Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Мультиплексные системы в обеспечении безопасности гемотрансфузий

На правах рукописи

Кузнецов Олег Евгеньевич

МУЛЬТИПЛЕКСНЫЕ СИСТЕМЫ В ОБЕСПЕЧЕНИИ БЕЗОПАСНОСТИ ГЕМОТРАНСФУЗИЙ

14.01.21 - гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

О 5 СЕН 2013

Москва 2013

005532567

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский Научный Центр Хирургии имени академика Б.В. Петровского РАМН»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, Рагимов Алигейдар Агаалекпер оглы

профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, Трахтман Павел Евгеньевич

заведующий отделением

трансфузиологии, заготовки и процессинга стволовых клеток ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России

доктор медицинских наук, Федорова Татьяна Анатольевна

профессор, руководитель отделения

гравитационной хирургии крови

ФГБУ "Научный центр акушерства, гинекологии

и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Минздрава РФ

Ведущая организация:

Государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Научно-исследовательский институт скорой помощи имени Н. В. Склифосовского Департамента здравоохранения г. Москвы»

Защита состоится « 24» сентября 2013 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 208.050.01 при ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России по адресу: 117997, ГСП-7, Москва, ул. Саморы Машела, д.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России по адресу: 117997, ГСП-7, Москва, ул. Саморы Машела, д. 1

Автореферат разослан «_»_2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

В.М. Чернов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Вопросы, связанные с обеспечением безопасности гемотрансфузий, остаются одними из самых важных в клинической и лабораторной практике. Несмотря на применение в Службе крови высокочувствительных и специфичных методов тестирования доноров, в большинстве случаев позволяющих обеспечить безопасность гемотрансфузий, остается риск инфицирования реципиента при использовании компонентов крови от доноров, находящихся в периоде серонегативного окна [Дашкова Н.Г., 2006; Рагимов A.A., 2012; Zou S, Dorsey KA, Notari EP, et al, 2010].

С целью минимизации периода серонегативного окна и оптимизации лабораторного скрининга донорской крови в ряде стран с конца 90-х годов XX столетия используют молекулярные технологии, в частности ПЦР (полимеразная цепная реакция) в реальном времени. Появление мультиплексных систем и международный опыт динамической оценки остаточного риска способствовали внедрению NAT-тестирования (метод амплификации нуклеиновых кислот) не только на гепатит С и ВИЧ- инфекцию, но и на гепатит В [Федоров H.A., Елов A.A., Черкасов Е.Г., 2005; Филатов Ф.П., 2005; Kleinman SH, Lelie N, Busch MP, 2009]. Несмотря на то, что в мире накоплен десятилетний опыт применения NAT- тестирования донорской крови, в России подходы к применению молекулярных тестов только формируются, а целесообразность обязательного NAT-скрининга в Службе крови до сих пор обсуждается. В нашей стране с 2011 года на законодательном уровне регламентировано использование в качестве дополнительных методов молекулярно-биологические исследования и мультиплексный анализ, позволяющий одновременно обнаруживать ДНК или РНК сразу нескольких вирусов (Постановление Правительства РФ №1230 от 31.12.2010). В связи с этим, на современном этапе развития гемобезопасности актуальной задачей является внедрение в практику технологий мультиплексного NAT-тестирования и оценка их эффективности в сертификации крови доноров и реципиентов.

В последние десятилетие стало очевидным, что кроме обязательного тестирования донорской крови на гепатит В, С и ВИЧ инфекцию необходимо выполнять исследования по выявлению патогенов, способных оказать существенное влияние на безопасность гемокомпонентой терапии, особенно для группы иммунокомпрометированных больных. В этой связи важное

значение приобретают гемотрансмиссивные герпесвирусы (CMV, EBV, HHV-6), способные вызывать серьезные осложнения у реципиентов после гемотрансфузий: гепатит, инфекционный мононуклеоз, болезнь «трансплантат против хозяина» и др. [Масчан A.A. , 2001; Hudnall SD, Stanberry LR. 2006]. Вопрос возможности применения мультиплексных тест-систем с целью расширения перечня регламентированных вирусных инфекции для скрининга донорской крови остается малоисследован.

Иммунологическая безопасность гемотрансфузий является

центральной задачей трансфузионной медицины. Наличие в переливаемых компонентах крови донора специфических анти-HLA I и II классов может спровоцировать развитие ТРАЛИ (связанное с трансфузией острое повреждения легких), которое по данным FDA является ведущей причиной посттрансфузионной летальности [Bux J, Sachs UH., 2007]. Последние несколько десятилетий методика выявления антител с помощью лимфоцито-токсического теста была единственной и до настоящего времени широко применяется в клинической лабораторной диагностике. Современные технологии мультиплексного анализа открывают новые возможности в совершенствовании, стандартизации и оптимизации скрининга антилейкоцитарных антител. Исследования в этой области являются перспективными, но в отечественной медицинской литературе публикации крайне немногочисленны.

Таким образом, вопрос необходимости изучения и внедрения высокочувствительных мультиплексных систем для обеспечения безопасности гемотрансфузий и повышения эффективности скрининга донорской крови является актуальным.

Цель работы

Совершенствование и оптимизация лабораторного скрининга донорской крови на основе внедрения современных мультиплексных технологий.

Задачи исследования

1. Изучить возможности выявления гемотрансмиссивных инфекций (HBV, HCV, HIV) у доноров крови и ее компонентов с помощью мультиплексной тест-системы ПЦР в реальном времени в формате минипул тестирования и параллельном ИФА скрининге.

2. Определить критерии пулирования образцов донорской крови при NAT тестировании, применяя «закрытые» и «открытые» системы.

3. Оценить распространённость и вирусную нагрузку EBV, CMV, HHV6 при скрининге доноров крови с использованием мультиплексной технологии ПЦР в реальном времени и методом ИФА.

4. Оценить медико-экономическую эффективность использования отечественных мультиплексных систем и целесообразность внедрения обязательного NAT- скрининга донорской крови.

5. Сравнить частоту выявления и распределение анти-HLA антител с помощью мультиплексного анализа хМАР Luminex и твердофазного иммуноферментного метода среди различных групп доноров.

Научная новизиа

Показана целесообразность внедрения современных молекулярно-биологических методов на базе мультиплексных систем в Службу крови с целью оптимизации алгоритма лабораторного скрининга и повышения безопасности гемотрансфузий.

При тестировании донорской крови методом ПЦР в мультиплексном формате выявлены молекулярные маркеры гемотрансмиссивных инфекций в период серонегативного окна и определена их вирусная нагрузка. Установлено, что применение мультиплексных систем позволяет уменьшить себестоимость исследований, трудозатраты, время выполнения, расширить спектр диагностических маркеров и снизить посттрансфузионный риск передачи вирусных инфекций. Сформулированы критерии определения размера пула.

С помощью мультиплексной тест-системы методом ПЦР в реальном времени у доноров крови определена распространённость и количество ДНК CMV, EBV, HHV-6 в сравнении с серологическими маркерами с целью расширения перечня регламентированных вирусных инфекции при скрининге донорской крови.

Установлено, что для скрининга анти-HLA антител метод проточной цитометрии на основе хМАР Luminex более чувствительный и специфичный по сравнению с твердофазным иммуноферментным. Показана необходимость применения высокочувствительных мультиплексных технологий для антилейкоцитарного скрининга всех групп доноров.

Практическая значимость работы

Показана возможность использования единой мультиплексной технологической платформы для скрининга донорской крови. Установлена высокая эффективность мультиплексных систем в обеспечении вирусной безопасности гемотрансфузий

Данные о распространенности герпесвирусов (CMV,EBV, HHV-6) свидетельствуют о необходимости применения дополнительного скрининга доноров и подборе гемокомпонентов для группы иммуно-компрометированных реципиентов, нуждающихся в регулярном трансфузиологическом пособии. Методы ИФА и ПЦР в диагностике гемотрансмиссивных инфекций взаимно дополняют друг друга.

Применение высокочувствительных мультиплексных технологий на основе Luminex позволяет получать новые данные о распространенности и распределении антилейкоцитарных антител, которые используются для анализа эффективности обследования различных категорий доноров и разработки комплекса мероприятий, направленных на снижение риска развития связанного с трансфузией острого повреждения легких.

Внедрение результатов исследования в практику

Материалы диссертации используются в практической работе клинико-диагностической лаборатории Центра крови Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова, в работе отделения трансфузиологии Российского научного центра хирургии имени академика Б.В. Петровского РАМН, при обучении курсантов кафедры «Клиническая трансфузиология» факультета послевузовского профессионального образования врачей Московского Государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Применение мультиплексного NAT скрининга донорской крови позволяет выявлять инфицированных доноров в период серонегативного «окна». Методы ИФА и ПЦР в диагностике гемотрансмиссивных инфекций взаимно дополняют друг друга.

2. Единая мультиплексная технология для скрининга донорской крови повышает эффективность обеспечения безопасности гемотрансфузий.

3. Высокая распространенность и вирусная нагрузка герпесвирусов среди доноров крови свидетельствует о необходимости проведения дополнительного скрининга с целью повышения вирусной безопасности для иммунокомпроментированных реципиентов.

4. Мультиплексное выявление антилейкоцитарных антител на основе технологии хМАР Luminex превосходит по чувствительности и специфичности метод ИФА. Высокая распространенность анти-HLA антител напрямую коррелирует с количеством беременностей в анамнезе. Антилейкоцитарные антитела выявляются у мужчин без гемотрансфузий и женщин без беременностей и гемотрансфузий в анамнезе.

Апробация работы

Апробация состоялась 12.04.2013 г. на объединенной научной конференции лабораторий иммунологии и регуляторных механизмов в хирургии, клинической биохимии, профилактики и лечения инфекции в хирургии, трансфузиологии с экспедицией Российского научного центра хирургии имени академика Б.В. Петровского РАМН и кафедры клинической трансфузиологии факультета послевузовского профессионального образования врачей Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова. Результаты исследования были доложены на Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2010», а также в виде устных докладов на семинаре «NAT-скрининг как стандарт безопасности в службе крови» (Мадрид, Испания 1821 августа, 2012 года), Всероссийской научно-практической конференции «Инфекции и инфекционная безопасность в гематологии и службе крови» (Санк-Петербург, 22-23 марта 2012 года). Стендовые доклады были представлены: ААВВ Annual Meeting and CTTXPO (Boston, MA,October 6-9, 2012), 32nd International Congress of the International Society of Blood Transfusion in joint cooperation with the 10th Congress of AMMTAC (Cancun, Mexico, July 7-12, 2012), 22nd Regional Congress of the ISBT (Asia, Taipei, Taiwan, November 19-23, 2011 ), AABB Annual Meeting (San Diego, October 22-25,2011).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ.

Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 112 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и практических рекомендаций. Список литературы состоит из 169 наименований, из которых отечественных 19, зарубежных 150. Работа иллюстрирована 16 таблицами, 8 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Скрининг донорской крови и ее компонентов на HCV, HBV,HIV

В период с января 2010 года по апрель 2012 года было обследовано 20486 образцов в параллельном режиме ИФА-методом и ГТГГР в реальном времени. Материалом исследования служили образцы крови доноров (возраст 18-60 лет) отделения трансфузиологии Российского научного центра хирургии им. акад. Б.В. Петровского РАМН и межклинического отделения переливания крови Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова.

Серологические исследования

Для определения HBV методом твердофазного ИФА использовали тест-систему Monolisa HBs Ag Ultra (BIO-RAD, Франция), HBsAg-ИФА -БЕСТ, Вектогеп B-HBs-антиген, BeKToHBcAg - антитела - стрип (Вектор-Бест). Верификацию дважды положительных на гепатит образцов проводили с помощью подтверждающих тестов: «Монолиза АГ HBs Подтверждение» (реакция нейтрализации), HBsAg-подтверждающий-ИФА - БЕСТ (Вектор-Бест); Для внутрилабораторного контроля качества исследования использовали лиофилизированную сыворотку, содержащую HBsAg.

Для определения HCV методом твердофазного ИФА использовали тест-систему Monolisa HCV Ag-Ab Ultra (BIO-RAD, Франция), ВГС AT/AT -ИФА - БЕСТ (Вектор-Бест). Верификацию дважды положительных образцов проводили с помощью подтверждающих тестов: БЕСТ анти-ВГС, Рекомбибест анти-ВГС-подтверждающий тест (Вектор-Бест). Для

внутрилабораторного контроля качества исследования использовали лиофилизированную сыворотку, содержащую антитела к вирусу гепатита С.

Для определения HIV методом твердофазного ИФА использовали тест-систему GeenScreen Ultra HIV Ag-Ab (BIO-RAD, Франция), КомбиБест ВИЧ-1,2 АГ/АТ (Вектор-Бест). Положительные результаты скрининговых исследований подтверждались методом иммуноблота.

Молекулярно-биологические исследования (ПЦР в реальном времени)

Все образцы исследовали методом ПЦР в режиме реального времени в формате минипул тестирования (по 5 образцов в пуле) на амплификаторе ДТ-96 фирмы ("ДНК-технология", Россия). Для мультиплексного анализа использовали тест-систему «АмплиСенс HCV/HBV/HIV-FL» (производства ЦНИИЭ Роспотребнадзора). При выявлении положительного пула образцы, входящие в его состав, исследовали в индивидуальном формате в этой же тест-системе. В качестве подтверждающего теста использовали моноплексные АмплиСенс HBV-FL, АмплиСенс HCV-FL, АмплиСенс РНК-ВИЧ-FL. Для выделения нуклеиновых кислот использовали наборы РИБО-преп, МАГНО-сорб (ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Для количественного определения ДНК HBV использовали тест-систему «АмплиСенс HBV-Монитор-FL», для количественного определения РНК HCV «АмплиСенс HCV-MoHHTop-FL» (ЦНИИЭ Роспотребнадзора).

Экспериментальная часть исследования включана два этапа:

1. Исследование двадцати независимых NAT положительных (ИФА-отрицательных) образцов плазмы в различных форматах пулирования.

2. Исследования трех NAT- положительных образцов (HCV, HBV,HIV) с известной концентрацией, откалиброванных по внешним стандартам качества, в различных разведениях (от 1:2 до 1:14) в повторах.

Исследования проводились в параллельном режиме с помощью «открытых» (позволяет технологически использовать реагентную базу и пластик разных производителей) и «закрытых» систем. Первые, представлены амплификатором ДТ-96 ("ДНК-технология", Россия) и мультиплексной тест-системой «АмплиСенс HCV/HBV/HIV-FL» (ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия). Вторые, представлены автоматизированным комплексом Cobas s201 и мультиплексной скрининговой тест-системой TaqScreen МРХ (Hoffmann-La Roche, Швейцария).

Оценка стоимости лабораторных исследований

Себестоимость лабораторных анализов определяется согласно Приказу МЗ РФ № 380 от 25.12. 1997 г. [Кишкун A.A., Гузовский А.Л., 2007] с использованием следующих расчетов:

S = V+AM + Э + М + П ,где S- себестоимость исследования, V - оплата труда, Ам- амортизационные отчисления на оборудование, Э - эксплуатационные расходы на содержание оборудования и инвентаря, М - материальные затраты (затраты на реактивы, пластик и т.д.), П - прочие расходы.

В себестоимость лабораторных исследований включается также участие в Федеральной системе внешней оценки качества, внедрение в лаборатории новых методов исследования, новой аппаратуры и тест-систем.

Скрипит донорской крови и ее компонентов на CMV, EBV, HHV-6

Было обследовано 300 случайных образцов в параллельном режиме ИФА-методом и ПЦР в реальном времени. Материалом исследования служили образцы крови доноров (возраст 18-60 лет) отделения трансфузиологии РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского РАМН и межклинического отделения переливания крови МГМУ им. И.М. Сеченова.

Серологические исследования

Иммуноферментный анализ проводили с использованием тест систем ВектоВЭБ-NA-IgG, ВектоВЭБ-EA-IgG ВектоВЭБ-VCA-IgM , ВектоВЭБ -VCA - IgG, ВектоЦМВ - IgM, ВектоЦМВ - IgG, Векто HHV-6 IgG (производство ЗАО "Вектор Бест", Новосибирск).

Молекулярно-биологнческие исследования (ПЦР в реальном времени)

Все образцы исследовали методом ПЦР в режиме реального времени на амплификаторе ДТ-96. Для выявления и количественного определения ДНК герпесвирусов в мультиплексном формате использовали тест-систему «АмплиСенс EBV/CMV/ННУб-скрин FL» (ЦНИИЭ Роспотребнадзора), для выделения нуклеиновых кислот РИБО-преп.

Определение аптилейкоцитарных антител

Исследовано 329 образцов сывороток доноров женского пола (возраст 21-49 лет), которые были объединены в три группы: без беременностей и трансфузий в анамнезе, с 1-3 беременностями, 4 и более беременностей, а

также 100 сывороток доноров мужского пола без трансфузий в анамнезе и 67 с трансфузиями (возраст 23-51 лет).

Таблица 1. Характеристика и объем исследований

Параметр Число

обследованных

Пол, возраст

Женский, 21-49 лет 329

Мужской ,23-51 лет 167

Кол-во беременностей в анамнезе

0 86

1-3 197

4 и более 46

Доноры мужского пола

с гемотрансфузиями в анамнезе 67

без гемотрансфузий в анамнезе 100

Тестирование проводили одновременно методом твердофазного иммуноферментного анализа и проточной цитометрии. В исследовании использован новый метод мультиплексного анализа на платформе Luminex. ИФА проводили с использованием тест-системы QUIKSCREEN (GTI, USA) для I класса антител и B-Screen (GTI, USA) для II класса. Для подтверждения положительных результатов использовали тест-системы QUIK ID Class I и QUIK ID_CIass II (GTI, USA). Мультиплексный хМАР анализ проводили с помощью Luminex LifeScreen Deluxe (Gen-Probe, USA) в соответствии с инструкцией производителя. Для подтверждения положительных результатов использовали тест-системы LIFECODES Class I ID и LIFECODES Class II ID (Gen-Probe, USA).

Статистическая обработка результатов для оценки полученных данных проводилась общепринятыми методами с использованием программы Statistica 6.0 (Statsoft, USA). Использовались следующие модули: построение гистограмм, подсчет частот, методы элементарной статистики (для определения основных параметров распределения переменных и проверки их на соответствие нормальному закону распределения); сравнительный анализ (непараметрический U-критерий Манна-Уитни); применялся критерий хи-квадрат для таблиц сопряженности. Результаты считались достоверными при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Выявление маркеров гемотрансмиссивных инфекций при молекулярном и серологическом скрининге

Из 20486 образцов, протестированных методом ИФА, в 2010 году протестировано 9617 и выявлено 27 случаев НВУ (0,28%) , 117 НСУ (1,22%), 14 случаев ВИЧ (0,15%). В 2011 году протестировано 8722 и было выявлено 23 случая НВУ (0,26%, р>0,05) , 87 НСУ (1,00%, р>0,05), но уровень выявления ВИЧ инфекции достоверно снизился и составил 4 случая (0,15%, р<0,05) (Таблица 2). Общий инфекционный брак в 2010 году составил 1,64%, а в 2011 - 1,31%.

Таблица 2.Частота выявляемое™ маркеров гемотрансмиссивных инфекций среди доноров ИФА методом

Год Кол-во обследованных Маркеры

Гепатит В Гепатит С ВИЧ

Абс. % Абс. % Абс. %

2010 9617 27 0,28 117 1,22 14 0,15

2011 8722 23 0,26 87 1,00 4 0,05

01-03.2012 2147 4 0,19 20 0,94 3 0,14

В 2010 с помощью NAT тестирования было выявлено 22 положительных образца ДНК HBV (0,23%), 81 РНК HCV (0,84%), 13 образцов по РНК ВИЧ (0,14%). В 2011 году показатели не отличались по гепатиту В и было выявлено 19 положительных образца ДНК HBV (0,22%, р>0,05) , по гепатиту С - 60 (0,69%, р>0,05) , однако по ВИЧ наблюдалось существенное достоверное снижение положительных образцов до 4 (0,05%, р<0,05) (Таблица 3).

Таблица З.Частота выявляемости маркеров гемотрансмиссивных инфекций среди доноров NAT методом

Год Кол-во Маркеры

обследованных Гепатит В Гепатит С ВИЧ

Абс. % Абс. % Абс. %

2010 9617 22 0,23 81 0,84 13 0,14

2011 8722 19 0,22 60 0,69 4 0,05

01-03.2012 2147 3 0,14 14 0,65 3 0,14

Одним из важных вопросов, возникающих при внедрения NAT тестирования для обследования донорской крови, является возможность замены серологических методов на современные молекулярно-биологические исследования. В таблице 4 показана частота выявления гемотрансмиссивных маркеров двумя методами. В 2010 совпадение результатов двух методов по маркерам HBV составило 81,49%, для HCV 69,23%, для ВИЧ 92,85%. В 2011 года показатели остались на том же уровне.

Таблица 4.Частота NAT положительных маркеров гемотрансмиссивных инфекций среди положительных по ИФА

Год Кол-во обследованных Маркеры

Гепатит В Гепатит С ВИЧ инфекция

2010 9617 22/27=81,49% 81/117=69,23% 13/14= 92,85%

2011 8722 19/23=82,61% 60/87=68,97% 4/4= 100%

01-03.2012 2147 3/4= 75,00% 14/20=70,00% 3/3= 100%

Полученные результаты подтверждаются данными международных исследований [W. К Roth, М.Р. Busch, А. Shuller et al., 2012]. Обобщенные показатели по странам демонстрируют наибольшее совпадение между результатами ВИЧ инфекции, наименьшее по HCV. Полученные данные подтверждают, что NAT тестирование не заменяет серологический метод, даже при использовании высокочувствительных тест-систем.

Из 20486 образцов, протестированных методом ПЦР в реальном времени, в серонегативном периоде было выявлено пять положительных пулов: два пула с гепатитом В и три пула с гепатитом С. При повторном тестировании положительных пулов в индивидуальном формате установлено: в двух образцах - ДНК HBV с вирусной нагрузка 4,8x102 и 1,2x102 копий/мл, в трех образцах - РНК HCV с концентрацией вируса 6,5х10б копий/мл, 1,2х104 копий/мл, 8,9х103 копий/мл. Стоит отметить, что именно гепатит В встречается в наименьшей концентрации и связано это с длительностью удвоения вируса. Частота выявления NAT- положительных образцов в период серонегативного «окна» составила 1:4097. В таблице 5 показан опыт еще трех учреждений Службы крови, использующих отечественные системы для молекулярного скрининга донорской крови.

Таблица 5. Результаты ИАТскрининга донорской крови в серонегативный период с использованием отечественных разработок

Название учреждения Период Кол-во обследованных Кол-во NAT (+) Частота выявления NAT(+) Производитель тест-системы

Собственные данные 01.201004.2012 20486 Пул из 5 3HCV 2HBV 1:4097 ЦНИИЭ Роспотреб-надзора

Саратовская областная станция переливания крови (СПК)* 01.200803.2011 118 420 Пул из 10 4HCV 1:29605 ЦНИИЭ Роспотреб-надзора

ГУМП СК «Сангвис» г. Пятигорск* 03.201003.2011 10 937 Пул из 10 4HCV 1HBV 1:2188 ЦНИИЭ Роспотреб-надзора

Ульяновская областная СПК** 05.201005.2012 51 767 Пул из 7-10 5HCV 3HIV 1 HBV 1:5752 ЗАО "Вектор Бест"

"Данные, получены по результатам анкетирования

**Е.В. Леготина, Л.М. Шишкина/Вектор-Бест" N2(64) 2012

Во всех случаях отечественные тест-системы позволили выявить инфицированных доноров в серонегативном периоде. Частота встречаемости NAT положительных случаев среди доноров изменяется от 1:2188 до 1:29605. Неравномерность результатов при условии одинаковой эпидемиологической ситуации по гемотрансмиссивным вирусам в этих регионах зависит от следующих факторов: чувствительность и специфичность тест-систем для серологического и NAT скрининга, объем пулирования, алгоритм подтверждения положительных результатов и система контроля качества лабораторного скрининга в целом.

Таким образом, полученные данные подтверждают, что мультиплексное NAT тестирование донорской крови повышает безопасность гемотрансфузий за счет выявления инфицированных доноров в период серонегативного «окна» и вместе с серологическим является взаимно дополняющим друг друга методом.

Критерии пулировапия образцов донорской крови при NA Т тестировании

Экспериментальная часть исследования включала два этапа:

Особенность первого состояла в использовании именно образцов, полученных в процессе рутинного NAT скрининга донорской крови. Мы попытались смоделировать в эксперименте проведение тестирования в «открытых» и «закрытых» системах с единичными образцами и наиболее часто применяемыми форматами пулирования в России — пул из 5, 6. В результате тестирования 20 образцов, установлено, что в четырех получены отличные от истинных результаты. При индивидуальном скрининге все образцы были достоверно положительные. В пуле из 6 - один образец дал ложноотрицательный результат по HBV (4,1 хЮ1 копий/мл) при использовании тест-системы cobas Taq-Screen МРХ, а при использовании тест-системы АмплиСенс HCV/HBV7 HIV-FL два ложноотрицательных результата по HBV и один по HCV с вирусными концентрациями соответственно 4,1 х 101, 7,50 хЮ1, 4,50 хЮ2 копий/мл, в пуле из 5 образцов осталось только два не выявленных образца ДНК HBV. На данном этапе продемонстрирована прямая зависимость выявления положительных образцов в низкой концентрации от размера пула с помощью разных тест-систем.

Целью второго этапа было показать зависимость снижения чувствительности различных систем от разведения образца. Проведено тестирование трех NAT (+) образцов (HBV- 1,5x102 копий/мл, HCV -1,8х102 копий/мл, HIV -1,75х102 копий/мл), в различных разведениях (от 1:2 до 1:14). С помощью тест-системы cobas TaqScreen МРХ были выявлены все образцы, а в АмплиСенс HCV/HBV/HIV один образец в разведении 1:14 дал ложноотрицательный результат по ДНК HBV, что указывает на снижение чувствительности при большом разведении. В результате эксперимента показано, что при выборе объема пулирования необходимо учитывать чувствительность тест-систем, особенно при использовании «открытых систем», где решающее значение в выборе формата пула приобретает человеческий фактор. «Закрытые системы» ограничены технологией проведения анализа (Cobas s201 проводит пулирование по 6 образцов), а полная автоматизация позволяет стандартизировать процесс ПЦР скрининга.

Вопрос максимального размера пула вызывает в мире большую дискуссию. В Европе и Северной Америке NAT тестирование проводили в форматах пула от 16 до 96 образцов, в Японии - размер пула изначально был 500, но позже уменьшился до 20 образцов [Stramer SL., 2006; Yugi Н. et

al„ 2005]. В последнее время наблюдается тенденция в использовании пулов меньших размеров (из 6 образцов) или индивидуального тестирования. Это связано с развитием автоматизации, новейшими тестами, а также стремлением выявить ДНК вируса гепатита В, которая во многих случаях присутствует в очень низких концентрациях [Kleinman SH et. al., 2006; Hollinger FB, 2008].

Эпидемиологическая ситуация в стране отражает тенденции в выявлении вирусной инфекции среди донорской популяции, особенно «скрытых» вирусоносителей и больных с низкой вирусной нагрузкой в период серологического «окна». В странах с высокой частотой инфицирования значительное число донаций будет совпадать по времени с этим периодом, поэтому с помощью NAT при меньшем размере пула можно определить большее количество инфицированных доноров [Vermeulen М., Lelie N., Sykes W. et al., 2009].

Одним из важных факторов, влияющих на объем пулирования, являются биологические свойства вирусов, особенно время удвоения вируса. В то время как удвоение РНК вируса гепатита С и ВИЧ инфекции составляет 11 и 17 часов соответственно, для ДНК гепатита В около 76 часов. По этой причине уменьшение размера пула для HBV не приведет к значительному сокращению диагностического «окна» (около 20 дней). Тем не менее, существование «оккультной» формы гепатита В, когда вирусная нагрузка минимальна, требует использования высокочувствительных тест-систем. Диагностическое «окно» при NAT тестировании для HIV инфекции в формате минипул составляет 8-9 дней, при индивидуальном — снижается до 5-6 дней. Для HCV инфекции около 6-7 дней, при индивидуальном скрининге уменьшается до 4-5 дней [М. Schmidt, 2010]. В этой связи, пулирование остается вопросом, в котором необходимо учитывать возможные риски посттрансфузионного инфицирования, связанные с биологией вируса.

Таким образом, на основе результатов экспериментов и международном опыте можно сформулировать следующие общие критерии определения размера пула: эпидемиологическая ситуация в стране по данной вирусной инфекции, характеристики оборудования и тест-систем, биологические свойства вирусов, эффективность тестирования.

Оценка эффективности применения отечественных мультиплексных

систем

В период с января 2010 года по апрель 2012 года было обследовано 20486 образцов и общие затраты на проведение ПЦР скрининга донорской крови составили 4,46 млн. рублей. Затраты на выявление одного NAT положительного (ИФА отрицат.) образца составили 892 тыс. рублей. Себестоимость тестирования одной донации методом ПЦР — 218 рублей. Надо отметить, что среднерыночная себестоимость одного исследования при использовании «закрытых» систем составляет около 900 рублей. Однако, вопрос использования «открытых» или «закрытых» систем вызывает дискуссию. Первые, требуют высокой квалификации персонала и трудоемкости при достаточно высокой экономической эффективности. Вторые, полностью автоматизированы и используют специфические, предметно-ориентированные реагенты, выпускаемые производителями оборудования, что позволяет стандартизировать проведение NAT тестирования и предъявлять меньшие требования к квалификации персонала лаборатории. Тем не менее, высокая стоимость ограничивает широкое применение таких систем.

Из 20486 обследованных образцов донорской крови было выявлено пять NAT положительных в серонегативном периоде. Из одной дозы цельной крови, полученной от такого донора, возможно заготовить до трех гемокомпонентов и перелить трем потенциальным реципиентам, расходы на лечение которых составили бы в среднем от 1,5 млн. руб. без учета затрат на диагностику и реабилитацию.

Мультиплексные системы на базе отечественной платформы позволяют снизить себестоимость лабораторного скрининга и повысить экономическую эффективность проведения NAT тестирования донорской крови. Несмотря на низкую частоту NAT положительных образцов (среди ИФА отрицательных), выявление инфицированных доноров в период серонегативного окна имеет большое медико-социальное значение. Экономический ущерб от распространения вирусных гепатитов В и С превышает 3 млрд. рублей в год (Г.Х.Викулов, 2010). Увеличение заболеваемости гемотрансмиссивными инфекциями в рамках страны - это не только расходы на профилактику и лечение, но и отрицательные последствия для факторов производства, рабочей силы (рост продолжительности отпусков по болезни, снижение производительности труда, сокращение абсолютной численности

трудоспособного населения по мере роста смертности). В России за последние пять лет заболеваемость хроническими вирусными гепатитами увеличилась на 2,75 %, остается напряженной эпидемиологическая обстановка по заболеваемости ВИЧ инфекцией [Государственный доклад "О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2011 году", 2012]. Высокая распространённость гемотрансмиссивных инфекций в популяции является одной из главных причин внедрения молекулярно-биологических методов скрининга донорской крови.

Успешный опыт NAT скрининга донорской крови в мире позволил выявить около 3000 инфицированных донаций, которые могли быть пропущены при использовании только серологических методов. Большая часть исследований была проведена с помощью мультиплексных систем [W.K Roth, et al, 2012].

Применение мультиплексных систем позволяет расширить спектр определяемых вирусов. До 2009 года в США не происходило широкого внедрения NAT скрининга на гепатит В, пока не появились коммерческие мультиплексные тест-системы, включающие определение HBV инфекции. NAT тестирование ДНК HBV необходимо для выявления образцов в период серологического окна и для выявления скрытой формы HBV инфекции среди доноров с положительными анти-НВс (антитела к НВсоге-антигену вируса гепатита В) [Seed CR et al., 2002; Kleinman SH, Busch MP, 2006].

Международный опыт и данные собственных исследований подтверждают необходимость повсеместного применения NAT скрининга донорской крови. В этой связи, вариантом выбора является мультиплексное тестирование донорской крови на базе «открытых» систем, которое обеспечивает высокую эффективность за счет снижения риска посттрансфузионного инфицирования, выявления скрытых вирусоносителей, своевременности получения результата и низкой себестоимости исследования.

Выявление маркеров гернесвирусов среди доноров при молекулярном и серологическом скрининге

С помощью ИФА метода выявлено 10 (3,3%) образцов с IgM - CMV, 252 (84%) образцов с антителами IgG -CMV, 260 (86,7%) с IgG-NA-EBV, 22 (7,3%) IgG-EA-EBV, 7 (2,3%) с IgM-VCA-EBV и 216 (72%) IgG-HHV6

19

(Рисунок 1). Маркеры герпесвирусов ^М - СМУ, ^в-ЕА-ЕВУ, ^М-УСА-ЕВУ являются лабораторным признаком активной формы инфекции. В результате исследования методом ИФА было выявлено 12,9% антител к герпесвирусам в активной форме.

90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

84,0%.....

-г' / --

I

У у о. ■

-У

[«О/ 1цVI -СМУ

86,7%

17.3'! о

А/ 1«<_;-КА/ 1ЯМ-УСА-ЕВУ

72.0%

ГдС-НИУб

Рисунок 1. Серологические маркеры герпесвирусов среди доноров

Из 300 образцов выявлено 92 (30,7%) образца с ДНК ЕВУ, 19 (6,3%) с ДНК ННУ6, 8 (2,7%) с ДНК СМУ, 6 (2%) образца включали микст-инфекцию: ЕВУ и ННУ6 (Рисунок 2). Шесть положительных образцов по ДНК ЕВУ совпали с положительным результатом по маркерам ^О-ЕА-ЕВУ и/ или ^М-УСА-ЕВУ. Среди восьми положительных по ДНК СМУ, у двух наблюдалось совпадение с 1§М — СМУ.

Необходимо отметить, что метод ИФА не может полностью гарантировать безопасность гемокомпонентов, полученных от доноров, находящихся в периоде серонегативного окна. Применение ЫАТ-скрининга на ДНК герпесвирусов, дает возможность выявлять инфицированные образцы крови в этот период. Некоторым исследователям удалось выявить ДНК СМУ как у серопозитивных, так и серонегативных доноров [Еагввоп Б. е1 а1., 1998]. Полученные результаты указывают на необходимость совместного применения серологического и молекулярно-биологического методов для выявления герпесвирусной инфекции.

Применение высокочувствительных тестов, способных выявить низкую вирусную нагрузку, может привести к гипердиагностике вследствие неспецифической амплификации ДНК, поэтому результаты ряда исследований, посвященных выявлению в крови клинически здоровых доноров ДНК герпесвирусов, бывают противоречивыми. В одних работах показана относительно высокая частота встречаемости ДНК СМУ от 19% до 33% [А1уагег-Еайшп1е Я е! а1„ 2005; МкзсЬе А й а!., 2000], однако в других

сообщалось о более низком проценте позитивности - до 2,8% [ЯоЬаск ,1Г) е! а1., 2001; №$Ы\уа1а М ег а1., 2006], что совпадает с результатами нашего исследования (2,7%).

Рисунок 2. Распространенность ДНК герпесвирусов среди доноров

Хотя по всему миру встречается более 90 % серопозитивных по EBV людей, выявление ДНК EBV среди донорской популяции варьируется в широких пределах - от 5% до 88 % [Thorne LB et al., 2007; Hopwood P et al., 2002; Qu L et al., 2005]. По нашим данным, 30,7% образцов донорской крови содержат ДНК EBV. Полагаем, что низкая частота выявления ДНК EBV в некоторых исследованиях была связана с использованием менее чувствительных тест-систем.

Полученные данные о частоте выявления ДНК HHV-6 среди доноров крови и ее компонентов совпадают с результатами исследования Wilborn F et al., которые выявили 5,4 % положительных образцов, однако в других работах ДНК HHV-6 была обнаружена у 25-36% обследованных образцов донорской крови [Clark DA et al., 1996; Alvarez-Lafiiente Ret al., 2006,].

Частью нашего исследования было количественное определение одновременно ДНК CMV, EBV, HHV-6 в донорской крови. Для EBV диапазон вирусной нагрузки составил 4,1х102- 1,5х10б копий/мл, при этом 77,2% (71 из 92) выявленных образцов - с низкой вирусной нагрузкой, а 1,1% - с высокой (более 103 копий/мл). Maurmann et al. (2003 г.) сообщают о вирусной нагрузке в пределах от 3x103 до 8,5x105 геном.экв/мл.

Для HHV-6 диапазон вирусной нагрузки составил 4,6х102- 8,7х106 копий/мл, при этом 57,9% (11 из 19) выявленных образцов с низкой вирусной нагрузкой и 10,5% - с высокой. Среди исследуемых герпесвирусов максимальная вирусная нагрузка встречается у HHV-6. Подобные данные

согласуются с результатами Ward et al. (2006 г.), где выявлена средняя вирусная нагрузка 107 геном.экв/мл.

Для CMV диапазон вирусной нагрузки составил 5,7х102- 2,3х104 копий/мл, при этом 87,5% выявленных образцов с низкой вирусной нагрузкой. В международных исследованиях диапазон количества ДНК CMV варьируется до 3,2 х103 геном.экв/мл [Hudnall SD et al., 2008].

Результаты исследования показали, что одновременное выделение вирусной ДНК (РНК) из одного исходного образца и применение мультиплексных тест-систем позволяют, фактически в рамках одной постановки, выявить шесть вирусов: CMV, EBV, HHV-6, HCV, HVB, HIV. Схожий опыт NAT-скрининга встречается в Германии, где применяется единая платформа для мультиплексного анализа Zelos хЮО для определения HCV, HBV, HIV-1, HIV-2, HAV, В19 [Walid Sireis, 2010].

Таким образом, применение мультиплексной тест-системы упрощает процесс проведения молекулярного скрининга и расширяет спектр выявляемых герпесвирусов. Кроме того, методы NAT и серологического тестирования не исключают, а взаимно дополняют друг друга. Герпесвирусы вносят существенный вклад в показатели заболеваемости и смертности у иммунокомпрометированных реципиентов [Zanghellini F. et al., 1999; Evans PC. et al., 2000], однако мнения о необходимости проведения дополнительного скрининга донорской крови на герпесвирусы расходятся. Высокая частота выявления ДНК герпесвирусов методом ПЦР в реальном времени в мультиплексном формате (30,7% -EBV, 6,3%-HHV6, 2,7% -CMV, 2% - микст-инфекция) с вирусной нагрузкой до 8,7х106 копий/мл и 12,9% антител герпесвирусов в активной форме, свидетельствуют о необходимости тестирования крови на дополнительные маркеры вирусных инфекций.

Исследование антилейкоцитарпых антител I и II классов

Среди 243 женщин с беременностями в анамнезе было обнаружено 62 (25,5%) и 49 (20.2%) с антителами к I и II классам НЬА с помощью хМАР Ьшптех и ИФА метода, соответственно (Таблица 6). Распределение антилейкоцитарных антител по классам среди 62 положительных образцов, выявлнных с помощью Ьигтппех, 43 (69,4%) анти-НЬА I класса, 19 (30,6%) анти-НЬА II класса, в 8 (12.9%) одновременно были выявлены антитела к НЬА I и II классов. Распределение антилейкоцитарных антител среди 49

положительных образцов, обнаруженных методом ИФА: 39 (79,6%) анти-НЬА I класса и 10 (20,4%) по НЬА II класса, в 4 (8,2%) образцах одновременно были выявлены антитела к НЬА I и II классов. При использовании ИФА метода было выявлено восемь ложноположительных результатов по II классу и один ложноположительный по I классу.

Таким образом, было показано, что метод хМАР Ьигшпех по сравнению с ИФА более чувствительный и специфичный для скрининга антилейкоцитарных антител. В структуре антител по классам ведущее место занимают анти-НЬА антитела I класса 69,4%.

На Рисунке 3 продемонстрирована распространенность анти-НЬА антител в группах доноров с увеличением количества беременностей в анамнезе: без беременностей и трансфузий — 2 из 86 (2,3%), 1-3 беременностей — 45 из 197 (22,8%), 4 и более беременностей — 17 из 46 (36,9%). В данном случае наблюдается статистически достоверное возрастание распространенности антилейкоцитарных антител с увеличением количества беременностей в анамнезе (р<0,05).

0% -К...........,----1----

без беременностей 1-3 беременностей 4 и более

беременностей

Рисунок 3. Распространенность анти-HLA антител в группах доноров с увеличением количества беременностей в анамнезе, р<0,05

Полученные данные отличаются от результатов некоторых международных исследований, в которых использовались менее чувствительные из существующих на сегодня методов обнаружения анти-HLA антител [MacLennan S et al, 2004; Powers A. et al, 2008].

Мультиплексный анализ на платформе Ьшшпех чувствительнее, чем лимфоцитотоксический тест, и при скрининге доноров характеризуются более высокой пропускной способностью [Биопсек БР е1 а1, 2007]. По результатам нашего исследования распространенность анти-НЬА-антител у доноров с беременностью в анамнезе несколько выше, чем по данным Оепвтоге ТЪ. е1 а1, (1999 г.), видимо, вследствие того, что для скрининга авторами использовался лимфоцитотоксический тест.

Таким образом, среди различных групп доноров с помощью хМАР Ьштппех наибольшая частота выявления антител наблюдается у женщин с беременностями в анамнезе (25,5%). Распространенность антител НЬА I и II классов увеличивается с каждой последующей беременностью, особенно у женщин с четырьмя и более беременностями (до 36,9%).

Из 67 доноров мужского пола с гемотрансфузиями в анамнезе выявлено два положительных образца с НЬА антителами I класса. Из 100 доноров мужского пола без переливаний крови в анамнезе выявлен один положительный образец анти-НЬА I класса. На Рисунке 4 представлена распространенность анти-НЬА антител в трех группах доноров. В данных группах нет статистически значимых различий ( р>0,05).

мужчины без мужчины с женщины без

гемотрансфузий гемотрансфузиями беременностей и

гемотрансфузий

Рисунок 4. Распространенность анти-НЬА антител среди доноров мужчин и женщин без беременностей в анамнезе, р>0,05

Установлено, что наличие в анамнезе гемотрансфузий мало сказывается на частоте выявления антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости. Одним из возможных объяснений такой низкой частоты

антител может служить исчезновение выявляемых анти-НЬА-антител в первые месяцы после сенсибилизации, аналогично тому, как это происходит у женщин после беременности [van de Watering L et al., 2003]. По данным других исследователей антилейкоцитарные антитела могут персистировать в течение длительного времени [Norris PJ et al., 2008], что предположительно связано с циркуляцией микрохимерных клеток плода в организме матери. Полученные данные не исключают того, что гемотрансфузия в анамнезе коррелирует с повышением распространенности анти-НЬА-антител.

Выявление анти-НЬА-антител у мужчин без гемотрансфузий и женщин без беременностей и гемотрансфузий в анамнезе (Рисунок 4) может быть объяснено следующими причинами: естественные антитела [Morrales-Buenrostro LE, Terasaki PI et al., 2008] антитела, образовавшиеся после потенциальной иммунизации, например, вакцинации, попадание антигенов HLA со сперматозоидами при половом контакте, перекрестно реагирующие с бактериальными антигенами антитела [Alberu J. et al., 2007] или ложно-положительные результаты.

Таким образом, нет достоверных различий (р>0,05) в выявлении антител у женщин без беременностей (2,3%) и мужчин как с гемотрансфузиями в анамнезе (3%), так и без них (1%). Полученные данные свидетельствуют о необходимости применения высокочувствительных методов мультиплексного анализа для дальнейшего изучения и скрининга всех категорий доноров.

В связи с вышеизложенным, внедрение в Службу крови современных мультиплексных систем позволяет оптимизировать алгоритм лабораторного скрининга, повысить вирусную и иммунологическую безопасность гемотрансфузий.

ВЫВОДЫ

1. Мультиплексное тестирование донорской крови на базе «открытых» систем обеспечивает высокую эффективность за счет выявления гемотрансмиссивных инфекций в период серонегативного окна, выявления скрытых вирусоносителей, расширения спектра определения вирусных агентов, времени получения результата теста и низкой себестоимости исследования.

2. При параллельном ИФА и ПЦР скрининге донорской крови в серонегативный период выявлено три образца РНК(+) ПСУ (вирусная нагрузка 6,5х106 копий/мл, 1,2х104 копий/мл, 8,9х103 копий/мл), два образца ДНК(+) НВУ (вирусной нагрузка 4,8x102 и 1,2x102 копий/мл). Частота встречаемости МАТ-положителыюго образца (ИФА-отрицательного) составила 1: 4097. Методы ИФА и ПЦР в диагностике гемотрансмиссивных инфекций взаимно дополняют друг друга.

3. В условиях отсутствия регламентированных требований к выбору объема пулирования сформулированы следующие критерии определения размера пула: эпидемиологическая ситуация в стране по данной вирусной инфекции, характеристики оборудования и тест-систем, биологические свойства вирусов, эффективность тестирования.

4. Методом ПЦР в формате мультиплексного тестирования выявлено 30,7% ЕВУ, 6,3% ННУ-6, 2,7% СМУ (диапазон вирусной нагрузки 4,1х102-1,5x106 копий/мл, 4,6x102- 8,7х106 копий/мл, 5,7х102- 2,3х104 копий/мл соответственно), 2% - микст-инфекция, тогда как в ИФА - 12,9% антител к герпесвирусам в активной форме.

5. Метод хМАР Ьшшпех для скрининга анти-НЬА антител в сравнении с ИФА более чувствительный и специфичный.

6. Использование мультиплексной технологии позволило установить, что среди различных групп доноров анти-НЬА антитела выявляются у мужчин без гемотрансфузий в анамнезе (1%), а наибольшая их частота наблюдается у женщин с четырьмя и более беременностями в анамнезе (36,9%). В структуре антител по классам ведущее место занимают анти-НЬА антитела I класса (69,4%). Показано, что нет достоверного различия (р>0,05) в выявлении антител у женщин без беременностей (2,3%) и мужчин как с гемотрансфузиями в анамнезе (3%), так и без них (1%).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Необходимо регламентировать наряду с иммунологическими методами обязательное ИАТ тестирование донорской крови и ее компонентов.

2. Для повышения медико-экономической эффективности обеспечения безопасности гемотрансфузий целесообразно применять мультиплексные технологии.

3. Необходимо проводить дополнительный скрининг на герпесвирусы с помощью методов ИФА и ПЦР в мультиплексном формате с целью повышения вирусной безопасности гемотрансфузий для группы

иммунокомпрометированных реципиентов (с иммунодефицитами, при трансплантации костного мозга, солидных органов и т.д.).

4. Необходимо выделять группы с повышенным риском лейкоцитарной аллоиммунизации у доноров крови и ее компонентов на основе первичного анкетирования и скрининга антилейкоцитарных антител.

5. Полученные данных о наличии анти-HLA антител у женщин без беременностей в анамнезе и мужчин, не получавших гемотрансфузии, показывают необходимость применения высокочувствительных методов мультиплексного анализа для дальнейшего изучения и скрининга всех категорий доноров.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Кузнецов O.E., Матвеев A.B., Дашкова Н.Г., Рагимов A.A. Применение отечественной мультиплексной системы скрининга доноров крови в минипул формате. Материалы Всероссийской научно-практической конференции "Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины", посвященной 50-летнему юбилею Кировского научно-исследовательского института гематологии и переливания ФМБА России. Киров, 2010,- С. 81-82.

2. Кузнецов O.E., Матвеев A.B., Дашкова Н.Г., Рагимов A.A. Отечественные мультиплексные системы скрининга доноров крови в минипул формате, как неотъемлемый элемент гемобезопасности. Сборник трудов VII Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2010». М., 2010. - том I, С. 343345.

3. Горяйнов В. А., Каабак М. М., Платонова Е. Н., Морозова М. М., Шишло Л. А., Дашкова Н. Г., Салимова Э.Л., Кузнецов O.E., Матвеев А. В., Нечаев И. М. Купирование гепатита С у реципиента аллотрансплан-тированной почки при помощи циклоспорина А. Журнал "Педиатрическая фармакология" М., 2011. - том. 8, № 2.стр. 108-110.

4. Кузнецов O.E., Матвеев A.B., Оратовская М. Н., Дашкова Н.Г., Рагимов A.A. Распространенность HLA антител I и II классов среди различных групп доноров крови. Научно-практический журнал трансфузиология. М., 2011. - № 2,том12, стр.78.

5. Kuznetsov О., A. Matveev A., Oratovskaya M., Dashkova N., Ragimov A. Prevalence of HLA antibodies class I and II among different groups of blood donors. Transfusion Vol. 51, № 3S, September 2011, p 132A-133A.

6. Дашкова Н.Г., Рагимов A.A., Кузнецов O.E., Матвеев А.В. Организация лабораторных исследований по обеспечению безопасности гемокомпонентной терапии в многопрофильной клинике. Научно-практический журнал Вестник службы крови России. М., 2011 - №3, сентябрь, стр.3-5.

7. Kuznetsov О., Matveev A., Konovalov A., Dashkova N., Ragimov А. Effectiveness of PCR multiplex testing of blood donors. Vox Sanguinis, Volume 101, Issue Supplement s2.,2011, p.39.

8. Белякова В. В., Гукасян . И. А., Момотюк К. С., Майорова О. А., Кузнецов О. Е., Дашкова Н. Г., Рагимов А. А. Генотестирование доноров на гемотрансмиссивные инфекции. Научно-практический журнал Вестник службы крови России. М., март 2012 - №1, стр.9-12.

9. Кузнецов О.Е., Матвеев А.В., Дашкова Н.Г., Рагимов А.А. Эффективность ПЦР тестирования доноров крови с использованием отечественных разработок. Вестник Гематологии. М., 2012. - том VIII, №1, стр. 58-59.

Ю.Кузнецов О.Е., Матвеев А.В., Дашкова Н.Г., Рагимов А.А. Использование мультиплексной тест-системы для выявления герпесвирусов среди доноров крови. Вестник Гематологии. М., 2012- том VIII, №1, стр. 59-60.

П.Кузнецов О.Е., Матвеев А.В., Дашкова Н.Г., Рагимов А.А. Исследование анти-HLA антител среди различных групп доноров с помощью мультиплексного анализа. Трансфузиология. М., 2012,-№3, том 13, стр. 13.

12.Kuznetsov О., Matveev A., Dashkova N., Ragimov A. Multiplex real-time PCR for the detection herpesviruses in healthy blood donors. Transfusion Vol. 52, № 3S, September 2012, p 132A-133A.

13. Kuznetsov O., Matveev A., Dashkova N., Ragimov A. Comparison methodologies for anti-HLA antibody screening among blood donors. Vox Sanguinis Volume 103, Issue Supplement si.,2012, p.266

14. Кузнецов О. E., Матвеев A.B., Дашкова H. Г., Рагимов А. А. Современные методы выявления анти-HLA антител в обеспечении безопасности гемотрансфузий. Научно-практический журнал Вестник службы крови России. М., июнь 2013 - №2, стр.47-49.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДНК дезоксирибонулеиновая кислота

ПЦР полимеразная цепная реакция

РНК рибонукуклеиновая кислота

ЦНИИЭ Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии

ЭДТА динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты

CMV цитомегаловирус (ЦМВ)

EBV вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ)

ELISA твердофазный иммуноферментный метод (ИФА)

FDA Управление США по надзору за качеством пищевых

продуктов и лекарственных средств

HAV вирус гепатита А

HBV вирус гепатита В (ВГВ)

HCV вирус гепатита С (ВГС)

HHV-6 вирус герпеса человека 6 типа

HIV вирус иммунодефицита человека (ВИЧ)

HLA антигены гистосовместимости человека

IgG иммуноглобулин G

IgM иммуноглобулин М

NAT метод амплификации нуклеиновых кислот

TRALI связанное с трансфузией острое повреждение легких (ТРАЛИ)

Подписано в печать. Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 экз. Заказ № 153 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-т, д.28 Тел. 8(495)782-88-39