Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Фармакологическая активность и фармакотрапевтическая эффективность гепатопротекторного растительного средства при остром токсическом гепатите

На правах рукописи

ДЫНЖИНОВА ЕЛЕНА АНАТОЛЬЕВНА

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ И ФАРМАКОТРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА ПРИ ОСТРОМ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ООЗ 159568

Улан-Удэ-2007

003159568

Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения Российской Академии наук

Научный руководитель

доктор биологических наук Ажунова Татьяна Александровна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Цыренжапока Да Ш и-До н доб о в н а

кандидат медицинских наук Елаева Эржена Борисовна

Ведущая организация ГОУ ДПО Иркутский государственный институт усовершенствования врачей Росздрава

Защита состоится «25» октября 2007 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К 003.028.01 при Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу: 670047, Г. Улан - Удэ, ул. СахьяновойД

С диссертацией можно ознакомиться е Центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН

Автореферат разослан «25» сентября 2007 г.

Ученый секретарь диссерташюнного совета кандидат биологических наук

В.Б.Хобракова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Значимость изучения проблемы заболеваний печени инфекционной и неинфекционной природы обусловлена их широкой распространенностью, ростом инфицирования лиц молодого возраста (Чередниченко и соавт, 2007), хронизацией, прогрессирующим течением, тяжелыми осложнениями, инвалидизацией (Лопаткина, 2007, Ма-евская, 2006, Михайлов, 2007,Подымова, 2005, Bjornsson, OIsson, 2005) Распространение вирусных гепатитов в мире приобрело угрожающие масштабы По данным ВОЗ отмечается ежегодный рост заболеваемости населения вирусными гепатитами, охватывающей более миллиарда человек, причем, только носителей антигена вирусного гепатита В насчитывается около 350 миллионов (Ганина и соавт, 2007;3айцев, 2006, Учайкин и соавт, 2007), а вирусным гепатитом С в настоящее время поражено не менее 180 млн населения (Ушкалова, 2003; Keefe, 2007; Zignego et al, 2007) По прогнозам ВОЗ в ближайшие 10-20 лет вполне ощутимыми станут последствия хронического гепатита С на 60% увеличится количество больных циррозом печени, на 68% - гепатокарциномой (Ершова и соавт, 2007; Ильченко, 2007, Малиновская и соавт, 2007, Сологуб и соавт, 2006, Ghany, Liang, 2007, Lawson et al, 2007)

В настоящее время лечение больных с острыми и хроническими заболеваниями печени, несмотря на прогресс современной гепатологии, связанный с внедрением новых методов лабораторной и инструментальной диагностики, изучением этиологии и патогенеза заболеваний печени на клеточном и молекулярном уровне, все еще остается крййне сложным и, в ряде случаев, далеким от удовлетворительного решения проблемы (Корсун, 2006, Нагоев, 2006, Широкова и соавт, 2007, Bartholomeusz, Lo-carnmi, 2006, Ghany, Liang, 2007, Rapti et al, 2007, Tillmann, 2007)

В связи с этим актуальным является поиск средств, способных повышать резистентность печени к повреждающему действию токсинов и активизировать процессы дезинтоксикации в организме (Оковитый, 2006. Родионова, 2007) Перспективными для разработки методов фармакологической коррекции заболеваний печени являются препараты природного происхождения, отличающиеся, как правило, широтой терапевтического действия, малой токсичностью и связанной с этим возможностью длительного применения без риска возникновения токсических реакций (Карлович, Ильченко, 2007, Осипова, 2005, Соколов, 2006, Шульпекова, 2006, Pradhan, Girish 2006,)

В Отделе биологически активных веществ разработано гепато-протекторное средство, (условно «гепатон»), состоящее из цветков ромашки аптечной (Matricaria recutita L), листьев мяты перечной (Mentha piperita L ), плодов шиповника (Rosa sp), плодов боярышника (Crataegus

sp ), травы зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L), корней солодки уральской (Glycyrrhiza uralensis Fisch), корневищ и корней девясила высокого (Inula helenium L )

Целью настоящего исследования явилось определение фармакологической активности и фармакотерапевтической эффективности комплексного гепатопротекторного растительного средства при остром тетра-хлорметановом токсическом гепатите.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

- определить основные фармакологические свойства гепатопротекторного растительного средства,

- оценить фармакотерапевтическую эффективность «гепатона» при повреждении печени четыреххлористым углеродом,

- выявить основные механизмы гепатопротекторного действия указанного растительного средства

Научная новизна. Работа представляет собой фармакологическое исследование нового многокомпонентного растительного средства «гепа-тон», предназначенного для лечения и профилактики заболеваний печени Определены основные фармакологические свойства «гепатона» Установлено его мембраностабилизирующее, антиоксидантное, желчегонное, антитоксическое, противовоспалительное, антибактериальное действие Дана комплексная оценка гепатопротекторного действия «гепатона» при повреждении печени четыреххлористым углеродом Установлено, что курсовое назначение данного растительного средства сопровождается инги-бированием перекисного окисления липидов, благодаря чему предотвращаются проявления синдрома цитолиза и холестаза Наряду с этим, испытуемое средство стимулирует детоксицирующую функцию печени, а также способствует ускорению процессов регенерации

Практическое значение работы. Материалы по проведенным экспериментальным исследованиям фармакологической активности и фармакотерапевтической эффективности «гепатона» включены в заключительный отчет Отдела биологически активных веществ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН по проекту № 21 1 3 «Регуляция свободнорадикальных процессов при повреждениях органов пищеварения с использованием биологически активных веществ из арсенала традиционной медицины» Результаты исследований используются в учебном процессе на профильных кафедрах медицинского факультета Бурятского государственного университета Поданы заявки на предполагаемое изобретение «Гепатопротекторное средство растительного происхождения» (№ 2006124093/15 (053802)) и на «Способ получения средства, обладающего гепатопротекторной активностью» (№ 2007153671/15(018793))

Положения, выносимые на защиту

1. Новое комплексное гепатопротекторное растительное средство обладает желчегонной, противовоспалительной, антибактериальной, антистрессорной активностью и стймулирует процессы регенерации

2 «Гепатон» обладает выраженной фармакотерапевтической эффективностью при токсическом повреждении печени четыреххлористым углеродом

3 Фармакотерапевтическа 1 эффективность «гепатона» при повреждении печени тетрахлорметаном обусловлена выраженной мембраностаёи-лизирующей, антиоксидантной, желчегонной активностью, а также способностью «гепатона» стимулировать дезинтоксикационную функцию печени.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на

- IV региональной межвузовской конференции «Медицина завтрашнего дня» (Чйта, 2005);

- научно- практической конференции «Актуальные вопросы восстановительной'медицины, курортологии и физиотерапии», посвященной 85-летию курорта «Аршан» (Иркутск, 2005),

- Всероссийской конференции с международным участием «Биоразнообразие экосистем внутренней Азии» (Улан - Удэ, 2006);

- научно- практической конференции, посвященной 75-летию со дня рождения д.м н Базарона Э.Г (Улан - Удэ, 2006),

- «The Second International Symposium on' Chemistry of Herbal Medicine and Mongolian Drag» (Ulaanbaatar, 2006)

Публикации. По теме диссертации опубликовано i 1 научных работ, в том числе 2 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК МО и науки РФ

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 2 глав собственных исследований, обсуждения результатов, списка использованной литературы, включающего 235 источников, из них - 84 зарубежных авторов

Диссертация изложена йа 137 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 31 таблицей и 7 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальная работа выполнена на 600 белых крысах линии Wistar обоего пола с исходной массой 190 - 230 г, 120 мышах линии СВА и F1 (СВА х С57 В 1/6) с исходной массой 18 - 20 г Животные содержались в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по

защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей Животным опытной группы внутрижелудочно вводили водный раствор «гепатона» (1 мл /100 г) в дозе 50 мг/кг, 1 раз в сутки Животные контрольной группы получали дистиллированную воду в соответствующем объеме по аналогичной схеме Оценку мембраностаби-лизирующего действия «гепатона» осуществляли по степени гемолиза эритроцитов, который вызывали реактивом Фентона (перекисный гемолиз) и дистиллированной водой (осмотичесм.й гемолиз) (Ковалев и соавт., 1986) «Гепатон» в инкубационной среде исследовали в концентрациях, соответствующих 25, 50 и 100 мг/мл. Исследование влияния «гепатона» на кинетику индуцированной хемилюминесценции (ХЛ) проведено с использованием 1 % суспензии липосом яичного желтка (Владимиров и соавт., 1991) по общепринятому методу (Клебанов и соавт, 1988). Для оценки противовоспалительной активности «гепатона» определяли его влияние на экссудацию при остром асептическом воспалении, которое вызывали путем субплантарного введения формалина (Стрельников, 1960), декстрана (Лещинский, 1972), гистамина гидрохлорида (Александров, 1986) Влияние на альтерацию тканей определяли на фоне острого воспаления, индуцированного введением уксусной кислоты (Ойвин, Шетель, 1961) Оценку влияния фитоэкстракта на образование фиброзно-грануляционной ткани осуществляли по методу ФП Тринус и соавт. (1975) Острый перитонит воспроизводили по методу А А Александрова (1986) Оценку влияния «гепатона» на сосудистую проницаемость проводили на модели 24-х часового иммобилизационного стресса с использованием метода «меченых» сосудов (Горизонтова и соавт, 1975). Оценивали влияние «гепатона» на процессы желчеобразования и желчеотделения, определяли скорость секреции желчи и общее количество выделенной желчи (Скакун, Олейник 1967), количество выделенных с желчью билирубина (Скакун, 1967), холестерина (Дроговоз, 1971) и желчных кислот (Карбач, 1961) Антибактериальную активность «гепатона» изучали методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде (Першин, 1971) Иммуномодули-рующее действие «гепатона» оценивали по его влиянию на состояние клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунитета (Петров и соавт, 1987, Методические , 1992) Изучение показателей периферической крови и системы гемостаза осуществляли стандартными гематологическими методами (Меньшиков, 1987, Методы исследования гемостаза, 1995) Диуретическую активность испытуемого фитоэкстракта оценивали по количеству выделенной мочи за 4 часа без нагрузки и с 2,5 % водной нагрузкой (Берхин, Иванов, 1972, Васильев, Ветюков, 1961) При изучении влияния «гепатона» на функциональное состояние центральной нервной системы определяли поведенческие показатели в тесте «открытое поле» у интакт-

ных крыс, выработку условной реакции пассивного избегания (УРПИ) у ин-тактных крыс и противосудорожное действие при камфорных и стрихниновых судорогах

Острый токсический гепатит воспроизводили введением 50 % масляного раствора четыреххлористого углерода (ССЬ4) в объеме 0,4 мл на 100 г массы 1 раз в сутки в течение 3 дней Исследуемое средство вводили со 2-го"дня эксперимента 1 раз в сутки в течение 14 дней в дозе 50 мг/кг. В качестве препарата, сравнения использовали Liv-52 в дозе 100 мг/кг. Животные контрольной группы получали дистиллированную воду в соответствующем объеме по аналогичной схеме. Исследования проводили через 7-, 14- и 21-е сутки от начала эксперимента

Для оценки функционального состояния печени при экспериментальном гепатите в сыворотке крови определяли активность аланинами-нотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), альдолазы, ще-лрчной фосфатазы (ЩФ); концентрацию ¡холестерина, ß-липопротеидов, общего билирубина, белка (Меньшиков и соавт, 1987) Детоксицирую-щую функцию печени оценивали по продолжительности гексеналового сна (Гацура, 1974), экскреторно-поглотительную функцию - по скорости выведения бромсульфалеина с желчью (Соловьев и соавт, 1976) и антипирина с кровью (Аширметов, Краковский, 1990) Для определения активности процессов репаративной регенерации в печени крыс определяли содержание дезоксирибонуклеиновой кислоты. (ДНК) (Трудолюбо-ва,1977) Оценивали активность каспазы-3 при токсическом гепатите (однократное введение 50 % масляного раствора четыреххлористого углерода в объеме 1,25 мл/кг) с использованием набора реактивов «Caspase 3 Assay Kit» (Sigma) Иммобилизационный стресс вызывали путем 6-часовой иммобилизации животных на спине Печень исследовали у животных через 39 часов и через 4 суток. Антиоксидантные свойства растительного средства «гепатон» оценивали по степени ингибирования образования продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) диеновых конъюгатов (ДК) (Гаврилов, Мишкорудная, 1983) и малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови (Темирбулатов, Селезнев, 1981), в гомогенате печени (Стальная, Гаришвили 1977), активности каталазы (КАТ) (Королюк и соавт, 1988) и супероксиддисмутазы (СОД) в ¡крови (Чевари и соавт, 1985), содержанию восстановленного глутатиона (Глу) в сыворотке крови (Anderson, 1989) Для патоморфологических исследований печень животных фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина и фиксаторе Буэна (Микроскопическая техника. , 1996) Депарафинированные гистологические срезы окрашивали гематоксилин-эозином (Киселева и соавт., 1983) Гистологические препараты оценивали на микроскопе «Motic Images-2000»(Германия)

Полученные данные статистически обработаны общепринятыми методами с использованием и- критерия Манна-Уитни (Сергиенко, 2001). Различие считали достоверным при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Определение фармакологической активности «гепатона»

Проведено исследование антиоксидантной активности (АОА) отваров и сухих экстрактов семи видов растений, входящих в состав исходного сбора и «гепатона», полученные по данным ТБК (тиобарбитуровая кйслота) - теста (Клебанов и соавт., 1988) Установлено, что сухие экстракты мяты перечной (Мр), зверобоя продырявленного (Нр), солодки уральской (ви), а также «гепатон» проявляют более выраженную АОА по сравнению с соответствующими отварами, что обусловлено повышенным содержанием в экстрактах веществ фенольной природы Выраженность АОА сухих экстрактов - компонентов «гепатона» - распределяется в ряду, мята перечная (Мр) > зверобой продырявленный (Нр) > солодка уральская (ви) > ромашка аптечная (Мг) > шиповник(Я) > боярышник кроваво-красный (С) > девясил высокий (Ш).

При изучении активности глутатионпероксидазы (ГП), глутатион-редуктазы (ГР), каталазы (КАТ) и пируваткиназы (ПК) установлено, что введение в инкубационную среду «гепатона» сопровождается повышением активности ферментов антиоксидантной защиты- глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы Наиболее выраженное повышение активности глутатиопероксидазы отмечается при введении «гепатона» в инкубационную среду в концентрации 50 мкг/мл (на 31 %) по сравнению с контролем Установлено, что испытуемое фитосредство в концентрациях 10 и 50 мкг/мл повышает активность пируваткиназы на 30 % по сравнению с контролем Наряду с этим, в опытах с использованием хемилюминесцентного метода, позволяющего судить об интенсивности свободнорадикальных реакций в биологических системах, установлено, что «гепатон» оказывает выраженное ингибирующее влияние на кинетику Ре2' - индуцированной хемилю-минесценции (ХЛ) снижает амплитуду быстрой и медленной вспышки, уменьшает скорость индукции медленной вспышки Учитывая, что интенсивность быстрой вспышки кривой ХЛ зависит от скорости протекания реакций радикалообразования, можно полагать, что указанные изменения кинетики ХЛ под влиянием «гепатона» свидетельствуют о наличии у него выраженной антиокислительной активности «Гепатон» оказывает выраженное мембрано-стабилизирующее действие, о чем свидетельствует уменьшение степени перекисного и осмотического гемолиза эритроцитов При этом показано, что наиболее выраженное мембраностабилизирующее действие «гепатона» отмечается при использовании его в дозе 50 мг/мл, в эюм случае ге-

молиз эритроцитов уменьшается в 2,2 раза по сравнению с контролем, в дозах 50 и 100 мг/мл достоверное уменьшает осмотический гемолиз эритроцитов

Таким образом, способность «гепатона» ингибировать процессы ПОЛ, приводящие к нарушению структуры и функции мембран гепатоцигов, является одной из сторон механизма гепатозащитного действия указанного растительного средства

«Гепатон» обладает выраженным противовоспалительным действием В частности, оказывает антиэкссудативное действие, снижая выраженность формалинового отека на 32 % , декстранового - на 16 %, гиста-минового - на 25 % по сравнению с аналогичными показателями у животных контрольной группы Введение «гепатона» в дозе 50 мг/кг белым крысам оказывает антиальтеративное действие, снижая площадь повреждения тканей на 37 % по сравнению с контролем. Механизм противовоспалительной активности данного растительного средства может быть связан как с неспецифическим противовоспалительным действием, так и с его способностью блокировать высвобождение гистамина из базофилов и тучных клеток Курсовое введение «гепатона» в указанной дозе сопровождается 2-х кратным уменьшением объема перитонеальной жидкости и отмечается снижение количества дегранулированных тучных клеток на 28 % по сравнению с данными у крыс контрольной группы Наряду с этим, в основе противовоспалительного действия «гепатона» лежит его способность регулировать микроциркуляторные процессы, на что указывают полученные нами данные о снижении сосудистой проницаемости под влиянием «гепатона», свидетельствующие о капилляроукрепляющем действии испытуемого фитоэкстракта

При изучении влияния «гепатона» на функциональное состояние печени у белых крыс животным опытной группы водный раствор «гепатона» вводили однократно внутрижелудочно в дозах 25, 50 и 100 мг/кг Наиболее выраженная желчегонная активность отмечается у крыс, получавших «гепатон» в дозе 50 мг/кг Так, скорость секреции желчи через 1 и 2 часа после введения испытуемого средства в указанной дозе возрастает на 42 % и 32 % соответственно по сравнению с аналогичными данными у крыс контрольной группы При этом «гепатон» стимулирует выделение желчных кислот с желчью, суммарная концентрация которых превышает показатели у крыс контрольной группы на 42 % Кроме того, испытуемое средство заметно повышает выделение с желчью билирубина и холестерина

При оценке иммуномодулирующего действия «гепатона» на фоне экспериментального иммунодефицита, установлено, что введение «гепатона» на фоне азатиоприновой иммуносупрессии сопровождается повы-

шением активности клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа. При этом испытуемый фитоэкстракт не оказывает влияния на иммунный статус организма интактных животных

, . «Гепатон» проявляет наиболее выраженную антибактериальную активность по отношению к золотистому стафилококку и, вульгарному протею, оказывая бактерицидное действие в концентрации 25 мг/мл По отношению к кишечной палочке фитоэкстракт оказывает бактерицидное действие в максимальной концентрации и бактериостатическое в концентрации 12,5 мг/мл. . ,

Таким образом, исследование фармакологической активности «гепатона» показало, что новое лекарственное гепатозащитное средство в экспериментально-терапевтической дозе, составляющей 50 мг/кг, обладает широким спектром фармакологической активности. Испытуемый, фитоэкстракт оказывает положительное влияние на функциональную активность печени, повышая ее холеретическую и секреторную функцию, повышает выделение с желчью билирубина и холестерина «Гепатон» обладает выраженной противовоспалительной активностью, оказывая положительное влияние на основные, стадии воспалительного процесса Установлено, что испытуемое средство оказывает антиэкссудативное и антиальте-ративное действие, стимулирует процессы регенерации в очаге воспаления, оказывает сосудоукрепляющее действие, уменьшает выделение эндогенных провоспалительных агентов из базофилов и тучных клеток «Гепатон» , в-,экспериментально-терапевтической дозе обладает существенным иммуномодулирующим потенциалом, оказывает антибактериальное действие. Установлено, что испытуемое средство обладает выраженной мем-браностабилизирующей и антиоксидантной активность!«, повышает активность эндогенной антиоксидантной системы и энергетический потенциал клеток При этом показано, что антиоксидантная активность, «гепатона» реализуется вследствие прямого антирадикального действия

Фармакотерапевтическая эффективность «гепатона» при остром токсическом повреждении печени кры.с четыреххлористым углеродом

Курсовое введение «гепатона» в дозе 50 мг/кг на фоне тетрахлор-метанового гепатита оказывает выраженное гепатопротекторное действие, уменьшая выраженность нарушений функциональной состоятельности печени животных (табл.1)

Так, на 7 сутки эксперимента у животных, получавших испытуемое средство, отмечается достоверное снижение активности аминотранс-фераз и альдолазы (на 27, 29 и 47 % соответственно) по сравнению с данными у живодных контрольной группы, уменьшение показателей тимоло-

вой пробы на 28 % и концентрации общего билирубина в сыворотке крови на 25 % по сравнению с соответствующими показателями в контроле. Через 14 суток опыта у крыс опытной группы активность AJ1T, ACT и аль-долазы снижается практически до уровня показателей у крыс интактной группы, активность ЩФ, тимоловая проба и концентрация билирубина также достоверно ниже аналогичных показателей у животных контрольной группы. На 21 сутки эксперимента у животных, получавших «гепа-тон», отмечается нормализация всех исследованных показателей, тогда как в контрольной группе ряд показателей (активность АЛТ, ЩФ, альдо-лазы, тимоловая проба и содержание билирубина) свидетельствуют о продолжающемся патологическом процессе При этом эффективность испытуемого средства по ряду показателей превосходит таковую у препарата сравнения

Таблица 1

Влияние «гепатона» на биохимические показатели сыворотки крови белых

Показатели Группы животных

Интактная Контрольная (CCL4) Опытная 1 (ССЬ4+гепа- тон) Опытная 2 (CCL4+Liv- 52)

7 сутки

АЛТ, мкмоль/мл 1,81± 0,18 3,91 ±0,24 2,88± 0,18* 3,41 ±0,13

ACT, мкмоль/мл 1,29+ 0,03 1,74 ±0,09 1,25 ±0,06* 1,80 ±0,05

ЩФ, ед Бо-данск 13,5± 1,29 17,2± 1,15 15,7± 1,58 17,0± 1,50

Альдолаза, мкмоль/мл 0,24± 0,01 0,58± 0,05 о,37±о,оГ 0,48+ 0,04

Общий белок, г/л 7,5± 0,24 6,40± 0,12 6,80+ 0,25 7,00+ 0,40

Тимоловая проба, ед ОП 1,40± 0,19 6,20+ 0,74 4,50± 0,25* 4,01+0,16*

Р- липопротеиды, уел ед 90,00± 2,54 182,00± 13,50 154,41 ±6,23 119,01 ± 4,52*

Билирубин общ, моль/л 5,01+0,45 13,50 ± 0,14 10,24 ±0,11* 10,35 ±0,10

14 сутки

АЛТ, мкмоль/мл 1,81+0,18 3,23±0,18 2,13+0,25* 2,87± 0,23

ACT, мкмоль/мл 1,29+ 0,03 1,45 ±0,11 1,25 ±0,06* 1,38 ±0,06

ЩФ, ед Бо,-данск. 14,00+ 1,00 '27,31+1,04 17,20+ 1,17* 16,00± 1,05*

Альдолаза,-. • мкмоль/мл 0,24± 0,01 0;41±0,03 0,27±0,01* 0,30± 0,02*

Общий белок, г/л 7,40± 0,11 ' 6,31±0,0& 6,80± 0,17 6,00± 0,50

Тимоловая проба, ед, ОП 1,61±0,19 5,72+ 0,10 3,51+0,25* 3,50± 0,12*

Р- липопротеиды, усл. ед 90,00± 2,51 182,01± 13,50 154,40± 10,20 119,02± 4,51*

Билирубин общ., моль/л 0,51 ±0,03 4,90± 0,16 2,12± 0,10* 2,15± 0,11*

21 сутки

АЛТ, мкмоль/мл 1,81± 0,18 2,53± 0,18 1,90± 0,28* 2,12± 0,13

ACT, мкмоль/мл 1,29± 0,03 1,25 ±0,14 1,18 ±0,02 1,23 ± 0,07

ЩФ, ед Бо-данск 14,0± 1,00 17,0+ 1,20 13,2±-0,85* 16,0± 1,05

Альдолаза, мкмоль/мл 0,24± 0,01 0,3 5± 0,05 0,22± 0,02* 0,26± 0,02*

Общий белок, г/л 7,40± 0,11 7,52± 0,15 7,31 ±0,30 7,52± 0,13

.Тимоловая проба, ед ОП 1,41+0,19 2,53±0,18 1,11± 0,15* - 1,80± 0,13*

Р- липопротеиды, уел ед 90,00± 2,5 10!,01± 10,11 82,04± 9,40* 98,32± 8,50

Билирубин общ, моль/л ' 0,50+0,03 1,91 ±0,09 0,70+ 0,06* 0,60± 0,04*

Примечание - здесь и далее ралтца достоверна по сравнению с контролем при Р <0,05, п- количество Животных в группе

При оценке влияния «гепагона» на желчеобразовательную и желче-выделительную функцию печени ори тетрахлорметановом гепатите установлено, что «геп^тон», способствует повышению содержания желчных кислот в с.ецернируемой жёлчи В частностич скррость секреции желчи возрастает к 3 и 4 часу наблюдения соответственно на 33 и 35 % по сравнению с кон-

тролем, при этом содержание желчных кислот в желчи повышается на 30 %, билирубина — на 11 %, холестерина - на 19 % по сравнению с данными в контроле. Отмечается нормализация холатохолестеринового коэффициента.

Таблица 2

Влияние «гепатона» на экскреторно-поглотительную и дето ко ициру ю I ну ю функции печени крыс при остром токсическом гепатите у крыс (7 сутки)

(М±т)

Группы ЖИВОТНЫХ Период полувыведения антипирина, % Период полувыведепия БСФ, %

Интактная 100 100

Контрольная (ССи) 129 144

Опытная 1 (С(Х4 + «гепатон») 112 120

Опытная 2 (ССЦ, + Ыу-52) 109 ИЗ

При изучении влияния «гепатона» на экскреторно-поглотительную и детоксицирующую функции печени при тетрахлорметановом гепатите, установлено, что испытуемое средство повышает скорость элиминации БСФ с желчью и концентрацию антипирина в крови {табл. 2). Наряду с этим, «гепатон» уменьшает продолжительность гексеналового сна у крыс с тетрахлорметановым гепатитом (рис. 1).

Интакшыс Контроль (СС14 ) Опьгт ("гепатол'1)

Рис. 1, Влияние «гепатона» на продолжительность гексеналового ска у белых крыс при остром токсическом тетрахлорметановом гепатите (7 сутки).

"При анализе содержания ДНК в клетках печени у животных, получавших «гепатон», на фоне повреждения печени четыреххлористым углеродом выявлено увеличение содержания ДНК в гомогенате печени крыс, по сравнению с показателем в контрольной группе, что свидетельствует о выраженных репаративных процессах в печени белых крыс, получавших «гепатон» (рис.2)

: • с ■% 1 ■А '7 Л" ..». ¿г <•

Контроль (СС14) Опыт ("гепатон")

Рис 2 Влияние «гепатона» на содержание ДНК в гомогенате печени крыс при остром токсическом тетрахлорметановом гепатите (7 сутки)

Гепатопротекторное действие «гепатона» при тетрахлорметановом гепатите сопровождается существенным снижением интенсивности ПОЛ и повышением активности антиоксидантной системы (АОС) организма белых крыс Повреждение печени лабораторных животных тетрахлорметаном сопровождается резкой активацией процессов ПОЛ, о чем свидетельствует повышение концентрации продуктов пероксидации липидов в тканях, а также угнетение активности эндогенной АОС животных контрольной группы (табл 3)

Как следует из таблицы, «гепатон» оказывает выраженное анти-оксидантное действие, уменьшая интенсивность процессов ПОЛ и повышая активность АОС Так, концентрация МДА в гомогенате печени, в сыворотке крови и сецернируемой желчи животных опытной группы снижается на 30 %, 46 % и 34 % соответственно по сравнению с аналогичными показателями крыс контрольной группы Одновременно с этим, под влиянием испытуемого средства отмечается повышение активности СОД, ка-талазы и возрастает содержание восстановленного глутатиона по сравнению с аналогичными показателями у крыс контрольной группы

Таблица 3

Влияние «гепатона» на содержание продуктов перекисного окисления липидов и состояние эндогенной антиокислительной системы белых крыс _при тетрахлорметановом гепатите (7 сутки) (М±т)_

" Показатели Группы животных

Интактная Контрольная (ССЬ4) Опытная 1 (ССЬ4 + «гепатон») Опытная 2 (ССЬ4 + 1лу-52)

МДА в гомоге-нате пече-ни,нмоль/г 0,32± 0,02 0,76± 0,05 0,5 3± 0,04* 0,54+0,02*

МДА в сыво- , ротке крови,мкмоль/мл мин 2,11+0,16 5,70± 0,36 3,05± 0,15* 3,13± 0,22*

МДА в желчи, ед ОП 1,08± 0,01 1,92± 0,19 1,25+ 0,11* 1,53+009*

СОД, мкмоль/л 8,69+0,58 5,12+ 0,41 7,15+0,33* 5,54+0,62

Каталаза, мкат/л 1,40±0,11 1,05± 0,25 1,93+ 0,25* 1,07± 0,20

Глу, ммоль/л 24,3± 2,40 15,5± 1,95 25,5+2,40* 24,6±1,06*

Патоморфологические исследования показали, что интоксикация животных тетрахлорметаном сопровождается развитием выраженнйх структурных нарушений печени, характеризующихся дистрофическими и некротическими изменениями гепатоцитов Так, в печени животных контрольной группы отмечается массивный некроз паренхимы, диффузное ожирение, нарушение микроциркуляции "и геморрагии, дискомплексация печеночных балок, некротизированные гепатоциты располагаются в основном в центролобулярных отделах, очаги некроза нередко достигают 1 зоны ацинусов У животных опытной группы, получавших «гепатон», патологические изменения в печени менее выражены, чем в контроле сину-соидные капилляры умеренно расширены, массивных геморрагий не отмечается, альтеративные изменения характеризуются зональностью поражения долек печени, умеренной жировой инфильтрацией, незначительным центролобулярным коагуляционным некрозом гепатоцитов При морфо-метрическом исследовании печени установлено, что на 7 и 14 сутки эксперимента количество «нормальных» гепатоцитов в печени крыс опытной группы повышается в 6 и 2 раза, количество некротизированных гепатоцитов снижается в 4 и 5 раз соответственно по сравнению с контролем

Проведено изучение влияния «гепатона» на регуляцию апоптоти-ческого процесса в гепатоцитах при остром токсическом повреждении клеток печени четыреххлористым углеродом (табл. 4)

Таблица 4

Влияние «гепатона» на активность каспазы-3 в клетках печени белых крыс

при остром токсическом тетрахлорметаьовом гепатите у крыс (М±т)

Группа животных Активность к-3'-пазы -3, пмоль/ мин/мг белка

1 час 12 часов 24 часа

Интактная 16,68 ±3,56

Контрольная 15,23 ± 1,27 38,42±1,39 38,98 ± 3,03

Контрольная + ингибитор 8,94 ± 1,53* 21,60±3,91* 23,65 ± 1,46*

Опытная 7,24 ± 1,59* 39,87±3,53 33,75 ± 2,40

Как следует из таблицы, через 12 и 24 часов после введения четы-реххлористого углерода активность каспазы-3 в клетках печени контрольной группы животных увеличивается по сравнению с показателями у ин-тактных животных в 2,3 раза, тогда как через 1 час активность фермента не отличается от данных у животных интактной группы. «Гепатон» оказывает выраженное ингибирующее действие на активность каспазы-3, сравнимое с действием специфического для этого фермента ингибитора (Ас-ОЕУО-СНО). через 1 и 12 часов после интоксикации ее активность снижается на 52 % и 41 %, соответственно Через 24 часа активность кас-пазы-3 в контрольной и опытной группах животных находится на одном уровне, тогда как специфический ингибитор снижает ее на 39 %.

Таким образом, установлено ингибирующее влияние комплексного растительного средства «гепатон» на активность каспазы-3 при остром токсическом поражении печени

При изучении антистрессорного действия «гепатона» выявлено, что иммобилизационный стресс сопровождается развитием структурных нарушений печени В частности, на 4 сутки на гистологических срезах печени животных контрольной группы выявляются нарушения микроциркуляции, венозное полнокровие и расширение внутридольковых синусо-идных капилляров, в просвете которых обнаруживается стаз эритроцитов, гепатоциты с признаками дистрофии и некроза в большей мере имеют локализацию в периферических отделах печени, в центролобулярных отделах

Таблица 5

Влияние «гепатона» на соотношение гепатоцитов (нормальные/патологические) и содержание гликогена в печени при иммобилиза-

Показатели Группы животных

Интактная Контрольная (стресс) Опытная (стресс+ «гепатон»)

2 сут 4 сут. 2 сут. 4 сут.

Нормальные гепатоциты, % 90,3+3,6 66,6+3,4 78,5+1,6 75,7±0,9 92,2±0,6 #

Дистрофические гепатоциты, % 8,6+3,1 20,0+1,5 11,6+0,8 18,8+0,9 4,8+0,3*

Некротические гепатоциты, % 1,0±0,5 13,3±1,7 9,8+1,2 5,5±0,5* 2,8±0,6*

Цитохимический индекс 2,9+0,04 0,6+0,02 1,2±0,02 0,9±0,03 * 1,7±0,12 *

Установлено, что курсовое введение «гепатона» животным на фоне иммобилизационного стресса способствует улучшению микроциркуляции в ткани печени и тем самым предупреждается развитие дистрофических изменений и некроза гепатоцитов Синусоидные внутридолько-вые капилляры на микропрепаратах животных опытной группы отличаются меньшими размерами по сравнению с контролем Морфометрические исследования показали, что у животных, получавших испытуемое средство, доля некротических гепатоцитов на 2 и 4 сутки эксперимента снижается по сравнению с контрольными показателями соответственно на 58 и 71 % (табл 5), цитохимический индекс возрастал по сравнению с данными в контроле на 50 и 41 % соответственно

Таким образом, «гепатон» оказывает выраженное антистрессор-ное действие, положительно влияя на морфофункциональное состояние печени при стресс-индуцированном патологическом состоянии

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование фармакологической активности «гепатона» показало, что новое лекарственное гепатозащитное средство в экспериментально-терапевтической дозе 50 мг/кг обладает широким спектром фармакологической активности, оказывая положительное влияние на функциональную активность печени, повышая ее холеретическую и секреторную функцию, стимулируя процессы регенерации в очаге воспаления, оказывая сосудоукрепляющее действие, уменьшая выделение эндогенных про-

воспалительных агентов из базофилов и тучных клеток «Гепатон» в экспериментально-терапевтической дозе' обладает существенным иммуномо-дулирующим потенциалом, оказывает антибактериальное'и противосудо-рожное действие. ' .

«Гепатон» обладает выраженной фармакотерапевтической эффективностью при токсическом повреждении печени тетрахлорметаном Курсовое, введение «гепатона» -оказывает гепатопротекторное действие, уменьшая' выраженность нарушений функциональной состоятельности печени животных опытной группы Установлено, что «гепатон» оказывает умеренное желчегонное действие и способствует повышению содержания желчных кислот в сецернируемой желчи Отмечается нормализация холато-холестеринового коэффициента Испытуемый фитоэкстракт стимулирует экскреторно-поглотительную и детоксицирующую функцию печени, нормализуя ее морфофункциональное состояние, ускоряет репаративные процессы в гепатоцитах, оказывает ингибирующее влияние на активность кас-пазы-3 при остром токсическом поражении печени, а также обладает выраженным антистрессорным действием, оказывая благоприятное влияние на морфофункциональное состояние-печени при стресс-инду цированном патологическом состоянии

Установлено, что фармакотерапевтическая эффективность испытуемого средства обусловлена его выраженной мембраностабилизирую-щей и антиоксидантной активностью, повышая активность эндогенной антиоксидантной системы и энергётическйй потенциал клеток При этом показано, что антиоксидантная активность «гепатона» реализуется вследствие прямого антирадикального действия

! 1 ( >

ВЫВОДЫ

1 Гепатопротекторное растительное средство «гепатон» в экспериментально-терапевтической дозе 50 мг/кг обладает желчегонной, противовоспалительной, антибактериальной, антистрессорной, иммуномо-дулирующей активностью и стимулирует процессы регенерации

2 «Гепатон» обладает выраженной фармакотерапевтической эффективностью при токсическом повреждении печени четыреххлористым углеродом, стимулирует экскреторно-поглотительную и детоксицирующую функцию печени и нормализует ее морфофункциональное состояние ' '

3 Фармакотерапевтическая эффективность «гепатона» обусловлена его мембраностабилизирующей, антирадикальной активностью, а также способностью повышать активность системы антиоксидантной защиты и стимулировать процессы энергетического обмена

4 Ведущим молекулярно- клеточным механизмом гепатопротекторного действия «гепатона» является ингибирование процессов свободнора-дикального окисления липидов, повышение антиоксидантного потенциала организма, стабилизация мембранных структур клеток

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ажунова Т А, Гармаева М.Л , Михайлова Е А, Бидогаева Т Г Фармакологическая эффективность комплексного средства при экспериментальном парацетамоловом гепатите // Тезисы доклладов международной конференции «Дорно-орнийн анагаах ухааны хосолмол тог-толцоо» -Уланбатор,2005 -С.91-92.

2 Гуляев С М , Ажунова Т А., Михайлова Е А, Гармаева М Л , Попова Н А Гепатозащитное влияние лекарственного сбора при иммобилиза-ционном стрессе // Материалы научно-практической конференции «Актуальные вопросы восстановительной медицины, курортологии и физиотерапии», посвященная 85-летию курорта «Аршан». - Иркутск, 2005 -С 142-144

3 Ажунова Т.А , Чехирова Г В , Николаев С М , Разуваева Я Г, Лонша-кова К С., Лемза С.В , Гармаева М Л, Михайлова Е А , Попова Н А Фармакотерапевтическая эффективность нового растительного средства при экспериментальном токсическом гепатите // Вестник Бурятского государственного университета - 2006 - Серия 11 Медицина -Вып 6 - С 178-184

4 Гармаева М Л , Михайлова Е А Фармакотерапевтическая эффективность «Гепатона» при повреждении печени белых крыс парацетамолом // Материалы научно- практической конференции, посвященной 75-летию со дня рождения д м н Базарона Э Г Улан- Удэ, 2006 - С 60

5 Лемза С В , Михайлова Е А, Попова Н.А, Гармаева М Л , Унагаева А А , Ажунова Т А , Мондодоев А Г. Влияние нового растительного средства на активность каспазы-3 при остром токсическом поражении клеток печени // Вестник Бурятского государственного университета - 2006 - Серия 11 Медицина-Вып 6 -С.128-131.

6 Михайлова Е А , Лемза С В , Ажунова Т А , Мондодоев А Г Влияние «Гепатона» на биохимические показатели гепатоцитов при токсическом поражении печени белых крыс // Тезисы Всероссийской конференции с международным участием «Биоразнообразие экосистем внутренней Азии» - Улан - Удэ, 2006 - Т 2 - С 98-99

7 Михайлова Е А , Попова Н А , Гармаева М Л , Лемза С В , Мондодоев А Г Повышение активности каспазы-3 при остром токсическом по-

ражении печени // Тезисы Всероссийской конференции с международным участием «Биоразнообразие экосистем внутренней Азии» -Улан - Удэ, 2006 - Т 2 - С. 99

8. Михайлова Е.А, Попова Н А, Гармаева МЛ, Лемза С В Повышение активности каспазы-3 в гепатоцитах при остром токсическом поражении печейи It Материалы научно-практической конференции, посвященной 75-летию со дня рождения д м.н. Базарона Э Г -2006 -С 61

9 Попова Н А , Михайлова Е./л,., Унагаева А.А., Мондодоев А.Г, Шан-танйва Л.Н Фармакологическая активность нового лекарственного средства растительного происхождения/У Сборник научных трудов. Серия* Химия и биологическая эффективность природных соединений - Улан- Удэ издательстйо ВСГТУ, 2006 - Вып 10. - С 113-120

10 Azhunova Т А; Gulyayev S М Chehirova G V , Garmaeva М L, Mik-hailova Е A The Hepatoprotective Action of a Vegetative Dry Polyextract at Immobilization Stress at White Rats Abstracts "The Second International Symposium on Chemistry of Herbal Medicine and Mongolian Drag " -Ulaanbaatar, 2006 - P 86

11. Mikhailova E A, Popova N A, Garmaeva M L, Lemza S V., Mondodoev A G. Caspase-3 Activity in Acute Toxic Liver Injury // The Second International Symposium on Chemistry of Herbal Medicine and Mongolian Drag - Ulaanbaatar, - 2006 -P 148. -

Подписано в печать 25 09 2007 г Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная Объем 1,25 печ л Тираж 100 Заказ №51

Отпечатно в типографии Изд-ва БНЦ СО РАН 670047 г Улан-Удэ, ул Сахьяновой, 6