Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Генетический полиморфизм тиопуринметилтрансферазы (ТПМТ) у детей с острыми лейкозами, жителей Российской Федерации

На правах рукописи

Чупова Наталья Вадимовна

Генетический полиморфизм тиопуринметилтрансферазы (ТПМТ) у детей с острыми лейкозами, жителей Российской Федерации

14.00.29 Гематология и переливание крови 14.00.09 Педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва, 2004

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте Детской гематологии Минздрава Российской Федерации (директор ГУ НИИ Детской гематологии - член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор А.Г. Румянцев).

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Е.В. Самочатова Научный консультант:

доктор химических наук, профессор Е.Ю. Крынецкий

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, О.А. Майрова Доктор медицинских наук, профессор В.М. Делягин Ведущее учреждение:

НИИ педиатрии Научного центра здоровья детей РАМН

Защита диссертации состоится '21 200^~в ( час, на заседании

Диссертационного совета Д 208.050.01 в ГУ НИИ Детской гематологии Минздрава Российской Федерации (117997, Москва, Ленинский проспект, 117)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ Детской гематологии

Автореферат разослан

/

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

В.М. Чернов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Показатель долгосрочной выживаемости детей с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) в настоящее время достиг 80%, что свидетельствует об эффективности риск-адаптированной терапии, применяемой в современных протоколах лечения как в западных клиниках (Pui CH et al., 2004), так и в нашей стране (А.И. Карачунский, 1999). Основной причиной неудач в терапии ОЛЛ по-прежнему остается рецидив заболевания (Schrappe М, 2004, Pui CH et al., 2004). Инфекции остаются серьезным осложнением терапии ОЛЛ и после рецидива являются второй самой частой причиной смерти детей с ОЛЛ. Кроме того, многие дети, излеченные от ОЛЛ, имеют поздние осложнения терапии. Современные направления развития детской лейкозологии включают оптимизацию использования существующих антилейкемических препаратов, раннее выявление факторов риска рецидива заболевания и фармакогенетических характеристик пациента, чтобы избежать применения недостаточно эффективной или, наоборот, излишне интенсивной терапии (Pui CH et al., 2001).

Тиопуринметилтрансфераза (ТПМТ) катализирует основной путь инактивации тиопуриновых препаратов, к которым относятся 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин и азатиоприн (Krynetski EY, Evans WE, 2003). 6-меркаптопурин (6-МП) и 6-тиогуанин (6-ТГ) широко используются в современных протоколах терапии острых лейкозов и лимфобластных лимфом. Активность ТПМТ определяется генетическим полиморфизмом и наследуется по аутосомному кодоминантному признаку. По данным зарубежной литературы около 10% людей в популяции, гетерозиготных по локусу гена ТПМТ, имеют среднюю активность фермента, тогда как 0,33% (т.е. 1 на 300 человек в популяции) являются гомозиготными носителями недостаточности ТПМТ (McLeod HL et al., 1994). Терапия 6-МП, 6-ТГ и азатиоприном в стандартных дозах больных с недостаточностью ТПМТ приводит к развитию длительной глубокой миелосупрессии и присоединению тяжелых, нередко фатальных, инфекционных осложнений (Evans WE et al., 1991; Lennard L et al., 1989, 1993). Напротив, успешные случаи излечения пациентов с недостаточностью ТПМТ наблюдали у детей с ОЛЛ, которые получали редуцированные дозы 6-МП, составляющие 6-10% от стандартной дозы препарата (Evans WE et al., 1991; Lennard L et al., 1993, 1997). Кроме того, больные OJ1J1 с низкой активностью ТПМТ_имеют повышенный риск развития

лекарственно-индуцируемых вторичных опухолей (Relling MV et al., 1998, 1999b; Thomsen JB et al., 1999).

В настоящее время идентифицированы более 10 мутантных аллелей гена ТПМТ, кодирующих фермент со сниженной активностью. Установлена более чем 95% конкордантность между генотипом и фенотипом ТПМТ (Yates CR et al., 1997). По данным популяционных исследований, проведенных в различных странах мира, наиболее часто встречаются мутации ТПМТ2, ТПМТ*ЗА и ТПМТ*ЗС, которые отличаются в распределении по основным этническим группам (McLeod HL et al., 2000). В России подобных исследований не проводилось.

С целью обнаружения инактивирующих мутаций гена ТПМТ применяется метод, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР), который является более точным и надежным по сравнению с радиохимическим методом определения эритроцитарной активности ТПМТ, и исключает получение ложных результатов в зависимости от гемотрансфузий (Yates CR et al., 1997) и приема 6-МП (Lennard L et al., 1990; McLeod HL et al., 1995). Применение молекулярных методов с целью проспективной диагностики недостаточности ТПМТ предлагает клинически важную стратегию минимизации риска возможных жизненно угрожающих состояний у пациентов, получающих терапию тиопуринами (Krynetski EY. Evans WE, 2000).

Актуальность настоящего исследования обусловлена определением частоты встречаемости мутантных аллелей ТПМТ в когорте детей с гемобластозами, жителей Российской Федерации, и идентификацией пациентов с генетическим дефектом ТПМТ, что позволяет оптимизировать терапию тиопуринами: уменьшить токсичность терапии и избежать необоснованного снижения дозы или отмены других химиопрепаратов, что повысит эффективность терапии в рамках установленного протокола.

Цель исследования: определить характер и частоту встречаемости мутантных аллели гена ТПМТ у детей с острыми лейкозами и неходжкинскими лимфомами и сравнить эффективность и токсичность терапии 6-меркаптопурином у больных с ОЛЛ в зависимости от генотипа ТПМТ.

Задачи исследования 1. Определить встречаемость гомозиготных и гетерозиготных пациентов, несущих мутации гена ТПМТ и гомозиготных пациентов "дикого типа" в когорте больных с гемобластозами.

2. Провести сравнительный анализ частоты встречаемости пациентов с генетическим дефектом ТПМТ в группах детей с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) и острым миелобластным лейкозом (ОМЛ).

3. Оценить, существует ли корреляция между мутацией гена ТПМТ и определенными биологическими характеристиками опухолевых клеток при ОЛЛ и ОМЛ (морфологией, иммунофенотипом и наличием хромосомных аберраций).

4. Провести сравнительный анализ гематологической токсичности 6-МП в группе больных ОЛЛ в зависимости от наличия или отсутствия мутации гена ТПМТ и исследовать влияние генотипа ТПМТ на переносимость тиопуринов.

5. Сравнить кривые безрецидивной выживаемости пациентов с генетическим дефектом ТПМТ и пациентов "дикого типа" в группе больных ОЛЛ.

6. Внедрить в клиническую практику оригинальный метод идентификации мутаций гена ТПМТ, основанный на применении олигонуклеотидных микрочипов.

Научная новизна

В настоящем исследовании впервые получены данные о генетическом полиморфизме ТПМТ в когорте детей с гемобластозами, которые являются жителями РФ, а также о характере и частоте встречаемости мутантных аллелей гена ТПМТ. Показано, что результаты исследований, проведенных в нашей стране и среди жителей белой расы США и Европы, не различались.

Впервые проведено фармакогенетическое исследование в группе пациентов РФ с ОЛЛ, которое показало, что индивидуальные различия в переносимости и эффективности препарата 6-МП являются генетически обусловленными. Больные, гетерозиготные по генному локусу ТПМТ характеризовались сниженной способностью толерировать 6-МП и развивали выраженную миелосупрессию, несмотря на применение дозы 6-МП, которая на 30% ниже дозы 6-МП, используемой в западных протоколах. Терапия 6-МП оказалась эффективнее в группе гетерозиготных пациентов, в которой наблюдалась более низкая частота рецидивов по сравнению с пациентами "дикого типа".

Впервые получены результаты сравнительного анализа частоты встречаемости пациентов с мутацией гена ТПМТ в группах детей с ОЛЛ и ОМЛ. Показана одинаковая частота встречаемости гетерозиготных пациентов среди больных ОЛЛ и ОМЛ.

В настоящей работе впервые выявлена корреляция встречаемости t(12;21)TEL/AML1 в лейкемических клетках с мутацией гена ТПМТ у больных ОЛЛ, что не представлено в зарубежной литературе.

Впервые в мировой практике апробирован новый генотипический метод, основанный на использовании ТПМТ-микрочипов, в структуру которых входят наиболее часто встречающиеся мутации гена ТПМТ. Данный метод молекулярной диагностики пациентов с генетическим дефектом ТПМТ, разработанный в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, позволяет проводить скрининговое обследование пациентов.

Научно-практическая значимость

Проведенное исследование показало, что около 10% пациентов с гемобластозами, жителей РФ, которым планируется терапия 6-МП или 6-ТГ, имеют повышенный риск тиопуриновой токсичности вследствие наследственного дефицита ТПМТ.

Проведенное сравнительное исследование тиопуриновой токсичности в группе больных ОЛЛ в зависимости от наличия или отсутствия мутации гена ТПМТ позволило выявить более высокую гематологическую токсичность 6-МП у гетерозиготных больных с генетическим дефектом ТПМТ, которая также препятствовала проведению адекватной терапии метотрексатом. На основании этих данных с целью предотвращения токсичности рекомендуется у пациентов с генетическим дефектом ТПМТ использование редуцированных доз 6-МП при сохранении полной протокольной дозы метотрексата и других антилейкемических препаратов.

Показано, что безрецидивная выживаемость гетерозиготных пациентов с ОЛЛ выше по сравнению с гомозиготными пациентами "дикого типа". Однако присутствие дополнительных неблагоприятных факторов, например, хромосомной аберрации t(9;22)BCR/ABLp190, может ухудшить прогноз заболевания у больных с мутацией гена ТПМТ.

Апробирован оригинальный метод молекулярной диагностики, основанный на применении ТПМТ-биочипов, который показал свою эффективность и рекомендуется для внедрения в практику с целью выявления больных с мутаций

гена ТПМТ и коррекции терапии тиопуриновыми препаратами в онкогематологии, в трансплантологии солидных органов, а также при лечении аутоиммунных заболеваний.

Организация исследования.

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте детской гематологии МЗ РФ (директор ГУ НИИ ДГ МЗ РФ - член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор А.Г.Румянцев) на базах отделений гематологии/онкологии Российской детской клинической больницы МЗ РФ (главный врач - проф.Н.Н. Ваганов), Морозовской детской клинической больницы (главный врач - проф.МА Корнюшин), Московского областного онкологического диспансера г. Балашихи (главный врач - к.м.н. И.Ф.Савкова). Выделение и хранение ДНК пациентов проводилось в лаборатории эпигенетики Медико-генетического научного центра РАМН - зав. лаборатории доктор биологичексих наук, проф. Д.В. Залетаев.

Изготовление ТПМТ-микрочипов, разработка метода и проведение генотипирования пациентов происходило в центре биологических микрочипов Института молекулярной биологии им. ВАЭнгельгардта (директор ИМБ РАН -академик РАН, доктор химических наук, профессор | А.Д.Мирзабеков}), руководитель центра доктор физико-технических наук А.С. Заседателев, руководитель группы по разработке и тестированию ТПМТ-биочипов - кандидат биологических наук Т.В. Наседкина.

Исследование поддержано грантом Исследовательского Госпиталя Св.Иуды, Мемфис, США (St.Jude Children's Research Hospital).

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы доложены на IX российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, 8-12 апреля 2002г; на III съезде онкологов и радиологов СНГ (Республика Беларусь, Минск, 25-28 мая 2004г); на XXVI конференции "Лейкозы и лимфомы" Гематологического научного центра РАМН, 28 июня 2004г.

Диссертация апробирована на совместной научно-практической конференции сотрудников ГУ НИИ Детской гематологии и Российской Детской Клинической Больницы 7 сентября 2004 года. По результатам диссертации опубликовано 3 работы.

Структура и объём диссертации.

Материал диссертации изложен на страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания пациентов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, приложения, библиографического указателя, включающего 5 работ отечественных и 98 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 38 таблицами, 30 рисунками и 2 клиническими примерами. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Характеристика патентов

В настоящем исследовании проведен анализ результатов генотипирования 280 пациентов с гемобластозами. Из них с диагнозом ОЛЛ было 174 больных, с ОМЛ - 41, с рецидивом ОЛЛ - 39, с рецидивом ОМЛ - 7 и с неходжкинскими лимфомами (в том числе 3 больных с В-ОЛЛ) -1 9 пациентов. Биологический материал (кровь или костный мозг) пациентов предоставили клиники НИИ детской гематологии за период с 20 октября 2001 года по 29 апреля 2004 года:

• отделение онкогематологии и полихимиотерапии Российской детской клинической больницы МЗ РФ (РДКБ) г.Москвы - зав. отделением Литвинов ДВ.

• отделение общей гематологии Российской детской клинической больницы МЗ РФ (РДКБ) г.Москвы - зав. отделением Масчан М.А.

• отделение онкогематологии Российской Детской Клинической Больницы МЗ РФ (РДКБ) г.Москвы - зав. отделением к.м.н. Тюкалова Н.Р.

• отделение гематологии Морозовской детской городской клинической больницы (МДГКБ) г.Москвы - зав. отделением к.м.н. Кондратчик К.Л.

а отделение детской онкогематологии Московского областного онкологического диспансера (МООД) г.Балашихи - зав. отделением к.м.н. Варфаломеева СР. Критерии включения пациентов с гемобластозами в анализ Критерии включения пациентов в исследование:

> Возраст пациента от 0 до 18 лет

> Пациенты с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), острым миелобластным лейкозом (ОМЛ) и неходжкинскими лимфомами (НХЛ), независимо от периода болезни: первично диагностированные, на

терапии и после её отмены, которые получают лечение или наблюдаются в вышеуказанных клиниках НИИ ДГ

> Пациенты с рецидивом ОЛЛ и ОМЛ , независимо от периода болезни: до начала терапии, на терапии или после её отмены, которые получают лечение или наблюдаются в клиниках НИИ ДГ

> Диагнозы ОЛЛ, ОМЛ, НХЛ, инициальные и в рецидиве, подтверждены данными морфологического и иммуноцитологического/ иммуногистохимического анализа опухолевых клеток.

Критерии забора биологического материала (периферической крови или костного мозга):

> Наличие в периферической крови пациента лейкоцитов > 2000/мкл на момент забора биологического материала

> Подписание информированного согласия об участии в исследовании больного родителями (опекунами) пациента

Метод генотипирования пациентов

Определение мутаций в гене ТПМТ осуществляли методом мультиплексной ПЦР и гибридизации с микрочипом. Образцы ДНК получены из лейкоцитов периферической крови и/или костного мозга методом фенол-хлороформной экстракции. Процесс генотипирования образцов ДНК пациентов состоял из трёх этапов: проведение двухраундовой мультиплексной ПЦР, гибридизация с ТПМТ-микрочипом, регистрация и обработка полученных результатов. ТПМТ-биочипы изготовлены по оригинальной методике ИМБ РАН. ТПМТ-микрочип представляет собой упорядоченную матрицу из 24 ячеек полиакриламидного геля, помещенных на стеклянную пластину. В трехмерных ячейках находятся олигонуклеотидные зонды, комплементарные определенным участкам последовательности гена ТПМТ. Схема ТПМТ-биочипа показана на рис.1. Для надежности применения математических алгоритмов каждая ячейка дублирована. Олигонуклеотидные зонды обозначены названием соответствующих мутантных позиций в гене ТПМТ.

1 2 3 4 5 6

G238 G292 G460 G644 Т681 А719

G238 G292 G460 G644 I Т681 А719

V -7Vwr --*»>- • я'ГЛ'ОД-

Рисунок 1. Схема ТПМТ-биочипа. Ячейки белого цвета соответствуют олигонуклеотидам, комплементарным последовательностям "дикого типа". Ячейки серого цвета соответствуют олигонуклеотидам, комплементарным мутантным последовательностям.

Анализ изображения проводили на портативном анализаторе микрочипов с программным обеспечением Imageware™ (Чипдетектор, "Биочип-ИМБ", Россия). Производилась визуальная оценка изображения, выбор наиболее ярких элементов чипа в каждой группе, составляющей нормальный и мутантный олигонуклеотиды для каждой позиции биочипа и сравнение со схемой биочипа. Результаты количественной оценки интенсивности флуоресцентного сигнала представлялись в программе Excel 7, где также происходило построение гистограмм интенсивности флуоресцентных сигналов. Делался вывод о том, какой вариант последовательности ДНК (нормальный или мутантный) присутствовал в клиническом образце. Результаты являлись основанием для определения ТПМТ-генотипа. С помощью разработанного ТПМТ-микрочипа было возможно идентифицировать 7 мутантных аллелей, содержащих одну, две или три точечных мутаций, которые располагаются в 5, 7 и/или 10 экзонах гена ТПМТ и 1 нормальный аллель, т.н. аллель "дикого типа" (табл. 1).

Таблица 1. Аллели гена ТПМТ

№ Вариант аллеля Точечные мутации в аллеле Экзон

1 ТПМГ1 "дикий тип" —

2 ТПМГ2 G238C 5

3 ТПМГЗА G460A и A719G 7иЮ

4 ТПМГЗВ G460A 7

5 ТПМТ*ЗС A719G 10

6 тпмгзэ G292T И G460A И A719G 5, 7 и 10

7 ТПМГ7 T681G 10

8 ТПМГ8 G644A 10

Определение событий для пациентов с ОЛЛ

Ремиссию констатировали при наличии в костномозговом пунктате менее 5% бластных клеток при полиморфной цитологической картине костного мозга, нормальном анализе крови и отсутствии экстрамедуллярных проявлений лейкемии. Смерть в индукции определялась как смерть, наступившая в индукции при отсутствии ремиссии. Смерть в ремиссии - смерть, наступившая после достигнутой ремиссии при продолжении терапии. Рефрактерными к терапии (nonresponder) считали пациентов, не достигнувших ремиссии к 36 дню терапии по программе ОЛЛ-МВ-91 или после 3-го блока терапии для больных группы высокого риска, согласно протоколам ОЛЛ-МВ-2002 и ОЛЛ-БФМ-90. Пациент считался выбывшим из-под наблюдения (Lost-to- follow up, LFU) при отсутствии информации о нем более года. Рецидив - появление бластов в костном

мозге и/или периферической крови, и/или лейкемическая инфильтрация любой другой локализации, после констатации ремиссии. Вторая опухоль -возникновение любой другой злокачественной опухоли после достижения полной ремиссии. Безрецидивная выживаемость (Relapse free survival, RFS) -вероятность выживаемости от момента достижения полной ремиссии до рецидива заболевания.

Включение пациентов с ОЛЛ в анализ токсичности 6-меркаптопурина Сравнительный анализ гематологической токсичности 6-МП проведен ретроспективно у 59 больных ОЛЛ в ремиссии на этапе консолидирующей терапии. В данный анализ включены пациенты, получавшие программную терапию по протоколам ОЛЛ-МБ-91 или ОЛЛ-МБ-2002 для стандартной группы риска, где доза 6-МП составляет 50мг/м2/сут. Этап консолидации ремиссии в указанных терапевтических протоколах для пациентов стандартного риска состоит из ежедневного перорального приема 6-МП в дозе 50мг/м2 и еженедельного парентерального введения метотрексата в дозе 30мг/м2 параллельно с еженедельным введением аспарагиназы в дозе 10000ЕД/м2 внутримышечно, которые прерываются реиндукционными курсами, включающими винкристин + дексаметазон (рис. 2). Длительность консолидации составляет 24 недели. Обязательным условием проведения консолидации и поддерживающей терапии является своевременная коррекция дозировки 6-МП и метотрексата в зависимости от количества лейкоцитов.

Рисунок 2. Консолидация для больных ОЛЛ группы стандартного риска по протоколу МБ-91.

Анализ результатов генотипирования пациентов с гемобластозами В зависимости от генотипа ТПМТ проведено сравнение групп по полу, диагнозу (ОЛЛ, ОМЛ, ОЛЛРЕЦ, НХЛ), по морфологическому варианту лейкоза (FAB-классификация), результатам иммунофенотипирования и молекулярно-генетического исследования бластных клеток. Определены характер и частота встречаемости мутантных аллелей ТПМТ в когорте пациентов с гемобластозами. Также проведен анализ характера и частоты встречаемости мутантных аллей гена ТПМТ в зависимости от расы и этнической группы. Анализ токсичности 6-МП у пациентов с ОЛЛ

Для проведения сравнительной оценки токсичности 6-МП в 2-х группах пациентов с гетерозиготным генотипом и гомозиготным "диким типом" ТПМТ на этапе консолидирующей терапии были проанализированы следующие параметры: 1. Толерантность 6-МП

Продолжительность выполнения этапа консолидации (в неделях) Средняя толерируемая доза 6-МП в неделю (мг/м2/нед) в процессе консолидации Период, в течение которого терапия 6-МП не проводилась (в неделях и % от длительности консолидации)

Время в ходе консолидации, когда отменялась терапия 6-МП, вследствие агранулоцитоза (в процентах от периода консолидации)

Время в ходе консолидации, когда требовалась редукция дозы 6-МП (<50мг/м2/сут), в процентах по отношению к продолжительности всего периода консолидации.

Время в ходе консолидации, когда больные получали полные дозы 6-МП (£50мг/м2/сут), в процентах по отношению ко всему периоду консолидации.

2. Гематологическая токсичность

Общая длительность агранулоцитоза (гранулоциты<500/мкл) в неделях Количество эпизодов анемии (Нв<80г/л)

Количество эпизодов тромбоцитопении (тромбоциты<30тыс/мкл) Суммарное количество трансфузий, приходящихся на одного больного Количество инфекционных эпизодов, приходящихся на одного больного Количество инфекционных эпизодов й2 степени тяжести, приходящихся на одного больного, согласно критериям ВОЗ.

Критерии ВОЗ: 0 - отсутствие инфекции, 1 - легкая форма инфекции, 2 -инфекция средней тяжести, требующая внутривенного назначения антибиотиков, возбудитель неизвестен, 3 - тяжелая инфекция, возбудитель известен, 4 -жизненно угрожающая инфекция с гипотонией. Анализ эффективности лечения 6-МП у пациентов с ОЛЛ

В данный анализ включены первичные пациенты с ОЛЛ, которым проводилась терапия по протоколам ОЛЛ-МБ-91 и ОЛЛ-МБ-2002. Результаты терапии больных ОЛЛ в зависимости от наличия или отсутствия мутации гена ТПМТ оценивались по кривым безрецидивной выживаемости. Из анализа исключены пациенты, получающие лечение по протоколу ОЛЛ-БФМ-90, который в отличие от протоколов МБ-91/2002 содержит другие режимы терапии 6-МП на этапе консолидации ремиссии, и пациенты, которым проводилась непрограммная терапия.

Статистические методы

Анализ оцениваемых показателей у детей с гемобластозами проведен по данным клинической работы и историям болезни с учетом результатов ТПМТ-генотипирования пациентов. Анализ достоверности различий по процентному сооотношению пациентов с генетическим дефектом ТПМТ и пациентов "дикого типа" проводился с помощью непараметрических критериев, таких как, х2-квадрат (критерий Фишера), критерий Манна-Уитни, медианный критерий. Кривые безрецидивной выживаемости (RFS) построены по методу Каплана-Майера. Для сравнения кривых выживаемости использовался Log-rank критерий. Данные считались статистически достоверными при значении р<0,05. Анализ результатов проводился с использованием программы для статистической обработки данных STATISTICA for Windows 6.0.

Результаты исследования Результаты генотипирования пациентов

Определение мутаций в гене ТПМТ методом мультиплексной ПЦР и гибридизации на микрочипе проведено у 280 пациентов с гемобластозами, 165 мальчиков и 115 девочек. Возраст пациентов на момент взятия крови/костного мозга составил от 2 мес до 17 лет 7 мес (медиана 7 лет 9 мес). По данным результатов генотипирования среди 280 больных был обнаружен 21 пациент, гетерозиготный по локусу гена ТПМТ (7,5%) и 259 (92,5%) гомозиготных пациентов "дикого типа". Гомозиготные пациенты с генетическим дефектом ТПМТ не были идентифицированы (табл. 2).

Таблица 2. Генотипы ТПМТ у пациентов с гемобластозами

Общее число больных wt/wt* wt/mut* mut/mut*

Пациенты с гемобластозами 280(100%) 259 (92,5%) 21 (7,5%) 0

95% СГ — 90,3 - 94,7 5,3 - 9,7 0

*wt/Wt - гомозиготный "дикий тип"; wl/mut - гетерозиготный мутантный генотип; mut/mut - гомозиготный мутантный генотип ТПМТ;

**95% С1 - доверительный интервал (%).

При распределении гетерозиготных больных по полу соотношение мальчики/девочки составило 2/1, а среди пациентов "дикого типа" -1,4/1 (табл. 3). Процент мальчиков с гетерозиготным генотипом ТПМТ был несколько выше по сравнению с девочками, но статистически недостоверно (8,6% и 6,1% соответственно, р=0,3055, критерий Фишера).

Таблица 3. Распределение пациентов с гемобластозами по полу в зависимости от генотипа ТПМТ

-^Генотип ТПМТ пол Гетерозиготные пациенты п =21 Пациенты "дикого типа" п =259 Всего п =280

Мальчики 14 (8,5%) 151 (91,5%) 165 (100%)

Девочки 7(6,1%) 108(93,9%) 115(100%)

Соотношение мальчики/девочки 2/1 1,4/1 1,4/1

Среди гетерозиготных пациентов с мутацией гена ТПМТ наблюдалось следующее распределение по нозологическим группам: 14 больных с ОЛЛ, 3 с ОМЛ, 2 с НХЛ и 2 больных с рецидивом ОЛЛ. Распределение пациентов с гемобластозами в зависимости от генотипа ТПМТ представлено в табл. 4.

Таблица 4. Распределение пациентов по нозологическим группам в зависимости от генотипа ТПМТ

Диагноз Всего Пациенты "дикого типа" Гетерозиготные пациенты

ОЛЛ 174 160(92,0%) 14 (8,0%)

ОЛЛРЕЦ 39 37 (94,9%) 2(5,1%)

ОМЛ 41 38 (92,7%) 3 (7,3%)

ОМЛРЕЦ 7 7(100%) 0

НХЛ 19 17(89,5%) 2(10,5%)

Итого 280 259 (92,5%) 21 (7,5%)

Частота встречаемости пациентов с гетерозиготным генотипом ТПМТ в группе больных с НХЛ составила 10,5%. Гетерозиготные пациенты с ОЛЛ и ОМЛ по частоте встречаемости не отличались (8,0% и 7,3% соответственно, р=0,5875). Низкая встречаемость гетерозиготных пациентов выявлена в группе больных с рецидивом ОЛЛ (5,1%). При сравнении этих групп между собой методом х2-квадрат, используя критерий Фишера, статистически достоверных различий получено не было. Среди пациентов с рецидивом ОМЛ мутаций не обнаружено при малом числе больных (п=7). Идентификация аллелей гена ТПМТ

Результаты идентификации аллелей с помощью ТПМТ-микрочипа у различных пациентов представлены на рисунках 3,4 и 5.

Среди 21 гетерозиготного пациента идентифицировано 18 больных с мутантным аллелем ТПМТ*ЗА, 2 больных с ТПМТ*ЗС и 1 больной с ТПМТ*2 (табл. 5). Аллель ТПМТ*ЗА оказался самым частым мутатным аллелем (85,7%), встречающимся у пациентов с гемобластозами. Аллель ТПМТ*ЗС составил 9,5%, а ТПМТ*2 был самым редким аллелем (4,8%). Другие мутантные аллели ТПМТ (*ЗВ, *3D, *7 и *8) не выявлены.

Вариант аллеля п % аллеля [95% С1]

ТПМ*2 1 4,8% [0-13,9%]

ТПМ*ЗА 18 85,7% [70,7-100%]

ТПМ*ЗС 2 9,5% [0-22,1%]

Всего 21 100%

а.

Б2 83 Б4

12 3

Э © #

б.

3

4 2,5

И- 1 ! ■

5: «

■ а

Д 1

я % о*

С138С С292Т С460А С644Л ТОЮ А719С

Рисунок 3. Идентификация гомозиготного пациента "дикого типа" (ТПМТ*1/*1) с помощью биочипа, (а) Полученное изображение микрочипа, (б) гистограмма распределения интенсивности флуоресцентных сигналов после их количественной обработки (рисунок предоставлен О.Е.Фёдоровой).

Рисунок 4. Идентификация гетерозиготного пациента с генотипом *1/*ЗА на ТПМТ-биочипе. (а) Полученное изображение биочипа и (б) гистограмма распределения интенсивности флуоресцентных сигналов после их количественной обработки (рисунок предоставлен О.Е.Фёдоровой).

Рисунок 5. Идентификация гетерозиготного пациента с генотипом *1ГЗС на ТПМТ-биочипе. (а) Полученное изображение биочипа и (б) гистограмма распределения интенсивности флуоресцентных сигналов после их количественной обработки.

В табл. 6 представлены результаты оценки частоты встречаемости аллелей ТПМТ в когорте пациентов с гемобластозами. Частота каждого аллеля определялась как процент от суммарного количества аллелей в популяции. Таким образом, общая частота встречаемости мутантных аллелей ТПМТ составила 3,7%, причем аллель ТПМТ*ЗА представляет 3,2% в данной когорте больных.

Таблица 6. Частота встречаемости аллелей ТПМТ в когорте пациентов с гемобластозами

Вариант аллеля Количество аллелей (п) Частота встречаемости аллеля(%) 95% С1

Общее число аллелей 560 —

ТПМ*2 1 0,18 0-5,3

ТПМ*ЗА 18 3,2 1,7-4,7

ТПМ*ЗС 2 0,36 0 - 0,85

Всего мутантных аллелей 21 3,7 2,2-5,3

ТПМ*1 539 96,3 94,7 - 97,8

Подавляющее большинство больных отнесено к европеоидной расе - 270 человек, из них 216 детей (79,1%) составили группу славянского происхождения и 54 (19,8%) - группу кавказских народностей; представителями монголоидной расы было 3 больных (1,1%) и исключены из анализа 7 человек. В группе славян обнаружены аллели ТПМТ*ЗА и ТПМТ*2 с частотой 4,17% и 0,23% соответственно, но не определялся вариант ТПМТ*ЗС. Напротив, в группе кавказцев был выявлен единственный аллельный вариант ТПМТ*ЗС с частотой встречаемости 1,85%. Среди представителей монголоидной расы мутантные аллели не обнаружены, возможно, из-за малого числа больных. Пациенты с острым лимфобластным лейкозом

Характеристики пациентов с ОЛЛ в зависимости отгенотипа ТПМТ Из 174 больных ОЛЛ 14 пациентов (8%) являются гетерозиготными по мутантным аллелям гена ТПМТ и соответственно 160 (92%) - гомозиготными пациентами "дикого типа". У одной больной ОЛЛ (0,6%) через 8 лет после окончания терапии развилась вторичная опухоль головного мозга. Эта больная лечилась по программе 0ЛЛ-БФМ-90 для группы высокого риска, включающей краниальное облучение в дозе 18 Гр. У девочки не обнаружено генетического дефекта ТПМТ. Гетерозиготные пациенты имели различные генотипы ТПМТ: *1/*2 (п=1), *1/ЗА (п=11)и*1/*ЗС(п=2).

Результаты анализа распределения больных с ОЛЛ по полу, морфологическому варианту лейкоза (РДВ-классификация), иммунофенотипу бластных клеток и экспрессии лимфобластами Г(12;21)ТЕЦ/ДМ1_1 в зависимости от полученного генотипа ТПМТ представлены в табл. 7.

Таблица 7. Основные характеристики пациентов с ОЛЛ в зависимости от генотипа ТПМТ

Показатели Генотип ТПМТ пациентов Все пациенты

М/тиЛ

Пол: мальчики девочки 85(53,1%) 75 (46,9%) 9 (64,3%) 5 (35,7%) 94 (54%) 80 (46%)

критерий Фишера р=0,3026

Морфология: 1_1 1_2 не определена 88 (55%) 46 (28,8%) 26 (16,2%) 8 (57,2%) 3(21,4%) 3(21,4%) 96 (55,2%) 49 (28,2%) 29(16,6%)

критерий Фишера р=0,4556

Иммунофенотип: Т-клеточный не-Т-клеточный не определен (н.д.) 23 (14,4%) 119(74,4%) 18(11,2%) 2 (14,8%) 12 (85,7%) 0 (0%) 25(14,4%) 131 (75,3%) 18(10,3%)

критерий Фишера р=0,6047

Г(12;21)ТЕ1_/ДМ1_1: обнаружена не обнаружена не определялась (н.д.) 9 (5,6%) 109(68,1%) 42 (26,3%) 4 (28,6%) 7 (50,0%) 3(21,4%) 13(7,5%) 116(66,7%) 45 (25,8%)

критерий Фишера р=0,0141

Всего пациентов 160(100%) 14(100%) 174(100%)

В группе гетерозиготных пациентов преобладали мальчики по сравнению с девочками. Различий в распределении больных по морфологическому варианту и иммунофенотипу бластных клеток в исследуемых группах не найдено. Интересно отметить, что при анализе результатов молекулярно-генетического исследования у первичных больных ОЛЛ с гетерозиготным генотипом ТПМТ из всех хромосомных аберраций выявлена только Г(12;21)ТЕ1_/ДМ1_1. Другие химерные транскрипты, такие как Г(1;19)Е2Д/РВХ, ВД22)ВСР/ДВ1_р190 и Г(4;11)М1_1_/ДР4 не обнаружены. При сравнении группы пациентов "дикого типа" и группы гетерозиготных больных обнаружены статистически достоверные отличия в частоте встречаемости Г(12;21)ТЕ17ДМ1_1 (табл. 8 и рис. 6). Оказалось, что в группе пациентов с гетерозиготным генотипом ТПМТ частота встречаемости Г(12;21)ТЕ1_/ДМ1_1 в 5 раз выше, чем в группе пациентов "дикого типа" (36,4% и

7,6% соответственно, р=0,0141). Общая частота встречаемости 1(12,21 )ТЕ1_/ДМ1_1 у больных ОЛЛ составила 10,1%.

Таблица 8. Сравнительная оценка частоты встречаемости (12;21)ТЕ1 _/ДМ1_1 в популяции больных ОЛЛ и у пациентов с различным генотипом ТПМТ.

1(12;21)ТЕ1_/ДМ1_1 Все пациенты Дикий тип (\М/\М) Гетерозиготы (М/тШ)

абс % абс % абс %

Позитивна 13 10,1 9 7,6 4 36,4

Негативна 116 89,9 109 92,4 7 63,6

Всего 129 100 118 100 11 100

\vtZwt \vtZmut все пациенты

Рисунок 6. Частота встречаемости 1(12;21)ТЕ1_/ДМ1_1 у пациентов с гетерозиготным генотипом ТПМТ и гомозиготных пациентов "дикого типа".

Сравнительныйанализ токсичности 6-МП в группахгетерозиготных пациентов и пациентов"дикого типа"на консолидирующей терапии В данный анализ включены 59 пациентов с ОЛЛ в ремиссии, удовлетворяющие критериям, описанным в разделе "Материалы и методы". Из них 8 пациентов имеют гетерозиготный генотип и 51 пациент - гомозиготный "дикий тип" ТПМТ. Продолжительность консолидации:

Длительность консолидации по протоколу МВ-91/2002 составляет 24 недели. Анализ длительности консолидации в 2-х сравниваемых группах больных показал, что у пациентов с гетерозиготным генотипом ТПМТ период консолидации был увеличен на 2 недели по сравнению с пациентами "дикого типа" (медиана: 28 нед уб 26 нед, р=0,045). Данные представлены в табл. 9, а также в виде статистического графика "Ящик с усами" на рис. 7 и являются статистически достоверными.

Таблица 9. Продолжительность консолидации в неделях в зависимости от генотипа ТПМТ

Генотип ТПМТ СреИНее+вй Медиана мин макс Критерий Манна-Уитни

\М/М 26,1 ±1,8 26 24 32 р=0,045

\М/ти1 27,6+2,1 28 24 31

Рисунок 7. Продолжительность консолидации в неделях в зависимости от генотипа ТПМТ Толерантность 6-МП.

Протокольная доза 6-МП составляет 50мг/м2 в сутки или 350мг/м2 в неделю. При сравнении группы гетерозиготных пациентов с группой пациентов "дикого типа" оказалось, что пациенты с генетическим дефектом ТПМТ толерировали достоверно более низкие дозы 6-МП. Так, средняя доза 6-МП в неделю составила для гетерозиготных пациентов 264мг/м2 по сравнению с 312мг/м2 для гомозиготных пациентов "дикого типа" (р=0,04) (табл. 10).

Таблица 10. Дозы 6-МП в мг/м2/нед, которые назначались гетерозиготным пациентам и пациентам "дикого типа".

Генотип ТПМТ Среднее+вй Медиана мин макс Критерий Манна-Уитни

\М/\М 312±68,6 315 188 486 р=0,04

\М/ти1 264+51,4 251 213 369

Статистические графики "Ящик с усами", представленные на рис. 8, показывают не только различия по медианам (или средним), но и по разбросу внутри сравниваемых групп. Видно, что имеются различия не только в средних дозах препарата, но и значительные различия в его дозах, назначаемых внутри каждой из групп. В группе гетерозиготных пациентов дозы 6-МП были снижены и значительно меньше колебались от пациента к пациенту. Кроме того, в этой группе больных наблюдалось более низкое значение максимально толерируемой дозы 6-МП по сравнению с группой пациентов "дикого типа" (369 и 486мг/м2/нед соответственно).

При расчете дозы 6-МП в процентах от протокольной дозы, средняя толерируемая доза 6-МП в сутки для гетерозиготных больных составила 75,4% ± 14,7% (макс 105,6%) по сравнению с 89,3% ± 19,6% (макс 138,9%) для пациентов "дикого типа", что представлено на рис. 8А.

Рисунок 8 Графический анализ дозы 6-МП, толерируемой гетерозиготными пациентами и пациентами "дикого типа". (А) % от протокольной дозы 6-МП в сутки; (Б) 6-МП в мг/м2/нед

Следует отметить, что наравне с 6-МП пациенты с гетерозиготным генотипом ТПМТ получали более низкие дозы метотрексата по сравнению с пациентами "дикого типа" (средняя доза метотрексата 22 уб 27мг/м2/нед, р=0,028), что представлено в табл. 11, различие статистически достоверно.

Таблица 11. Дозы метотрексата в мг/м/нед, используемые у гетерозиготных пациентов и пациентов "дикого типа".

Генотип ТПМТ Среднее ± SD Медиана мин макс Критерий Манна-Уитни

wt/wt 26,6 ±6,0 27,2 14,6 42,5 р=0,028

wt/mut 22,1 ±3,3 21,5 18,3 28,3

При анализе пациентов в сравниваемых группах, которым по каким-либо причинам отменялась терапия 6-МП также получены статистически достоверные различия. Гетерозиготные больные в 2 раза чаще пропускали терапию 6-МП по сравнению с гомозиготными пациентами "дикого типа", причем почти в половине случаев вследствие развития агранулоцитоза (табл. 12 и рис. 9). Из 8 больных с гетерозиготным генотипом ТПМТ только 1 пациенту ни разу не отменили 6-МП.

Рисунок 9. Процент недель без терапии 6-МП у гомозиготных "дикого типа" и гетерозиготных пациентов.

Таблица 12. Количество недель без терапии 6-МП в зависимости от генотипа

ТПМТ (исключая недели реиндукций)

Показатели Генотип ТПМТ Критерий

М/тШ Манна-Уитни

Недели без 6-МП среднНее+вй (мин-макс) 2,3+1,96 (0-8) 4,5+2,1 (0-6) р=0,010

Недели без 6-МП вследствие агранулоцитоза среЯНее+вй (мин-макс) 1,2+1,32 (0-6) 2,7+1,67 (0-5) р=0,010

% недель без 6-МП в процессе консолидации среднее+вй (мин-макс) 10,8%+8,4 (0-30,1%) 20,2%+9,2 (0-27,3%) р=0,0087

Пациенты "дикого типа" толерировали 6-МП в полной дозе (50мг/м2 в сутки и более) в течение 72% всего срока консолидирующей терапии, обусловленного протоколом, по сравнению с 63% у гетерозиготных пациентов (табл. 13). При сравнительном анализе назначения полной протокольной дозы 6-МП в исследуемых группах статистически достоверных различий не было.

Таблица 13. Процент недель консолидации, когда 6-МП назначался в полной дозе

(£50мг/м2/сут) в зависимости от генотипа ТПМТ.

Генотип ТПМТ Среднее+вй Медиана мин макс Критерий Манна-Уитни

\М/\М 72% + 18,4 74% 21% 100% р=0,1

М/тШ 63% +12,8 62% 48% 89%

Процент недель, когда больные получали редуцированные дозы 6-МП (менее 50мг/м2/сут) с целью предотвращения токсичности терапии в обеих группах оказался одинаковым: 17,4% у пациентов "дикого типа" и 16,9% у гетерозиготных больных, р=0,54. Но в группе пациентов с гетерозиготным генотипом ТПМТ всем больным приходилось снижать дозу 6-МП (табл. 14).

Таблица 14. Процент недель консолидации, когда 6-МП назначался в редуцированной дозе (<50мг/м2/сут) в зависимости от генотипа ТПМТ.

Генотип ТПМТ Среднее±вй Медиана мин макс Критерий Манна-Уитни

17,4% ±17,2 15,0% 0% 73,4% р=0,54

М/тШ 16,9%±8,6 14,6% 8% 28,6%

На рис. 10 в виде диаграмм суммированы данные, показывающие различия в выполняемое™ терапии 6-МП в течение консолидации у гетерозиготных пациентов и пациентов "дикого типа".

Дикий тип Гетерозиготы

72^

■ редуцированная доза □ без 6МП ■ полная доза

Рисунок 10. Терапия 6-МП на этапе консолидации ремиссии у 51 гомозиготного пациента "дикого типа" и 8 пациентов с гетерозиготным генотипом ТПМТ.

Анализ гематологической токсичности 6-МП:

1. Средние значения лейкоцитов, гемоглобина и тромбоцитов в процессе консолидирующей терапии у пациентов в исследуемых группах ничем не отличались.

2. Эпизоды анемии (Нв<80г/л) наблюдались в 2 раза чаще у пациентов с гетерозиготным генотипом ТПМТ. Количество трансфузий эритроцитов на одного ребенка за период консолидации было в 1,4 раза больше в этой группе больных. Статистически достоверных различий обнаружено не было.

3. Эпизоды тромбоцитопении (< ЗОтыс/мкл) встречались в 3 раза чаще у пациентов с гетерозиготным генотипом ТПМТ. Количество трансфузий тромбоцитов на одного пациента в течение консолидации было в 2,4 раза

больше в этой группе по сравнению с группой пациентов "дикого типа", однако различия статистически недостоверны.

4. Длительность агранулоцитоза (гранулоциты < 500/мкл) в неделях в течение консолидации у гетерозиготных больных была в 2 раза выше, чем у пациентов "дикого типа", причем максимальная длительность агранулоцитоза составила 13 недель консолидации (табл. 15). Статистически значимых различий между группами не обнаружено.

5. Общее количество инфекционных эпизодов (1-Зст) и значимые инфекционные эпизоды (2-Зст) также в 2 раза чаще наблюдались в группе гетерозиготных больных (табл 16) Инфекционных эпизодов 4 ст. в течение консолидации в анализируемых группах не было

Таблица 15. Длительность агранулоцитоза (в неделях) на одного ребенка в зависимости от генотипа ТПМТ

Генотип ТПМТ Ореднее±вР Медиана мин макс Критерий Манна-Уитни

Длительность агранулоцитоза в нед. (дга<500/мкл) р=0,066

\М/\М 3,5 ±2,8 3 0 11

М/тШ 6,0 ±3,9 6 1 13

Таблица 16. Количество инфекционных эпизодов на одного ребенка в зависимости от генотипа ТПМТ

Генотип ТПМТ ОреднеевР Медиана мин макс Критерий Манна-Уитни

Общее кол-во инфекционных эпизодов 1-Зст на одного ребенка р=0,6029

\М/М 1,8±1,5 2 0 6

М/тШ 3,4 ± 3,7 1,5 0 9

Кол-во инфекционных эпизодов 2-Зст на одного ребенка р=0,6184

\М/М 0,9 ±1,1 1 0 5

М/тШ 1,8 ±2,3 0,5 0 6

Сравнительный анализ эффективности терапии6-МПвгруппах гетерозиготныхпациентов и пациентов "дикого типа ": В группе больных ОЛЛ с гетерозиготным генотипом ТПМТ все пациенты получали программную терапию. При распределении гетерозиготных пациентов по группам риска оказалось, что из 14 человек группу стандартного риска составили 11 детей, а группу среднего риска - 3 больных. Среди гетерозиготных пациентов не было больных, которые получали терапию для высокой группы риска. Все пациенты достигли полной ремиссии к 33/36 дню индукции. Для проведения сравнительного анализа эффективности терапии 6-МП в исследуемых группах пациентов "дикого типа" и гетерозиготных пациентов важным условием было создание однородных групп больных. Поэтому из группы пациентов "дикого типа" дополнительно были исключены больные, не ответившие на терапию (non-responder), и дети, получавшие терапию высокого риска (табл. 17). Таким образом, из 160 пациентов "дикого типа" в анализ включено 116 больных, а в группе гетерозиготных пациентов - 11 больных, которые лечились по протоколам ОЛЛ-МБ-91/2002. Распределение пациентов, вошедших в анализ, по группам риска, согласно используемому протоколу представлено в табл. 19, из которой видно преобладание пациентов стандартной группы риска.

Таблица 17. Распределение пациентов "дикого типа" и гетерозиготных пациентов по группам риска, согласно используемому протоколу_

протокол

группа риска

МБ-91

МБ-2002

Итого

Гомозиготные пациенты "дикого типа"

Стандартный риск

30

45

75(64,1%)

Средний риск/риск

19

23

42 (40,3%)

Всего

49

68

117(100%)

Пациенты с гетерозиготным генотипом ТПМТ

Стандартный риск

9(81,8%)

Средний риск/риск

2(18,2%)

Всего

11 (100%)

Результаты лечения по протоколам ОЛЛ-МБ-91/2002, представленные в табл. 18 и на рис. 11, показывают тенденцию к улучшению показателя RFS в группе

гетерозиготных пациентов, который составил 100% (медиана наблюдения 25 месяцев) по сравнению с 84% в группе пациентов "дикого типа" (медиана наблюдения 28 месяцев). Статистически достоверных различий по ЯРв не обнаружено. Следует отметить, что в группе пациентов с гетерозиготным генотипом ТПМТ не было рецидивов при максимальном периоде наблюдения 4,1 года. Один пациент в этой группе больных потерян для наблюдения. Напротив, в группе пациентов "дикого типа" рецидивировали 10 человек, а максимальный срок наблюдения составил 5,3 года.

Таблица 18. Результаты лечения больных ОЛЛ в зависимости от генотипа ТПМТ по протоколам 0ЛЛ-МБ-91/2002:

п % Критерий Фишера

Протокол МБ-91/02 МБ-91/02

Генотип ТПМТ МЛ/М М/тиЛ МЛ/М М/тй

Протокольные пациенты 116 11 100 100 —

ири 1 1 0,9 9,1 —

Рецидивы 10 0 8,6 0 р=0,4740

Полная продолжительная ремиссия 105 10 90,5 90,9 р=0,5706

рЯРв — — 0,84 1,0

Рисунок 11. Безрецидивная выживаемость в зависимости от генотипа ТПМТ (результаты лечения по протоколам ОЛЛ-МБ-91/2002)

Пациенты с рецидивом острого лимфобластного лейкоза

Среди 39 больных, обследованных впервые уже в состоянии рецидива ОЛЛ, обнаружено 2 гетерозиготных пациента (5,1%) с генотипом ТПМТ*1/*ЗА Следует отметить, что в отличие от первичных больных ОЛЛ с гетерозиготным генотипом ТПМТ эти пациенты получали инициальную терапию для группы высокого риска. Пациент с очень ранним рецидивом ОЛЛ имел транслокацию 1(9;22)ВСЯ/АВ1_р190, которая ассоциирована с неблагоприятным прогнозом заболевания и определила развитие рефрактерности к терапии и гибель больного. У пациента с поздним изолированным костномозговым рецидивом ОЛЛ, который случился через 5 лет после завершения терапии, достигнута вторая полная клинико-гематологическая ремиссия, продолжительностью 22 месяца.

Пациенты с острым миелобластным лейкозом

Всего обследован 41 больной с ОМЛ, среди них обнаружено 3 больных (7,3%), гетерозиготных по генному локусу ТПМТ. Все гетерозиготные пациенты имеют генотип ТПМТ*1/*ЗА и характеризуются морфологическими вариантами ОМЛ: МО, М2 и М5 (табл. 19). По данным результатов молекулярно-генетического исследования хромосомные аномалии у гетерозиготных пациентов с ОМЛ не выявлены. Цитогенетическое исследование проводилось только 1 пациенту, у которого выявлена моносомия 45Х(-У). Двое больных получали терапию по программе ОМЛ-БФМ-87, которая включает препарат 6-ТГ или 6-МП как компонент консолидирующей и поддерживающей терапии. Один из них погиб от профессии заболевания, другой пациент достиг ремиссии только на этапе консолидации.

Таблица 19. Характеристика гетерозиготных пациентов с ОМЛ

Пациент(мальчик) Пациент(мальчик) Пациент(мальчик)

Морфология ОМЛ МО ОМЛМ2 ОМЛМ5

Генотип ТПМТ *1/*ЗА *1/*ЗА *1/*ГЗА

Цитогенетика 45Х(-У) не проводилась не проводилась

Молекулярная генетика negative negative negative

Иммунофенотип CD13+33+ CD13+33+ CD13+33+19+22+ (бифенотип)

Протокол терапии ОМЛ-2000 ОМЛ-БФМ-87 ОМЛ-БФМ-87

Ответ на терапию ремиссия non-responder non-responder

Исход рецидив после аутоТКМ, погиб прогрессия заболевания,погиб ремиссия достигнута на консолидации, жив

выводы

1. Частота встречаемости больных, гетерозиготных по генному локусу ТПМТ, в когорте пациентов с гемобластозами, жителей РФ, составляет 7,5%, а гомозиготных пациентов "дикого типа" - 92,5%. Самым часто встречающимся мутантным аллелем является ТПМТ*ЗА (85,7%), более редкими аллелями - ТПМТЗС (9,5%) и ТПМГ2 (4,8%). Все пациенты с мутацией гена ТПМТ относятся к европеоидной расе.

2. Больные ОЛЛ и ОМЛ, несущие мутации гена ТПМТ, встречаются с одинаковой частотой (8,0 и 7,3% соответственно, р=0,3055).

3. В группе больных ОЛЛ выявлена достоверно более высокая частота встречаемости 1(12;21)ТЕ1_/ДМ1_1 у пациентов с генетическим дефектом ТПМТ по сравнению с пациентами "дикого типа" (36,4% УБ 7,6%, р=0,0141).

4. Больные ОЛЛ с гетерозиготным генотипом ТПМТ имеют сниженную толерантность 6-МП, что приводит к перерывам в терапии.

5. Больные ОЛЛ с гетерозиготным генотипом ТПМТ характеризуются выраженной гематологической токсичностью 6-МП по сравнению с пациентами "дикого типа", что является основанием для редукции дозы 6-МП у гетерозиготных больных.

6. Больные ОЛЛ с гетерозиготным генотипом ТПМТ получают в ходе консолидирующей терапии более низкие дозы метотрексата по сравнению с пациентами "дикого типа" (22 уб 27мг/м2/нед, р=0,028) вследствие токсичности 6-МП.

7. В группе больных ОЛЛ, получавших терапию по протоколам МБ-91/2002 для стандартной и средней групп риска, среди гетерозиготных пациентов выявлена тенденция к улучшению RFS, которая составила 100% по сравнению с 84% среди пациентов "дикого типа".

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Проведение ТПМТ-генотипирования рекомендуется всем больным, которым планируется терапия тиопуриновыми препаратами, такими как 6-МП, 6-ТГ или азатиоприн.

2. Больным ОЛЛ с гетерозиготным генотипом ТПМТ с целью предотвращения тиопуриновой токсичности рекомендовано назначение редуцированной дозы 6-МП (50-75%) при сохранении полной протокольной дозы

метотрексата и других антилейкемических препаратов под контролем показателей гемограммы.

3. Рекомендовано внедрение метода мультиплексной ПЦР и гибридизации на ТПМТ-микрочипе в клиническую практику как точного и быстрого метода молекулярной диагностики пациентов с мутацией гена ТПМТ.

Список опубликованных научных работ по теме диссертации

1. Самочатова Е.В., Карачунский АИ., Мякова Н.В., Руднева А.Е., Трубина Н.М., Чупова Н.В., Румянцев А.Г. Активность тиопуринметилтрансферазы у детей с острым лимфобластным лейкозом. Гематология и трансфузиология, 2002, т.47, №6.

2. Fedorova О, Glotov A, Krynetski E, Krynetskaya N, Chupova N, Nasedkina T, Mirzabekov A. Analysis of point mutations in human thiopurine S-methyltransferase gene by hybridization with oligonucleotide microchips. Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics. Kyiv, Ukraine 2003, p. 240.

3. T.V.Nasedkina, O.E.Fedorova, AS.GIotov, E.V.Samochatova, N.V.Chupova, V.E.Barsky, A.S.Zasedatelev. "Genetic polymorphism studies in Russian population using biochips". European Journal of Human Genetics, 2004, 12, Suppl. 1,331.

Список сокращений Гр - Грей

ДНК - дезоксирибонуклеоиновая кислота ИМБ - институт молекулярной биологии РАН КМ - костный мозг

МДГКБ - Морозовская детская городская клиническая больница 6-МП - 6-меркаптопурин

МООД - московский областной онкологический диспансер

НХЛ - неходжкинские лимфомы

ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз

0ЛЛ-БФМ-90 - протокол лечения ОЛЛ группы БФМ

0ЛЛ-МБ-91/2002 - протокол лечения ОЛЛ группы Москва-Берлин

ОМЛ - острый миелоидный лейкоз

ОЛЛРЕЦ - рецидив ОЛЛ

ОМЛРЕЦ - рецидив ОМЛ

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РДКБ - российская детская клиническая больница

6-ТГ-б-тиогуанин

ТКМ - трансплантация костного мозга ТПМТ - тиопуринметилтрансфераза ЦНС - центральная нервная система А1_1_^Е7-ВРМ-90 - протокол лечения рецидивов ОЛЛ

Cl (confidence interval) - доверительный интервал FAB - франко-американо-британская классификация LFU (lost-to-follow up) - потерянный для наблюдения NHL-BFM-90 - протокол лечения неходжкинских лимфом

RFLP-PCR - ПЦР с анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов RFS (relapse free survival) - безрецидивная выживаемость SD (standard deviation) - стандартное отклонение wt (wild type) - «дикий» тип

Подписано в печать 21.12.04. Формат 60x84/16.

Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,88. Тираж 100 экз. Заказ № 352.

Отпечатано в ООО «Реглант» Москва, Электролитный проезд, ЗБ Тел. 747-81-48, 317-70-09 E-mail: info@maska.su, www.maska.su

P--85Í

Показатель долгосрочной выживаемости детей с острым лимфобластным лейкозом (OJIJI) в настоящее время достиг 80%, что свидетельствует об эффективности риск-адаптированной терапии, применяемой в современных протоколах лечения как в западных клиниках (Pui СН et al., 2004), так и в нашей стране (А.И. Карачунский, 1999). Основной причиной неудач в терапии OJIJI по-прежнему остается рецидив заболевания (Schrappe М, 2004, Pui СН et al., 2004). Инфекции остаются серьезным осложнением терапии OJIJI и после рецидива являются второй самой частой причиной смерти детей с OJIJI. Кроме того, многие дети, излеченные от OJIJI, имеют поздние осложнения терапии. Современные направления развития детской лейкозологии включают оптимизацию использования существующих антилейкемических препаратов, раннее выявление факторов риска рецидива заболевания и фармакогенетических характеристик пациента, чтобы избежать применения недостаточно эффективной или, наоборот, излишне интенсивной терапии (Pui СН et al., 2001).

Тиопуринметилтрансфераза (ТПМТ) катализирует основной путь инактивации тиопуриновых препаратов, к которым относятся 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин и азатиоприн (Krynetski EY, Evans WE,

2003). 6-меркаптопурин (6-МП) и 6-тиогуанин (6-ТГ) широко используются в современных протоколах терапии острых лейкозов и лимфобластных лимфом. Активность ТПМТ определяется генетическим полиморфизмом и наследуется по аутосомному кодоминантному признаку. По данным зарубежной литературы около 10% людей в популяции, гетерозиготных по локусу гена ТПМТ, имеют среднюю активность фермента, тогда как 0,33% (т.е. 1 на 300 человек в популяции) являются гомозиготными носителями недостаточности ТПМТ (McLeod HL et al., 1994). Терапия 6-МП, 6-ТГ и азатиоприном в стандартных дозах больных с недостаточностью ТПМТ приводит к развитию длительной глубокой миелосупрессии и присоединению тяжелых, нередко фатальных, инфекционных осложнений (Evans WE et al., 1991; Lennard L et al., 1989, 1993). Напротив, успешные случаи излечения пациентов с недостаточностью ТПМТ наблюдали у детей с OJIJI, которые получали редуцированные дозы 6-МП, составляющие 6-10% от стандартной дозы препарата (Evans WE et al., 1991; Lennard L et al., 1993, 1997). Кроме того, больные OJTJI с низкой активностью ТПМТ имеют повышенный риск развития лекарственно-индуцируемых вторичных опухолей (Relling MV et al., 1998, 1999b; Thomsen JB et al., 1999).

В настоящее время идентифицировано более 10 мутантных аллелей гена ТПМТ, кодирующих фермент со сниженной активностью. Установлена более чем 95% конкордантность между генотипом и фенотипом ТПМТ (Yates CR et al., 1997). По данным популяционных исследований, проведенных в различных странах мира, наиболее часто встречаются мутации ТПМТ*2, ТПМТ* ЗА и ТПМТ*ЗС, которые отличаются в распределении по основным этническим группам (McLeod HL et al., 2000). В России подобных исследований не проводилось.

С целью обнаружения инактивирующих мутаций гена ТПМТ применяется метод, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР), который является более точным и надежным по сравнению с радиохимическим методом определения эритроцитарной активности ТПМТ, и исключает получение ложных результатов в зависимости от гемотрансфузий (Yates CR et al., 1997) и приема 6-МП (Lennard L et al., 1990; McLeod HL et al., 1995). Применение молекулярных методов с целью проспективной диагностики недостаточности ТПМТ предлагает клинически важную стратегию минимизации риска возможных жизненно угрожающих состояний у пациентов, получающих терапию тиопуринами (Krynetski EY, Evans WE, 2000).

Актуальность настоящего исследования обусловлена определением частоты встречаемости мутантных аллелей ТПМТ в когорте детей с гемобластозами, жителей Российской Федерации, и идентификацией пациентов с генетическим дефектом ТПМТ, что позволяет оптимизировать терапию тиопуринами: уменьшить токсичность терапии и избежать необоснованного снижения дозы или отмены других химиопрепаратов, что повысит эффективность терапии в рамках установленного протокола.

Цель исследования:

Определить характер и частоту встречаемости мутантных аллелй гена ТПМТ у детей с острыми лейкозами и неходжкинскими лимфомами и сравнить эффективность и токсичность терапии 6-меркаптопурином у больных с ОЛЛ в зависимости от генотипа ТПМТ.

Задачи исследования:

1. Определить встречаемость гомозиготных и гетерозиготных пациентов, несущих мутации гена ТПМТ и гомозиготных пациентов "дикого типа" в когорте больных с гемобластозами.

2. Провести сравнительный анализ частоты встречаемости пациентов с

------------генетическим дефектом—ТПМТ—в—группах—детей—с—острым------лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) и острым миелобластным лейкозом (ОМЛ).

3. Оценить, существует ли корреляция между мутацией гена ТПМТ и определенными биологическими характеристиками опухолевых клеток при ОЛЛ и ОМЛ (морфологией, иммунофенотипом и наличием хромосомных аберраций).

4. Провести сравнительный анализ гематологической токсичности 6-МП в группе больных ОЛЛ в зависимости от наличия или отсутствия мутации гена ТПМТ и исследовать влияние генотипа ТПМТ на переносимость тиопуринов.

5. Сравнить кривые безрецидивной выживаемости пациентов с генетическим дефектом ТПМТ и пациентов "дикого типа" в группе больных ОЛЛ.

6. Внедрить в клиническую практику оригинальный метод идентификации мутаций гена ТПМТ, основанный на применении олигонуклеотидных микрочипов.

Научная новизна

В настоящем исследовании впервые получены данные о генетическом полиморфизме ТПМТ в когорте детей с гемобластозами, которые являются жителями РФ, а также о характере и частоте встречаемости мутантных аллелей гена ТПМТ. Показано, что результаты исследований, проведенных в нашей стране и среди жителей белой расы США и Европы, не различались.

Впервые проведено фармакогенетическое исследование в группе пациентов РФ с ОЛЛ, которое показало, что индивидуальные различия в переносимости и эффективности препарата 6-МП являются генетически обусловленными. Больные, гетерозиготные по генному локусу ТПМТ характеризовались сниженной способностью толерировать 6-МП и развивали выраженную миелосупрессию, несмотря на применение дозы 6-МП, которая на 30% ниже дозы 6-МП, используемой в западных протоколах. Терапия 6-МП оказалась эффективнее в группе гетерозиготных пациентов, в которой наблюдалась более низкая частота рецидивов по сравнению с пациентами "дикого типа".

Впервые получены результаты сравнительного анализа частоты встречаемости пациентов с мутацией гена ТПМТ в группах детей с ОЛЛ и ОМЛ. Показана одинаковая частота встречаемости гетерозиготных пациентов среди больных ОЛЛ и ОМЛ.

В настоящей работе впервые выявлена корреляция встречаемости 1(12;21)ТЕЬ/АМЬ1 в лейкемических клетках с мутацией гена ТПМТ у больных ОЛЛ, что не представлено в зарубежной литературе.

Впервые в мировой практике апробирован новый генотипический метод, основанный на использовании ТПМТ-микрочипов, в структуру которых входят наиболее часто встречающиеся мутации гена ТПМТ. Данный метод молекулярной диагностики пациентов с генетическим дефектом ТПМТ, разработанный в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, позволяет проводить скрининговое обследование пациентов.

Практическая значимость

Проведенное исследование показало, что около 10% пациентов с гемобластозами, жителей РФ, которым планируется терапия 6-МП или 6-ТГ, имеют повышенный риск тиопуриновой токсичности вследствие наследственного дефицита ТПМТ.

Проведенное сравнительное исследование тиопуриновой токсичности в группе больных ОЛЛ в зависимости от наличия или отсутствия мутации гена ТПМТ позволило выявить более высокую гематологическую токсичность 6-МП у гетерозиготных больных с генетическим дефектом ТПМТ, которая также препятствовала проведению адекватной терапии метотрексатом. На основании этих данных с целью предотвращения токсичности рекомендуется у пациентов с генетическим дефектом ТПМТ использование редуцированных доз 6-МП при сохранении полной протокольной дозы метотрексата и других антилейкемических препаратов.

Показано, что безрецидивная выживаемость гетерозиготных пациентов с ОЛЛ выше по сравнению с гомозиготными пациентами "дикого типа". Однако присутствие дополнительных неблагоприятных факторов, например, хромосомной аберрации 1(9;22)ВСК/АВЬр190, может ухудшить прогноз заболевания у больных с мутацией гена ТПМТ.

Апробирован оригинальный метод молекулярной диагностики, основанный на применении ТПМТ-биочипов, который показал свою эффективность и рекомендуется для внедрения в практику с целью выявления больных с мутаций гена ТПМТ и коррекции терапии тиопуриновыми препаратами в онкогематологии, в трансплантологии солидных органов, а также при лечении аутоиммунных заболеваний.

вывода

1. Частота встречаемости больных, гетерозиготных по генному локусу ТПМТ, в когорте пациентов с гемобластозами, жителей РФ, составляет 7,5%, а гомозиготных пациентов "дикого типа" - 92,5%. Самым часто встречающимся мутантным аллелем является ТПМТ*ЗА (85,7%), более редкими аллелями - ТПМТ*ЗС (9,5%) и ТПМТ*2 (4,8%). Все пациенты с мутацией гена ТПМТ относятся к европеоидной расе.

2. Больные ОЛЛ и ОМЛ, несущие мутации гена ТПМТ, встречаются с одинаковой частотой (8,0 и 7,3% соответственно, р=0,3055).

3. В группе больных ОЛЛ выявлена достоверно более высокая частота встречаемости 1:(12;21)ТЕЬ/АМЫ у пациентов с генетическим дефектом ТПМТ по сравнению с пациентами "дикого типа" (36,4% уб 7,6%, р=0,0141).

4. Больные ОЛЛ с гетерозиготным генотипом ТПМТ имеют сниженную толерантность 6-МП, что приводит к перерывам в терапии.

5. Больные ОЛЛ с гетерозиготным генотипом ТПМТ характеризуются выраженной гематологической токсичностью 6-МП по сравнению с пациентами "дикого типа", что является основанием для редукции дозы 6-МП у гетерозиготных больных.

6. Больные ОЛЛ с гетерозиготным генотипом ТПМТ получают в ходе консолидирующей терапии более низкие дозы метотрексата по сравнению с пациентами "дикого типа" (22 уэ 27мг/м2/нед, р=0,028) вследствие токсичности 6-МП.

7. В группе больных ОЛЛ, получавших терапию по протоколам МБ-91/2002 для стандартной и средней групп риска, среди гетерозиготных пациентов выявлена тенденция к улучшению Ш^, которая составила 100% по сравнению с 84% среди пациентов "дикого типа".

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Проведение ТПМТ-генотипирования рекомендуется всем больным, которым планируется терапия тиопуриновыми препаратами, такими как 6-МП, 6-ТГ или азатиоприн.

2. Больным ОЛЛ с гетерозиготным генотипом Г11МТ с целью предотвращения тиопуриновой токсичности рекомендовано назначение редуцированной дозы 6-МП (50-75%) при сохранении полной протокольной дозы метотрексата и других антилейкемических препаратов под контролем показателей гемограммы.

3. Рекомендовано внедрение метода мультиплексной ПЦР и гибридизации на ТПМТ-микрочипе в клиническую практику как точного и быстрого метода молекулярной диагностики пациентов с мутацией гена ТПМТ.