Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Гены фолатного цикла и системы биотрансформации ксенобиотиков у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами

На правах рукописи

БЕРЕЗИНА ОЛЬГА ВАЛЕРЬЕВНА

ГЕНЫ ФОЛАТНОГО ЦИКЛА И СИСТЕМЫ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ У БОЛЬНЫХ НЕХОДЖКИНСКИМИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ ЛИМФОМАМИ

14.01.21 - гематология и переливание крови 03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

4849957

1 6 ИЮН 2011

Новосибирск-2011

4849957

Диссертация выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор кандидат биологических наук Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, академик РАМН доктор медицинских наук, профессор

Поспелова Татьяна Ивановна Филипенко Максим Леонидович

Сидорова Лидия Дмитриевна Поляков Лев Михайлович

Ведущее учреждение: Федеральное государственное учреждение «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства России»

Защита состоится .> 11 года в

часов на заседании

диссертационного совета Д 208.062.04 при Новосибирском государственном медицинском университете (630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52; тел.: (383) 229-10-83)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского государственного медицинского университета (630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52)

Автореферат разослан «/¿^ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

К. Ю. Макаров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Неходжкинские злокачественные лимфомы (HX3JT) - это гетерогенная группа опухолевых заболеваний, развивающихся из клеток лимфоидной ткани. Согласно классификации ВОЗ 2008 года, отдельные морфологические варианты НХЗЛ выделяются в соответствии с морфологией, иммунофенотипом, генетическими маркерами и клиническими признаками [Sabbatini Е. etal., 2010].

Новосибирская область и город Новосибирск входят в число административных территорий, неблагоприятных по заболеваемости злокачественными новообразованиями, в том числе опухолями крови. Основная динамика роста обеспечивается лим-фомами, среди которых ведущие позиции занимают неходжкинские злокачественные лимфомы [Ковынев И. Б. и др., 2006J,

В настоящее время не вызывает сомнений, что процесс онкогенеза заключается в патологических изменениях вначале на молекулярном, а затем на клеточном уровне, а предрасположенность к злокачественным новообразованиям и опухолевая прогрессия могут модифицироваться аллельными полиморфизмами генов [Мушкамбаров Н. Н., 2007; Ставровская А. А., 2007; Татосян А.. Г., 2007]. В последние годы идентифицированы десятки полиморфных генов-кандидатов, которые могут принимать участие в формировании онкологического риска. Достаточно широко изучена роль полиморфных локусов ключевых ферментов фолатного цикла и системы глутатиона при солидных новообразованиях [SinghM.S. etal., 2009; SafarinejadМ.R. etal., 2010; Economopoulos K. P. et al., 2010; Ciu L. H. et al, 2011]. Данные гены играют ключевую роль в таких процессах как синтез и метилирование ДНК, биотрансформация ксенобиотиков, а их полиморфизмы, изменяя свойства кодируемых белков, могут вызывать нестабильность генома, что в ряде случаев способствует предрасположенности носителей этих генов к развитию опухолей различной локализации. Вместе с тем, роль данных полиморфизмов в патогенезе гемобластадов остается малоизученной. Ряд авторов указывают на то, что одни и те же аллели полиморфных локусов генов фолатного цикла и системы биотрансформации ксенобиотиков глутатион-8-трансферазТ1 и Ml могут иметь как проонкогенный, так и защитный эффект, в зависимости от этнической принадлежности популяции, типа ткани, из которой развивается опухоль и воздействия вредных факторов внешней среды [Добролюбов А. С., 2006; Баранов В. С., 2009]. По этой причине данные литературы по вопросу о роли полиморфных вариантов ДНК в онкологическом риске и опухолевой прогрессии часто являются противоречивыми, а результаты отдельных работ обладают плохой воспроизводимостью [Зборовская И. Б., 2007], что создает невозможность механического переноса результатов, полученных зарубежными авторами для солидных опухолей на опухоли

крови. Вместе с тем, изучение роли полиморфных вариантов генов фолатного цикла и системы биотрансформации ксенобиотиков в патогенезе гемобластозов является важным, так как снижение их функциональной активности может быть связано с генетическими полиморфизмами.

Учитывая вышеизложенное, представляется значимым и перспективным исследование врожденных генетических полиморфизмов С677Т и А1298С гена метилен-тетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), A2756G гена метионинсинтазы (MTR), A66G гена редукгазы-метионинсинтазы (MTRR), G1958A гена мегшлентетрагвдрофолатде-гидрогеназы (MTHFD1), С1420Т гена серингидроксиметилтрансферазы (SHMT1), T833C/844ins68 гена цистатионин-|}-синтазы (CBS), глутатион-Б-трансфераз Т1 и Ml (GSTT1 и GSTM1) у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами с целью установления их роли в предрасположенности к развитию заболевания.

Цель работы. Изучить полиморфные варианты генов ключевых ферментов фолатного цикла и второй фазы системы биотрансформации ксенобиотиков глутатион-S-трансфераз Т1 и Ml у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами и установить их связь с риском развития заболевания.

Задачи исследования

1. Изучить распределение частот аллелей и генотипов полиморфных локусов генов фолатного цикла MTHFR, MTR, MTRR, MTHFD1, SHMT1, CBS и генов второй фазы системы биотрансформации ксенобиотиков GSTM1 и GSTT1 у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами города Новосибирска и оценить их ассоциацию с риском развития заболевания.

2. Проанализировать распределение частот аллелей и генотипов данных полиморфных локусов у больных агрессивными и индолентными лимфомами и выявить их связь с риском развития заболевания.

3. Сравнить распределение частот аллелей и генотипов исследуемых полиморфизмов у больных в зависимости от иммуноморфологического варианта опухоли и оценить их влияние на предрасположенность к развитию заболевания.

4. Провести мета-анализ, включающий полученные результаты по исследованным полиморфным локусам и данные других исследований.

Научная новизна. Впервые исследована частота полиморфных вариантов генов фолатного цикла С677Т и А1298С MTHFR, A2756G MTR, A66G MTRR, G1958A MTHFD1, C1420T SHMT1, T833C/844ins68 CBS и генов второй фазы системы биотрансформации ксенобиотиков GSTT1 и GSTM1 у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами города Новосибирска, обнаружена ассоциация полиморфного локуса G1958A гена MTHFD1 со снижением риска развития НХЗЛ.

Проведен сравнительный анализ частот аллелей и генотипов указанных поли-

морфных локусов в группах агрессивных и индолентных лимфом, и доноров. Выявлено уменьшение частоты минорного 1958А-аллеля и гомозиготного А/А-генотипа MTHFD1 и увеличение частоты мутантного 1420Т/Т-генотипа SHMT1 в группе пациентов с агрессивными вариантами заболевания по сравнению с индолентными HX3JI и контролем.

Определены частоты полиморфных вариантов исследуемых генов в морфологически однородных подгруппах агрессивных и индолентных лимфом, показана генетическая неоднородность пациентов с HX3JI по данным полиморфизмам, свидетельствующая об уменьшении частоты мутантного 1298А аллеля и А/А-генотипа MTHFD1 в группе пациентов с диффузной В-крупноклеточной лимфомой. Доказано увеличение частоты делециоиного генотипа GSTM1 в группе пациентов с фолликулярными лимфомами 1-го и 2-го цитологического типов по сравнению с контролем.

Отмечено, что носители мутантного аллеля и генотипа полиморфного локуса G1958A гена MTHFD1 характеризуются снижением риска развития диффузной R-крупноклеточной лимфомы, а делеционного генотипа GSTM1 - возрастанием риска развития фолликулярной лимфомы.

Обнаружена ассоциация однонуклеотидной замены A2756G в гене MTR со снижением риска развития неходжкинских злокачественных лимфом путем мета-анализа публикаций, включающего результаты настоящего исследования и данные литературы о распределении аллелей и генотипов изучаемых полиморфных локусов генов фо-латного цикла в различных популяционных выборках.

., Практическая значимость. Результаты, полученные при исследовании полиморфных локусов генов фолатного цикла С677Т и А1298С MTHFR, A2756G MTR, A66G MTRR, G1958AMTHFD1, С1420Т SHMT1, T833C/844ins68CBS, и второй фазы системы биотрансформации ксенобиотиков GSTT1 и GSTM1 у больных неходжкин-скими злокачественными лимфомами города Новосибирска вносят вклад в современные представления о роли генетических изменений в патогенезе злокачественных заболеваний крови.

Учитывая, что полиморфные варианты генов G1958A MTHFD1, С1420Т SHMT1, A2756G MTR и делеция в гене GSTM1 могут модулировать риск развития НХЗЛ, следует рекомендовать их в качестве дополнительных критериев при формировании групп повышенного риска по НХЗЛ, в частности, у лиц, имеющих длительный контакт с экзогенными канцерогенами или отягощенный семейный анамнез.

Обнаруженные различия в частоте аллелей и генотипов между группами больных диффузной В-крупноклеточной и фолликулярной лимфомами и контролем позволяют сформировать панель генов для оценки риска развития и дифференциальной диагностики определенных морфологических вариантов НХЗЛ.

Путем меха-анализа проведена систематизация большого количества данных по полиморфным локусам генов фолатного цикла, опубликованных в международных журналах и касающихся разных популяций, что позволило выявить влияние полиморфного локуса A2656G гена MTR на риск развития НХЗЛ.

Положения, выносимые на защиту

1. Частота встречаемости аллелей и генотипов полиморфных локусов SHMT1, MTHFD1 и GSTM1 различна при индолентных и агрессивных лимфомах: в группе агрессивных НХЗЛ выявлено увеличение частоты мутантного гомозиготного Т/Т генотипа SHMT1, а у пациентов с диффузной В-крупноклеточной лимфомой - снижение частоты мутантного 1958А аллеля и гомозиготного А/Агенотипа MTHFD1 в сравнении с больными индолентнымн лимфомами и контрольной группой; в то время как частота делеционного генотипа GSTM1 выше у пациентов с фолликулярными лимфомами 1-го и 2-го цитологического типов по сравнению с другими группами НХЗЛ и контролем. . . . •• ■ - .:

2. Полиморфный локус G1958A гена MTHFD1 ассоциируется со снижением риска развития диффузной В-крупноклеточной лимфомы, а однуклеотидная замена С1420Т в гене SHMT1 и делеционный генотип GSTM1 - с увеличением риска агрессивных и фолликулярных лимфом соответственно.

3. Полиморфный локус A66G гена MTR ассоциируется со сниженным риском развития неходжкинских злокачественных лимфом, что подтверждено результатами мета-анализа.

Апробация результатов исследования. Материалы исследования были представлены на конференциях студентов и молодых ученых «Авиценна» (г.Новосибирск, 2006, 2007, 2008, 2011), на научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы онкогематологии» (г.Новосибирск, 2008, 2010); на V региональной конференции молодых ученых-онкологов им. Академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (г. Томск, 2010); на I Всероссийском конгрессе «Генетика опухолей кроветворной системы» (г. Ростов-на-Дону, 2010); на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 50-летию Кировского научно-исследовательского института гематологии и переливания крови с международным участием (г. Киров, 2010).

Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационного исследования внедрены в работу гематологического отделения Городской клинической больницы № 2 (г. Новосибирска), в работу молекулярно-генетического звена лаборатории Регионального центра высоких медицинских технологий (г. Новосибирск), в работу группы фармакогеномики Института химической биологии и фундаментальной ме-

дицины СО РАН, в учебный процесс и научную работу кафедры терапии, гематологии и трансфузиологии ФПК и ППВ Новосибирского государственного медицинского университета.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 26 работ, в том числе 3 - в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК Минобрнауки России для публикаций основных результатов исследования.

Объем и структура диссертации. Материал диссертации изложен на 174 страницах машинописного текста и содержит разделы: введение, обзор литературы, главу «Материал и методы исследования», 6 глав, отражающих результаты собственных исследований, 2 клинических примера, обсуждение результатов, выводы и практические рекомендации. Работа иллюстрирована 38 таблицами, 13 рисунками. Указатель литературы состоит из 299 источников, из них - 42 отечественных и 257 зарубежных авторов.

Личный вклад автора. Весь представленный материал собран, обработан и проанализирован лично автором.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Исследование одобрено комитетом по этике Новосибирского государственного медицинского университета.

Общая характеристика группы обследованных больных. Группу обследованных составили 146 пациентов с впервые установленным диагнозом неходжкин-ской злокачественной лимфомы. Средний возраст больных - 52,4 ± 14,97 года (18-72 лет). По полу больные распределились поровну: мужчины и женщины по 73 человека. В соответствии с классификацией ВОЗ 2008 года [БаЬЬайш Е. ее а!., 2010], больные НХЗЛ были разделены на группы в зависимости от иммунологической принадлежности: с В-клеточными лимфомами - 135 человек (92,5 %), с Т-клеточными - 11 пациентов (7,5 %). В зависимости от степени злокачественности выделялись лимфомы агрессивные - 89 пациентов (61 %), к которым относились диффузная крупноклеточная, беркитгоподобная, плеоморфная, неспецифицнрованная, лимфобластная, плазмобластная, анапластическая, фолликулярная 3 цитологического типа, мантийноклеточная; индолентные - 57 человек (39 %), к которым относились диффузная мелкоклеточная, пролимфоцитарная, центроцитарная, лимфоплазмоци-тарная, фолликулярная 1-го и 2-го цитологического типов, грибовидный микоз, мар-гинальноклеточная, МАЬТ-лимфома, В обследованной группе больных НХЗЛ подавляющее большинство пациентов имели продвинутые стадии заболевания: 101человек (69 %) - IV стадию и 19 человек (13 %) - III стадию. У всех пациентов оценивалось наличие клинических признаков опухолевой интоксикации (В-симптомы): ночная

профузная потливость, снижение массы тела на 10 % и более за 6 месяцев, фебриль-

7

ная лихорадка. Те или иные проявления имели 99 пациентов (68 %). Больные были обследованы до начала курсов полихимиотерапии для исключения влияния лечения на результаты исследования. Все больные HX3JI получили 6-12 курсов полихимиотерапии. В терапии использовались стандартные протоколы первой и второй линии: при агрессивных лимфомах - CHOP и R-CHOP (циклофосфан, доксорубицин, винкристин, преднизолон с добавлением или без ртуксимаба), СНОЕР (циклофосфан, доксорубицин, винкристин, этопозид, преднизолон), DHAP (дексаметазон, цитарабин, цисплатин); ESHAP (этопозид, солю-медрол, цитарабин, цисплатин), BFM и терапия по протоколу Хельцера при лимфобластной лимфоме-лейкемии, при индолентных лимфомах - СОР (циклофосфан, винкристин, преднизолон) и FC (флударабин, циклофосфан) с ритуксимабом или без ритуксимаба.

Контрольная группа для генов ферментов фолатного цикла составила 549 доноров Новосибирского центра крови в возрасте от 18 до 57 лет (200 женщин и 349 мужчин), средний возраст обследованных 33,0 ±11,01 лет. Для полиморфных локусов GSTM1 и GSTT1 группу контроля составили 177 доноров Новосибирского центра крови, средний возраст 31,0 ± 12,02 лет.

Общеклинические методы исследования. Обязательный комплекс обследования больных включал сбор жалоб, анамнеза, объективный осмотр, лабораторные методы: общий анализ крови и мочи, биохимические тесты (функциональные пробы печени и почек), в том числе С-реакгивный белок, фибриноген, лакгатдегидрогеназа и щелочная фосфатаза для определения биохимической активности опухолевого процесса. Всем пациентам проводилось ультразвуковое исследование органов брюшной полости, рентгенологическое исследование органов грудной клетки, компьютерная томография малого таза, забрюпшнного пространства, брюшной полости или грудной клетки - по показаниям, исследование пунктата костного мозга с подсчетом миело-граммы и гистологическое исследование трепанобиоптата. Диагноз неходжкинской злокачественной лимфомы был установлен на основании гистологического исследования биоптатов лимфоузлов с иммуногистохимической верификацией варианта опухоли с использованием широкой панели моноклональных антител к кластерам диф-ференцировки гемопоэтических клеток.

Специальные методы исследования. Все работы по генотипированию проводились на базе Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, группа фармакогеномики (руководитель группы — к. б. н. Филипенко М. Л.).

Материалом для исследования служили периферическая кровь или буккальный эпителий больных НХЗЛ. ДНК выделяли из венозной крови с использованием стандартной процедуры, включающей выделение и лизис клеток крови, гидролиз белков

протеиназой К, очистку ДНК путем экстракции примесей смесью фенол-хлороформа, осаждение ДНК этанолом; а также из буккального эпителия с использованием стандартной методики выделения ДНК на силикогеле. Определение полиморфных вариантов генов MTHFD1 и CBS проводилось методом полимеразной цепной реакции полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ). Реакцию для определения полиморфных локусов генов MTHFD1 и CBS проводили одновременно в одной пробирке с применением методики «hot-start». Продукты амплификации обрабатывались эндонуклеазой рестрикции Bmel 81, в сайте узнавания которой лежат исследуемые полиморфные локусы. Анализ продуктов гидролиза, полученных в результате ПЦР-ПДРФ анализа, проводили путём вертикального электрофореза в 8 % полиакри-ламидном геле (рис. 1).

М 1 2 3 4 5

Примечание: п.н. - пары нуклеотидов; М - маркер; 1-5 -ПЦР-продукты, обработанные эндонуклеазой рестрикции Вше 18

Рис. 1. Электрофореграмма продуктов гидролиза эндонуклеазой рестрикции до-

определение полиморфных вариантов генов MTHFR, MTRR, MTR и SHMT1 проводилось методом ПЦР в режиме реального времени (Real-time ПЦР) с использованием конкурирующих TaqMan-зондов, комплементарных полиморфной последовательности ДНК. Увеличение флюоресценции пропорционально количеству синтезированного ПЦР-продукта (рис. 2).

Примечание: FAM, HEX - флюоресцентные красители; Q -гаситель флюоресценции

Рис. 2. Генотипирование образцов методом Real-Time ПЦР с использованием конкурирующих TaqMan зондов 9

4— Аллель 833C/844ins68 гена CBS (339 п.н.) ■4— Аллель 833T/844del68 гена CBS (271 п.н.)

Аллель 1958А гена MTHFD (149 п.н.) Аллель 1958G гена MTHFD ( 129 п.н.)

диморфных локусов CBS и MTHFD 1

Для определения делеции в генах GSTM1 и GSTT1 также использовался метод Real-time ПЦР с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green с дальнейшей регистрацией кривых плавления. Праймеры были подобраны таким образом, что при наличии хотя бы одного аллеля с делецией ПЦР-продукт не образуется. Для исключения ложноотрицательных результатов в связи с отсутствием ДНК или инги-бированием ПЦР, в реакционные смеси добавляли в качестве внутреннего контроля ПЦР легкоплавкие праймеры (LTM). Полученные результаты интерпретировали исходя из анализа графиков накопления флуоресценции, специфичность оценивалась с помощью кривой плавления (рис. 3). ПЦР проводили на ДНК-амплификаторе фирмы iCycler iQ5 (Bio-Rad, США).

тем ГИТ'1 " vpi. С температура, С

Рис. 3. Графики производных кривых плавления продуктов ПЦР анализа GSTM1 и GSTT1 полиморфных локусов

Статистическая обработка материала проводилась с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel 2007, статистических программ STATIST1KA, версия 6.0; GenABEL; rmeta для языка R (версия 2.6.0).

Частоты встречаемости аллелей и генотипов исследуемых однонуклеотидных замен (SNPs) в выборке больных HX3JI сравнивали с таковыми в контрольной группе. Значимость различий оценивалась с помощью критерия В случае, если абсолютные частоты более 20 % признаков в группе не превышали 5, использовали точный критерий Фишера. Статистически значимыми считались различия при р<0,05. Соответствие контрольной выборки равновесию Харди-Вайнберга проверяли с помощью критерия х2. Для оценки величины относительного риска использовали отношение шансов (OR) с его доверительным интервалом (C.I.) при уровне доверия 95 %. Вычисления производились с помощью программы DeFinetti на сайте Института генетики человека (Мюнхен, Германия, http://ihg2.helmhoitz-muenchen.de/cgi-bin/hw/hwal.pl).

Поиск публикаций для мета-анализа осуществлялся с помощью базы данных PubMed (www.pubmed.gov). При включении оригинальных исследований в мета-анализ учитывались следующие критерии: (а) исследование ассоциации одного из изучаемых SNP и HX3JI; (Ь) дизайн эксперимента типа «case-control»; (с) численность контрольной группы и группы пациентов с НХЗЛ не менее 150 человек; (d) распределение генотипов в контрольной группе соответствует равновесию Харди-Вайнберга. Для мета-анализа использовались значения OR и 95% C.I. (редкий аллель против частый аллель).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Полиморфизмы генов фолатного цикла MTHFR, MTR, MTRR, MTHFD1, SHMT1, CBS и второй фазы системы биотрансформации ксенобиотиков GSTM1 и GSTT1 у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами

Частоты аллелей и генотипов полиморфных локусов С677Т и А1258С гена MTHFR, A66G гена MTRR, A2756G гена MTR, С1420Т гена SHMT1, 844ins68 гена CBS, генов системы биотрансформации ксенобиотиков GSTM1 и GSTT1 у больных в общей группе неходжкинских злокачественных лимфом не отличалась от таковых в контрольной группе.

Обнаружены различия по полиморфному локусу G1958A гена MTHFD1: у больных лимфомами частота минорного 1958А-аллеля гена MTHFD1 составила 42 %, а дикого 1958С-аллеля - 58 %, тогда как в контрольной группе 1958А-аллель отмечен у 49,5 % пациентов, а 19580-аллель-у 50,5 % (р < 0,017) (рис. 4).

Примечания: 1. * - уровень значимость отличий р < 0,02 между группой больных НХЗЛ и контролем; 2. ** - уровень значимости отличий р < 0,01 между группой больных НХЗЛ и контролем

Рис. 4. Частота встречаемости аллелей и генотипов полиморфного локуса С1958А генаМТШ-ТП в общей группе больных неходжкинскими злокачественными

лимфомами

Отмечены различия и в частоте генотипов полиморфного локуса G1958А MTHFD1 в обследованной группе пациентов и контрольной группе. Генотип А/А встречался лишь у 14% пациентов с НХЗЛ, в то время как в контрольной группе -у 25 % (р < 0,009), генотип GIG - у 44 % и 26 % соответственно (р < 0,009). Для гете-розигрт (G/A-генотип) различия между группой больных и контролем не достигли уровня статистической значимости: 55 % в группе больных с НХЗЛ и 49 % в контроле (р > 0,05) (рис. 4). При оценке риска развития НХЗЛ выявлено, что лица, несущие му-тантный 1958А-аллель, характеризуются сниженным риском развития лимфомы (OR = 0,747, СЛ. [0.579-0.963], р < 0,017), также как и лица с гомозиготным А/А-генотипом (OR - 0,471, C.I. [0.264-0.841], р < 0,009). Вместе с тем, носительство нормального 1958С-аллеля и G/G-генотипа характеризуется увеличением риска развития НХЗЛ в 1,3 я 2Д раза соответственно (табл. 1).

Таблица 1

Ассоциация аллелей и генотипов полиморфного локуса G19S8A гена

МТНГР1 с pstcKOM развития неходжкинских злокачественных лимфом

Ассоциация тенотипов Ассоциация аллелей

G/G G/A А/А G А

OR 2,122 1,125 0,471 1,339 0,747

C.I. 1.190-3.785 0.744-1.701 0.264-0.841 1.038-1.726 0.579-0.963

Р 0,089 0,575 0,099 0,017 0,017

Однонуклеотидная замена G1958A в гене MTHFD1 приводит к аминокислотной замене в формнлтетрагидрофолатсинтетазном домене фермента MTHFD1 и уменьшает его термостабильность и метаболическую активность [Kohlmeier M., 2005; Christensen K.E., 2009]. Субстратом данного фермента является тетрагидрофолат. Потенциально, накопление этого соединения способствует увеличению концентрации 5,10-метилентетрагидрофолата, что, в свою очередь, может увеличивать эффективность синтеза тимидилата и метилирования ДНК. Это может препятствовать злокачественной трансформации. К настоящему времени существует ряд исследований, указывающих на протекгивный эффект фолата (предшественника тетрагидрофолйта) в отношении НХЗЛ [Lim U. et al., 2005; Polesel J. et al., 2007; Koutrus S. et al., 2008].' Однако, данных о связи полиморфного локуса G1958A MTHFD1 с увеличением внутриклеточной концентрации тетрагидрофолата в настоящее время не обнаружено.

2. Полиморфизмы генов фолатного цикла MTHFR, MTR, MTRR, MTHFD1, SHMT1, CBS и второй фазы системы биотрансформации ксенобиотиков GSTM1 и GSTT1 у больных агрессивными и индолентными лимфомами

Учитьшая, что неходжкинские злокачественные лимфомы - это гетерогенная группа злокачественных лимфопролиферативных заболеваний, проведено сравнение частот аллелей и генотипов изучаемых полиморфных локусов в группах больных ин-

долентными и агрессивными лимфомами, так как различная скорость опухолевой профессии агрессивных и индолентных лимфом может быть связана не только с мутациями, приобретенными подвергшимися озлокачествлению клетками в фазу инициации, промоции и прогрессии лимфомы [Горбунова В. С., ] 997], но и с исходными генетическими характеристиками клеток, то есть полиморфизмами генов.

Частоты аллелей и генотипов полиморфных локусов С677Т и А1258С гена MTHFR, A2756G гена MTR, A66G гена MTRR, 844ins68 гена CBS и гена системы биотрансформации ксенобиотиков GSTT1 были сопоставимы между группами пациентов с агрессивными и иидолентными HX3JI и контролем.

В группе агрессивных лимфом отмечено увеличение частоты дикого 1958G-аллеля (64 %) по сравнению с контролем (50,5 %, р < 0,001) и индолентными лимфомами (50 %, р<0,02), тогда как мутантный 1958А-аллель, наоборот, в группе агрессивных HX3JI встречался реже по сравнению с контролем и индолентными варишгта-ми заболевания: 36 % против 49,5 % (р < 0,001) и 50 % (р < 0,02) с оответственно При этом значимых различий в распределении аллелей между контрольной группой и иидолентными лимфомами не выявлено. Гомозиготный G/G-nî40Tsra MTHFD1 в rpynrï агрессивных лимфом встречался в 1,5 раза чаще, чем в контроле: 38 % против 26 % (р< 0,00079) и в 1,9 раз чаще, чем у больных индолентными лимфомами: 20% (р < 0,02). Частота гомозиготного А/А-генотипа была более редкой у пациентов с агрессивными HX3JI по сравнению с популяцией г. Новосибирска и индолентными лимфомами: 10 % против 25 % (р < 0,00079) и 20 % соответственно (р < 0,02) (рис. 5).

G A G/G G/A А/А

»Контроль в Агрессивные НХЗЛ ®ИндолснтныеНХЗЛ

Примечания: 1. * — уровень значимость отличий р < 0,0008 между группой больных агрессивными лимфомами и контролем

2. ** - уровень значимости отличий р < 0,02 между группой больных агрессивными и индолентными лимфомами

Рис. 5. Частота встречаемости аллелей и генотипов полиморфного локуса 01958А гена МЮТОI у больных агрессивными и индолентными лимфомами

При оценке ассоциации данного полиморфного локуса с риском развития разных вариантов лимфом, как и в общей группе, выявлена ассоциация мутантного 1958А-аллеля со снижением риска возникновения агрессивных лимфом. (OR = 0,578, C.I. [0.415-0.805], р < 0,001), то есть сочетание минорных аллелей (А/А-генотип) приводит к усилению проггекгавного эффекта (OR=0,283, C.I. [0.130-0.613], р < 0,00079). Соответственно, дикий 1958С-аллель и G/G-генотип обуславливают повышение риска возникновения агрессивных HX3JI в 1,7 и 3,5 раза соответственно. Можно отметить суммацию эффектов дикого и минорного аллелей в гомозиготных G/G и А/А-генотипах, в то время как гетерозиготный G/A-генотип достоверно не ассоциируется с риском развития агрессивных лимфом (OR = 0,734, C.I. [0.448-1.202], р<0,2), что может быть обусловлено недостаточным эффектом каждого из аллелей в гетерозиготном генотипе. Для индолентных лимфом ассоциации G1958A MTHFD1 с риском возникновения HX3JI не обнаружено.

Несмотря на то, что в общей группе пациентов с лимфомами распределение аллелей и генотипов полиморфного локуса С1420Т гена SHMT1 не отличалось от контроля, при разделении на агрессивные и индолентные варианты заболевания обнаружено, что различия в частоте аллелей С1420Т гена SHMT1 между пациентами с агрессивными HX3JI и контролем находились на грани статистической значимости-. С-аллель - 61 % и 68 %, Т-аплель - 39 % и 32 % соответственно (р = 0,065). Различия достигают уровня статистической значимости при анализе частоты генотипов в данных группах НХЗЛ. Так, гомозиготный Т/Т-генотип SHMT1 встречался в 2 раза чаще у больных с агрессивными лимфомами по сравнению с контролем: 18 % против 9 % (р < 0,02). При анализе влияния аллелей и генотипов полиморфного локуса С1420Т гена SHMT1 на развитие агрессивных и индолентных лимфом обнаружена ассоциация минорного 1420Т-аллеля с повышенным риском развития агрессивных НХЗЛ на грани статистической значимости (OR= 1,371, C.I. [0.980-1.918], р 0,06), однако сочетание 1420Т-аллелей в гомозиготном Т/Т-генотипе обуславливает повышение риска развития данной группы лимфом в 2,2 раза (р < 0,02), что говорит о суммации эффектов минорных аллелей. Ассоциации С1420Т SHMT1 с риском возникновения индолентных вариантов заболевания не обнаружено. Большинство исследований, посвященных анализу влияния полиморфного локуса С1420Т SHMT1 на риск развития НХЗЛ, не обнаружило какой-либо ассоциации данного локуса с лимфомами (Ski-bola S. F. et al., 2004; Nicklot S. et al., 2006; Berghmd M. et al., 2009). Фермент SHMT1 осуществляет превращение тетрагидрофолата в 5,10-метилентетрагидрофолаг - основной субстрат фермента MTHFR. Однонуклеотидная замена С1420Т в гене SHMT1 приводит к уменьшению каталитической активности фермента и, как следствие, ухудшению синтеза тимидиновых нуклеотидов, с одной стороны, и снижением эф-

фективности метилирования ДНК, с другой. Эти два процесса могут лежать в основе злокачественной трансформации клеток.

Для полиморфных локусов GSTM1 и GSTT1 также не было обнаружено различий в общей группе неходжкинских злокачественных лимфом в сравнении с контролем, но выявлена большая частота делеционного генотипа GSTMI в группе пациентов с индолентными лимфомами по сравнению с популяционной выборкой и агрессивными НХЗЛ: 56 % против 34 % (р < 0,01) и 40 % (р < 0,02) соответственно (рис. 6).

100% 1

80%

60%-f

i

40%

20%■I

0% -м GSTMI null GSTMI + GSTT1 null Gí

Примечания: 1. * - уровень значимость отличий р < 0,05 между группой больных агрессивными лимфомами и контролем

2. ** - уровень значимости отличий р < 0,05 между группой больных агрессивными и индолентными лимфомами

Рис. 6. Частота встречаемости генотипов GSTM1 и GSTT1 у больных агрессивными и индолентными лимфомами

Частоты генотипов полиморфного локуса GSTM1 между группой агрессивных лимфом и контролем не отличались. Найденные различия позволили оценить вклад делеции в гене GSTM1 в предрасположенность к развитию индоленгных вариантов заболевания. Выявлено, что у носителей мутантного генотипа GSTM1 риск развития индолентных НХЗЛ увеличен в 2 раза по сравнению с носителями нормального генотипа (OR = 1,96, C.I. [1.072-3.581], р < 0,02).

Известно, что делеция в гене GSTM1 приводит к резкому снижению активности фермента, который участвует в метаболизме большого количества ксенобиотиков. В ряде исследований было показано, что дефекты ферментов второй фазы системы биотрансформации ксенобиотиков GSTM1 и GSTT1, обусловленные делениями в соответствующих генах, приводят, помимо увеличения частоты мутационных процессов, к таким изменениям ДНК, которые и дальнейшем не поддаются репарации, что может приводить к злокачественной трансформации, а длительная персистенция активных метаболитов с мутагенными и канцерогенными свойствами может в дальнейшем способствовать генерализации опухоли [Lahiri D. К. et al., 1992; Wani М. A. et al., 2000; Miller D. Р. et al, 2002].

Таким образом, ассоциация мутантного 1958А-аллеля и А/А-генотипа MTHFD1,

а также 1420Т-аллеля и Т/Т-генотипа SHMT1 в общей группе неходжкинских злока-

15

чесгвенных лимфом обусловлена за счет группы пациентов с агрессивными формами заболевания, а для полиморфного локуса GSTM1, наоборот, за счет пациентов с ин-долентными НХЗЛ.

3. Полиморфизмы генов фолатного цикла MTHFR, MTR, MTRR, MTHFD1, SHMT1, CBS и второй фазы системы биотрансформации ксенобиотиков GSTM1 и GSTT1 у больных агрессивными и фолликулярными лимфомами

Принимая во внимание полученные нами данные о неоднородности пациентов с агрессивными и индолентными вариантами НХЗЛ по ряду генов, были проанализированы отличия частот аллелей и генотипов изучаемых полиморфных локусов при различных морфологических вариантах заболевания.

Из группы агрессивных НХЗЛ, с учетом наибольшей представленности, были выделены пациенты с диффузной В-крупноклеточной лимфомой (ДВККЛ, п = 56). Отдельному анализу также подверглись больные с другими вариантами агрессивных лимфом (Т- и В-анапластической, Т и В-лимфобластной, беркитгоподобной, мантий-ноклеточной, фолликулярной 3-го цитологического типа, плеоморфной, п = 33), преимущественно крупноклеточными (KKJI). Из группы индолентных НХЗЛ были выделены диффузная В-мелкоклеточная лимфома (ДВМКЛ, п = 17) и фолликулярная лим-фома 1-го и 2-го цитологического типов (ФЛ, п = 15).

Дикий 19580-алллель MTHFD1 в группе больных ДВККЛ встречался чаще как по сравнению с группой контроля: 70 % против 50,5 % (р < 0,00008), так и с группами больных с ККЛ и ДВМКЛ, в которых частота 19580-аллеля составила 44% (р < 0,001) и 47% (р < 0,01) соответственно. При этом разницы в частоте 1958G-аллеля между группами больных ККЛ и ДВМКЛ и контролем не обнаружено. В свою очередь, частота минорного 1958А-аллеля MTHFD1 в группе больных ДВККЛ составила лишь 30 %, тогда как в группе пациентов с ККЛ - 56 %, в группе ДВМКЛ -53 %, а в популяции г. Новосибирска - 49,5 %. Частоты распределения генотипов между группами пациентов с ККЛ, ДВМКЛ и контрольной сопоставимы (р > 0,05), в то время как гомозиготный G/G-генотип MTHFD1 в группе больных ДВККЛ встречается в 1,9 раз чаще по сравнению с контролем: 26 % (р < 0,0002) и в 4 раза чаще, чем в группе пациентов с ККЛ и ДВМКЛ: 11 % и 12 % соответственно (р <0,001) (табл. 2).

Учитывая различия в распределении аллелей и генотипов в группе ДВККЛ, была проведена оценка риска развития данной группы неоплазий. Обнаружено, что минорный 1958А-аллель (OR = 0,192, C.I. [0.072-0.513], р < 0,00003) и гомозиготный А/А-генотип (OR = 0,429; C.I. [0.279-0.659], р <0,00008) гена MTHFD1 ассоциируются со сниженным риском развития ДВККЛ, в то время как дикий 19580-аллель и G/G-генотип повышают риск развития ДВККЛ в 2,3 и 5,2 раз соответственно.

Таблица 2

Распределение аллелей и генотипов полиморфного локуса С1958А гена МТОТШ в группах больных различными вариантами агрессивных лимфом и диффузной В-мелкоклеточной лимфомой

Аллели Генотипы Контроль 1 Больные ДВККЛ 2 (Ж СЛ. Р ДВККЛ Больные ККЛ 3 Больные ДВМКЛ 4

Абс. | % Абс. | % Абс. | % Абс. | %

п=539 п=54 п=27 п=17

в 544 50,5 76 70 рь2< 0,00008 р2.з< 0,001 Р2-4<0,01 2,331 1.517-3.584 0,00008 24 44 Р1.з>0,05 16 47 рм>0,05

А 534 49,5 32 30 Р1.2< 0,00008 Р2-з< 0,001 р2^<0,01 0,429 0.279-0.659 0,00008 30 56 рю> 0,05 18 53 рм>0,05

в/о 141 26 27 50 Рь2< 0,0003 р2.з< 0,002 Р2-4< 0,02 5,209 1.949-13.918 0,0003 3 11 Р1_з> 0,05 2 12 рм>0,05

в/А 262 49 22 41 р,.2< 0,006 0,439 0.241-0.798 0,006 18 67 Р1-з> 0,05 12 70 рм> 0,05

А/А 136 25 5 9 р,.2< 0,0003 р2-з< 0,002 Р2-4< 0,02 0,192 0.072-0.513 0,0003 6 22 Р|.з> 0,05 3 18 рм>0,05

В отличие от общей группы НХЗЛ и группы агрессивных лимфом, отмечена ассоциация с риском развития ДВККЛ гетерозиготного О/А-генотипа (СЖ = 0,439; С.1. [0.241-0.798], р <0,006), то есть протективное влияние мутантного 1958А-аллеля превалирует над влиянием дикого 19580-аллеля. Таким образом, становится очевидным, что вьивленная исходно ассоциация полиморфного локуса в 1958А МТНР01 с низким риском развития неходжкинских злокачественных лимфом, обусловлена группой пациентов с диффузной В-крупноклеточной лимфомой. В исследовании Кга-.ршмсМ. е1а1., 2004 бьша показана ассоциация 1958А-аллеля с увеличением риска развития рецидива и летального исхода у больных острым лимфобластным лейкозом, для лечения которых применялся метотрексат. Авторы объясняют полученный результат тем, что носительство данного аллеля, вероятно, приводит к увеличению количества 5,10-метилентетрагидрофолата, необходимого для синтеза тимидиновых нуклеотидов, что снижает эффективность применения метотрексата и увеличивает риск неблагоприятного исхода. Результат вышеуказанного исследования является косвенным свидетельством влияния локуса С1958А МТНИМ на концентрацию 5,10-метилентетрагидрофолата. Вероятно, для одних видов опухоли, например индолент-ных НХЗЛ, процесс синтеза пуринов играет более важную роль, чем синтез тимиди-лата и метилирование ДНК, для других же, в частности диффузной В-крупноклеточной лимфомы, два последних процесса более значимы.

Для полиморфного локуса С1420Т гена 8НМТ1 не было обнаружено различий в . частоте аллелей и генотипов между группами больных с диффузной В-крупноклеточной и диффузной В-мелкоклеточной лимфомами и популяционной выборкой, тогда как в группе больных с другими вариантами агрессивных лимфом минорный 1420Т-аллель встречался чаще по сравнению с контролем: 46 % против 32 % (р < 0,025), также как и гомозиготный Т/Т-генотип, который в группе ККЛ составил 18 % против 9 % в популяционной выборке (р< 0,026). При оценке риска развития НХЗЛ выявлено отсутствие связи однонуклеотидной замены С1420Т в гене вНШТ с ДВККЛ, но ассоциация с повышенным риском развития других видов агрессивных лимфом: в 1,8 раза у носителей минорного 1420Т-аллеля (р < 0,025) и в 3,5 раз для ТЯ-генотипа (р < 0,026). Вероятно, полученная ассоциация обусловлена каким-либо одним вариантом лимфом, входящим в группу других агрессивных НХЗЛ (не ДВККЛ), но проанализировать в настоящем исследовании точную взаимосвязь с морфологией не представляется возможным из-за небольшого числа пациентов в каждой подгруппе. Таким образом, негативная ассоциация мутантного 1420Т/Т-генотипа БНМТ1 в общей группе агрессивных НХЗЛ обусловлена за счет пациентов с другими вариантами (не ДВККЛ) агрессивных лимфом.

Литературные данные, касающиеся ассоциации данного полиморфного локуса с солидными опухолями крайне гетерогенны, а ряд исследований, касающихся НХЗЛ, не обнаружили ассоциации данной группы неоплазий с полиморфным локусом С1420Т SHMT1. Это может быть связано с рядом причин. Так, например, существует митохондриальный вариант данного фермента - SHMT2, изменение активности которого, совместно с цитозольным SHMT1, может влиять на процессы метилирования в клетке и нивелировать эффекты последнего в определенных популяциях.

Анализ частоты нормальных и мутантаых генотипов глутатион-Б-трансфераз Ml и Т1 в подгруппах агрессивных и индолентных лимфом показал, что делеция в гене GSTM1 в группе индолентных НХЗЛ встречается чаще среди пациентов с фолликулярными лимфомами, где частота мутантного генотипа составила 67 % против 53 % в группе больных с диффузной В-мелкоклеточной лимфомой (р < 0,05) и 40 % в группе контроля (р < 0,039) (рис. 9). Учитывая найденные различия в частоте генотипов локуса GSTM1 у пациентов с фолликулярными лимфомами по сравнению с популяцией, была произведена оценка риска развития данного варианта НХЗЛ. Мутантный (деле-ционный) генотип GSTM1 обуславливает повышение риска развития фолликулярной лимфомы в 3 раза (OR = 3,06, C.I. [1.01-9,32], р < 0,039), тогда как нормальный генотип GSTM1 обладает протективным эффектом. Подобные результаты получены Hohaus S. et al., 2007, которые показали, помимо увеличения риска развития фолликулярных лимфом, что делеционный генотип GSTM1 может модифицировать факторы, входящие в прогностический индекс для фолликулярных лимфом, приводя худшему прогнозу у пациентов именно низкой группы риска. Для ряда опухолей было показано увеличение частоты мутаций в гене апоптоза р53 у носителей делеции в генах глу-татион-З-трансфсраз [Hail J. et al., 2009; Oguztiizun S. et al., 2009, 2010; Avti P. K. et al., 2010; Zhang Z.etal., 2010; Beltran-Ramirez O. etal., 2010; AgodiA. etal., 2010]. Нарушение функции p53 в результате точечных мутаций, делеций, образования комплекса с другим клеточным регулятором или изменение внутриклеточной локализации приводит к утрате супрессивных свойств и стимулирует опухолевый процесс [Зборовская И. Б., 2007; Vogelstein В. et al., 1988; Nigro G. M. et al., 2007]. Нарушения процессов апоптоза являются ключевыми в патогенезе развития индолентных лимфом, в целом, и фолликулярных лимфом, в частности [Поддубная И. В., 2007]. К тому же было показано, что частота мутаций в гене р53 большая по сравнению с другими неопла-зиями и составляет до 16% [Wilson W. Н. et al., 1997; Bellido М. et al., 2002]. Вышесказанное может объяснять большую частоту делеционного генотипа GSTM1 именно у пациентов с фолликулярной лимфомой.

Для всех других групп неходжкинских злокачественных лимфом не обнаружено влияния сочетания нормальных и делеционных генотипов GSTM1 и GSTT1 на риск

развития, что может быть связано с нивелированием эффектов отдельных локусов в комбинации.

4. Мета-анализ результатов исследования н данных литературы по полиморфным локусам генов фолатного цикля

В связи с тем, что настоящее исследование, как и многие другие аналогичные работы, выполнено на выборке небольшого размера, с целью увеличения статистической мощности исследования, были объединены полученные данные по изучаемым полиморфизмам с результатами других работ и выполнен мета-анализ (для локусов в генах MTHFD1 и CBS мета-анализ не проводился в связи с недостаточным количеством литературных данных). С целью снижения вероятности включения исследований с возможными ошибками генотипирования, в мета-анализ включались только работы с выполнением закона Харди-Вайиберга в контрольной группе. Размеры объединенной выборки больных с НХЗЛ колебались от 896 человек для полиморфного лс-куса A66G гена MTRR до 4176 пациентов для однонуклеотидной замены С677Т в гене MTHFR.

В большинстве исследований, включая настоящее, отмечена ассоциация мутант-ного 27560-аллеля со сниженным риском развития. НХЗЛ, и при расчете объединенного отношения шансов данная ассоциация оказалась статистически значимой (OR = 0,902; C.I. [0.821-0.991], р = 0,03), что подтвердило вклад данной замены в предрасположенность к НХЗЛ (рис. 7).

Корея [Kim $3

Австовгмя eï ' Я6;

Австралия* una«at.2a0!S ........ЯИ.......

Италия {0ещт«Яз1 xti. 7J0>4j AMÙirn if. ¡yld/oor rtl a!. 7005) ¡'-jf'/ifl! fer si, ?fi№}

ryptM^HHHÎLiiBwbai^eial. 2Û04) -----«—-

Россия (иташ£е иссл*доваиие)

■m-

Размер объединённой выборки; больные: 2602 человека контроль: 4756 человека

0.0« О.10 0.1« 0.25 040 A-S3 100 I.S8

Рис. 7. Форест-график для полиморфного локуса A2756G гена MTR

Ассоциация 275бО-аллеля со сниженньш количеством гиперметилированных CpG-островков в составе генов-супрессоров опухоли была показана в работе Paz M. F. et al., 2002. Вероятно, мутантный аллель способствует активации генов-супрессоров опухоли, что обуславливает полученную ассоциацию, а также аналогич-

20

ные результаты для других видов неоплазий [UlvikA. eta]., 2004; SemmlerA. et al., 2006; Shekari M. et al., 2008], однако детальный механизм такого влияния данного ал-леля в настоящее время остаётся неизученным.

Ни для одного из остальных проанализированных полиморфных локусов не было выявлено ассоциации с HX3JI в объединённой выборке при выполнении мета-анализа. Стоит отметить, что для большинства полиморфных замен наблюдался большой разброс значений отношения шансов и 95 % доверительного интервала между исследованиями, включенными в мета-анализ. Вероятно, такие различия в результатах связаны с влиянием этнических особенностей выборок.

Несмотря на то, что для полиморфных локусов MTHFR, MTRR, CBS не обнаружено ассоциации с риском развития НХЗЛ, это не исключает их вклад в патогенез не-ходжкинских злокачественных лимфом. Так, для осуществления фолатного обмена очень важен нутритивный статус. Некоторые биологически активные компоненты пищи могут модулировать метилирование ДНК и предрасположенность к опухолям. Пищевые факторы, такие как витамины В12 и В6, фолиевая кислота, метионин и хо-лин, принимающие участие в одноуглеродном метаболизме, влияют на количество метальных групп и, следовательно, биохимические пути процессов метилирования, что позволяет предположить, что эффекты дефицита фолиевой кислоты на метилиро-. ванне ДНК являются очень сложными и зависят от типа клеток, органа-мишени и стадии трансформации, а также генов [Jacob R. A. et al., 1998; Trasler J. et al., 2003]. Действие генов второй фазы системы биотрансформации ксенобиотиков GSTM1 и GSTT1 может модифицироваться другими ферментами, например, семейства цито-хрома р450. Влияние данных полиморфизмов также опосредуется совместно со степенью экспрессии соответствующих ферментов в зависимости от вида ткани.

Таким образом, были исследованы полиморфизмы шести генов фолатного цикла MTHFR, MTR, MTRR, MTHFD1, SHMT1 и CBS и двух генов второй фазы системы биотрансформации ксенобиотиков GSTM1 и GSTT1 у пациентов с неходжкинскими злокачественными лимфомами. Полученные результаты позволили выявить различные патогенетические механизмы участия полиморфных локусов исследованных генов в развитии агрессивных и индолентных вариантов кеходжкинских злокачественных лимфом. Обнаружена большая частота изменений полиморфных вариантов генов фолатного цикла G1958A MTHFD1 и С1420Т SHMT1 при агрессивных лимфомах в сравнении с контрольными значениями и больными индолентными вариантами заболевшим. Полученные результаты свидетельствуют об отборе при данных вариантах лиц с нарушениями в полиморфных локусах генов MTHFD1 и SHMT1, что может быть связано с большим значением указанных изменений в быстро пролиферирую-щих опухолях. Литературные сведения тоже достаточно противоречивы и указывают

на то, что влияние однонуклеотидных замен в генах фолатного цикла опосредуется такими факторами как этническая принадлежность и нутритивный статуй. В связи с этим был проведен мета-анализ, направленный на обобщение большого количества данных по распределению аллелей и генотипов исследуемых полиморфизмов в генах фолатного цикла в различных популяциях, с целью выявления направленности действия того или иного локуса в отношении развития HX3JI. Делеция в гене GSTM1 ассоциирована с высоким риском развития фоликулярной лимфомы 1-го и 2-го цитологического типа. Опухолевый субстрат при индолентных HX3JI имеет низкую пролифе-ративную активность и полный блок апоптоза, связанный, в том числе, с мутациями в гене р 53, частота которых выше у носителей мутантных генотипов глутатион-S-трансфераз.

Таким образом, больные HX3JI являются не только морфологически неоднородной группой, но и значительно отличаются по генетическим характеристикам, а одной из причин вариабельности восприимчивости популяции к канцерогенным влияниям, а также механизмов опухолевой прогрессии HX3JI могут быть врожденные полиморфизмы генов фолатного цикла и системы биотрансформации ксенобиотиков.

ВЫВОДЫ

1. Распределение аллелей и генотипов ш> полиморфным локусам генов фолатного цикла MTHFR, MTR, MTRR, CBS и гена системы биотрансформации ксенобиотиков GSTT1 в группе пациентов с HX3JI соответствует популяционному.

2. У пациентов с HX3J1 частота мутантного 1958А-аллеля (42%) и гомозиготного А/А-генотипа (14%) полиморфного локуса MTHFD1 статистически значимо ниже в сравнении с контрольной группой (49,5 %, р < 0,017 и 25 %, р < 0,009 соответственно), что обуславливает сниженный риск развития HX3JI.

3. У больных агрессивными лимфомами мутантные 1958А-аллель (36%) и А/А-генотип (10 %) MTHFD1 встречаются реже по сравнению с контролем (49,5 %, р < 0,001 и 25%, р< 0,0008 соответственно) и ассоциируются со снижением риска развития агрессивных HX3JI, а доля лиц, несущих гомозиготный мутантный Т/Т-генотип полиморфного локуса SHMT1 выше, чем в контрольной группе: 18 % против 9 % (р < 0,02), что увеличивает риск развития агрессивных лимфом в 2,2 раза.

4. Делеционный генотип GSTM1 чаще встречается в группе пациентов с фолликулярными лимфомами по сравнению с контролем: 67 % против 40 % (р < 0,039) и повышает риск возникновения фолликулярных лимфом в 3,0 раза.

5.' Риск развития диффузной В-крупноклеточной лимфомы, в сравнении с по-пуляционным, снижен у лиц, несущих минорный 1958А-аллель и гомозиготный А/А-генотип полиморфного локуса MTHFD1, тогда как дикий 19580-аллель и G/G-генотип увеличивают риск развития ДВККЛ в 2,3 и 5,2 раз соответственно.

22

6. Мутантный 27560-аллель полиморфного локуса A2756G гена MTR ассоциируется со снижением риска развития HX3J1, что подтверждено результатами мета-анализа.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Статистически значимые различия в частоте аллелей и генотипов полиморфных

вариантов генов G1958A MTHFD1, С1420Т SHMT1, A2756G MTR и GSTM2 дают возможность использовать их в качестве факторов превентивной диагностики неход-жкинских злокачественных лимфом среди лиц, подвергающихся длительному воздействию неблагоприятных факторов внешней среды и имеющих случаи опухолевых заболеваний крови у близких родственников.

Преобладание 19580-аллеля гена MTHFD1 и 1420Т-аллеля гена SHMT1 у больных агрессивными вариантами неходжкинских лимфом, а также увеличение частоты делеционного генотипа GSTM1 у больных индолентными НХЗЛ позволяют оценить риск развития определенного вида заболевания и использовать данные локусы при проведении дифференциальной диагностики морфологических вариантов лимфом в лабораторной пракгихе и реактивных состояний иммунной системы, в частности у пациентов с лейкемоидными реакциями, в клинической практике.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Поспелова Т. И., Воропаева Е. Н., ВоеводаМ. И., Березина О. В. Полиморфизм гена р53 как потенциальный маркер предрасположенности к развитию неходжкинских злокачественных лимфом // Гематология и трансфузиология. - 2010. -Т. 55, № 1. - С. 11-17, автора - 0,2 п. л.

2. Березина О. В., Вайнер А. С., Поспелова Т. И., Воронина Е. Н., Филипенко М. Л. Ассоциация полиморфных вариантов генов фолатного цикла с риском развития индолентных и агрессивных лимфом // Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук- 2011. - Т. 31, № 2. - С. 20-25, автора-0,15 п. л.

3. Березина О. В., Вайнер А. С., Воропаева Е. Н., Воронина Е. Н., Поспелова Т. И., Филипенко М. Л. Влияние однонуклеотидных замен в генах фолатного цикла на риск развития агрессивных неходжкинских лимфом // Сибирское медицинское обозрение. - 2011. - № 3 - С. 22-26, автора - 0,1 п. л.

4. Weiner A. S., Beresina О. V., Voronina Е. N., Voropaeva Е. N., Boyarskih U. А., Pospelova T. I., Filipenko M. L. Polymorphisms in folate-metabolizing genes and risk of non-Hodgkin's lymphoma // Leukemia Research. - 2011. - № 35. - P. 508-515, автора -0,14 п. л.

5. Поспелова Т. И., ВоеводаМ. И., Воропаева Е. Н., Белявская В. А., Ковы-нев И. Б., Березина О. В. Функциональный полиморфизм гена р53 у больных неход-

23

жкинскими лимфомами II Вестник гематологии. - 2008. - Т. 4, №.4. - С. 23-28, автора -0,1 п. л.

6. Воевода М. И., Поспелова Т. И., Воропаева Е. Н., Березина О. В. Значение сочетанных нарушений в гене р53 и XRCC1 у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами // Гематология и трансфузиология. -2009.-Т. 54, № 1, —С. 28, автора-0,03 п. л.

7. Поспелова Т. И, Воевода М. И., Воропаева Е. Н., Березина О. В. Влияние сочетанных нарушений в генах р53 и XRCC1 у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами на прогноз // Вестник гематологии. - Санкт-Петербург, 2009. -Т. 5, № 2, 2009, стр. 35-36, автора - 0,063 п. л.

8. Березина О. В., Филипенко М. JL, Вайнер А. С., Воронина Е. П., Воропаева Е. Н. Исследование полиморфных вариантов генов фолатного цикла у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами // Вестник гематологии. - 2010. -Т. VI,№2.-С. 14-15,автора-0,05 п. л.

9. Воропаева Е. Н., Поспелова Т. И., Березина О. В., ВоеводаМ. И. Применение молекулярно-генетического подхода в прогнозировании выживаемости больных неходжкинскими лимфомами // Вестник гематологии. - 2010. - Т. VI, № 2. - С. 22-23, автора - 0,06 п. л.

10. КовыневИ. Б., Поспелова Т. И., Агеева Т. А., ДьячковаН.Ю., Скворцо-ва Н. В., Воропаева Е. Н., Березина О. В., Нечунаева И. Н., Лямкина А. С. Апоптоз и механизмы опухолевой прогрессии неходжкинских злокачественных лимфом // Фундаментальные и прикладные исследования в онкогематологии: материалы IV Всероссийской научно-практическойконференции // Бюллетень сибирской медицины. -2008. - Т. 7, № 3. - С. 26-32, автора - 0,1 п.л.

11. Поспелова Т. И., ВоеводаМ. И., Воропаева Е. Н., Белявская В. А., Ковы-нев И. Б., Березина О. В. Значение конституциональных полиморфизмов гена р53 у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами // Фундаментальные и прикладные исследования в онкогематологии : материалы IV Всероссийской научно-практической конференции Н Бюллетень сибирской медицины. - 2008. - Т. 7, № 3. -С. 56-62, автора - 0,15 п. л.

12. Поспелова Т. И., ВоеводаМ. И., Воропаева Е. Н., Березина О. В. Полиморфизм Arg399Gln гена XRCC1 и риск развития лимфом высокой степени злокачественности // Высокотехнологические методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов : материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием И Артериальная гипертензия. Приложение. - 2008. - Т. 14, № 1. - С. 108, автора - 0,03 п. л.

13. VoropaevaЕ. N., Pospelova Т. I., Voevoda М. I., Beresioa О. V. The role of р53

polymorphisms in non-Hodgkins lymphomas susceptibility and prognosis // Cellular therapy and transplantation. - St. Petersburg, 2009. - Vol. 2, № 5. - P. 128, автора - 0,06 п. л.

14. Березина О. В., Поспелова Т. И., Филипенко М. JL, ВайнерА. С., Воропаева Е. Н. Влияние полиморфных вариантов генов фолатного цикла на предрасположенность к развитию неходжкинских злокачественных лимфом // Генетика опухолей кроветворной системы : материалы I Всероссийского конгресса. - Ростов-на-Дону, 2010. - С. 23-24, автора- 0,05 п. л.

15. Воропаева E.H., Поспелова Т. И., ВоеводаМ. И., Березина О. В. Выживаемость больных лимфомами с изменениями в полиморфном локусе ARG72PRO гена Р53 // Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины : материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 50-летию ФГУ «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови ФБМА России» с международным участием. - Киров, 2010. - С. 208-209, автора -0,06 п. л.

16. Поспелова Т. И., Филипенко М. Л., Березина О. В., ВайнерА. С., Воропаева Е. Н., Воронина Е. Н. Исследование генетических полиморфизмов MTHFR и MTHFD у больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой // Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины : материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 50-летию ФГУ «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови ФБМА России» с международным участием. - Киров, 2010. - С. 269-270, автора - 0,04 п. л.

17. Березина О. В., ВайнерА. С., Поспелова Т. И., Воропаева Е. Н., Воронина E.H., Филипенко М. Л. Исследование ассоциации полиморфных вариантов генов фолатного цикла с предрасположенностью к развитию неходжюшской злокачественной лимфомы в Западно-Сибирском регионе России // Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии : материалы V региональной конференции молодых ученых-онкологов им. академика РАМН Н. В. Васильева // Сибирский онкологический журнал. Приложение 1. - Томск, 2010. - С. 24-25, автора - 0,04 п. л.

18. Поспелова Т. И., ВоеводаМ. И., Воропаева Е. Н., Белявская В. А., Ковы-нев И. Б., Скворцова Н. В., Березина О. В. Прогностическое значение сочетанных нарушений в гене Р53 и XRCC1 у больных НХЗЛ // Актуальные проблемы медицины. Клиника, диагностика и лечение воспалительных заболеваний в терапевтической практике : материалы второй городской научно-практической конференции врачей. -Новосибирск, 2008. - С. 151-153, автора- 0,036 п. л.

19. ВоропаеваЕ. Н., Поспелова Т. И., ВоеводаМ. И., КовыневИ. Б., Скворцова Н. В., Березина О. В., Штукерт А. В. Сочетанные нарушения в антионкогене Р53 у пациентов с НХЗЛ // Актуальные проблемы медицины. Клиника, диагностика и лече-

ние воспалительных заболеваний в терапевтической практике : материалы второй городской научно-практической конференции врачей. - Новосибирск, 2008. - С. 127129, автора- 0,063 п. л.

20. Поспелова Т. И., Воевода М. И., Воропаева Е. Н., Ковынев И. Б., Белявская В. А., Скворцова Н. В., Березина О. В. Олигонуклеотидные полиморфизмы генов р53 и хемокинового рецептора ССЯ5 при неходжкинских злокачественных лим-фомах // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике : сборник научных работ. - Выпуск 11.- Новосибирск : Альфа Виста, 2007. - С. 81-85, автора -0,1 п. л.

21. Поспелова Т. И., ВоеводаМ.И., Воропаева Е. Н., Белявская В. А., Ковынев И. Б., Березина О. В. Конституциональный полиморфизм гена р53 у больных не-ходжкинскими лимфомами // Фундаментальные науки - медицине : сборник трудов конференции. - Новосибирск, 2008. - С. 209-217, автора-0,2 п. л.

22. Березина О. В., Лямкина А. С. Клинико-лабораторные особенности В-мантийноклеточных лимфом и В-клеточных лимфом маргинальной зоны И Авиценна-2006 : материалы ежегодной конкурс-конференции студентов и молодых ученых.-Новосибирск, 2006. - С. 52-53, автора - 0,1 п. л.

23. Воропаева Е. Н., СметанниковаН. А., Скворцова Н. В., Березина О. В. Молекулярно-биологические аспекты опухолевой прогрессии неходжкинских лимфом // Авиценна - 2007 : материалы ежегодной конкурс-конференции студентов и молодых ученых. - Новосибирск, 2007. - С. 45-46, автора 0,06 п. л.

24. Березина О. В., Воропаева Е. Н., Кострыкина Н. А. Исследование полиморфных вариантов генов 08ТМ1, С8ТТ1 у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами П Авиценна - 2008 : материалы ежегодной конкурс-конференции студентов и молодых ученых. - Новосибирск, 2008. - С. 43-44, автора - 0,083 п. л.

25. Баранова Д. С., Березина О. В., Ковальчук С. Ю., Обгольц Ю. Н . Эффективность терапии Т-клеточных лимфом по данным Городского гематологического центра г. Новосибирска // Авиценна - 2008 : материалы ежегодной научно-практической конференции студентов и молодых ученых. - Новосибирск, 2008. - С. 42-43, автора -0,06 п. л.

26. Березина О. В., Вайнер А. С., Воропаева Е. Н., Воронина Е. Н. Изучение роли однонуклеотидной замены С1420Т БНМТ1 в развитии неходжкинских злокачественных лимфом // Авиценна-2011 : материалы П Российской (итоговой) конкурс-конференции студентов и молодых ученых. - Новосибирск, 2011. - С. 34-35, автора -0,06 п. л.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДВККЛ - диффузная В-крупноклеточная лимфома ДВМКЛ - диффузная В-мелкоклеточная лимфома KKJI - другие варианты агрессивных лимфом НХЗЛ- неходжкинские злокачественные лимфомы ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ПЦР - полимеразная цепная реакция ФЛ - фолликулярная лимфома OR - odd ratio (отношение шансов) C.I. - confidential interval (доверительный интервал)

Подписано к печати 26.05.2011 формат-60Х84 1/8,Усл. печ.л. 1,5

Бумага: офсетная Печать: трафаретная Тираж: 100 экз. Номер заказа № 520 Типография ООО "ЮГУС-ПРИНТ", ИНН 5402467637, г. Новосибирск, ул. Залесского, 4, тел.: (383) 226-14-56,225-04-47

Актуальность темы

Неходжкинские злокачественные лимфомы (HX3JI) - это гетерогенная группа опухолевых заболеваний, развивающихся их клеток. лимфоидной; ткани. Согласно классификации ВОЗ 2008 года, отдельные морфологические варианты НХЗЛ выделяются в соответствии с морфологией, имму но фенотипом,' генетическими маркерами и клиническими признаками. [Sabbalini Б. et al., 2010].

Новосибирская область, и город Новосибирск; входят в число административных территорий; неблагоприятных по заболеваемости , злокачественными^ новообразованиями,, в том; числе опухолями; крови-. Основная динамика роста1 обеспечивается лимфомами, среди которых ведущие позиции занимают неходжкинские злокачественные лимфомы. Причем;одна из особенностей этого вида; опухолей — высокий удельный вес лиц молодого трудоспособного возраста и детей (57,5% больных имеют возраст до 40 лет) [Ковынев И.Б. и др., 2006].

В настоящее время не вызывает сомнений, что процесс онкогенеза заключается в патологических изменениях сначала на молекулярном, а затем на клеточном уровне [Татосяш A.F., 2007], а предрасположенность к злокачественным новообразованиям и опухолевая прогрессия могут модифицироваться аллельными полиморфизмами генов [Зборовская И;Б., 2007; Ставровская А.А., 2007; Мушкамбаров®Н1,.2007].

В последние годы идентифицированы десятки полиморфных генов-кандидатов, которые могут принимать участие в формировании онкологического риска. Достаточно широко изучена роль полиморфных локусов MTHFR1, GSTM1, GSTT1 [Singh M:S. et al., 2009; Safari-nejad M.R. et al., 2010; Economopoulos K.P: et al., 2010] при солидных новообразованиях. Данные гены играют ключевую роль в таких процессах как синтез и метилирование ДНК, биотрансформация ксенобиотиков, а их полиморфизмы могут изменять свойства кодируемых белков, вызывать^ нестабильность генома, что в ряде случаев способствует предрасположенности носителей этих генов к развитию опухолей различной локализации, однако, роль данных полиморфизмов в патогенезе гемобластозов остается неизученной.

Ряд авторов указывают на то, что одни и те же аллели полиморфных локусов генов фолатного цикла и системы биотрансформации ксенобиотиков-могут иметь как проонкогенный, так и защитный эффект, в зависимости от этнической принадлежности популяции, типа ткани, из которой развивается^ опухоль и воздействия вредных факторов внешней среды [Баранов B.C., 2009]. По этой причине данные литературы по вопросу роли полиморфных вариантов ДНК в онкологическом риске и опухолевой прогрессии часто являются противоречивыми, а результаты отдельных работ обладают плохой воспроизводимостью [Зборовская И.Б., 2007], что создает невозможность механического переноса результатов, полученных зарубежными авторами на солидных опухолях, на опухоли крови.

Вместе с тем, изучение роли полиморфных вариантов генов фолатного цикла и системы биотрансформации ксенобиотиков в патогенезе гемобластозов является важным, так как снижение их функциональной t активности может быть связано с генетическими полиморфизмами.

Учитывая вышеизложенное, представляется значимым и перспективным исследование врожденных генетических полиморфизмов С677Т и А1298С гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), A2756G гена метионинсинтазы (MTR), A66G гена редуктазы-метионинсинтазы (MTRR), G195 8А гена метилентетрагидрофолатдегидрогеназы (MTHFD1), С1420Т гена серингидроксиметилтрансферазы (SHMT1), T833C/844ins68 цистатйонин-Р-синтазы (CBS), глутатион-8-трансфераз Т1 и Ml (GSTT1 и GSTM1) у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами с целью установления их роли в предрасположенности к развитию заболевания.

Цель работы: изучить полиморфные варианты генов ключевых ферментов фолатного цикла и второй фазы системы биотрансформации ксенобиотиков глутатион-8-трансфераз Т1 и Ml у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами и установить их связь с риском развития заболевания.

Задачи исследования:

1. Изучить распределение частот аллелей и генотипов полиморфных локусов генов фолатного цикла MTHFR, MTR, MTRR, MTHFD1, SHMT1, CBS и генов второй фазы системы биотрансформации ксенобиотиков GSTM1 и GSTT1 у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами города Новосибирска и оценить их ассоциацию с риском развития заболевания:

2. Проанализировать распределение частот аллелей и генотипов-данных полиморфных локусов у больных агрессивными и индолентными лимфомами и выявить их связь с риском развития заболевания.

3. Сравнить распределение частот аллелей и генотипов исследуемых полиморфизмов у больных в зависимости от иммуноморфологического варианта опухоли и оценить их влияние на предрасположенность к развитию-заболевания.

4. Провести мета-анализ, включающий полученные результаты по исследованным полиморфным локусам и данные других исследований.

Научная новизна

Впервые исследована частота полиморфных вариантов генов фолатного цикла С677Т и А1298С MTHFR, A2756G MTR, A66G MTRR, G1958A MTHFD1, С1420Т SHMT1, T833C/844ins68 CBS и генов второй фазы системы биотрансформации ксенобиотиков GSTT1 и GSTM1 у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами города Новосибирска, обнаружена ассоциация полиморфного локуса G1958A гена MTHFD1 со1 снижением риска развития HX3JI.

Проведен сравнительный анализ частот аллелей и генотипов указанных полиморфных локусов в группах агрессивных и индолентных лимфом, и доноров. Выявлено уменьшение частоты минорного 1958А-аллеля и гомозиготного А/А-генотипа MTHFD1 и увеличение частоты мутантного 1420Т/Т-генотипа SHMT1 в группе пациентов с агрессивными вариантами заболевания по сравнению с индолентными HX3JI и контролем.

Определены частоты полиморфных вариантов исследуемых генов в морфологически однородных подгруппах агрессивных и индолентных лимфом, показана генетическая неоднородность пациентов с HX3JI по данным полиморфизмам, свидетельствующая об уменьшении частоты мутантного 1298А аллеля и А/А-генотипа MTHFD1 в группе пациентов* с диффузной В-крупноклеточной лимфомой. Доказано увеличение частоты делеционного генотипа GSTM1 в группе пациентов с фолликулярными лимфомами 1-го и 2-го цитологического типов по сравнению с контролем.

Отмечено, что носители мутантного аллеля и генотипа полиморфного локуса G195 8А гена MTHFD1 характеризуются снижением риска развития диффузной В-крупноклеточной лимфомы, а делеционного генотипа GSTM1 - возрастанием риска развития фолликулярной лимфомы.

Обнаружена ассоциация однонуклеотидной замены A2756G в гене MTR со снижением риска развития неходжкинских злокачественных, лимфом* путем мета-анализа публикаций, включающего результаты настоящего исследования и данные литературы о распределении аллелей и генотипов и изучаемых полиморфных локусов генов фолатного цикла в различных популяционных выборках.

Практическая значимость

Результаты, полученные при исследовании полиморфных локусов генов фолатного цикла С677Т и А1298С MTHFR, A2756G MTR, A66G MTRR, G1958A MTHFD1, С1420Т SHMT1, T833C/844ins68CBS, и второй фазы системы биотрансформации ксенобиотиков GSTT1 и GSTM1 у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами города Новосибирска вносят вклад в современные представления о роли генетических изменений в патогенезе злокачественных заболеваний крови.

Учитывая, что полиморфные варианты генов G1958A MTHFD1, С142ОТ SHMT1, A2756G MTR и делеция в гене GSTM1 могут модулировать риск развития HX3JI, следует рекомендовать их в качестве дополнительных критериев при формировании групп повышенного риска по HX3J1, в частности, у лиц, имеющих длительный контакт с экзогенными канцерогенами или отягощенный семейный анамнез.

Обнаруженные различия в частоте аллелей и генотипов между группами больных диффузной В-крупноклеточной и фолликулярной лимфомами и контролем позволяют сформировать панель генов для оценки риска развития; и дифференциальной диагностики определенных морфологических вариантовНХЗЛ.

Путем* мета-анализа: проведена систематизация большого количества; данных по полиморфным локусам генов фолатного цикла, опубликованных в Международных: журналах и касающихся? разных популяций, что позволило выявить влияние полиморфного локуса A2656G гена MTR на риск развития нхзл;

Положения, выносимые на защиту:

1. Частота, встречаемости аллелей и генотипов полиморфных локусов SHMT1, MTHFD1 и GSTM1 различна при индолентных и агрессивных лимфомах: в группе агрессивных НХЗЛ выявлено увеличение частоты мутантного гомозиготного Т/Т генотипа SHMT1, а у пациентов с диффузной В-крупноклеточной лимфомой - снижение частоты мутантного 195 8А аллеля и- гомозиготного А/А генотипа MTHFD1 в сравнении с больными, индолентными лимфомами и контрольной группой; в то время как частота, делеционного генотипа GSTM1 выше у пациентов с фолликулярными лимфомами 1-го и 2-го цитологического типа по сравнению с другими группами НХЗЛ и контролем.

2. Полиморфный локус G1958А гена . MTHFD1 ассоциируется со снижением риска развития диффузной В-крупноклеточной лимфомы, а однуклеотидная замена С1420Т в гене SHMT1 и делеционный генотип GSTM1 - с увеличением риска агрессивных и фолликулярных лимфом соответственно.

3. Полиморфный локус A66G гена MTR ассоциируется со сниженным риском; развития неходжкинских злокачественных лимфом, что подтверждено результатами мета-анализа.

Апробация результатов исследования

Материалы исследования были представлены на конференциях студентов и молодых ученых «Авиценна» (г. Новосибирск, 2006, 2007, 2008, 2011), на научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы онкогематологии» (г.Новосибирск, 2008, 2010); на V региональной конференции молодых ученых-онкологов им. академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (г. Томск, 2010); на I Всероссийском конгрессе «Генетика опухолей кроветворной системы» (г. Ростов-на-Дону, 2010); на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 50-летию ФГУ «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови ФБМА России» с международным участием (г. Киров, 2010). х

Внедрение результатов исследования

Исследование генов фолатного цикла и системы биотрансформации ксенобиотиков у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами внедрено в практику работы гематологического отделения МБУЗ ГКБ №2 г. Новосибирска, в работу молекулярно-генетического* отдела AHO «Региональный центр высоких медицинских технологий», в работу группы фармакогеномики Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН. Материалы диссертации получили отражение в учебном процессе на кафедре терапии, гематологии и трансфузиологии ФГПС и ППВ НГМУ.

Публикации: по теме диссертации опубликовано>26 работ, в том числе 4' — в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК Минобрнауки России для публикаций основных результатов исследования.

Личный вклад автора:

Весь материал, представленный в диссертации, собран, обработан и интерпретирован лично автором.

Автор выражает глубокую благодарность научным руководителям д.м.н., профессору Поспеловой Т.И. и к.б.н. Филипенко М.Л. за неоценимую помощь, чуткое руководство, методические рекомендации к диссертации; искреннюю признательность сотрудникам лаборатории Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН за помощь в работе над исследованием. Автор благодарит врачей отделения МБУЗ ГКБ №2 во главе с заведующей, к.м.н. Нечунаевой И.Н. за помощь в наборе материала и содействие в работе с пациентами, сотрудников кафедры терапии, гематологии и трансфузиологии ФПК и ППВ за активную поддержку и помощь в оформлении документов.

12

выводы

1. Распределение аллелей и генотипов по полиморфным локусам генов фолатного цикла MTHFR, MTR, MTRR, CBS и гена системы биотрансформации ксенобиотиков GSTT1 в группе пациентов с HX3J1 соответствует популяционному.

2. У пациентов с HX3JI частота мутантного 1958А-аллеля (42%) и гомозиготного А/А-генотипа (14 %) полиморфного локуса MTHFD1 статистически значимо ниже в сравнении с контрольной группой (49,5 % , р< 0,017 и 25%, р < 0,009 соответственно), что обуславливает сниженный риск развития HX3JI.

3. У больных агрессивными лимфомами мутантные 1958А-аллель (36%) и А/А-генотип (10%) MTHFD1 встречаются реже по сравнению с контролем (49,5 %, р < 0,001 и 25 %, р < 0,0008 соответственно) и ассоциируются со снижением риска развития агрессивных HX3JI, а доля лиц, Ь-несущих гомозиготный мутантный Т/Т-генотип полиморфного локуса SHMT1 выше, чем в контрольной группе: 18% против 9% (р < 0,02), что увеличивает риск развития агрессивных лимфом в 2.2 раза.

4. Делеционный генотип GSTM1 чаще встречается в группе пациентов г ч с фолликулярными лимфомами по сравнению с контролем: 67 % против 40 % (р < 0,039) и повышает риск возникновения фолликулярных лимфом в 3 раза.

5. Риск развития диффузной В-крупноклеточной лимфомы, в сравнении с популяционным, снижен у лиц, несущих минорный 1958А-аллель и гомозиготный А/А-генотип полиморфного локуса MTHFD1, тогда как дикий 19580-аллель и G/G-генотип увеличивают риск развития ДВККЛ в 2,3 и 5,2 раз соответственно.

6. Мутантный 2756С-аллель полиморфного локуса A2756G гена MTR ассоциируется со снижением риска развития НХЗЛ, что подверждено ■ ' результатами мета-анализа.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Статистически значимые различия в частоте аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов G1958A MTHFD1, С1420Т SHMT1, A2756G MTR и GSTM1 дают возможность использовать их в качестве факторов превентивной диагностики неходжкинских злокачественных лимфом среди лиц, подвергающихся длительному воздействию неблагоприятных факторов внешней среды и имеющих случаи опухолевых заболеваний крови у близких родственников.

Преобладание 1958С-аллеля гена MTHFD1 и 1420Т-аллеля гена SHMT1 у больных агрессивными вариантами неходжкинских лимфом, а также увеличение частоты делеционного генотипа GSTM1 у больных индолентными НХЗЛ позволяют оценить риск развития определенного вида заболевания и использовать данные локусы при проведении дифференциальной диагностики морфологических вариантов лимфом в лабораторной практике и реактивных состояний иммунной системы, в частности у пациентов с лейкемоидными реакциями, в клинической практике.