Генамплификационное тестирование донорской крови на патогены: технологии, системы и стандарты

Ёлов, Андрей Александрович

Диссертации по медицине → Гематология и переливание крови

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Генамплификационное тестирование донорской крови на патогены: технологии, системы и стандарты

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Ёлов, Андрей Александрович Москва 2003 г.

Ученая степень: доктора биологических наук

ВАК РФ: 14.00.29

Автореферат диссертации по медицине на тему Генамплификационное тестирование донорской крови на патогены: технологии, системы и стандарты

На правах рукописи

Ёлов Андрей Александрович

ГЕНАМПЛИФИКАЦИОННОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ ДОНОРСКОЙ КРОВИ НА ПАТОГЕНЫ: ТЕХНОЛОГИИ, СИСТЕМЫ И СТАНДАРТЫ

Специальности: .14.00.29 - гематология и переливание крови 03.00.04 -биохимия

Автореферат

диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2003 г.

Работа выполнена в ГУ Центр крови Минздрава России, на станции переливания крови ФУ «Медбиоэкстрем» и в Центрально™ НИИ трансфузионной медицины и медицинской техники АМТН.

Научные консультанты:

Докт.меднаук, профессор Н.А. Федоров Докт.мед.наук, профессор Ю.С.Суханов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор М.Н.Блинов доктор медицинских наук, профессор Т.Т.Смольская доктор биологичеких наук, профессор А.В.Карякин

Ведущая организация:

Военно-медицинская академия им.С.М.Кирова Министерства обороны России

/ 0°

Защита состоится « 23» <•¿■402003 г. в час на заседании диссертационного совета Д 208.074.01 при Российском НИИ гематологии и трансфузиологии по адресу: 193024, г.Санкт-Петербург, ул.2-я Советская,

ДЛ6.

С диссетрацией можно ознакомиться в библиотеке Российского НИИ гематологии и трансфузиологии.

Автореферат разослан «2г » 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

В.С.Быков

<^2(0 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Контролю вирусной и бактериальной безопасности донорской крови всегда уделялось особое внимание, но его эффективность была и остается ограничена возможностями применяемых серологических методов. Последние же по своей основе являются косвенными и не всегда дают однозначные результаты. "Специальные методы инактивации вирусов в донорской крови были предложены лишь в последнее время, их эффективность пока еще нельзя считать абсолютной и поэтому они применяются лишь в сочетании с ИФА- или NAT-тестированием. Эпидемия СПИДа обострила проблему инфекционной безопасности донорской крови настолько, что был поднят даже вопрос об отказе от переливания крови. Очень серьезную проблему в настоящее время представляет собой распространение вирусов гепатитов, особенно среди наркоманов и других лиц, относимых к группе социального риска

Идентификация возбудителя по нуклеотидной последовательности его генома обеспечивает наиболее прямую и точную диагностику. Необходимость внедрения генамплификационных анализов для повышения инфекционной безопасности донорской крови стала очевидной еще в 1995 году. Тогда же по инициативе Национального института биологической стандартизации и контроля Великобритании (NIBSС) Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) создала рабочую группу по стандартизации генамплификационных методов исследования, применяемых в службе крови (WHO International working group on the standartisation of genomic amplification techniques for the virological safety testing of blood and blood products: WHO SoGAT). Основной задачей этой группы, помимо обмена информацией, является создание международных стандартов для контроля чувствительности генамплификационных методов и аппаратов.

Применение в генотестировании крови и других материалов тест-систем собственного изготовления ("in-house") являете?..„сложившейся—мировой

! РОС. КАЦИОНЛДЬНАЛ

практикой, что, вероятно, обусловлено спецификой вщялШСекавой рбласти,

рекой нщгибздгЕкавой \ оэ

каковой является генодиагностика. Тем не менее опыт нескольких лет применения таких анализов в США [Dodd R.Y. et al., 2002], во Франции [Pillonel J. et al.,. 2002], в Италии [Velati С. et al., 2002] и в Испании [Alvarez М. et al., 2002] свидетельствует о реальном снижении риска инфицирования через препараты донорской крови. С учетом невысокой сложности исполнения генамплификационных анализов и создания в последнее время относительно недорого оборудования, в том числе и отечественного производства, внедрение генотестирования в практику службы крови России является назревшей и актуальной задачей.

Цель работы, как следует из ее названия, заключается в создании практического варианта комплекса технологий генотестирования крови и других материалов и разработке соответствующих тест-систем.

Основные задачи работы могут быть разделены на две группы. Во-первых это нахождение приемлемых решений для основных проблем генодиагностики, таких как выявление ложноотрицательных и ложноположительных результатов, оптимизация методов выделения ДНК и РНК из биопроб и компоновки реагентов, обеспечивающей их сохранность и удобство постановки анализа Второй группой задач данной работы является первый российский опыт практического внедрения генодиагностических анализов в службу крови и оценка реального уровня распространения патогенов в донорской крови.

Научная новнзна работы.

Предложен общий подход к проведению генодиагностических анализов в условиях обычных клинических лабораторий. Он состоит в следующем.

Для минимизации потерь нестабильной РНК определяемых вирусов предложена однопробирочная технология, при которых ДНК и РНК биопробы находятся в условиях, исключающих действие нуклеаз внешней среды -последовательно в сильносолевом растворе, в виде суспензии в органической среде и в сухом осадке, который далее растворяется одновременно с обратной транскрипцией РНК.

Впервые предложен двухрастворный вариант компоновки реагентов в генодиагностических тест-системах на основе ПЦР, обеспечивающий их длительную сохранность в готовом для работе виде при комнатной температуре, что обеспечило предельное упрощение как проведение анализа, так и хранение и транспортировку реагентов.

Для выявления как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов предложено использовать внутренние стандарты конкурентного типа, благодаря которым возможны и количественные оценки содержания возбудителя в пробе. Работы в области количественной ПЦР с такими внутренними стандартами и их конструированию были начаты нами еще в 1993 году. Показано, что требования к соответствию структуры таких стандартов и определяемой ДНК не столь высоки, как считалось ранее, что позволяет их конструировать простыми методами для широкого круга возбудителей.

Установлено, что основным, если не практически единственным источником ложноположительных результатов является попадание во внешнюю среду продуктов ПЦР - амплификонов, поскольку возможно устранение ложно-положительных результатов методом, состоящим в переходе на другую систему праймеров и обратно. Это подтверждает, что наиболее перспективным путем преодоления этого главного ограничения генамплификационных анализов является переход к детекции продуктов в закрытой системе - ПЦР в реальном времени или флуориметрия без вскрытия пробирки.

Предложенный двухрастворный вариант компоновки реагентов применим и в тест-системах для генотипирования. На примере в- и г-мутаций гена альфа-1-анггитрипсина впервые была показана возможность обнаружения с помощью аллель-специфичной ПЦР в одной пробирке нуклеотидных замен в двух точках одновременно.

Практическая значимость работы.

Разработаны тест-системы для генотестирования основных гемотрансмиссивных возбудителей (ВИЧ, вирусов гепатитов В и С,

цитомегаловируса, бледной трепонемы), а также для других клинически-значимых возбудителей, включая системы для обработки проб крови и других материалов, которые успешно применяются в ряде медицинских учреждений.

Полностью обоснована и экспериментально подтверждена эффективность применения специально сконструированных ДНК - внутренних стандартов конкурентного типа как универсальных средств для выявления ложноотрицательных и ложноположительных результатов ПЦР-анализа.

Проведенный на СПК КЗ г.Москвы и СПК ФУ «Медбиоэкстрем» первый российский опыт ручного и полуавтоматического минипул-ПЦР-тестирования плазмы донорской крови на ВИЧ и вирусы гепатитов В и С показал его эффективность как в небольших, так и в более крупных СПК.

Применение генамплификационных технологий позволило получить ряд данных о реальном распространении патогенов, необходимых для лечебно-профилактической работы среди доноров и других групп лиц, требующих повышенного внимания в отношении их инфекционной безопасностии. Строго доказанное отсутствие генома патогенов во многих случаях указывает на возможность и необходимость реабилитации доноров и пациентов, а также на возможность использования компонентов и препаратов крови.

Разработанные принципы конструирования и форматы тест-систем для генодиагностики и генотипирования имеют общий характер и могут быть применены для создания аналогичных систем для обнаружения других патогенов или мутаций.

Состояние внедрения.

Разработанный комплекс технологий ПЦР-генотестирования донорской крови на вирусы гепатитов В, С и ВИЧ внедрен в повседневную практику на Станции переливания крови ФУ «Медбиоэкстрем» Минздрава РФ параллельно с иммуноферментным тестированием. Разработанные генодиагностические тест-системы применяются в Кировском НИИ гематологии и трансфузиологии (г.Киров), Российском НИИ гематологии и переливания крови (г.Санкт-

Петербург), НИИ медицины труда РАМН (г.Москва), 301-м окружном военном клиническом госпитале (г.Хабаровск) и в других медицинских учреждениях.

Наборы реагентов для подготовки биологического материала для ГТТТР (ГенТест-РНК'ДЖ-экстракция, ТУ 9398-423-47621885-00) и определения РНК вируса гепатита С в сыворотке и плазме крови (ГенТест-НС, ТУ 9398-42347621885-00) внесены в государственный реестр медицинских изделий (регистрационные удостоверения №29/24091099/1926-01 и №29/24091099/192701 от 14 июня 2001 г.).

Сделанное в ходе данной работы изобретение «Способы и наборы реагентов для генамплификационной диагностики методами ПЦР и РНК-ПЦР» (заявка №2000118116 от 11.07.2000, патент №2164532) рекомендовано экспертным отделом Федерального института промышленной собственности для включения в базу данных перспективных российских разработок (сообщение ФИПС №41-286-12 от 12.03.2001 г.)

По результатам данной работы совместно с Федеральным центром Госсанэпиднадзора разработаны методические указания «Применение ПЦР-генотестирования донорской крови на ВИЧ, вирусы гепатитов В, С и цитомегаловирус», представленные от СПК ФУ «Медбиоэкстрем» на парламентские слушания Комитета Государственной думы РФ по охране здоровья и спорту на тему «О государственной политике по предупреждению распространения в Российской Федерации заболеваемости инфекционным гепатитом», проходившие 13 февраля 2001 г.

Результаты данной работы включены в тематический цикл «Универсальные технологии для генотестирования биоматериалов» Института повышения квалификации ФУ «Медбиоэкстрем» Минздрава РФ.

Апробация работы состоялась 4 февраля 2003 г. на конференции Центра крови Минздрава Российской Федерации. Материалы работы докладывались также на конференциях SoGAT в 2000 r.(SoGAT 11th meeting of 12 May 2000, Madrid; 12th meeting of 17 November 2000, NIBSC, London); 25th Congress of the

International Society of blood transfusion, June 27 - July 2, 1998, Oslo, Norway; Cambridge Healthtech Institute's conference "Blood Safety - Europe", November 1618, Lisbon, Portugal; VI regional congress of the international society of blood transfusion, Jerusalem, Israel, May 9-13, 1999; на научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» в Санкт-Петербурге в 2000 г., на 2-й и 10-й международных конференциях «СПИД, рак и родственные проблемы в Санкт-Петербурге в 1993 и 2002 гг., на 3-й и 4-й всероссийских научно-практических конференциях «Генодиагностика в современной медицине» в Москве в 2000 и 2002 гг., на научно-практических конференциях «Современные проблемы гематологии и трансфузиологии» в Кирове в 2000 и 2002 гг., на У1П съезде всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Москве 26-28 марта 2002 г. и других научных конференциях.

По материалам диссертации опубликовано 55 работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 186 страницах компьютерного текста кегля 12, состоит из введения, литературного обзора на тему «Генамплификационная диагностика: современное состояние, проблемы и перспективы», разделов «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 139 источников, и приложения. Иллюстрации представлены 51 рисунком и 15 таблицами.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. При генодиагностических анализах, проводимых с использованием ПЦР и обнаружением ее продуктов гель-электрофорезом, применение внутренних стандартов конкурентного типа, обеспечивающих количественные оценки содержания генома возбудителя в пробе, является оптимальным способом выявления как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов, обусловленных контаминациями исходной смеси. При этом по своей структуре внутренние стандарты конкурентного типа могут быть продуктами ПЦР и иметь

существенные отличия в нуклеотидной последовательности от определяемого генома, что упрощает получение таких стандартов для широкого круга возбудителей.

2. Предложен способ устранения ложноположительных результатов в условиях высокого фона контаминаций путем перехода на систему «смещенных» праймеров, эффективность которого прямо подтверждает тот факт, что основным источником ложноположительных результатов при генодиагностике является попадание размноженных продуктов в исходную смесь.

3. Разработан комплекс технологий и тест-систем для генотестирования вирусов гепатитов В, С и ВИЧ и бледной трепонемы в донорской крови, а также других важных патогенов в различных клинических материалах. Осуществлен первый российский опыт регулярного минипул-ПЦР-генотестирования донорской крови.

4. Предложен и запатентован двухрастворный формат компоновки реагентов для постановки ПЦР, обеспечивающий их длительную сохранность при комнатной температуре, что позволяет существенно упростить генодиагностические анализы.

5. На примере сконструированной тест-системы для генотипирования Ъ,!-аллелей гена альфа-1-антитрипсина показана возможность обнаружения нуклеотидных замен в двух и более точках посредством аллель-специфичной ПЦР в одной смеси с последующей гель-электрофоретической детекцией продуктов ПЦР.

6. Основным преимуществом генотестирования является возможность строгого доказательства отсутствия генома патогена в исследуемом материале, что дает основание для реабилитации компонентов и препаратов донорской крови, а также обследуемых лиц как инфекционно безопасных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реактивы.

Для приготовления реагентов для ПЦР и для выделения ДНК и РНК из биопроб использовали отечественные или импортные реактивы, соответствующие квалификации не ниже ХЧ. Тад ДНК-полимеразу приобретали у отечественных производителей (в основном «Диалат», ФГУП «ГОСНИИГЕНЕТИКА» в Москве, «Биосан» в Новосибирске), обратная транскриптаза МиЬУ - фирмы "Ргоп^а" (США) или «Биосан» (Россия), дезоксинуклеозидтрифосфаты - фирмы «Медиген» (Новосибирск, Россия). Олигонуклеотидные праймеры были синтезированы на фирме «Синтол» (Россия).

Клинический материал.

Отработка методов генотестирования вирусов в крови проводилась на образцах донорской крови и плазмы, обследованных в лаборатории иммуноферментного анализа СПК КЗ г.Москвы и СПК ФУ «Медбиоэкстрем». Использовали также различные клинические материалы других учреждений, упомянутых в тексте.

Положительные контроля.

В качестве положительных контролей при текущей работе и комплектования тест-систем применялись препараты ДНК и РНК возбудителей, полученных или приготовленных как указано ниже с приближенным подбором концентрации. Использовались также амплификоны, извлеченные из геля после электрофореза в виде полосок агарозы, которые далее расплавлялись в 1 мл воды, и полученный раствор далее разбавлялся водой не менее чем в 104 раз. Для оценки чувствительности и калибровки тест-систем применялись международные стандарты и эталонные образцы, охарактеризованные в соответствующем разделе.

В качестве обычного положительного контроля ВИЧ-ДНК применялась ДНК-копия генома ВИЧ (изолят НХВ2), клонированная в плазмиде рБР62

(AroS Reagent Project NIBSC, ARP206). Для ВИЧ-РНК применялся прогретый при 95°С в течение 20 минут в присутствии хелатирующего сорбента Chelex-100 (для инфекционной безопасности) супернатант культуры клеток Н9, инфицированных HIV-1 RF (AIDS Reagent Project NIBSC, ARP103.1) или аналогичный супернатант культуры клеток СЕМ, инфицированных HIV-1 ZmB (от П.Г\Рытика, Белорусский НИИ эпидемиологии и микробиологии, г.Минск). Использовались также эталонные образцы ВИЧ-ДНК: HIV-1 positive control DNA фирмы Perkin Elmer (N808-0016) и международный стандарт NIBSC -серия разведений плазмидного клона ВИЧ-1.

Для вируса гепатита В применялись плазмы крови доноров, оказавшихся ПЦР-положительными, или их щелочные лизаты [Lucotte G. et al., 1994]. Международный стандарт для генодиагностирования гепатита В - WHO international Standard for HBV DNA NAT assays, code 97/746 с концентрацией вируса 6.25xl06 GE/ml, был любезно предоставлен В.Герлихом (W.Gerlich, Institute of Medical Virology, Justus Liebig University Giessen, Giessen, Germany).

Для вируса гепатита С применялись плазмы крови доноров, оказавшихся ПЦР-положительными. В текущей работе применялся также раствор РНК-транскрипта - копии 5'-концевого нетранслируемого участка РНК вируса гепатита С, предоставленный фирмой «Авиценна» (получен транскрипцией плазмидного клона РНК-полимер азой Т7).

Цитомегаловирус и вирусы герпеса. Для ЦМВ и вируса герпеса-2 применяли препараты ДНК фирмы Sigma (США), не заявленные как эталонные. Для герпеса-1 применялся раствор ДНК, предоставленный фирмой «Авиценна».

Бледная трепонема. В качестве положительного контроля на ДНК и РНК применяли полученный из ЦНИКВИ МЗ РФ смыв со срезов яичек инфицированного кролика. Представлял собой суспензию клеток трепонемы в физиологическом растворе, хорошо сохранающуюся при 2-8°С в течение нескольких месяцев [Федоров E.H. и др., 2002]. Применялась также ДНК трепонемы, выделенная из этой культуры. В качестве эталонного образца ДНК бледной трепонемы известной концентрации использовали препарат, любезно

предоставленный А.Центурион-Лара (Arturo Centurion-Lara, Department of Medicine and Neurology, University of Washington, Seattle, USA).

Токсоплазма. Применяли инактивированная мертиолятом К2 культура Toxoplasma gondii, предоставленная НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф,Гамалеи, и ДНК, выделенная из этой культуры.

Хламидня, микоплазма и уреаплазма. Применялись растворы ДНК C.trachomatis, M.hominis U.Urealiticim, предоставленные фирмой «Авиценна».

Трихомонада, гонорея и холерный вибрион. Применялись растворы ДНК T.vaginalis, N.gonorreae, V.cholerae, предоставленные НИПЧИ «Микроб» (г.Саратов).

Прнборы и оборудование.

С учетом главной задачи работы - создания комплекса технологий генотестирования донорской крови на вирусы для их применения в условиях обычных клинических лабораторий - использовалось генамплификационное оборудование, коммерчески доступное в России. Наилучшим соотношением цены и качества обладают дозаторы жидкостей фирмы Labsystems (филиал в Санкт-Петербурге), термостаты и вортексы фирмы «Биоком», настольные среднескоростные (до 16000g) центрифуги фирм ELMI (Латвия) или Eppendorf (Германия), доступные через фирму Диа-М, термоциклер «Терцик» и электрофоретическое оборудование фирмы «ДНК-технология». Для регистрации электрофореграмм был успешно применен гель-сканер «ГСК-Шатер-ЮООМ» с компьютерной обработкой изображения по программе «Дельтатех TV-95 М800 V2.3» (производство ТОО «Дельтатех» Научного парка МГУ). Эта система, как и другие аналогичные, позволяют сохранять электрофореграммы в памяти компьютера, идентифицировать продукты ПЦР в геле и проводить обработку изображения, необходимую для количественной ПЦР с внутренним стандартом.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Обработка проб крови, ее компонентов и белковых препаратов для генотестирования вирусных и бактериальных ДНК и РНК.

При выборе и адаптации метода обработки проб для контроля вирусной безопасности крови основным критерием является, конечно, обеспечение сохранности ДНК и особенно РНК в процессе выделения. Задачей данной работы состояла еще и в том, чтобы метод был прост и доступен в исполнении и не требовал использования дорогостоящих материалов. Для подбора такого метода была проведена сравнительная оценка различных доступных методов подготовки проб для ПЦР, каковыми для клинических лабораторий России являются метод щелочного лизиса, лизиса протеиназой К, термическго лизиса с сорбентом, метод фенольной депротеинизации, однопробирочный метод лизиса и осаждения ДНК и РНК и метод сорбции ДНК и РНК на силикагеле.

Для выделения вирусных ДНК и РНК из сыворотки и плазмы крови при регулярном генотестировании для обеспечения вирусной безоапсности наиболее

привлекательно выглядит однопробирочный метод, состоящий из лизиса при 60°С в присутствии концентрированного иодистого натрия и последующего высаживания ДНК изопропанолом. Данный метод обеспечивал практически количественное выделение вирусной ДНК и РНК, пригодной для ПЦР-анализа, и привлекал простотой исполнения и доступностью реагентов. Как показал опыт, метод также оказался весьма эффективен при работе с белковыми препаратами, цельной кровью и даже с сухими пятнами крови на фильтровальной бумаге. Данный метод был запатентован (патенты РФ № 2134871, приоритет 01.12.98; № 2164532, приоритет 11.07.00), для проведения такого выделения был разработан и производится в ЦНИИ ТММГ АМТН набор из трех реагентов («ГенТест-РНК/ДНК-эксгракция», ТУ 9398-423-47621885-00). Данный метод оказался удобен еще и тем, что обратная транскрипция РНК может быть совмещена с растворением осадка суммы РНК и ДНК. Таким образом можно получать сумму ДНК и кДНК биопробы без изоляции РНК -

минуя стадию растворения РНК в воде или водном буфере. Это означает переход к технологии, когда РНК биопробы в процессе выделения недоступна для действия рибонуклеаз внешней среды, поскольку находится в высокоионной денатурирующей среде, в органической среде или в сухом осадке, который прямо попадает в процесс обратной транскрипции. Проведение обратной транскрипции рибосомальной 16S рРНК при растворении осадка, полученного при обработке однопробирочным методом из культуральных смывов бледной трепонемы, позволило, как и ожидалось на основании литературных данных [Centurion-Lara et al, 1997], многократно повысить чувствительность определения этого возбудителя методом ПЦР на фрагменте указанной РНК (рис.1). Это связано с тем, что 16S рРНК, содержится в количестве не менее 1000 копий на клетку, а ее гены - в единичных копиях.

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис.1. Электрофореграмма продуктов ПЦР-детекции бледной трепонемы по ДНК гена 16S рРНК и по самой 16S рРНК в смывах, содержащих 1000 (1 и 4), 100 (2 и 5) и 10 (3 и 6) клеток возбудителя в пробе. Для проб 4-6, в отличие от проб 1-3, была проведена обратная транскрипция РНК. 7 и 8 - отрицательный и положительный контроли.

Опробованный нами еще в 1993 году метод выделения ДНК термическим лизисом с сорбентом - фосфоцеллюлозой, являющийся аналогом обработки InstaGene фирмы BioRad, оказался весьма эффективным при обработке клеточных осадков - лейкоцитарой фракции крови или клеток из суспензии мазка или соскоба со слизистой. Методика сводится к добавлению суспензии сорбента к осадку клеток, отмытых от растворимых примесей, перемешиванию смеси и прогреву ее 15 минут при 95°С, что очень просто в исполнении при массовых анализах. Для обработки проб методами термолизиса с сорбентом и сорбции на силикагеле в ЦНИИ ТММТ АМТН также налажено производство наборов реагентов.

Применение внутренних стандартов как способ выявления ложиоотрицательных и ложноположительных результатов ПЦР

Внутренние стандарты конкурентного и неконкурентного типа.

Основная причина ложиоотрицательных результатов при ПЦР-анализах состоит в наличии ингибирующих примесей из-за недостаточной очистки ДНК и РНК при выделении. Другой причиной ложиоотрицательных результатов являются возможные потери ДНК и РНК при выделении. Причиной ложноположительных сигналов, очень распространенных в ПЦР-анализе, являются контаминации (загрязнения) исходной смеси единичными молекулами определяемых ДНК и РНК, прежде всего продуктами ПЦР.

Для преодоления этих нежелательных явлений при регулярной генодиагностической работе наиболее привлекательным представляется использование количественной ПЦР с внутренним стандартом - специально сконструированной ДНК или РНК, размножающаяся в ПЦР вместе с определяемой последовательностью мишени, но дающая отличный от нее сигнал - при электрофоретической детекции это фрагмент ДНК другой длины и подвижности в геле. Наличие этого сигнала в пробах при отсутствии сигнала патогена указывает на эффективность ПЦР и строго доказывает отрицательный результат анализа, а отсутствие дает возможность выявить ложноотрицательные результаты, обусловленные ингибированием. Для выявления также и ложноположительных результатов, обусловленных контаминациями, предлагается использовать внутренние стандарты конкурентного типа, применяемые при количественной ПЦР. Последняя основана на том, что внутренний стандарт работает в ПЦР с теми же праймерами что и определяемая ДНК, «конкурируя» с ней, благодаря чему отношение интенсивностей сигналов пропорционально количеству введенной в ПЦР определяемой ДНК [Rolfs А. et al, 1992; Pannetier С. et al, 1993]. Внутренний стандарт может просто «глушить» слабые сигналы случайно занесенных единичных молекул, а при небольшом уровне контаминаций отношение сигналов возбудителя и стандарта в отрицательном контроле может рассматриваться как фоновый уровень

(аналогичный cut-off в ИФА), с которым сравниваются сигналы всех анализируемых проб. Кроме того, оценки количества генома возбудителя в пробе представляют особый интерес.

Для выявления ложноотрицательных результатов предлагалось также проводить параллельную ПЦР с другой парой праймеров на фрагменте ДНК [Innis М.А. et al, 1990; Tabrizi S.N.et al, 1993] или РНК [Saksela К. et al, 1994] организма-хозяина. При определении вирусов в плазме крови в качестве внутреннего контроля предлагалось введение непатогенного для человека вируса бычьей диарреи BVDV [Simmonds Р., 1999]. Подобные системы, требующие проведения дополнительной ПЦР с отдельной парой праймеров в той же смеси или отдельно, можно рассматривать как внутренние стандарты неконкурентного типа. Они не дают возможности количественных оценок содержания возбудителя, но обеспечивают контроль ингибирования ПЦР и, что очень важно, контроль потерь ДНК и РНК при обработке проб, не требуя при этом работы по их конструированию.

С учетом изложенного одной из задач работы были подбор структуры и методики применения внутренних стандартов ПЦР для последующего регулярного применения в службе крови при генотестировании патогенов.

Выбор структуры и конструирование внутренних стандартов

Первый опыт конструирования внутренних стандартов и количественной ПЦР был проведен нами в 1993 году в ходе работы, тогда еще прямо не связанной с задачами службы крови. Для точного определения содержания провирусной ДНК ВИЧ в лейкоцитах крови разных пациентов в ходе лечения (работа проводилась в Институте вирусологии РАМН), вне зависимости от потерь ДНК при подготовке пробы была применены две количественных ПЦР с внутренними стандартами: одна на фрагмент вирусного гена pol, другая на фрагмент клеточного гена HLA-DQoc. По отношению величин, полученных при этих двух анализах, определялось число копий ВИЧ-ДНК на 1000 лейкоцитов. Для конструирования внутренних стандартов было применено направленное

соединение фрагментов ДНК методом ПНР, предложенное нами же одновременно с серией аналогичных работ других авторов и известным в литературе под названием DNA splicing by overlap extension [Horton С. et al, 1989]. Этот метод позволяет соединять с помощью ПЦР выбранные фрагменты одной или разных ДНК практически в любой заданной точке. Схема конструирования внутреннего стандарта на ВИЧ, имеющего вставку 80 н.п. в размножаемом при ПЦР участке, приведена на рис.2.

Исходная ДНК

1__2

А Bi Ва С

Внутренний стандарт со вставкой Рис.2. Схема синтеза внутреннего стандарта путем ПЦР-копирования и соединения фрагментов ДНК. АС - определяемый участок в ДНК возбудителя, В - место введения вставки (в данном случае это фрагмент В,В2 плазмидной ДНК) Соединения скопированных фрагментов в ПЦР обеспечиваются введением перекрывающихся участков с помощью праймеров необходимой структуры.

Испытания сконструированных внутренних стандартов показали, что для

них соблюдается прямая пропорциональная зависимость между отношением

сигналов ДНК-мишени и внутреннего стандарта после электрофореза в геле и

количеством определяемой ДНК-мишени в исходной смеси. С учетом того, что

в данной работе длина продукта ПЦР на ДНК ВИЧ составляла 130 н.п., а длина

такового для внутреннего стандарта составляла 210 н.п., то есть на 61% больше,

этот результат был совсем не тривиален, так как в литературе указывалось на

очень высокие требования близости структур ДНК-мишени и внутреннего

стандарта [Pannetier S. et al., 1993; Rolfs A.et al., 1992].

По аналогичной приведенной на рис.2 схеме позднее были получены внутренние стандарты на вирусы гепатитов В и С, цитомегаловирус, бледную трепонему, а также на ген токсина холерного вибриона. Стоит отметить, что используемый при этом метод направленного ПЦР-соединения фрагментов ДНК применяется в ведущих лабораториях до настоящего времени [ТЭтШеп С. ег а!., 2001]. Тем не менее такой метод конструирования внутренних стандартов представлялся нам слишком трудоемким, в связи с чем был опробован способ получения внутренних стандартов за одну ПЦР - копирование какой-либо ДНК с помощью составных праймеров [НоШе1с1 Р. е1 а1., 1994]. Такие составные праймеры имеют длину около 40 звеньев: первые 20-25 звеньев с 5'-конца совпадают с рабочим праймером, используемом при анализе, а следующие до 3'-конца - последовательность какой-либо доступной ДНК, выбранная так, чтобы полученный амплификон - внутренний стандарт имел требуемую длину. Однако, в отличие от схемы на рис.2, участок генома возбудителя между праймерами во внутреннем стандарте заменяется на совсем другой участок. При этом полностью игнорируются упомянутые выше требования близости структур внутреннего стандарта и размножаемого участка генома возбудителя. Тем не менее приведенные на рис.3 и 4 данные показывают, что внутренний стандарт на уреаплазму, полученный методом составных праймеров, и внутренний стандарт на вирус гепатита В, полученный введением вставки, одинаково эффективно работают в количественной ПЦР. Методом составных праймеров в данной работе были сконструированы внутренние стандарты для нескольких урогенитальных и других клинически значимых патогенов.

Таким образом, в результате проведенного исследования было установлено, что даже для точных количественных измерений требования к соответствию структур внутреннего стандарта и определяемой ДНК намного ниже, чем считалось вначале. Это позволяет получать внутренние стандарты с помощью простых методов, что существенно облегчает создание генодиагностических тест-систем для широкого круга возбудителей.

/ — 272

----Integral------

187 326 199 514,67

1,58

//--------Integral-

327 189 679

201 117,92

0,17

Рис.3. ПЦР-анализ ДНК вируса гепатита В с внутренним стандартом (его сигнал расположен выше сигнала ДНК-мишени). На электрофореграмме слева дорожка 1 соответствует исходному препарату ДНК (щелочной лизат плазмы крови вирусоносителя), 2 и 3 - соответственно его разведения в 10 и 100 раз, 4 - результат ПЦР без вирусной ДНК (виден только сигнал стандарта). Справа приведен результат обработки по программе «Дельтатех TV-95 М800 V2.3». Данные по колонкам слева направо: координата дорожки (272 и 327 соответствуют дорожкам 2 и 3), координата пробега в геле (программа идентифицировала две полосы: стандарта (187) и вирусной ДНК (199)), результат «взвешивания» полосы (интегрирования интенсивности флуоресценции по площади полосы) и отношение «массы» полосы ДНК-мишени к массе полосы стандарта.

//--------Integral----------//

692 395 2164

448 7513,50 3,47

//--------Integral----------//

747 394 5072

447 1723,20 0,34

Рис.4. ПЦР-анализ ДНК Ureaplasma unealiticum с внутренним стандартом (его сигнал расположен выше сигнала ДНК-мишени). На электрофореграмме слева дорожка 1 соответствует исходному препарату ДНК (щелочной лизат плазмы крови вирусоносителя), 2, 3 и 4 - соответственно его разведения в 10, 100 и 1000 раз, 4 -результат ПЦР без вирусной ДНК (виден только сигнал стандарта). Справа приведен результат той же обработки, что и на рис.3 (координаты 692 и 747 соответствуют дорожкам 2 и 3),

С учетом основной задачи работы в целом - создания практического варианта комплекса технологий генотестирования крови и других материалов для применения в условиях России в настоящее время - наиболее оптимальным представляется разработка генодиагностических тест-систем с конкурентными внутренними стандартами типа амплификонов, использующих хорошо отработанную электрофоретическую регистрацию результатов. Такие системы вполне обеспечат надежное генодиагностирвание патогенов в крови и других биоматериалах в период ближайших нескольких лет до внедрения в повседневную практику методов нового поколения типа ПЦР в реальном времени, которые пока еще находятся в стадии разработки.

Практическое применение внутренних стандартов.

При разработке комплекса технологий генотестирования было решено вводить внутренний стандарт в реакционную смесь ПЦР, а не в смесь до выделения, а также использовать внутренние ДНК-стандарты для РНК-ПЦР. Это оставляет вне контроля стадии выделения ДНК и РНК из биопробы, а также стадию обратной транскрипции, но вполне оправдано с точки зрения практической работы. Стадия обратной транскрипции хорошо контролируется с помощью положительного контроля РНКовой природы, использование же внутреннего стандарта в форме нестабильной РНК подняло бы проблему его сохранности в строго определенной концентрации. Введение же внутреннего стандарта в смесь для ПЦР (что практикует, в частности, также и фирма «Литех»), полностью оправдано в случаях, когда процесс выделения ДНК из биоматериала просто исключает потери (например, при термическом лизисе с сорбентом) или эти потери невелики и стабильны (что бывает при любом налаженном методе). Наконец, следует указать на то, что в большинстве случаев (и в том числе - при генотестировании донорской крови на вирусы) проводится анализ одной пробы на несколько инфекций, и стадия выделения нуклеиновых кислот из пробы, а также обратная транскрипция РНК оказываются общими для разных возбудителей.

В качестве «универсальных» внутренних стандартов конкурентного типа, контролирующих стадии выделения РНК из биопробы, обратной транскрипции и ПЦР применяются «армированные РНК» [ЕйШеп С. е1 а1., 2001], которые весьма сложны в изготовлении. Следует указать, что специально для контроля выделения ДНК и РНК биопробы применяются другие внутренние стандарты -неконкурентного типа (см.выше). Примененная на раннем этапе работы уже упомянутая схема количественной ПЦР с двумя внутренними стандартами - на возбудитель и на ген организма-хозяина НЬА-ОС>а - как раз и нацелена на получение количественных данных о вирусной нагрузке независимо от возможных потерь ДНК при выделении. С ее помощью для проб крови нескольких ВИЧ-инфицированных пациентов было показано, что содержание

вирусной ДНК в крови составляет от 2 до 500 копий на 1000 лимфоцитов и сильно различно для разных пациентов. Обнаружены его закономерные уменьшения при азидотимидиновой терапии. Аналогичные оценки с двумя внутренними стандартами были проведены позже и для ДНК цитомегаловируса. Среди кадровых доноров СПК КЗ г.Москвы в 1998 году обнаружено 6,5% (23 из 350) носителей этого условно-патогенного вируса, и его содержание было очень невелико 1 копия генома на 5-10 тысяч лейкоцитов. Опыт работы, однако, показал, что дополнительная количественная ПНР на клеточный ген делает методику довольно громоздкой. Тем не менее подобная схема может оказаться удобной для практической работе при ПЦР в реальном времени, которая дает количественные данные без применения конкурентных внутренних стандартов. В этом случае ПЦР на фрагменте генома возбудителя и на каком-либо контрольном фрагменте генома, присутствующем в пробе или введенном специально, могла бы быть проведена в одной смеси ПЦР и обеспечить информацию о количестве возбудителя в биоматериале независимо от ингибиторов ПЦР, потерь ДНК и РНК при выделении и даже эффективности отбора клинической пробы.

Внутренний стандарт при обнаружение бактерий методом ПЦР на универсальной последовательности гена рибосомальной РНК. Методом посева на питательные среды удалось выявить довольно заметный уровень нестерильности хранимых единиц тромбоконцентрата, эритромассы и свежезамороженной плазмы [Montag Т., 2001]. Однако рост бактерий происходит не во всех случаях, так как существуют некультивируемые или медленно растущие микроорганизмы.

Благодаря характерной для рибосомальной 16S рРНК консервативности структуры в ее генах методом ПЦР можно обнаруживать всех бактерий без применения культуральных методов [Klausegger А. et al, 1999]. Однако ПЦР такого типа (универсальная) осложнена проблемой ложноположитель ных результатов гораздо более, чем обычное специфическое генотестирование. Это связано с присутствием примеси бактериальной ДНК в препаратах ферментов

Taq-полимерэзы, а также обратной транскриптазы для РНК-ПЦР, выделяемых для практической работы из рекомбинантных бактерий, и с нестерильностью работы при обычной генодиагностике.

Подобные проблемы возникли при первой же нашей попытке провести ПЦР на универсальном фрагменте генома бактерий, и для ее решения по аналогии был сконструирован и применен внутренний стандарт конкурентного типа. Однако сигнал примесной бактериальной ДНК мог быть «заглушён» лишь довольно высокими концентрациями внутреннего стандарта. Нам удалось подобрать препарат фермента, позволявший получать приемлемые результаты в присутствии 300 молекул внутреннего стандарта на пробу. ПЦР-анализ в этом случае имел чувствительность, уступающую методу посева для хорошо растущих бактерий, но позволял обнаруживать совершенно некультивируемую in vitro бледную трепонему.

Об актуальности работ в области универсального генодиагностирования бактерий в донорской крови, ее компонентах и других материалах говорит то большое внимание, которое уделялось этой проблеме на последней сессии SoGAT в июне 2002 года. Исследования в данном направлении продолжаются, и основной проблемой является устранение влияния всех бактериальных ДНК и РНК внешней среды, что является даже более строгим требованием, чем стерильность работы в обычном понимании.

Двухрастворная компоновка реагентов для ПЦР и обратной транскрипции

Во всех разработанных и применяемых в данной работе тест системах применяется двухрастворный формат компоновки реагентов, который запатентован (патент РФ № 2164532, приоритет 11.07.00). Для ПЦР такими растворами являются (1) двукратный буфер с ферментом Taq-полимерэзой и хлористым магнием (2хБФ), общий для всех ПЦР-анализов, и (2) амплификационный реагент, специфичный для каждого типа анализов, содержащий дезоксинуклеозид-трифосфаты, праймеры, фрагмент ДНК

внутреннего стандарта, лидирующий краситель для электрофоретического анализа продуктов ПЦР и, возможно, другие компоненты. Реакционная смесь для однократной ПЦР или для каждого из двух раундов амплификации при двукратной (гнездовой) ПЦР формируется путем смешивания 2хБФ, амплификационного реагента и препарата суммарной ДНК из биопробы. Преимуществами предлагаемой схемы формирования реакционной смеси для ПЦР являются (1) минимально возможное число растворов для ПЦР (два), один из которых, кроме того, является универсальным для всех анализов; (2) возможность повышения специфичности ПЦР с помощью «горячего старта» -начала амплификации строго при температурах выше 80°С, достигаемого с помощью расплавляемой парафиновой перегородки между амплификационным реагеном (внизу) и смесью 2хБФ с амплифицируемой ДНК (ввверху), или с помощью термоактивируемой Taq-ДHK-пoлимepaзы в составе 2хБФ; (3) стабильность универсального реагента 2хБФ и амплификационных реагентов, которые хранится в течение пяти месяцев при комнатной температуре (рис.5).

Рис.5. Электрофоре грамма продуктов ПЦР-анализа ДНК из плазмы здорового донора (1, 3,5) и носителя вируса гепатита В (2, 4, 6). Используемые при этом амплификационный реагент аНВ и буфер с ферментом 2хБФ хранились 5 месяцев при -20°С (1, 2) и при комнатной температуре (3-6). В пробах 5 и 6, в отличие от 3 и 4, реагенты дополнительно содержали консервант - азид натрия. Сигнал вируса расположен ниже сигнала внутреннего стандарта.

Для обратной транскрипции реакционная смесь формируется также из двух раствров: ЛТВ-хх (буфер для обратной транскрипции, содержащий трифосфаты, хлористый магний и требуемые антисмысловые праймеры; хх - сокращенное обозначение возбудителя) и рабочего раствора обратной транскриптазы МиЬУ (реагент ЛТ). Испытания показали, что эти реагенты также стабильны при комнатной температуре по крайней мере в течение двух месяцев. Фермент Тад-

полимераза, а также обратная транскриптаза МиЬУ производства фирм

«Ргоп^а» (США) и «Биосан» (Россия) так же хорошо сохраняется и в более концентрированном, четырехкратном буфере, содержащем хлористый магний. Может быть приготовлен и 4-кратный буфер с Тач-полимеразой и обратной транскриптазой (4хЯТАВ), который также стабилен при хранении и позволяет проводить обратную транскрипцию и затем ПЦР в одной пробирке в ячейке термоциклера, задав соответствующую программу.

Полученные данные о стабильности реагентов для ПЦР в разных условиях указывают на необходимость пересмотра многих методик генотестирования, ) правил хранения и перевозки реагентов в сторону их упрощения. Все разработанные тест-системы могут перевозиться без термоса и храниться в обычном холодильнике или даже при комнатной температуре. Замораживание растворов нежелательно - оно неблагоприятно влияет на амплификационный раствор (2хБФ, тем не менее, хорошо выдерживает многократные заморозки-оттаивания, что довольно неожиданно).

Характеристика разработанных и применяемых наборов генодиагностических реагентов

В ходе данной работы были разработаны и опробованы тест-системы 1 (наборы реагентов) для генодиагностики как важнейших гемотрансмиссивных, так и других важных патогенов. Опытное производство всех этих наборов > начато в ЦНИИ ТММТ АМТН; два из них (ГенТест-РНК/ДНК-экстракция для однопробирочного выделения суммы РНК и ДНК; ГенТест-НС для определения РНК вируса гепатита С) прошли все официальные испытания и зарегистрированы в Комитете по новой технике Минздрава Российской Федерации; остальные полностью готовы к такой регистрации. С учетом требования сочетания максимальной чувствительности анализа и достоверности результата на первом этапе применения генотестирования в службе крови использовалась максимально чувствительная двукратная ПЦР в присутствии наименьшего из практически возможного количества внутреннего стандарта -10 молекул на пробу. Однако опыт практической работы и проблема

контаминаций указывает на возможность и некоторую целесообразность перехода к однократной ПЦР. Это было сделано для гепатита В, для большинства же других клинически значимых инфекций двукратная ПЦР никогда не применялась.

Для генотестирования вирусов гепатита С и ВИЧ в сыворотке и плазме крови разработаны наборы реагентов и практические одинаковые методики анализа, включающая проведение обратной транскрипции одновременно с растворением осадка, получаемом при однопробирочном выделении или фенольной депротеинизации (возможен и анализ препарата РНК в виде раствора) и двукратную ПЦР в присутствии 10 молекул соответствующего внутреннего стандарта. В случае ВИЧ предусмотрено определение как РНК вирионов, так и ВИЧ-ДНК в составе лейкоцитарной ДНК. Чувствительность тест-системы на ВИЧ на стадии ДНК-ПЦР была проверена с использованием контрольных растворов плазмидных клонов известной концентрации, предлагаемых фирмой Perkin Elmer (HIV-1 positive control DNA, cat. No. N808-0016), и панели аналогичных контролей из NIBSC, предложенной в качестве международного стандарта.

Для генотестирования вируса гепатита В в сыворотке и плазме крови разработан набор реагентов для проведения однократной ПЦР в присутствии 100 молекул внутреннего стандарта (а также вариант двукратной ПЦР в присутствии 10 молекул внутреннего стандарта). Для подготовки проб применяется однопробирочный метод или самый простой метод щелочного лизиса [Lucotte G. et al., 1994]. Чувствительность тест-системы на вирус гепатита В была проконтролирована по международному стандарту - first WHO international Standard for HBV DNA NAT assays, code 97/746 с концентрацией вируса 6.25xl06 GE/ml, любезно предоставленному В.Герлихом (W.Gerlich, Institute of Medical Virology, Justus Liebig University Giessen, Giessen, Germany. Аналогичным образом тест-системы для однократной и двукратной ПЦР были разработаны и для цитомегаловируса.

Для генотестирования бледной трепонемы разработана высокочувствительная тест-система, основанная на РНК-ПЦР на многокопийной 16S рРНК. Благодаря присутствию этой РНК в количестве не менее 1000 копий на клетку даже единичные микроорганизмы дают интенсивный ПЦР-сигнал, «заглушающий» сигнал внутреннего стандарта (пример на рис.1), вводимого в количестве 100 молекул на пробу. Для калибровки внутреннего стандарта тест-системы на бледную трепонемы и оценки чувствительности тест-системы на стадии ДНК-ПЦР в качестве эталона был использован препарат суммарной ДНК Treponema pallidum, 1 мкл которого соответствовал 1000 микроорганизмам, любезно предоставленный А.Центурион-Лара (Arturo Centurion-Lara, Department of Medicine and Neurology, University of Washington, Seattle, USA). Инструкция по генотестированию бледной трепонемы с помощью разработанной тест-системы утверждена Комитетом здравоохранения правительства Москвы.

Для генотестирования наиболее клинически-значимых урогенигальных и других инфекций (вирусов герпеса типа 1 и 2, хламидии, микоплазмы, уреаллезмы, трихомонады. гонореи, гарденереллы, токсоплазмы, холерного вибриона) разработана группа тест-систем с внутренними стандартами, применяемых по простым однотипным методикам с «горячим стартом» или без него.

Тест-системы для генотипирования.

Определение индивидуальных особенностей генома человека (генотипирование), в первую очередь - анализ точечных нуклеотидных замен, представляет не меньший интерес, чем диагностика инфекций. Это позволяет решать вопросы совместимости при трансплантациях и трансфузиях, а также выявлять предрасположенность к заболеваниям.

Одним из распространенных и доступных методом идентификации нуклеотидных замен в ДНК является аллель-специфичная ПЦР. Она основана на

том, что продукт ГИДР образуется лишь в случае точной комплементарности нуклеотидных звеньев на растущем З'-конце праймера.

С использованием разработанного двухрастворного формата тест-систем ПНР (см.выше) была сконструирована система для генотипирования тромбоцитов по 5 антигенам на основе описанной в литературе [Cavanagh G. et al, 1997] системы праймеров. Был реализован обычный вариант аллель-специфичной ПЦР, когда для идентификации нуклеотидного звена в точке f возможной замены ставятся две- ПЦР: одна определяет норму, другая -

мутацию, что означает проведение 10 ПЦР для одной пробы и потому довольно трудоемко. При создании тест-системы для идентификации S- и Z-аллелей гена альфа-1-антитрипсина, проведенном в рамках совместной работы с НИИ медицины труда РАМН, была опробована аллель-специфичная ПЦР с идентификацией замен в двух точках в одной смеси ПЦР.

Повышенный риск развития лёгочной эмфиземы, хронического обструктивного бронхита и цирроза печени, как показывают наблюдения, имеют лица, гомозиготные по дефицитным S- и Z-аллелям ингибитора протеиназ альфа-1 -антитрипсина, схема которого приведена на рис.6.

Расположение праймеров atsc (общий) atsn (норма) atzn (норма) atze (общий)

t stem (мутация) atzm (мутация)

I—--=4-*=-!

730 867 1100 1337

звенья по HSA1ATZ, АС .102819

мутация S мутация Z

Afer_>T«7 Gi,io_;'A,ioo

Glu284 -> Val264 Glu342 -> Lys342

Рис.6. Схема расположения в гене альфа-1-антитрипсина нуклеотидных замен, приводящих к S и Z мутациям, и праймеров (обозначены стрелками) для их выявления методом аллель-специфичной ПЦР. Длины амплификонов, образующихся при определении звена в точке 867 (S) и в точке 1100 (Z) заданы различными (146 и 245 н.п. соответственно), что позволяет проводить ПЦР с праймерами на обе мутации в одной пробирке.

На схеме указаны нуклеотидные замены и соответствующие им аминокислотные замены в белке-ингибиторе протеаз, а также отмечено расположение подобранных праймеров аллель-специфичной ПЦР. Для анализа

каждой пробы пробу готовятся всего 2 смеси ПЦР того же двухрастворного формата с амплификационными с реагентами аМ (анализ мутаций в точках Б и X) и аШ (анализ нормы в тех же точках).

АЖ АМ 12 ОЗ М N М N МЫ МЫ

• j "

Рис.7. Электрофореграмма продуктов ПЦР при определении S и 2 мутаций у четырех пациентов АЖ, AM, 12 и ОЗ. Во всех случаях дорожка M соответствует анализу мутации (ПЦР с праймерами atsc, afem.atzc.afzm, HGH1, HGH2), дорожка N - анализу нормы (ПЦР с праймерами aise, atsn,atzc,aizn, HGH1, HGH2). Цифры справа указывают длину продуктов в н.п. Сигнал маркерного гена виден как фрагмент длиной 429 н.п., сигналы по точке Z - 245 н.п., сигналы по точке S -146 н.п.

Пример анализа для четырех пациентов приведен на рис.7. Результат для АЖ отвечает норме в обеих точках (это встречается наиболее часто), для AM и 12 заметна гетерозиготность по Z, а для 03 наблюдается гомозиготность по Z. В последнем случае полное отсутствие в организме нормального гена очень сильно повышает риск заболеваний, и для пациента 03 диагноз основной -хронический бронхит, выраженная эмфизема лёгких, дыхательная недостаточность II степени по смешанному типу, фиброз печени; диагноз сопутствующий - гипертоническая болезнь, хронический холецистит.

Как это всегда делается при аллель-специфичной ПЦР, в каждую смесь вводится еще одна пара праймеров на маркерный клеточный ген - в данном случае это пара HGH1 и HGH2 на фрагмент гена гормона роста. Его сигнал подтверждает эффективность ПЦР и наличие ДНК в каждой из проб. Однако при комбинации в одной смеси ПЦР на редкую мутацию с ПЦР на распространенную норму в другой точке на геле не окажется «пустых» дорожек и эффективность ПЦР будет проконтролирована в каждой пробе без введения

дополнительной пары праймеров на маркерный ген. Это расширит возможности применения аллель-специфичной ПЦР.

Разработанная тест-система в настоящее время применяется при обследованиях в НИИ медицины труда РАМН.

Амплификоны как основной источник ложноположительных результатов

ПЦР-анализов.

Как было обнаружено по ходу работы, при использовании однократной ПЦР любые сильные контаминации можно устранить сразу и полностью путем перехода на другую пару праймеров, смещенных по цепи ДНК-мишени как показано на рис.8. Возможен и еще один аналогичный способ ухода от контаминаций - это переход на анализ с ПЦР-амплификацией совсем другого фрагмента генома возбудителя с соответствующими праймерами и внутренним стандартом любого типа. Последнее было опробовано для хламидии и уреаплазмы.

1 -2-*

ПЦР с 1 и 3

ПРОДУКТ ПЦР (А)

|пцРс2и4

ПРОДУКТА НЕТ

3 4

ПЦР с 2 и 4

ПРОДУКТ ПЦР (Б)

Рис.8. Схема ухода от контаминаций переходом на другую систему праймеров. Если в ходе работы с праймерами 1 и 3 произошла контаминация образующимся при этом амплификоном А, то при переходе на смещенную по цепи ДНК-мишени пару праймеров 2 и 4 ложноположительные сигналы исчезают (так как праймер 4 не имеет места посадки на амплификоне А), но при ПЦР на ДНК-мишени эта пара праймеров дает нормальный сигнал -образуется амппификон Б. Со временем контаминация амплификоном А исчезнет, и тогда при возникновении новой контаминации амплификоном Б можно от нее уйти аналогичным образом, перейдя на пару праймеров 1 и 3.

Эффективность рассмотренного способа устранения контаминаций имеет не только практическое значение, но и прямо указывает на амплификоны как на основной, если не единственный, источник ложноположительных результгов ПЦР. Об этом же свидетельствует и опыт ведущих лабораторий мира, использующих уже упоминавшуюся выше ПЦР в реальном времени. В этом случае регистрация продуктов ПЦР проводится по их флуоресценции без вскрытия пробирки, и потому амплификоны не попадают в окружающую среду и в смесь до ПЦР. Таким образом ПЦР в реальном времени, наряду с другими возможностями, позволяет преодолеть главное ограничение генодиагностических анализов - устранить ложноположительные результаты.

Предварительные данные о реальном распространения патогенов в

донорской крови

Первый российский опыт ручного и полуавтоматического минипул-

генотестирования донорской крови на ВИЧ и вирусы гепатитов В и С.

Опыт ручного генотестирования нами был получен на остатках плазмы, заключенной в трубочках одноразовой системы аппарата Геманетик, удаляемой в отходы после проведения плазмафереза. По такой ручной технологии в минипулах по 10 донаций были исследованы 8849 донаций серонегативной плазмы, полученной плазмаферезом в период с сентября 1998 года по апрель 1999 года. При этом было выявлено лишь две донации (0,023% от общего числа), содержащие ДНК вируса гепатита В. Еще 3 положительных сигнала на ДНК вируса гепатита В и все 7 сигналов РНК вируса гепатита С, первоначально полученные при анализе минипулов, далее не подтвердились. Сигналы ВИЧ при этом исследовании не наблюдались. Значительное число ложно-положительных минипулов плазм донорской крови до недавнего времени имели и более оснащенные лаборатории на Западе [Roth et al, 1999].

Далее мы получили возможность готовить минипулы из 8 и 12 донаций плазмы автоматически на сэмплере фирмы «Гамильтон» с использованием разработанной Е.Г.Черкасовым компьютерной программы формирования пулов.

Этот автомат работает с сериями проб в формате иммунологического 96-луночного планшета. Такое минипул-генотестирование плазмы на основе полуавтоматической технологии нами проводилось в отношении первичных доноров Станции переливания крови ФУ «Медбиоэкстрем», которые еще не прошли ИФА-скринирование, т.е. не были отведены доноры с ИФА-положительными результатами. В таблице 1 приведены суммированные данные этих исследований.

Таблица 1.

ПЦР-анализы первичных доноров на СПК ФУ «Медбиоэкстрем» с 25.10.2000 г. по 18.06.2001 г.

Вирус Положительные сигналы в пулах Из них не подтвердилось при идентификации Выявлено ПЦР-положительных донаций Из них в составе:

ИФА+ ИФА-

HBV 4 2 3* (0,085%) 3 0

HCV 26 14 12 (0,34%) 10 2

HIV 2 2 0 (0%) 0 0

Общее число вовлеченных в ПЦР донаций -3514. Анализы проводились в составе пулов по 8 донаций..

* Аликвоты двух HB V-инфицированных донаций попали в один минипул-восъмерку.

Исследования аналогичного уровня, проведенные на РНК HCV в Банке Крови Сан-Паулу (Бразилия) показали в общем аналогичные результаты: среди 4231 первичных донаций 42 (1,1%) оказались ИФА-положительными, из них подтвердились в иммуноблоте 22 (0,52%) и из последних 19 (0,45%) оказались ПЦР-положительными [Levi J.E. et al., 1998]. Среди 2578 донаций в Гане ПЦР-положигельными на гепатит С оказались 0,12% [Allain J. et al., 2000]. Эти цифры одного порядка, с московским регионом - 0,34% на СПК ФУ «Медбиоэкстрем».

Генотестирование серопозитивных донаций крови по антителам к HCV и по HbsAg HBV позволяет отделить группу людей не содержащих РНК и ДНК этих вирусов. По нашим данным, из 124 Hbs-Ag -положительных доноров лишь 49 (39,5%) содержали в крови ДНК вируса гепатита В, а из 47 доноров, серопозитивных по гепатиту С, 27 (57,5%) содержали в крови РНК этого вируса.

Это соответствует усредненным литературным данным. Такие исследования прежде всего важны для ИФА-серопозигавных доноров на HCV и HBV, так как имеют отношение к возможности их реабилитации.

Генотестирование РНК и ДНК ВИЧ, проводимое в ходе данной работы, показало отсутствие этого вируса как в плазме всех обследованных доноров, так и в плазме и лейкоцитах 20 образцов крови, для которых ЙФА-анализ дал положительный или сомнительный результат. Проведенное нами для сравнения генотестирование нескольких проб пациентов Республиканского центра СПИД Белоруссии (в 1998 году) показало, что вирусную РНК содержат 3 из 7 образцов сыворотки крови, а провирусную ДНК - 4 из 6 препаратов лейкоцитарной ДНК. Периодическое отсутствие ВИЧ в крови инфицированного человека (особенно вирионов в плазме), конечно, может быть объяснено способностью этого вируса к неопределенно длительному существованию в организме в скрытой форме в виде встроенного в геном провируса, причем не только в лейкоцитах крови, но и в других клетках (например, в лимфоузлах или костном мозге). Эти факты с учетом мирового опыта генотестирования на ВИЧ, дают основание поднять вопрос о том, что все ли люди, зарегистрированные в центрах СПИД как ВИЧ-инфицированные, содержат этот вирус в крови, и о возможности снятия для многих из них этого диагноза-приговора [Федоров H.A., 2000].

Рассмотренная ситуация с ВИЧ аналогична таковой для вирусов гепатитов, которые размножаются в клетках печени и не всегда попадают в кровь, и многих других инфекций. Однако при отсутствии в крови вирусов гепатита и ВИЧ можно считать невероятным их появление на слизистых или в каких-либо выделениях организма, а значит, и их передачу другому человеку при любом контакте. Результаты генодиагностики ни в коей мере не исключают необходимость иммунологических и других анализов, а также регулярного медицинского наблюдения, но на их основе вполне может быть проведена социальная реабилитация многих пациентов как инфекционно безопасных.

Обследование вирусоносительства среди больных гемофилией, проведенное нами в мае-июне 1999 года для 64 пациентов Детского

гематологического центра Измайловской детской больницы г.Москвы, регулярно получающих белковые препараты из донорской крови. В этой группе выявлено 10 носителей НВУ (15,6%), 21 носитель НСУ (32,8%), 8 пациентов (12,5%) имели оба вируса одновременно; носителей ВИЧ в этой группе выявлено не было. Величины такого же высокого уровня были получены и при аналогичных обследованиях в США [ЗДае .Г.М. а1., 2001] и в Санкт-Петербурге [Гарезина О.В. и др., 2002]. Полученные результаты указывают на существенный уровень риска передачи вирусов через препараты крови.

Определение бледной трепонемы в крови с использованием описанной выше высокочувствительной тест-системы на основе РНК-ПЦР, показало отсутствие этого возбудителя как в сыворотке крови 500 серопозигивных на сифилис доноров из разных учреждений, так и для более чем 20 обследованных пациентов с разными формами сифилиса, в том числе и при сильных сигналах для соскобов и ликвора. Аналогичные данные были получены и в США [ОПоп 8Х. е! а1, 2002]. В пресс-релизе Американской ассоциации банков крови [ААВВ, 2000] рассматривается даже возможность полной отмены для доноров серологического теста на сифилис ввиду быстрой потери инфекционности бледной трепонемы в условиях хранения компонентов крови и отсутствия доказанных случаев трансфузионного сифилиса за 30 лет наблюдения. Разумеется, следует с осторожностью относиться к вопросу о возможном наличии (хотя бы кратковременном) трепонемы в крови больных сифилисом. Более того, серьезность проблемы требует сохранения отведения от донорства и всех СТС-положительных лиц независимо от других показателей. Однако сохранившаяся только в России и СНГ практика уничтожения производственных пулов и полученных из них препаратов, в составе сырья которых оказались донации от серопозигивных на сифилис доноров, выглядит необоснованной.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В течение последних шести лет практически по личной инициативе Н.А.Федорова и Ю.С.Суханова на СПК КЗ г.Москвы, а затем на СПК ФУ «Медбиоэкстрем», вошедшей с февраля 2003 г. в состав Центра крови Минздрава России, было организовано впервые в России генотестирование донорской крови на ВИЧ и вирусы гепатитов В и С параллельно с обычным иммуноферментным тестированием. Такой дополнительный контроль в странах Европейского союза уже не только признан эффективным, но даже с июля 1999 года стал обязательным.

Согласно сложившейся мировой практике, надежность результатов генодиагностических анализов обеспечивается с помощью международных стандартов или их аналогов, представляющих собой контрольные образцы с известным количеством возбудителя. При условии обеспечения необходимой чувствительности анализа, определяемой по таким стандартам, могут использоваться любые методы и тест-системы, причем чаще всего используются системы собственного изготовления - "т-Ьоше" («доморощенные»). Для разработки и выпуска таких стандартов, предназначенных в первую очередь для службы крови, при Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) создана Международная рабочая группа по стандартизации генамплификационных технологий (БоОАТ). Таким образом генодиагностические лаборатории, а также производители тест-систем, находятся под постоянным контролем и самоконтролем качества их работы.

В работе суммированы итоги первого российского опыта регулярного генотестирования донорской крови, осуществленного на двух указанных СПК. Тот набор решений и разработок, который для этого потребовался, вполне может рассматриваться как вариант комплексной технологии генотестирования крови и других клинических материалов. Для создания такой технологии было необходимо найти осуществимые в имеющихся условиях решения следующих основных проблем генодиагностики:

1. Выявление ложноотрицательных и ложноположительных результатов;

2. Оптимизация метода выделения ДНК и РНК из крови и других биоматериалов;

3. Оптимизация компоновки реагентов для ПЦР-аналгаа, обеспечивающей их сохранность и удобство постановки анализа.

В качестве способа решения первой проблемы - предотвращения ложноотрицательных, а также и ложноположительных результатов, впервые в России и среди первых работ в мире было применено введение в ПЦР внутреннего стандарта конкурентного типа. При отсутствии в пробе генома возбудителя на гель-элекгрофореграмме продуктов ПЦР виден сигнал внутреннего стандарта, введенного в ПЦР в известном количестве - в наших тест-системах это 100 молекул на пробу для однократной ПЦР (это соответствует нижнему пределу, определяемому при обычной ПЦР с гель-электрофоретической детекцией продуктов) или 10 молекул для двукратной (это минимум гарантированного внесения анализируемого материала, ограниченный статистическими ошибками отбора). Сигнал внутреннего стандарта в отрицательных пробах указывает на эффективность и достаточную чувствительность ПЦР. При наличии двух сигналов по отношению их интенсивностей можно рассчитать содержание генома возбудителя в пробе. Подобные расчеты могут быть проведены в настоящее время при обработке изображения, полученного при видеокомпьютерной регистрации гель-электрофореграммы. Это есть не что иное, как количественная ПЦР, но в диагностике измеренное отношение сигналов возбудителя и стандарта дает возможность отличать положительные сигналы от слабых ложноположительных. При небольших конгаминациях эта величина, определенная в отрицательном контроле, является как бы аналогом cut-off в ИФА-анализе и определяет минимальный значимый уровень сигнала

Таким образом, внутренний стандарт частично снимает самую серьезную проблему ПЦР-анализа - преодоления ложноположительных результатов из-за контаминаций. Вместе с тем в данной работе был предложен эффективный

способ устранения даже сильных

переходе на

систему смещенных праймеров. Эффективность этого способа значима не только для практической работы, но и как наглядное доказательство того, что главным, если не единственным, источником ложноположительных результатов при генодиагностике являются заносы размноженных фрагментов ДНК в исходную смесь через внешнюю среду. Отсюда логично следует и перспективный способ решения этой самой тяжелой проблемы генодиагностики - это переход к регистрации продуктов ПНР в закрытой пробирке по их флуоресценции. Такая регистрация как раз и применяется при ПЦР в реальном времени. Применение этой технологии следующего поколения ПЦР-анализов в Институте трансфузионной медицины и иммуногематологии Красного Креста Германии и других ведущих лабораториях мира позволило резко сократить количество неподтвержденных положительных результатов при генотестировании патогенов в донорской крови. Регистрация продуктов ПЦР без вскрытия пробирки, причем не обязательно в реальном времени, снижает известные весьма высокие требования к помещениям и организации работы в ПЦР-лаборатории. Такое серьезное упрощение, в сочетании с устранением трудоемкого электрофореза, сделает генодиагностические анализы намного более доступными.

При решении второй основной проблемы генодиагностики - выборе и адаптации метода подготовки проб - основным критерием было обеспечение сохранности в первую очередь нестабильной РНК, особенно при неидеальных условиях работы. Как показали исследования и опыт работы, для плазмы крови таким требованиям наиболее отвечает однопробирочный метод выделения суммы ДНК и РНК. Данный метод запатентован (патент РФ № 2134871, приоритет 01.12.98), а необходимый для него набор реагентов зарегистрирован в Минздраве РФ (ТУ 9398-423-47621885-00). Метод включает стадию лизиса биоматериала, высаживание суммы РНК и ДНК изопропанолом и промывку осадка ацетоном, обеспечивающим его быстрое высушивание. Растворение сухого осадка может быть совмещено с обратной транскрипцией РНК. Это не просто упрощение методики, а переход к технологии, когда РНК в процессе

выделения защищена от действия рибонуклеаз, так как находится либо в высокоионной среде, либо в органической среде или в сухом осадке. Было показано, что выделение РНК наиболее актуальных для безопасности крови вирусов - гепатита С и ВИЧ - проходит при этом методе практически без потерь.

Выбор рассмотренного однопробирочного метода в качестве основного для регулярного генотестирования донорской крови базировался, конечно, на его сопоставлении с другими методами подготовки проб для ПЦР. Проведение такого сопоставления в данной работе позволило, в свою очередь, предложить удобные методы обработки широкого круга клинических проб. Для обычных в современной практической генодиагностике проб типа мазков и соскобов был разработан весьма удобный метод термического лизиса с сорбентом, связывающим ингибиторы ПЦР. Реагент для такой обработки проб нами производится и успешно применяется при очень распространенных анализах урогенитальных инфекций. С другой стороны, на основе широко распространенного и эффективного метода, основанного на связывании ДНК и РНК с силикагелем, была разработана доступная методика обработки любых сложных клинических проб. Привлекательность методов на основе сорбции-элюции нуклеиновых кислот и, возможно, тенденция к распространению этих методов в будущем, связана с возможностью автоматизации процесса в проточной системе. Другим важным преимуществом принципа сорбции-элюции ДНК и РНК является удаление окрашенных и светорассеивающих примесей. Последнее может иметь особое значение при уже упомянутой флуоресцентной регистрации, когда герметически закрытая реакционная смесь ПЦР становится элементом оптической системы.

Компоновка реагентов для ПЦР определяется возможностью их хранения, удобством исполнения анализа и исключением нежелательных взаимодействий до начала ПЦР. Во всех разработанных тест системах применяется двухрастворный вариант компоновки реагентов, который запатентован (патент РФ № 2164532, приоритет 11.07.00). Такими реагентами являются двукратный

буфер с ферментом Тад-полимеразой (2хБФ), общий для всех ПЦР-анализов, и амплификационный реагент, специфичный для каждого возбудителя, содержащий дезоксинуклеозид-трифосфаты, праймеры, внутренний стандарт, лидирующий краситель для электрофоретического анализа продуктов ПЦР и, возможно, другие компоненты. Реакционная смесь формируется путем смешения 2хБФ, амплификационного реагента и препарата суммарной ДНК из биопробы. Аналогичный двухрастворный формат разработан и для обратной транскрипции, которая в зависимости от задачи может проводиться как отдельно от ПЦР для одной или нескольких РНК, так и в той же пробирке перед ПЦР по программе, задаваемой термоциклером. Преимуществами предлагаемой схемы формирования реакционной смеси являются (1) минимально возможное число реагентов (два), один из которых, кроме того, является универсальным для всех анализов; (2) возможность повышения специфичности ПЦР с помощью «горячего старта», при котором расплавляемая перегородка как раз должна разделять два образующих реакционную смесь реагента; (3) стабильность реагентов для ПЦР и обратной транскрипции, для которых впервые была обнаружена возможность длительного хранения при комнатной температуре.

Выполнению данной работы во многом способствовало активное участие одного из консультантов - профессора Н.А.Федорова - в работе уже упомянутой группы ЗовАТ при ВОЗ. Показательным является тот факт, что и в нашу лабораторию, как и другим участникам БоОАТ, было направлено предложение участия в определении новых целей и задач этой группы при ВОЗ (документы 1 и 2 в разделе 2.7.5 литобзора). В ответ на это обращение были выработаны и отправлены в ЗовАТ предложения вариантов новых целей этой организации:

1. Разработка простой технологии количественного выделения нуклеиновых кислот из различных биоматериалов для генотестирования, используя магнитные частицы или полимерные пробирки с иммобилизованными зондами для захвата патогенов.

2. Исследование концентрации НГУ, ПСУ, НВУ и других патогенов в цельной крови и плазмы доноров и в образцах их крови, хранимых при разных температурах, в том числе и комнатной.

3. Разработка набора реагентов для детекции бактериальной контаминации крови и ее препаратов на основе универсальных праймеров на 168 рРНК.

Важным результатом сотрудничества с вовАТ и с ведущими зарубежными генодиагностическими лабораториями была возможность получить международные стандарты и эталонные образцы для таких важных гемотрансмиссивных патогенов, как ВИЧ, вирус гепатита В и бледная трепонема. Поэтому эффективность и чувствительность сконструированных в данной работе тест-систем на указанные возбудители была объективно подтверждена по этим стандартам, как это принято в мировой генодиагностической практике. Тест-система для ПЦР-обнаружения вируса гепатита С была зарегистрирована в Комитете по новой технике Минздрава РФ (ГенТест-НС, ТУ 9398-424-47621885-00) вместе с набором реагентов для уже упомянутого основного метода обработки проб крови для ПЦР -однопробирочного метода выделения ДНК и РНК (ГенТест-РНК/ДНК-экстракция, ТУ 9398-423-47621885-00), чему предшествовал обязательный для такой регистрации полный комплекс официальных испытаний. Таким образом, надежность работы сконструированных в данной работе тест-систем на важнейшие гемотрансмиссивные патогены - ВИЧ, вирусы гепатитов В и С, бледную трепонему - может считаться объективно подтвержденной. Следствием этого является и подтверждение правильности общего подхода и принципов конструирования генодиагностических тест-систем, выработанных в данной работе.

Основным результатом данной диссертационной работы является первый российский опыт регулярного минипул-ПЦР-генотестирования донорской крови, а также данные о реальном распространении патогенов в крови доноров и других групп лиц, требующих повышенного внимания к их инфекционной безопасности. Обследование более 12000 донаций от кадровых и первичных

доноров московского региона показало, что распространенность среди них вирусов гепатитов В и С соответствует среднемировой для аналогичного контингента. В то же время отмечена аномально высокая инфицированность вирусами гепатитов В и С больных гемофилией, регулярно получающих белковые препараты донорской крови. Это указывает на возможность и актуальность передачи вирусов через белковые препараты из крови, что общепризнано во всем мире. С другой стороны, мы подтвердили данные о том, что не все серопозитивные по гепатитам лица имеют вирус в крови, что распространенность ВИЧ среди доноров крайне мала и что даже не все пациенты центров СПИД имеют этот вирус в крови. Конечно, отсутствие вирусов в крови не исключает их наличие в организме, но вполне обоснованным представляется утверждение, что ПЦР-негативные лица не могут передать вирус во внешнюю среду или другим людям и потому должны считаться инфекционно-безопасными. Такая реабилитирующая роль

генамплификационных анализов, которая не менее значима, чем обнаружение инфекций, была впервые обоснована в данной диссертационной работе. Несомненно, что на основании генодиагностических обследований могут и должны быть сняты необоснованные ограничения со многих лиц, состоящих на учете как инфицированные ВИЧ, вирусами гепатитов или другими патогенами.

Аналогичным образом в работе обосновывается и возможность применения генотестирования для реабилитации компонентов крови и белковых препаратов как инфекционно безопасных. Совершенно неоправданной представляется сохранившаяся только в России и странах СНГ практика обязательного уничтожения производственных пулов плазмы или полученных из них белковых препаратов, если в составе сырья оказалась хотя бы одна донация от серопозигивного на сифилис донора. С помощью сконструированной в данной работе высокочувствительной тест-системы было строго доказано отсутствие бледной трепонемы в крови более 500 таких доноров и даже в крови группы больных сифилисом. Конечно, эти результаты не являются основанием отмены отвода от донорства серопозитивных на сифилис лиц, но при информации о

случайном попадании их донаций в производственные пулы плазмы следует проводить генотестирование этих пулов. Очень вероятный в таком обследовании отрицательный результат при использовании разработанной высокочувствительной тест-системы будет строго доказанным, и это может быть достаточным основанием для допуска этих пулов в переработку. Другим важным результатом являются данные о редкости и невысоком уровне инфицирования крови здоровых доноров условно-патогенным цигомегаловирусом. В этом случае на основе данных генотестирования может быть увеличен резерв ЦМВ-отрицательной крови и ее компонентов.

Впервые показанная возможность обнаружения в одной смеси аллель-специфичной ПЦР нуклеотидных замен в двух и более точках на примере сконструированной оригинальной тест-система для обнаружения 8- и Ъ-мутаций гена альфа-1 -антитрипсина относится к иной, чем генодиагностика патогенов, области применения генамплификационных анализов -генотипированию, которое также представляет большой интерес для трансфузиологии. На основании разработанных общих принципов конструирования генамплификационных тест-систем была создана система для типирования тромбоцитов по 5 антигенам, определяющих эффекты несовместимости при трансфузиях тромбоконцентратов. С последними связана и еще одна проблема - высокий риск их бактериальной контаминации. Предложенный в данной работе способ обнаружения в крови и ее компонентах бактериальной контаминации на основе общей для всех бактерий нуклеотидной последовательности является перспективным подходом к обеспечению бактериальной безопасности донорской крови - проблеме, которой в последние годы в мировой трансфузиологии уделяется особое внимание.

ВЫВОДЫ

обычном агарозном геле, позволяющий уже сегодня внедрить генотестирование в службе крови России.

2. Впервые в России и среди первых работ в мире было установлено, что при генамплификационном обнаружении патогенов внутренние стандарты конкурентного типа позволяют выявить как ложноотрипательные, так и ложноположительные результаты.

3. Предложен способ устранения ложноположительных результатов в условиях высокого фона конгаминаций путем перехода на систему «смещенных» праймеров. Одновременно подтверждено, что контаминации продуктами ПЦР являются основными источниками ложноположительных результатов.

4. Запатентован (патенты РФ № 2134871, приоритет 01.12. 98, № 2164532, приоритет 11.07.00) универсальный однопробирочный метод выделения суммы РНК и ДНК из плазмы крови и других биоматериалов типа жидкости или суспензии.

5. Запатентован (патент РФ № 2164532, приоритет 11.07.00) двухрастворный вариант компоновки реагентов для ПЦР, обеспечивающий длительную сохранность этих реагентов.

6. Разработаны перечисленные ниже тест-системы для выявления патогенов: наборы реагентов для обработки биопроб однопробирочным методом, термическим лизисом с сорбентом и методом сорбции на силикагеле; наборы реагентов для обнаружения вирусов гепатитов В и С, ВИЧ в форме РНК и ДНК, цитомегаловируса и герпеса, бледной трепонемы и комплект тест-систем для обнаружения урогенитальных и других бактериальных инфекций. Две из перечисленных тест-систем зарегистрированы в Минздраве РФ.

7. Разработана тест-система для генотипирования Б^-аллелей альфа-1-антитрипсина. На примере последней впервые показана возможность детектирования в одной ПЦР-смеси нуклеотидных замен в двух точках при одновременной контрольной ПЦР на маркерном фрагменте.

8. Осуществлен первый российский опыт ручного и полуавтоматического минипул-ПЦР-тестирования плазмы донорской крови на ВИЧ и вирусы гепатитов В и С. Среди 8849 серонегативных доноров СПК КЗ г.Москвы обнаружено 2 носителя вируса гепатита В (0,023%), а среди 3514 первичных доноров СПК ФУ «Медбиоэкстрем» - 3 носителя вируса гепатита В (0,085%) и 12 носителей вируса гепатита С (0,34%). Результаты соответствуют среднемировым для аналогичных небольших банков крови.

9. Предложен и запатентован способ контроля бактериальной контаминации крови генамплификационным методом на общей для всех бактерий нуклеотидной последовательности.

10. На основе собственного опыта генотестирования и литературных данных донорской крови показано, что:

- дополнительное к иммуноферментному анализу генотестирование донорской крови актуально и необходимо, о чем свидетельствуют неоднократные доказанные случаи трансфузионной передачи вирусов и бактерий;

достоверность результатов генамплификационных тест-систем собственного изготовления ("т-Ьоше") сравнима с коммерческими и обеспечивается необходимым в любом случае регулярным контролем всего процесса по международным стандартам или их аналогам.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕДАЦИИ

трепонема), а также для других патогенов, и быть доступными для всех лабораторий. Результаты генотестирования панелей таких стандартов следует считать главным критерием для лицензирования тест-систем и лабораторий.

2. Международный опыт и результаты данной работы позволяют рекомендовать (в том числе и в официальном порядке) реабилитацию компонентов и продуктов крови, а также потенциально-инфицированных лиц как инфекционно безопасных, если их генотестирование с внутренним контролем дало отрицательный результат. Тот же результат для производственных пулов, полученный при введении в анализ материала из большого объема (10-100 мл), следует считать основанием для их допуска в переработку даже в случае попадания в них скомпрометированных донаций. При этом необходимо пока сохранить индивидуальное отведение от донорства по результатам иммунотестирования.

3. Приступить к параллельному генотестированию донорской крови, ее компонентов и в первую очередь - концентратов тромбоцитов на бактериальную контаминацию посредством ПЦР на общей для всех бактерий нуклеотвдной последовательности.

4. Рекомендовать генамплификационное обследование всех лиц, состоящих на учете как инфицированные ВИЧ, вирусами гепатитов или другими патогенами, и при строго доказанных отрицательных результатах признать их инфекционно-безопасными со снятием всех необоснованных ограничений.

Список работ, опубликованных по теме диссертация

1. Yolov A.A. and Shabarova Z.A. Constructing DNA by polymerase recombination. -Nucleic Acids Research 1990, v.18, No.13, p.3983-3987.

2. Yolov A.A., Kozlova A. V. and Karamov E.V. Quantitative PCR as a way to the gene-level monitoring of retroviral infection. 2-nd International Conference "AIDS, Cancer and Human Retroviruses" St.-Petersburg, 1993. Program and Abstracts, p.18.

3. Yolov A.A. Kozlova A.V. and Karamov E.V. Gene-level monitoring of HIV infection by PCR with two internal standards. Tenth International Conference on AIDS. Yokohama, 7-12 August 1994. Abstract book, PA0193.

4. Суханов Ю.С., Федоров H.A., Артемьев М.А., Ёлов А.А.И Селиванов Е.А. Пути полной вирусной безопасности донорской крови и ее компонентов. -Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии. Тезисы докладов 3-го всероссийского съезда гематологов и трансфузиологов. Санкт-Петербург, 26-28 ноября 1996 г., стр.71.

5. Yolov A.A., Kozlova A.V., Yaioslavtseva N.G., Mednikov B.M. and Karamov E.V. Quantitative PCR as a way for the monitoring of retroviral infection on the gene level. - Virus genes 1995, v.10, No.l, p.45-51.

6. Ёлов A.A. и Козлова A.B.. Диагностика и мониторинг ВИЧ-инфекции на генетическом уровне. - Успехи совр. биол. 1996, т.116, вып.1, с.48-59.

7. Ёлов A.A., Федоров H.A., Виноградов A.B., Добросельский В.В. и Суханов Ю.С. Внедрение генотестирования крови доноров наборами второго поколения с применением видеокомпьютерной регистрации. - Актуальные вопросы трансфузионной и клинической медицины. Материалы научной конференции 16-17 апреля 1997 г., г.Киров, с. 16.

8. Ёлов A.A., Федоров H.A. и Суханов Ю.С.. Критерии для отбора систем генотестирования, используемых при контроле вирусной безопасности крови и ее продуктов.

- Вестник службы крови России 1998, № 1, с. 18-20.

9. Федоров H.A., Ёлов A.A., Куличенко А.Н., Опочинский Э.Ф. и Касьян И.А. Применение сухих ПЦР-тест-систем для обнаружения возбудителей опасных инфекционных болезней. - Материалы научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России. Саратов, 1997, т.2, стр.227-228.

10. Ёлов. A.A., Федоров H.A. и Ю.С.Суханов. ПЦР-тест-системы второго и третьего поколений для контроля вирусной безопасности крови. - Материалы 2-й Всероссийской конференции «Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний», Москва, 20-22 января 1998 г., с.84.

11. Федоров H.A., Ёлов A.A., Куличенко А.Н., Опочинский Э.Ф., Оншценко Г.Г. и Суханов Ю.С. Стандартные сухие ПЦР-тест-системы на особо опасные и другие инфекции..

- Материалы 2-й Всероссийской конференции «Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний», Москва, 20-22 января 1998 г., с. 110.

12. Yu.S.Sukhanov, A. A. Yolov and N.A.Fedorov. Single sample detection of HIV, CMV and bacteria in the donors' blood by PCR. - Vox Sanguinis 1998, v.74 suppl. 1, abstract 1093.

13. НЛ.Федоров, А.Н.Канев, А.И.Полунин, А.А.Ёлов, В.М.Русанов, Е.А.Селиванов, Ю.С.Суханов) Стандартизация ИФА- и ПЦР-тестирования крови и карантинизация плазмы на путях повышения вирусной безопасности продукции службы крови. - Трансфузиология и служба крови. Тезисы конференции 17-19 ноября 1998 г., Москва. Стр.7.

14. Н.А.Федоров, А.А.Ёлов и Ю.С.Суханов. ПЦР-диагностнка цитомегаловирусной инфекции: распространение ЦМВ-носительства среди доноров СПК КЗ г.Москвы. -Трансфузиология и служба крови. Тезисы конференции 17-19 ноября 1998 г., Москва. Стр. 17.

15. Федоров Н.А., Ёлов А.А., Суханов Ю.С.. Способ подготовки биологического материала для ПЦР-генамплификационной диагностики. Патент РФ № 2134871, приоритет 01.12.1998 г.

16. Yu.S.Sukhanov, N.A.Fedorov, A.A.yolov, V.M.Rusanov, V.E.Alekseev. Minipool NAT assay of blood for HTV, HCV, HBV and HCMV by using single-tube RNA/DNA extraction at the Moscow blood bank. - VI regional European congress of the international society of blood transfusion. Jerusalem, Israel, May 9-13,1999. Abstracts, p.l 13.

17. H.A,Федоров, А.А.Ёлов, В.А.Максимов, Ю.С.Суханов и С.Х.Уразов. Разработка и апробация оригинальной технологии минипул-ПЦР-генотестирования плазмы производственных пулов СПК КЗ г.Москвы на РНК ВИЧ, HCV и ДНК HBV. -Производственная трансфузиология на рубеже XXI века. Тезисы докладов научно-практической конференции. Москва, 16-18 ноября 1999 года. С5, с.49.

18. Н.А.Федоров, А.А.Ёлов, Ю.С.Суханов. Универсальный однопробирочный метод подготовки проб крови, компонентов и препаратов плазмы для ПЦР-анализа. -Производственная трансфузиология на рубеже XXI века. Тезисы докладов научно-практической конференции. Москва, 16-18 ноября 1999 года. С4, с.49.

19. Е.Н.Федоров, А.А.Ёлов,, В.В.Вдовин, НЛ.Блохина, Н.Л.Резаева Н.А.Федоров, Ю.С.Суханов. Частота инфицированное™ вирусами гепатитов В и С и ВИЧ больных гемофилией. - Вестник службы крови России, 1999, №4, с.35.

■ 20. Е.Н.Федоров, Н.П.Блохина, ААЁлов, Н.А.Федоров, Ю.С.Суханов. Длительность бессимптомного носительства вирусов гепатитов В и С среди доноров крови и лиц группы риска. Вестник службы крови России, 2000, №1, с.7-8.

21. Fedorov N.A., Yolov А.А.,. Sukhanov Yu.S. Prevention of PCR inhibition in RNA/DNA pellets from plasma minipool after single tube extraction. - SoGAT XI: Draft minutes of the 11th meeting of 12 May 2000, p.8.

22. НА.Федоров, А.А.Ёлов Ю.С.Суханов, Е.Г.Черкасов, И.Б.Сущенко. Стандартизация методов генной амплификации и минипул-ПЦР-тестирование донорской крови, ее компонентов и препаратов плазмы на ВИЧ, вирусы гепатитов В, С и ЦМВ. Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии. Материалы научно-практической конференции, Санкт-Петербург, 6-8 июня 2000 г., с.237-238.

23. НА.Федоров, А.А.Ёлов О.К.Лосева, И.И.Петухова, С.Г.Александрова, О.В.Доля, Г.АДмитриев, Ю.С.Суханов. ПЦР-детекция Treponema pallidum: калибровка

чувствительности, способ подготовки исследуемого материала и опыт клинического применения. - Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии. Материалы научно-практической конференции, Санкт-Петербург, 6-8 июня 2000 г., с.248.

24. Petuhova I., Fedorov N., Loseva О., Yolov A, Dmitriev G. The stabolity of Treponema pallidum 16S rRNA is a base for the wide usage of high sensitive RT PCR in diagnostic, therapeutic and pathogenic investigation of syphilis. - Int. Journal of STD & AIDS 2001, v. 12, suppl.2, p. 144.

25. N.A. Fedorov, A.A.Yolov, Yu.S. Sukhanov). The stability of PCR reagents at room temperature. - SoGAT XII: Draft minutes of the 12th meeting of 17 November 2000, p. 7.

26. Давыдова H.A., Шарова И.Н., Ёлов A.A., Федоров H.A., Куличенко А.Н. Выявление Vibrio Cholerae (ctxA+) в биологическом материале и объектах внешней среды с помощью полимеразной цепной реакции. Генная диагностика особо опасных инфекций. Материалы 1-й Всероссийской научно-практической конференции (21-22 ноября 2000 г., г.Саратов), стр.2931.

27. Шарова И.Н., Давыдова H.A., Тихвинский М.С., Воробьев A.A., Ёлов A.A., Федоров H.A., Самойлова JI.B., Куличенко A.B. Обнаружение бруцелл в молочных продуктах методом ПЦР. Генная диагностика особо опасных инфекций. Материалы 1-й Всероссийской научно-практической конференции (21-22 ноября 2000 г., г.Саратов), стр.42-44.

28. Федоров H.A., Ёлов A.A., Черкасов Е.Г., Суханов Ю.С.. Повышение вирусной безопасности донорской крови на основе генотестирования. - Всероссийская конференция «Методические и практические аспекты фракционирования донорской крови в лечебной практике и донорстве», г.Москва, ОАО БФА, 28-29 ноября 2000 г.

29. Федоров Н.А„ Ёлов A.A., и Суханов Ю.С. Способы и наборы реагентов для генамплификационной диагностики методами ПЦР и РНК-ПЦР. Патент РФ № 2164532, приоритет 11 июля 2000 г.

30. Федоров НА,. Ёлов A.A., и Суханов Ю.С. Универсальные технологии предподготовки биоматериалов, выделения ДНК+РНК (НК) однопробирочным методом, последующего их ПЦР- и РТ-ПЦР-анализа на вирусы, бактерии и ПЦР-генотестирования тромбоцитов и лейкоцитов. - Актуальные проблемы трансфузионной медицины. Материалы научно-практической конференции, г.Киров, 4-5 октября 2000 г., с.13.

31. H.A.Федоров, А.А.Ёлов, O.K.Лосева, И.И.Петухова, С.Г.Александрова, О.В.Доля, Г.АДмитриев и Ю.С.Суханов. ПЦР-детекция Treponema pallidum: калибровка чувствительности, способ подготовки исследуемого материала и опыт клинического применения. - Генодиагностика в современной медицине. Сборник тезисов докладов 3-й Всероссийской научно-практической конференции. Москва, 25-27 января 2000 г., с. 110.

32. Б.М.Медников, М.Н.Мельникова, Н.В.Гуменюк, Л.АЛекановская, У.Ю.Малинникова, А.А.Ёлов и А.В.Виноградов. Количественная амплификация ДНК как метод мониторинга инфекции и оценки эффективности лекарственных препаратов (на примере гепатита «В» и препарата «гамма-плант». - Генодиагностика в современной медицине. Сборник тезисов докладов 3-й Всероссийской научно-практической конференции. Москва, 25-27 января 2000 г., с.213-214.

33. Н.А.Федоров, А.А.Ёлов и Ю.С.Суханов. Универсальный однопробирочный метод подготовки проб крови, ее компонентов и других биомаиериалов для ПЦР-анализа. -Генодиагностика в современной медицине. Сборник тезисов докладов 3-й Всероссийской научно-практической конференции. Москва, 25-27 января 2000 г., с.258-259.

34. Н.А.Федоров, А.А.Ёлов Ю.С.Суханов, В.Е.Алексеев. Стандартизация методов генной амплификации и минипул-ПЦР-генотестирование донорской крови, ее компонентов и препаратов плазмы на ВИЧ, вирусы гепатитов В, С и ЦМВ. - Генодиагностика в современной медицине. Сборник тезисов докладов 3-й Всероссийской научно-практической конференции. Москва, 25-27 января 2000 г., с.259.

35. E.H.Федоров, Н.ПБлохина, В.В.Вдовин, А.А.Ёлов и НА.Федоров. Результаты ПЦР-и ИФА- тестирования на вирус гепатита С крови доноров и лиц из группы риска.

I енодиагностика в современной медицине. Сборник тезисов докладов 3-й Всероссийской научно-практической конференции. Москва, 25-27 января 2000 г., с.347.

36. Скворцов С.В., Воликов Ю.К., Маркин Ю.В., Федоров H.A., Ёлов A.A., Казаков С.П., Акимкин В.Г. Использование иммунологических и молекулярно-биологических показателей за контролем лечения ВИЧ-инфекции методом эндогенно-волновой терапии. - Военно-медицинские аспекты ВИЧ-инфекции. Тезисы докладов научно-практической конференции под ред. проф. Змушко Е.И. Санкт-Петербург, 2000, с.59-60.

37. Н.А.Федоров, E.H.Федоров, А.А.Ёлов, Е.Г.Черкасов, Н.П.Блохина, Ю.С.Суханов, И.Б.Сущенко. Новые данные об отсутствии прогрессирования инфицирования вирусом гепатита С у здоровых молодых людей. - Российские медицинские вести 2001, т. VI, №2, с.16-18.

38. Черкасов Е.Г., Федоров H.A., Ёлов A.A., Суханов Ю.С. и Сущенко И.Б. Первый российский опыт ручного и полуавтоматического минипул-НАТ-тестирования донорской крови на HIV, HCV, HBV. - Вестник службы крови России 2001, № 4, с.4-9.

39. Федоров E.H., Ёлов А.А, Петухова И.И. и Федоров H.A. Минипул-РТ-ПЦР-детекция 16S рРНК Treponema pallidum в биоматериалах. - Вестник службы крови России 2001, № 4, с.9-10.

40. Черкасов Е.Г., Ёлов А.А., Сущенко И.Б., Федоров Н.А. Разработка технологии параллельного ИФА- и минипул-КАТ-тестироваиия донорской крови на ВИЧ, вирусы гепатитов В и С. - Материалы VIII съезда всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва, 26-28 марта 2002 г. С.364-365.

41. Федоров Е.Н., Петухова И.И., Ёлов А.А., Федоров Н.А. РТ-ПЦР-тестирование 16S рРНК Treponema pallidum в серопозитивной на сифилис крови. - Материалы VIII съезда всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва, 26-28 марта 2002 г. С.355-356.

42. Ёлов А.А., Федоров Н.А., Черкасов Е.Г., Федоров Е.Н., Суханов Ю.С. и Сущенко И.Б. Универсальные технологии для ПЦР-генотестирования крови и других биоматериалов на бактерии и вирусы. - Современные проблемы гематологии и трансфузиологии. Сборник трудов научно-практической конференции, Киров, 2002 г., с.43-44.

43. Федоров Н.А., Ёлов А.А., Черкасов Е.Г., Суханов Ю.С. и Сущенко И.Б. NAT-генотестирование крови на основе международных стандартов ВОЗ - гарантия вирусной безопасности реципиента. - Современные проблемы гематологии и трансфузиологии. Сборник трудов научно-практической конференции, Киров, 2002 г., с.47-48.

44. Федоров Е.Н., Петухова И.И., Лосева O.K., Черкасов Е.Г. Ёлов А.А. и Федоров Н.А. РТ-ПЦР-тестирование 16S рРНК Treponema pallidum в серопозитивной на сифилис крови. Современные проблемы гематологии и трансфузиологии. Сборник трудов научно-практической конференции, Киров, 2002 г., с.49-50.

45. Черкасов Е.Г., Ёлов А.А., Сущенко И.Б. и Федоров Н.А. Разработка технологии параллельного ИФА- и минипул^АТ-тесгирования донорской крови на ВИЧ, вирусы гепатитов В и С. - Современные проблемы гематологии и трансфузиологии. Сборник трудов научно-практической конференции, Киров, 2002 г., с.51-52.

46. Н.А.Федоров, А.А.Ёлов, Ю.С.Суханов, О.НХришаева. Универсальные технологии для ПЦР-генотестирования биоматериалов (от взятия пробы до оценки результатов) -Информационный бюллетень ЦНИИ ТММТ АМТН - ЗАО «Вектор-Бест». Москва, Новосибирск-2001 г., 15 стр.

47. Федоров Е.Н., Петухова И.И., Лосева O.K., Черкасов Е.Г., Ёлов А.А. и Федоров Н.А. РТ-ПЦР-тестирование 16S рРНК Treponema pallidum в серопозитивной на сифилис крови. Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, 2002, т.6, № 1, с.128.

48. Черкасов Е.Г., Ёлов А.А., Сущенко И.Б. и Федоров Н.А. Разработка технологии параллельного ИФА- и минипул-ЫАТ-тестирования донорской крови на ВИЧ, вирусы гепатитов В и С. . - Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, 2002, т.6, № 1, с. 129

49. Суханов Ю.С., Ёлов A.A., Черкасов ЕГ., Сущенко И.Б, Федоров НА. Международные NAT-стандарты для контроля лимита детекции патогенов в компонентах и препаратах донорской крови. - Генодиагностика инфекционных заболеваний. Сборник тезисов 4-й Всероссийской научно-практической конференции. Москва, 2002 г., с. 166.

50. Черкасов Е.Г., Ёлов A.A., Суханов Ю.С., Сущенко И.Б., Федоров H.A. Частота NAT-детекции ДНК HBV, РНК HCV в плазме крови серонегативных, серопозитивных и первичных (ИФА-неисследованных) доноров. - Генодиагностика инфекционных заболеваний. Сборник тезисов 4-й Всероссийской научно-практической конференции. Москва, 2002 г., с. 167.

51. Гришаева О.Н., Липатникова C.B., Гришаев M.IL, Тимофеев Д.И., Пивень Л.А., Федоров H.A., Ёлов A.A. Универсальный способ получения материала для генодиагностического исследования влагалищной микрофлоры женщин. - Генодиагностика инфекционных заболеваний. Сборник тезисов 4-й Всероссийской научно-практической конференции. Москва, 2002 г., с.20-22.

52. H.A.Федоров, А.А.Ёлов, Е.Г.Черкасов, И.Б.Сущенко. Состояние проблемы NAT-минипул-тестирования донорской крови на HIV, HCV и HBV. - В кн.: NAT-минипул-гекоскршшровнаие крови на основе международных стандартов ВОЗ - гарантия вирусной и бактериальной безопасности реципиентов. Вектор-Бест, Москва - Новосибирск - Франкфурт-на-Майне, 2003.

53. H.A. Федоров, А.А.Ёлов, Е.Г.Черкасов, М.П.Гришаев, Е.Б.Жибурт. NAT-тестирование вирусов в крови человека на основе международных стандартов ВОЗ. - В кн.: NAT-минипул-геноскринировнаие крови на основе международных стандартов ВОЗ -гарантия вирусной и бактериальной безопасности реципиентов. Вектор-Бест, Москва -Новосибирск - Франкфурт-на-Майне, 2003.

54. Н.А.Федоров, А.А.Ёлов, Е.Г.Черкасов, Ю.С.Суханов, И.Б.Сущенко. Первый российский опыт ручного и полуавтоматического минипул-NAT-тестирования донорской кров на HTV, HCV и HBV. - В кн.: NAT-минипул-геноскринировнаие крови на основе международных стандартов ВОЗ - гарантия вирусной и бактериальной безопасности реципиентов. Вектор-Бест, Москва - Новосибирск - Франкфурт-на-Майне, 2003.

55. Черкасов Е.Г., Круглов А.Н., Ёлов A.A., Федоров H.A., Федоров Е.Н, Суханов Ю.С. Способ определения бактериальной контаминации крови. Заявка на патент № 2002123004/13 (024441), приоритет 28.08.2002, положительное решение ФИПС о выдаче патента 25 февраля 2003 г.

Подписано в печать 28.03.03. Заказ №38. Тираж 110 экз. ООО "Фирма Печатный двор"

?2(С>

- 9 2 1 о

Оглавление диссертации Ёлов, Андрей Александрович :: 2003 :: Москва

1. Введение и общая характеристика работы.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цель и задачи работы.

1.3. Научная новизна работы.

1.4. Практическая ценность работы.

1.5. Основные положения, выносимые на защиту.

2. ГЕНАМПЛИФИКАЦИОННАЯ ДИАГНОСТИКА: СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ, ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ (литературный обзор).

2.1. Проблема вирусной безопасности донорской крови и ее компонентов.

2.2. Генамплификационные методы анализа, их возможности и основные проблемы.

2.2.1. Полимеразные цепные реакции и другие генамплификационные методы.

2.2.2. Способы преодоления ложноположительных результатов ПЦР.

2.2.3. Анализ индивидуальных особенностей генома - генотипирование

2.3. Методы детекции продуктов генамплификации.

2.3.1. Метод гель-электрофореза.

2.3.2. ПЦР с «горячим стартом».

2.3.3. Гибридизационная детекция в растворе.

2.3.3.1. Измерение гибридизационной защиты хемилюминесцентных меток зонда- НРА (hybridization protection assay).

2.3.3.2. Экзонуклеазная активность Taq-полимеразы (система TaiqMan).

2.3.3.3. Молекулярные бакены и праймеры-скорпионы.

2.3.3.4. Система двух зондов с передачей энергии.

2.3.3.5. Зажигаемые зонды (light-up probes).

2.3.4. Гибридизационная детекция на твердой фазе.

2.4. ПЦР в реальном времени.

2.5. ПЦР с внутренним стандартом и ее применение для количественных и диагностических анализов.

2.5.1. Внутренние стандарты конкурентного типа.

2.5.2. Внутренние стандарты неконкурентного типа. Значение внутренних стандартов при ПЦР в реальном времени.

2.6. Обработка крови и другого клинического материала для генамплификационных анализов.

2.6.1. Методы обработки .сыворотки и плазмы крови для получения суммы ДНК и РНК для ПЦР-анализа.

2.6.2. Упрощенные методы получения препаратов ДНК для ПЦР-анализа

2.7. Международные стандарты для генамплификационных анализов. Деятельность БоОАТ.

2.7.1. ИАТ-стандарты на РНК ВИЧ.

2.7.2. ИАТ-стандарт для ДНК НВУ.

2.7.3. ЫАТ-стандарт для РНК вируса гепатита С.

2.7.4. ЫАТ-стандарт для ДНК парвовируса В19.

2.7.5. Новые цели БоСАТ. Перспективы развития международных КАТ-стандартов.

2.8. Краткие итоги мирового опыта генотестирования донорской крови и ее компонентов.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4. ГЕНАМПЛИФИКАЦИОННОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ ДОНОРСКОЙ КРОВИ НА ПАТОГЕНЫ: ТЕХНОЛОГИИ, СИСТЕМЫ И СТАНДАРТЫ результаты и их обсуждение).

4.1. Основные задачи работы.

4.2. Обработка проб крови, ее компонентов и белковых препаратов для генотестирования вирусных и бактериальных ДНК и РНК.

4.2.1. Выделение ДНК из лейкоцитов и других клеток с использованием протеиназы К и термического лизиса с сорбентом.

4.2.2. Методы, применяемые для выделения вирусных ДНК и РНК из сыворотки и плазмы крови: метод фенольной депротеинизации и метод сорбции на силикагеле.

4.2.3. Однопробирочный метод для одновременного выделения суммы

РНК и ДНК.

4.2.4. Получение суммы ДНК и кДНК биопробы без изоляции РНК.

4.3. Применение внутренних стандартов как способ преодоления ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

4.3.1. Конструирование внутренних стандартов методом направленного соединения фрагментов ДНК. Первый опыт количественной ПЦР.

4.3.2. О возможном применении простых методов для конструирования внутренних стандартов конкурентного типа.

4.3.3. Внутренние стандарты для практического генотестирования гемотрансмиссивных вирусов и других патогенов.

4.2.4. Калибровка внутренних стандартов.

4.4. Оптимизация компоновки реагентов для ПЦР-анализа, обеспечивающей их сохранность и удобство постановки анализа.

4.4.1. Двухрастворная компоновка реагентов для ПЦР и обратной транскрипции.

4.4.2. «Сухие» тест-системы для ПЦР и другие варианты компоновки тест-систем для пользователей.

4.5. Характеристика разработанных и применяемых наборов генодиагностических реагентов.

4.5.1. Наборы реагентов для обработки биопроб.

4.5.2. Наборы реагентов для обнаружения возбудителей инфекций.

4.5.2.1. Тест-системы для обнаружения вируса гепатита В.

4.5.2.2. Тест-система (набор реагентов) для определения вируса гепатита С (НСУ) в плазме крови путем двукратной РНК-ПЦР.

4.5.2.3. Тест-системы для определения ДНК и РНК ВИЧ.

4.5.2.4. Тест-системы (набор реагентов) для определения ДНК цитомегаловируса методом двукратной ПЦР.

4.5.2.5. Тест-система (набор реагентов) для определения бледной трепонемы методом РНК-ПЦР.

4.5.2.6. Комплект тест-систем для определения возбудителей урогенитальных и других инфекций методом ПЦР.

4.5.4. Тест-системы для генотипирования.

4.6. Проба флуоресцентной детекции продуктов ПЦР. Детекция продуктов ПЦР в закрытой системе как наиболее перспективный способ преодоления ложноположительных результатов.

4.6.1. Конструирование зондов для флуориметической детекции продуктов ПЦР.

4.6.2. Зонд для флуоресцентной детекции ДНК гепатита В с использованием экзонуклеазной активности Taq-пoлимepaзы (система типа ТацМап).

4.6.3. Пара зондов для детекции ДНК вируса гепатита В с внутренним стандартом. ЭАВСУЬ как эффективный нефлуоресцирующий тушитель

4.6.4. Варианты зонда - молекулярного бакена и праймера-скорпиона.

4.6.5. Амплификоны как основной источник ложноположительных результатов ПЦР-анализов. О простом приеме ухода от контаминаций и перспективности детекции продуктов ПЦР в закрытой системе.

4.7. О результатах применения разработанных методов и тест-систем при генотестировании крови доноров и пациентов.

4.7.1. Первый российский опыт ручного и полуавтоматического минипул-ИАТ-тестирования донорской крови на ВИЧ и вирусы гепатитов В и С

4.7.2. Генотестирование серопозитивных донаций крови.

О возможной реабилитации доноров и пациентов на основе результатов генодиагностики.

4.7.3. О вирусоносительстве среди больных гемофилией.

4.7.4. Оценка распространения носительства цитомегаловируса среди кадровых доноров СПК КЗ г.Москвы.

4.7.5. Проблема бактериальной безопасности донорской крови.

4.7.5.1. Об отсутствии бледной трепонемы в крови серопозитивных

4.7.5.2. Обнаружение бактерий в крови методом ПЦР на универсальной последовательность гена рибосомальной РНК.

Заключение диссертационного исследования на тему "Генамплификационное тестирование донорской крови на патогены: технологии, системы и стандарты"

6. выводы

1. Разработан комплекс технологий, основанный на универсальном методе выделения вирусных ДНК и РНК из плазмы крови, полимеразной цепной реакции на основе оригинальных компоновок реагентов и анализа продуктов в обычном агарозном геле, позволяющий уже сегодня внедрить генотестирование в службе крови России.

2. Впервые в России и среди первых работ в мире было установлено, что при генамплификационном обнаружении патогенов внутренние стандарты конкурентного типа позволяют выявить как ложноотрицательные, так и ложноположительные результаты.

3. Предложен способ устранения ложноположительных результатов в условиях высокого фона контаминаций путем перехода на систему «смещенных» праймеров. Одновременно подтверждено, что контаминации продуктами ПЦР являются основными источниками ложноположительных результатов.

7. Разработана тест-система для генотипирования 8,2-аллелей альфа-1-антитрипсина. На примере последней впервые показана возможность детектирования в одной ПЦР-смеси нуклеотидных замен в двух точках при одновременной контрольной ПЦР на маркерном фрагменте.

9. Предложен способ контроля бактериальной контаминации крови генамплификационным методом на общей для всех бактерий нуклеотидной последовательности.

10. На основе собственного опыта генотестирования и литературных данных донорской крови показано, что:

- достоверность результатов генамплификационных тест-систем собственного изготовления ("¡п-Ьоизе") сравнима с коммерческими и обеспечивается необходимым в любом случае регулярным контролем всего процесса по международным стандартам или их аналогам.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕДАЦИИ

1. С учетом мирового опыта применения международных стандартов и эталонных образцов для объективного контроля и самоконтроля эффективности и чувствительности генамлификационных анализов следует рекомендовать разработку, производство и официальное утверждение в России национальных аналогов таких стандартов, прокалиброванных по международным. Такие стандарты должны быть созданы в первую очередь для важнейших гемотрансмиссивных патогенов (ВИЧ, вирусы гепатитов В и С, бледная трепонема), а также для других патогенов, и быть доступными для всех лабораторий. Результаты генотестирования панелей таких стандартов следует считать главным критерием для лицензирования тест-систем и лабораторий.

3. Приступить к параллельному ЫАТ-тестированию донорской крови, ее компонентов и в первую очередь - концентратов тромбоцитов на бактериальную контаминацию посредством ПЦР на общей для всех бактерий нуклеотидной последовательности.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2003 года, Ёлов, Андрей Александрович

1.П., Шувалова Т.М, Афонин Н.И. Ещё раз к вопросу о спорных и нерешенных проблемах трансфузионного сифилиса. - Вестник службы крови России 1999, № 2, с.21-24.

2. Гарезина О.В., Гончар В.А., Кайтанджан Е.И. Трансфузионные вирусные гепатиты у больных гемофилиями. . Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, 2002, т.6, № 1, с. 125.

3. Лысов Ю.П., Флорентьев В.Л., Хорлин А.А., Храпко К.Р., Шик В.В. и Мирзабеков А.Д. Доклады АН СССР^1988, т.303, с. 1508-1511.

4. Митрохин С.Д. Микробиологическая диагностика инфекций кровяного русла на современном этапе развития клинической микробиологии. Инфекции и антимикробная терапия 2002, т.4, № 1, с.27-29

5. Федоров Е.Н., Петухова И.И., Суханов Ю.С., Ёлов А.А., Федоров Н.А. ПЦР-детекция ДНК и РНК Treponema pallidum в крови серопозитивных доноров. — Вестник службы крови России 2001, № 3, с.42-46.

6. Федоров Н.А. Все ли люди, зарегистрированные в центрах СПИД как ВИЧ-инфицированные, содержат этот вирус в крови? Вестник службы крови России, 2000, №4, с.9-11.

7. Шибата Д.К. В кн.: Молекулярная клиническая диагностика. Методы. Москва, «Мир», 1999, с.422.

8. AABB: Statement of the American Association of Blood Banks before the blood products advisory committee. September 15, 2000. http://www.aabb.org/pressroom/pressreleases/prbpacsyph091400.htm

9. Allain J., Reddy R., Candotti D., Sarcodie F., Nel T. Genomic detection of HIV & HCV by TMA in high prevalence areas of Sub Saharian Africa. // Transfusion, 2000, v.40 Supplement, S26-030E, p. 9S.

10. Alvarez M., Oyonarte S., Rodriguez P.M. and Hernandez J.M. Estimated risk of transfusion-transmittted viral infections in Spain. Transfusion 2002, v.42, p.994-998.

11. AuBuchon J.P., Birkmeyer J.D., Busch M.R. Safety of the blood supply in the United States: opportunities and controversies. // Ann. Intern. Med. 1997, v. 127, p. 904-909.

12. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M., Jansen C.H., P.M.E.Wertheim van Dillen, J. Van der Nordaa. Rapid and simple method of purification of nucleic acids. J. Clinical Microbiol. 1990, v.28, No.3, p.495-503.

13. Bootman J.S., Kitchin P.A.: An international collaborative study tu assess set of reference reagents for HIV-1 PCR. Journal of Virological Methods 1992, v.37, p.32-42

14. Burg J.L., Grover C.M., Pouletty P. And Boothroyd J.C. Direct and sensitive detection of a pathogenic protozoan, Toxoplasma gondii, by a polymerase chain reaction. J. of Clin. Microbiol. 1989, v.27, No.8, p. 1787-1792.

15. Bustin S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology 2000, v.25, p.169-193.

16. Cardoso M.D.S. SoGAT XI. Draft minutes of the 11th meeting of 12 May 2000, p.3.

17. Cavanagh G., Dunn A., Chapman C.E. and Metcalfe P. HPA genotyping by PCR sequence specific priming (PCR-SSP): a streamline method for rapidroutine investigations. -Transfusionmedicine 1997,7:41-45

18. Celi F., Zenilman M.E. and Shuldner A.R. A rapid and versatile method to synthesize internal standards for competitive PCR. — Nucleic Acids Research 1993, v.21, No.4, p. 1047.

19. Centurion-Lara A., Castro C., Shaffer J.M., van Voorhis W.C., Marra C.M. and Lukehart S.A. Detection of Treponema pallidum by a sensitive reverse transcriptase PCR. -Journal of Clinical Microbiology 1997, v.35, No.6, p.1348-1352.

20. Chomczynski P. and Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate phenol - chloroform extraction. - Analyt. Biochem. 1987, v.162, p.156-159.

21. Cone R.W., Hobson A.S. and Huang M.W. Coamplified positive control detects inhibition of the polymerase chain reaction in diagnostic laboratory. J. Clin. Microbiol. 1992, v. 30, No. 12, p.3185-3189.

22. Davis C., Holmes H. and Heath A. 4th statistical analyses of HIV-1 RNA working reagents PWS-1 (99/634), PWS-2 (99/636) and PWS-3 (99/766). NIBSC, January 1999 to Summer 2001.

23. Deggerdal A. and Larsen F. Rapid isolation of PCR-Ready DNA from blood, bone marrow and cultured cells, based on paramagnetic beads. BioTechniques 1997, v.22, No.3, p.554-557.

24. Ehrlich H.A., ed. PCR technoplogy. Stockton Press, New York, 1989.

25. Drosten C., Weber M., Seifried E and Roth W.K. Evaluation of a new PCR assay with competitive internal control sequence for blood donor screening Transfusion 2000, v.40, p.718-724.

26. Drosten C., Seifried E. and Roth W.K. TaqMan 5'-nuclease human immunodefifciency virus type 1 PCR assay with phage-packaged competitive internal control for high-throughput blood donor screening. J. of Clin. Microbiol. 2001, v.39, No. 12, p.4302-4308.

27. Elfath M., Luka J., Tahhan R., and Morriarty R. Detection of CMV by polymerase chain reaction (PCR) in seropositive blood donors. Transfusions 1996, v.36 suppl., p.34S, abstract SI34

28. French' D.J., Archard C.L., Brown T., McDowell D.G. HyBeacon™ probes: a new tool for DNA sequence detection and allele discrimination Molecular and cellular probes 2001, v.15, No.6, pp. 363-374

29. Gajardo R. SoGAT XI. Draft minutes of the 11th meeting of 12 May 2000, p.2.

30. Gilliland G., Perrin S., Blanchard K. and Bunn F.H. Analysis of cytokine mRNA and DNA: detection and quantification by the polymerase chain reaction. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1990, v.87, p.2725-2729.

31. Gluck, D., Maurer, C., Kubanek, B., Petersen N. Seroconversion of HIV, HCV,and HBV in blood donors in 1996-risk of virus transmission by blood products in Germany. Infusionsther Transfusionsmed, 1998, v. 25, p. 82-84.

32. Grabnitz F., Halperin E., Resnick L. Und Bieger W.P. Sensitiver und spezifischer Nachweis von Treponema pallidum mit der Polymerase-Kettenreaktion. Klinisches Labor 1992, v.38, p.537-543.

33. Greenlee D.J., Fan H., Lawless K., Harrison C.R. and Gulley M.I. Quantitation of CMV by real-time PCR in transfusable RBC units. Transfusion 2002, v.42, p.403-408.

34. Greisen K., Loeffelholz M., Purohit A. and Leong D. PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. J. of Clin. Microbiol. 1994, v.32, No.2, p.335-351.

35. Guatelli J.C., Whitefield M.A., Kwoh D.Y., Barringen D.J., Richman D.D. and Gingeras T.R. Isothermal self-sustained in vitro replication of nucleic acids like retroviral infection. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1990, v.87, p. 1874-1878.

36. Gubbe K.: PCR a new tool for improved plasma safety. — Symposium organized by "Baxter- Hyland- Immuno", Vienna, Ausrtia, September, 1998.

37. Haugland R.P. Handbook of fluorescent probes and research chemicals. Seventh edition. Molecular Probes, Inc., 1999.

38. Higuchi R., Dollinger G., Walsh P.S. and Griffith R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology 1992, v. 10, p.413-417.

39. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., and Watson, R. Kinetic PCR: Real time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology 1993, v.l 1, p.1026-1030.

40. Hitzler W. E., Runkel S.: Routine HCV PCR screening of blood donations to identify early HCV infection in blood donors lacking antibodies to HCV. Transfusion 2001, v.41, p.333-337

41. Hnatyszyn H. J., Podack E.R., Young A.K., Seivright R., Spruill G., Kraus G. The use of real-time PCR and fluorogenic probes for rapid and accurate genotyping of newborn mice Molecular and Cellular Probes 2001, v.15, No.3, p. 169-17555

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Генамплификационное тестирование донорской крови на патогены: технологии, системы и стандарты

Автореферат диссертации по медицине на тему Генамплификационное тестирование донорской крови на патогены: технологии, системы и стандарты

Оглавление диссертации Ёлов, Андрей Александрович :: 2003 :: Москва

Заключение диссертационного исследования на тему "Генамплификационное тестирование донорской крови на патогены: технологии, системы и стандарты"

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2003 года, Ёлов, Андрей Александрович

Похожие научные работы

Каталог диссертаций