно не различалось, что такге свидетельствует о вкладе семейно-средового фактора в его детерминацию; вариации их содержания в несколько более широких пределах могут быть обусловлены количественным соотношением апо В к ano Е в частице ЛП В:Е. Недавно было показано, что сродство апо В-содержа!цих ЛП к апо В.Е-рецептору возрастает при увеличении соотношения ano Е к апо В з частице ЛП В:Е; это сродство модулируется фенотипом ano Е (Bard J.-M. et al.. 1989). Более того, в литературе имеются данные о том. что определенные нарушения транспорта ХС характеризуются специфическим профилем апо В-содеркащих частиц. Так. у лиц с семейной ГХС наряду с увеличением концентрации ЛП В возрастает и количество ЛП В:Е и ЛП В: CHI по сравнению с нормолипидемией; ГЛП III типа характеризуется резким повышением только частиц ЛП В:Е (Fruchart J.-С. et al.. 1991); у больных с почечной недостаточностью повышено содержание ЛП В: CHI и ЛП В: (a) (Parra Н.-J. et al.. 1987).

Таким образом, анализ распределения апо В неаду частицами ЛП низких плотностей позволяет идентифицировать метаболически различные субпопуляции этих ЛП. а повышенное относительное содерза-ние ЛП В:(а) при более низкой доле частиц ЛП В могет быть предло" :?ено в качестве маркера атерогенности апо В-содерзащи ЛП. осу-зэстзллааих доставку ХС в ткани.

С тем чтобы выяснить, всегда ли накоплетае частиц, содеращих в своем составе апо В и апо (а), характерное, как било показано, для больных ИБС и их детей, связано с повышенным уровнем ЛП (а) в плазме крови, был проведен анализ содержания ЛП (а) в плазма крови в непреднамеренно отобранной группе муячкн из московской популяции (П-.160) и в группе больных ИБС того го возраста (п-158).

Обнаружен сходный с описанным в литературе (Dahlen G. et al.. 1986; Assraann G., 1993) асимметричный характер распределения его

концентраций, что следует из различий между средними арифметическими и медианой (12.5 и 7.0 мг/дл для выборки из популяции и 15.5 и 6.7 мг/дл для больных ИБС).

В клинических исследованиях было показано, что риск развития ИБС возрастает в 2 раза при концентрации ЛП (а), равной или превышающей 30 мг/дл (Kostner G. et al.. 1981; Armstrong V. et al., 1989), поэтому уровень ЛП (а) ниже этого значения принято считать нормальным. В обследованных нами группах более 80% лиц имели нормальный - менее 30 мг/дл - уровень ЛП (а) и более 65% - менее 10 мг/дл. Лица, имевшие уровень ЛП (а)>30 мг/дл, встречались одинаково часто в обеих группах (16% среди больных ИБС и 13.4% в группе сравнения). Группы в целом не различались по среднему содержа-нив ЛП (а): 15.5+1.57 и 12.5+1.38 мг/дл. соответственно, однако в подгруппах больных ИБС с низким (<10 мг/дл) и с высоким (>30 мг/дл) уровнем ЛП (а) его уровень был достоверно выше, чем в соответствующих контрольных подгруппах (5.4+0.19 против 3.3+0.33 мг/дл. Р<0.001; и 55.2+4.12 против 42.9+2.92. Р<0.05). Примечательно, что в небольшой группе лиц, у которых при ангиографии не было выявлено патологии коронарных артерий (п=40), концентрация ЛП (а) в крови была достоверно ниже, чем у больных ИБС (9.7+2.13 против 15.5+1.57 мг/дл; Р<0.05); среди них всего 3 человека (5.9%) имели ЛП (а)>30 мг/дл. Интересно отметить, -что анализ группы подростков из семей с положительным анамнезом по наличию ИБС уже в детстве выявил такую же частоту случаев высокого уровня ЛП (а), как у больных ИБС (19%), что значительно превышало эту величину у их сверстников (7.6%), чьи отцы здоровы.

У 112 прошедших обследование с применением селективной ангиог- < рафии мужчин был проведен детальный анализ содержания ЛП (а) в зависимости от степени поражения венечных артерий сердца, который показал, что в группе лиц с повышенным уровнем ЛП (а)>30 иг/дл частота встречаемости лиц с непорааенными сосудами и без клинических признаков ИБС была почти-в 3.5 раза них» (2 человека из 21, или 9.5%). чем в группе лиц с нормальным уровнем ЛЯ (а) (30 из 91, или 33%, Р<0.05);. содержание всех других показателей системы ЛП при этом было одинаковым в обеих грушах. В то же время. частота встречаемости больных ИБС с распространенными стенозами коронарных сосудов в группе с ЛП (а)>30 мг/дл была в 2 раза выше (13 из 21. или 61.9%) против группы с ЛП (а)<30 мг/дл (26 из 91. или 28.656, Р<0.05).

Значение ЛП (а) как фактора риска ИБС, независимого от других параметров обмена ЛП показано в целом ряде работ (Rhoads G. et al., 1986; Hoefler G. et al., 1988; Wlklund 0. et al.. 1990; Оло-финская И., 1992). Более того, имеются указания на возможность различных путей метаболизма ЛП у лиц с высоким и низким уровнем ЛП (а) в крови (Strandberg Т. et al., 1991). В то же время, не всегда лица с высоким уровнен ЛП (а), детерминированным составом изоформ апо (a) (Uterraann G. et al., 1987; 1988). имеют повышенный риск развития ИБС; примером могут служить темнокожие американцы, имеющие высокое содержание е крови ЛП (а), но низкую заболеваемость ИБС (Guyton J. et al., 1985).

Обнаруженная нами одинаковая частота лиц с ЛП (а)>30 мг/дл среди больных ИБС и лиц без ИБС может быть обусловлена наличием в популяции носителей фенотипов, -ассоциирутацихся с высокой концентрацией ЛП (а), но не сопряженных с повышенным риском ИБС; в таком случае для выявления специфики атерогенного сдвига количественного определения ЛП (а) недостаточно и возникает необходимость проводить анализ изоформ апо (а). В то ке время, обнаружение у больных ИБС высокого уровня ЛП (а), который слупит маркером высокой атерогенносги ЛП, является указанием к коррекции имеющихся у больного нарушений липидного обмена.

Глава 4. Генетически детерминированная гетерогенность ело S-содерасадах ЛП Генетические аномалии, приводящие к нарушению в системе, транспорта ХС в составе ЛНП, могут быть обусловлены либо дефектом ЛНП-рецептора (Brown М.& Goldstein- J., 1977, 1986), либо патологией апо В и/или апо Е, являющихся лигандами этого рецептора. В связи с этим задачей настоящего раздела было исследование гетерогенности апо В-содержащих ЛП, обусловленной мутациями генов апо В или апо Е, приводящими к заменам в аминокислотной последователь-• ности этих апобелков. Затрагивая лигандные свойства апобеляов. такие мутации вызывают нарушения опосредуемого апо В и/или апо Е взаимодействия ЛП с рецепторами. Было важно также выяснить, как наличие мутаций в генах апо В и апо Е проявляется фенотипически.

4.1. Мутация гена, кодирующего аполипопротеин В Несколько лет назад была описана мутация в гене, кодирующем апо В, которая приводит к замене аминокислоты аргинин (арг) на

глутамий (глу) в 3500 аминокислотном остатке молекулы белка (McCarthy В. et al., 1988); мутация была названа "наследственным дефектом ano В-100". Гетерогиготы с наследственным дефектом ало В-100 в разных популяциях встречаются с частотой 1:500-1:700 (Welsgraber К. et al.. 1988), а среди лиц с гиперлипидемиями (ГЛП) его частота оказалась значительно выше (1:50) (Soria L. et al., 1989). Для россиян таких данных нет.

Поскольку при данной нутации нарушено рецепторное связывание ЛНП с апс В.Е-рецепторои и. соответственно, их вффективное удаление из кровотока, кояно думать, что эта аномалия сопряжена с накоплением в плазме крови ano В. Если это так, то наиболее вероятную группу для тестирования на наличие мутации в гене ало В представляют лща. икевщие высокий уровень ало В. Для проверки этой гипотезы бала отобрана группа из 27 мужчин, находившихся в стационаре для уточнения предположительного диагноза ИБС и имевших высокое содержание ало В в плазме крови (уровень ano В превышал 9035 отрезную точку распределения - 160 мг/дл).

Таблица 7. Профиль липопротеидов у членов семьи пробанда Г-С. - носителя мутации в гене ало В

Член Возраст, Наличие ХС ХС ЛНП ХС ЛВП ТГ Ало А1 Ало В

семьи годы мутации (мг/дл плазмы)

Г. С.. пробанд 43 -/+ 373 296 53 122 160 239

Г.П.. отец i-* СО -/+ 219 139 48 159 145 142

Г.М.. vate» 79 273 180 56 187 146 165

Г. Вл., брат 45 293 161 46 158 141 190

Г.К., сын 17 140 85 48 37 121 77

Г. Вал.. гена 42 183 108 61 69.. 158 92

В совместной работе с сотрудниками НИИ молекулярной генетики РАН с использованием методов молекулярной генетики нам удалось выявить одного гетерозиготного носителя мутации; это бал больной Г.С., 42 лет. Пробанд имел ГХС (Табл. 7), обусловленную повышенным содержанием ХС ЛНП и ano В. Фенэтипически мутация у пробанда была сопряжена с ИБС на фоне коронарного атеросклероза. Обследование семьи пробанда выявило, что он унаследовал эту мутацию от своего отца, имевшего клинически выраженную ИБС. Профиль ЛЛ отца пробанда характеризовался умеренно повышенным уровнем ХС крови.

тогда как уровень ano В был в пределах нормы. Ни брат пробанда. ни его сын не унаследовали данную мутацию. Выявленная ГХС у брата пробанда, как и у их матери, обусловлена, очевидно, другими механизмами. поскольку уровень ХС крови контролируется множеством различных генов и факторов окружающей среды.

Таким образом, показано, что мутация в гене ало В может быть сопряжена с семейной ГХС. по-видимому, полигенного характера.

Для оценки способности обнаруженного мутантного ano В связываться с ЛНП-рецепторами на клеточной мембране мы провели серию экспериментов, используя линию HeLa клеток. За 48 часов до проведения эксперимента клетки помещали в среду, содержащую 10% ЛП-де-фицитную сыворотку для активации ЛНП-рецепторов. ЛНП, выделенные из плазмы крови пробанда с наследственным дефектом ало В, оказались- менее эффективными в отношении их способности связываться с ЛНП-рецепторами на поверхности клеток: концентрация, необходимая для 50% конкурентного" вытеснения меченых 125-1 нативных ЛНП, предварительно связанных с ЛНП-рецепторами на поверхности HeLa клеток, для мутантного ano В оказалась почти в 2.5 раза выше, чем для нормального ano В (18.2 мкг/мл дефектного ano В и 7.5 мкг/мл нормального ano В).

Дефектное связывание ЛНП с рецептором можно было бы объяснить присутствием в ЛНП, выделенных из плазмы крови носителя мутации, других апобелков (группы С), которые ингибируют взаимодействие лиганда ano В с рецептором (Bard J.-М. et al.. ). Однако, согласно результатам электрофореза в ПААГ, дефектные ЛНП не содержали других апобелков. в то время как сам ano В был представлен рядом Фрагментов, свидетельствующих о большей деградации молекулы мутантного белка по сравнению с обычным (Metelskaya V. et al., 1993). Следовательно, аномальное связывание мутантного ano В с рецептором обусловлено самой мутацией.

Таким образом, нам удалось выявить и описать случай семейной ГХС, фенотипически сходной с нарушением, обусловленным дефектом ЛНП-рецептора, но вызванной иной причиной, а именно мутацией гена апобелка В, приводящей к дефектному связыванию лиганда с ЛНП-рецептором и, как следствие этого, к замедленному удалению ЛНП из кровотока. Следовательно, дефектный ano В может служить генетической причиной и четким маркером нарушенного катаболизма ЛНП, реализующегося в итоге в ГХС. В то же время, исходя из величины гена, кодирующего ano В-100, можно предполагать существование и

других мутаций, затрагивающих рецептор-связывающий участок этого белка и представляющих собой нераспознанные до сих пор причины некоторых форм ГХС.

4.2. Аполипоггоотеин Е В ряде исследований продемонстрирована роль апо Е в модуляции метаболизма апо В-содзржащих ЛП и их ремнантов как экзогенного (пищевой кир), так и эндогенного (синтез ЛП в печени) происхождения (Utermann G. et al.. 1984; Gregg R. et al.. 1989). Высказывается предположение. что фенотип апо Е во многом детерминирует процесс всасывания ХС в тонком кишечнике (Mlettlnen Т.& Kesanleml Y., 1989); полагают также, что генетическая форма апо Е определяет реакцию организма на липид-снижающую терапию (Nestruck A. et al., 1987). На основании этих сведений была поставлена задача исследовать зависимость от фенотипа апо Е реакции известных показателей атерогенности липопротеидов на некоторые воздействия, модифицирующие уровень триглицерид-богатых ЛП как кишечного, так и печеночного происхождения.

В нашей совместной работе с Е. Д. Айнгорн был отработан упрощенный метод фенотипирования апо Е непосредственно в плазме крови. позволяющий идентифицировать фенотипы апопротеина Е: Е4/4. Е4/3, ЕЗ/З. ЕЗ/2, Е4/2 и Е 2/2 путем изоэлектрического фокусирования сыворотки крови в ПААГ с последующим иммуноблотингом без предварительного выделения ЛП ультрацентрифугированием. Это позволило использовать метод для массовых исследований.

Планируя анализ частоты встречаемости аллелей апобелка Е в популяции, мы остановились на случайной репрезентативной выборке из популяции подростков, поскольку фенотип апо Е детерминирован наследственно и можно ожидать, что анализ его распределения в том возрасте, когда еще невелик уровень других факторов риска, скорее будет отражать истинные зависимости между фенотипом белка и профилем ЛП. Фенотипирование было выполнено у 350 школьников обоего пола; показано, что относительная частота аллелей гена апо Е в популяции составляет Е2:ЕЗ:Е4 = 0.068:0.808:0.124, что обычно для американцев и европейцев (Havel R., 1982; Ordovas J. et al., 1987; Utermann G., 1987).

Достоверного сдвига относительных частот этих аллелей среди больных ИБС (п=156) не выявлено (Е2:ЕЗ:Е4 = 0.045:0.852:0.103). Некоторые авторы сообщают о наличии ассоциации между полиморфиз-

ном апо Е и ИБС (Lenzen Н. et al.. 1986; Kuusl Т. et al.. 1989), однако мы, как и ряд других исследователей (Menzel Н. et al., 1983; [itermann G. et al., 1984). такой связи не обнаружили. В то же время, в популяции нами были обнаружены достоверные различия по уровню ХС между носителями разных аллелей (самый низкий ХС плазмы был у лиц с Е2 - 140+4.5 мг/дл, а самый высокий у носителей аллеля Е4 - 183+4.4 мг/дл). Больные ИБС-носители разных аллелей не различались по уровню ХС плазмы, но носители аллеля Е2 имели самый высокий уровень ТГ: 223+34.2 мг/дл против 145+6.6 мг/дл у лиц с ЕЗ, Р<0.05. и против 187+22.4 у лиц с Е4.

Анализ распределения аллелей гена апо Е в группах с ДЛП в популяции показал, что среди подростков с ГХС (ХС>200 мг/дл) достоверно выше относительная частота аллеля Е4 (20.9% по сравнению с 12.4% для всей выборки. Р<0.01): это сочеталось у носителей Е4 с высоким уровнем ХС (228+1.0 против 174+2.6 мг/дл в среднем по выборке) . Среди больных ИБС с ГЛП (ХС>250 мг/дл и/или ТГ>200 мг/дл) частота аллелей Е4 и ЕЗ не изменена по сравнению с больными с нормальным спектром ЛП. но при ГТГ увеличена частота аллеля Е2 (12% по сравнению с его отсутствием при нормолипидемии).

Таким образом, в популяции московских подростков нами, как и в других странах (Assmann G. et al., 1984; Ehnholm С. et al.. 1986), выявлена ассоциация аллеля Е4 с ранней, очевидно наследственно детерминированной, ГХС , когда атерогенные свойства аллеля Е4 опосредуются через сопряженную с ним ГХС.

в продолжение этих исследований был проведен анализ изменения показателей спектра ЛП под влиянием модулирующих уровень липидов крови экзогенных или эндогенных воздействий з зависимости от фенотипа апо Е. Предпосылкой этому явились данные о низком сродстве к апо В,Е- и апо Е-рецепторан изоформы апо Е2 по сравнению с ЕЗ И Е4 (Welsgraber К. et al.. 1982; Mahley R. et al., 1983). а такае данные о зависимости от фенотипа апо Е скоростей протекания реакций катаболизма апо в-содержащих ЛП, которые опосредуется апобел-ком Е (Gregg R. et al., 1989).

В качестве воздействия на систему транспорта экзогенных ЛП (всасывающийся в тонком кишечнике пищевой аир) использовали одноразовую жировую нагрузку. Стандартная жировая нагрузка выполнена по методике (Patsch J. et al., 1983); она включала прием натощак в течение 5 мин. эмульгированного жира в виде 20% сливок из

Рис. 7. Изменение уровней липидов и белков при жировоиГ нагрузке

200

150

xclinf

100

ür/дл

150

100

50

ЕЗ До жировой нагрузки

ЛГ/ЛЛ

175

12Г

75

□ Через 3 часа

МГ/ДЛ

I»

расчета 65 г жира на 1 kbím поверхности тела (в среднем, 639+7 мл), содержащих 510 мг ХС. 130 г жира, 23 г углеводов, и 50 г белого хлеба, что составляло около 1330 ккал. Исследование параметров системы ЛП проводилось натощак и через 3 часа после жировой нагрузки. В исследование было включено 148 человек, из них 113 -имели ИБС.

У всех обследованных независимо от фенотипа ano Е уровень ТГ через 3 часа после однократной жировой нагрузки был примерно в 2 раза выше, чем натощак. Из Рис. 7 видно, что у носителей аллеля Е2, обусловленное приемом жирной пищи возрастание уровня ТГ сопровождалось достоверным снижением ХС ЛНП и ano В; уровень ХС ЛВП при этом не снижался, а содержание ano AI даже несколько возрастало. У носителей аллелей ЕЗ и Е4 повышение при жировой нагрузке содержания ТГ не сопровождалось снижением уровней ХС ЛНП и ало В, тогда как содержание ХС ЛВП достоверно снижалось -и при фенотипе ЕЗ, и при Е4. Уровень ano AI при этом снижался только у носителей аллеля ЕЗ.

Кодификацию содержания эндогенных (синтезирующихся в печени) ЛП осуществляли при лечении больных с умеренной ГЛП (п=69) пролонгированной формой никотиновой кислоты - эндурацином (Endur-acln. Endurance Co.) в дозе 1500-2000 мг в день в течение 4 мес. В результате уровень ХС достоверно снизился, причем у лиц с апо Е2 степень его снижения была наименьшей (-95?) по сравнению с ЕЗ и Е4 ( -20% и -21%. соответственно). В то же время, снижение уровня ТГ под влиянием терапии в группе лиц с апо Е2 было наиболее выраженным (-25% против -18% и -1755 для фенотипов ЕЗ и Е4).

Полученные результаты можно объяснить различным сродством отдельных изоформ апо Е к специфическим рецепторам на поверхности клеток. Замедленная утилизация клетками печени содержащих апо Е2 ремнантов ХМ, концентрация которых при пищевой липемии увеличена, приводит к еще большей, чем натощак, активации апо В, Е-рецепторов и, тем самым, к снижению содержания ХС ЛНП и апо В через 3 часа после пищевой нагрузки. Этим и обусловлено "защитное" от атеросклероза действие фенотипа апо Е2. Другая ситуация складывается при разных изоформах апо Е на фоне воздействий, модифицирующих систему эндогенных ЛП. Наименьшая степень"падения уровня ХС у лиц с апо Е2 на фоне коррекции ГЛП никотиновой кислотой, снижающей эндогенную продукцию ЛОНП в печени, очевидно, обусловлена тем, что. несмотря на активацию ЛНП-рецепторов, индуцированную сниженным синтезом и. следовательно, сниженным содержанием ХС в клетке, ин--тенсивность связывания с ними апо Е2-содержащих ремнантов ЛОНП меньше, чем содержащих апо ЕЗ или Е4.

Таким образом, проведенное исследование системы ЛП в условиях модификации экзогенного и эндогенного путей транспорта липидов выявило специфику участия в этих процессах отдельных изоформ апо Е и продемонстрировало целесообразность их определения и учета при разработке показаний к направленным воздействиям на систему ЛП. корригирующим экзогенное (диетические мероприятия) или эндогенное звено их метаболизма.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученная в работе комплексная характеристика полиморфизма апо AI- и апо В-содержащих ЛП при физиологическом нормальном спектре липидов крови и в условиях их естественной (дислипидемии) или индуцированной (прием пищи или гиполипидемических препаратов) модификации позволила сформулировать и экспериментально подтвердить следующую концепцию. Молекулярная гетерогенность ЛП,

обусловленная их полифункциональностью, вносит существенный вклад в регуляцию биологической активности липид-транспортной системы организма. Вариации физико-химических свойств ЛП и их апобелков, которые являются следствием взаимодействия наследственных и/или средовых факторов, влияют ка проявление атерогенных свойств Ш1. Параметры; характеризующие гетерогенность ЛП могут служить маркерами ранних нарушений функционирования системы липопротеидов.

На модели эндотелиальных клеток аорты быка мы впервые показали различную функциональную роль двух типов частиц ЛВП, гетерогенных по апобелковому составу. Полученные в модельных экспериментах результаты позволяют понять и физиологическую роль частиц ЛП AI и ЛП А1:АИ. Поскольку только фракция ЛП AI активна в отношении удаления внутриклеточного ХС, можно думать, что снижение ее содержания в плазме крови в значительной мере определяет и меньшую функциональную активность ЛВП. В то же время, накопление в спектре ЛВП неактивной относительно стимуляции выхода ХС из внутриклеточного пула подфракции ЛП AI: АН также свидетельствует о сниженной антиатерогенной функции частиц ЛВП. При этом нами обнаружено, что подфракция ЛП AI:AII оказывается несколько более вариабельным параметром, чем ЛП AI. Содержание именно подфракции ЛП AI:AII увеличено еще до начала полового созревания у детей, чьи отцы страдают ИБС; более высокое содержание именно.этой подфракции характеризует семьи с наличием в них ИБС; наконец, именно этой подфракцией обогащены ЛВП при повышенном уровне ХС ЛВП у российских мужчин, что может быть причиной их сниженной антиатерогенной функции.

Обсуждая возможную роль ano AII, входящего в состав ЛП AI:AII, следует учитывать тот факт, что ЛВП участвуют не только в обратном транспорте ХС от периферических клеток в печень, но и доставляют ХС, например, к стероидогеннкм клеткам. Полагают, что направленность транспорта ХС в составе ЛВП во многом определяется ano АН. и его присутствие (ЛП А1:АН) обеспечивает поступление ХС, в специализированные клетки. Частицы ЛВП, не содержащие ano АН, т.е. ЛП Al способствуют транслокации ХС к плазматической мембране и его удалению из клетки.

Характеристика ano В-содержащих ЛП выявила ассоциации ИБС и предрасположенности к ней с более выраженной, чем в группах сравнения, неоднородностью ЛП низких плотностей как по размеру частиц, так и по распределению ano В между иммунохимически раз-

личными ЛП. Можно думать, что именно этой неоднородностью с относительным снижением количества частиц, содержащих только апо В, который является лигандом ЛНП-рецептора, обусловлено замедленное рецептор-опосредованное удаление ЛНП из кровотока у больных атеросклерозом.

Другим регулятором утилизации ЛНП является генетически детерминированный полиморфизм апо б ежа. Е. При этом изоформа Е2 играет защитную от атеросклероза роль, поскольку у носителей аллеля Е2 замедлено поступление экзогенного ХС в клетки в составе апо Е2-содержащих ремнантов хиломикронсв и, как следствие, активируется рецепторно-опосредованный захват эндогенных ЛНП.

В литературе последних лет широко дискутируется вопрос о том, следует ли добиваться снижения концентрации ЛП (а), каким образом и в какой степени. Полученные, нами данные об увеличенной доле частиц ЛП В:(а) у больных ИБС и у детей группы риска, имеющей место даже при нормальном, менее 30 мг/дл. уровне ЛП (а), указывают на необходимость поиска путей коррекции этого нарушения.

Таким образом, нам удалось выявить взаимосвязь функциональных свойств ЛП плазмы крови и их участия в атерогенезе с параметрами их молекулярной гетерогенности по распределению апопротеинов А1 и В между разными по составу частицами и содержанию в них минорных апобелков. по размеру липопротеидных частиц,, по специфике генетически детерминированных изоформ апо В и апо Е. Это свидетельствует об обоснованности выбора указанных параметров в качестве кандидатов на маркеры ключевых точек обмена ЛП. которые в первую очередь следует выявлять и на которые следует направлять корригирующие воздействия.

ВЫВОДЫ

1. Изучение гетерогенности липопротеидов плазмы крови по параметрам физико-химических характеристик и апобелкового состава позволило выявить те ее Формы, которые обусловливают проявление атерогенных свойств апо В-содержащих липопротеидов и нарушение антиатерогенных свойств апо А1-содержащих липопротеидов.

2. На основе анализа многофакторности атерогенных свойств липопротеидов крови предложен и апробирован в проспективном наблюдении чувствительный и высокоспецифичный маркер формирования атерогенных нарушений в системе транспорта холестерина детском возрасте (величина дискриминантной функции, ДФ), включающий в себя концентрацию апобелка В и уровень ХС ЛВП и позволяющий прогнози-

ровать направление динамики уровней липидов по крайней мере, в течение двух лет.

3. В модельных экспериментах с использованием клеточных культур продемонстрированы принципиальные различия в функциональной способности двух типов частиц ЛВП. гетерогенных по апобелковому составу. Частицы, содержащие только ano AI (ЛП AI), дозо-зависи-мым образом ускоряют выход холестерина из внутриклеточного пула предварительно нагруженных холестерином эндотелиальных клеток аорты быка. Связываясь со специфическими центрами на поверхности мембраны, ЛП AI индуцируют транслокацию вновь синтезированного холестерина к наружной мембране для его последующей акцепции, этерификации и транспортировки в печень. Частицы ЛВП. содержащие оба белка группы А - ЛП AI:AII - оказались неэффективными в этом процессе; они могут выступать лишь в роли акцептора холестерина, уже находящегося в плазматической мембране клеток.

4. Анализ иммунохшической гетерогенности ano Al-содержащих липопротеидов показал, что наследственная предрасположенность к ИБС с детства ассоциируется с низким уровнем в плазме крови частиц ЛП AI, которые стимулируют выход холестерина из клеток. Более того, и у больных ИБС, и у их детей обнаружено преимущественное распределение ano AI в частицы, содержащие ano AI и ano AII. что проявляется относительным накоплением ЛП AI:AII в спектре ЛВП у больных ИБС и увеличением их абсолютного содержания у детей группы риска.

5. Выяснена по крайней мере одна из- причин отсутствия отрицательной корреляционной связи между высоким уровнем ХС ЛВП в крови и смертностью от заболеваний, обусловленных атеросклерозом, в российской популяции мужчин. При высоком - более 50 мг/дл - уровне ХС ЛВП на фоне сниженной концентрации наиболее функционально активных мелких частиц ЛВПЗ, в основном, ЛВПЗЬ, показано обогащение ЛВП подфракцией частиц ЛП AI:AII.

6. Охарактеризована молекулярная гетерогенность ano В-содержа-щих липопротеидов. Установлен типичный для больных ИБС с ангиог-рафически документированным атеросклерозом коронарных артерий профиль ЛНП, для которого характерны преимущественно мелкие плотные частицы. Анализ иммунохимической гетерогенности ЛП.низких плотностей выявил специфику распределения ano В между частицами разных типов. Показано, что для-больных ИБС и их детей наряду со сниженной долей частиц, содержащих только ano В, специфично от-

носительное накопление в спектре высокоатерогенных частиц, содержащих ало В вместе с ало (а).

7. Методами ДНК-анализа выявлен носитель и охарактеризована мутация кодирующего апобелок В гена, которая ассоциируется с семейной полигенной гиперхолестеринемией. дефектным связыванием ало В с ЛНП-рецептором и наличием ИБС.

8. В условиях модификации двух систем транспорта лигадов в кровотоке обнаружена связь фенотипа апобелка Е с изменениями основных параметров спектра липопротеидов, вызванными воздействиями на экзогенное или эндогенное звено транспорта холестерина. Показана зависимость эффективности коррекции умеренной гиперлипи-демии от фенотипа ano Е.

9. Выявлена взаимосвязь параметров гетерогенности ЛП крови с их функциональными свойствами и участием в атерогенезе. Характеристика молекулярной гетерогенности ЛП и их функциональной активности по распределению апобелков AI и В между разными по составу частицами, по размеру липопротеидных частиц, а также анализ генетически детерминированных форм гетерогенности выявили различия между больными ИБС и/или их детьми, с одной стороны, и группами сравнения, с другой. Это свидетельствует об обоснованности выбора указанных параметров в качестве кандидатов на маркеры ранних ате-рогенных изменений в лигшд-транспортной системе организма.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Использовать полученные в работе границы нормальных значений содержания апобелков AI и В для диагностики атерогенных диса-полипопротеинемий.

2. Включить в число параметров, позволяющих с детства прогнозировать развитие атерогенных нарушений в системе ЛП, определение содержания в плазме крови ano В наряду с уровнем общего ХС и ХС ЛВП и расчетом величины дискриминантной функции (ДФ) для формирования групп подростков высокого риска развития дислипидемий. на которых следует направлять профилактические воздействия.

3. Внедрить определение уровня в плазме крови апопротеина AI, входящего в состав ЛП AI и ЛП А1:АП, для тестирования .эффективности удаления холестерина из клеток, опосредованного ЛВП.

4. При выборе подходов к коррекции повышенного уровня ХС ЛНП учитывать, что при фенотипе ano Е2 гиполипидемические препараты, воздействующие через активацию ЛНП-рецепторов, наименее эффективны, т.к. изоформа Е2 обладает наименьшим сродством к рецепторам.

1. Метельская^!?!!, ^¡вров&^В. Черкксева ^П? Курданов X.А.. Полес.ский В.А.. Герасимова Е.Н. Аполипопротеины AI и В плазмы крови и аполипопротеикы AI двух подклассов ЛВП у больных ИБС njM разном спектре липопротеидов. Билл. ВКНЦ АМН СССР. 1983

2. Айнгорн Е.Д., Метельская В. А., Чериыаева Н. П., Ветров

A.В., Озерова И.Н.. Бодрова Е.А.. Перова Н.В. Апопротеины и ли-пиды липопротеидов плазмы крови детей с отягощенной наследственностью по ИБС. Вопр. охраны матер, и детства. 1984, (2): 18-21.

3. Ветров А.В., Метельская В.А.. Герасимова Е.Н.. Барац С.С.. Перова Н.В. Апопротеины AI и В плазмы крови у молодых мужчин, перенесших инфаркт миокарда. Кардиология, 1984. (10): 87-90.

4. Айкгорн Е.Д., Метельская В. А.. Чернышева Н. П., Дорофеева Т.Г.. Григорьева И.В., . Белоконь Н.А., Герасимова Е.Н.. Перова Н.В. Лишды и апопротеины в плазме крови детей с наследственной предрасположенностью к ИБС. Кардиология, 1985. (5): 76-81.

5. Метельская В.А., Айнгорн Е.Д.. Черншева Н.П., Белоконь К. А. Апопротеины В, AI, и АН и липиды плазмы крови детей, наследственно предраспологенных к ИБС. Тезисы 1 Незднар. Конфер. Проф. Кардиологии. Москва, 1985: 73. Но. 195.

6. Oganoy R, MetelsKaya V, Belokonj Ы, Alngora Е. Olferlev А, Tubol I. Perova H. Apollpoprotein and lipid Indicators of hereditary predisposition to coronary heart disease in children. Abstr. 7m Intern. Symposium on Atherosclerosis, Melbourne, Australia, 1985: 210, Ho. 449.

7. Щербакова И.А., Перова Н.В., Метельская В.А.. Ануфриева Н.В.. Олферьев A.M.., Нечаев А.С. Распределение подфракций ЛШ при их разделении в соответствии с гидратированной плотностью и размером частиц. Вопр. мед. химии. 1986 (2): 93-102.

8. Перова Н.В., Бонне Я., Нечаев А.С., Щербакова И.А., Метельская В. А.. Крокет Р.. Леауань Ф., Грацианский Н. А.. Осокина И. В., Брико А.. Оганоз Р. Г. Сравнительная характеристика спектра основных лшидов и аполипопротеинов крови в группах больных ИБС из Москва и Бордо. Балл. ВКНЦ АШ СССР. 1986 (1): 66-72.

9. Перова и.В.. Метельская В.А.. Ануфриева Н.В.. Щербакова И. А., Нечаев-А. С., Шикоза А. И.. Косых В. А., Шахов D.A. Субфракционный сиактр липопротеидов еысокой плотности и их холесте-рин-тракспортная способность. Тезисы 4 Всесоюзн. Съезда кардиологов, Москва, 1986:14, Но. 022.

10. Perova N. J'etelskaya УА. BelokonJ НА, Alexandrov АА. Tubol IB, Haslennlkova GY, Dorofееva TG, Oganov RG. Dysllpoprotelnemla: plasffia lipids .and apollpoprotelns In Moscow school children. Abst. X World Congr. Cardiology. Washington, USA. 1986, No. 1528.

И. Добордапшидзе Л.it.. Перова H.В., Халтаев Н.Г., Метельская

B. А., Гризенков Е.А.. Тимофеева Т. Н.. Еуковский Г.С. Аполипопротеины В и AI плазмы крови в случайной выборке из организованной популяции муачин 20-59 лет и ииемическая болезнь сердца. Тер. архив. 1987 (1): 22-26.

12. Халтаев Н. Г.. Перова Н. В.. Добордггинидзе Л.И.. Метельская В.А., Грашш® Е.А., Куц Г.Г.. Чернькеза Н.П.. Захарбеков P.P. Питание и апопротеины В и AI плазмы крови. Тер. архив. 1987 (5): 108-112.

13. Dobordzhglnldze L. Perova N. Khaltaev N. Metelskaya V. Zhukovskl G, Gi'lshenicov E, Tlmoieeva T, levlev A. Bulln,V. Blood plasma apo B/apo AI ratio as predictive variable for coronary heart disease in occupational group. CYD Epldem. Newsletter. 1987. 42: 34-35.

14. Perova NV. Hetelskaya VA, Anufrleva HV, Scherbakova IA. Nechaev' AS, Shlshova AM, Shakhov YuA, Gratslanskl NA. Subfractlonal Spectrum of high density lipoproteins and their cholesterol-transporting properties. In: RI Levy et al (eds). Atherosclerosis Rev. Raven Press, New York, 1988, 17: 29-38.

15. Perova N.. Alngorn H.. Matelskaya v.. Dorofeeva Т.. BelokonJ N. Plasma lipid and apollpoprotem levels In children hereditarily predisposed to coronary heart disease. Acta Paedlatr. Scand 1988, 77: 559-563.

16. Метельская В.A., CesKa R. Перова H.В.. Sohra J. Апопротеи-ны AI и В плазмы крови при разных типах гипорлипопротездскии: сравнительный анализ в группах жителей Москвы и Праги. Cor vasa. 1988. (3): 168-175.

17. Perova N., IJetelskaya v., Nechaev A.. Scherbdkova I.. Gorchakova N.. Bonnet J.. Brlcaud H., Oganov R. Apollpoprotem profile and subfractlonal spectrum of low and high density lipoproteins In coronary heart disease: comparative study of patients of two European cities. Abstr, 8th Intern. Syttp. on Atherosclerosis. Rone, Italy, 1988, No. 726.

18. Metelskaya V., Perova N.. Alngorn E.» Dorofeeva Т.. Olferlev A., Oganov R. Adolescent dislipoproteinemias: Is It feasible to predict the®? Abtsr. 61 AHA Confer.. Washington, USA. 1988 : No. 1749.

19. Метельская В.А., Айнгорн Е.Л.. йасленникова Г.Я., Лорофее-ва Т.Г.. Горчакова Н.Н., Снпягина А.Е., Ртаанская Т.В.,.Григорьева И. В.. Олферьев А.М., Белоконь Н.А., Перова Н. В. Атерогенкыэ даслипидемии у подростков: связь с наличием иаекической болезни сердца у отцов, возможность прогнозирования. Кардиология. 1989, (9): 28-34.

20. Hetelskaya V.. Perova N., Haslennlkova G., Tubol I..Alngorn E.. Kullkov S., Chudakova I.. Oganov R. Precursors of dysllpoprotelnemias, coronary heart disease risk factor In children: lipid and apolipoproteln levels, their evolution with age. feasibility of prevention. Abstr. 2nd Intonb Confer. Preventive Cardiology, Washington. USA, 1S89: Ho. 477.

21. Stelnerova А, Перова H.В., Метельская В.A.. Topolcan 0.. Karlleek V., Pollvkova v. Изменения уровней ядаидови апелипопро-теинов у больных ипемачесхой болезнью сердца (ссавннтаяьное исследование Пльзень-Москва). 1989 Cor Vasa (Л):'257-254.

22. Perova Ш. «Setelskaya VA, Alngorn HD, Dorofeeva TG. ¡laslennikova G.Ya.. Belok.cn N.A., Oganov R.G. The precursors of the atherogenic and nonatherogenlc dysllpoprotelnenilas In cblldhood. In: Chazov EI, Oganov P.G. (ed3). Preventive Cardiology. Int. Universities Ргезз Inc.. 1989: 71-108.

23. Перова И.В., Щербакова и,А., Метэдьская В.А.. Горшова И.Н., Щукина Г.В., Никитина Н.А., Соколова и.А., Соколов,J3.Ц.. Оганов Р. Г. Изменения после яфовой нагрузи! з химических ко£зга-нентах и физических характеристиках липопротеадов при ИБС. В сб.: Проблемы атеросклероза. 1990, с. 101-111.

24. Perova N., Hetelskaya V. . • Scherbakova I.. Gorshkoval., Schuklna G., Sokolov E. Coronary heart disease: postprandial changes in chemical and physical composition of low and high density lipoproteins and apollpoproteins levels In blood plasma. Abstr. XI World Congr. Cardiol., Manila, Philippines, 1990, v. XIX (1): 924.

25. Geraslmova E., Perova N., Ozerova I., Polessky V.. Metelskaya V., Scherbakova I., Levachev M., KulakovaS., Nlkltln Yu., Astakhova T. The effect of dietary n-3 polyunsaturated fatty acids on HDL cholesterol in Chucot residents vs Muscovites.

Lipids, 1991, 26: 261-265.

26. Метельская В. А., АЯнгорн Е.Д., Перова Н.В. Применение иммунологических методов для диагностики нарушений в системе аполи-попротеинов плазмы крови. В Сб.: Актуальные вопросы кардиологии. ВЫП. 5. Томск, ТГУ, 1991, С. 64-70.

27. Perova N.. Metelskaya V.. Scherbakova I. Tests for discriminating adults and children with atherogenic disturbances in lipoproteins. vAbstr. IX Eur. Cong. Clin Chem Cracow, Poland, 1991: 132, No. 17-23.

28. Metelskaya V., Alngorn E., RosseneuM., Aronov D., Perova N. Lipoprotein markers of coronary heart disease (comparative study in two European cities). Там же: 132, No. 17-24.

29. Metelskaya V., Perova N., Belokond N., Alnglrn E. Blood lipoproteins in adolescents with positive family history of coronary heart disease or with blood pressure lability. Abstr. 9th Intern. Symp. on Atherosclerosis, Rosemont, USA. 1991: 153.

30. Щербакова И.А.. Перова Н.В.. Соколов Е.И.. Щукина Г.Н., Метельская В.А., Никитина Н. А., Фомина В. М. Влияние одноразовой жировой нагрузки на показатели системы липопротеидов плазмы крови больных ИБС и здоровых лиц. Вопр. мед. химии. 1991, (2): 23-26.

31. Metelskaya V., Alngorn Е.. Perova N., Oganov R. Adolescent dysllplderalas: feasibility for prediction. Cardiovasc. Risk Factors 1992, 2: 31-35.

32. Perova N.. Metelskaya V., Geraslmova E., Kllmov A., Llndgren F.. Nichols A. Comparison of high density lipoprotein distributions In populations differing In correlation between high density lipoprotein levels and coronary heart disease mortality. Abstr. XIV ESC Congress, Barcelona, Spain, 1992: 181. No. 1072.

33. Shcheltslna N.. Metelskaya V., Melklna 0., Perova N. Coraparatlve evaluation of Lp (a) and apoprotein В as factors associated with coronary atherosclerosis manifestations. Abstr. 59th EAS Congress, Nice, France. 1992: 25', No. 65.

34. Metelskaya V.. Alngorn H., Parra H-J.. Bard J-M.. Oaf11 M., Perova N.. Fruchart J-C. Apolipoproteln AI containing lipoproteins In children with positive family history of coronary heart disease. Там же: 47.

35. Metelskaya V.. Cecchelll R., Bard J-M., Fruchart J-C.. Luc G. Lp AI but not Lp AI:All promote cholesterol efflux from bovine endothelial aortic cells. Там же: 68.

36. Perova N.. Zykova v.. Scheltzlna N.. Metelskaya v.. Avrusln K., Aronov D. The role of Lp (a) level In fibrinolysis activating therapy. 1993. Acta Cardiol. XLVII1:329-330.

37. Metelskaya V., Perova N.. Oganov R., Llndgren F., Nichols A., Fruchart J.-C. High density lipoproteins heterogeneity at hy-peralphacholesterolemla In men from Russian population. Abstr.3rd Intern. Conf. Preventive Cardiol., Oslo. Norway, 1993:6, No. 008.

38 Metelskaya V., Nlkonova A., Pogoda T.. Lestavel S., Limborskaya S., Clavey V., Perova N.. Fruchart J-C. Apolipoproteln В gene mutation in Moscow family. Abstr. 62th EAS Congr.. Jerusalem, Israel. 1993: 66.

39. Метельская В. А.. Айнгорн Е.Д., Бард Ж.-М.. ПарраЖ.-А.. Белоконь Н.А., Фруыар ж. -Ш., Перова Н.В. Частицы липопротеидов высокой плотности, содержащие аполипопротеин AJ. у подростков, наследственно предрасположенных к ИБС. 1933. Педиатрия,- 4: 26-30.

40. Metelskaya V.А., Dehouck М.-Р.. Cecchelll R., Bard J. -М., Fruchart J.-C., Luc G. Lp AI but not Lp AI:AII promote efflux of cholesterol from bovine aortic endothelial cells. - Cardiovasc. Risk Factors 1993, принято в печать.