Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Генетический полиморфизм ИЛ-13 и его рецептора у больных бронхиальной астмой
- Ученая степень
- кандидата биологических наук
- ВАК РФ
- 14.00.36
Автореферат диссертации по медицине на тему Генетический полиморфизм ИЛ-13 и его рецептора у больных бронхиальной астмой
На правах рукописи / ,
Мазурина Светлана Александровна.
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ ИЛ-13 И ЕГО РЕЦЕПТОРА У БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ.
14.00.36- Аллергология и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2008.
з о (ШШ
003451398
Работа выполнена в ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН
НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ
доктор медицинских наук
профессор В.Б. Гервазиева
кандидат биологических нау
Ю. В. Гервазие
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ - доктор медицинских наук, профессор
акад. РАЕН, A.A. Ярилин доктор биологических нау И.В. Мирошниченко
ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ - ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава.
Защита состоится « 20 » ноября 2008 года в 12 часов на заседанир диссертационного совета Д.001.035.01 при ГУ НИИ вакцин и сыворото им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный переулок, 5а.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вакцин и сыворото им. И.И. Мечникова РАМН.
Автореферат разослан « 20 » октября 2008 г. Ученый секретарь диссертационного ученого совета
канд. биол. наук
И.В. Яковлева
Общая характеристика работы.
Бронхиальная астма (БА) является хроническим воспалительным заболеванием дыхательных путей, в основе которого лежит атопия с увеличенным уровнем общего IgE. Это хроническое воспаление ведет к развитию гиперчувствительности дыхательных путей в ответ на различные стимулирующие факторы и сопровождается повторяющимися симптомами обратимой бронхиальной обструкции. Современные представления о генетической предрасположенности констатируют, что развитие клинической формы этого заболевания требует наличия в генотипе индивида определенных аллельных вариантов генов, формирующих неблагоприятный наследственный фон, реализующийся под действием факторов внешней среды патологическим фенотипом.
Сложность схемы наследования не позволяет точно установить гены, ответственные за развитие данной патологии, и исследования в этой области продолжаются, имея в основном накопительный характер. В этой связи перспективной выглядит концепция исследования однонуклеотадных замен, известных как SNP - single nucleotide polymorphisms, - это однонуклеотидные позиции в геномной ДНК, для которых в популяции имеются различные варианты последовательностей в соответствующих генах и их сочетания в генотипе индивида являются предрасполагающими к различным заболеваниям, в том числе и к астме.
Число генов-кандидатов предрасположенности к БА достаточно велико, однако, исходя из характерных особенностей развития этого заболевания, интересными для исследования являются гены, ответственные за индукцию синтеза IgE - одного из основных иммунологических маркеров данного заболевания. К таким генам относятся гены интерлейкинов (ИЛ) и их рецепторов.
Известно, что центральным цитокином аллергического ответа является ИЛ-4, активирующий транскрипцию генного локуса тяжелой цепи типа е иммуноглобулинов, тем самым, индуцируя переключение изотипов с М на Е в B-клетках. ИЛ-13 - другой, синтезируемый Т-клетками цитокин, который как и ИЛ-4 активирует В-клетки к продукции IgE, независимо от ИЛ-4 (PunnonenJ. 1992). Многочисленные исследования показали, что ИЛ-13 является ключевым цитокином в инициировании астмы у экспериментальных животных (Blease К 2001, McKenzie G. J. 1998).
Действие ИЛ-13, осуществляется посредством взаимодействия со своим рецептором на поверхности клеток. Рецептор ИЛ-13 представляет гетеродимерный комплекс, состоящий из а-цепи, общей с рецептором к ИЛ-4 (ИЛ4Яа) и самостоятельной цепью ИЛ13Яа1. При этом HJI13Ral является связывающей, в то время как RJI4Ra осуществляет трансдукцию сигнала внутрь клетки (Zurawski 1993, Aversa G. 1993). Полиморфизм генов ИЛ-13 и JUI-4Ra определяет разнообразие фенотипических проявлений функций ИЛ-13 и ассоциирован с атопией и астмой.
Так, первые аллельные варианты были определены в промоторном участке гена ИЛ-13 - С-1055Т (Noguchi Е 1998). Позднее открыты новые полиморфизмы — два в интронах (G+543C в первом интроне и Т+1922С в третьем) и два в кодирующей части гена (A+2043G и А+2579С в транслируемом и З'-нетранслируемом регионе, соотв., четвертого экзона) (Rosemvasser U. 1995). Найдена ассоциация генотипа Т/Т в участке -1055 от старт-кодона гена ИЛ-13 и увеличенной продукцией этого цитокина (Walley A.J. 1996). В японской и европейских популяциях была выявлена ассоциация полиморфизма A+2043G (Argl30Gln) с атопической БА и увеличенным уровнем сывороточного IgE (Graves P. 2000).
Цитоплазматический вариант замены аминокислоты аргинина на глутамин в положении 551, обусловленный полиморфизмом +1902 в гене
MJI4Rct, бьш обнаружен при изучении индивидуумов с экземой и гипер-IgE синдромом в популяции британцев (Mitsuyasu Н. 1998). В противоположность этому - низкий уровень IgE у индивидуумов носителей Arg551Gln аллеля -был обнаружен в популяции немцев (Kruse S. 1999). Другой полиморфизм G+398A (Ile50Val) в гене MJI4Ra, единственный найденный экстрацеллюлярный вариант рецептора у человека, ассоциирован с БА и повышенным уровнем общего IgE и IgE-антител к аллергенам клеща домашней пыли (Mitsuyasu Н. 1999).
Учитывая вышесказанное, целью данной работы явилось: исследовать полиморфизм генов ИЛ-13 (С-1055Т и Argl30Gln) и а-цепи его рецептора HJI4Ra (IleSOVal и Gln576Arg) у больных атопической БА, выявить их ассоциацию с заболеванием и такими иммунологическими маркерами, как IgE и ИЛ-13.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Сформировать группы больных БА различной степени тяжести, группы здоровых и пациентов с аллергическим ринитом (АР).
2. Определить в сыворотках исследуемых групп содержание общего IgE, ИЛ-13, ИЛ-4, ИЛ-10 и ИНФу.
3. Провести типирование по гену ИЛ-13 относительно замены С на Т в положении -1055 промоторной области и G на А в +2044 положении кодирующей области гена.
4. Провести типирование по гену ИЛ411а относительно замен А на G в положениях +398 и +1902 в кодирующей области.
5. Провести анализ связи выявленных полиморфизмов с БА и показателями IgE и ИЛ-13.
Научная новизна и практическая значимость.
Впервые на территории РФ среди жителей г. Москвы проведено исследование генетического полиморфизма ИЛ-13 и ИЛ4Яа, а также
5
проанализированы его ассоциации с заболеванием атопической БА и повышенным содержанием общего ^Е.
Показано, что частота встречаемости исследуемых аллелей в группе больных астмой, характеризующихся сниженными показателями ИФН-а,-у, ИЛ-10, и ИЛ-13 на фоне повышенного содержания ИЛ-4, общего и специфических 1§Е, не отличается от таковых частот в группе здоровых лиц. Отмечено отсутствие ассоциации отдельных Б№ (С-1055Т, Аг§13(Ю1п, 01п576Аг§, 11е50Уа1) с заболеваемостью и повышенным содержанием общего в исследуемых группах.
Выявлена ассоциация промоторного полиморфизма гена ИЛ-13 с повышенным содержанием сывороточного ИЛ-13 у больных БА в сравнении со здоровой группой.
Получены данные об ассоциации комбинации генетического полиморфизма С-1055Т и Аг§130С1п гена ИЛ-13 с заболеванием БА и повышенным содержанием общего ^Е. Для изученных полиморфных вариантов гена ИЛ4Яа выявлено отсутствие ассоциации комбинации генетического полиморфизма 11е50Уа1 и 01п576Аг§ с заболеваемостью бронхиальной астмой и повышенным содержанием общего 1§Е.
Полученные сведения дают информацию как о роли отдельных генов в развитии БА и содержании общего 1{>Е, так и о гетерогенности данной группы. Кроме того, данные об отсутствии ассоциации отдельных с заболеванием и повышенным содержанием общего 1£Е указывают на актуальность дальнейшего анализа комбинаций генотипов различных исследуемых полиморфизмов.
Изучение полиморфных вариантов генов ключевых цитокинов будет способствовать выяснению роли генетической составляющей в развитии данного заболевания и могут быть учтены в создании системы ранней диагностики аллергических и других мультифакторных заболеваний.
Положения, выносимые на защиту:
1. При исследовании генетического полиморфизма в промоторной и кодирующей областях ИЛ-13 у больных атопической бронхиальной астмой выявлена ассоциация комбинации С-1055Т и А^13(Ю1п с заболеванием и повышенным содержанием общего ^Е, тогда как эти отдельные однонуклеотидные замены не связаны с этими признаками. При этом установлена ассоциация промоторного полиморфизма С-1055Т гена ИЛ-13 с повышенным содержанием сывороточного ИЛ-13 у больных астмой в сравнении со здоровыми лицами.
2. При определении кодирующих однонуклеотидных замен гена ИЛ4Яа не выявлено ассоциации отдельных БЫР (11е50Уа1 и 01п576Аг§) и их комбинаций с заболеваемостью атопической БА и повышенным содержанием общего 1§Е.
Апробация и публикации работы.
Материалы диссертации доложены на X и XI Всероссийских форумах с международным участием имени академика Иоффе В.И. «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», (2006 и 2007 гг.), на Объединенном иммунологическом форуме в Санкт-Петербурге (2008г.) и на Всемирном конгрессе по аллергии в г.Бангкок (Тайланд, 2007г.).
Основные положения диссертации изложены в 8 печатных работах.
Апробация диссертации состоялась 10.06.2008 г. на научной конференции отдела аллергологии ГУ Научно-исследовательского института вакцин и сывороток им И. И. Мечникова РАМН.
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа изложена на 97 страницах машинописного текста и состоит введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных,
выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 14 рисунками. Библиография включает 144 научные работы.
Материалы и методы исследования.
В работе в качестве исследуемого материала были использованы образцы ДНК и сыворотка крови 204 пациента с БА, русских, проходивших лечение в лечебно-профилактических учреждениях г. Москвы в 2003-2006гт. Диагноз и степень тяжести были установлены согласно критериям GINA. Группы сравнения составили 32 больных АР и 93 здоровых пациента. Анализ тяжести симптомов АР показал, что они соответствуют средней степени тяжести согласно ARIA. Все больные на момент обследования находились в стадии обострения соответствующего заболевания. Критерием отбора здоровых лиц явилось: отсутствие неврологических, аутоиммунных, аллергических и хронических заболеваний в стадии обострения, а также отсутствие отягощенного семейного анамнеза.
Кровь из локтевой вены собирали по 5 мл в центрифужную пробирку и по 4,5 мл в пробирку, содержащую Na-цитратный в процедурном кабинете с соблюдением правил асептики и антисептики.
Сыворотку для исследования содержания общего IgE, сывороточных ИЛ-4, ИЛ-13, ИЛ-10, ИФНу получали методом центрифугирования в течении 15 минут при 1 ООО оборотах, аликвотировали и хранили полученные образцы при t= -80°С до использования. Сыворотки с гемолизом и мутные в исследовании не использовались.
Для выделения ДНК из крови использовали коммерческий набор «МИННИПРЕП», выпускаемый фирмой «Силекс» в соответствии с инструкцией по применению, полученные образцы хранили при t = -80°С.
Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием соответствующих праймеров (табл. 1).
Таблица 1.
Используемые в работе последовательности праймеров.
Полиморфизм Последовательность праймера Т° отжига
Ile50Val S: 5 - A GA GTCTGA TGCGG TTCCTG -3' R: 5'- CGCACTGACCACGTCA ТСС -3' 57°С
Gln576Arg S: 5'-GGCCCCCACCAGTGGCGA ТС-3' R: S'-GCAAGCAGGCTTGAGAAGGC-3' 62°С
Argl30Gln S: 5'- TCCGTGAGGACTGAATGAGA -3' R: 5'- CCGCCTA CCCAAGA С А ТТТТ -3' 55°С
С-1055Т S: 5'- GGAATCCAGCATGCCTTGTGAGG -3' R: 5'- GTCGCCmTCCTGCTCTTCCCGC -3' 60°С
Титрование образцов ДНК относительно замен С-1055Т гена ИЛ-13 и Gln576Arg гена HII4Ra проводили методом ПЦР-ПДРФ с использованием соответствующих рестриктаз (для Gln576Arg - Pvul (CGATACG); для С-1055Т-BstUI(CGACG)). Регистрацию результатов осуществляли методом электрофореза в соответствии с длинами фрагментов ДНК. При анализе полиморфизма С-1055Т гена ИЛ-13 наблюдали продукты рестрикции длиной 224 и 23 п.н., характерные для аллеля С и нерасщепленньш фрагмент длиной 247 п.н., соответствующий аллелю Т. Аналогичным образом регистрировали полиморфизм Gln576Arg гена HJI4Ra. При анализе аллеля А наблюдали нерасщепленный фрагмент длиной 127 п.н., а при анализе аллеля G -продукты рестрикции 107 п.н. и 20 п.н.
Типирование образцов ДНК относительно замен Argl30Gln гена ИЛ-13
и Ие50Уа1 гена ИЛ4Яа проводили с помощью реакции термоциклического
минисеквенирования с использованием соответствующих олигонуклеотидов и
смеси dNTP-ddNTP (для Argl30Gln - 3 '-AAACTmTCGCGAGGGAC-5', dG,
ddT, ddA - для прямой последовательности; и для Ile50Val -
5'-GCTCCGTTGTTTCAGGGA-3', ddT, ddC - для комплементарной
последовательности). Регистрацию осуществляли методом масс-
спектрометрии по наличию в масс-спектрах продуктов реакции ионов
определенной молекулярной массы. При анализе полиморфизма Argl30Gln
9
гена ИЛ-13 пики массой 6125Да и 6775Да соответствовали аллелям А и G соответственно, а при анализе полиморфизма üe50Val пики массой 6007Да и 6023Да соответствовали аллелям А и G соответственно.
Определение уровня общего IgE проводили методом ИФА с помощью коммерческого набора «IgE-ИФА» производства ООО «ЦКФФ» в соответствии с инструкцией по применению. За нормальный уровень общего IgE принимали 100 кЕ/л.
Определение уровней сывороточных питокинов: ИЛ-4. ИЛ-10. ИЛ-13 и ИФНу проводили методом ИФА с использованием соответствующих коммерческих тест-систем: «ИФА EL 4», «ИФА EL 10», «ELISA IL 13» и «ProCon ИФНу», - в соответствии с инструкциями по применению.
Статистическую обработку материала проводили с использованием пакета прикладных программ «Statistica for Windows 6.0». Выборки данных проверяли на нормальность распределения (критерий Колмогорова-Смирнова). При соответствии нормальному закону распределения признака в исследуемых выборках проверку равенства средних выборочных величин проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Для оценки статистической значимости различий показателей выборок, не подчиняющихся закону нормального распределения, использовали непараметрический критерий Манна-Уитни (U-тест). Для внутригрупповых (множественных) сравнений использовали критерий Крускала-Уоллиса (Н-тест). С целью обнаружения связи между исследуемыми показателями проводили корреляционный анализ путем вычисления коэффициента ранговой корреляции Спирмена (г). При сравнении частот гаплотипов использовали стандартный критерий Пирсона. При условии, когда объем выборки не превышал 5 случаев, использовали критерий %2 с поправкой Йетса. Подсчитывали отношение шансов (OR - odd ratio) по методу Woolf с 95%-ным доверительным интервалом (Confidence interval - CI). В том случае, когда один
из показателей был равен О, (Ж вычисляли по формуле, модифицированной НаЫапе для малых чисел (Лакин Г.Ф. 1990).
Собственные исследования.
Нами были исследованы образцы ДНК и сыворотка крови 204 пациентов с БА (средний возраст 40,5±2,7 лет), а также 32 больных АР и 93 здоровых лиц (средний возраст составил 37,5±2,5 и 45±1,6 соответственно).
Таблица 2.
Характеристика исследуемых групп по данным анамнеза.
Степень тяжести бронхиальной астмы. Кол-во Ср. возраст % больных с манифестацией в возрасте
до 17 л с 23 до 38 л после 43 л
Легкая, иптермитирующая 40 33,4±2,2 69,7% 26,5% 4,8%
Легкая, перситирующая 46 36,8±2,8 63,4% 16,7% 19,9%
Средняя 94 44,2±1,8 42,4% 10,2% 47,4%
Тяжелая 24 54,1±4,7 3,5% 11,5% 85%
Анализ распределения тяжести больных БА в зависимости от возраста больных и манифестации заболевания показал, что средний возраст во всех группах не имел достоверно значимых различий (табл. 2). Как видно из таблицы, для больных, диагностированных в возрасте до 17 лет, характерна легкая степень тяжести, а для больных диагностированных после 43 лет -тяжелая. При этом, выявляется положительная корреляция между степенью тяжести и манифестацией заболевания (г=0,47; р<0,05).
По данным анамнеза отягощенным семейным анамнезом обладают 96% пациентов с выявленной астмой до 17 лет и только 6% больных Б А, диагностированных после 43 лет.
Во всех исследуемых группах определяли уровень общего IgE и
сывороточных цитокинов (табл. 3). Повышенное содержание общего IgE
отмечено у 155 больных БА и АР (65%) и у 16 здоровых лиц (17%).
il
Таблица 3.
Содержание общего 1|*Е и сывороточных цитокинов у больных бронхиальной астмой различной степени тяжести.
Группы больных астмой, различной степени тяжести и группы сравнения. Показатели содержания общего (кЕ/л) и цитокинов (т/мл) в сыворотке крови.
ИЛ-4 Я/7-70 ИЛ-13 ИФНу
Аллергический ринит 180(80;380) 4(1;12) 10(1 ;64) 4(1;6) 3(1 ;22)
Легкая, интермитирующая 220(50;490) б(3;34) 18(2;35) КПЗ) 9(1;56)
Пегкая, перситирующая 245(50;940) 11(3;42) 15(1;56) 2(1;6) 60(5;145)
Средняя 250(90;610) 9(3;50) 2(1;20) 1(1;5) 34(12;114)
Тяжелая 170(60;470) 9(2;54) 1(1 ;39) 5(1:10) 12(5;20)
Здоровые 40(19; 100) 3(3; 14) 2(1;17) 4(3;5) 7(2;20)
Содержание общего значительно выше в группе больных БА и АР, по сравнению с группой здоровых. При этом наибольшие значения уровня 1§Е характерны для больных БА средней и легкой степеней тяжести и АР. Значения данного показателя в этих группах существенно отличаются от таковых в группе больных тяжелой БА и здоровых исследуемых (р<0,05).
Наибольшее значение содержания сывороточного ИЛ-4 характерно для группы больных БА с легким персистирующим течением. Наименьшее значение для группы больных БА с интермитирующим течением и больных АР, при этом показатели в этих двух группах не имели достоверно значимых различий (р>0,05). Важно отметить, что показатели уровня сывороточного ИЛ-4 в группах больных БА со средним и тяжелым течением также не различались (р>0,05). Показатели содержания сывороточного ИЛ-13 не имели достоверно значимых различий среди всех исследуемых групп (р>0,05). Наибольшие значения содержания ИЛ-10 характерны для группы больных легкой БА с интермитирующим и персистирующим течением и группы больных АР. Показатели ИЛ-10 во всех трех группах не имели достоверно значимых различий (р>0,05). При этом наименьшие значения характерны для
группы больных БА со средней и тяжелой степенью тяжести, показатели в этих двух группах также не имели достоверно значимых различий. (р>0,05).
Наибольшие значения содержания сывороточного ИФНу были у больных БА с легким персистирующим течением заболевания. Наименьшие показатели ИФНу обнаружены в группе больных легкой степени тяжести БА с интермитирующим течением и у больных АР, при этом достоверно значимых различий между показателями в этих двух группах не было (р>0,05). Важно отметить, что в остальных трех группах больных БА наблюдается обратная тенденция между степенью тяжести заболевания и уровнем сывороточного ИФНу.
При исследовании сывороточных показателей в группе больных АР и атопической БА, легкой и средней степеней тяжести, были выявлены положительная корреляция между уровнем ИЛ-4 и уровнем общего ^Е (1= 0,53; р<0,05), положительная корреляция между уровнями ИЛ-10 и ИЛ-13 (г = 0,39; р<0,05), а также отрицательная корреляция между уровнями ИЛ-10 и ИФНу (г = -0,44; р<0,05). В группе больных тяжелой БА и в группе здоровых лиц достоверных корреляций выявлено не было.
Поскольку имеются литературные данные об ассоциации генов ИЛ-13 и а-цепи его рецептора (ИЛ4Яа) с атопической БА, было проведено исследование полиморфизма этих генов по следующим однонуклеотидным заменам: С-1055Т в промоторной области гена ИЛ-13, Аг§13001п в кодирующей области того же гена, а также 11е50Уа1 и С1п576Аг§ в кодирующей области гена ИЛ4Яа. При этом, больные АР были объединены с группой БА на основании одинаковых иммунологических показателей атопии.
Нами были определены генотипы относительно С-1055Т и Аг§130С1п замен гена ИЛ-13, а также относительно 11е50Уа1 и 01п576Аг§ замен гена ИЛ411а. Оказалось, что частота встречаемости аллеля Т-1055 (полиморфизм С-1055Т) составила 25,14% в группе больных астмой и 26,9% среди здоровых
лиц, а частота встречаемости аллеля А+2044(С1п130) относительно полиморфизма А^13(Ю1п составила 28,65% в группе больных астмой и 32,89% среди здоровых лиц. При этом анализ полиморфных замен 11е50Уа1 и 01п576А[£ гена ИЛ411а показал, что частота встречаемости аллеля (3+398(Уа150) составила 34,61% в группе больных астмой и 38,96% среди здоровых лиц, а частота встречаемости аллеля СН-1902(А^576) составила 83,89% в группе больных БА и 83,1% среди здоровых лиц.
Распределение генотипов в исследуемой и контрольной группах оказалось неравномерное для всех четырёх исследуемых вариантов. Сравнительный анализ распределений генотипов в исследуемых группах не дал достоверно значимых различий (табл. 4).
Таблица 4.
Распределение частоты (%) встречаемости трех возможных генотипов у больных БА и здоровых лиц относительно всех исследуемых замен.
Генотипы гена И Л-13 Генотипы гена ИЛ4Яа
5М> Генотип Б-еБА Здоровые р-1е\~г1 Ггнотш Б-еБА Здоровые р-1еуе1
СС 54,7 47,4 ПеПе 38,4 29,9
С-1055Т СТ 41,1 51,3 0,06 Ле50Уа1 ЛеУа! 53,9 62,3 0,53
ТТ 4,12 1,3 УЫУЫ 7,7 7,8
Агфъ 49,4 38,2 ап551А^ вШп 2,0 1,3
АгёШвЫ АгцРЫ 43,9 57,9 0,3 апАгх 28,2 44,6 0,05
вШп 6,7 3,9 АгяАгя 69,8 54,1
Таким образом, нами не было выявлено ассоциации отдельных полиморфных вариантов С-1055Т и А^ШвЬг гена ИЛ-13, а также 11е50Уа1 и Оп576А^ гена ИЛ4Яа с заболеваемостью атопической БА. Поэтому следующим этапом явилось рассмотрение ассоциации комбинаций этих исследуемых 8№> с заболеваемостью.
Для изученных полиморфных вариантов генов ИЛ-13 и ИЛ4Яа в исследуемых группах распределение комбинаций генотипов (гаплотипов) относительно С-1055Т и А^13(Ю1п замен и относительно 11е50Уа1 и
Gln576Arg замен соответствовало ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга. Величина неравновесия по сцеплению в обоих случаях не значительно отличалась от нуля (0,08 и 0,002 соотв.), что свидетельствует о высокой вероятности совместного наследования аллелей Т(-1055) и А(+2044) в первом случае и аллелей G+398(Val50) и G+1902(Arg576) во втором случае.
Частота встречаемости аллелей Т-1055/А+2044 составила 7,89% в группе больных БА и 9,62% в группе сравнения, а частота встречаемости аллелей +398G/+1902G составила 20,95% и 15,12% в тех же группах. При этом распределение частот встречаемости исследуемых комбинаций аллелей гена ИЛ-13 и комбинаций аллелей гена ИЛ411а не имеет достоверно значимых различий у больных БА и здоровых лиц (табл. 5).
Таблица 5.
Распределение частот встречаемости (%) возможных аллельных комбинаций гена ИЛ-13 и гена ИЛ4Яа у больных Б А и здоровых лиц.
Аллельные комбинации относительно замен С-1055Т и Argl30Gln гена ИЛ-13 и Ile50Val и Gln576Arg гена ИЛ4Яа
С-1055/ Argl30 С-1055/ Glnl30 Т-1055/ Argl30 Т-1055/ Glnl30 Р-level Пе50/ Gln576 Пе50/ Arg576 Val50/ Gln576 Val50/ Arg576 P- level
Больные БА 60,76 17,76 13,59 7,89 1,0 36,31 7,26 35,48 20,95 1,0
Здоровые 54,23 20,38 15,77 9,62 38,37 15,12 31,39 15,12
Особенностью распределения комбинации генотипов относительно полиморфизма С-1055Т и А^13001п(0+2044А) гена ИЛ-13 (рис. 1) явилось то, что для группы здоровых лиц не были выявлены носители -1055ТТ/+13001п01п и -1055ТТ/+130Аг5Агё, а носители -1055СС/+13001п01п и -1055ТТ/+2044АгцИп составляют менее 1%.
0.61
ОН отношение шансов
1.73
■ .
СС-АгвАгк СС-Агвап СС-б|п С1п CT-ArgArg СТ-Агй61п СТ-С1пС1п ТТ-АгеАгй ТТ-Агв^п ТТ^пСп ! ■ Больные БА □ Здоровые ГЛПЛОТИПЫ
Рис 1. Распределение частот встречаемости возможных гаплотипов исследуемых С-1055Т и А^13(Ю1п вариантов гена ИЛ-13 среди исследуемых групп.
Статистический анализ распределения частот гаплотипов выявил достоверно значимые различия между группой больных и здоровых лиц (р = 0,023). На основании распределения комбинаций генотипов были определены величины (Ж (отношение шансов), которые составили для гаплотипа -1055СС/+13001п01п - 3,74 (95% С1 = 1,48 - 28,71), а для гаплотипов -1055ТТ/+130Аг§Аг§ и -1055ТТ/+13001п01п - 2,38 (95% С1 =1,29-19,17).
При анализе комбинаций исследуемых генотипов гена ИЛ4Яа было определено семь вариантов (рис. 2).
■ 45 ! 40
I35
; 30
! 25 I 20
! 15
!
I Ю
| 5
! о
0,82
ОН отношение шансов
1,56
0,63
1,16
ПеИе-АгвАгв |1е!1е-Агв<31п Не11е-С1п31п ПеУа1-Аг8&п 11еУэ1-С1гЮ1п Уа1Уа1-АгвС1п Уа1уУа1-&п01п ■ Больные БА Оэдоровые гаплотипы
Рис. 2. Распределение частот встречаемости возможных генотипов исследуемых 11е50Уа1 и йп576А1£ вариантов гена ИЛ4Яа среди исследуемых групп.
Сочетания +5011еУа1/+576АгЕАг£ и +5 0 Уа1 Уа1/+5 в обеих
группах не выявлялись. Распределение комбинаций генотипов не выявило достоверных различий (р=0,8).
Таким образом, выявлена ассоциация комбинации полиморфизма С-1055Т и Аг§13СЮ1п гена ИЛ-13 с заболеванием БА, в то время как варианты 11е50Уа1 и 01п576А^ гена ИЛ4Яа с таковым не ассоциированы.
Одной из важных функций ИЛ-13 является активация транскрипции генного локуса е-цепи иммуноглобулинов. В связи с этим был проведен анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов ИЛ-13 и его а-цепи рецептора -ИЛ4Яа с повышенным содержанием Распределение значений содержания общего 1бЕ в группах больных БА и здоровых лиц среди носителей различных генотипов исследуемых замен, а также распределение частоты встречаемости повышенного уровня среди исследуемых аллелей не выявило достоверно значимых различий (р>0,05). Поэтому, следующим этапом были проанализированы объединенные генотипы каждого исследуемого гена.
Как было описано выше, комбинации генотипов (галлотипы) относительно замен С-1055Т и Аг§130С1п(Сг+-2044А) гена ИЛ-13 были представлены 9-ю возможными вариантами у больных БА (рис. 3).
У больных БА, носителей гаплотипа-1055ТТ/+130С1п01п, определялось высокое содержание общего 1§Е. При этом множественные внутригрупповые сравнения содержания общего 1§Е среди больных БА, носителей различных сочетаний полиморфизма С-1055Т и Аг§13(Ю1п((1+2044А), выявили достоверно значимые различия уровня общего между группой с генотипом -1055ТТ/+13(Ю1пС1п и остальными 8 группами (табл. б). У здоровых лиц содержание общего было в пределах нормы и не различалось среди носителей 7 генотипов (сочетание генотипов -1055ТТ/+130А^Аг£ и -1055ТТ/+1 ЗООпвк выявлены не были).
Таблица б.
Показатели достоверности различий (р*) содержания Тф при множественном внутригрупповом сравнении у больных бронхиальной астмой.
Группы лиц с различи, гаплотипом по гену ИЛИ СС-А^Агв сс- ArgGln сс-С(пС1п ст-А^Агв ст-А^ап СТ-Оп^л тт- АггАгй тт- Аг$С1п
ТТ-СЫ31п *=0.000 *=0.000 *=0.003 *=0.000 *=0.000 *<0.06 *-0.012 *=0.01
Комбинации генотипов (гаплотипы) относительно полиморфизма Ие50Уа1 (А+3980) и Оп576Агв (А+19(Ш) по гену ИЛ4Яа были представлены 7-ю возможными вариантами как в группе больных, так и в группе здоровых лиц. Сочетание генотипов +5011еУа1/+576Аг§Агд и +50ValVal/+576ArgArg не выявлено ни в одной из исследуемых групп.
Исследование содержания общего ^Е показало его повышение в группе больных астмой - носителей гаплотипа +5011е11е/+576Аг§Аг£ (рис. 4). Множественные внутригрупповые сравнения содержания общего 1§Е среди больных астмой, носителей различных сочетаний полиморфизма Пе50Уа1 и 01п576Аг§, не выявили достоверно значимых различий содержания общего между группой с гаплотипом +5011е11е/+576Аг§Ащ и всеми остальными группами (р>0,05). В группе здоровых содержание общего 1§Е было в пределах нормы и не различалось среди носителей 7-и гаплотипов (р>0,05).
Таким образом, выявлена ассоциация гаплотипа -1055ТТ/+13001пС1п гена ИЛ-13 с повышенным содержанием общего 1§Е в сыворотке крови. Комбинации генотипов относительно Пе50Уа1 и 01п576Аг§, несмотря на тенденцию, достоверно не ассоциированы с повышенным уровнем общего 1%Е у больных БА.
1§Е(МЕ/ил)
3500
3000 -
(
2000 1500 -1000 — 500 ^
335
1
200 270
1 —ц
350 300
200
150
N850
■ш -175%
^25% ш]л
ГАПЛОТИПЫ
CC-AгgArg СС-А^б1п СС-61пС1л СТ-А^п СТ-йп&п П-А^ ТТ-А^Ап ТТ-С1п61п
Рис. 3. Содержание общего 1дЕ у больных БА, носителей возможных гаплотипов относительно замен С-1055Т и А^13(Ю1п гена ИЛ-13.
1§Е (МЕ/мл) 4000 -------
3500 3000 2500 -.2000 1500 ! 1000 : 500 : О ■
850
350
Фт«х
2!% пш
650
ГАПЛОТИПЫ
llelle-ArgArg ИеНе-АгвЗп ИеМе-<В1пС1п 11еУа1-Аг8б1п Ие\й1-С1л61п \ftlva-ArgGln Уа1уУа1-й1пе1п
Рис. 4. Содержание общего ^Е у больных БА, носителей возможных гаплотипов относительно замен Ие50Уа1 и 01п576А^ гена ИЛ4Яа.
Поскольку полиморфные промоторные варианты гена ИЛ-13 влияют на экспрессию бежа, был проведен анализ ассоциаций полиморфизма С-1055Т с содержанием сывороточного ИЛ-13.
Распределение содержания ИЛ-13 среди трех возможных генотипов относительно полиморфизма С-1055Т показало, что значение медианы было выше у лиц, имеющих генотип ТТ как в группе больных, так и в группе здоровых лиц [Ме=3(2;4) и Ме=4(4;4), соотв.] по сравнению с группами лиц, носителей генотипа СТ [Ме=1(1;6) и Ме=](1;4)] и СС [Ме=2(1;6) и Ме=1(1;4)] в группе больных БА и здоровых соответственно. Множественные внутригрупповые сравнения содержания сывороточного ИЛ-13 у лиц, носителей трех различных генотипов, выявили достоверно значимые различия в группе больных атопической БА (р=0,023). При этом уровень достоверности составил 0,0047 при сравнении групп СС-СТ; 0,000 при сравнении СС-ТТ и 0,003 при сравнении СТ-ТТ в группе больных БА. В группе здоровых достоверных различий выявлено не было (р=0,45).
Исходя из сравнительного анализа распределения значений уровня сывороточного ИЛ-13 среди лиц, носителей различных трех генотипов, можно заключить, что полиморфизм С-1055Т ассоциирован с повышенным содержанием сывороточного ИЛ-13.
Отдельные гены предрасполагают к развитию атопии и астмы в связи с тем, что их ДНК может включать полиморфные участки (варианты), изменяющие функцию гена. При моногенных заболеваниях такие варианты нарушают функцию гена и известны как мутантные формы соответствующих генов. При распространенных мультифакторных заболеваниях, каким является атопия, полиморфизм ДНК приводит к более тонким нарушениям функции и экспрессии генов.
Так, исследуя полиморфизм С-1055Т в промогорной области гена ИЛ-13, нами была выявлена ассоциация данного маркера с содержанием
сывороточного ИЛ-13. Можно предположить, что механизм действия связан с образованием дополнительного сайта связывания нуклеотидной последовательности гена для транскрипционного фактора NFkP, что согласуется с ранее опубликованными результатами исследования Van der Pouw Kraan и соавторами (1999). Авторы показали, что в промоторе ИЛ-13 находится предположительно 3 сайта узнавания для NFicß и что последовательность -1055, находящаяся дистальнее одного из них, может влиять на связывающие свойства семейства NFicß. Замена С на Т в промоторной области гена ИЛ-13 изменяет последовательность, характерную для сайта узнавания транскрипционного фактора NFKß. Авторы ссылаются на исследование in vitro, при котором нуклеотидная последовательность GGAAAAAC была изменена на GGAAAATT, что привело к повышению связующих нуклеарных свойств промотора ИЛ-2. Позже этой же группой авторов была выявлена ассоциация генотипа TT с повышенной продукцией ИЛ-13 Т-лимфоцитами.
Нами не были выявлены ассоциации отдельных SNP (С-1055Т, Argl30Gln, Ile50Val, Gln576Arg) с повышенным уровнем IgE и с заболеванием, что побудило провести теоретический анализ структуры ИЛ-13 и ИЛ4Яа и оценить влияние исследуемых нами замен на белок - рецепторное взаимодействие. Гомологичная модель тройного комплекса ИЛ-13 с рецепторами PLH13Ral и ИЛ4Яа была построена с помощью программы SwissPdvViewer3.7. В качестве матрицы была выбрана кристаллическая структура этого комплекса ЗВРО. Эта же программа была использована для моделирования мутагенеза молекулы ИЛ-13. Анализ межмолекулярных интерфейсов и определение контактов для отдельных выбранных аминокислотных остатков проводили с помощью программы iMolTalk. Визуализацию белковых молекул осуществляли с помощью -RasWin 7.2 .
Определение структуры ИЛ-13 показало, что этот цитокин образован четырьмя короткими альфа-спиралями. Поверхность контакта ИЛ-13 с рецепторньш комплексом состоит из 3 основных интерфейсов, обозначенных римскими цифрами I, II и Ш (рис. 5.а).
Связывание HJI4Ra с короткими а-спиралями А- и С- ИЛ-13 формирует интерфейс I, Интерфейс II образован выпухлым изгибом (петля FG2), соединяющим D2 и D3 домены HJI13Ra, который комплиментарно расположен в углублении между С- и D- а-спиралями ИЛ-13. Это взаимодействие в значительной степени является гидрофобным. Поверхность FG2 петли примембранного домена рецептора ИЛ13Яа не содержит полярных или заряженных аминокислотных остатков. Отличительной чертой всех лиганд-рецепторпых комплексов 2-го типа является взаимодействие между интерлейкином И D1 доменом HJI13Ra (интерфейс Ш). Характерной структурной особенностью этого сайта является антипаралельный ¡3-лист, расположенный между C-D тяжами лиганда и С-тяжем рецептора. При контакте ИЛ-13 с рецептором происходит формирование дополнительной связывающей поверхности (Cell, 2008).
Рис. 5. Строение редел торного комплекса, состоящего из ИЛ-13 (сплошной), ИЛ4Яа (штрих) и ШИЗКа! (клетка) вид спереди (а) и сверху (Ь).
Полиморфизм +2044С/А, который встречается у 25% европейцев {Не&тап А. 2000), приводит к замене положительно заряженного Ат£\30 на нейтральный глутамин в Б а-спирали молекулы ИЛ-13 (рис, б а,Ь). Этот аминокислотный остаток расположен непосредственно в месте контакта гидрофобного кармана между А и О а-спиралями цитокина и петлей Р02. Однако этот контакт стабилизируется гидрофобными взаимодействиями, а не ионными или водородными связями. Действительно, при замене аргинина на глутамин не происходит изменений в сети водородных связей, образованных 130 аминокислотным остатком ИЛ-13. Кроме того, как показали результаты молекулярного моделирования, изменение структуры и ориентации боковой цепи этого остатка при мутации не вызывает существенных структурных перестроек в его окружении.
остатка.
Таким образом, проведенный нами структурный анализ рецепторного
комплекса ИЛ-13 позволяет высказать суждение, что замена А^130(ИЛ-13) на
глутамин не оказывает существенного влияния на формирование,
стабильность и функционирование сигнального комплекса этого цитокина.
Подтверждением этому явились последние эксперименты Апгпа (2008), в
которых было установлено, что мутация не изменяет константы связывания
ИЛ-13 с ИЛ1311а1 и стабильность этого комплекса. В то же время было
23
показано, что замена гуанина на аденин в положении +2044 сопровождается увеличением уровня экспресии ИЛ-13. Авторами высказывалось мнение, что данный полиморфизм приводит к образованию более часто встречающегося триплета, который может быть одной из причин повышенного уровня ИЛ-13 и увеличенной концентрации 1цЕ. С другой стороны, повышенная экспрессия ИЛ-13 может определяться неравновесным сцеплением полиморфизма Аг£13001п с другим полиморфным вариантом (С-1055Т), находящимся в промоторе гена ИЛ-13, учитывая, что величина неравновесия по сцеплению практически не отличалась от 0 и составила 0,08.
Увеличение уровня 1§Е, наблюдаемое при полиморфизме +398А—Ю, который приводит к замене 11е50Уа1 в рецепторе ИЛ1311а1, также неясно. Как показывает анализ структурного комплекса ИЛ-13 с ИЛ13Яа1, данная аминокислота располагается на внешней поверхности рецептора ИЛ1311а1 и в месте, удаленном от межмолекулярных интрфейсов интерлейкин-рецепторного комплекса (рис. 5Ь). Замена изолейцина в данном положении на гомологичный валин не изменяет структуру рецептора и не влияет на его связывание как с молекулой цитокина, так и рецептором ИЛ13Яа1. Известно, что 11е50 трансфецированный вариант Ш14Ка В-клеточной линии /-вЕТР и мышей линии ВР-вЕТР в ответ на действие ИЛ-4 проявлял в 1,8 раз большую активность Б1а1б по сравнению с Уа150-трансфецированными КШТРи ВР-вЕТР клетками (Мквиуази Н. 1999).
В этой связи, было высказано мнение, что конформационные изменения рецептора отражаются на передаче сигнала внутрь клетки. Учитывая поверхностное положение полиморфизма 11е50Уа1, мы можем предположить, что данный эффект ассоциирован с другим рецепторным комплексом, находящимся рядом, на поверхности клетки, поскольку и изолейцин и валин содержат неполярные гидрофобные Л-группы, стремящиеся к «себе
подобным» и, следовательно, к наименьшему соприкосновению с НгО.
24
Полиморфизм С1п576А^ локализуется в цитоплазматическом домене рецептора, и не влияет на связывающие характеристики рецептора. Предполагается, что данная замена приводит к изменению уровня фосфорилирования тирозиновых киназ 2 и 8ТАТ6 и, как следствие, изменение в передаче сигнала. А^576 влияет на передачу сигнала через ИЛ4Яа, эффект которого усиливается присутствием полиморфизма Рго478. Так, было показано, что Ат^576 форма рецептора обладает пониженным сродством к внутриклеточной тирозиновой фосфатазе вШМ, включающей сигнал терминации транскрипции гена ИЛ-4. Таким образом, индивиды с Аг§576 характеризуются потерей возможности к супрессии синтеза ИЛ-4, что и является предрасполагающей к атопии особенностью (М^иуаБи Н. 1998). Возможно, отсутствие ассоциации полиморфизма 01п576Аг§ с повышенным уровнем общего 1§Е связанно с другими БИР гена ИЛ411а или других генов, которые оказывают более значительное влияние на молекулярные механизмы развития астмы.
В последние годы особое внимание уделяют распространенности в различных популяциях аллелей генов предрасположенности к тем или иным заболеваниям и их фенотипическим проявлениям в различных условиях внешней среды. В нашем исследовании у больных БА мы выявили ассоциацию комбинации однонуклеотидных замен С-1055Т и Аг§13(Ю1п гена ИЛ-13 с заболеванием. Отношение шансов с заболеваемостью Б А для гаплотипа -1()55СС/13(Ю1п01п составило 3,74(95%С1 =1,48- 28,71), для гаплотипов -1055TT/130AгgArg и -1055ТТ/130Аг§ап - 2,38(95% С1 =1,29-19,17). Была также выявлена ассоциация гаплотипа -1055ТТ/+13(Ю1п01п гена ИЛ-13 с повышенным содержанием общего 1$.. Кроме того, нами выявлена ассоциация промоторного полиморфизма С-1055Т гена ИЛ-13 с повышенным содержанием сывороточного ИЛ-13 у больных БА в сравнении со здоровыми.
При исследовании комбинации полиморфизма 11е50Уа1 и Оп576Аг§ гена ИЛ4Яа мы не выявили ассоциации с заболеваемостью БА, но была отмечена недостоверная тенденция к увеличению общего 1§Е.
По-видимому, географическое положение популяций не всегда коррелирует с распределением частот аллелей важнейших генов и этим объясняется разнообразие (и часто противоречивое) результатов, полученных разными авторами. Проведение исследований в этой области и накопление новых данных по изучению полиморфных вариантов генов ключевых цитокинов будут способствовать пониманию молекулярных механизмов предрасположенности индивидуумов к атопической БА.
Выводы.
1. Клинико-иммунологическое исследование больных атопической БА выявило, что легкое (в том числе ассоциированное с АР) и средне - тяжелое течение заболевания характеризуется наследственной (семейной) отягощенностью и ранней манифестацией клинических симптомов, тогда как у больных БА тяжелой степени тяжести эти характеристики отсутствуют.
У всех обследованных больных на фоне повышенного содержания общего и специфических ¡¡^Е антител выявлено увеличенное содержание сывороточного ИЛ-4, тогда как содержание ИЛ-13 не отличалось от группы здоровых.
2. Отмечено более высокое содержание сывороточного ИЛ-10 у больных АР и БА легкого течения. С утяжелением заболевания, его хроническим персистирующим течением увеличивается уровень сывороточного ИФНу в сравнении с таковым в группе здоровых лиц.
3. Частота встречаемости аллелей в группе больных БА составила: 25,14% для Т-1055; 28,65% для А(С1п130); 34,61% для С(Уа150); 83,89% для 0(0п576) и не отличалась от таковых частот в группе здоровых лиц (26,9%; 32,89%; 38,96%; 83,1% соответственно).
4. Генетический полиморфизм ИЛ-13 и ИЛ4Яа относительно С-1055Т, АгдПОИп, С1п576Аг§, Пе50Уа1 замен не ассоциирован с заболеванием атопической БА и повышенным содержанием общего
5. Выявлена ассоциация промоторного полиморфизма С-1055Т гена ИЛ-13 с повышенным содержанием сывороточного ИЛ-13 у больных БА, тогда как в группе здоровых она не выявлена.
6. Частота встречаемости аллельных комбинаций относительно С-1055Т и Аг§130С1п замен гена ИЛ-13 в группе БА была сравнима с группой здоровых лиц. При этом была выявлена ассоциация гаплотипа -1055ТТ/13001п01пс повышенным уровнем общего 1§Е. В то же время как гаплотипы
-Ю55СС/13(Ю1п01п, 1055TT/130ArgAгg и -1055ТТ/130А^01п ассоциированы с заболеванием.
7. Частота встречаемости аллельных комбинаций относительно 11е50Уа1 и 01п576А^ гена ИЛ4Яа в группе больных Б А была также сравнима с группой здоровых, однако связи комбинации генотипов относительно Ие50Уа1 и 01п576Ащ с заболеванием БА и повышенным содержанием общего ^Е отмечено не было.
Список опубликованных работ по теме диссертации.
1. С.А. Мазурина, В.А. Казначеев. Роль полиморфизма генов - кандидатов в развитии атопической бронхиальной астмы. //Российский аллергологический журнал, 2006, №5, С. 14-22.
2. С.А. Мазурина, В.А. Казначеев, O.E. Воронько. Выявление полиморфизма Argl30Gln в гене интерлейкина-13 и Ile50Val в гене а-цепи рецептора интерлейкина-4 при атопической бронхиальной астм. //Медицинская иммунология, 2006, том 8 №12, стр. 206-207.
3. С.А. Мазурина, Е.В. Зайцева, O.E. Воронько, Н.В. Бодоев, В.А. Казначеев, Ю.В. Гервазиев. Влияние полиморфизма гена интерлейкина 13 на основные маркеры атопии у больных бронхиальной астмой. //Российский аллергологический журнал, 2007, №2, С. 27-31.
4. Мазурина С.А., Гервазиев Ю.В. Полиморфизм гена ИЛ-13 и его ассоциация с атопической бронхиальной астмой. //Медицинская иммунология, 2007, том 9 №2-3, стр. 182-183.
5. Kaznacheev V.A., Mazurina S.A., Frequency of Argl30Gln interleukin-13 gene polymorphism in Russian population and its association with asthma and IgE. //Abstracts of XXVI EAACI Congress.9-13 June 2007, Göteborg, Sweden, Allergy, v. 62 , suppl. 83, abs.366.
6. Mazurina Svetlana, Kaznacheev Valéry, Gervaziev Yuri. IL13 Haplotype and association with atopy. //Abstracts of WAC 2007, Bangkok, Thailand, 2-6 December 2007, abs 532.
7. O.Voronko, E. Zaytseva, S. Mazurina, Yu. Gervaziev, N. Bodoev. Polymorphisms in cytokine genes are associated with asthma and asthma severity in Russian patients. //Abstracts of 6th Annual Cytokines & Inflammation Conference, January 28-29, 2008, Orlando, USA.
8. Мазурина C.A., Гервазиев Ю.В. Ассоциация полиморфизма генов интерлейкина-13 и а-цепи его рецептора (MJI4Ra) с атопической бронхиальной астмой. //Российский иммунологический журнал, 2008, том 2. № 2(11), стр. 133.
Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 15.10.08. Тираж 75 экз. Усл. п.л 1,75 Печать авторефератов: 730-47-74,778-45-60
Оглавление диссертации Мазурина, Светлана Александровна :: 2008 :: Москва
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ.
Цель исследования:.
Задачи исследования:.
Научная новизна и практическая значимость.
Положения, выносимые на защиту:.
ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1. Индукция синтеза IgE при бронхиальной астме.
2.1.1. Механизм перестройки генов иммуноглобулинов на синтез IgE.
2.1.2. Механизмы регуляции синтеза IgE in situ.
2.1.3. Участие регуляторных Т—клеток в механизмах переключения изотипов.
2.2. Аллергический фенотип при бронхиальной астме.
2.2.1. Роль ИЛ-13 в регуляции эозинофилъного воспаления.
2.2.2. Роль ИЛ-13 в развитии субэпителиального фиброза.
2.2.3. Роль ИЛ-13 в регуляции гиперпродукции слизи.
2.2.4. Роль ИЛ-13 в развитии гиперреактивности бронхов.
2.3. Генетический полиморфизм при бронхиальной астме.
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. Исследуемый материал.
3.2. Реагенты и тест-системы.
3.3. Методы исследования.
3.3.1. Выделение ДНК.
3.3.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
3.3.3. Определение полиморфизма методом ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов).
3.3.4. Определение полиморфизма масс-спектрометрическим методом.
3.3.5. Твёрдофазый имму но ферментный анализ.(ELISA).
3.3.6. Оценка интерферонового статуса.
3.3.7. Статистические методы.
ГЛАВА 4. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
4.1. Характеристика групп больных бронхиальной астмой на основании клинико-иммунологического исследования.
4.2. Исследование полиморфизма генов ИЛ-13 и ИЛ-4Яа.
4.2.1. Ассоциация исследуемых SNP с заболеваемостью атопической бронхиальной астмой.
4.2.2. Ассоциация генетического полиморфизма ИЛ-13 и ИЛ4Яа с повышенным содержанием общего IgE.
4.2.3. Ассоциация генетического полиморфизма ИЛ-13 с повышенным содержанием сывороточного ИЛ-13.
ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ГЛАВА 6. ВЫВОДЫ.
Введение диссертации по теме "Аллергология и иммулология", Мазурина, Светлана Александровна, автореферат
Атопическая бронхиальная астма является хроническим воспалительным заболеванием дыхательных путей, в основе которого лежит атопия с увеличенным уровнем общего IgE. Это хроническое воспаление ведет к развитию гиперчувствительности путей в ответ на различные стимулирующие симптомами дыхательных факторы и сопровождается бронхиальной повторяющимися обструкции. обратимой о Современные представления генетической предрасположенности предполагают, что для развития клинической формы этого заболевания требуется наличие в генотипе индивида определенных аллельных вариантов генов, формирующих неблагоприятный наследственный фон, реализующийся под действием факторов внешней среды патологическим фенотипом. Сложность схемы наследования не позволяет точно установить гены, ответственные за развитие данной патологии, и исследования в этой области продолжаются, нося, в основном, накопительный характер. В этой связи интересной выглядит концепция исследования однонуклеотидных замен, известных также как SNP.. SNP single nucleotide polymorphisms, это однонуклеотидные позиции в геномной ДНК, для которых в популяции имеются различные варианты последовательностей в соответствующих генотипе индивида являются генах и их сочетания в к различным предрасполагающими заболеваниям, в т. ч. и к астме. Число генов-кандидатов предрасположенности астме достаточно велико, однако, исходя к бронхиальной из характерных для особенностей развития этого заболевания, интересными исследования являются гены, ответственные за индукцию синтеза IgE одного из основных иммунологических маркеров данного заболевания. К таким генам относятся гены интерлейкинов (ИЛ) и их рецепторов. Известно, что центральным цитокином аллергического ответа является ИЛ-4, активирующий транскрипцию генного локуса тяжелой цепи типа е иммуноглобулинов, тем самым, индуцируя переключение изотипов с М на Е в В-клетках. ИЛ-13 другой, синтезируемый Т-клетками цитокин, который как и ИЛ-4 активирует В-клетки к продукции IgE, независимо от ИЛ-4 [105]. Многочисленные исследования показали, что ИЛ-13 является ключевым цитокином в инициировании астмы у экспериментальных животных [19, 51]. Действие ИЛ-13, осуществляется посредством взаимодействия со своим рецептором на поверхности клеток. Рецептор ИЛ-13 представляет гетеродимерный комплекс, состоящий из а-цепи, общей с рецептором к ИЛ-4 (ИЛ4Ыа) и самостоятельной цепью RJI13Ral. При этом ИЛ13Яа1 является связывающей, в то время как ИЛ4Яа осуществляет Полиморфизм трансдукцию сигнала внутрь клетки [11, 74, генов ИЛ-13 и ИЛ-4Ка определяет и 144]. разнообразие с фенотипических атопией и астмой. Так, проявлений функций ИЛ-13 ассоциирован первые аллельные варианты были определены промоторном участке гена ИЛ-13 С-1055Т [96]. Позднее открыты новые полиморфизмы два в интронах (G+543C в первом интроне и Т+1922С в третьем) и два в кодирующей части гена (A+2043G и А+2579С в транслируемом и З-нетранслируемом регионе, соотв., четвертого экзона) [11]. Найдена ассоциация генотипа Т/Т в участке -1055 от старт-кодона гена ИЛ-13 и увеличенной продукцией этого цитокина [134]. В японской и европейских популяциях была выявлена ассоциация полиморфизма A+2043G (Argl30Gln замена 130 аминокислоты ИЛ-13) с атопической астмой и увеличенным уровнем сывороточного IgE [49,50]. Цитоплазматический вариант замены аминокислоты аргинина на глутамин в положении 551(Gln576Arg), обусловленный полиморфизмом +1902 в гене ИЛ4Яа, был обнаружен при изучении индивидуумов с экземой и гипер-IgE синдромом в популяции британцев [90]. В противоположность этому низкий уровень IgE, ассоциированный с Arg576Gln заменой был обнаружен в популяции немцев [78]. Другой полиморфизм G+398A (аминокислотная замена Ile50Val) в гене HJI4Ra, единственный найденный экстрацеллюлярный вариант рецептора у человека, ассоциирован с бронхиальной астмой, повышенным уровнем общего IgE и IgE-антител к аллергенам клеща домашней пыли [91]. Цель исследования: Исследовать полиморфизм генов ИЛ-13 (С-1055Т и Argl30Gln) и a-цепи его рецептора KJI4Ra (Ile50Val и Gln576Arg) у атопической заболеванием и ИЛ-13. бронхиальной астмой, выявить их больных с ассоциацию и такими иммунологическими маркерами, как IgE Задачи исследования: 1. различной Сформировать степени группы больных бронхиальной и астмой с тяжести, группы здоровых пациентов аллергическим ринитом.Определить в сыворотках исследуемых групп содержание общего IgE, ИЛ-13, ИЛ-4, ИЛ-10 и ИНФу. 3. Провести типирование по гену ИЛ-13 относительно замены С на Т в положении -1055 промоторной области и G на А в +2044 положении кодирующей области гена. 4. Провести типирование по гену ИЛ4Яа относительно замен А на G в положениях +398 и +1902 в кодирующей области. 5. Провести анализ связи выявленных полиморфизмов с заболеванием бронхиальной астмой и показателями IgE и ИЛ-13. Научная новизна и практическая значимость. Впервые на территории РФ среди жителей г. Москвы проведено исследование генетического полиморфизма, ИЛ-13 и ИЛ4Яа по некоторым однонуклеотидным заменам, а также проанализированы его ассоциации с заболеванием атопической бронхиальной астмой и повышенным содержанием общего IgE. Показано, что частота встречаемости аллелей в группе больных астмой, характеризующихся сниженными показателями ИФН-а,-у, ИЛ-10 и ИЛ-13 на фоне повышенного содержания ИЛ-4, общего и специфических IgE, не отличается от таковых частот в группе здоровых лиц. Отмечено отсутствие ассоциации отдельных замен (С-1055Т, Argl30Gln, Gln576Arg, Ile50Val) с заболеваемостью повышенным содержанием общего IgE в исследуемых группах. Выявлена ассоциация промоторного полиморфизма гена ИЛ-13 с повышенным содержанием сывороточного ИЛ-13 у больных астмой в сравнении со здоровой группой.Получены данные об ассоциации полиморфных замен С-1055Т и Argl30Gln ИЛ-13 с заболеванием бронхиальной астмой и повышенным содержанием общего IgE. Для изученных вариантов ИЛ4Яа выявлено отсутствие ассоциации комбинации Ile50Val и Gln576Arg с заболеваемостью астмой и повышенным содержанием общего IgE. Полученные сведения дают информацию как о роли отдельных генов в развитии атопической бронхиальной астмы и содержании общего IgE, так и о гетерогенности данной группы. Кроме того, данные об отсутствии ассоциации отдельных полиморфных замен с заболеванием и повышенным содержанием общего IgE указывают на актуальность дальнейшего анализа комбинаций генотипов различных исследуемых полиморфизмов. Изучение полиморфных вариантов генов ключевых цитокинов будет способствовать выяснению роли генетической составляющей в развитии данного заболевания и могут быть учтены в создании системы ранней диагностики аллергических и других мультифакторных заболеваний. Положения, выносимые на защиту: 1. При исследовании генетического полиморфизма в промоторной и кодирующей областях ИЛ-13 у больных атопической бронхиальной астмой выявлена ассоциация комбинации С-1055Т и Argl30Gln с заболеванием и повышенным содержанием общего IgE, тогда как эти отдельные однонуклеотидные замены не связаны с этими признаками. При этом установлена ассоциация промоторного полиморфизма С-1055Т гена ИЛ-13 с повышенным содержанием сывороточного ИЛ-13 у больных астмой в сравнении со здоровыми лицами.При определении кодирующих полиморфных вариантов гена ИЛ4Яа не выявлено ассоциации отдельных замен (Ile50Val и Gln576Arg) и их комбинаций с заболеваемостью атопической БА и повышенным содержанием общего IgE. 10
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2008 года, Мазурина, Светлана Александровна
1. Балаболкин И.И. Бронхиальная астма у детей. Медицина; 2003, с 145
2. Григорян С.С., Майоров И.А., Иванова A.M., Ершов Ф.И. Оценка интерферонового статуса людей по пробам цельной крови. Вопросы вирусологии 1988; 33 (4): 433-436.
3. Казначеев В. А. Гервазиев Ю. В. Роль полиморфизма генов цитокинов и их рецепторов в развитии атопической бронхиальной астмы. Астма. 2004; №1 с. 73-84
4. Карунас A.C., Измайлова А.Р., Загидуллин Ш.З.,. Хуснутдинова Э.К. Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов с бронхиальной астмой в республике Башкортостан. Цитокины и воспаление, 2007, № 4
5. Лакин Г.Ф. Биометрия. 3-е изд. Высш. школа, 1990, с. 203
6. Флепс Дж. Статистические методы для изучения таблиц долей и пропорций. Финансы и статистика, 1989, с 319
7. Фрейдин М. Б., Кобякова О. С., Огородова Л. М. и др. Наследуемость уровня общего интерлейкина-5 и полиморфизм С-703Т гена IL5 у больных бронхиальной астмой. Бюлл. эксп. биол. мед. 2000, 129(1), 50-52.
8. Фрейдин М.Б., Пузырев В.П., Огородова Л.М. и др. Полиморфизм генов интерлейкинов и их рецепторов: популяционная распространенность и связь с атопической бронхиальной астмой. Генетика. 2002, 38, 1710-1718.
9. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г Иммунология: Учебник для студентов вузов. Изд. 2-е, М, 2002.
10. Ярилин А. А., Донецкова А.Д. Регуляторные FoxP3+ Т-клетки и их роль при аллергии. Российский аллергологический журнал. 2005, 2, 2226.
11. Ahonen C et al. The CD40-TRAF6 axis controls affinity maturation and the generation of long-lived plasma cells. Nature Immunol. 2002, 3, 451-156.
12. Akdis CA, Blesken T, Akdis M, Wiithrich B, Blaser IC. Role of interleukin 10 in specific immunotherapy. J Clin Invest. 1998, 102(1), 98106.
13. Andrews AL, Nasir T, Bucchieri F, Holloway JW, Holgate ST, Davies DE. IL-13 receptor alpha 2: a regulator of IL-13 and IL-4 signal transduction in primary human fibroblasts. J Allergy Clin Immunol. 2006, 118(4), 858-65.
14. Arima K, Sato K, Tanaka G, Kanaji S, Terada T, Honjo E, Kuroki R, Matsuo Y, Izuhara K. Characterization of the interaction between interleukin-13 and interleukin-13 receptors. J Biol Chem. 2005 , 280(26), 24915-22.
15. Bai T. R. Abnormalities an airway smooth muscle in fatal asthma. Am. Rev. Respir. Dis. 1991, 143, 441-443.
16. Basaki Y., Ikizawa K., Kajiwara K., Yanagihara Y. CD40-mediaied tumor necrosis factor receptor-associated factor signaling upregiilates IL-4-induced germline Ce transcription in a human B cell line. Arch. Biochem. Biophys. 2002, 405, 199-204.
17. Blease, K., C. Jakubzick, J. Westwick, N. Lukacs, S. L. Kunkel, C. M. Hogaboam. Therapeutic effect of IL-13 immunoneutralization during chronic experimental fungal asthma. J. Immunol. 2001, 166, 5219-5224.
18. Bober, L. A., M. J. Grace, C Plughese-Sivo, T. A. Waters, L. M. Sullivan, and S. K. Narula. Human IL-10 reduces the number of IL-4-induced IgE B cells in cultures of atopic mononuclear cells. Int. Arch Allergy1.munol. 1994, 105, 26-31.
19. Borggrete T., Keshavarzi S., Gross B., Wabl M., Jessberger R. Impaired IgE response in SWAP-70-deficient mice. Eur. J. Immunol. 2001, 31, 2467-2475.
20. Borggrete T., Wabl M., Akhmedov A.T., Jessberger R.A. B-cell specific DNA recombination complex. J. Biol Chem. 1998, 273, 1702517035.
21. Burchard EG, Silverman EK, Rosenwasser U, Borish L, Yandava C, Pillari A, Weiss ST, et al. Association between a sequence variant in the IL-4 gene promoter and FEV(l) in asthma. Am J Respir Crit Care Med. 1999, 160, 919-922.
22. Cameron LA, Durham SR, Jacobson MR, et al. Expression of IL-4, Ce RNA, and Ie RNA in the nasal mucosa of patients with seasonal rhinitis: effect of topical corticosteroids. J Allergy Clin Immunol. 1998, 101, 330-336.
23. Chen C.L. et al. RAG2-/-, Ikß-/- chimeras display a psonasiform skin disease. J.Invest. Detrmatol. 2000, 115, 1124-1133.
24. Chen W, Jin W, Hardegen N, Lei KJ, Li L, Marinos N, McGrady G, Wahl SM. Conversion of peripheral CD4+CD25- naive T cells to CD4+CD25+ regulatory T cells by TGF-beta induction of transcription factor Foxp3. J Exp Med. 2003, 198(12), 1875-1886.
25. Cheng G. et al. Involvment of CRAF1, a relative of TRAP, in CD40 signaling. Science. 1995, 267, 1494-1498.
26. Cohn L, Homer RJ, MacLeod H, et al. Th2-induced airway mucus production is dependent on IL-4Ralpha, but not on eosinophils. J Immunol. 1999, 162, 6178-6183.
27. Cohn L, Tepper JS, Bottomly K, Cutting edge: IL-4-independent induction of airway hyperresponsiveness by Th2, but not Thl, cells. J1.munol. 1998, 161, 3813-3816.
28. Delphin SJ, Stavnezer J. Characterization of an interleukin 4 (IL-4) responsive region in the immunoglobulin heavy chain germline epsilon promoter: regulation by NF-IL-4, a C/EBP family member and NF-kappa B/p50. J Exp Med. 1995, 181, 181-192.
29. Doherty TM, Kastelein R, Menon S, et al. Modulation of murine macrophage function by IL-13. J Immunol. 1993, 151, 7151-7160.
30. Duetsch, G. et al. STAT6 as an asthma candidate gene: polymorphism-screening, association and haplotype analysis in a Caucasian sib-pair study. Hum.Mol.Genet. 2002, 11(6), 613-21.
31. Durham SR, Gould HJ, Thienes CP, et al. Expression of e germ-line gene transcripts and mRNA for the e heavy chain of IgE in nasal B cells and the effects of topical corticosteroid. Eur J Immunol. 1997, 27, 2899-2906.
32. Fujieda S, Diaz-Sanchez D, Saxon A. Combined nasal challenge with diesel exhaust particles and allergen induces in vivo IgE isotype switching. Am J Respir CellMol Biol. 1998, 19, 507-512.
33. Fukushi J, Ono M, Morikawa W, Iwamoto Y, Kuwano M. The activity of soluble VCAM-1 in angiogenesis stimulated by IL-4 and IL-13. J Immunol. 2000, 165(5), 2818-2823.
34. Ganzer U, Bachert U. Localisation of IgE synthesis in immediate-type allergy to the upper respiratory tract. Otorhinolaryngology. 1988, 50, 257264.
35. Gao PS, Mao XQ, Baldini M, Roberts MH, Adra CN, Shirakawa T, Holt PG, Martinez FD, Hopkin JM. Serum total IgE levels and CD 14 on chromosome 5q31. Clin Genet. 1999, 56, 164-165.
36. Gavett SH, O'Hearn DJ, Karp CL, et al. Interleukin-4 receptor blockade prevents airway responses induced by antigen challenge in mice. AM J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 1997, 272, 253-261.
37. Gervaziev YV, Kaznacheev VA, Gervazieva VB Allelic polymorphisms in the interleukin-4 promoter regions and their association with bronchial asthma among the Russian population. Int Arch Allergy Immunol. 2006, 141(3), 257-64.
38. Ghaffar O, Laberge S, Jacobson MR, et al. IL-13 mRNA and immunoreactivity in allergen-induced rhinitis: comparison with IL-4 expression and modulation by topical glucocorticoid therapy. Am J Respir Cell Mol Biol. 1997, 17, 17-24.
39. Global Strategy for Asthma Management and Prevention. 2007
40. Graves PE, Kabesch M, Halonen M, et al. A cluster of seven tightly linked polymorphisms in the IL-13 gene is associated with total serum IgE levels in three populations of white children. J Allergy Clin Immunol. 2000, 105, 506-513.
41. Grunig, G., M. Warnock, A. E. Wakil, R. Venkayya, F. Brombacher, D. M. Rennick, D. Sheppard, M. Mohrs, D. D. Donaldson, R. M. Locksley, D. B. Corry. Requirement for IL-13 independently of IL-4 in experimental asthma. Science. 1998, 282, 2261-2263.
42. Grunstein MM, Hakonarson H, Leiter J, et al. IL-13-dependent autocrine signaling mediates altered responsiveness of IgE-sensitized airway smooth muscle. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2002, 282, 520-528.
43. Hall I. P., Wheatley A., Wilding P., Liggett S. Association of the Glu27 32-adrenoreceptor polymorphism with lower airway reactivity in asthmatic subjects. Lancet. 1995, 345, 1213-1214.
44. Hall IP, Wheatley A, Christie G, McDougall C, Hubbard R, Plelms PJ. Association of CCR5 delta32 with reduced risk of asthma, Lancet. 1999, 354, 1264-1265.
45. Heinzmann A, Plesnar C, Kuehr J, Forster J, Deichmann KA, Common polymorphisms in the CTLA-4 and CD28 genes at 2q33 are not associated with asthma or atopy. Eur J Immonogenet. 2000, 27, 57-61.
46. Hellquist HB, Karlsson MG, Rudblad S, et al. Activated T cells in the nasal mucosa of patients with grass-pollen allergy: a pilot study. Rhinology. 1992, 30, 57-63.
47. Hershey GK, Friedrich MF, Esswein LA, Thomas ML, Chatila TA. The association of atopy with a gain-of-function mutation in the alpha subunit of the interleukin-4 receptor. N Engl J Med. 1997, 337, 1720-1725.
48. Hilton DJ,Orchansky PL, Ayres SD, Schrader JW., An interleukin (IL)-13 receptor lacking the cytoplasmic domain fails to transduce IL-13-induced signals and inhibits responses to IL-4, J Biol Chem. 1997 272(36):22940-7
49. Hizawa N, Yamaguchi E, Jinushi E, Kawakami Y. A common FCER1B gene promoter polymorphism influences total serum IgE levels in a Japanese population. Am J Respir Crit Care Med. 2000, 161, 906-909.
50. Holloway JW, Dunbar PR, Riley GA, Sawyer GM, Fitzharris PF, Pearce N, Le Gros GS, Beasley R: Association of beta2-adren-ergic receptor polymorphisms with severe asthma. Clin Exp Allergy. 2000, 30, 1097-1103.
51. Iciek LA., Dolphin S.A., Slavnezer J. CD40 cross-linking induces Is germline transcripts in B cells via activation of NF-kB: synergy with IL-4 induction. J.Immunol. 1997, 158, 4769-4779.
52. Ilium P, Balle V. Immunoglobulins in nasal secretions and nasal mucosa in perennial rhinitis. Acta Otolaryngol. 1978, 86, 135-141.
53. Ishida T et al. Identification of TRAF6, a novel tumor necrosis factor receptor-associated factor protein that mediates signaling from an ammo-terminal domain of the CD40 cytoplasmic region. J.Biol. Chem. 1996, 271,28745-28748.
54. Ishida T.K. et al. TRAF5, a novel tumor necrosis factor receptor-associated factor family protein, mediates CD40 signaling. Proc. Nail. Acad. Sci. USA 1996, 93, 9437-9442.
55. Jabara H. et al. The binding site for TRAF2 and TRAF3 but not for TRAF6 is essential for CD40-mediated immunoglobulin class switching. Immunity 2002, 17, 265-276.
56. Jeannin P, Lecoanet S, Delneste Y, Gauchat JF, Bonnefoy JY. IgE versus IgG4 production can be differentially regulated by IL-10. J Immunol. 1998, 160(7), 3555-3561.
57. Kawashima T, Noguchi E, Arinami T, Yarnakawa-Kobayashi K, Nakagawa H, Otsuka F, Hamaguchi H. Linkage and association of an interleukin 4 gene polymorphism with atopic dermatitis in Japanese families. J Med Genet. 1998, 35, 502-504.
58. Kelly-Welch AE, Hanson EM, Boothby MR, Keegan AD. Interleukin-4 and interleukin-13 signaling connections maps. Science. 2003, 300, 1527-8.
59. Kruse S., Japha T., Tedner M. et al. The polymorphisms S503P and Q576R in the interleukin-4 receptor a gene are associated with atopy and influence the signal transduction. Immunology. 1999, 96, 365-371.
60. Kruse, N., Tony, H.P. Sebald, W. Conversion of human interleukin-4 into high affinity antagonist by a single amino acid replacement. EMBO J. 1992, 11,3237-3244.
61. Kuhn, R., Rajewski, K., Miller, W. Generation and analysis of IL-4 deficient mice. Science. 1991, 254, 707-710.
62. Kuperman D, Schofield B, Wills-Karp M, et al. Signal transducer and activator of transcription factor 6 (Stat6)-deficient mice are protected from antigen-induced airway hyperresponsiveness and mucus production. J Exp Med. 1998, 187, 939-948.
63. Kuperman DA, Huang X, Koth LL, et al. Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Nat Med. 2002, 8, 885-889.
64. Laporte JC, Moore PE, Baraldo S, et al. Direct effects of interleukin-13 on signaling pathways for physiologic responses in cultured human airway smooth muscle cells. Am J Respir Crit Care Med. 2001, 164, 141-148.
65. Larche, M., D. S. Robinson, A. B. Kay. The role of T lymphocytes in the pathogenesis of asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 2003, 111, 450-463.
66. Lee SG, Kim BS, Kim JH, Lee SY, Choi SO, Shim JY, Hong TJ, Hong SJ. Gene-gene interaction between interleukin-4 and interleukin-4 receptor alpha in Korean children with asthma. Clin Exp Allergy. 2004 34(8): 1202-8.
67. Leung TF, Tang NL, Chan IH, Li AM, Ha G, Lam CW. A polymorphism in the coding region of interleukin-13 gene is associated with atopy but not asthma in Chinese children. Clin Exp Allergy. 2001 31(10): 1515-21.
68. Li L, Xia Y, Nguyen A, et al. Effects of Th2 cytokines on chemokine expression in the lung: IL-13 potently induces eotaxin expression by airway epithelial cells. J Immunol. 1999, 162, 2477-2487.
69. Liu X, Kohyama T, Wang H, Zhu YK, et al. Th2 cytokine regulation of type I collagen gel contraction mediated by human lung mesenchymal cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2002, 282, 1049-1056.
70. McKenzie GJ, Emson CL, Bell SE, et al. Impaired development of Th2 cells in IL-13 deficient mice. Immunity. 1998, 9, 423-432.
71. Messner B., Stutz A.M., Albrecht B., Peiritsch S., Woisetschlager M. Cooperation of binding sites for STAT6 and NF-KB/rel in the lL-4-induced up-regulation of the human IgE germline promoter. J. Immunol. 1997, 159, 3330-3337.
72. Mitchell TJ, Walley AJ, Pease JE, Venables PJ, Wiltshire S, Williams TJ, Cookson WO. Delta 32 deletion of CCR5 gene and association with asthma or atopy. Lancet. 2000, 356, 1491-1492.
73. Mitsuyasu H, Izuhara K, Mao XQ, Gao PS, Arinobu Y, Enomoto T, Kawai M, Sasaki S, Dake Y, Hamasaki N, Shirakawa T, Hopkin JM. Ile50Val variant of IL4R alpha upregulates IgE synthesis and associates with atopic asthma. Nat Genet. 1998, 19, 119-120.
74. Mitsuyasu, H., Yanagihara, Y., Mao, X.-Q., et al. Dominant effect of Ile50Val variant of the human IL-4 receptor a-chain in IgE synthesis. J. Immunol., 1999, 162, 1227-1231
75. Moffatt MF, Schou C, Faux JA, Cookson WO. Germline TCR-A restriction of immunoglobulin E responses to allergen. Immunogenetics. 1997,46,226-230.
76. Moore PE, Church TL, Chism DD, et al. IL-13 and IL-4 cause eotaxin release in human airway smooth muscle cells: a role for ERK. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2002, 282, 847-853.
77. Mueller TD, Zhang JL, Sebald W, Duschl A., Structure, binding, and antagonists in the IL-4/IL-13 receptor system., Biochim Biophys Acta. 2002, 1592(3):237-50.
78. Nelms K, Keegan AD, Zamorano J, Ryan JJ, Paul WE. The IL-4 receptor: signaling mechanisms and biologic functions. Annu Rev Immunol. 1999;17:701-38.
79. Noguchi E, Shibasaki M, Arinami T, Takeda K, Yokouchi Y, Kawashima T, Yanagi H, Malsui A, Hamaguchi H. Association of asthma and the interleukin-4 promoter gene in Japanese, Clin Exp Allergy. 1998, 28, 449453.
80. Oiso N, Fukai K, Ishii M: Interleukin 4 receptor alpha chain polymorphism Gln551Arg is associated with adult atopic dermatitis in Japan. Br J Dermatol. 2000, 142, 1003-1006.
81. Oettgen H. C. IgE regulation and roles in asthma pathogenesis J Allergy Clin Immunol 2001 V 107 (3) p. 429-441
82. Pantelidis P, Jones MG, Welsh KI, Taylor AN, du Bois RM. Identification of four novel interleukin-13 gene polymorphisms. Genes Immun. 2000, 1(5), 341-5.
83. Patuzzo C, Trabetti E, Malerba G, Martinati LC, Boner AL, Pescollderungg L, Zanoni G, Pignatti PF. No linkage or association of the IL-4Ralpha gene Q576R mutation with atopic asthma in Italian families. J Med Genet. 2000, 37, 382-384.
84. Polvi A., West A., Kinos R. et al. Development of Asthma-Immuno Chip for gene expression studies of asthma and other immune mediated diseases. Am. J. Hum. Genet. 2000, 67, 382.
85. Pope SM, Brandt EB, Mishra A, et al. IL-13 induces eosinophil recruitment into the lung by an IL-5 and eotaxin-dependent mechanism. J Allergy Clin Immunol. 2001, 108, 594-601.
86. Pullen S.S. et al. High-affinity interactions of tumor necrosis factor receptor-associated factors (TRAFs) and CD40 require TRAF trimerization and CD40 mullimerization. Biochemistry. 1999,38, 10168-10177.
87. Punnonen, J., R. de Waal Malefyt, P. van Vlasselaer, J.-F. Gauchat, and J. E. de Vries. IL-10 and viral IL-10 prevent IL-4-induced IgE synthesis by inhibiting the accessory cell function of monocytes. J. Immunol. 1993, 151, 1280-1289.
88. Qiu G, Stavnezer J. Overexpression of BSAP/Pax-5 inhibits switching to IgA and enhances switching to IgE in the 1.29 muB cell line. J Immunol. 1998, 161, 2906-2918.
89. Reihsaus E, Innis M, Maclntyre N, Liggett SB. Mutations in the gene encoding for the beta 2-adrenergic receptor in normal and asthmatic subjects. Am J Respir Cell Mol Biol. 1993, 8, 334-339.
90. Richter A, Puddicombe SM, Lordan JL, et al. The contribution of interleukin (IL)-4 and IL-13 to the epithelial-mesenchymal trophic unit in asthma. Am J Respir Cell Mol Biol. 2001, 25, 385-391.
91. Rosa-Rosa L, Zimmermann N, Bernstein JA, Rothenberg ME, Khurana Hershey GK: The R576 IL-4 receptor alpha allele correlates with asthma severity. J Allergy Clin Immunol. 1999, 104, 1008-1014.
92. Rosenwasser U, Klemm DJ, Dresback JK, Inarnura H, Mascali JJ, Klinnert M, Borish L Promoter polymorphisms in the chromosome 5 gene cluster in asthma and atopy. Clin Exp Allergy. 1995, 25, 74-78, discussion. 95-76.
93. Rothman PSC, Li B, Gorham L, Glimcher F, Alt M, Boothby M. Identification of a conserved lipopolysaccharide-plus-interleukin 4-responsive element located at the promoter of germline epsilon transcripts. Mol Cell Biol. 1991,11, 5551-5561.
94. Sanak M, Pierzchalska M, Bazan-Socha S, Szczeklik A. Enhanced expression of the leukotriene C(4) synthase due to overactive transcription of an allelic variant associated with aspirin-intolerant asthma. Am J Respir Cell Mol Biol. 2000, 23, 290-296.
95. Sha W.C., Liou H.C., Tuomanen E.I., Baltimore D. Targeted disruption of the p50 subunit of NF-KBleads to multilocal defects in immune responses. Cell. 1995, 80, 321-330.
96. Sengler C. et al. Interactions between genes and environmental factors in asthma and atopy: new developments Respir.Res. 2002 V3 (1) p.7
97. Shi HZ, Li S, Xie ZF, Qin XJ, Qin X, Zhong XN. Regulatory CD4+CD25+ T lymphocytes in peripheral blood from patients with atopic asthma. Clin Immunol. 2004, 113(2), 172-178.
98. Shirakawa T, Li A, Dubowitz M, Dekker JW, Shaw AE, Faux JA, Ra C, Cookson WO, Hopkin JM. Association between atopy and variants of the beta subunit of the high-affinity immunoglobulin E receptor. Nal Genet. 1994, 7, 125-129.
99. Shirakawa T, Mao XQ, Sasaki S, Enomoto T, Kawai M, Morirnoto K, Hopkin J. Association between atopic asthma and a coding variant of Fc epsilon R1 beta in a Japanese population letter. Hum Mot Genet. 1996, 5, 2006.
100. Singer M, Lefort J, Vargaftig BB. Granulocyte depletion and dexamethasone differentially modulate airways hyperreactivity, inflammation, mucus accumulation, and secretion induced by rmIL-13 or antigen. Am J Respir Cell Mol Biol. 2002, 26, 74-84.
101. Small P, Barrett D, Frenkiel S, et al. Local specific IgE production in nasal polyps associated with negative skin tests and serum RAST. Ann Allergy. 1985, 55,736-739.
102. Song Z, Casolaro V, Chen R, et al. Polymorphic nucleotides within the human HJI-4 promoter that mediate overexpression of the gene. J.Immunol. 1996; 156, 424-429.
103. Stiitz A.M, Woisetschlager M. Functional synergism of STAT6 with either NF-kappa B or PU.l to mediate IL-4-induced activation of IgE germline gene transcription. J Immunol. 1999, 163, 4383-4391.
104. Sugai M. el al. Essential role of lcl2 in negative regulation of IgE class switching. Nature Immunol. 2003, 4, 25-30.
105. Sun X.H., Copeland M.G., Jenkins N.A., Baltimore D. Id proteins Idl and Id2 selectively inhibit DMA binding by one class of helix loop-helix proteins. Mot. Cell. Biol 1991, 11,5603-5611.
106. Suzuki I, Hizawa N, Yamaguchi E, Kawakami Y. Association between a C+33T polymorphism in the IL-4 promoter region and total serum IgE levels. Clin Exp Allergy. 2000, 30(12), 1746-9
107. Suzuki I, Yamaguchi E, Hizawa N, lloh A, Kawakami Y. A new polymorphism in the 5' flanking region of the human interleukin (IL)-4 gene. Immunogenetics. 1999, 49, 738-739.
108. Takeda K. et al. Essential role of State in IL-4 signalling. Nature. 1996, 380, 627-630.
109. Tan S, Hall IP, Dewar J, Dow E, Lipworth B. Association between beta 2-adrenoceptor polymorphism and susceptibility to bronchodilator desensitisation in moderately severe stable asthmatics. Lancet. 1997, 350, 995-999.
110. Thienes C.P. et al. The transcription factor B cell-specific activator protein (BSAP) enhances both IL-4- and CD40-mediated activation of the human 8 germline promoter. J.Immunol. 1997, 158, 5874-5882.
111. Vercelli D. Novel insights into class switch recombination. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2002, 2(2), 147-151.
112. Vercelli D. One cytokine, two isotypes: a trojan horse, pandora's box, and an evolving paradigm. Am J Respir Crit Care Med. 2000 ; 162: 86-90.
113. Walley, A.J., Cookson, W.O. Investigation of an interleukin-4 promoter polymorphism for associations with asthma and atopy. J Med Genet. 1996, 33,689.
114. Wang M, Xing ZM, Lu C, Ma YX, Yu DL, Yan Z, Wang SW, Yu LS. A common IL-13 Argl30Gln single nucleotide polymorphism among Chinese atopy patients with allergic rhinitis. Hum Genet. 2003 Oct; 113(5):387-90.
115. Wen FQ, Kohyama T, Liu X, et al. Interleukin-4- and interleukin-13-enhanced transforming growth factor beta-2 production in cultured human bronchial epithelial cells is attenuated by interferon-gamma. Am J Respir Cell Mol Biol. 2002, 26, 484-490.
116. Wills-Karp M, Luyimbazi J, Xu X, et al. Interleukin-13: central mediator of allergie asthma. Science. 1998, 282, 2258-2261.
117. Yan L, Galinsky RE, Bernstein JA, Liggett SB, Weinshilboum RM: Histamine N-methytransferase pharmacogenetics: association of a common functional polymorphism with asthma. Pharmacogenetics. 2000, 10, 261-266.
118. Yang M, Hogan SP, et al. IL-13 mediates airways hyperreactivity through the IL-4 receptor-alpha chain and STAT-6 independently of IL-5 and eotaxin. Am J Respir Cell Mol Biol. 2001, 25, 522-530.
119. Ying S, Durham SR, Jacobson MR, et al. T lymphocytes and mast cells express messenger RNA for interleukin-4 in the nasal mucosa in allergeninduced rhinitis. Immunology. 1994, 82, 200-206.
120. Ying S, Humbert M, Meng Q, et al. Local expression of e germline gene transcripts and RNA for the e heavy chain of IgE in the bronchial mucosa in atopic and nonatopic asthma. J Allergy Clin Immunol. 2001, 107,
121. Zhang W, Zhang X, Qiu D, Sandford A, Tan WC. IL-4 receptor genetic polymorphisms and asthma in Asian populations. Respir Med. 2007 101(1): 186-90.
122. Zhu Z, Homer RJ, Wang Z, et al. Pulmonary expression of interleukin-13 causes inflammation, mucus hypersecretion, subepithelial fibrosis, physiologic abnormalities, and eotaxin production. J Clin Invest. 1999, 102,
123. Zurawski, S.M., Vega, F. Jr., Huyghe, B, Zurawski G. Receptors for interleukin-13 and interleukin-4 are complex and share a novel component that functions in signal transduction. EMBO J. 1993, 12, 2663-2670.686.692.779.788.