Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Гетерогенная система гемоглобина в условиях нормального и измененного эритропоэза

Актуальность исследования. Проблема адаптации организма к действию различных экстремальных факторов является центральной в современной физиологии, патофизиологии и медицине. В связи с тем, что биологическое действие большинства из них и патогенез многих заболеваний связаны с изменением кислородного режима в тканях, особое место в обеспечении адаптивных и компенсаторных процессов занимает газотранспортная функция крови.

В процессе эволюции сформировалось несколько типов белков, осуществляющих эту функцию. В настоящее время выделяют четыре типа дыхательных пигментов животных: гемоглобин, гемоцианин, хлорокруорин, гемеритрин. Гемоглобин содержат 49,58% видов животных, хлорокруории-0,58%, гемеритрин-0,17%. Распространённость гемоцианина соответствует таковой для гемоглобина. У наиболее развитых представителей животного мира основным переносчиком кислорода является гемоглобин [82,83], имеющий определённые видовые особенности.

В крови большинства живых организмов, как правило, можно одновременно зарегистрировать несколько типов гемоглобина, которые принято называть изоформами. В частности, у взрослого человека в крови циркулирует три [41 ], у крысы - шесть [94], у птиц - две [137,148], у леща - четыре [57] изоформ ы гемоглобина, различющиеся по молекулярной структуре. Эти факты легли в основу представлений о гетерогенной системе гемоглобина [94]. В то же время остаётся неясным, чем определяются различия в количестве изоформ в эритроцитах разных видов животных и их связь со степенью зрелости и строением клеток красной крови.

В настоящее время достаточно подробно описаны механизмы синтеза гемоглобина человека, смена его типов в процессе онтогенеза. Наиболее детально охарактеризована смена доминирующих изоформ гемоглобина на ранних этапах онтогенеза (антенатальный и ранний постнатальный периоды). В то же время состояние системы гемоглобина в более поздние периоды жизни неизвестно.

Многими авторами показаны изменения гемоглобинового профиля при действии экстремальных факторов. В научной литературе это явление описано для различных вариантов гипоксии: гипоксической гипоксии [91,94,62,22,110], анемической гипоксии [37,88,91,94,50,164,165,77,162], циркуляторной гипоксии [6,129], гипоксии у жителей Севера [1,8]. У человека в гипоксических ситуациях происходит возрастание содержания гемоглобина ¥, свойственного плодному периоду развития, а у животных - фракций, эквивалентных этому типу гемоглобина.

Изменения гемоглобинового профиля в виде повышения уровня гемоглобина Б регистрируются и при различных гематологических заболеваниях, таких как серповидно-клеточная анемия [17,120,244], бета-талассемия [7,47,79,113,111], апластическая анемия [123], гемобластозы [168,193] и других.

Кровь выполняет свою газотранспортную функцию в меняющихся условиях тканевой среды - в том числе при сдвигах рН, активации протеолитических ферментов (в желудочно-кишечном тракте в процессе пищеварения, в очаге воспаления, в гипоксических условиях), что ставит вопрос о физиологическом смысле различий физико-химических свойств изоформ гемоглобина и месте последних в адаптации к экстремальным воздействиям. Тем более, что с помощью метода мессбауэровской спектроскопии прямо показана зависимость электронной структуры железа и стереохимии активного цежра 01 молекулярной структуры глобина [71].

Доказано, что фетальный гемоглобин человека обладает большим, чем гемоглобин А, сродством к кислороду, более выраженным эффектом Бора [12|, кислото- и щёлочеустойчивостью [105,141]. В свете этих особенностей персистенция его в антенатальном онтогенезе и в условиях гипоксии являсюя физиологически закономерной.

Таким образом, гетерогенность гемоглобина является давно признанным фактом, а изменения соотношения между его фракциями отмечены при экстремальных состояниях, различных заболеваниях и в онтогенезе.

Однако, свойства отдельных фракций, формирование гемоглобиновсм о профиля в процессе онтогенеза, его изменения в экстремальных условиях и при патологических процессах, а также механизмы, регулирующие соотношение между фракциями гемоглобина, изучены лишь фрагментарно. Вероятно, это связано с тем, что авторы, занимавшиеся исследованием системы гемоглобина при экстремальных состояниях, как правило, изучали только соотношение фракций, не рассматривая других параметров эритрона. Кроме того, многие исследователи оценивали состояние системы гемоглобина чаще всего в какой-нибудь определённый момент времени. При этом содержание изоформ гемоглобина определялось в процентах, а не в абсолютных величинах, в то время как для выявления значимости той или иной формы гемоглобина важно проследить изменения содержания её абсолютного количества в крови в динамике действия экстремального фактора или развития патологического процесса.

Всё вышеизложенное свидетельствует о том, что понимание физиологического значения гетерогенности гемоглобина, роли отдельных изоформ в адаптации организма к экстремальным воздействиям и при различных патологических процессах требует специальных, целенаправленных исследований.

Цель исследования: изучить характер и механизмы изменений отдельных изоформ гемоглобина в процессе онтогенеза и при адаптации к действию экстремальных факторов.

Задачи исследования:

1. Определить соотношение между фракциями гемоглобина и сопоставить его с особенностями эритроцитов у животных различных видов.

2. Исследовать гемоглобиновый спектр эритроцитов крысы и курицы в течение жизни.

3. Изучить изменения гемоглобинового профиля при действии на организм гематотропных экстремальных факторов (кровопотеря, гипоксическая гипоксия, гипероксия).

4. Выявить и дать характеристику фракций гемоглобина крысы, наиболее значимых для адаптивных реакций.

5. Изучить возможности прямого и опосредованного влияния гипоксии на гемоглобиновый профиль зрелых эритроцитов.

6. Сопоставить изменения гемоглобинового профиля с состоянием эритропоэза при действии на организм экстремальных факторов.

7. Сопоставить изменения гемоглобинового профиля и других параметров эритрона в онтогенезе и при действии экстремальных факторов

8. Сравнить гемоглобиновый профиль ретикулоцитов нормальных животных и при фенилгидразиновой анемии.

Научная новизна исследования:

1. Впервые проведено определение абсолютного содержания отдельных изоформ гемоглобина в эритроцитах экспериментальных животных.

2. Показаны отличия в соотношении изоформ гемоглобина в ядросодержащих и безъядерных эритроцитах.

3. Установлено, что перестройка соотношения между фракциями гемоглобина происходит после рождения у животных с внутриутробным развитием зародыша и отсутствует у организмов, развивающихся в яйце вне организма матери.

4. Доказано наличие двух видов ретикулоцитов, отличающихся по гемоглобиновому спектру.

5. Установлены различия в смене типов гемоглобина после рождения у животных с внутриутробным развитием зародыша и развивающихся в яйце вне организма матери.

6. Впервые показано наличие изменений гемоглобинового спектра у С1арых животных на фоне сокращения плацдарма кроветворения.

7. Доказано, что изменения гемоглобинового профиля эритроцитов при действии на организм экстремальных факторов (кровопотеря, гипоксия, гипероксия) обусловлены качественной перестройкой эритропоэза.

8. Доказано, что гетерогенность гемоглобина является важным компонентом адаптивных реакций, выделены наиболее значимые для адаптации фракции гемоглобина и дана характеристика их некоторых свойств.

9. Впервые обнаружено, что при изменении соотношения между селезёночным и костномозговым эритропоэзом у кур с болезнью Марека меняется соотношение гемоглобиновых фракций эритроцитов.

Теоретическая значимость работы. Результаты исследования расширяют современные представления об участии эритрона в адаптации организма к действию различных экстремальных факторов. Полученные данные показывают, что, наряду с изменениями интенсивности эритропоэза, важную роль играет и соотношение между отдельными фракциями гемоглобина, отличающимися по своим физико-химическим свойствам. Их содержание в клетках определяется видом животного и особенностями строения эритроцита. По реакции на экстремальные воздействия среди этих фракций выделяются "реактивные" и "инертные" изоформы. Перестройка эритропоэза направлена на изменение числа клеток, в большем количестве содержащих адаптивно значимые фракции гемоглобина. Представления о качественных изменениях эритропоэза как механизме изменений гемоглобинового профиля в онтогенезе и при действии на организм экстремальных факторов позволяют с новых позиций взглянуть на процессы регенерации тканей и их становление в онтогенезе и филогенезе.

Практическая значимость работы. Полученные данные позволяют использовать гемоглобиновый профиль для оценки качественных изменений эритропоэза и адаптации организма при экстремальных состояниях, могут служить основой для разработки методов повышения резистентности организма к действию экстремальных факторов, новых подходов к диагностике и терапии гематологических заболеваний, а также для получения новых препаратов крови и кровезаменителей.

Положения, выносимые на защиту.

1. Изменения гемоглобинового профиля могут быть обнаружены на различных этапах онтогенеза животного. Их закономерности определяются морфофизиологическими особенностями индивидуального развития.

2. Отдельные фракции гемоглобина отличаются не только по физико-химическим свойствам, но и по своему участию в механизмах адашацип организма к действию экстремальных факторов.

3. В основе сдвигов в соотношении гемоглобиновых фракций в онтогенезе и при действии экстремальных факторов лежит перестройка эритропоэза. При этом выделяется два пути образования клеток красной крови. Основной путь, присущий зрелому организму в нормальных условиях, и "резервный" или "аварийный", имеющий место у молодых крыс, в старческом возрасте и при экстремальных состояниях. Он характеризуется продукцией крупных эритроцитов с повышенным содержанием 5 и 6 изоформ гемоглобина.

Апробация работы. Работа апробирована на заседании Уральского отделения физиологического общества им. И.П. Павлова (2000 г.), на заседаниях Учёного Совета Екатеринбургского филиала Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (2001,2002 г.г.), на Всероссийской научной конференции "Физиология организмов в нормальном и экстремальном состояниях" (г. Томск, 2001 г.), на 18 съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (г. Казань, 2001 г.). По материалам исследования опубликовано 12 научных работ.

Внедрение

Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре физиологии человека и животных Уральского государственного университета имени A.M. Горького, на кафедре физиологии и биохимии животных Уральской государственной сельскохозяйственной академии, на кафедре физиологии и безопасности жизнедеятельности Российского государственного профессионально-педагогического университета, а также в научных разработках отдела иммунологии Екатеринбургского филиала института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской Академии Наук.

выводы

1. Гетерогенность гемоглобина, являясь общебиологическим явлением, имеет свои особенности в зависимости от видовых свойств эритроцитов: в ядросодержащих клетках (лягушка, курица) превалируют высокоподвижные фракции, а в безъядерных (человек, крыса)- фракции с низкой электрофоретической подвижностью.

2. У животных, проходящих начальные этапы онтогенеза внутриутробно (млекопитающие), после рождения происходит перестройка гемоглобинового профиля. У крысы наблюдается снижение доли пятой и шестой изоформ в крови при увеличении- третьей. У животных на ранних этапах развития не связанных с организмом матери (птицы) такие изменения отсутствуют.

3. Соотношение между отдельными фракциями гемоглобина непостоянно на протяжении жизни животного. У молодых крыс (в первые месяцы жизни) в отличие от животных зрелого возраста, увеличено содержание пятой и шестой фракций гемоглобина и снижено содержание третьей фракции. Эю связано с постепенным сокращением образования крупных эритроцитов с высокой долей пятой и шестой фракций. У старых крыс наблюдайся возрастание содержания пятой и шестой фракций при сокращении содержания третьей фракции. Это обусловлено возобновлением продукции крупных эритроцитов с повышенным содержанием пятой и шесюй изоформ гемоглобина, что может быть расценено как фетализация эритропоэза.

4. При экстремальных воздействиях наблюдаются выраженные изменения гемоглобинового профиля. По характеру изменений все фракций гемоглобина крысы можно разделить на три группы. Первая группа -кислородзависимые - пятая-шестая и первая фракции. Уровень пятой и шестой фракций возрастает в гипоксических условиях, снижается - в гипероксических. Доля первой фракции при гипоксии практически не изменяется, падает при кровопотере, возрастает при длительной гипероксии. Ко второй группе относится вторая фракция: первоначально снижается независимо от вида воздействия, затем повышается, достигая исходной величины, либо превышая её. Третья группа - третья и четвёртая изоформы-резистентны к используемым воздействиям и изменяются лишь при гипоксической гипоксии.

5. В процессе адаптации к экстремальному воздействию в наибольшей степени меняется концентрация содержащихся в более крупных клетках кислородзависимых пятой и шестой фракций гемоглобина, характеризующихся высокой кислотоустойчивостью и большей, чем другие резистентностью к трипсину.

6. Изменения гемоглобинового профиля при действии экстремальных факторов обусловлены не внутриэритроцитарными процессами (потерей гемоглобина эритроцитами, его протеолитической деградацией, прямым влиянием экстремального фактора, действием биологически активных веществ плазмы), а изменениями эритропоэза. В условиях гипероксии сокращение продукции гемоглобинов 5,6 происходит на фоне уменьшения размеров образуемых эритроцитов. При анемии, либо гипоксической гипоксии, образуются эритроциты более крупных размеров при повышении уровня гемоглобинов 5 и 6.

7. В условиях стационарного эритропоэза гемоглобиновый спектр ретикулоцитов не отличается от такового для зрелых эритроцитов. При фенилгидразиновой анемии в циркуляцию поступают ретикулоциты с повышенным содержанием пятой и шестой фракций гемоглобина.

8. Изолированная лимфоидная инфильтрация селезёнки при сохранении интактности костного мозга у кур с болезнью Марека сопровождается изменением соотношения между гемоглобиновыми фракциями: увеличением доли гемоглобина Б при снижении доли гемоглобина А, а значит, в костном мозге и селезёнке образуются эритроциты с разным гемоглобиновым составом.

5.3. Заключение

На основании изучения возможных механизмов изменений соотношения между отдельными изоформами гемоглобина можно прийти к ряду выводов.

Изменения гемоглобинов при действии экстремальных факторов не связаны с внутриэритроцитарными перестройками изоформ. Такой вывод мы можем сделать на основании следующих фактов. Во-первых, имеет место отсутствие сходства изменений изоформ гемоглобина при протеолитической деградации со сдвигами при экстремальных состояниях, что позволяет отвергнуть ферментативный распад фракций в качестве причины изменения их соотношения. Во-вторых, отмечается отсутствие изменений гемоглобинового профиля при непосредственном действии гипоксии на эритроциты. В-третьих, имеет место отсутствие изменений изформ под действием плазмы кровопущенных животных. Вопрос о возможности протеолитической природы изменений гемоглобинового профиля при гипероксии может быть решён лишь при сопоставлении изменений гемоглобинов с состоянием эритона. Во всех прочих случаях протеолитический механизм изменений гемоглобинового профиля является маловероятным.

Изменения содержания отдельных изформ гемоглобина в первые часы после воздействия не могут быть связаны и с активацией их биосинтеза. В литературе присутствуют данные, показывающие, что для активации синтеза глобина и, тем более, появления вновь синтезированного гемоглобина в крови необходим значительно больший промежуток времени [134,269]. В частности, согласно исследованиям Barker J. [134] у овец при действии эритропоэтического стимула происходит активация синтеза гемоглобина С. Период между действием стимула и началом синтеза соответствующего iuna глобина составляет от 3 до 5 суток. Вероятно, пятая и шестая изоформы гемоглобина крысы, поступающие в кровоток в первые часы гипоксии и анемии, предобразованы в физиологических условиях, а не синтезируются при действии гипоксического фактора. Следовательно, в организме сущесгвуе! депо клеток с повышенным содержанием гемоглобинов 5 и 6. При экстремальных воздействиях эти клетки поступают в циркуляцию.

Поскольку внутриклеточные перестройки гемоглобинов не могут быть причиной изменений при гипоксии, мы можем сделать вывод о том, что сдвиг и обусловлены перераспределением клеток, отличающихся по содержанию отдельных изоформ. Наиболее вероятным механизмом этого явления служат качественные изменения эритропоэза, направленные на образование клеток, содержащих более кислотоустойчивые и более резистентные к действию протеолитических ферментов изоформы гемоглобина (пятая и шестая фракции). При этом складывается впечатление, что в экстремальных условиях включается «резервный» или «аварийный» эритропоэз.

В пользу этого положения свидетельствуют следующие факты:

1)Различия гемоглобинового профиля ретикулоцитов итакшых животных и животных с фенилгидразиновой анемией.

2)Несовпадение динамики содержания ретикулоцитов и клеток с кислотоустойчивыми фракциями гемоглобина при кровопотере.

3) Однонаправленность изменений содержания пятой и шестой фракций гемоглобина и количества крупных клеток в кровотоке при экстремальных состояниях и в онтогенезе.

4) Повышение уровня пятой и шестой фракции гемоглобина и увеличение среднего объёма эритроцита на фоне сокращения активности эритропоэза у старых животных.

5)Изменения гемоглобинового профиля эритроцитов кур с болезнью Марека в период преобладающего поражения у них селезёнки.

Предположение о двух типах эритропоэза подкрепляется дапнымп и других авторов. В частности, Weatherall D.J. с соавторами [271] высказывает точку зрения о существовании у человека двух различных популяций эритроидных предшественников, одна из которых продуцирует только гемоглобин А, а другая - гемоглобины А и F. Именно дифференциальной селекцией популяции F- клеток цитируемые авторы объясняют повышение уровня фетльного гемоглобина у взрослого человека.

Таким образом, наиболее вероятным механизмом изменений гемоглобинового профиля эритроцитов при действии на организм экстремальных факторов является качественная перестройка эритропоэза.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Реакции системы крови играют ведущую роль в комплексе механизмов адаптации к действию экстремальных факторов. Среди этих механизмов одними из важнейших являются механизмы изменения красной крови как системы, через которую реализуется газотранспортная функция. Реакциям системы эритрона в условиях экстремальных воздействий посвящено большое количество исследований. Однако подавляющее большинство работ в этой области характеризуются тем, что авторы, уделяя своё внимание количественным изменениям (количества ретикулоцитов, гемоглобина, гематокритного показателя, ретикулоцитов), практически не рассматривают качественные сдвиги в системе красной крови. Между тем, многие гематологические заболевания, характеризующиеся поражением красного ростка кроветворения, сопровождаются изменениями именно такого характера. К таким заболеваниям относятся ряд гемобластозов, эритремия, В¡2 дефицитная анемия, апластические анемии, (3-талассемия, серповидно-клеточная анемия.

Одним из важнейших качественных показателей красной крови является её гемоглобиновый профиль, то есть соотношение между отдельными изоформами гемоглобина. В результате многочисленных исследований было описано явление гетерогенности в эволюционном аспекте [94,57,133,137,253,41,132,51] в онтогенезе [55,92,116,31,57,148,195,214], при экстремальных состояниях организма [164,165,166,167,134,91,94,95,35,36,129], при гематологических заболеваниях [7,9,82,123,172,211,236]. Однако до настоящего времени полностью не расшифрована ни адаптивная значимость явления гетерогенности, ни механизмы изменений соотношения между отдельными изформами.

Гетерогенность гемоглобина является общебиологическим явлением, присущим большинству позвоночных животных. При этом количество изформ гемоглобина и соотношение между ними во многом определяется уровнем эволюционного развития животного, его видовой принадлежностью, а также используемым методом. Так, с помощью электрофореза в полиакриламидном геле у крысы можно выявить шесть фракций, у курицы, лягушки - по две. У человека с помощью данного метода можно выделить лишь две фракции. У одних видов животных (человек, крыса) преобладают быстро движущиеся фракции, у других (курица, лягушка) - медленно движущиеся. Очевидно, что у животных, имеющих ядросодержащие эритроциты, преобладают медленно движущиеся фракции, у животных, имеющих безъядерные красные клетки, -быстро движущиеся.

Гемоглобиновый профиль животных и человека претерпевает существенные изменения в течение онтогенеза. Так, общеизвестно, что у человека в онтогенезе происходит смена трёх гемоглобиновых систем. В эмбриональный период в крови персистируют примитивные гемоглобины, в плодный - доминирует гемоглобин Р, тогда как у взрослого человека преобладающей изоформой является гемоглобин А, но имеются также гемоглобины Р и Аг [116]. У крысы онтогенетические изменения гемоглобинов схожи с таковыми у человека. Согласно данным Стародуба Н.Ф.[94], до 14 суток внутриутробного развития в крови плода присутствуют эмбриональные гемоглобины Е1, Е2, ЕЗ, Е4. После 14 дня гемоглобиновый профиль сходен с таковым у взрослого животного, однако, содержание 4,5,6 фракций у плодов выше, а 3 - ниже, чем у взрослых крыс. Указанным автором были изучены фракции гемоглобина крысы до десятого дня жизни.

Нами были исследованы изменения гемоглобиновго профиля крысы на дальнейших этапах постнатального онтогенеза. Было установлено, что наибольшим изменениям в ходе онтогенеза подвергаются 3,5 и 6 изо формы гемоглобина. Так, у животных возрастом до 9-10 недель (масса до 100 г) доля гемоглобинов 5,6 выше, а 3 - ниже, чем у взрослых крыс (от 101 до 300 грамм-от 10 недель до года). У старых крыс наблюдается противоположная закономерность. У животных старше двух лет (массой более 400 г) содержание фракций 5,6 выше, а 3 - ниже, чем у крыс среднего возраста. Другими словами, в процессе старения гемоглобиновый профиль приобретает черты фетальности.

Изменения гемоглобинового профиля в онтогенезе крысы сопровождаются выраженными изменениями в системе эритропоэза. Молодые животные (моложе 9-10 недель, массой до 100 г) характеризуются более высокой интенсивностью эритропоэза, что проявляется в большей, чем у взрослых крыс клеточности костного мозга и большим содержанием эритроидных клеток в бедренной кости. При этом эритроциты молодых животных характеризуются большими размерами.

В процессе старения животного наблюдается сокращение эритропоэза, находящее отражение в уменьшении содержания эритроидных клеток в костном мозге, сопровождающемся увеличением среднего объёма эритроцита. Следовательно, изменения эритропоэза в процессе онтогенеза сопровождаются не только количественными, но и качественными изменениями. Эти изменения характерны для двух периодов индивидуального развития. Первый период соответствует раннему антенатальному онтогенезу, сопровождающемуся исчезновением из кровотока крупных эритроцитов, при одновременном уменьшении содержания пятой-шестой фракции гемоглобина и увеличении -третьей. Второй период - старческий, когда изменения эритропоэза имеют противоположную направленность: в кровотоке снова появляются крупные эритроциты при увеличении содержания 5 и 6 фракций гемоглобина и сокращении - третьей.

У птиц (куры), как и у крыс, на ранних этапах онтогенеза отмечается возрастание содержания обеих изоформ гемоглобина. В последующем изменения со стороны гемоглобина А отсутствуют, в то время, как содержание гемоглобина В сокращается, начиная с 200 дней. Сравнение онтогенетических изменений гемоглобинов крысы и курицы показывает, что в эмбриональном периоде развития птиц, как и у млекопитающих, происходят существенные качественные перестройки гемоглобинового профиля [53,94]. Первые месяцы жизни крысы характеризуются закономерными изменениями соотношения между изоформами гемоглобина, отражающими качественную перестройку эритропоэза. В тоже время у курицы аналогичные изменения отсутствуют.

Сдвиги соотношения между НЬА и НЬЭ отмечаются только на седьмые сутки жизни. В дальнейшем же, вполть до 200 дня жизни показатели не отличаюстя от таковых у суточных цыплят. Вероятно, описанное явление отражает морфофуькциональные различия, характеризующие онтогенез крысы и курицы.

Рождение характеризуется драматическими изменениями в оксигенации и выраженными изменениями эритропоэза, что приводит к десятикратному снижению продукции эритроцитов и преходящей физиологической анемии [230]. Это сопровождается и качественными сдвигами в соотношении фракций гемоглобина.

Известно, гемоглобин Б человека характеризуется более высоким сродством к кислороду, более выраженным эффектом Бора и является кислото- и щёлочеустойчивым [12]. Эти свойства определяют большую адекватность данного типа белка в условиях плацентарного кровообращения. При переходе к внеутробному существованию в связи с изменением требований, предъявляемых к газотранспортной функции, исчезает необходимость в переносчике такого рода. Более того, физиологические свойства гемоглобина Р в условиях лёгочного дыхания атмосферным воздухом оказываются инадаптивными. В связи с этим после рождения происходит замена НЬР на гемоглобин А, который в данном случае является функционально более выгодным белком.

Аналогичные изменения отмечаются и у крыс. Как было отмечено выше, у молодых животных, имеет место высокое содержание шестой фракции при сниженном уровне фракции 3, а у старых животных имеет место противоположная направленность изменений в соотношении изоформ: снижение уровня фракции 3 при повышении уровня фракций 5,6. Согласно исследованиям Стародуба Н.Ф., пятая и шестая фракции гемоглобина по ряду характеристик (устойчивость к кислоте и щёлочи) близки к фетальному гемоглобину человека. Это сходство подкрепляется и тем, что и сам фетальный гемоглобин гетерогенен по своему составу [119,273].

Общепризнанно, что изменения гемоглобинового профиля в процессе онтогенеза отражают адаптацию организма к условиям развития.

Вместе с тем, этот факт ставит вопрос о роли соотношения между отдельными изоформами в процессе адаптации к ограниченному по времени действию экстремальных факторов. На такую возможность указывает возрастание концентрации гемоглобина Б при высокогорной гипоксии [62,108], дыхательной недостаточности [6,22], сердечной недостаточности [129], кровопотере, отравлении фенилгидразином [166,167] в условиях Крайнего Севера [3].

Для изучения этой проблемы нами было проведено исследование гемоглобинового профиля в условиях экстремальных состояний.

В качестве экстремальных воздействий нами были выбраны кровопотеря как воздействие, приводящее к уменьшению в организме концентрации переносчика кислорода, и состояния, характеризующиеся изменениями газотранспортной функции - гипоксическую гипоксию и нормобарическую гипероксию.

Установлено, что в условиях стимуляции эритропоэза при кровопотере и гипоксии изменения гемоглобинового профиля наблюдались уже в первые шесть часов, в то время, как при гипероксии - только после седьмого сеанса. 11а основании направленности изменений гемоглобинового профиля были выявлены кислородозависимые фракции: в большей степени - пятая и шее кик в меньшей - первая. Доля пятой и шестой фракций гемоглобина в циркулирующей крови возрастает при гипоксии различного генеза и снижает ся при гипероксии. Первая фракция в гипоксических условиях практически не изменяется, уменьшается при кровопотере, возрастает при длшельной гипероксии. Причём, в последнем случае имеет место и абсолютное увеличение содержания этой фракции.

Изменения процентного содержания второй фракции гемоглобина имеют следующие особенности: первоначально показатель снижается независимо от вида воздействия, а затем повышается, достигая исходной величины, либо превышая её.

Третья и четвёртая изоформы достаточно резистентны к используемым экстремальным факторам. Их изменения наблюдаются только при гипоксической гипоксии. Доля четвёртой фракции снижается лишь после седьмого сеанса, а третьей - уже после первого.

Описанные изменения гемоглобинового профиля при экстремальных воздействиях позволяют поставить вопрос о физиологическом смысле наблюдаемых явлений. Для гемоглобинов крыс Стародубом Н.Ф. [94] отмечены различия отдельных изоформ по сродству к кислороду, устойчивости к действию кислоты и щёлочи. Согласно его данным очищенные препараты гемоглобина крысы обладает существенно более высоким сродством к кислороду, чем гемоглобин человека: р50 для гемоглобина крысы составляет 1,57 гПа [94]. Фракция 3 обладает существенно более высоким сродством к кислороду. АТФ в большей степени снижает сродство гемоглобина к кислороду для фракций 4,5 и 6. [94]. Кроме того, гемоглобины пятой и шестой фракций обладают максимально кислото- и щёлочеустойчивостью.

Наши данные показали совпадение динамики содержания 5,6 фракции гемоглобина в крови с клетками, содержащими кислотоустойчивый гемоглобин, что подтверждает факт большей кислотоутойчивости гемоглобинов 5 и 6.

Однако их значение для адаптивных реакций не ограничивается различиями в кислородосвязывающих свойствах и устойчивостью к действию кислоты или щёлочи. Оказалось, что пятая и шестая фракции гемоглобина в меньшей мере подвержены протеолитической деградации.

Физиологическая значимость этих фракций ещё более ярко проявляется в условиях патологии, связанной с качественными нарушениями эритропоза. Так, при серповидно-клеточной анемии субпопуляция ретикулоцитов, содержащих малое количество фетального гемоглобина, удаляется из циркуляции вследствие гемолиза, не дозревая до зрелой клетки, в то время, как ретикулоциты, содержащие большее количетво гемоглобина F, более резистентны к разрушению и достигают стадии зрелого эритроцита [191].

Описанные изменения гемоглобинового профиля при экстремальных воздействиях позволяет оставить вопрос об их механизмах. В качестве возможных механизмов рассматриваемых явлений нами были изучены следующие:

1) различная степень потери изоформ гемоглобина, 2) различная степень протеолитической деградации отдельных фракций, 3) изменение физико-химических свойств изоформ гемоглобина под влиянием экстремального фактора, 4) клеточные реакции в системе эритрона.

Возможность потери эритроцитами гемоглобина была описана в paöoiax Willekens F.L. [275] и Карелина A.A. [44]. Однако потеря отдельных фракций гемоглобина клеткой должна приводить к сокращению среднего содержания гемоглобина в эритроците, чего не наблюдалось в условиях используемых экстремальных воздействий. Следовательно, потерю гемоглобина эритроцитом как ведущий механизм изменений гемоглобинового профиля можно счтагь мало вероятной.

Исследование протеолитической деградации гемоглобина в модельных опытах с трипсином показали, что обработка гемоглобина in vitro в концентрациях фермента 1/50 приводит к повышению электрофоретической подвижности (ЭФП) всех изоформ гемоглобина, чего не наблюдалось при используемых экстремальных состояниях. Отсутствие изменений ЭФП при экстремальных воздействиях подтверждается и другими авторами [33]. Однако при низких концентрациях фермента при отсутствии изменений ЭФП наблюдается снижение содержания всех фракций гемоглобина при возрастании гемоглобина первой фракции. Поскольку подобных изменений при экстремальных состояниях не происходит, указанный механизм нельзя рассматривать как ведущий.

Единственное состояние, при котором наблюдается возрастание первой фракции при сокращении прочих - это гипероксия. Однако при данном воздействии имеет место снижение уровня лишь пятой и шестой фракций, тогда как при протеолитическом воздействии снижается уровень фракций 3-6.

Исследование влияния гипоксии на эритроциты in vitro, а также действия на эритроциты биологически активных факторов плазмы постгеморрагических крыс позволили исключить эти факторы из числа возможных механизмов изменений гемоглобинового профиля.

Все приведённые сведения позволяют отвергнуть внутриэритроцитарные изменения гемоглобина как возможный механизм изменений гемоглобинового профиля. Следовательно, внутриклеточные механизмы изменений гемоглобинового профиля являются маловероятными и, скорее всего, сдвиги в соотношении отдельных фракций гемоглобина обусловлены особенностями кроветворения в экстремальных условиях. Это подтверждается данными сопоставления изменений гемоглобинового спектра с активностью эритропоэза при экстремальных воздействиях.

Проведённые исследования показали, что в первые часы гипоксии и кровопотери со стороны миелограммы отмечаются изменения, заключающиеся в сокращении количества эритроидных предшественников в костном мозге, что может быть расценено как ускоренное созревание клеток, приводящее к выходу в кровоток ретикулоцитов.

Нами было показано, что изменения гемоглобинового профиля при кровопотере и гипоксии происходят уже в течение шести часов экстремального состояния. При гипоксии они заключаются в повышении уровня пятой и шестой фракций при снижении - второй и третьей. При кровопотере в снижении концентрации изоформ гемоглобина с первой по третью при отсутствии динамики шестой и минимальных изменениях пятой, что, по-видимому, отражает поступление этих фракций в кровоток. Однако, согласно литературным данным, 6 часов недостаточно для активации биосинтеза глобина [133,134], а, следовательно, пополнение циркулирующего пула фракций происходит за счёт предобразованных в физиологических условиях белков.

Важным проявлением, сопровождавшим первые часы развития кровопотери и гипоксии, являются перераспределительные реакции в системе красной крови. Они заключаются в поступлении в кровоток крупных клеток при удалении мелких, что приводит к возрастанию среднего объёма эритроцита. Удаление из кровотока мелких эритроцитов совпадает с мнением Ужанского Я.Г. [101,102,103,104] о том, что в первые часы экстремального состояния происходит интенсивный гемолиз эритроцитов. Реакция удаления эритроцитов из кровотока коррелирует с характеристическими изменениями селезёнки, где отмечается возрастание плотности эритроцитов в красной пульпе.

Одновременно с описанными изменениями происходят реакции системы гемоглобина. Уже в эти сроки наблюдается возрастание уровня пятой и шестой фракции и сокращение содержания второй и третьей при гипоксии и отсутствие изменений содержания шестой при незначительных изменениях пятой на фоне достоверного сокращения остальных фракций гемоглобина при кровопотере. Эти изменения согласуются с описанными перераспределительными реакциями. По-видимому, выходящие в кровоток крупные эритроциты характеризуются более высоким содержанием пятой и шестой изоформ, в то время как удаляемые мелкие характеризуются более высоким содержанием второй и третьей изоформ.

Первые часы гипоксического состояния не сопровождаются выраженными реакциями ни системы эритрона в целом, ни гемоглобнового профиля в частности.

Поздние сроки адаптации к кровопотере и гипоксии характеризуются максимальной активацией эриропоэза. Она проявляется в выраженном возрастании содержания эритроидных клеток в костном мозге и ретикулоцитозе. Со стороны эритроцитов периферической крови отмечается ещё большее содержание крупных эритроцитов, приводящее к значительному возрастанию среднего объёма эритроцита. Гемоглобиновый профиль при этом характеризуется как в том, так и в другом случае, значительным повышением количества гемоглобинов пятой и шестой фракций.

После семи сеансов гипероксии отмечается угнетение костномозгового эритропоэза, характеризующееся снижением в костном мозгу содержания эритроидных предшественников и ретикулоцитозом. В периферической крови отмечается некоторое сокращение содержания крупных эритроцитов при увеличении - мелких. Изменения гемоглобинового профиля характеризуются снижением уровня пятой и шестой фракций при возрастании- первой.

Таким образом, при используемых экстремальных воздействиях прослеживается взаимосвязь поступления в кровоток крупных эритроцитов с изменениями гемоглобинового профиля в сторону возрастания содержания пятой и шестой фракций и, наоборот, удаление крупных - со снижением содержания этих гемоглобинов.

Как показано выше, изменения гемоглобинового профиля происходят на фоне изменений эритропоэза. Поскольку активация и угнетение эритропоэза сопровождается изменением концентрации ретикулоцитов в крови, нами было предпринято исследование взаимосвязи гемоглобинового профиля с концентрацией ретикулоцитов.

Разделение эритроцитов периферической крови по плавучей плотности методом МигрИу [16,222] позволило выделить крайнюю верхнюю фракцию клеток, обогащённую ретикулоцитами (до 33,84±1,51%), и крайнюю нижнюю (с концентрацией ретикулоцитов 1,29±0,24%). Было обнаружено, что клетки обеих фракций не отличаются друг от друга по гемоглобиновому профилю. Это означает, что изменения в крови концентрации ретикулоцитов, образующихся в условиях стационарного эритропоэза, не могут изменить соотношение между изоформами гемоглобина. Однако в условиях гемолитической фенилгидразиновой анемии, в условиях ретикулоцитоза 31,24+1,55% соотношение между изоформами гемоглобина в периферической крови резко изменяется, а ретикулоциты фенилгидразиновых крыс в отличие от интактных жифотных содержат большее количество фракций 5 и 6 и меньшее -2 и 3. Таким образом, в системе эритрона могут образовываться, по меньшей мере, два вида ретикулоцитов, различающихся по гемоглобиновому профилю.

Кроме того, эти клетки могут также отличатсья по размерам и плотности, о чём свидетельствует обнаружение их во всех фракциях сепарации. Это подтверждается также данными других авторов [267,268].

Сопоставление динамики клеток, обладающих кислотоустойчивыми изоформами гемоглобина (пятая и шестая), с динамикой ретикулоцитов при кровопотере показывает, что характер изменений этих двух параметров отличается (рисунок 20). При этом на некоторые сроки развития экстремального состояния содержание клеток с кислотоустойчивыми гемоглобинами превышает уровень ретикулоцитоза. Все это позволяет сделать вывод о том, что разновозрастные популяции эритроцитов крысы не отличаются по гемоглобиновому профилю.

Поскольку нами было зафиксировано сочетание изменений гемоглобинового профиля, направленных на возрастание уровня пятой и шестой изоформ гемоглобина в крови с увеличением размеров эритроцитов, мы произвели измерение диаметра указанных клеток у интактных животных. Было обнаружено, что средний диаметр таких эритроцитов составляет 6,51±0,08 мкм при 5,8±0,1 мкм для прочих эритроцитов (р<0,001).

Таким образом, при действии экстремальных факторов и в онтогенезе наблюдаются качественные изменения эритропоэза. При этом выделяется два пути образования клеток красной крови. Основной путь, присущий зрелому организму в нормальных условиях, и «резервный» или «аварийный», имеющий место у молодых крыс, в старческом возрасте, при гипоксических условиях и при гематологических заболеваниях. Этот путь характеризуется продукцией крупных эритроцитов с повышенным содержанием 5 и 6 изоформ гемоглобина. При этом на себя обращает внимание тот факт, что, если при гипоксии и кровопотере «резервный» эритропоэз реализуется в условиях активированного кроветворения, то в старческом возрасте продукция макроцитов с высоким содержанием фракций 5,6 происходит в условиях угнетённого эритропоэза.

Данные литературы о стимулировании образования фетального гемоглобина человека при введении цитостатиков

244,236,235,265,205,209,199,190], сочетающемся с макроцитозом [93,283,209,284,285,286], подтверждают этот факт.

Анализ литературных данных указывает также на качественные изменения эритроцитов, сопровождающие сдвиги гемоглобинового профиля. Так, у человека повышение уровня гемоглобина Б, как правило, сопровождаются экспрессией, проявлением других признаков, таких как большая устойчивость к иммунному гемолизу, ьантиген на мембране [160,186,242,231], изменённое соотношение между В и С изоферментами карбоангидразы [238], особенности изоэнзимного спектра гексокиназы [189,210]. Кроме того, некоторые исследователи обращают внимание на меньшую продолжительность жизни эритроцитов фетального типа [123,55].

Указанные признаки в той или иной мере проявляются как на ранних этапах онтогенеза, так и при гипоксии взрослого организма. Помимо перечисленных особенностей персистенция фетального гемоглобина, как правило, сопровождается макроцитозом.

Макроцитоз при гипоксических состояниях описан многими авторами [224,260,279,55,5,39,45,49,52,80,138,142]. Кроме того, нами описано возрастание 5 и 6 изоформ гемоглобина у старых крыс. В то же время у человека в пожилом и старческом возрасте так же отмечается возрастание среднего диаметра эритроцита при угнетении эритроидного рос1ка кроветворения [70].

Отталкиваясь от литературных данных по изучению формирования гемоглобина Б в процессе эритропоэза, сформулированы три гипотезы, способные объяснить становление гемоглобинового профиля в процессе образования красных клеток:

1). Гипотеза отдельных клеток-предшественников для эритроидных клеток с различным содержанием изоформ гемоглобина. [123,271] Повышение образования отдельных изоформ связано со стимуляцией соответствующих клонов.

2). Гипотеза укорочения клеточного цикла. Основывается на представлении о единой родоначальной клетке для всех эритроцитов. В условиях изменённого эритропоэза (анемия, гиперплазия костного мозга, лечение цитостатиками) происходит укорочение длительности клеточного цикла и сокращение времени дифференцировки клеток. При условии возрастания скорости эритроидной дифференцировки образование ¥- клеток является атрибутом «предзрелой» коммитации клеток-предшественников, при этом экспрессия гена гамма-цепей обеспечивается либо благодаря тому, что изменения хроматина, в норме приводящие к его инактивации, осуществляются не полностью, либо, благодаря тому, что пропускается критическое деление, в ходе которого ген гамма-цепей инактивируется. Модель более короткого клеточного цикла объясняет образование Б-клеток тем, что активация транскрипции гена гамма-цепи происходит на фоне сокращения клеточного цикла клеток-предшественников или эритробластов меньше критической величины [257,277].

3) Гипотеза контакта с эритробластическим островком. Как известно, эритробластический островок является морфофункциональной единицей эритропоэза и состоит из центрального макрофага (ретикулярная клетка), окружённого развивающимися эритроидными элементами [139,140,85]. Согласно настоящей гипотезе, если на протяжение всех этапов своего развития эритроидная клетка находится в непосредственном контакте с ретикулярной клеткой (центральный макрофаг) эритробластического островка, в ней осуществляется продукция только альфа- и бета- цепей, а продукция I амма-цепей ингибирована. При эритропоэтическом стрессе происходит ускорение высвобождения клеток из островка. Эритроидная клетка, потерявшая контакт с ретикулярной, переключается с синтеза бета-цепей на образование гамма-цепей [145].

Однако ряд фактов ставят последние два взгляда под сомнение. Во-первых, это стимуляция образования фетального гемоглобина при терапии цитостатическими препаратами (гидроксимочевина, изобутирамид, бутират, дидокс), приводящей к угнетению нормального кроветворения

244,236,235,265,205,209,199,190]. Во-вторых, наши данные по исследованию гемопоэза у старых животных, свидетельствующие, что в условиях сокращения количества костномозговых эритроидных клеток имеет место повышение уровня «фетальных» (пятой и шестой) фракций гемоглобина в крови. Xoia в последних двух случаях нельзя полностью исключить интенсификацию дифференцировки и созревания отдельных сохраняющихся клеток.

Несмотря на кажущиеся различия, все три гипотезы имеют общую черту: образование нормальных эритроцитов и эритроцитов, содержащих фетальные формы гемоглобина, идут двумя различными путями. При этом процессы формирования клеток с фетальным гемоглобином также как и эритроцитов, не содержащих его, регулируются целым рядом специфических механизмов. Среди регуляторов образования F- клеток выделяют интерлейкип-3 [176], гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор [175], эритропоэтин [183], трансформирующий фактор роста - бета, Steel фактор [219,146], гамма-интерферон [217,218].

Предположение подтверждается также тем, что при экстрамедуллярном кроветворении образование гемоглобина F не ограничивается только фетальными эритропоэтическими органами экстрамедуллярного эритропоэза, а сдвиг эритропоэза в фетальные гемопоэтические органы не обязателен для индукции синтеза HbF у взрослого человека [157].

Кроме того, в пользу существования двух типов эритропоэза свидетельствуют изложенные в литературе результаты трансплантации клеток костного мозга взрослого человека, либо подростка. В этом случае пересаженные клетки синтезируют также и фетальный гемоглобин [215,123].

Гипотеза о существовании двух видов эритропоэза находит подтверждение в исследовании изменений гемоглобинового профиля при болезни Марека кур. Известно, что у взрослых кур эритропоэз протекает в двух органах: костном мозге и селезёнке. Установлено, что в условиях поражения селезёнки у кур с болезнью Марека при относительном инактном костном мозге наблюдается изменение гемоглобинвого профиля. Это свидетельствует в пользу того, что эритроциты, происходящие из этих органов, отличаются по содержанию отдельных изоформ. В пользу данной возможности свидетельствует сопоставление гемоглобинового профиля с периодами кроветворения в онтогенезе человека. Действительно, обнаруживается соответствие: период персистенции эмбриональных гемоглобинов примерно соответствует кроветворению в желточном мешке. Доминирование гемоглобина Б характерно для печёночного этапа кроветворения, а переход к преобладанию гемоглобина А сопровождает переход к костномозговому кроветворению [116,64]. Аналогичные ассоциации прослеживаются и для других видов животных. Данные литературы свидетельствуют о том, что у лягушки онтогенетическое формирование гемоглобинового профиля определяется диффернцировкой различных клеточных линий, коммиттированных к экспресии определённых гемоглобиновых фенотипов [282]. Другие авторы отмечают, что онтогенез лягушки сочетается с последовательной пролиферацией трёх различных клеточных популяций [149,226,270], происходящих: первая -из почек, вторая -из печени, третья - из костного мозга [270].

Таким образом, можно говорить о возможности существования двух качественно различных вариантов эритропоэза: стационарном, который имеет место в нормальных условиях существования и "аварийном" или "резервном", который включается в условиях адаптации и несёт черты, сходные с чертами эритропоэза на начальных этапах индивидуального развития.

На основании проведённых исследований можно прийти к заключению, что гетерогенность гемоглобина является общебиологической закономерностью и представляет собой важный элемент механизма адаптации организма к действию экстремальных факторов. Роль отдельных изоформ гемоглобина в адаптивных реакциях определяется их физико-химическими свойствами, газотранспортной способностью и, что особенно важно, резистентностью к повреждению. В основе сдвига соотношения между отдельными фракциями лежат не только изменения интенсивности эритропоэза, но и качественная его перестройка, направленная на образование клеток с различным содержанием отдельных изоформ.