Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Генетические маркеры прогнозирования преэклампсии

На правах рукописи 005049539

ХАЛФОРД-КНЯЗЕВА ИНЕССА ПАВЛОВНА

Генетические маркеры прогнозирования преэклампсии

14.01.01 - акушерство и гинекология 03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

7 ФЕВ 2013

Москва 2013

005049539

Работа выполнена на кафедре акушерства и гинекологии, кафедре биохимии и молекулярной медицины Факультета фундаментальной медицины ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», на кафедре акушерства и гинекологии с курсом перинатологии ФГБУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО РУДЫ,

заведующий кафедрой акушерства и гинекологии с курсом перинатологии Виктор Евсеевич Радзинский

кандидат медицинских наук, доцент, ФГБОУ ВПО МГУ им. М.В. Ломоносова, старший научный сотрудник лаборатории генных и клеточных технологий Факультета фундаментальной медицины Лариса Михайловна Самоходская

Официальные оппоненты: Шалина Раиса Ивановна,

доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава РФ, профессор кафедры акушерства и гинекологии педиатрического факультета

Титов Владимир Николаевич,

доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ РКНПК Минздрава РФ, руководитель лаборатории клинической биохимии липидного обмена

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-

стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава РФ

Защита диссертации состоится »-ФДЗоЬсг.Ал.% 2013 г. в _ на заседании

диссертационного совета Д 212.203.01 приФГБУВПО «Российский университет дружбы народов» по адресу 117333, г. Москва, ул. Фотиевой, д. 6.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. б.

Автореферат разослан «18» января 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Ордиянц Ирина Михайловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Преэклампсия (ПЭ), или гестоз - осложнение беременности, развивающееся после 20-й недели и характеризующееся полиорганной недостаточностью. В основе синдрома ПЭ лежит генерализованная эндотелиальная дисфункция, ведущая к расстройству общего кровообращения во время беременности. В мире ПЭ осложняет течение беременности в 2 - 8%, и является одной из главных причин заболеваемости и смертности матери и плода (khan K.S. et al., 2006; Duley L., 2009; Berg C.J. et al., 2009; Steegers E.A. et al., 2010). В структуре причин преждевременных родов во всем мире на долю ПЭ приходится до 15% (Duley L., 2009; Berg C.J. et al., 2009). В РФ частота заболеваемости ПЭ на редкость стабильна и варьирует от 22,2% до 17,8% за последние десять лет (Радзинский В.Е., 2012). Уровень заболеваемости новорожденных на фоне ПЭ колеблется от 64 до 78%, а перинатальная смертность составляет 18-30%о (Радзинский В.Е., 2012). По данным ВОЗ, у каждого 5-го ребёнка, родившегося от матери с ПЭ, в той или иной степени происходит нарушение физического и психоэмоционального развития, значительно выше уровень заболеваемости в младенческом и раннем детском возрасте.

До настоящего времени, несмотря на достигнутый высокий уровень ряда медицинских технологий, многие вопросы, посвященные проблеме ПЭ, остаются малоизученными, спорными и противоречивыми. Излечить ПЭ невозможно, поэтому цель терапии - предотвратить прогрессирование имеющегося заболевания и уменьшить выраженность клинических симптомов. Эффективность коррекции данного состояния значительно выше при начальных стадиях заболевания. Следовательно, актуален поиск методов прогнозирования и ранней диагностики ПЭ, оценки вероятности развития ПЭ еще до беременности, чтобы своевременно провести комплекс профилактических мероприятий и предгравидарную подготовку (Irminger-Finger I. et al., 2008; Kalkunte S. et al., 2009).

Причина ПЭ остаётся до сих пор до конца не ясной и зависит от множества факторов. В основе патогенеза ПЭ лежит патологическая инвазия трофобласта, связанная с нарушением трансформации мышечного слоя спиральных артерий миометрия, в результате чего развивается острая дисфункция эндотелия спиральных артерий и системный эндотелиоз, происходит системный сосудистый спазм и формируется системный воспалительный ответ. Эти процессы сопровождаются нарушением в работе систем гемостаза, ангиогенеза, ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС) (Поздняков И.М. и соавт., 2008; Mütze S. et al., 2008; Wang Z. et al., 2009; Wang A et al., 2009; Myatt L., Webster R.P., 2009).

ПЭ рассматривают как генетически детерминированную недостаточность процессов адаптации материнского организма к новым условиям существования, которые возникают с развитием беременности (Национальное руководство «Акушерство», 2007). Роль генетических

факторов в развитии ПЭ составляет более 50%, и вклад материнских генов в этот процесс превышает генетическую компоненту плода (Cnattingius S. et al., 2004; Goddard K.A. et al., 2007; Roten L.T. et al. 2009). К настоящему времени изучено более 50 генов, предположительно связанных с развитием ПЭ (Chappell S., Morgan L., 2006), однако полностью определить спектр генов, ответственных за развитие ПЭ, еще не удалось.

68% женщин с ПЭ имеют отеки (Sibai В., 2005), однако, в большинстве стран отечный синдром как критерий диагноза ПЭ не рассматривается, так как отеки возможны и при физиологическом течении беременности. В тоже время, выраженные отеки могут служить предвестником дальнейшего развития ПЭ, поскольку отражают повышенную проницаемость эндотелия сосудов и недостаток белка в плазме крови, что может быть связано с дисфункцией эндотелия и экскрецией белка почками.

Цель исследования.

Оценить роль полиморфизма генов белков, связанных с регуляцией артериального давления (АД), участвующих в плацентации, связанных с оксидативным стрессом и влияющих на функцию эндотелия, вовлеченных в системный воспалительный ответ, в прогнозировании риска развития ПЭ.

Задачи исследования:

1. Изучить и сравнить частоты встречаемости аллельных вариантов генов белков, связанных с РААС - АСЕ (I/D), AGT (М235Т); участвующих в плацентации - VEGF (С936Т), ММР9 (С(-1562)Т); связанных с оксидативным стрессом и влияющих на функцию эндотелия - NOS3 (G894T, intron 4a/b), CYBA (С242Т), MTHFR (C677T); вовлеченных в системный воспалительный ответ -MBL2 (G161A codon 54), у беременных с ПЭ и в группе контроля.

2. Изучить взаимосвязь носительства комбинаций вышеуказанных генов с формированием предрасположенности к развитию ПЭ и выявить комбинации аллельных вариантов генов, обладающие наибольшей прогностической ценностью.

3. Определить группы риска развития ПЭ по данным различных сочетаний генотипов полиморфизмов исследованных генов.

Научная новизна.

> В результате проведенного исследования расширены представления о роли ряда генов белков, связанных с РААС, участвующих в плацентации, связанных с оксидативным стрессом и влияющих на функцию эндотелия, вовлеченных в системный воспалительный ответ, в развитии ПЭ и расширены представления о патогенезе данного осложнения.

> Впервые проанализирована встречаемость различных комбинаций генотипов аллельных вариантов изученных генов у женщин с ПЭ в сравнении с женщинами с нормально протекающей беременностью.

> Впервые изучен синергический эффект различных сочетаний «функционально неблагоприятных» генотипов, а также антагонистический эффект различных сочетаний «благоприятных» и «неблагоприятных» генотипов данных генов при развитии ПЭ.

> Доказана возможность использования определения носительства мутантного аллеля 161А гена МВЬ2, мутантного аллеля О гена АСЕ и мутантного генотипа 235ТТ гена ЛОТ в качестве информативных маркеров прогнозирования развития ПЭ.

Практическая значимость.

Определение комбинаций генотипов генов АСЕ, МВЬ2, АвТ может быть использовано в качестве предгравидарного прогнозирования и доклинической диагностики ПЭ. Это позволит выделить группы риска развития ПЭ и провести раннее оздоровление женщин до и во время беременности с целью улучшения исхода беременности и родов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Носительство аллельных вариантов генов белков, связанных с регуляцией АД (АСЕ, АСТ), и белков, участвующих в развитии системного воспалительного ответа (МВЬ2), ассоциировано с развитием ПЭ с отечным синдромом.

2. Оценка сочетаний генотипов генов (пары АСЕ-МВЬ2 и МВЬ2-АСТ), а также подсчет количества одновременно выявляемых мутаций (пара АСЕ-МВЬ2) более точно определяют вероятность развития ПЭ.

3. Носительство полиморфных маркеров разных генов имеет не только значимость, но и разнонаправленность действия (не только негативное, но и протективное) на вероятность развития ПЭ.

4. Определение в крови мутантных аллельных вариантов генов АСЕ, МВЬ2 и АСТ с применением балльной шкалы оценки результатов генотипирования аллельных вариантов данных генов, может быть применено для выявления степени риска развития ПЭ.

5. Отечный синдром ассоциирован с тремя выявленными полиморфизмами, тогда как протеинурия и артериальная гипертензия (АГ) не связаны с полиморфизмами АСЕ ИТ) и АСТ М235Т, что может указывать на влияние других полиморфизмов в развитии АГ и протеинурии.

Внедрение результатов исследования.

Результаты исследования используются в учебном процессе; для оценки данных генотипирования пациенток с ПЭ; при выполнении государственного контракта № 16.512.11.2030 от 14 февраля 2011 г. с Министерством образования и науки РФ по теме «Разработка метода дифференцированного выявления генетических маркеров аллельных вариаций генов материнской и фетальной ДНК, ведущих к нарушению роста и развития плода, в крови матери».

Апробация работы.

Основные положения работы доложены и обсуждены на совместном заседании сотрудников кафедры биохимии и молекулярной медицины, кафедры акушерства и гинекологии факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова и кафедры акушерства и гинекологии с курсом перинатологии РУДН (8 июня 2012).

Материалы диссертации доложены на 13м международном конгрессе по контраверсиям в акушерстве, гинекологии и вопросах бесплодия (Берлин, Германия, 2010).

Публикации.

По теме диссертационной работы опубликовано 8 печатных работ в отечественной и зарубежной печати, из них 3 — в журналах, включенных в перечень ВАК РФ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, содержащего 21 отечественный и 144 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 40 таблицами и 25 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Контингент, материалы и методы исследования.

Для решения поставленных задач были обследованы 216 женщин в возрасте от 20 до 41 года. Основную группу составили 116 пациенток с «чистой» формой ПЭ и с выраженным отечным синдромом. В контрольную группу вошли 100 родильниц с физиологическим течением одноплодной беременности и родов (отсутствие симптомов ПЭ и отеков), а также отсутствием ПЭ в анамнезе.

Критериями включения в основную группу стали: наличие у беременных симптомов ПЭ или выраженных отеков, одноплодная беременность, оба родителя принадлежат к славянской народности. Критериями исключения для обеих групп являлись сопутствующие экстрагенитальные заболевания (гипертония, системные аутоиммунные, эндокринные заболевания), диагностированные вне беременности; наличие специфических инфекций, нейроинфекции, черепно-мозговые травмы в анамнезе, нейродегенеративные заболевания, опухоли головного мозга; наличие у плода аномалий развития, Шьконфликга; вредные привычки женщины (курение, злоупотребление алкоголем, наркотиками). Критериями диагноза «преэклампсия» послужили: артериальная гипертензия (повышение систолического АД >135 мм рт. ст., диастолического >85 мм рт. ст., при гипотензии - увеличение систолического АД на 30 мм рт. ст. и более от исходного до беременности, а диастолического — на 15 мм рт. ст. и выше); протеинурия - от 300 мг/сутки. Диагноз ставился при наличии хотя бы одного критерия (Национальное руководство

6

«Акушерство», 2007; Руководство по амбулаторно-поликлинической помощи в акушерстве и гинекологии, 2007). Критериями отечного синдрома послужили: отеки ног, рук, живота, лица (не пропадают после ночного отдыха); скрытые отеки (патологическая прибавка массы тела >900 г за неделю, неравномерно) (http://www.preeclampsia.org/health-information/signs-апё-вутрШтв).

Всем исследованным женщинам проводилось полное клиническое обследование, изучение анамнеза, физикальных и лабораторных данных; акушерское исследование; объективное обследование новорожденных. У каждой женщины, включенной в исследование, проводился забор венозной крови для генетического анализа, состоящего из этапа выделения ДНК и последующего проведения полимеразной цепной реакции.

Статистическая обработка данных проводилась при помощи пакета 81аи5Йса 8.0 с использованием ^критерия Стьюдента, критерия Манна-Уитни и Фишера для параметрических признаков. Для исследования зависимости непараметрических признаков использовались таблицы сопряженности 2x2 с применением двустороннего точного критерия Фишера, в таблицах сопряженности 2x3 и 3x4 применялся критерий у2 Пирсона. Производился расчет отношения шансов (ОШ) и доверительного интервала (ДИ). Многофакторный анализ проводился с использованием модели логистической регрессии. Подбор коэффициентов для создания балльной шкалы осуществлялся при помощи регрессионного анализа. Уровень значимости был принят как р<0,05.

Клиническая характеристика обследованных женщин.

Средний возраст женщин основной и контрольной групп существенно не различался (28,26±4,38 и 29,13±4,83 лет соотв., р>0,05). Средние значения индекса массы тела (ИМТ) в сравниваемых группах не выходили за пределы нормальных показателей, однако женщины основной и контрольной групп статистически достоверно отличались по средним значениям ИМТ (р<0,05), а у женщин с тяжелой ПЭ ИМТ оказался повышенным (25,87±1,96 и 21,11±2,58, р=0,0040). У 43,1% обследованных женщин основной группы выявлен только выраженный отечный синдром. У 56,9% женщин основной группы в той или иной степени выраженности были выявлены артериальная гипертензия и/или протеинурия во время данной беременности, где протеинурия встречалась у 36,2% женщин с ПЭ, а повышение АД - у 37,9%.

Спектр выявленных соматических заболеваний в основной и контрольной группах был представлен заболеваниями сердечно-сосудистой (10,3% и 8,0% соответственно), дыхательной (5,2% и 3,0%), пищеварительной (15,5% и 19,0%) и мочевыделительной (17,2% и 9,0%) систем, а также заболеваниями иммунной системы (аллергические реакции) (25,0% и 18,0%), анемией (5,2% и 0%) и миопией разной степени (34,5% и 29,0%) (р>0,05).

У женщин в основной и контрольной группах средний возраст менархе, длительность менструального цикла и продолжительность менструаций были

7

сопоставимы и соответствовали физиологическим параметрам. Однако в основной группе, в отличие от группы сравнения, обращает внимание достоверно более высокая частота обильных менструаций (16,4% и 5,0%, р=0,0088) и дисменореи (22,4% и 10,0%, р=0,01717).

Анализ гинекологической заболеваемости выявил статистически достоверную разницу только в наличии миомы матки, в основной группе она обнаружена у 5,2% пациенток, а в контрольной - ни у одной (р<0,05). ВЗОМТ встречались у 12,1% женщин основной группы и у 12,0% женщин группы контроля, кисты яичников — у 4,3% и 4,0% соответственно, нарушения менструального цикла - у 4,3% и 3,0%, доброкачественные заболевания шейки матки - у 14,7% и 10,0% (р>0,05). В группе контроля, в отличие от женщин основной группы, чаще наблюдался эндометриоз (6,0% и 5,2%), вагинит (27,0% и 23,3%) (р>0,05).

В репродуктивном анамнезе у женщин основной группы, в отличие от женщин группы контроля, чаще встречались неразвивающаяся беременность (12,9% и 9,0%) и самопроизвольные выкидыши (15,5% и 11,0%) (р>0,05). Частота абортов была выше среди женщин группы сравнения, в отличие от женщин с ПЭ (29,0% и 25,0%) (р>0,05). Наследственность близких кровных родственниц по женской линии у женщин основной группы отягощена ПЭ в 4,3 раза чаще, чем у женщин группы сравнения (12,9% и 3,0%, р=0,0118).

При анализе осложнений данной беременности в основной группе, в сравнении с женщинами группы контроля, достоверно чаще встречались: угроза прерывания текущей беременности (36,2% и 17,0%), ОРВИ (36,2% и 23,0%), гестационный сахарный диабет (8,6% и 1,0%), хроническая фетоплацентарная недостаточность (23,3% и 5,0%), маловодие (11,2% и 3,0%) (р<0,05). Частота вагинитов, гестационного пиелонефрита, раннего токсикоза беременных, многоводия в обеих группах статистически не отличалась (р>0,05).

При анализе данных обследования новорожденных значимых различий по степени доношенности между группами не отмечалось (р>0,05), однако, при сравнении средней и тяжелой степеней ПЭ с контрольной группой выявлены статистически значимые отличия гестационного срока родоразрешения (38,63±1,07 и 39,20±0,99, р=0,0217; 35,50±5,20 и 39,20±0,99, р=0,0452). Показатели среднего веса и роста новорожденных между основной и контрольной группами достоверно не различались (р>0,05). При средней тяжести и тяжелой ПЭ средний вес и рост новорожденных снижены статистически значимо (р<0,05). Отмечаются статистически значимые отличия в состоянии новорожденных по шкале Апгар на первой и пятой минутах жизни (7,69±0,72 и 8,08±0,46, р=0,0004; 8,27±0,66 и 8,65±0,56, р=0,0001). С утяжелением ПЭ средняя оценка по шкале Апгар ухудшается со статистической значимостью по сравнению с новорожденными группы контроля (р<0,05). У новорожденных основной группы и группы сравнения выявлены гипоксия плода (30,2% и 6,0%), морфофункциональная незрелость (20,7% и 5,0%), задержка роста плода (7,8% и 0%) (р<0,05).

Результаты молекулнрно-генетпчсского исследования.

Гены белков, принимающих участие в регуляции АД.

РАЛС играет центральную роль в регуляции АД, сосудистого ре моделирования и внеклеточного объема жидкости. Во время беременности у матери функционируют две основные ренин-продуцирующие системы: почечная и маточно-плацентарная (Shah D.M., 2005). Полноценная локальная РААС в маточно-плацентарной системе может регулировать регионарный материнской межворсинчатый кровоток.

При исследовании полиморфизма i/D гена ангиотензшшревращающего фермента (АСЕ) было обнаружено, что среди женщин основной группы частота встречаемости мутантной D-аллели выше, а гомозиготного генотипа i-аллели ниже, по сравнению с женщинами группы контроля (р=0,0206 и р=0,0099 соотв.). Процент гетеро- и гомозиготных носительниц аллели D был выше в основной группе (р=0,0099) (рис. 1).

%

120,0 100,0 80,0 ■ 60,0 ■ 40,0 20,0 0,0

□ Основная группа □ Контрол!

ОШ=1,57

59,5 |1'07;'321

— 482]= JJlJ Г^ 40,5

1 : -! ^

%

120,0 100,0 -80,0 60,0 40,0 * 20,0 0,0 +

□ Основная груша □ Контроль

0111=0,44

ОШ=2,25 79,3

[0,24-0,82] [1,22-4,14] _55,2__

37,0

20,7

45,0

24,1.

18,0

63,0

D-аллель

iD

DD iD+DD

Рисунок 1. Частота встречаемости аллелей и генотипов полиморфизма ¡/О гена АСЕ среди женщин основной и контрольной групп

Исследование полиморфизма М235Т (Т704С) гена ангиотензиногена (ДСП ) показало, что среди женщин основной труппы, в отличие от женщин группы сравнения, была выявлена более низкая частота встречаемости мутантной 235Т-аллсли (р>0,05), а также достоверно реже встречался мутантнын генотип 235ТТ (р=0,0327) (табл. 1).

Таблица 1. Распределение встречаемости генотипов и аллелей гена АвТ

Группы/ М-аллсль Т-аллель ММ мт TT МТч ТГ

значимость % Ol) % (п) % (п) % (п) % (л) % (п)

Основная 53,4 46,6 23,3 60,3 16,4 76,7

N-116 (124) (108) (27) (70) (19) (89)

Контрольная 45,5 54,5 20,0 51,0 29,0 80,0

N-100 (91) (109) (20) (51) (29) (80)

ОШ 0,73 1,21 1,46 0,48* 0,82

[95% ДИ] [0,49-1,07] [0,63-2,34] [0,85-2,52] [0,25-0,931 [0,43-1,59]

*(р<0,05, для 2-хстор. тсста Фишера) - достоверность показателей основной группы по отношению к соответствующим показателям контрольной группы

9

Возможно, нарушению ремоделирования спиральных артерий способствует не столько увеличение локальной концентрации ангиотензина П (Ang II), сколько повышенная чувствительность его рецепторов (ATiR) (Herse F. et al., 2007). На это указывает выявленная нами более высокая частота встречаемости аллели D гена АСЕ (носительство которой связывают с повышением чувствительности ATiR к Ang II) у женщин основной группы по сравнению с женщинами группой контроля. В последнее время ПЭ рассматривается с позиций аутоиммунного заболевания, при котором вырабатываются аутоантитела к АТД (AA-ATiR) (Parrish M.R. et al., 2011). Возможно, повышенная локальная концентрация AGT, а значит и Ang II, отмечаемая у носительниц мугантной 235Т аллели, приводит к уменьшению связывания AA-AT1R с AT1R, тем самым нивелируя их негативный эффект. Более того, в исследовании Adrian Mondiy и соавт. (2005) показано, что генотип 235ТТ гена AGT снижает риск развития гипертензии, особенно у женщин, что также идет вразрез с результатами других исследований о роли данного полиморфизма в развитии гипертонии. Это может свидетельствовать о некой особенности РААС женского организма, что может быть связано с гормональным гомеостазом вне и во время беременности.

Гены белков, вовлеченных в патогенез эндотелиальной дисфункции.

В основе патогенеза ПЭ и отечного синдрома во время беременности лежит дисфункция эндотелия, ассоциированная с оксидативным стрессом. Последний развивается в результате активации NADPH-оксидазы и нарушения синтеза оксида азота (NO) эндотелиальной NO-синтазой (eNOS). Недостаток фермента метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), которая играет ключевую роль в метаболизме фолиевой кислоты, необходимой для превращения гомоцистеина (ГЦ) в метионин, также ведет к развитию оксидативного стресса.

При исследовании полиморфизма С242Т гена р22рИох-субъединицы NADH-оксидазы (СУВА) было обнаружено, что среди женщин основной группы, в отличие от женщин группы сравнения, была отмечена повышенная частота встречаемости минорной 242Т-аллели (р>0,05) (табл. 2).

Исследование полиморфизма G894T (Glu298Asp) гена eNOS (NOS3) показало, что среди женщин основной группы была отмечена повышенная частота встречаемости минорной 894Т-аллели, в отличие от женщин группы сравнения (р>0,05) (табл. 2).

При исследовании полиморфизма 4а/Ь гена NOS3 было обнаружено, что среди женщин основной группы, по сравнению с женщинами группы контроля, была отмечена повышенная частота встречаемости гетерозиготного генотипа 4Ьа, и пониженная частота встречаемости мутантного генотипа 4аа (р>0,05) (табл. 2).

При исследовании полиморфизма С677Т гена MTHFR не было выявлено достоверных различий по частоте распределения встречаемости аллелей или генотипов среди женщин основной и контрольной групп. Это

может быть связано с адекватными дозами фолиевой кислоты, которую назначают всем беременным на ранних сроках беременности (табл. 2).

Таблица 2. Распределение встречаемости генотипов и аллелей генов, вовлеченных в патогенез эндотелиальной дисфункции, среди женщин основной и контрольной групп_

Группы/ \*Л-аллсл!, Мш-аллель XVI Н«* МШ Нй+Мт

значимость % (п) % (п) % (п) % (п) % (п) %(п)

СУВА С242Т

Основная 67,2 32,8 44,0 46,5 9,5 56,0

N=116 (156) (76) (51) (54) (11) (65)

Контрольная 71,5 28,5 50,0 43,0 7,0 50,0

N=100 (143) (57) (50) (43) (7) (50)

ОШ 1,22 0,78 1,15 1,39 1,27

[95% ДИ1 [0,80-1,861 [0,46-1,35] [0,67-1,981 [0,52-3,761 [0,74-2,191

N083 С894Т

Основная 70,7 29,3 52,6 36,2 11,2 47,4

N=116 (164) (68) (61) (42) (13) (55)

Контрольная 73,5 26,5 55,0 37,0 8,0 45,0

N=100 (147) (53) (55) (37) (8) (45)

ОШ 1,15 0,91 0,97 1,45 1,10

|95% ДИ] [0,75-1,77] [0,53-1,56] [0,55-1,69] [0,57-3,68] [0,64-1,89]

КЮБЗ 4а/Ь

Основная 84,1 15,9 70,7 26,7 2,6 29,3

N=116 (195) (37) (82) (31) (3) (34)

Контрольная 84,0 16,0 74,0 20,0 6,0 26,0

N=100 (168) (32) (74) (20) (6) (26)

ОШ 1,00 0,85 1,46 0,42 1,18

[95% ДИ] [0,59-1,691 [0,46-1,55] [0,77-2,781 [0,10-1,72] [0,65-2,16]

МТПГК. С677Т

Основная 69,0 31,0 49,1 39,7 11,2 50,9

N=116 (160) (72) (57) (46) (13) (59)

Контрольная 66,0 34,0 44,0 44,0 12,0 56,0

N-100 (132) (68) (44) (44) (12) (56)

ОШ 0,87 1,23 0,84 0.93 0,81

[95% ДИ| [0.58-1,32] [0,72-2,111 [0,48-1,44) [0,40-2,14] [0,47-1,40]

Гены белков, участвующих в тацентащш.

Важная роль в формировании плаценты принадлежит процессам ангиогенсза и межклеточного взаимодействия, как в материнских, так и в плодовых тканях. Особое значение имеет сосудисто-эпдотелнальный фактор роста (УНС1;) и матриксная мсталлопротеиназа 9 (ММР9).

При исследовании полиморфизма С936Т гена УКЛ7 было обнаружено, что среди женщин основной группы, но сравнению с женщинами группы контроля, была отмечена более высокая частота встречаемости мутантного аллсля 936Т (р>0,05) (табл. 3).

Исследование полиморфизма С(-1562)Т гена ММР9 показало, что среди женщин группы сравнения, в отличие от женщин основной группы, была

отмечена более высокая частота встречаемости мутантного аллеля (-1562)Т (р>0,05) (табл. 3).

Таблица 3. Распределение встречаемости генотипов и аллелей генов,

участвующих в плацентации, среди женщин основной и контрольной групп

Группы/ Wt-aллeль МиЬаллсль Wt Нй Мш Нй+Ми!

значимость %(п) % (п) % (п) % (п) % (п) % (п)

УЕОР С936Т

Основная 79,7 20,3 65,5 28,5 6,0 35,5

N=116 (185) (47) (76) (33) (7) (40)

Контрольная 83,0 17,0 67,0 32,0 1,0 33,0

N=100 (166) (34) (67) (32) (1) (33)

ОШ 1,24 0,94 0,84 6,36 1,07

[95% ДИ] [0,75-2,04] [0,53-1,65] [0,47-1,52] [0,76-53,23] [0,60-1,89]

ММР9 С(-1562)Т

Основная 85,3 14,7 72,4 25,9 1,7 27,6

N=116 (198) (34) (84) (30) (2) (32)

Контрольная 80,0 20,0 64,0 32,0 4,0 36,0

N=100 (160) (40) (64) (32) (4) (36)

ОШ 0,69 1,48 0,74 0,42 0,68

[95% ДИ1 [0,41-1,151 [0,83-2,641 [0,41-1,34] [0,07-2,371 [0,38-1,21]

Ген белка манпозосвязывающего лектипа (МВЬ), участвующего в регуляции системного воспалительного ответа.

Исследование полиморфизма С161Л (сос!оп 54, С1у54А5р) гена МВЬ (МВЬ2) показало, что среди женщин основной труппы, в отличие от женщин группы сравнения, выявлена повышенная частота встречаемости мутантной 161А-аллели и 161АА генотипа (р=0,0017 и р=0,0375), достоверно реже встречался генотип 161 СЮ (р=0,0122), чаще встречался гетерозиготный генотип (р>0,05). Процент гетеро- и гомозиготных носительниц мутантной 161А аллели был достоверно выше в основной группе (р=0,0122) (рис. 2).

120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0.0

П Основная группа □Контроль

86,5

ОШ=2,24

[1,34-3,73]

25,9

-13,5-

С-аллель

А-аллель

%

120.0 т

100,0 80,0 ' 60,0 40,0 20,0 0,0

О Основная группа О Контроль

-78,0,

¡62.1

0111=0,46 [0,"25:0,85]"

ОШ 2.17_ [1,18-3,98]

24.1

ОШ -3,04 37 * 11.07-8,(,К->22_0 "•¿7,0-13,8*-..... ..г=)~

ее

вА

АА ОА+АА

Рисунок 2. Частота встречаемости аллелей и генотипов полиморфизма С161А (сос1оп 54) гена МВЬ2 среди женщин основной и контрольной групп

Наши данные о роли полиморфизма MBL2 codon 54 в развитии преэклампеии идут вразрез с данными венгерских исследователей о преобладании мутантного аллеля гена MBL2 среди женщин с нормальной беременностью (Sziller I. et al., 2007). Носительство мутантной аллели гена MBL2 ассоциировано с дефицитом данного белка. Sziller I. и соавт. (2007) выдвинули предположение, что активация материнского каскада комплемента по пути MBL вносит свой вклад в разрушение клеток трофобласта фетоплацентарной системы и ухудшает его инвазию в спиральные артерии при имплантации, а носительство матерыо мутантной аллели гена MBL2 может привести к снижению уровня MBL. Than N.G и соавт. (2008) также приводят данные, где средний уровень белка MBL в плазме матери выше у женщин с преэклампсией по сравнению с женщинами с нормальной беременностью. Однако полиморфизм гена MBL2 у данных пациенток не исследовался, следовательно, не представляется возможным оценить, насколько связано данное повышение уровня MBL с генетическими особенностями данного белка. Напротив, по данным ряда исследователей (van dc Geijn F.E. et al., 2007; Ciarmcla P. et al., 2010; Vianna P. et al., 2010) MBL очищает плазму кропи от обломков клеток после апоптоза, а также регулирует уровень ФИО. При недостаточности функции MBL в результате генотинически обусловленного MBL-дефицитного состояния не происходит адекватной утилизации обломков трофобласта, а также повышается уровень ФНО, который, в свою очередь, принимает участие в апоптозе трофобласта, замыкая порочный круг, далее развивается системный воспалительный ответ.

Таким образом, при однофакторном анализе полиморфных маркеров исследованных генов выявлены достоверные отличия в носительстве полиморфизмов АСЕ i/D, AGT М235Т, MBL codon 54. Носительство мутантной аллели полиморфизма codon 54 гена MBL2 или полиморфизма i/I) гена АСЕ в 2,2 раза или в 1,6 раза соответственно увеличивает шанс развития и отечного синдрома и ПЭ, в то время как мутантпый генотип 2351Т гена AGT в 2 раза снижает шанс развития отечного синдрома и ПЭ. Носительство двух мутантпых аллелей полиморфизма MBL codon 54 (мутантпый генотип) увеличивается шанс развития отечного синдрома и ПЭ в 3 раза.

Анализ комбинаций полиморфных маркеров исследованных генов.

При анализе комбинаций генотипов полиморфизмов AGT М235Т и ACE i/D выявлено, что в случае гетерозиготного носительства аллели 235Т исход беременности зависел от наличия или отсутствия мутантной D аллели: сочетание генотипов 235MT/iD и 235MT/DD чаще отмечается у женщин основной группы, чем у женщин группы контроля (46,6% и 32,0%, р=0,0365). Гомозиготное носительство аллели 235Т выявлено у 16,4% женщин основной группы и у 29,0% женщин контрольной группы (р=0,0327). Среди женщин основной группы, по сравнению с женщинам контроля, в 3 раза реже встречался генотип 235TT/ii (3,4% и 10,0%, р=0,0579); в 1,5 раза реже встречались сочетания генотипов 235TT/iD или 235TT/DD (12,9% и 19,0%,

13

р=0,2625). Сочетания генотипов с гомозиготным носительством протективной аллели 235Т или наличием аллели 235М при отсутствии негативной Б-аллели отмечались значительно реже среди женщин основной группы, чем среди контрольной группы. «Неблагоприятные» комбинации с Б-аллелыо и отсутствием либо гетерозиготным носительством 235Т аллели встречались значительно чаще среди женщин основной группы, чем среди женщин группы контроля (р=0,0010) (Табл. 4).

Таблица 4. Частоты распределения «благоприятных» и «неблагоприятных» комбинаций генотипов полиморфизмов АСЕ ¡/Б и ЛОТ М235Т среди женщин основной и контрольной групп_

Комбинации генотипов АСЕ ¡/Т) и АОТ М235Т Благоприятные: ¡¡/ММ, ¡¡/МТ, ¡¡/ТТ, ¡О/ТТ, ББ/ТТ Неблагоприятные: ¡Б/ММ, Ш/МТ, БП/ММ, БИ/МТ

Основная группа, % (п) N=116 33,6 (39) 66,4 (77)

Контрольная группа, % (п) N=100 56,0 (56) 44,0 (44)

р, 2-хстор. тест Фишера 0,0010

При анализе комбинаций генотипов полиморфизмов АСЕ № и МВ1.2 соёоп 54 выявлено, что комбинации с отсутствием аллели Б гена АСЕ вне зависимости от наличия или отсутствия аллели 161А гена МВ1,2 встречались в 37,0% среди женщин группы контроля и в 20,7% среди женщин основной группы (р=0,0099). При гетерозиготном носительстве аллели Б исход беременности зависел от наличия или отсутствия 161А аллели: комбинация генотипов 1Б/161АА чаще встречается среди женщин основной группы (8,6% против 2,0% в группе контроля, р=0,0394). Среди женщин контрольной группы достоверно чаще встречалось отсутствие мутантных аллелей Б и 161А (генотип н/161СС, р=0,0222). Гомо- или гетерозиготное носительство одновременно двух мутантных аллелей Б и 161А достоверно чаще встречалось у пациенток основной группы (р=0,0017) (рис.3).

Отсутствие мутаций: ш'СС

Мутация в 1 гене: ¡П/ОО, ЕЮ/ОО, ¡¡'СтА, Н/АА

Мутация в 2 генах: Ю/вА, Ю/АА, БОЛЗА, ВЪ/АА

1б,4%* р=0,0222 I 30,0%

О Основная группа □Контроль_

50,0% 55,0%

^^ 33,6%

15,0%

р- 0,0017

-10% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70%

Рис.3. Частота встречаемости мутаций по одному или двум генам АСЕ ¡/Б и МВЬ2 сос1оп 54 среди женщин с основной и контрольной групп (р-значсние для 2-хстороннего критерия Фишера)

При анализе комбинаций генотипов полиморфизмов МВЬ2 сос!оп 54 и АОТ М235Т выявлено, что комбинации с отсутствием аллели 161А вне зависимости от наличия или отсутствия аллели 235Т чаще встречались среди женщин группы контроля (78,0% против 62,1% в основной группе, р=0,0122). При гетерозиготном носительстве аллели 161А независимо от наличия или отсутствия 235Т аллели ПЭ и отечный синдром встречались чаще (р>0,05). Гомозиготное носительство аллели 161А чаще встречалось среди женщин основной группы (13,8% против 5,0% в группе контроля, р=0,0375). Сочетания генотипов 161АА/235ММ и 161АА/235МТ встречались чаще у женщин основной группы (12,1% против 3,0% в группе контроля, р=0,0203). Комбинация 161АА/МТ встречалась чаще у женщин основной группы (7,8% против 1,0% в группе контроля, р=0,0219). «Благоприятная» комбинация 16ЮО/235ТТ реже встречалась среди женщин основной группы, по сравнению с женщинами группы контроля (р=0,0038). «Неблагоприятные» комбинации, включающие в себя наличие 161А-аллели и отсутствие либо гетерозиготное носительство 235Т аллели, значительно чаще наблюдались среди женщин основной группы, по сравнению с женщинами группы контроля (р=0,0425). Остальные комбинации оказались «нейтральными» и встречались в обеих группах практически с одинаковой частотой (табл. 5).

Таблица 5. Частоты распределения «благоприятных», «нейтральных» и «неблагоприятных» комбинаций генотипов полиморфизмов МВЬ2 сос!оп 54 и АОТ М235Т среди женщин основной и контрольной групп_

Комбинации генотипов MBL2 codon 54 и AGT М235Т Благоприятные: GG/TT Нейтральные: GG/MM, GG/MT, GA/TT, АА/ТТ Неблагоприятные: GA/MM, GA/MT, АА/ММ, АА/МТ

Основная группа, % (п) N=116 10,3 (12) 57,8 (67) 31,9(37)

Контрольная группа, % (п) N=100 26,0 (26) 55,0 (55) 19,0(19)

р, 2-хстор. тест Фишера 0,0038 0,7832 0,0425

Таким образом, при анализе сочетаний диплотипов полиморфизмов АСЕ ¡/Б, ЛОТ М235Т, МВЬ2 сос!оп 54 среди женщин с ПЭ и отечным синдромом, в отличие от женщин группы контроля, комбинации ¡0/161АА и 161АА/235МТ встречаются достоверно чаще (р=0,0394 и р=0,0219 соотв.); комбинации п/16ЮО и 16ШО/235ТТ встречаются достоверно реже (р=0,0222 и р=0,0038 соотв.). Гомо- или гетерозиготное носительство мугантных аллелей генов АСЕ и МВЬ2 (¡Б/161 ОЛ, Ю/161ЛЛ, ББ/ШОЛ, ББ/161АА) в 2,2 раза чаще встречалось среди женщин с ПЭ и отечным синдромом, чем среди женщин группы контроля. Мутантный генотип 235ТТ гена ЛОТ при сочетании с гетеро- или гомозиготным мутантным генотипом гена АСЕ в 1,5 раза снижает риск развития ПЭ и отечного синдрома (р>0,05), а в комбинации с гетеро- и гомозиготным мутантным генотипом гена МВЬ2 -теряет свою протективную роль, однако снижает патогенное действие мутанта ой аллели 161А гена МВЬ2 (р>0,05).

15

Многофакторный анализ.

С учетом полученных данных был проведен многофакторный анализ с включением в модель логистической регрессии наиболее значимых полиморфизмов АСЕ i/D, MBL2 codon 54 и AGT М235Т. Наиболее устойчивая связь с развитием ПЭ и отечного синдрома отмечалось у аллельного варианта 161GA+161AA гена MBL2, затем у iD+DD гена АСЕ, наименее устойчивая - у 235ТТ гена AGT. Были введены коэффициенты значимости: 2,4 для аллели D гена АСЕ; 2,7 для аллели 161А гена MBL2; 1,8 для аллели 235Т гена AGT. На основании подсчета суммы баллов по трем генотипам создана шкала оценки риска данных осложнений.

Суммарный балл по трем генам высчитывался по формуле: Ьа« = 2,7*(Amu, MBL2) + 2,4*(Amut АСЕ) + (-1,8*(Аши, AGT)), где Ainut может принимать значения от 0 до 2 в зависимости от количества мутантных аллелей; коэффициент 1,8 для гена AGT имеет отрицательный знак, ввиду его протекгивного действия.

Далее пациентки были разделены на три группы риска формирования предрасположенности к ПЭ и отечному синдрому. К 1-ой группе были отнесены женщины с суммарным баллом <0 (этот балл был выявлен у 21,5% женщин основной группы и 41,0% женщин группы контроля, р=0,0029); ко 2-й группе - с суммарным баллом >0 и <3 (43,1% и 42,0% соотв., р=0,8910), к 3-ей группе — с суммарным баллом >3 (35,4% и 17,0% соотв., р=0,0033). Также мы выделили отдельно последние три комбинации с суммарным баллом >7,5, встречающиеся только у женщин основной группы (7,8% против 0% группы контроля, р=0,004), которых можно отнести к очень высокому риску развития ПЭ и отечного синдрома во время беременности (рис. 4).

Рисунок 4. Распределение комбинаций генотипов генов АСЕ, МВЬ2, ЛОТ по баллам в основной и контрольной группах

16

Таким образом, в первую группу (низкий риск) больше вошло женщин из группы контроля (в 1,6 раза), нежели из основной группы (0111=0,40, 95% ДИ [0,22-0,72]). Вторая группа (средний риск) в 1,2 раза больше состояла из женщин основной группы, чем из женщин группы сравнения (ОШ=1,05). В третьей группе (высокий и очень высокий риск) основная группа в 2,4 раза превосходила контрольную (ОШ=2,67, 95% ДИ [1,39-5,11]) (табл. 6).

Таблица 6. Группы риска развития преэклампсии и отечного синдрома

Группы риска

Низкий %(П)

Средний (п}_

Высокий %(П)

Очень высокий %(п)_

Женщины из основной группы, N=116

37,9 (25)

54,3 (50)

65,3 (32)

100(9)

70,7 (41)

34,7(17) I 0(0)

Женщины из контрольной группы, N=100

62,1 (41)

45,7 (42)

29,3 (17)

Итого

66

92

49 I

58

ОШ [95% ДИ]

0,40 [0,22-0,72j

1,05 [0,61-1,80]

2,67 [1,39-5,111

Примечание: для системы р-знач. для % Пирсона = 0,0007

Полученные комбинации генотипов можно использовать как отдельный фактор при подсчете общей суммы баллов перинатального риска, используемой для оценки общего состояния беременной женщины с определением тактики ведения данной беременности. Таким образом, сочетаниям генотипов первой группы (низкий риск) можно присвоить 0 баллов, 2-ой группы (средний риск) - 1 балл, 3 группе (высокий риск) - 2 балла. Комбинации с суммарным баллом >7,5 можно отдельно выделить как очень высокий риск развития ПЭ (3 балла).

Использование балльного подхода для оценки риска развития заболеваний на основании данных генодиагностического исследования было предложено многими исследователями (Глотов A.C. и соавт., 2007; Wang Т. and Eiston R.C., 2007; Pan W„ 2009; Чайка B.K. и соавт., 2011; Scholz M. and Kirsten H., 2011), однако баллы для аллельных вариантов генов присваивались преимущественно эмпирическим путем, либо учитывалось только положительное влияние полиморфизмов генов на развитие исследуемого заболевания. В нашем исследовании используются коэффициенты с учетом уровня значимости и разнонаправленное™ действия (не только негативное, но и протективное) каждого из включенных в анализ аллельных вариантов, что позволяет точнее оценить вклад генетической предрасположенности в развитие ПЭ у каждой конкретной женщины.

Анализ ассоциаций исследованных полиморфных маркеров у женщин с отечным синдромом во время беременности и с протеинурией и/или АГ (ПЭ).

Мутантная аллель 161А гена MBL2 в 2 раза чаще встречается среди женщин с отечным синдромом ив 1,9 раза чаще встречается среди женщин с

ПЭ, по сравнению с женщинами группы контроля (р=0,0010 и р=0,0016). Мутантный генотип полиморфизма МВЬ2 соёоп 54 в 3,4 раза увеличивает шанс развития ПЭ (ОШ=3,39, 95% ДИ [1,09-10,52], р=0,0494). Среди женщин с отечным синдромом, по сравнению с женщинами группы контроля, в 2,4 раза реже встречается мутантный генотип 235ТТ гена АвТ (01П=0,33, 95% ДИ [0,13-0,88], р=0,0240), в 1,3 раза чаще встречается мутантная аллель Б гена АСЕ (р=0,0487). С протеинурией и АГ полиморфизмы генов АСЕ 1/Т) и АвТ М235Т не ассоциированы (р>0,05) (табл. 8).

Таблица 8. Распределение встречаемости генотипов и аллелей

полиморфизмов изученных генов среди женщин с отечным синдромом во время беременности, с протеинурией и/или АГ и женщин группы контроля

Группы \^1-аллель % (п) МШ-аллель %(п) %(п) Не1 %(п) мт %(п) Не1+МШ % (п)

АСЕ ИТ)

Отечный синдром N=50 47,0* (47) 53,0* (53) 16,0* (8) 62,0 (31) 22,0 (П) 84,0* (42)

Протеинурия и/или АГ N=66 49,2 (65) 50,8 (67) 24,2 (16) 50,0 (33) 25,8 (17) 75,8 (50)

Контроль N=100 59,5 (119) 40,5 (81) 37,0 (37) 45,0 (45) 18,0 (18) 63,0 (63)

АОТ М235Т

Отечный синдром N=50 55,0 (55) 45,0 (45) 22,0 (11) 66,0 (33) 12,0* (6) 78,0 (39)

Протеинурия и/или АГ N=66 52,3 (69) 47,7 (63) 24,2 (16) 56,1 (37) 19,7 (13) 75,8 (50)

Контроль N=100 45,5 (91) 54,5 (109) 20,0 (20) 51,0 (51) 29,0 (29) 80,0 (80)

МВЬ2 С161А (сос!оп 54)

Отечный синдром N=50 73,0* (73) 27,0* (27) 58,0 (29) 30,0 (15) 12,0 (6) 42,0* (21)

Протеинурия и/или АГ N=66 75,0* (99) 25,0* (33) 65,2 (43) 19,7 (13) 15,1* (Ю) 34,8 (23)

Контроль N=100 86,5 (173) 13,5 (27) 78,0 (78) 17,0 (17) 5,0 (5) 22,0 (22)

*(р<0,05, для 2-хстор. теста Фишера) - достоверность показателей основной группы по отношению к соответствующим показателям контрольной группы

Таким образом, полиморфизмы генов АСЕ Ю и АСТ М235Т ассоциированы в основном с развитием отечного синдрома, а не с ПЭ. Полиморфизм гена МВЬ2 сос1оп 54 связан с формированием как отечного синдрома, так и АГ и протеинурии во время ПЭ. Полиморфизмы генов АСЕ \1Т) и АвТ М235Т не играют особой роли в развитии гипертензивного синдрома во время формирования ПЭ, что может указывать на влияние других полиморфизмов в развитии АГ и протеинурии.

Прогноз развития ПЭ наиболее эффективен при учете всех факторов риска: первая беременность; ПЭ в предыдущую беременность; возраст

старше 40 лет или младше 18 лет; экстрагенитальные заболевания (хроническая АГ, диабет, аутоиммунные заболевания и нефропатии), ожирение, множественная беременность, интервал между беременностями более или равный 10 годам; семейный анамнез ПЭ, АГ и сахарного диабета; а также носительство определенных аллельных вариантов генов. В нашем исследовании прямая зависимость формирования предрасположенности к ПЭ выявлена у полиморфизма MBL2 codon 54, однако, учитывая, что отечный синдром обуславливает тяжесть ПЭ (является одним из признаков тяжелой ПЭ по данным Sibai В.М., 2012 и Lim К-Н и соавт., 2012), то уместно также использовать и два других исследованных нами полиморфизма для определения степени риска формирования ПЭ.

ВЫВОДЫ

1. У женщин с ПЭ и с отечным синдромом, в отличие от женщин группы сравнения, отмечается:

- достоверное увеличение частоты встречаемости мутантных аллелей D гена АСЕ (51,7% и 40,5%, р=0,0206), 161А гена MBL2 (25,9% и 13,5%, р=0,0017), и генотипа 161АА гена MBL2 (13,8% и 5,0%, р=0,0375), что указывает на значимую роль носительства этих полиморфных маркеров в формировании предрасположенности к ПЭ с отечным синдромом;

- достоверное снижение частоты встречаемости генотипа 235ТТ (16,4% и 29,0%, р=0,0327), что отражает его протективный эффект на развитие ПЭ с отечным синдромом;

- отсутствие различий по частоте встречаемости у женщин с ПЭ, отечным синдромом и у женщин контрольной группы мутантных аллелей полиморфизмов G894T гена NOS3 (29,3% и 26,5%), 4ab гена NOS3 (15,9% и 16,0%), С242Т гена CYBA (32,8% и 28,5%), С(-1562)Т гена ММР9 (14,7% и 20,0%), С936Т гена VEGF (20,3% и 17,0%), С677Т гена MTHFR (31,0% и 34,0%), что свидетельствует об отсутствии влияния носительства данных аллелей на формирование симптомокомплекса ПЭ с отечным синдромом.

2.. Среди женщин с ПЭ и с отечным синдромом, в отличие от женщин группы контроля, достоверно чаще встречаются комбинации аллельных вариантов iD/161AA генов АСЕ и MBL2 и 161АА/235МТ генов MBL2 и AGT (р=0,0394 и р=0,0219 соотв.), достоверно реже встречаются комбинации аллельных вариантов Ü/161GG генов АСЕ и MBL2 и 161GG/235TT генов MBL2 и AGT (р=0,0222 и р=0,0038 соотв.). Гомо- или гетерозиготное носительство одновременно двух мутантных аллелей D и 161А генов АСЕ и MBL2 в 2,2 раза чаще встречается среди женщин с ПЭ и отечным синдромом (р=0,0017). Мутантный генотип 235ТТ гена AGT при сочетании с гетеро- или гомозиготными мутантными генотипами генов АСЕ и MBL2 снижает патогенное действие мутантной аллели D и 161А (р>0,05).

3. Пациентки с «благоприятными» комбинациями генотипов генов АСЕ, MBL2, AGT (с суммой баллов генотипов <0) относятся к низкому риску развития ПЭ; с «неблагоприятными» комбинациями (с суммой баллов

19

генотипов >3) - к высокому риску; три последние комбинации (сумма баллов >7,5), встречаются только среди женщин с ПЭ - очень высокий риск развития ПЭ. Остальные комбинации генотипов относятся к среднему риску развития ПЭ.

Практические рекомендации.

1. С целью выделения группы риска по развитию ПЭ на доклинической стадии рекомендуется в дополнение к другим методам обследования использовать определение носительства мутантных аллелей генов АСЕ i/D и MBL2 codon 54, а также мутантного генотипа гена AGT М235Т в периферической крови матери. Наибольшую прогностическую значимость имеет мутантная аллель 161А гена MBL2, наименьшую -235Т гена AGT.

2. Данное распределение комбинаций генотипов генов ACE i/D, MBL2 codon 54, AGT М235Т по баллам риска развития ПЭ может быть использовано в качестве предгравидарного прогнозирования и выявления групп риска ПЭ. При положительном результате может служить показанием для изменения динамики наблюдения и кратности обследования с целью раннего выявления ПЭ и улучшения исхода беременности и родов для матери и ребенка.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Галина Т.В., Князева И.П. Генетические маркеры прогнозирования гестоза // Сборник материалов Всероссийской конференции с международным участием «Охрана репродуктивного здоровья — будущее России». -Белгород. - 2010. - С.22-23.

2. Радзинский В.Е., Князева И.П.. Самоходская JI.M., Галина Т.В., Руицкая В.Р., Рябцев K.M. М235Т полиморфизм гена ангиотензина и E298D полиморфизм гена эндотелиальной синтазы оксида азота у женщин с гестозом // Сборник материалов конференции с международным участием «Актуальные вопросы акушерства, гинекологии и перинатологии». -Симферополь, Издательский центр КГМУ. - 2010. - Том 149, часть IV. - С. 283.

3. Knvazeva LP. Eseneeva F.M., Samokhodskaya L.M., Radzinsky V.E., Galina T.V., Tkachuk V.A. The M235T polymorphism of Angiotensinogen gene and the insertion/deletion polymorphism of Angiotensin-Converting enzyme gene in women with gestosis // Abstract book of « The 13th World Congress on Controversies in Obstetrics, Gynecology & Infertility (COGI)». - Berlin, Germany.-2010. -P.A-45.

4. Eseneeva F.M., Knvazeva I.P., Galina T.V., Samokhodskaya L.M., Radzinsky V.E., Tkachuk V.A. The Glu298Asp and 4a/b polymorphism of endothelial nitric oxide synthase gene and the C242T polymorphism of P22 Phox gene women with gestosis // Abstract book of « The 13th World Congress on Controversies in

Obstetrics, Gynecology & Infertility (COGI)». - Berlin, Germany. - 2010. - P. A-35.

5. Князева И.П.. Самоходская JI.M., Радзинский B.E., Галина Т.В., Рябцев К.М. М235Т полиморфизм гена ангиотензина и E298D полиморфизм гена эндотеллиальной синтазы оксида азота у женщин с гестозом // Вестник Российского университета дружбы народов. Серия Медицина. Акушерство и гинекология. — 2010. — № 6. — С. 23—29.

6. Садекова О.Н., Князева И.П.. Никитина Л.А., Демидова Е.М., Радзинский В.Е., Самоходская Л.М., Ткачук В.А. Нарушение процессов имплантации как ключевое патогенетическое звено гестационных осложнений. Постгеномные исследования и технологии: Коллективная монография / Под ред. Варфоломеева С.Д. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 2011. — С. 319—346.

7. Князева И.П.. Галина Т.В., Радзинский В.Е., Самоходская Л.М. Роль маннозосвязывающего лектина в развитии преэклампсии // Акушерство и гинекология. - 2012. - № 4-2. - С. 29-32.

8. Садекова О.Н., Князева И.П.. Яровая Е.Б., Радзинский В.Е., Демидова Е.М., Самоходская Л.М., Ткачук В.А. Роль системных нарушений в формировании гестационных осложнений и их генетическая составляющая // Акушерство и гинекология. - 2012. - № 4-2. - С. 21—28.

АННОТАЦИЯ

Халфорд-Князева Инесса Павловна «Генетические маркеры прогнозирования преэклампсии»

Диссертационное исследование посвящено изучению взаимосвязи преэклампсии и носительства генов белков системы регуляции артериального давления, плацентации, формирования эндотелиальной дисфункции, системного воспалительного ответа. В ходе исследования обследованы 116 женщин с «чистой» формой преэклампсии с выраженным отечным синдромом и 100 женщин с нормально протекающей беременностью. Выявлены аллельные варианты генов, ассоциированные с развитием преэклампсии с выраженным отечным синдромом (АСЕ i/D, AGT М235Т, MBL2 codon 54), показана прогностическая значимость комбинаций генотипов полиморфизмов изученных генов, расширены представления о патогенезе преэклампсии. Полученные результаты указывают на различный уровень значимости каждого из аллельных вариантов и учитывают их разнонаправленные действия (не только негативное, но и протекгавное). Предложено использовать полученные данные генодиагностического обследования для предгравидарного прогнозирования и выявления групп риска преэклампсии, а также как один из факторов перинатального риска. Что может служить показанием для изменения динамики наблюдения и кратности обследования с целью раннего выявления преэклампсии и улучшения исхода беременности и родов для матери и ребенка.

Halford-Knyazeva Inessa Pavlovna «Genetic markers of pre-eclampsia»

This dissertation is devoted to the study of the association between pre-eclampsia and carriership of genes of proteins involved in the regulation of blood pressure and placentation, proteins involved in pathogenesis of endothelial dysfunction and systemic inflammatory response. A total of 116 patients with a diagnosis of preeclampsia with severe edema and 100 healthy controls were enrolled in the study. Allelic variants of genes associated with pre-eclampsia with severe edema were found (ACE i/D, AGT M235T, MBL2 codon 54), also we identified the prognostic value of combinations of investigated polymorphic markers. It has provided an enhanced understanding of the pathogenesis of pre-eclampsia. The results indicate a different level of importance of each of the allelic variants, and take into account their different effect (not only negative, but also protective). These genetic studies can be used to predict and detect the risk of pre-eclampsia, and also as one of the factors of perinatal risk. This can lead to changing the dynamics of monitoring and multiplicity of examination for early detection of pre-eclampsia and improve the outcome of pregnancy and delivery for both mother and child.

Подписано в печать. 15.01.2013 Формат А5

Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. пл. 1 Тираж 100 Экз. Заказ № 4046 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39

Актуальность проблемы.

Гестоз или преэклампсия - осложнение беременности, развивающееся после 20-й недели и характеризующееся полиорганной недостаточностью. В основе синдрома преэклампсии лежит генерализованная эндотелиальная дисфункция, ведущая к расстройству общего кровообращения во время беременности. В мире преэклампсия осложняет течение беременности в 2 - 8%, и является одной из главных причин заболеваемости и смертности матери и плода [28, 56, 78, 129]. В структуре причин преждевременных родов во всем мире на долю преэклампсии приходится до 15% [28, 56]. В РФ частота заболеваемости преэклампсией на редкость стабильна и варьирует от 22,2% до 17,8% за последние десять лет [14]. Уровень заболеваемости новорожденных на фоне преэклампсии колеблется от 64 до 78%, а перинатальная смертность составляет 18-30%о [14]. По данным ВОЗ, у каждого 5-го ребёнка, родившегося от матери с преэклампсией, в той или иной степени происходит нарушение физического и психоэмоционального развития, значительно выше уровень заболеваемости в младенческом и раннем детском возрасте.

До настоящего времени, несмотря на высокий уровень медицинских технологий, многие вопросы, посвященные проблеме преэклампсии, остаются малоизученными, спорными и противоречивыми. Излечить преэклампсию невозможно, поэтому цель терапии - предотвратить прогрессирование имеющегося заболевания и уменьшить выраженность клинических симптомов. Эффективность коррекции данного состояния значительно выше при начальных стадиях заболевания. Следовательно, актуален поиск методов ранней диагностики преэклампсии и методов, позволяющих прогнозировать вероятность развития преэклампсии еще до беременности, чтобы своевременно провести комплекс профилактических мероприятий и предгравидарную подготовку [70, 76].

Причина преэклампсии до сих пор до конца не ясна и зависит от множества факторов. Согласно современным представлениям, преэклампсию рассматривают как генетически детерминированную недостаточность процессов адаптации материнского организма к новым условиям существования, которые возникают с развитием беременности [3]. Роль генетических факторов в развитии преэклампсии составляет более 50%, и вклад материнских генов в этот процесс превышает генетическую компоненту плода [48, 62, 119]. К настоящему времени изучено более 50 генов-кандидатов, предположительно связанных с развитием преэклампсии [40]. Однако полностью определить спектр генов, ответственных за преэклампсию, еще не удалось.

68% женщин с преэклампсией имеют отеки [126], однако, в большинстве стран отечный синдром как критерий диагноза преэклампсии не рассматривается, так как отеки возможны и при физиологическом течении беременности. В тоже время, выраженные отеки могут служить предвестником дальнейшего развития преэклампсии, поскольку отражают повышенную проницаемость эндотелия сосудов и недостаток белка в плазме крови, что может быть связано с дисфункцией эндотелия и экскрецией белка почками.

Частоты аллелей во многих полиморфизмах отличаются между этническими группами. [40].

Цель исследования.

Оценить роль полиморфизма генов белков, связанных с регуляцией артериального давления (АД), участвующих в плацентации, связанных с оксидативным стрессом и влияющих на функцию эндотелия, вовлеченных в системный воспалительный ответ, в прогнозировании риска развития преэклампсии.

Задачи исследования.

1. Изучить и сравнить частоты встречаемости аллельных вариантов генов белков, связанных с ренин-ангиотензин-альдостероновой системой (РААС) -АСЕ (1/0), АСТ (М235Т); участвующих в плацентации - УЕОБ (С936Т), ММР9 (С(-1562)Т); связанных с оксидативным стрессом и влияющих на функцию эндотелия - N083 (0894Т, Шоп 4а/Ь), СУВА (С242Т), МТЫБЯ (С677Т); вовлеченных в системный воспалительный ответ -МВЬ2 (0161А сос1оп 54), у беременных с преэклампсией и в группе контроля.

2. Изучить взаимосвязь носительства комбинаций вышеуказанных генов с формированием предрасположенности к развитию преэклампсии и выявить комбинации аллельных вариантов генов, обладающие наибольшей прогностической ценностью.

3. Определить группы риска развития преэклампсии по данным различных сочетаний генотипов полиморфизмов исследованных генов.

Научная новизна.

В результате проведенного исследования расширены представления о роли ряда генов белков, связанных с РААС, участвующих в плацентации, связанных с оксидативным стрессом и влияющих на функцию эндотелия, вовлеченных в системный воспалительный ответ, в развитии преэклампсии и расширены представления о патогенезе данного осложнения.

Впервые проанализирована встречаемость различных комбинаций генотипов аллельных вариантов изученных генов у женщин с преэклампсией в сравнении с женщинами с нормально протекающей беременностью.

Впервые изучен синергический эффект различных сочетаний «функционально неблагоприятных» генотипов, а также антагонистический эффект различных сочетаний «благоприятных» и «неблагоприятных» генотипов данных генов при развитии преэклампсии. Доказана возможность использования определения носительства мутантного аллеля 161А гена МВЬ2, мутантного аллеля О гена АСЕ и мутантного генотипа 235ТТ гена АвТ в качестве информативных маркеров прогнозирования развития преэклампсии.

Практическая значимость.

Определение комбинаций генотипов генов АСЕ, МВЬ2 и АвТ может быть использовано в качестве предгравидарного прогнозирования и доклинической диагностики преэклампсии. Это позволит выделить группы риска развития преэклампсии и провести раннее оздоровление женщин до и во время беременности с целью улучшения исхода беременности и родов.

Апробация работы, внедрение результатов исследования в практику и личный вклад автора.

• Полученные данные были представлены на 13-ом международном конгрессе по контраверсиям в акушерстве, гинекологии и вопросах бесплодия, Берлин, Германия, 2010.

• Данная работа проведена в рамках государственного контракта № 16.512.11.2030 от 14 февраля 2011 г. с Министерством образования и науки РФ по теме «Разработка метода дифференцированного выявления генетических маркеров аллельных вариаций генов материнской и фетальной ДНК, ведущих к нарушению роста и развития плода, в крови матери».

• Клинико-анамнестические и молекулярно-генетические исследования, анализ и интерпретация данных проведены автором самостоятельно. Все научные результаты, представленные в работе, автором получены лично. По теме диссертации опубликованы 8 печатных работ в отечественной и зарубежной печати, из них 3 — в журналах, включенных в перечень ВАК РФ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Носительство аллельных вариантов генов белков, связанных с регуляцией АД (АСЕ, АвТ), и белков, участвующих в развитии системного воспалительного ответа (МВЬ2), ассоциировано с развитием преэклампсии с отечным синдромом.

2. Оценка сочетаний генотипов генов (пары АСЕ-МВЬ2 и МВЬ2-АСГ), а также подсчет количества одновременно выявляемых мутаций (пара АСЕ-МВЬ2) более точно определяют вероятность развития преэклампсии.

3. Носительство полиморфных маркеров разных генов имеет не только значимость, но и разнонаправленность действия (не только негативное, но и протективное) на вероятность развития преэклампсии.

4. Определение в крови мутантных аллельных вариантов генов АСЕ, МВЬ2 и АвТ с применением балльной шкалы оценки результатов генотипирования аллельных вариантов данных генов, может быть применено для выявления степени риска развития преэклампсии.

5. Отечный синдром ассоциирован с тремя выявленными полиморфизмами, тогда как протеинурия и артериальная гипертензия (АГ) не связаны с полиморфизмами АСЕ ¡А) и АвТ М235Т, что может указывать на влияние других полиморфизмов в развитии АГ и протеинурии.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, содержащего 21 отечественный и 144 зарубежных источника. Работа изложена на 147 страницах машинописного текста, содержит 40 таблиц и 25 рисунков.

ВЫВОДЫ

1. У женщин с преэклампсией и с отечным синдромом, в отличие от женщин группы сравнения, отмечается:

- достоверное увеличение частоты встречаемости мутантных аллелей Э гена АСЕ (51,7% и 40,5%, р=0,0206), 161А гена МВЬ2 (25,9% и 13,5%, р=0,0017), и генотипа 161АА гена МВЬ2 (13,8% и 5,0%, р=0,0375), что указывает на значимую роль носительства этих полиморфных маркеров в формировании предрасположенности к преэклампсии с отечным синдромом;

- достоверное снижение частоты встречаемости генотипа 235ТТ (16,4% и 29,0%, р=0,0327), что отражает его протективный эффект на развитие преэклампсии с отечным синдромом;

- отсутствие различий по частоте встречаемости у женщин с преэклампсией, отечным синдромом и у женщин контрольной группы мутантных аллелей полиморфизмов в894Т гена N083 (29,3% и 26,5%), 4аЬ гена N083 (15,9% и 16,0%), С242Т гена СУВА (32,8% и 28,5%), С(-1562)Т гена ММР9 (14,7% и 20,0%), С936Т гена УЕОБ (20,3% и 17,0%), С677Т гена МТНРЯ (31,0% и 34,0%), что свидетельствует об отсутствии влияния носительства данных аллелей на формирование симптомокомплекса преэклампсии с отечным синдромом.

2. . Среди женщин с преэклампсией и с отечным синдромом, в отличие от женщин группы контроля, достоверно чаще встречаются комбинации аллельных вариантов ¡0/161АА генов АСЕ и МВЬ2 и 161АА/235МТ генов МВЬ2 и АвТ (р=0,0394 и р=0,0219 соотв.), достоверно реже встречаются комбинации аллельных вариантов п/16ЮС генов АСЕ и МВЬ2 и 16ЮС/235ТТ генов МВЬ2 и АСТ (р=0,0222 и р=0,0038 соотв.). Гомо- или гетерозиготное носительство одновременно двух мутантных аллелей О и 161А генов АСЕ и МВЬ2 в 2,2 раза чаще встречается среди женщин с преэклампсией и отечным синдромом (р=0,0017). Мутантный генотип 235ТТ гена АвТ при сочетании с гетеро- или гомозиготными мутантными генотипами генов АСЕ и МВЬ2 снижает патогенное действие мутантной аллели О и 161А (р>0,05).

3. Пациентки с «благоприятными» комбинациями генотипов генов АСЕ, МВЬ2, АСТ (с суммой баллов генотипов <0) относятся к низкому риску развития преэклампсии; с «неблагоприятными» комбинациями (с суммой баллов генотипов >3) — к высокому риску; три последние комбинации (сумма баллов >7,5), встречаются только среди женщин с преэклампсией — очень высокий риск развития преэклампсии. Остальные комбинации генотипов относятся к среднему риску развития преэклампсии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью выделения группы риска по развитию преэклампсии на доклинической стадии рекомендуется в дополнение к другим методам обследования использовать определение носительства мутантных аллелей генов АСЕ ¿/О и МВЬ2 сос!оп 54, а также мутантного генотипа гена АОТ М235Т в периферической крови матери. Наибольшую прогностическую значимость имеет мутантная аллель 161А гена МВЬ2, наименьшую - 235Т гена АОТ.

2. Данное распределение комбинаций генотипов генов АСЕ ¿Л), МВЬ2 сос1оп 54, АвТ М235Т по баллам риска развития преэклампсии может быть использовано в качестве предгравидарного прогнозирования и выявления групп риска преэклампсии. При положительном результате может служить показанием для изменения динамики наблюдения и кратности обследования с целью раннего выявления преэклампсии и улучшения исхода беременности и родов для матери и ребенка.