Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Гемопоэтические стволовые клетки пуповинной и периферической крови у детей (характеристика, процессинг и моделирование биологических свойств для клинического использования)

На правах рукописи

РУМЯНЦЕВ СЕРГЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ГЕМОПОЭТИЧЕСКИЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ПУПОВИННОЙ И ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У ДЕТЕЙ

(характеристика, процессинг и моделирование биологических свойств для клинического использования)

14.00.09 - педиатрия

14.00.29 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 2006

003061966

Работа выполнена в ФГУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации.

Научные консультанты: Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Доктор медицинских наук, профессор

А.Г.Румянцев О.А.Майорова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор Член-корреспондент РАМН,

Б.В.Афанасьев Д.Н.Дегтярев

доктор медицинских наук, профессор

В.Г.Савченко

Ведущее учреждение: Научный центр здоровья детей РАМН

Защита диссертации состоится 30 марта 2007 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 208.050.01 в Федеральном государственном учреждении «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Росздрава (117997, Москва, ГСП-7, Ленинский проспект 117, корпус 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Росздрава.

Автореферат разослан «_» ______ 2006 года

Ученый секретарь диссертационного Совета

доктор медицинских наук, профессор В.М.Чернов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) является важным компонентом терапии при многих гематологических заболеваниях, врожденных нарушениях иммунной системы, наследственных анемиях, некоторых болезнях обмена и злокачественных новообразованиях (Thomas E.D., 1990; Афанасьев Б.В. и соавт. 1994; Bensinger W. et al., 1995; Schmitz N. et al., 1995; Савченко В.Г. и соавт. 1996; Румянцев А.Г., 1996; Птушкин В.В., 1997; Rubinstein Р., 1999; Gluckman Е., 2004); однако, поиск подходящего донора костного мозга - дорогой и длительный путь, и иногда пациент не доживает до трансплантации (Falkenburg J.H.F.,1996; Афанасьев Б.В. и соавт. 1998; Gluckman Е., 2000). Вероятность того, что для пациентов, принадлежащих к этническим меньшинствам, найдется HLA-идентичный неродственный донор, может быть еще меньше, поскольку встречаемость определенных HLA-типов в различных этнических группах значительно варьирует (Armitage J., 1994). Создание банков пуповинной крови (ПК) в значительной степени облегчает поиск материала для трансплантации, что в сочетании с дешевизной получения такого материала и легкой его доступностью является предпосылкой для увеличения количества трансплантаций ГСК ПК (Wagner J. Е., 1992; Harris D. T., 1996; Kogler G., 1996; Dcuta К., 1998; Rubinstein P., 1999; Gluckman E., 2005). Технологии получения ГСК ПК для последующей криоконсервации требуют разработки условий контроля течения беременности и родов и поиска надежных прогностических факторов пригодности получаемого материала для последующей трансплантации. Известно, что состав клеток ПК отражает течение беременности и родов, а также перенесенных заболеваний. Несмотря на многочисленные исследования клеточного состава ПК (Monroe B.L., 1979; Stokman P.A., 1992; Alacron P.A., 1992; Торубарова H.A., 1993; Cairo M.S., 2005; Aravita S., 2005) отсутствуют референтные значения клеточного состава ПК доношенных и недоношенных новорожденных. Появившиеся в последнее время сообщения о различии клеточного состава ПК в зависимости от пола и массы тела новорожденного, вида родоразрешения, сроков, прошедших после родов и сбора ПК до начала процесса обработки, (Cairo M.S., 2005; Aravita S., 2005) демонстрируют влияние множества факторов на клеточный состав ПК и, как следствие этого, на эффективность заготовки трансплантационного материала. Кроме того, ПК имеет некоторые физиологические отличия от периферической крови взрослого человека (Solves Р., 2005; Bradley М.В., 2005), в связи с чем исследование состава и характеристик клеток ПК, проводимое при помощи автоматических счетчиков, не вполне удовлетворительно.

Успех трансплантации во многом зависит от достаточного количества ГСК, поэтому, важным вопросом при применении ПК в клинике является оценка трансплантата, в основе которой лежит определение количества и жизнеспособности ГСК, содержащихся в трансплантационном материале (Bender J.G., 1994; Gonzalez В.Е., 1997; Traîneau R., 1998; Allan D.S., 2002; Cotta S.V. et al., 2002; Marino M.P. et al„ 2002).

В течение последних 10 лет в качестве источника гемопоэтических стволовых клеток все чаще используют мобилизованную при помощи Г-КСФ периферическую кровь (Bensinger W. et al., 1995; Schmitz N. et al., 1995; Масчан A.A., 1995; Афанасьев Б.В. и соавт. 1996; Савченко В.Г. и соавт. 1996); в связи с чем, важно определить условия и механизмы воздействия Г-КСФ на систему гемопоэза, для получения наиболее эффективного трансплантационного материала (Asano S., 1991; Welte К., et al., 1996; Kronenwett R., et al., 2000; Cutler С., et al., 2001; Maianski NA., et al., 2002).

Использование различных источников ГСК для трансплантации, а также использование множества технологических приемов для получения непосредственного трансплантационного материала из ПК и периферической крови требует тщательного описания и сравнения клеточного состава и характеристик ГСК в различных источниках и определение факторов, оказывающих на них влияние.

Изучение и разработка технологий моделирования биологических свойств ГСК ПК также представляется актуальной задачей, так как в таком случае можно получить возможность влиять на степень и направленность их дифференцировки (Medcalf D., 1989; Ogawa M., 1993; Varnum-Finney В. et al, 1998). Разработка генных векторов «третьей» генерации на базе вируса иммунодефицита человека первого типа позволяет проводить работу с неделящимися клетками, к которым относится большинство ГСК, что дает возможность получить эффективную и безопасную модель для изменения свойств ГСК в клинических целях (Hawley R. et al., 1987; Dull T. et al., 1998; Suttou R.E., 2002, Marino M. et al., 2002; Follenzi A. 2002). Выбор в качестве индуктора/ингибитора пролиферативной активности стволовых клеток генов из семейства Notch наиболее перспективен, так как они принимают участие в процессах, как самообновления клеточной популяции, так и активации антидифференцировочных клеточных программ (Weinmaster G. et al., 1992; Artavanis-Tsakonas S. et al., 1995; Lewis J., 1996; L. Wu., 2000; Baldi A. et al., 2004).

Таким образом, решение указанных вопросов позволит оптимизировать технологии заготовки, процессинга и модификации ГСК ПК и периферической крови для клинического использования.

Цель исследования:

Разработать и внедрить в практику научно обоснованные методы сбора, тестирования и хранения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной и периферической крови для неродственных трансплантаций, а также изучить возможность моделирования их биологических свойств для клинического применения.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать клеточный состав ПК, определить количество и субпопуляции CD34+ и С0133+клеток, а также колониеобразукяцую активность ГСК ПК доношенных новорожденных.

2. Разработать и внедрить систему критериев для оценки и отбора потенциальных доноров ПК с целью получения максимально эффективного трансплантационного материала.

3. Изучить механизмы мобилизации ГСК периферической крови при использовании Г-КСФ у здоровых доноров и пациентов с различными онкогематологическими заболеваниями.

4. Усовершенствовать и внедрить технологии процессинга ПК и мобилизации ГСК периферической крови для получения максимально эффективного трансплантационного материала.

5. Охарактеризовать клеточный состав и жизнеспособность трансплантационного материала ПК и мобилизованной периферической крови.

6. Разработать эффективную технологию моделирования биологических свойств ГСК для клинических целей.

7. Обосновать и усовершенствовать организационные принципы работы банков ПК и стандарты работы с ГСК ПК для практических целей.

Научная новизна

Получены референтные значения состава ПК с использованием автоматического анализатора клеток крови и микроскопии окрашенных мазков, определены величины расхождения результатов и факторы, влияющие на разницу определения. Определено количество основных субпопуляций лимфоцитов, CD34+ и CD133+KneroK. Функциональная оценка ГСК ПК доношенных новорожденных изучена на модели колониеобразования in vitro.

Проведена оценка влияния течения беременности и родов, острой и хронической гипоксии плода на показатели клеточного состава ПК доношенных новорожденных, впервые показаны различия клеточного состава ПК в зависимости от пола и массы тела новорожденного, причем эти различия независимы друг от друга.

Впервые получены референтные значения уровня спонтанного апоптоза основных клеточных популяций ПК, обработанной по разработанным стандартам, базирующимися на системе NetCord. Определены степень и характер влияния особенностей течения беременности и родов, а также основных технологических параметров процессинга на жизнеспособность клеток ПК.

Отработана технология процедуры лейкоконцентрации при различных состояниях беременности, родов, новорожденного и технологических параметрах ПК, подробно охарактеризован клеточный состав концентрата ПК, являющегося трансплантационным материалом.

Изучен характер и степень влияния препаратов Г-КСФ на состав и жизнеспособность клеток периферической крови при выполнении протоколов мобилизации гемопоэтических стволовых клеток у здоровых доноров, детей с различными онкогематологическими заболеваниями в ремиссии с целью аутологичной трансплантации и при лечении медикаментозной цитопении. Определены концентрации мобилизующих цитокинов и ферментов - IL-8, G-CSF, ММР-9 - в сыворотке ПК доношенных новорожденных и периферической крови при использовании препаратов Г-КСФ у детей с различными онкогематологическими заболеваниями и здоровых доноров. Определено количество основных субпопуляций лимфоцитов, CD34+ и С0133+клеток, а на модели колониеобразования in vitro изучено количество и состав ГСК мобилизованной периферической крови и продукта цитафереза, являющегося трансплантационным материалом.

Впервые показана возможность эффективной трансфекции генов в неделящиеся клетки при помощи модифицированного вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1). Впервые на модели NOD/SCID мышей показана возможность изучения гемопоэтической дифференцировки СБ133+клеток ПК человека. Модифицированная авторами векторная система, созданная на базе ВИЧ-1, способная обеспечить эффективный перенос исследуемого генетического материала в неделящиеся клетки, а также показанное эффективное угнетение колониеобразующей активности и увеличение уровня спонтанного апоптоза CD133+mieTOK генами Notch 1 и Notch 2, могут быть использованы при моделировании биологических свойств ГСК человека.

Разработан комплекс практических рекомендаций по усовершенствованию технологических операций отбора доноров, сбора, процессинга и тестирования ПК для последующей трансплантации, а также по усовершенствованию протоколов мобилизации ГСК периферической крови.

Практическое значение

Практическое значение работы заключается в установлении референтных значений ПК, как при использовании автоматического анализатора клеток крови, так и при подсчете клеток крови при светооптической микроскопии. Получены значения, характеризующие состав лейкоцитов ПК, которые рекомендуется использовать в качестве факторов, определяющих показания и противопоказания к сбору ПК для безвозмездного донорства ГСК. Кроме того, полученные данные имеют важное практическое значение при проведении технологических расчетов в работе банков стволовых клеток.

Практическое значение имеют данные объективной оценки эффективности методов сбора ПК, различных способов процессинга ПК с целью получения подготовленного к хранению трансплантационного материала, а также выявленные зависимости эффективности процессинга ПК от особенностей течения беременности, родов и ряда технологических элементов.

Эффективность мобилизации и сбора ГСК периферической крови зависит от количества циркулирующих гранулоцитов и ряда вторичных посредников (IL 8, ММР-9), что позволяет оптимизировать процедуру мобилизации и получения более эффективного трансплантационного материала у пациентов в ремиссии различных онкогематологических заболеваний.

Полученные сравнительные характеристики количества и жизнеспособности ГСК в трансплантационном материала ПК и мобилизованной периферической крови могут использоваться в качестве стандартов по определению качества заготавливаемого трансплантационного материала в банке стволовых клеток.

Модифицированная авторами векторная система, созданная на базе ВИЧ-1, способная обеспечить эффективный перенос исследуемого генетического материала в неделящиеся клетки, а также показанное эффективное влияние генов Notch 1 и Notch 2 на колониеобразующую активность и уровень спонтанного алоптоза CD133+KneTOK могут быть использованы при моделировании биологических свойств стволовых клеток человека. Отработана модель для изучения приживления и дифференцировки различных популяций гемопоэтических стволовых клеток человека на основе трансплантации предварительно облученным NOD/SCID мышам.

Практическое значение выполненной работы заключается в разработке рекомендаций по отбору потенциальных доноров ПК, методикам сбора ПК и соблюдению временных параметров в зависимости от индивидуальных характеристик каждого образца ПК.

Положения, выносимые на защиту

1. Трансплантационный материал ПК содержит около 11x106 CD34+KJieTOK, что меньше, чем в Г-КСФ мобилизованной периферической крови здоровых доноров (104х106 СЮ34+клеток); однако популяция ГСК ПК содержит статистически значимо большее количество более ранних CD133+ предшественников гемопоэза, мезенхимальных и эндотелиальных клеток-предшественников, по сравнению с трансплантационным материалом, полученным из мобилизованной Г-КСФ периферической крови (р<0,0001).

2. Условием получения наиболее эффективного трансплантационного материала служат обоснованные стандарты сбора (соблюдение стандартного списка противопоказаний для отбора доноров, срок гестации от 37 до 41 недель, физиологические роды, сбор ПК до отделения плаценты, в срок до 5 минут после родов), процессинга (проведение процедуры лейкоконцентрации в условиях GMP не позднее 18 часов после родов в системе, максимально ограничивающей контаминацию, с использованием стандартного метода двойного центрифугирования или аппаратного автоматического выделения), количественной и качественной оценки материала при помощи автоматического анализатора клеток крови, учитывающего наличие нормобластов, определение количества и состава ГСК с учетом количества CD34+, CD133+, CD3+, CD16+56+ клеток, определения эффективности клонирования в 14 суточной культуре в метилцеллюлозе с учетом КОЕ-ГЕММ, КОЕ-ГМ, КОЕ-Г, КОЕ-М, КОЕ-Э, уровня спонтанного апоптоза (РГ/Аппехш ^клетки).

3. Клетки ПК могут служить моделью для регуляции пролиферативной активности ГСК, что может быть использовано для предгрансплантационной подготовки материала для клинического использования, и подтверждено экспериментальными исследованиями. Трансфекция генов системы Notch с помощью векторной системы на базе модифицированного ВИЧ-1 позволяет изменять пролиферативную активность и жизнеспособность CD133YCK ПК.

4. Произведена оценка трансплантационного материала, полученного из периферической крови, мобилизованной Г-КСФ. При использовании препаратов Г-КСФ в периферической крови увеличивается количество всех субпопуляций лейкоцитов. Эффект мобилизующего действия Г-КСФ зависит от количества нейтрофилов перед началом мобилизации и связан со степенью повышения концентрации в сыворотке крови IL 8 и ММР-9.

5. Усовершенствованы и внедрены в работу БСК стандарты сбора, процессинга и тестирования пригодности трансплантационного материала ПК для клинического использования.

Внедрение в практику

Результаты исследования внедрены в работу ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава, ГУЗ «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения г. Москвы». Основные положения и выводы диссертации используются в подготовке специалистов гематологов, онкологов и иммунологов на кафедре клинической гематологии, онкологии и иммунопатологии с курсом поликлинической и социальной педиатрии ФУВ РГМУ. По теме диссертации опубликовано 38 работ, в том числе пособие для врачей «Влияние Г-КСФ на клеточный состав крови и костного мозга человека» (2003) и монография «Биологические основы и перспективы терапии стволовыми клетками» (2005).

Результаты работы доложены на IV Российском Национальном конгрессе «Человек и Лекарство», Москва, в апреле 1997 г., I Съезде детских онкологов и гематологов России, Москва, в ноябре 1997 г., I Российском симпозиуме «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний у детей», Москва, в феврале 1999 г., VII Российском Национальном конгрессе «Человек и Лекарство», Москва, в апреле 2000 г., П Российском симпозиуме «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний у детей», Москва, в феврале 2001 г., П1 Российском симпозиуме «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний у детей», Москва, в феврале 2003 г., IV Российском симпозиуме «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний у детей», Москва, в феврале 2005 г., I Всероссийском съезде гематологов, 16 - 18 апреля 2002 г., IX Российском Национальном конгрессе «Человек и Лекарство», Москва, в апреле 2002 г., 7th Meeting of the European Hematology Association, Florence, Italy в июне 2002., X Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» в апреле 2003 года, Москва., 5th International Symposium on Leukemia and Lymphoma, Amsterdam, The Netherlands в марте 2003, 8th Annual Congress of the European Hematology Association, Lyon, France в июне 2003, 9й Congress of the European Hematology Association, Geneva, Switzerland в июне 2004, 6th International Symposium and Expert Workshops on Leukemia and Lymphoma, Amsterdam, the Netherlands в марте 2005, ХП Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» в апреле 2005, 31th Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation, Prague, Czech Republic в марте 2005, на научном конгрессе Science Workshop, Halwerston, Texas, в апреле 2004 г., на Национальном конгрессе CAGT Cell & Gene Therapy, The Woodlands, Houston, Texas, в марте 2003., на

съезде Медицинского Колледжа Бэйлор, The Warwick Hotel, Houston, Texas, в феврале 2004., собраниях лабораторий департамента Молекулярной вирусологии и микробиологии, Медицинского Колледжа Бэйлор, Houston, Texas, в 2002-2004 гг., на конгрессе «Национальные дни лабораторной медицины России», Москва, в октябре 2005, на X Съезде педиатров России, Москва, в феврале 2006, и Российском Съезде гематологов и трансфузиологов, Москва, в апреле 2006, Всероссийской конференции РНОИ, Курск, в мае 2006, Российском конгрессе «Новые технологии в перинатологии», Москва, в ноябре 2006.

Апробация диссертации

Диссертация апробирована на совместной научно-практической конференции сотрудников клинических и лабораторных отделов ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава, кафедр факультетской педиатрии Московского факультета и клинической гематологии, онкологии и иммунопатологии с курсом поликлинической и социальной педиатрии ФУВ РГМУ, ГУЗ «Банк стволовых клеток» Департамента здравоохранения г. Москвы, Российской детской клинической больницы 18 сентября 2006 г.

Структура и объем диссертации

Материал диссертации изложен в одном томе на_страницах машинописного

текста, содержит_таблицу и проиллюстрирован_1 рисунками. Указатель литературы

включает_источника отечественной и_- зарубежной литературы. Работа состоит из

введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы.

Работа выполнена в ФГУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Росздрава (директор ФГУ ФНКЦ ДГОИ - член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Румянцев А.Г.), на базе лаборатории регуляции кроветворения (зав. - д.б.н. Осипова Е.Ю.) отдела молекулярной гематологии (зав. - засл. деятель науки РФ, д.м.н., профессор Владимирская Е.Б.), лаборатории контроля количества и жизнеспособности стволовых клеток ГУЗ «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения г. Москвы» (директор - д.м.н., профессор Майорова O.A.), лаборатории моделирования и создания векторных систем ВИЧ-1, (зав. - Dr. Richard Е. Sutton, MD., PhD.), департамента молекулярной вирусологии и микробиологии (зав. - Dr. Janet S. Butel, PhD.), Медицинского колледжа Бэйлор (президент - Dr. Ralph D. Feigin, MD.), Хьюстон, Техас, США.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Материалом исследования служили:

1. Пуповинная кровь 1095 доношенных новорожденных, родившихся на 37-41 неделе гестации (медиана составила 40 недель) в ЦПСиР ДЗ г. Москвы (гл. врач - д.м.н., проф. Курцер М.А.) и Родильном доме №10 Управления здравоохранения ЮЗАО г. Москвы (гл. врач - Оземковская Е.П.) за период с 2003 по 2005 год.

2. Концентрат ПК (п=1095), полученный при помощи седиментации эритроцитов раствором гидроксиэтилкрахмала (НЕв) в ГУЗ «Банк стволовых клеток» ДЗ г. Москвы за период с 2003 по 2005 год.

3. Материал ретроспективного анализа мобилизации СБ34+клеток крови у 71 пациента (48 детей с различными онкологическими и онкогематологическими заболеваниями и 23 здоровых донора), находившихся на лечении в НИИ Детской гематологии МЗ РФ за период с 1995 по 2000 год.

4. Кровь и костный мозг 45 детей с различными онкологическими и онкогематологическими заболеваниями в стадии ремиссии, находившихся на лечении в клинике НИИ Детской гематологии МЗ РФ далее в ФГУ «ФНКЦ ДГОИ» Росздрава с 2000 по 2006 год. Из них 19 пациентов получали препараты Г-КСФ с целью мобилизации С034+клеток в периферическую кровь для сбора и последующей аутологичной трансплантации, а 26 - с целью восстановления количества гранулоцитов при развитии медикаментозной цитопении.

5. Кровь 15 здоровых доноров ГСК, которые получали препараты Г-КСФ с целью мобилизации СБ34+клеток в периферическую кровь для сбора и последующей аллогенной трансплантации в ФГУ «ФНКЦ ДГОИ» Росздрава.

Получение пуповинной крови Пуповинную кровь получали при физиологических и оперативных родах доношенных новорожденных (37-41 недель гестации (медиана - 40 недель)) с учетом информированного согласия матери и отсутствия стандартных противопоказаний. После пережатия и пересечения пуповины, производили пункцию сосудов пуповины специальной системой для забора ПК, содержащей 35,5 мл антикоагулянта СРОА. Сбор крови осуществляли в течение 2-15 минут после родов (менее 5 минут - 847 случаев (84,4%), от 5 до 10 минут - 89 случаев (8,7%) и более 10 минут - 68 (6,9%)), до отделения плаценты (п=993 (98,5%)). В случае сбора крови после отделения плаценты (п=15 (1,5%)), плацента помещалась в специальную стерильную стойку и проводилась аналогичная

процедура сбора ПК. Полученный материал хранили в темном месте при комнатной температуре и подвергали анализу не позднее 18 часов после процедуры сбора ПК. Клиническая характеристика беременности

Течение беременности проанализировано у 391 роженицы и представлено в табл. 1. Таблица 1. Особенности течения беременности (количество наблюдений) _

№№ Состояние Без 1 половина 2 половина 1 и2

патологии беременности беременности половина беременности

1 Анемия 354 10 24 3

2 Инфекционные заболевания 290 38 56 7

3 Угроза прерывания беременности 254 92 23 22

4 Патология почек у матери 368 23

5 Фетоплацентарная недостаточность 377 5 9

6 Внутриутробная гипоксия 346 45

7 Ожирение у матери 380 И

Клиническая характеристика родов Из 1004 новорожденных 585 родились в результате первых родов, 340 - вторых, 63 -третьих и 16 - роды четвертые и более (12 человек - 4-е роды, 2 человека - 5-е и 2 человека - 6-е). Процент мальчиков и девочек среди групп, составленных по порядковому номеру родов, не отличался. В каждой из групп девочек и мальчиков было приблизительно поровну. Вес плаценты проанализирован в 990 случаях. Средний вес плаценты в группе составил - 580,57±4,92, диапазон: 77,0 г - 1138,0 г. Течение и осложнение родов прослежены у 391 новорожденного. Все новорожденные были разделены на группы согласно способу родоразрешения: самостоятельные роды и роды путем кесарева сечения. Медиана длительности безводного промежутка составила 5 часов (от 20 минут до 19 часов 20 минут). Медиана длительности II периода родов (от начала потуг до рождения ребенка) составила 30 минут (от 10 минут до 1 часа 35 минут).

Клиническая характеристика состояния новорожденных

Из 1004 образцов, для которых доступны данные относительно пола ребенка,

мальчиков и девочек было 524 (52,2%) и 480 (47,8%), соответственно. Средняя масса при

рождении была несколько выше у мальчиков (3629,24±18,25 г.; диапазон: 2270-5000 г.),

чем у девочек (3467,23±18,17 г.; диапазон: 2300-4650 г.) (р<0,0001). Из 391

новорожденных у 58 отмечалось изменение цвета околоплодных вод (56 - зеленые воды и

2 - кровянистые), что является косвенным признаком внутриутробной гипоксии плода, у

45 - во время беременности была диагностирована внутриутробная гипоксия плода, у 90 -

отмечалось обвитие пуповины при рождении, у 27 - отмечалось внутриутробная задержка

развития плода. Медиана гестационного возраста в группе без внутриутробной задержки

развития составила 40 недель (диапазон - 33-42), а в группе с задержкой развития - 38

12

недель (диапазон - 37-41). Все 186 новорожденных, у которых имеются сведения о степени зрелости плаценты на момент родов, были разделены на три группы: степень зрелости плаценты 1-10 человек; степень зрелости плаценты 2-72 человека и степень зрелости плаценты 3-104 человека.

Процедура выделения стволовых клеток Выделение клеточного концентрата, содержащего стволовые клетки, проводилось в асептических условиях, в «чистом» помещении класса D двумя методами: методом двойного центрифугирования и аппаратным методом с помощью аппарата «Sepax S100», Biosafe, Switzerland (539 и 554 образца, соответственно). Все обработанные образцы были подвергнуты криоконсервации в роботизированном криокомплексе "BioArchive®", ThermoGenesis, USA. Непосредственно перед криоконсервацией, в каждый образец добавлялся криопротектор DMSO в смеси с декстраном-40 в количестве 20% от объема конечного продукта для предотвращения разрушения клеток концентрата ПК под воздействием сверхнизких температур.

Определение клеточного состава пуповинной крови Подсчет клеток крови производился двумя методами:

• все 1095 образцов ПК были подвергнуты анализу автоматическим счетчиком клеток крови АВХ Pentra 60 С+ в режиме автоматической аспирации с определением 26 параметров;

• для точной морфологической характеристики клеток ПК использовали мазки ПК, окрашенные по методу Паппенгейма-Кркжова (комбинированная окраска фиксатором-красителем Мая-Грюнвальда и краской Романовского);

Количество нормобластов определяли при подсчете лейкоцитарной формулы на 200 последовательно встречающихся лейкоцитов с дальнейшим пересчетом на 100 (нормобласты/100 лейкоцитов).

Коррекция результатов автоматического анализа пуповинной крови

Степень разведения образцов ПК антикоагулянтом была различна и зависела от объема собранной крови. Объем антикоагулянта в системе постоянный и составляет 35,5 мл, объем собранной крови колебался в пределах от 20,0 до 170,0 мл. Пересчет результатов автоматического анализа крови проводился с учетом степени разведения каждого образца для каждого показателя.

Определение количества субпопуляций лейкоцитов и стволовых клеток

Количество субпопуляций лейкоцитов и гемопоэтических стволовых клеток

определяли по экспрессии мембранных маркеров (CD - clusters of differentiation) в

реакции прямой иммунофлюоресценции с моноклональными антителами CD3, CD4, CD8,

13

CD13, CD 14, CD 16, CD 19, CD25, CD30, CD31, CD33, CD34, CD38, CD44, CD45, CD56, CD61, CD62L, CD62E, CD71, CD90, CD106, CD117, CD133, HLA-DR «Becton Dickinson», США при помощи проточной цитометрии на приборе FACSCalibur «Becton Dickinson», США.

Определение колониеобразующей активности

Колониеобразующую активность лейкоцитарной фракции ПК определяли двумя методами:

1. культивирование в течение 14 суток в метилцеллюлозе (готовая среда, содержащая факторы роста «MethoCult 4338, StemCellTehnologies, Canada) с подсчетом количества КОЕ-ГЕММ, КОЕ-ГМ, КОЕ-Г, КОЕ-М, КОЕ-Э.

• Эффективность клонирования (ЭК) определяли как общее число КОЕ на 1х105 эксплантированных клеток.

• Для определения абсолютного количества гемопоэтических предшественников в 1 мл ПК, полученные величины эффективности клонирования умножали на число мононуклеарных клеток в 1 мл крови.

2. Культивирование в полутвердой среде в системе «агаровая капля - жидкая среда» в течение 7 суток с расчетом следующих показателей:

• колониеобразующая (КОС) и кластерообразующая (КлОС) способность - число колоний (малые - 20-40 клеток, средние - 41-100 клеток и большие - более 100 клеток) и кластеров (малые - 5-9 клеток, большие - 10-19 клеток) на 1х105 эксплантированных клеток.

• эффективность клонирования (ЭК) - общее число колоний и кластеров на 1х105 эксплантированных клеток.

• для определения абсолютного количества гемопоэтических предшественников в 1 мл крови или костного мозга, полученные величины эффективности клонирования умножали на число мононуклеарных клеток в 1 мл крови и на число миелокариоцитов в 1 мл костного мозга.

• пролиферативный потенциал (ПП) - отношение числа колоний к кластерам в культуре.

Определение уровня спонтанного апоптоза и некроза клеток ПК

Исследование уровня некроза и спонтанного апоптоза лейкоцитов, гранулоцитов и лимфоцитов ПК проводили при помощи проточной цитофлюориметрии двумя методами: определение количества клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК при окрашивании Propidium iodid (PI), и определение числа локусов связывания мембранного фосфатидил-

серина в реакции прямой иммунофлюоресценции с использованием Annexin V FITC ("Phar Mingen"), согласно инструкциям производителей.

Результаты реакции анализировали на проточном цитофлюориметре FACSCalibur ("Becton Dickinson", США). Обработку полученных данных производили при помоши программы WinMDI 2.8 for Windows. Уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов, гранулоцитов и лимфоцитов клеток ПК определяли как сумму РГ/Annexin V+ и РГ/Annexin V+ клеток, а уровень некроза, как количество PlV Annexin \Г клеток.

Вирус иммунодефицита человека 1 типа, предоставленный компанией Invitrogen, (США) был модифицирован с целью потери вирусом способности к репликации следующим образом: ген Env, кодирующий белок gpl60, был заменен геном гуанинфосфорибозил трансферазы (gpt). Другие гены, входящие в ВИЧ (Vif, Vpr, Vpu и Nef), были также несколько изменены - большое количество последовательности ДНК было удалено. Далее, в вектор pBluescript SK(+/-) (№52325 GenBank, США), встраивался участок IRES-eYFP-в сайт многократного клонирования (MCS), при помощи рестриктазы Sacl(pnc. 1).

Рисунок 1, Схематическое изображение внедрения трансгенной кассеты в участок, показанный стрелкой (Первый этап).

лпо

Рисунок 2. Схематическое изображение реакции обменного дотирования при создании конечного вектора. (Второй этап).

Получение генных векторов

- (+)ori

pUC я!

В полученный вектор, который получил название pBs-IRES-eYFP, встраивались активированные формы генов Notchl и Notch2 (GenBank, США) при помощи применения рестриктазы EcoRI и последующего пигирования Т4 ДНК лигазой в сайте RI. Таким образом, были получены два новых вектора: pBs-Nl-IY и pBs-N2-IY. Далее проводили реакцию обменного лигирования полученных векторов отдельно друг от друга с модифицированным вектором на базе ВИЧ 1 - pHIV-cycT 1 -IRES-eYFP, при помощи обработки используемых плазмид смесью рестриктаз Notl+Xhol с последующей инактивавацией ферментов (3 мин - 75°С). После этого плазмиды, содержащие исследуемые гены, смешивали отдельно друг от друга с ВИЧ-плазмидой. В полученный раствор добавляли Т4 ДНК лигазу и оставляли на 30 мин. при температуре +5°С. Таким образом, вся кассета Notchl -2-IRES-eYFP от плазмиды pBs переходила к ВИЧ-плазмиде, а к той в свою очередь IRES-eYFP от плазмиды на базе ВИЧ (рис. 2). Так были получены: pHIV-Nl-IY и pHIV-N2-IY.

Нуклеотидные последовательности активированных генов Notch 1 и Notch 2 предоставлены GeneBank. Определение нуклеотидной последовательности готовых плазмид проведена SeqWright-DNA Sequencing., Houston, (www.seqwrieht.com'). при помощи праймеров Т7 и 1RES uni (SeqWright - DNA Sequencing, США). Для создания и наработки плазмидного вектора использовали штамм Е. coli HB 101 или ТОР 10.

Подготовка и трансфекция клеток 293Т

Приблизительно за 12 ч до трансфекции клетки рассеивали в соотношении 1:4 в чашки диаметром 10 см. Неконцентрированный вирусный супернатант добавляли титрованием 0,1 мл, 0,01 мл и 0,001 мл раствора к стандартно используемой клеточной линии HOS. Через 48 ч оценивали результат: клетки исследовали под флуоресцентным микроскопом. Если вирус был хорошо приготовлен, то все клетки, к которым было добавлено 0,1 мл раствора, синтезировали трансген YFP. При добавлении 0,01 и 0,001 мл раствора трансген YFP синтезировали 70 и 40% клеток соответственно.

Получение CD133+wiemoK

Выделение чистой популяции CD133+ клеток проводили в течение 4-7 ч после родов и получения ПК (всего проведено 72 иммунные сепарации). Мононуклеарную фракцию получали при помощи центрифугирования в градиенте плотности с использованием среды для выделения лимфоцитов Ficoll-Paque (Gibco BRL, Grand Island, NY). После выделения мононуклеарные клетки смешивали в растворе для иммуномагнитной сепарации и подвергали ультрафильтрации при помощи клеточных нейлоновых фильтров с диаметром пор 0,22 мкм (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ).

Пуповинная кровь

&

Выделение мононуклеарных клеток на градиенте плотности

Л

Мононуклеарные клетки пуповинной кпови

-О-

Иммуномагнитная сепарация MiniMACS с CD ИЗ? частицами

с CD 133 частицами / %

Л-

Иммуномагнитная сепарация MiniMACS с CD34* частицами

XL

Поражение CD 133 клеток созданными векторами.

Негативная фракция ГСТЛ 33~СТ)34"1

Чистая популяция fCD133"CD34^

4)

А £ 5 « г

еа £ о с Я fl

S Г) to я ° £

л

Определение

уровня спонтанного апоптоза

Определение колониеобразу ющей активности

Трансплантация NOD/SCID мыши после сублетального облучения

Рисунок 3. Схема проведения эксперимента с чистой популяцией СШЗЗ+клеток

ПК.

Процедуру иммуномагнитной сепарации проводили при помощи стандартной методики и с использованием реагентов и устройства Mini MACS (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Из суспензии, содержащей мононуклеарные клетки ПК человека, выделяли СШЗЗ+клетки. После выделения С0133+клеток из полученной суспензии выделяли С034+клетки, получая, таким образом, CD133+CD34TCK и CD133+CD34+TCK, которые в дальнейшем использовали для внедрения генов Notch 1 и 2. Оставшуюся суспензию, не содержащую CD133+- и С034+клеток, использовали в качестве отрицательного контроля -CD 133XD34" клетки (рис. 3).

Трансфекция полученных вирусов в CD133+ клетки CD133+ клетки перед трансфекцией распределяли равными объемами (по 1 мл) в четыре ячейки 6-ти ячеечного планшета (Falcon, BD, США) с добавлением в каждую из них по 4 мкл 1000 х раствора полибрена (4 мг/мл, водный раствор, Sigma, США). Затем в три ячейки добавляли по 400 мкл раствора векторов: в первую - pHIV- N1-IY , во вторую - рШУ-Ш-ГУ, в третью - pHiV-cycTi-IRES-eYFP, соответственно. В четвертую добавляли такой же объем свежей среды DMEM complete + цитокины (негативный контроль). Таким образом, в каждой лунке находился только один тип вектора. После добавления, содержимое планшета тщательно перемешивали плавными круговыми движениями и накрыв крышкой помещали в инкубатор при 37°С и с 5% содержанием С02. Через 12 часов из каждой лунки аккуратно аспирировали жидкую часть одноразовыми пипетками, после чего добавляли по 1 мл свежего раствора DMEM complete + цитокины.

Оценка эффективности включения векторов Эффективность включения векторов определяли при подсчете количества клеток, несущих желтый флуоресцирующий протеин (yellow fluorescent protein - eYFP), при помощи проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии. YFP флуоресцирует желтым светом, который при длине волны 488 нм абсорбируется как зеленый.

Определение уровня спонтанного апоптоза CD133* клеток Уровень спонтанного апоптоза CD133+ клеток, подвергшихся трансфекции векторов, определяли после недели инкубации в среде DMEM complete в присутствии цитокинов IL-3, IL-6, SCF и flt3 лиганда, при помощи проточной цитометрии с использованием двойного окрашивания Annexin V FITC и пропидиум йодидом (PI). Определяли количество PI+AmiexinV+ (поздние стадии апоптоза) - и РГАппехтУ* (ранние стадии апоптоза) клетки.

Определение колониеобразующей активности CD133* клеток Подвергшиеся трансфекции векторов С0133+клетки, разводили до концентрации 200-500 клеток в 0,5 мл 0,9% раствора NaCl и помещали в заранее приготовленную среду Methoculttm SFb" Н4236 (Stemcell Technologies Inc. Vancouver, Canada), состоящую из 2,6% метилцеллюлозы, содержащей в 80 мл: 10% бычьего альбумина - 10 мл, инсулина - 1 мг, трансферрина человеческого 20 мг, 2-меркаптоэтанола - 0,1 мл, L-глютамина - 1 мл и, соответственно, метилцеллюлозы - 40 мл. Кроме того, к этой среде мы добавляли цитокины: IL-3 (5 нг/мл, R&D Systems), IL-6 (5 нг/мл, R&D Systems), SCF (50 нг/мл, R&D Systems), ЕРО-эритролоэтнн (]х1000). Подготовленные клетки добавлялись к 5 мл метилцеллюлозы, находящейся в 6-ти ячеечном планшете (Falcon, BD) по 200 мкл в каждую ячейку. Тщательно перемешав содержимое, планшет помещали в инкубатор

18

(+37°С, 5% С02), после чего ежедневно в течение 20 дней наблюдали за появлением гемопоэтических колоний, содержащих YFP-положительные клетки, при помощи флуоресцентного микроскопа подсчитывалось среднее количество КОЕ в лунках, содержащих, различные векторы. Проводился ежедневный подсчет количества КОЕ-Э, КОЕ-Г, КОЕ-ГМ, КОЕ-ГЕММ в трех ячейках: Notch 1, Notch 2 и контроль.

Оценка способности CD13S*CD3<T и CDH3~CD3'tклеток ПК человека обеспечивать донорский гемопоэз у NOD/SCID мышей

В исследовании использовались мыши с комбинированным иммунодефицитом nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID). Выделенные клетки подвергали стимуляции цитокинами при помощи инкубирования в растворе питательной среды DMEM complete с цитокинами IL-3 (5 нг/мл R&D Systems), IL-6 (5 нг/мл, R&D Systems), SCF (50 нг/мл, R&D Systems) в течение 24 часов. После инкубации клетки доводились до концентрации 2,5x104 в 1 мл для внутривенного введения в хвостовую вену мыши. Перед проведением трансплантации, мыши были сублетально облучены источником у-излучения в дозе 350 рад. Сразу после облучения, в вену хвоста вводился 1 мл раствора, содержащего 2,5x104 клеток. Каждая мышь получала только один вид клеток: CD34+ CD 133", CD34±CD133+ или CD34TD133". Клетки, полученные из одного образца ПК, вводились 6 мышам: по 2 мыши получали соответствующую субпопуляцию клеток. Всего было проведено 60 трансплантаций из 10 образцов ПК. Схема эксперимента представлена на рис. 3.

Результаты трансплантации оценивались через 8 недель путем определения в костном мозге мышей, полученном при промывании костей бедра и голени, С045+клеток крови человека (использовали антиген CD45 РегСР) при помощи проточной цитофлюориметрии.

Протоколы клинического применения препаратов Г-КСФ

В настоящем исследовании использовались препараты Г-КСФ - граноцит (леногастрим), нейпоген (филгастрим) и лейкостим (филгастрим) - в рамках трех протоколов клинического применения Г-КСФ:

1. Мобилизация С034+клеток в периферическую кровь с целью их сбора для аллогенной трансплантации.

2. Мобилизация гемопоэтических стволовых клеток в периферическую кровь с целью их сбора для аутологичной трансплантации.

3. Лечение медикаментозной цитопении после курсов высокодозной цитотоксической полихимиотерапии у детей с онкологическими и онкогематологическими заболеваниями.

Получение CD34* клеток периферической крови Периферические С034+клетки получали с помощью процедуры цитафереза на гемосепараторе «Baxter CS-3000 Plus». Мононуклеарную фракцию клеток крови выделяли на градиенте гравитации. Процедуры цитафереза после периода мобилизации проводили ежедневно до тех пор, пока суммарное количество С034+кяеток не достигало уровня, обеспечивающего наиболее быстрое приживление трансплантата.

Минимально допустимым количеством С034+клеток для трансплантации считали их число более 2х10б/кг массы реципиента. Оптимальным считали количество С034+клеток более 5х106/кг массы тела реципиента. Для достижения такого уровня требовалось различное число процедур цитафереза (от 1 до 4). Ежедневное введение препаратов Г-КСФ продолжали и в дни проведения сеансов цитафереза.

Определение концентрации цитокинов и ферментов в сыворотке крови Для количественного определения концентрации G-CSF, IL-8, ММР-9, ММР-2, TIMP-1, TIMP-2 в сыворотке крови проводилась реакция ИФА «сэндвич» типа. В качестве ферментных меток использовалась пероксидаза. В настоящем исследовании использовались следующие наборы реагентов: «Human ММР-9 (total)», «Human/mouse MMP-2(total)», «Human TIMP-2» («Quantikine©» R&D Systems Inc., USA), «Human TIMP-1» (Biosource International Inc., USA), «Human IL-8 ELISA Kit II» (BD OptEIA™ BD Biosciences Pharmingen, USA).

Статистическая обработка Статистическую обработку данных производили для вариационных рядов с параметрическим распределением с помощью однофакторного дисперсионного анализа и оценкой по критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони и тесту Ньюмена-Кейлса; для вариационных рядов с непараметрическим распределением с помощью критерия Крускалла-Уоллеса и критерия Манна-Уитни. Для оценки равенства долей использовали Z-тест. Корреляционный анализ проводили с использованием уравнений линейной регрессии и по методу Спирмена для рядов с непараметрическим распределением. При расчетах использовали программы Excel 2002 Pro, STATISTKA for Windows 8.0, Biostat for Windows.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Развитие банков ПК привело к пониманию необходимости стандартизации методов сбора, тестирования, процессинга и хранения ПК, так как основной целью банков ПК является обеспечение материала для использования в клинических целях. Работа в рамках воспроизводимых технологий, тем не менее, демонстрирует множество особенностей, учет которых может позволить повысить их эффективность, и, соответственно, получить более дееспособный с точки зрения последующей трансплантации материал. Учитывая тот факт, что состав клеток ПК в определенной степени является отражением процессов, протекающих во время беременности и родов, в настоящем исследовании предпринята попытка охарактеризовать состав ПК у доношенных новорожденных при различных состояниях и особенностях течения беременности и родов, в зависимости от пола и массы тела новорожденного, а также ряда технологических параметров сбора ПК. Результаты исследования морфологического состава ПК при помощи автоматического

гематологического анализатора представлены в табл. 2.

Таблица 2. Клеточный состав ПК (М ± ш) (п=1013)

\\'ВС (х10'/л) N£1! (%) яви (хЮ'/л) ЬУМ (%) ЬУМ (хЮ'/л) м<ж (%) мок (хЮ'/л)

17,24 ±0,16 48,48 ±0,25 8,41 ±0,10 32,45 ±0,22 5,54 ± 0,06 14,02 ±0,11 2,42 ±0,03

ЕОв (%) ЕОЭ (хЮ'/л) ЕАв (%) ВАв (хЮ'/л) иве (х101г/л) нвв (г/л) нет (%)

3,83 ± 0,06 0,64 ± 0,01 1,22 ±0,02 0,23 ±0,01 4,40 ±0,01 157,4 ± 0,46 32,29 ± 0,14

МСУ (Фл) мен (пг) мснс (г/л) ЩШ (%) РЬТ (хЮ'/л) МРУ (фл)

105,81 ±0,12 35,82 ± 0,04 338,6 ±0,24 12,71 ± 0,02 307,54 ±1,97 7,18 ±0,02

В процессе работы оказалось, что при определении параметров ПК при помощи автоматического гематологического анализатора и при микроскопии окрашенных мазков обнаруживается разница в ряде показателей (табл. 3.)

Таблица 3. Клеточный состав ПК при подсчете клеток при помощи автоматического анализатора и светооптической микроскопии_-_.' - ■_

Вид анализа Лейкоцитарная формула (%)

гаи ЬУМ MON ЕОв ВАБ

Автоматический анализ п 341 341 341 341 341

М±т 47,48 ± 0,44 32,76 ±0,36 14,64 ±0,24 3,86 ±0,10 1,25 ± 0,04

Ручной подсчет п 341 341 341 341 341

М±т 57,48 ±0,47 28,66 ±0,43 9,95 ±0,19 3,28 ±0,13 0,61 ± 0,03

Р <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001

При анализе причин различий решающим являются технологические особенности аппаратов для определения клеточного состава крови, в которых за показатели нормы

взяты параметры периферической крови здоровых взрослых, имеющей существенные качественные отличия от ПК (Solves Р., 2005; Bradley М.В., 2005). Основными отличиями ПК от крови взрослого являются большее содержание лейкоцитов, наличие нормобластов и большая осмотическая резистентность эритроцитов. Показано, что при большем содержании в ПК лейкоцитов увеличивается степень различий в определении в ПК базофилов (г=-0,44; р<0,0001), лимфоцитов (г=-0,25; р<0,0001), нейтрофилов (г=0,22; р=0,00005). При большем содержании в ПК нормобластов увеличивается степень различий в определении в ПК лимфоцитов (г=-0,4; /КО,0001), нейтрофилов (г=0,2743; /К0,0001) и базофилов (г=-0,3598; р<0,0001). Полученные закономерности не зависели от сроков гестации, степени разведения образца ПК антикоагулянтом, времени, прошедшего после родов до начала сбора и обработки ПК.

Анализ образцов ПК при помощи автоматического гематологического анализатора позволил провести качественное определение нормобластов. Наличие нормобластов отражалось в виде «флага» - «urbes». Количественное содержание нормобластов, определенное при помощи световой микроскопии оказалось 5,62±0,33/100 лейкоцитов (п=339).

Иммунологическая характеристика лейкоцитов ПК показала следующие значения количества субпопуляций лимфоцитов в ПК (табл. 4).

Количество С034+клеток в ПК определялось с помощью проточной цитометрии и оценивалось как 2 параметра: процент от общего количества лейкоцитов и абсолютное количество СШ4+клеток в 1 мл ПК. Всего было изучено 618 образцов ПК (табл. 5).

Таблица 5. Количество СР34+клеток в ПК доношенных новорожденных

Параметры CD34 (%) CD34 (107мм3)

Количество наблюдений 618 618

Среднее значение 0,827 0,100

Медиана 0,700 0,078

Стандартное отклонение 0,562 0,079

Стандартная ошибка среднего 0,023 0,003

Минимальное значение 0,120 0,009

Максимальное значение 4,520 0,714

Таблица 4. Иммунологическая характеристика лейкоцитов ПК доношенных новорожденных (% от всех лейкоцитов) (п=62)

Субстрат Маркеры Параметры 3+ 19* 4+ 3+4+ 8+ 3+8+ 45+14+ НЬА-Ш1 СШ6+56+

ПК Среднее значение 18,83 4,84 9,41 13,45 2,68 5,66 7,37 13,03 6,05

Стандартная ошибка среднего 0,96 0,26 1,15 0,74 0,22 0,36 0,49 0,58 0,69

ПК (концентрат) Среднее значение 21,01 5,72 9,08 14,76 3,28 5,82 8,75 17,34 8,54

Стандартная ошибка среднего 1,02 0,31 0,46 0,79 0,23 0,4 0,58 3,05 0,92

Р 0,12 0,032 0,79 0,23 0,06 0,77 0,07 0,17 0,034

Таблица 6. Субпопуляции СШ4+ клеток ПК доношенных новорожденных (п=47)

Субстрат Субпопуляции С034+кпеток Параметры 34*133+ 34+133" 34+38" 34~38+ 34+61" 34"61+ 34+71+ 34"71+ 34*621/ 34+44+ 34+117+

ПК Среднее значение 0,46 0,31 0,77 36,86 0,45 14,99 0,96 23,8 0,59 0,82 0,49

Стандартная ошибка среднего 0,05 0,02 0,09 1,38 0,06 1,26 0,1 0,24 0,06 0,07 0,05

ПК (концентрат) Среднее значение 0,44 0,56 0,74 35,64 0,42 16,43 0,79 22,12 0,61 0,9 0,46

Стандартная ошибка среднего 0,05 0,16 0,08 1,57 0,05 0,68 0,09 1,07 0,06 0,08 0,04

Р 0,78 0,124 0,8 0,56 0,7 0,32 0,2 0,13 0,81 0,46 0,64

Таблица 7. Субпопуляции СР133+ клеток ПК доношепных новорожденных (п=47)

Субпопуляции СП133+ клеток Параметры 133+106+ 133+106" 133106+ 133+31+ 133^31+ 31+62Е+

ПК Среднее значение 0,48 0,25 0,28 0,88 75,15 1,65

Стандартная ошибка среднего 0,07 0,02 0,03 0,11 2,13 0,3

ПК (концентрат) Среднее значение 0,46 0,23 0,54 0,8 68,55 2,46

Стандартная ошибка среднего 0,06 0,02 0,07 0,08 2,59 0,57

Р 0,83 0,48 0,1 0,55 0,052 0,21

В работе оценивалось количество СП34+С0133+ клеток, как наиболее ранних предшественников гемопоэза. Количество СО 133н клеток и их субпопуляций: С0133+С031+ - эндотелиальные предшественники, С0133+СШ06+ - мезенхимальные стволовые клетки. Оценивалось количество пролиферируюших гемопоэтнческих предшественников по уровню экспрессии трансферринового рецептора (СШ1) (табл. 6,7).

Колониеобразующая активность ПК оценивалась как эффективность клонирования (на 105 МЫС) и абсолютное количество а 1 мл ПК, Также подсчитывался процент колоний каждого вида от их общего количества. В ПК показано преобладание наиболее ранних гемопоэтических клеток-предшественник о в - КОЕ-ГЕММ - 35%. (рис.4).

35,33

19,28 18,72

1Г-ГГТ •И** -7 1~Ч ;к , ... мш 13,69 12,99

КОё-пгих КОЕ-ГМ КОЕ-Г КОЕ-М КОЕ-Эр

Рисунок 4. Распределение колоннеобразующих единиц ПК.

В практике трансплантации ГСК принято ориентироваться на количество С034тклеток, как определяющее пригодность трансплантационного материала для обеспечения донорского гемопоэза у реципиента. Однако, популяция С034+клеток гетерогенна (табл. 6) и содержит большое количество более дифференцированных клеток, не обеспечивающих пролиферацию и экспансию у реципиента. При оценке взаимосвязи количества СР34+клеток и колоннеобразующей активности ПК получена зависимость колониеобразующей активности от количества СП34+клеток, но полученные связи достаточно слабые (табл. 8).

Таблица 8. Взаимосвязь количества С О 34* клеток и колониеобразующей активности ПК _ _

В 1 мл образца Процент С034+ клеток Абс. кол-во СШ4+ клеток

т Р г Р

КОЕ-пж 0,231 0,013 0,3888 0,001

КОЕ-ГМ 0,1659 0,0764 0,4285 0,001

КОЕ-Г 0,0611 0,5164 0,2887 0,0018

КОЕ-М 0,1142 0,2241 0,3197 0,0005

КОЕ-Э 0,069 0,4636 0,1023 0,2767

КОЕ-сумма 0,1777 0,0575 0,4187 0,001

При определении ЭК (на №' МЫС) наблюдаются практически те же тенденции, однако, связи более слабые.

Технологические манипуляции с ПК в процессе сбора и процессии га предполагают увеличение количества погибших клеток и уровня спонтанного апоптоза, который определяет популяцию клеток, определяющихся иммунологическими методами как СОЗД^ клетки. которые, однако, не могут учитываться как функционально активные ГСК. В работе определен уровень некроза и спонтанного апоптоза клеток ПК после всех процедур сбора и процесс;! л га перед криоконсервацией. Показано, что уровень некроза лейкоцитов ПК составил 3,49±0,28 %, при этом, уровень некроза лимфоцитов был ниже значений всех лейкоцитов (2,99±0,34 %) и статистически значимо отличался от уровня некроза моноцитов и гранулоцитов, составлявшего 5,59±0,72 % и 6,12±0,65 % соответственно {¿><0,0001) (рис. 5), Уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов составил 9,18±1,19 %, при этом, уровень спонтанного апоптоза лимфоцитов, был также ниже значений в общей группе (4,32±0,7 %), и также статистически значимо отличался от уровня спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов, составившего 15,3 5±2,02 % и 28,22±2,51 % соответственно (/><0,0001) (рис. 5) и не отличался от показателей периферической крови здоровых доноров.

■ Лимфоциты □Макоциты □ Гранул опиты

Рисунок 5. Уровень некроза и спонтанного апоптоза лейкоцитов ПК.

Такое соотношение показателей позволяет предположить большую жизнеспособность ли м фот: и то в, что представляется позитивным результатом, учитывая тот факт, что популяция гемопоэтических стволовых клеток находится в пуле лимфоцитов. Это предположение подтверждается положительной корреляционной взаимосвязью количества лимфоцитов и колониеобразующей активности ПК (табл. 9).

Таблица 9. Взаимосвязь количества лимфоцитов и колониеобразующей активности ПК _

Параметр Лимфоциты

Г Р

KOE-mix 0,399 0,00

КОЕ-ГМ 0,4993 0,00

КОЕ-Г 0,4467 0,00

КОЕ-М 0,4995 0,00

КОЕ-Э 0,2068 0,0018

КОЕ-сумма 0,5634 0,00

Уровень спонтанного апоптоза и пролиферативный потенциал - это противоположные процессы, поддерживающие стабильность клеточного состава, и, как следствие, нормальное функционирование любой биологической системы. Следовательно, эти процессы, при адекватной способности организма реагировать на внешние и внутренние раздражители, предположительно, должны быть однонаправленными, чтобы обеспечить компенсацию повышения гибели клеток биологическая система должна усилить процессы деления и созревания клеток, напротив, при повышенной пролиферации клеток, необходимо обеспечить их адекватное «умирание», чтобы клеточная масса не вышла из-под контроля. Мы изучили взаимосвязь уровня спонтанного апоптоза лимфоцитов и колониеобразующей активности клеток ПК, и оказалось, что отмечается положительная корреляционная взаимосвязь между уровнем спонтанного апоптоза лимфоцитов и колониеобразующей активностью ПК, что доказывает однонаправленность процессов апоптоза и пролиферации (табл. 10).

Таблица 10. Взаимосвязь уровня апоптоза лимфоцитов и колониеобразующей активности ПК_ ___

Параметр Доля лимфоцитов на разпых стадиях апоптоза

г Р

KOE-mix 0,4427 0,0208

КОЕ-ГМ 0,2948 0,1525

КОЕ-Г 0,3537 0,0828

КОЕ-М 0,3003 0,1447

КОЕ-Э -0,1221 0,544

КОЕ-сумма 0,3677 0,0706

В работе обнаружены различия клеточного состава ПК в зависимости от пола и массы тела новорожденного, совпадающие с данными литературы (Cairo M.S., 2005; Aravita S., 2005). Результаты исследования количества клеток и их основных параметров при помощи автоматического гематологического анализатора проанализированы в ПК 1004 доношенных новорожденных. При анализе половых различий отмечено, что у девочек уровень лейкоцитов выше (17,74±0,24х109/л; М±т), чем у мальчиков

(16,8±0,23хх109/л; />=0,005). Преимущественно за счет нейтрофилов, которых у девочек больше, а лимфоцитов, моноцитов и эозинофилов меньше. В абсолютных количествах у девочек также больше нейтрофилов, а меньше эозинофилов (табл. 11).

Таблица 11. Количество лейкоцитов в зависимости от пола новорожденного

Пол \\'ВС (х10'/л) Лейкоцитарная формула (%)

1Ш) ЬУМ М(Ж ЕОв ВАЯ

Девочки п 480 480 480 480 480 480

М±т 17,74 ±0,24 49,97 ± 0,35 31,57 ±0,31 13,75 ±0,15 3,48 ±0,07 1,26 ±0,03

Мальчики п 524 524 524 524 524 524

М±т 16,80 ±0,23 47,10 ±0,34 33,23 ± 0,30 14,29 ±0,17 4,16 ±0,09 1,18 ±0,03

Р 0,005 <0,001 <0,001 0,018 <0,001 0,06

Пол \VIiC (хЮ'/л) Лейкоцитарная формула (хЮ'/л)

N£11 1ЛТУ1 МОК ЕОв ВАБ

Девочки п 480 480 480 480 480 480

М±т 17,74 ±0,24 8,93 ± 0,14 5,53 ± 0,09 2,44 ±0,04 0,60 ±0,01 0,24 ±0,01

Мальчики п 524 524 524 524 524 524

М±т 16,80 ±0,23 7,94 ±0,12 5,54 ± 0,09 2,40 ±0,05 0,68 ± 0,02 0,22 ± 0,01

Р 0,005 < 0,001 0,938 0,537 < 0,001 0,158

Количество эритроцитов (4,33±0,02х1012/л) и содержание гемоглобина (155,1±0,7 г/л) у девочек меньше, чем у мальчиков (4,46±0,02х1012/л; 159,5±0,6 г/л; р<0,0001). Гематокрит у девочек (31,79±0,2 %) также меньше, чем у мальчиков (32,76±0,19 %; р=0). Различий в эритроцитарных индексах (МСУ, МСН, МСНС, 1Ш\У) в зависимости от пола новорожденного не обнаружено. Количество тромбоцитов у девочек (314,87±2,98х 109/л) больше, чем у мальчиков (300,72±2,62х109/л; /><0,0001). Средний размер тромбоцитов не имеет различий. Из 611 новорожденных, для которых были получены данные относительно количества С034+клеток в ПК, мальчиков было 314 (51,39%), девочек - 297 (48,61%). При сравнении полученных результатов выявлено, что у мальчиков С034+клеток больше в процентном (0,88±0,03 - мальчики; 0,77±0,03 - девочки; />=0,01) и в абсолютном количестве (0,106±0,005 - мальчики; 0,095±0,005 - девочки; р=0,002) (табл. 12).

Таблица 12. Количество СБ34+клеток в ПК доношенных новорожденных

мальчиков и девочек

Пол ребенка Параметры СШ4 (%) СШ4 (107мм3)

Девочки Количество наблюдений 297 297

М±т 0,769 ±0,032 0,095 ± 0,005

Мальчики Количество наблюдений 314 314

М±т 0,883 ± 0,032 0,106 ±0,005

Р 0,01 0,002

При анализе данных колониеобразующей активности ПК выявлено, что у мальчиков статистически значимо больше количество КОЕ-ГМ в 1 мл ПК (745,71±65,11 - девочки;

12)6,7=185,45 - мальчики; р=0,022), и имеется тенденция к увеличению (статистически незначимо) количества КОЕ-М (691,64±78,6 - девочки; 1052,1±252,09 - мальчики; /т=0,19) и общего количества колоний (4883,13±455 - девочки; 6070,8±691 - мальчики; /И),16) в 1 мл образца ПК. При анализе эффективности клонирования (на 105 МЫС) у мальчиков также больше КОЕ-Г (18,44±1,31 - девочки; 22,42±1,6 - мальчики; р=0,058). В процентном соотношении имеется тенденция к увеличению количества КОЕ-ГЕММ (р=0,11) у девочек, и уменьшению у них КОЕ-ГМ 0=0,13) и КОЕ-Э (р=0,14).

Связь клеточного состава с массой тела новорожденного очень слабая: статистически значимая положительная корреляция с массой тела ребенка обнаружена для нейтрофилов (г=0,12; /5=0,0002), эозинофилов (г=0,14; /7=0,0001), базофилов (г=0,12; />=0,0002) и гематокрита (1=0,2; /КО,0001). Все новорожденные были разделены на хруппы согласно массе тела при рождении: <2500 г; 2500-3000 г; 3000-4000 г и >4000 г. При сравнении полученных данных отмечено, что с увеличением массы тела ребенка при рождении увеличивается количество леикоцитов - от 15,52±0,59х107л в группе с массой тела 2,5-3 кг до 17,51±0,44х10'/л в группе с массой тела >4 кг (р=0,01). Также увеличивается абсолютное количество нейтрофилов и эозинофилов (р<0,0001 и />=0,004, соответственно), а количество моноцитов уменьшается (р<0,0001). В процентном соотношении у детей с большей массой тела нейтрофилов и эозинофилов больше, а лимфоцитов и моноцитов меньше. Концентрация гемоглобина и количество эритроцитов не менялись в зависимости от массы тела ребенка при рождении. Отмечено увеличение гематокрита с увеличением массы тела ребенка (от 28,48±2,47% при массе тела <2,5 кг до 33,86±0,39 % при массе тела >4 кг; /КО,0001). Отмечено также уменьшение МСНС (р<0,0001) и увеличение МРУ (р=0,025) с увеличением веса ребенка.

Можно предположить, что выявленные различия клеточного состава ПК в зависимости от пола новорожденного связаны с тем, что новорожденные мальчики крупнее новорожденных девочек. Действительно, средняя масса тела при рождении была несколько выше у мальчиков (3629,24±18,25г; диапазон 2270-5000г), чем у девочек (3467,23±18,17г; диапазон 2300-4650г) (р<0,0001). При разделении на группы по массе тела при рождении мальчиков было больше в группе с массой тела > 4000 г (р=0,001), а девочек в группе 2500-3000 г (р=0,008). Однако, при исследовании групп сходных по массе тела при рождении, различия в параметрах крови между мальчиками и девочками сохранялись. Таким образом, различия в клеточном составе ПК в зависимости от пола не могут быть объяснены различной массой тела мальчиков и девочек при рождении.

При изучении количества СВ34+клеток в ПК новорожденные были разбиты на 3 группы: масса при рождении 2,5-3 кг - 48 детей; 3-4 кг - 477 детей и >4 кг - 84 ребенка.

Статистически значимых различий в процентном и абсолютном содержании С034+клеток не обнаружено. Однако имеется тенденция к увеличению абсолютного количества СШ4+клеток в ПК при увеличении массы ребенка при рождении, что, возможно, связано с увеличением общего количества лейкоцитов. При проведении регрессионного анализа достоверных корреляционных взаимосвязей количества С034"к,четок в ПК и массы ребенка при рождении не получено (очень слабая положительная взаимосвязь абсолютного количества С034 клеток с массой ребенка при рождении повторяет таковую для общего количества лейкоцитов в ПК -т = 0,144,/? = 0,0004).

Также не получено никаких статистически значимых корреляционных взаимосвязей между колон и еоб разу ющей активностью и массой ребенка при рождении. Отмечена тенденция к увеличению общего количества колоний (статистически незначимо) в 1 мл ПК с увеличением массы ребенка при рождении за счет увеличения всех видов колоний Доля разных клеток-предшественников не меняется (рис. 6, 7).

2,5-3 «г 3-4 кг >4 кг

Рисунок 6. Общая эффективность клонирования ПК в зависимости от массы новор ержденн ого.

■■ ♦ КОЕ-пт ■'■ КОЕ-ГМ —КОЕ-Г —* - КОЕ-М ■■■»■■" КОЕ-Эр

Рисунок 1. Общая эффективность клонирования ПК в зависимости от массы новорожденного.

Анте- и интранатальные факторы, оказывающие влияние на состав и характеристики клеток ПК

Можно предположить влияние на клеточный состав ПК анемии, инфекционных заболеваний и патологии почек, перенесенных матерью во время беременности. При анализе влияния анемии, обнаруженной у 10 женщин в I половине беременности, у 24 - во II половине и у трех - на протяжении всей беременности из 391 обследованной роженицы, никаких статистически значимых различий клеточного состава ПК не обнаружено. К сожалению, нет данных о степени снижения гемоглобина у этих женщин и о проводимой медикаментозной коррекции. Интересно отметить, что при наличии анемии во П половине беременности, отмечается тенденция (р=0,097) к увеличению содержания эозинофилов в ПК, что может быть следствием реакции на прием матерью препаратов железа с целью коррекции анемии.

При анализе влияния инфекционных заболеваний обнаружено статистически значимое снижение концентрации гемоглобина (р=0,02) и уровня гематокрита (р<0,0001) при наличии инфекций на протяжении всей беременности. Имеется также тенденция к уменьшению количества эритроцитов (р=0,076) в этой группе. Отмечено также увеличение абсолютного количества лимфоцитов при инфекционных заболеваниях во II половине беременности (р=0,044), что, вероятно, связано с возможной вирусной этиологией инфекций. К сожалению, данных об этиологии заболеваний и о проводимой медикаментозной терапии нет.

В ПК детей, матери которых имели патологию почек, отмечается увеличение концентрации гемоглобина (165,4±3,80 г/л - с патологией почек; 157,0±0,80 г/л - без патологии; р=0,012) и количества эритроцитов (4,55±0,1х1012/л - с патологией почек; 4,39±0,02хЮ12/л - без патологии; р= 0,05). Также отмечается тенденция к увеличению МСУ при наличии патологии почек у матери (107,13±0,73 фл - с патологией почек; 105,63±0,2 фл - без патологии; р=0,09).

Параметры ПК не зависели от угрозы прерывания беременности, количества околоплодных вод.

Наличие многоплодной беременности предполагает большее напряжение физиологических систем для адекватного обеспечения роста и развития плодов. Установлено, что при многоплодной беременности количество лейкоцитов в ПК новорожденных (нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов) меньше, чем при одноплодной. Со стороны параметров красной крови и тромбоцитов различий не обнаружено.

Различия клеточного состава ПК и крови новорожденного первых суток, у которого отмечается снижение количества многих клеточных элементов, позволяет предположить,

что повышенное содержание многих клеточных элементов в ПК может быть следствием мобилизации, сходной с мобилизацией периферической крови взрослых, вызванной родовым . стрессом, а различия количества клеток ПК в зависимости от пола новорожденного - различной способностью девочек и мальчиков толерироватъ родовой стресс. Исходя из этого предположения, могут быть оценены многие особенности течения беременности и родов, как причины усиления или ослабления родового стресса. Известно, что прохождение плода по естественным родовым путям является более сильным стрессовым фактором по сравнению с оперативными родами путем кесарева сечения. При сравнении показателей ПК в зависимости от способа родоразрешения показано, что при оперативных родах путем кесарева сечения наблюдается меньшее количество лейкоцитов (14,29±0,57х109/л против 17,38±0,17х109/л; /><0,0001), за счет меньшего количества нейтрофилов (р<0,0001), лимфоцитов (р=0,02), моноцитов (р=0,003) и эозинофилов (р=0,002). Также при оперативных родах отмечается меньшее количество эритроцитов (4,3±0,05х1012/л против 4,4+0,01 х 10|2/.т; ¿>=0,04) и тромбоцитов (284,88±9,55х109/л против 308,59±2,01х109/л; р=0,015). МРУ при этом имеет статистически значимо большее значение (р=0,039). Доля мальчиков и девочек в группах оперативных и физиологических родов не отличалась. При исследовании групп мальчиков и девочек по отдельности все вышеописанные различия для способов родоразрешения сохранялись.

Известно, что повторные роды проходят с меньшей нагрузкой для плода, поскольку родовые пути более приспособлены для его прохождения. Установлено, что при увеличении количества родов в анамнезе уменьшается количество лейкоцитов в ПК (18,14±0,22х109/л - первые роды; 16,22±0,25х109/л - 2-е; 15,44±0,61х109/л - 3-й и 15,1±1,37х109/л - 4-е и более; ¿><0,0001). Также уменьшается абсолютное количество нейтрофилов (с 8,91±0,13х109/л при первых родах до 6,86±0,65х109/л при 4-х; р<0,0001); абсолютное количество лимфоцитов (с 5,8±0,09х109/л при первых родах до

при 4-х; ¿ко,0001); абсолютное количество моноцитов (с при первых родах до 2,1±0,09х109/л при 3-х; ¿КО,0001) и абсолютное количество базофилов (с 0,24±0,01х109/л при первых родах до 0,16±0,01х109/л при 3-х; ¿>=0,017), что подтверждает гипотезу о снижении стрессового воздействия при последующих родах. Параметры красной крови и тромбоцитов в зависимости от количества родов в анамнезе не изменялись. Процент мальчиков и девочек среди групп, составленных по порядковому номеру родов, не отличался. В каждой из групп девочек и мальчиков было приблизительно поровну. При исследовании групп, составленных только из девочек и

мальчиков, различия сохранялись, что исключает влияние пола новорожденного на различия клеточного состава ПК в зависимости от количества родов в анамнезе.

Несмотря на относительную точность определения гестгщионного возраста, при анализе показателей ПК обнаружено, что абсолютное количество нейтрофилов увеличивается с увеличением срока гестации (6,78±0,63х109/л - 37 неделя; 8,94±0,64х109/л - 41 неделя; £>=0,005). Общее количество лейкоцитов также увеличивается, однако, недостоверно (/?=0,107). В процентном соотношении с увеличением срока гестащш увеличиваются нейтрофипы (р=0,004), а моноциты уменьшаются (р=0,0()1). Количество эритроцитов и гемоглобина не изменяется в зависимости от срока гестшши, однако, при увеличении гестационного возраста отмечается уменьшение МСН (36,37±0,21 пг - 37 неделя; 35,77±0,21 пг - 41 неделя; р=0,028) и МРУ (7,38±0,16 фл - 37 неделя; 7,02±0,08 фл -41 неделя; р=0,032).

Акте- и интранаталъные факторы, оказывающие влияние на количество

С034*клеток ПК доношенных новорожденных Количество С034+клеток повторяет закономерности, обнаруженные для лейкоцитов ПК. Обнаружена тенденция к уменьшению процентного содержания и статистически значимое уменьшение абсолютного количества С034+ клеток при четвертых и более родах (рис. 8).

0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0

1-е роды

Рисунок 8. Количество СР34+ родов.

2-е роды 3-й роды 4-е роды

клеток ПК в зависимости от порядкового номера

При сравнении количества С034^клеток в ПК при физиологических и оперативных родах статистически значимых различий не получено. Тенденция к уменьшению абсолютного количества (Ш34 клеток в ПК при родах путем кесарева сечсния, вероятно, связана с уменьшением общего количества лейкоцитов в данной группе.

На количество СП34+клеток не оказьшали влияния анемия, патологии почек, угроза прерывания беременности у матери, многоплодие, внутриутробная задержке развития плода, количество околоплодных вод, степень зрелости плаценты и гестационный возраст.

Особенности клеточного состава ПК доношенных новорожденных при различных состояниях острой и хронической гипоксии плода Гипоксия является мощным стрессовым фактором, и, предположительно, должна приводить не только к повышению количества эритроцитов с компенсаторной целью, но и к повышению количества других клеток крови, как следствие цитокиновой мобилизации в ответ стресс. В работе были проанализированы ряд состояний острой и хронической гипоксии плода. Установлено, что при обвитии пуповины повышается количество эритроцитов 4,55±0,05х1012/л против 4,35±0,02х101:/л (р<0,0001) концентрация гемоглобина - 162,2±1,7 г/л против 156,1±0,9 г/л (р=0,001), уровень гематокрита -32,98±0,46 % против 31,86±0,24 % (р=0,027). Кроме того уровень гематокрита повышается при увеличении длительности периода изгнания (р=0,009). Количество СБ34+клсток статистически значимо выше при острой гипоксии плода и ниже при хронической гипоксии плода. Эффективность клонирования и уровень спонтанного апоптоза снижаются при ФПН. При внутриутробной гипоксии повышается как эффективность клонирования, так и уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов ПК. При острой гипоксии плода жизнеспособность лейкоцитов и гемопоэтических стволовых клеток ПК не изменяется. При повышении степени зрелости плаценты, эффективность клонирования имеет тенденцию к снижению, а уровень спонтанного апоптоза к повышению.

Внугриутробная гипоксия приводит к увеличению количества нормобластов в ПК -11,94±3,11/100 лейкоцитов против 5,42±0,53/100 лейкоцитов (р<0,0001). Увеличения количества нормобластов в ПК при острой гипоксии в родах не вьивлено 6,21 ±0,66/100 лейкоцитов против 5,32±1,25/100 лейкоцитов (р=0,55). На количество нормобластов влияет только состояние хронической гипоксии плода. Состояние острой гипоксии плода не отражается повышением количество нормобластов в ПК, поскольку система кроветворения не успевает ответить пролиферацией эритроидных предшественников. Состояния, косвенно приводящие к острой гипоксии плода в родах (длительность периода изгнания и длительность безводного промежутка), также не оказывают влияния на количество нормобластов в ПК.

У 206 образцов ПК было подсчитано количество нормобластов и определено количество СШ4+клеток. Образцы были поделены на 2 группы: менее 15 нормобластов на 100 лейкоцитов и более 15 нормобластов на 100 лейкоцитов. При сравнении получены статистически значимые различия в абсолютном количестве С034+ клеток в ПК

(0,11±0,007 -- при менее 15 нормобластов; 0,17±0,032 - при более 15 нормобластов; р=0,034). При проведении регрессионного анализа получена достоверная положительная корреляционная взаимосвязь абсолютного количества СБ34+клеток в ПК и количества нормобластов в ПК (г=0,3352; />=0,001). Кроме того, получена статистически значимая положительная корреляционная взаимосвязь между количеством нормобластов в ПК и количеством КОЕ-ГМ (г=0,6778; р=0,0004), КОЕ-Г (г=0,7833; /7=0,00001) и КОЕ-М (г=0,7811; />=0,00001), а также суммарным количеством КОЕ (г=0,6367; /7=0,0011). Таким образом, обнаруженное рядом авторов (Rubinstein P. et. al., 2005), влияние количества нормобластов в ПК на скорость приживления миелоидного ростка кроветворения после трансплантации стволовых гемопоэтических клеток ПК нашло биологическое подтверждение в нашей работе.

Исходя из этого, количество нормобластов, статистически значимо взаимосвязанное с количеством С034+клеток и колониеобразующей активностью, рекомендуется учитывать, как дополнительный, благоприятный признак при проведении отбраковки ПК на этапе первичного тестирования в банках ПК.

Влияние технологических особенностей сбора на клеточный состав ПК Можно предположить, что эффективность сбора ПК для хранения трансплантационного материала зависит от ряда технологических особенностей сбора. При сравнении параметров ПК в случае сбора до отделения плаценты и после существенных различий не получено. Количество С034+клеток в ПК также не отличалось. Только гематокрит был несколько ниже при сборе ПК после отделения плаценты (29,27±1,02 % и 32,35±0,14 %, соответственно; />=0,007). Средняя масса плаценты в группе (п=990) составила - 580,57±4,92 г, диапазон: 77,0 г - 1138,0 г. При анализе полученных данных корреляционной взаимосвязи между параметрами ПК, включая количество CD34+mieTOK, и массой плаценты не получено.

По времени между родами и забором ПК все образцы (п=1006) разделены на 3 группы: <5 минут; 5-10 минут и более 10 минут. Никаких различий в параметрах ПК, включая количество С034+клеток, между этими группами не найдено.

Влияние процедуры лейкоконцентрации на клеточный состав ПК Проводимая для уменьшения объема ПК крови процедура лейкоконцентрации, основанная на седиментации эритроцитов раствором гидроксиэтилкрахмала, влияет на соотношение количества клеток ПК, так как, вероятно, степень потери различных субпопуляций лейкоцитов отличается. Количество клеток концентрата ПК, определенное при помощи автоматического анализатора клеток крови, представлено в табл. 13.

Виды клеток Параметры \УВС N£11 1Л'М М(Ж Е08 ВАЗ

Количество 1004 1004 1004 1004 1004 1004

Среднее значение 39,00 18,30 13,10 5,20 1,10 0,20

Медиана 41,06 19.66 14,27 5,58 1,28 0,28

Стандартное отклонение 15,86 8,78 6,38 2,71 0,81 0,54

Стандартная ошибка среднего 0,48 0,27 0,19 0,08 0,02 0,02

Минимальное значение 8,00 0,70 2,60 0,60 0,00 0,00

Максимальное значение 106,00 60.40 43,70 24,60 10,30 8,59

I

Показано, что при провезший процедуры концентрации ПК, доля яейтрофилоа не изменяется, доля лимфоцитов статистически значимо повышается (рис. 9) за счет того, что доля моноцитов, эозинофилов и базофилов статистически значимо снижается (рис. 10). Это, по-видимому, связано с большей потерей этих клеток при концентрации.

р = 0,7

Иэ (про филы Лимфоциты

□ Пуповиннаякровь

э Концентрат

Моноциты Эозинофилы Базофипы

Рисунок 9. Доле нейтрофилов и лимфоцитов в ПК и концентрате мононуклеарной фракции ПК.

□ Пу повинна я крозь

иКонцентрат

Рисунок 10. Доля моноцитов, эозинофилов и базофилов в ПК и концентрате мононуклеарной фракции ПК.

Абсолютное количество субпопуляций лимфоцитов {СОЗ+клетки, С019+клетки, СОЗ+С1>Гклеткн, СГО+СП8'клетки, С016+С056+клетки, НЪА-О^клетки) также повышается в процессе процедуры концентраций, но статистически незначимо (табл. 4,),

Степень повышения повторяет динамику лимфоцитов, определенную при помощи автоматического счетчика клеток крови.

Полученные данные продемонстрировали отсутствие влияния процедуры концентраций ПК на количество и состав СОЗ+лимфоцитов в сочетании со статистически значимым увеличением после концентрации доли МС-клеток и СЭЗ 3+СО13+клеток. Доля натуральных киллеров (КК) СВ16+С056+клеток среди ядросодержащих клеток ПК составила 5,97±0,67 % и статистически значимо увеличилась после процедуры концентрации - 8,54±0,91 % (/>=0,027). Такое соотношение связано с тем, что при проведении процедуры концентрации лейкоцитов ПК, происходит статистически незначительная потеря лейкоцитов вместе с седиментирующимися эритроцитами, за счет эозинофилов, базофилов и моноцитов и, следовательно, относительное количество ЫК-клеток и миелоидных предшественников возрастает. Количество СОЗ+лимфоцитов, опосредующих развитие РТПХ, в результате процедуры лейкоконцентрации практически не менялось и составило 17,9±1,44 % и 19,2±1,4 % от всех ядросодержащих клеток соответственно. Количество и соотношение субпопуляций СОЗ+лимфоцитов -СОЗ+С04+клеток и С03+С08+клеток - в процессе концентрации также не изменилось и составило: до концентрации СБЗ+С04+клетки - 12,62±1,12 %, СПЗ+С08+клетки -5,62±0,53 %; после концентрации С03+С04+клетки - 13,23±1,12 %, СБЗ+СВ8+клетки -5,52±0,48 % от всех ядросодержащих клеток. Относительное количество предшественников миелопоэза - С033+СП13+клет0к составило 12,5±0,76 % и статистически значимо увеличилось 15,82±0,81 % (р=0,005) после процедуры выделения, что может быть связано с большей потерей гранулоцитов при проведении процедуры выделения. Доля активированных лимфоцитов (СБ25+СШ0+) в результате лейкконцентрации также не изменилась и составила 0,40±0,08 % до выделения и 0,38±0,09 % после выделения. Количество СШ4+клегок не увеличилось и составило 8,65±1,58 % до выделения и 9,11±1,76 % после. Количество СШ5+клеток имело тенденцию к снижению, по-видимому, вследствие большей потери при процедуре выделения по сравнению с остальными субпопуляциями лейкоцитов и составило 39,32±3,45 % до выделения и 35,23±3,26 % после. Относительное количество С034+клеток после проведения процедуры лейкоконцентрации статистически значимо увеличилось (1,23±0,27 % против 0,83±0,023 %, р<0,0001), тогда как абсолютное значение не изменилось (100±3,1 в мкл против 96±2,8 в мкл, р=0,72). Количество субпопуляций стволовых клеток после процедуры концентрации практически не изменилось и составило: СП34+С0133+клетки -0,44±0,05 %, СШЗЗ+СОЮ6+клетки - 0,4б±0,0б %, С0133*С031+клетки - 0,80±0,08 % от общего числа ядросодержащих клеток. Количество субпопуляций С034+клеток в

процессе процедуры выделения также не изменилось и составило: С034+СБ61+клетки -0,45±0,07 %; С034+С038+клетки - 0,77±0,12 %; С034+С1Э7Гклетки - 0,9б±0,22 % - до процедуры выделения и СБ34+С061+клетки - 0,42±0,08 %; С034+СБ38+клетки -0,74±0,15 %; С034+СИ71 +клетки - 0,79±0,19 % - после. Количество СВ34~СШ8+клеток и СВ34~С1>71+клеток в процессе процедуры выделения также не изменилось и составило: СБ34"СП38+клетки - 14,99±2,27 %; СГО4~С071+клетки - 23,8±3,22 % - до процедуры выделения и СШ4ТВ38+клетки - 16,43±2,83 %; С034~СП71+клетки - 22,12±3,14 % -после.

Прогнозирование эффективности процедуры лейкоконцентрации ПК

Проведение процедуры лейкоконцентрации приводит к потере абсолютного количества лейкоцитов. При анализе потерь оказалось, что средняя эффективность выделения лейкоцитов в концентрат составила 71,45%, общего количество мононуклеарных лейкоцитов - 74,05%, лимфоцитов - 76,48%, а количество эритроцитов, оставшихся после их редукции составило - 28,56%. Учитывая тот факт, что клеточный состав и характеристики ПК зависят от ряда анте- и интранатальных факторов, а также пола, массы тела новорожденного, а ряд этих характеристик, вероятно связан со степенью мобилизующего эффекта родового стресса, можно предположить, что эффективность процедуры лейкоконцентрации, может зависеть от тех же факторов. Оказалось, что практически не оказывают влияния на эффективность процедуры лейкоконцентрации масса тела и пол новорожденного, способ родоразрешения, длительность безводного периода, количество околоплодных вод, масса плаценты, наличие внутриутробной гипоксия плода, наличие в анамнезе матери угрозы прерывания беременности в первой половине, эритроцитарные индексы ПК. Эффективность выделения увеличивается при наличии в анамнезе матери неспецифических инфекционных заболеваний во второй половине беременности и увеличение длительности второго периода родов. Эффективность выделения снижается при наличии внутриутробной гипоксии плода.

Показано, что методика сбора ПК после отделения плаценты увеличивает выделение \УВС, в том числе ЬУМ и МЫС. Увеличение временного промежутка между сбором ПК и началом ее обработки улучшает выделение У/ВС, включая ЬУМ. С другой стороны увеличение времени между родами и сбором ПК более 5 минут снижает эффективность выделения \УВС и ГСК из ПК. Обнаружено, что эффективность лейкоконцентрации растет с увеличением процента содержания антикоагулянта в образце. Максимальная эффективность выделения ЬУМ и МКС наблюдается при «чистом» весе образца ПК от 40 до 120 грамм и содержании антикоагулянта в образце в пределах 20-40%. Следует отметить, что выделение всей лейкоцитарной фракции недостоверно уменьшается с

увеличением «чистого» веса образца более 60 грамм, тогда как эффективность выделения LYM и MNC снижается при содержании антикоагулянта в образце менее 20% и более 40%.

Эффективность редукции RBC из образца ПК в процессе его концентрации подчинена следующим закономерностям: снижение эффективности редукции RBC с увеличением порядкового номера родов, при наличии в анамнезе неспецифических инфекционных заболеваний в первую половину беременности, с увеличением процента содержания антикоагулянта в образце, при увеличении в исходной ПК процента CD34+igictok и увеличении эффективности выделения в концентрат WBC; повышение эффективности редукции RBC при наличии в анамнезе матери неспецифических инфекционных заболеваний во второй половине беременности и угрозы прерывания беременности во второй половине и в течение всей беременности, при увеличении срока гестации, при весе плаценты более 700 грамм, с повышением веса новорожденного и с увеличением времени между родами и сбором ПК более 5 минут, при увеличении «чистого» веса образца ПК, при высоких цифрах Ht и инициального лейкоцитоза ПК, в том числе количества LYM и MON. Кроме того, эффективность редукции RBC тем выше, чем больше процент некроза LYM ПК и процент выделения в концентрат LYM и MNC, а также при использовании аппаратного метода обработки ПК.

Сравнение метода автоматического выделения клеток (МАВК) и метода двойного центрифугирования (МДЦ)

При сравнении полученных результатов исследований выявлено, что при МАВК эффективность выделения лейкоцитов в целом слегка меньше, чем при МДЦ. Однако эффективность выделения мононуклеаров и лимфоцитов значительно выше, чем при методе двойного центрифугирования. При этом эффективность редукции эритроцитов в полученном концентрате при МАВК значительно меньше, чем при МДЦ. При МДЦ выявлено наличие очень слабой достоверной отрицательной корреляционной взаимосвязи между эффективностью редукции эритроцитов и временем от момента сбора крови до ее обработки; между инициальным количеством лейкоцитов и эффективностью выделения лейкоцитов и эффективностью редукции эритроцитов; слабая положительная достоверная корреляционная взаимосвязь с эффективностью редукции эритроцитов, слабая положительная достоверная корреляционная взаимосвязь между процентным содержанием ангикоагулянта в образце и эффективностью выделения лейкоцитов и очень слабая с эффективностью выделения мононуклеаров и лимфоцитов; достоверная средняя отрицательная корреляционная зависимость между «чистым» весом образца и эффективностью редукции эритроцитов; средняя достоверная отрицательная

корреляционная взаимосвязь между гематокритом ПК и эффективностью редукции эритроцитов и слабая отрицательная достоверная корреляционная взаимосвязь с эффективностью выделения остальных клеток.

При МАВК клеток выявлено наличие очень слабой достоверной отрицательной корреляционной взаимосвязи между процентом эффективности выделения мононуклеаров и лимфоцитов и временем между родами и сбором крови; слабая достоверная положительная корреляция между эффективностью выделения лейкоцитов и временем от момента сбора крови до ее обработки; очень слабая достоверная отрицательная корреляционная взаимосвязь между инициальным количеством лейкоцитов и эффективностью редукции эритроцитов (как и в МДЦ); средняя положительная достоверная корреляционная взаимосвязь между процентным содержанием антикоагулянта в образце и эффективностью выделения лейкоцитов (как и в методе двойного центрифугирования); средняя отрицательная корреляционная взаимосвязь между «чистым» весом образца и эффективностью редукции эритроцитов, а также достоверная слабая отрицательная корреляционная взаимосвязь между «чистым» весом образца и эффективностью выделения лейкоцитов; средняя достоверная отрицательная корреляционная взаимосвязь между гематокритом ПК и эффективностью редукции эритроцитов и слабая отрицательная достоверная корреляционная взаимосвязь с эффективностью выделения лейкоцитов.

Создание векторной конструкции на базе ВИЧ-1

Перед нами стояла задача добиться создания вируса, который мог бы обеспечить эффективный перенос активной формы гена в ГСК, которые обладают очень выраженной устойчивостью против проникновения в их геном чужеродной и вообще какой-либо ДНК, обеспечив при этом его корректную работу. К тому же, для объективной оценки результатов процент положительных клеток должен быть достаточно высоким (25% и выше). В настоящей работе удалось добиться поражения вектором 32% CD133+ клеток.

Работа по созданию данных векторов была сопряжена с рядом трудностей, которые в первую очередь заключались в достижении достаточного уровня проникновения вируса в клетку и правильной работы встраиваемого генетического материала. Это было достигнуто путем создания модифицированного протокола (описан в разделе «Материалы и методы») и ряда стандартных генно-инженерных приемов, что, в конечном счете, позволило создать клон ДНК на базе ВИЧ-1, который включает в себя кассету, содержащую 2 гена: YFP и Notch 1 или 2.

Вставка: pBs -Ni -IY/Not 1+ Xho I~ 3.8 kb

Обработка EcoRI дает фрагменты 12 kb + 2.4 kb + 1.6 kb

Обработка Not I + Xho I дает фрагменты 12 kb + 3.8 kb

Рисунок 11. Схематическое изображение вектора: pHIV - cycTl - IRES -eYFP/Not I + Xho I ~ 12.0 kb.

Notch 2 ГАС-2.3 kb

Not I

Вставка: pBs -N2 - IY/ Not II + Xho I ~ 3.8 kb

Обработка EcoRI дает фрагменты 12 kb + 2.4 kb + 1.6 kb

Обработка Not I + Xho I дает фрагменты 12 kb + 3.8 kb

Рисунок 12. Схематическое изображение вектора: pHTV - cycTl - IRES -eYFP/Not II + Xho I -12.0 kb.

N«!

Рисунок 13. Схематическое изображение вектора: pHIV- cycTl - 1RES -eYFP/Not + Xho I ~ 13 kb.

После того, как векторы были сформированы окончательно, они получили названия:

1. Плазмидный ВИЧ - Notch 1 (Plasmid human immunodeficiency virus - pHIV-Nl-IY)

(рис. 11).

2. Плазмидный ВИЧ - Notch 2 (Plasmid human immunodeficiency virus - pHIV-N2-IY) (рис. 12).

3. Плазмидный ВИЧ - внутренний рибосомальный промоторный участок - желтый флюоресцирующий протеин (Plasmid human immunodeficiency virus - internal ribosomal entry site - yellow fluorescent protein - pHIV-IRES-eYFP) - негативный контроль (рис. 13).

Для возможности манипулирования С0133+клетками требовалось выделить чистую популяцию С0133+клеток из ПК. При оценке чистоты полученной популяции при помощи проточной цитофлюориметрии показано, что среднее содержание С0133+клеток в продукте сепарации составило 97,37±1,53 %. Соотношение CD133+CD34+ и CD133+CD34"KneTOK в продукте сепарации CD133+клеток в среднем составило 1:1, то есть приблизительно 50% С0133+клеток экспрессировали на мембране CD34. Эффективность иммуномагнитной сепарации зависит только от количества мононуклеарных клеток в ПК (г=0,86,/к0,001)

В нашем исследовании возможность получения чистой популяции СЭ133+клеток преследовала собой цель исследования репопуляционной способности двух полученных субпопуляций клеток (CD34+CD133~ и CD34~CD133+) при проведении трансплантации NOD/SCID мышам.

Показано, что СВ133+клетки обладают большей способностью обеспечивать донорский гемопоэз, по сравнению СТ) 133~С034+клетками (2,23±0,26 % и 0,68±0,14 % соответственно, р<0,001). В случае трансплантации негативного контроля СВ133ТЮ34~ клетки, человеческие СБ45+клетки не обнаруживаются (табл. 14).

Таблица 14. Содержание СР45+клеток человека в костном мозге ЖЮ/БСГО мышей через 8 недель после трансплантации стволовых клеток ПК (п=60)_

№ опыта Количество трансплантиро ванных клеток Всего мышей в опыте Костный мозг КСШ/вСШ мышей через 8 недель, содержание СВ45* клеток (%). (в каждом опыте среднее зпачение у 2 мышей)

CD133+CD34± CD133"CD34+ CD133XD34"

1 2.5x10" 6 2,22 0,58 0,00

2 2.5x10" 6 0,95 1,51 0,00

3 2.5x10" 6 1,45 0,28 0,00

4 2.5x10" 6 3,08 0 0,00

5 2.5x10" 6 3,24 1 0,00

6 2.5x10" 6 1,97 0,67 0,00

7 2.5x10" 6 2,71 0,54 0,00

8 2.5x10" 6 1,17 0,72 0,00

9 2.5x10" б 2,95 1Д9 0,00

10 2.5x10" б 2,56 0,32 0,00

Среднее 2,23 ± 0,26 0,68 ±0,14 0,00

Такая тенденция может свидетельствовать о большей эффективности восстановления донорского кроветворения при трансплантации СВ133+клеток, однако низкое количество СП45+клеток и небольшое количество опытов не позволяет утверждать этого и требует продолжения эксперимента с увеличением кратности обследования трансплантированных мышей на более ранних и более поздних сроках.

Доля CD45+kh6Tok человека в костном мозге мыши, вопреки ожиданиям, оказалась очень низкой (0,5-3,5 %), как в случае трансплантации CD133+CD34+, так и в случае трансплантации CD 13 3~CD34+mieTOK. Этот факт требует дальнейшего изучения, однако можно предположить следующие причины этого. Самостоятельное восстановление кроветворения и жизнеспособность мышей, получивших трансплантацию CD133~CD34~ клеток, может говорить о вытеснении донорского гемопоэза восстанавливающимся гемопоэзом хозяина при поздних сроках наблюдения. Для подтверждения или опровержения этого предположения требуется дальнейшее продолжение эксперимента с определением СБ45+клеток в костном мозге мышей на более ранних сроках.

При определении колониеобразующей активности (Л3133+клеток ПК оказалось, что гены Notch 1 и 2 оказывают супрессивное действие, независимо от линейной принадлежности колоний, что, как правило, заканчивается их гибелью. YFP-позитивные

колонии, с момента их формирования до 3-4 дней, выглядели вполне жизнеспособными, но затем наблюдалось достаточно резкое угасание их роста и формирования новых колоний. Затем в течение 3-4 дней наблюдался распад и гибель колонии в целом. Колонии негативного контроля напротив, сохраняли способность к росту еще достаточно продолжительное время - около 7-10 дней. Ген Notch 2 оказывал большее супрессивное воздействие, чем ген Notch 1 (рис. 14).

Такая же тенденция наблюдалась при определении уровня спонтанного апоптоза СШЗЗ+клеток. Клетки, инфицированные геном Notch 1, имели уровень спонтанного апоптоза 15,78±3,27 % , a Notch 2 - 29,31±5,64 %, р<0,05. В контрольной популяции этот показатель не превышал 2 % (/><0,01).

I

>х S X

с о к / »

ш к fm f 4 4 i

У £ f / « * ✓ • * * N »

Общее кс СП С о о £ • i » f * / \ > \ \ »

TU J » \ > 4 ♦ « ч \

1 2 3 4 5 в 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 13

' коктропь 0 0 20 30 45 95 120 160 200 230 285 310 300 290 270 250 235 210

- «■ ■ Notchl 0 0 15 22 33 60 95 130 185 187 239 254 231 195 140 90 40 0

— • Notch2 0 0 В 15 17 29 43 64 94 115 133 141 124 94 60 21 0 0

Дни наблюдения

Рисунок 14. Динамика роста YFP-положительных колоний в среде метилцеллюлозы.

Таким образом, в результате работы удалось создать векторы, способные поражать неделящиеся клетки-мишени с положительным результатом 32% (по данным проточной цитометрии), что достаточно для объективной оценки результатов. Создание экспериментальной модели трансфекции С0133+клеток позволило начать экспериментальную работу, посвященную изучению действия генов семейства Notch на функциональную активность ГСК человека, в результате которой, получены данные свидетельствующие о возможном негативном регулировании генами семейства Notch пролиферации СО!33+клеток. Возможно, in vivo регуляция заключается в сдерживании

клеточного роста и деления, что, скорее всего, удерживает стволовые клетки от дальнейшей линейной дифференцировки и является одним из механизмов поддержания постоянного самообновления.

Сравнительная характеристика клеточного состава ПК и Г-КСФ мобилизованной

периферической крови Известно, что ГПС не может отождествляться с кровью новорожденного даже в первые часы жизни, поскольку особенности клеточного состава ПК являются быстропроходящими последствиями родового стресса, а сыворотка ПК обладает выраженной цитокиновой активностью (Bailie К.Е., et al., 1994). Учитывая тот факт, что состав мобилизованной при помощи препаратов Г-КСФ крови в значительной степени отличается от физиологического состояния, что обусловлено действием множества вторичных посредников, многие из которых являются также естественными эффекторами стрессового состояния, представляется интересным сравнить клеточный состав ПК с кровью доноров после применения препаратов Г-КСФ. Сравнение клеточного состава ПК и крови доноров показало, что Г-КСФ мобилизованная периферическая кровь содержит статистически значимо большее количество лейкоцитов за счет статистически значимого большего количества нейтрофилов (табл. 15), в то время как количество эозинофилов и базофилов не различается, а количество лимфоцитов, напротив больше в ПК.

Таблица 15. Клеточный состав Г-КСФ мобилизованной крови и ПК (хЮ'/л)

Параметр ПК Периферическая кровь после Г-КСФ Р

п=1013 п=23

Лейкоциты 17,24±0,16 32,8±2,2 <0,0001

Нейтрофилы 8,41±0,1 27,6±2,0 <0,0001

Лимфоциты 5,54±0,06 2,9±0,4 <0,0001

Моноциты 2,42±0,03 2,2±0,4 0,28

Эозинофилы 0,64±0,01 1,2±0,21 <0,0001

Базофилы 0,23±0,01 0,17±0,04 0,37

Мобилизованная при помощи Г-КСФ периферическая кровь содержит больше СОЗ+лимфоцитов и меньше СБ1б+С05б+ (№С) клеток (табл. 16).

Таблица 16. Содержание субпопуляций лимфоцитов в Г-КСФ мобилизованной и ПК

Параметр ПК Периферическая кровь после Г-КСФ Р

11=62 п=15

Доля (%) от лимфоцитов

СБЗ+ 56,03±1,67 67,8±3,04 0,002

СБЗ+СВ4+ 39,44±1,4 48,76±2,76 0,004

СВЗ+СБ8+ 15,65±0,81 19,27±2,07 0,065

СШ9+ 14,61±0,62 17,87±3,33 0,115

СШ6+С05б+ 13,85±1,83 8,62±0,96 0,169

Абсолютное количество (х106/мл)

СБЗ+ 2,07±0,15 2,94±0,08 0,002

С019+ 0,55±0,06 0,56±0,05 0,928

СБЗ+С04+ 1,44±0,1 1,89±0,07 0,016

СШ+Сй8+ 0,68±0,07 0,78±0,08 0,453

СШб+СР56+ 0,76±0,11 0,36±0,05 0,048

Если рассматривать ПК с точки зрения идентичного механизма мобилизации при помощи того же набора цитокинов, концентрация которых в ПК повышается в ответ на родовой стресс, то, вероятно, такая картина может натолкнуть на мысль, что терапевтическая концентрация Г-КСФ в периферической крови выше, чем в пуповинной и, соответственно, выше уровень остальных цитокинов, участвующих в процессе мобилизации. Тем не менее, количество СБ34+клеток в Г-КСФ мобилизованной крови статистически значимо ниже, чем в ПК (табл. 17), за счет всех исследованных субпопуляций (табл. 18), что дает возможность предположить, что аналог мобилизации в процессе родового стресса является не единственной причиной повышенного количества СБ34+клеток в ПК. Это предположение отчасти подтверждается тем, что эффективность клонирования Г-КСФ мобилизованной периферической крови также ниже, чем в ПК, а ГСК, в основном, представлены гранулоцитарно-макрофагальными предшественниками (табл. 19).

Таблица 17. Количество СГШ^клеток в Г-КСФ мобилизованной крови и ПК

Параметры С034 (%) СШ4 (в мм3)

Количество СБ34+клеток в ПК доношенных новорожденных

Количество наблюдений 618 618

Среднее значение 0,827 ±0,023 100 ±3

Количество СШ4+клеток в Г-КСФ мобилизованной периферической крови здоровых доноров

Количество наблюдений 23 23

Среднее значение 0,24 ±0,09 44 ±10

Р р<0,0001 р<0,0001

Таблица 18. Количество субпопуляций СБ34+ и СБ133+клеток Г-КСФ мобилизованной крови и ПК ___-

Параметр ПК Периферическая кровь после Г-КСФ Р

11=47 п=15

Доля (%) от лимфоцитов

С034+С0133+ 0,46±0,05 0,09±0,03б <0,0001

СБ34'С0133" 0,31 ±0,02 0,12±0,031 <0,0001

С034+С038" 0,77±0,09 0,19±0,042 <0,0001

ст>34+ат+ 0,96±0,1 0,22±0,065 <0,0001

СС34+С062Ь+ 0,59±0,06 0,15±0,045 <0,0001

С1)34+СВ44+ 0,82±0,07 0,26±0,068 <0,0001

С034+СШ17+ 0,49±0,05 0,16±0,026 <0,0001

СС34+СБбГ 0,45±0,058 0,1б±0,53 0,356

СШ4+СБ38+ 0,77±0,086 0,31±0,08б 0,006

СШЗЗ+СБ10б+ 0,48±0,07 0,1±0,042 0,004

СШЗЗ+СШ1+ 0,88±0,11 0,7±0,24 0,45

Абсолютное количество /мкл

СБ34+СВ133+ 59±7 3±0,9 <0,0001

С034+СП61+ 58±8 5±1,1 <0,0001

СШ4ТСВ38+ 103±16 9±1 0,002

С034+СВ71+ 131±20 6±0,9 <0,0001

С0133+СШ06Т 58±8 3±0,9 <0,0001

СООЗ'ССЗГ 116±17 20±2 0,002

Таблица 19. Эффективность клонирования Г-КСФ мобилизованной крови и ПК

Параметр ПК Периферическая кровь после Г-КСФ р

п=22б п=15

ЭК (х 103 эксплантированных мононуклеарных клеток)

Суммарное количество 116,8±4,47 19,2±3,6 <0,0001

КОЕ-ГЕММ 41,95±2,2 1,3±0,6 <0,0001

КОЕ-ГМ 23,22±1,38 7,1±1,2 0,003

КОЕ-Г 20,44±1,04 4,б±0,6 <0,0001

КОЕ-М 15,93±1,14 3,8±0,6 0,007

КОЕ-Э 15,28±1,26 2,0±0,5 0,007

Количество клеток-предшественников в 1 мл

Суммарное количество 5490,2±419,3 478,б±112 0,002

КОЕ-ГЕММ 1789±121,9 38±6 <0,0001

КОЕ-ГМ 1144±117,1 181±24 0,036

КОЕ-Г 988,8±101,9 114±21 0,028

КОЕ-М 875,7±13б 94+18 0,141

КОЕ-Э 692,8±7б,4 .46±11 0,03

Соотношение клеток-предшественников

КОЕ-ГЕММ 35,33±1,35 7,9±1,2 <0,0001

КОЕ-ГМ 19,28±0,75 37,8±4,7 <0,0001

КОЕ-Г 18,72±0,77 24,5±3,8 0,067

КОЕ-М 13,69±0,87 20,2±3,7 0,065

КОЕ-Э 12,99±0,88 10,6±2,9 0,495

Уровень спонтанного апоптоза клеток Г-КСФ мобилизованной крови и ПК статистически значимо не различался, имея, однако, тенденцию к значительному снижению в Г-КСФ мобилизованной крови (табл. 20). Этот факт может быть связан с тем, что ПК перед началом тестирования проходила определенные технологические этапы сбора и транспортировки в БСК, тогда как периферическую кровь у доноров тестировали сразу после сбора, а Г-КСФ, известный как мощный антиапоптотический фактор (РЫ1рой №. Е1 а!., 1997; Ма1апз!а КТА., й а!., 2002), приводит к выбросу в циркуляцию наиболее жизнеспособных клеток. При этом уровень спонтанного апоптоза С034+клеток, подавляющая часть которых (96,6±1,2 %) находится в Со фазе клеточного цикла, был наиболее низким и не различался (табл. 20).

Таблица 20. Уровень спонтанного апоптоза клеток Г-КСФ мобилизованной крови и

ПК

Параметр ПК Периферическая кровь после Г-КСФ Р

п=440 п=15

Апоптоз лейкоцитов (%) 9,18±1,19 3,4±0,6 0,387

Лимфоцитов 4,32±0,7 3,6±0Д5 0,855

Моноцитов 15,35±2,02 3,8±0,72 0,309

Гранулоцитов 28,22±2,51 2,51±0,67 0,069

СО 34+ клеток 2,12±0,09 2,74±0,56 0,229

При сравнении уровня Г-КСФ в периферической крови и в ПК оказалось, что в ПК уровень Г-КСФ составляет 14,8±2,2 пг/мл (п=45), что не превышает нормальный уровень сывороточного Г-КСФ в периферической крови. При клиническом использовании препаратов Г-КСФ в дозе 5-10 мкг/кг в сутки в течение 5 суток, уровень сывороточного Г-КСФ в крови у доноров возрастает приблизительно в 1000 раз. Таким образом, уровень Г-КСФ в сыворотке ПК доношенных новорожденных не отличается от нормального уровня Г-КСФ в сыворотке здоровых доноров, что в сочетании с данными, свидетельствующими об увеличении количества лейкоцитов и СВ34+клеток в ПК при наличии ряда осложнений беременности и родов, а также физиологических состояний при нормальном течении родов, удлиняющих родовой стресс, позволяет предположить изменение уровня других цитокинов и ферментов, участвующих в Г-КСФ индуцированной мобилизации лейкоцитов и С034+клеток. При изучении уровня 1Ь-8 в сыворотке ПК и Г-КСФ мобилизованной периферической крови было показано, что статистически значимое повышение концентрации 1Ъ-8 после применения Г-КСФ было отмечено на всех клинических моделях, независимо от степени угнетения кроветворения. При этом,

концентрация IL 8 в сыворотке ПК была статистически значимо выше, чем у здоровых доноров до применения Г-КСФ, но меньше, чем после его отмены (табл. 21).

Концентрация ММР-9 в сыворотке крови также статистически значимо повышается в результате использования Г-КСФ во всех исследованных клинических моделях, в то время как концентрация ММР-9 в сыворотке ПК не отличалась от таковой в крови здоровых доноров до начала использования Г-КСФ (табл. 22).

Таблица 21. Концентрация IL-8 в сыворотке ПК и крови до и после применения Г-

КСФ

Исследуемые группы N Концентрация IL 8 в сыворотке Р

До Г-КСФ После Г-КСФ

Здоровые доноры б 6,07 ± 0,39 47,0 ±6,18 0,022

Мобилизация ГСК у детей с онкогематологическими заболеваниями 10 108,15 ±44,72 569,0 ±159,0 0,013

Лечение медикаментозной цитопении 21 485,0 ± 158,0 И 13,0 ±250,0 0,040

Пуповинная кровь 45 19,83 ± 4,93 0,039*

*- р - сравнение с уровнем здоровых доноров до применения Г-КСФ.

Таблица 22. Концентрация ММР-9 в сыворотке ПК и крови до и после применения

Г-КСФ

Исследуемые группы N Концентрация ММР-9 в сыворотке Р

До Г-КСФ После Г-КСФ

Здоровые доноры 6 225,4 ± 33,6 3333,8 ± 608,2 < 0,0001

Мобилизация ГСК у детей с онкогематологическими заболеваниями 5 175,0 ±79,7 819,4 ±254,7 0,043

Лечение медикаментозной цитопении 10 24,2 ± 7,7 826,5 ±180,3 <0,0001

Пуповинная кровь 45 182,4 ±23,7 0.521*

*- р - сравнение с уровнем здоровых доноров до применения Г-КСФ.

Такое соотношение концентрации мобилизующих цитокинов в сочетании с количеством СВ34+клеток в результате мобилизации и в ПК позволяет предположить, что хотя родовой стресс и позволяет объяснить многие тенденции в изменениях клеточного состава ПК в зависимости от ряда анте- и интранатальных факторов, но, вероятно, не является единственной причиной особенностей ПК.

Сравнительная характеристика клеточного состава концентрата ПК и продукта первого цитафереза клеток Г-КСФ мобилизованной периферической крови здоровых

доноров

В результате использования технологий, предложенных стандартом №1Согс1/РАСТ, получен трансплантационный материал, содержащий ГСК ПК. Учитывая возможность потери и перераспределения количество различных клеток в результате процессинга, концентрат ПК, готовый к криоконсервации был подробно исследовании для определения

количества и жизнеспособности ГСК. Результаты были сравнены с показателями трансплантационного материала, полученного при помощи стандартной сепарации (Baxter CS3000 Plus) периферической крови после проведения курса Г-КСФ у здоровых доноров. Показано, что количество лейкоцитов в продукте цитафереза значительно выше, чем в концентрате ПК (табл. 23), причем представлены они, в основном, лимфоцитами, в отличие от концентрата ПК, половину лейкоцитарного пула которого составляют гранулоциты.

Таблица 23. Клеточный состав трансплантационного материала (хЮ'Умл)

Параметр Концентрат ПК Продукт цитафереза Р

п = 1013 п = 15

Лейкоциты х 10б/мл 39,0±0,48 188,4±16,3 <0,0001

Нейтрофилы х 10б/мл 18,3±0,27 25,8±2,91 <0,0001

Лимфоциты х 106/мл 13,1±0,19 119,3±11,74 <0,0001

Моноциты х 106/мл 5,2±0,08 37,5±4Д <0,0001

Эозинофилых 10б/мл 1,1 ±0,02 2,8б±0,53 <0,0001

Базофилы х 106Умл 0,2±0,02 1,12±0,17 <0,0001

Продукт цитафереза содержит значительно большее количество всех субпопуляций лимфоцитов (табл. 24).

Таблица 24. Субпопуляции лимфоцитов в трансплантационном материале

Параметр Концентрат ПК Продукт цитафереза Р

П = 62 п = 15

Доля (%) от лимфоцитов

CD3* 53,91±1,62 70,0±3,08 <0,0001

CD3+CD4+ 38,15±1,4 4б,2±2,91 0,014

CD3+CD8+ 14,37±0,8 22,1±2,64 <0,0001

CD19+ 16,04±0,69 16,3±2,52 0,889

CD16+CD56+ 15,16±1,57 12,61±1,74 0,444

Абсолютное количество (х Ю^/мл)

CD3 8,29±0,63 82,8±6,24 <0,0001

CD19+ 2,39±0,27 19,4±2,71 <0,0001

CD3+CD4+ 5,72±0,5 56,6±4,63 <0,0001

CD3+CD8+ 2,26±0,23 27,4±3,01 <0,0001

CD16+CD56+ 3,68±0,01 14,6±2,39 <0,0001

Доля СЭ34+клеток была статистически значимо выше в продукте цитафереза, тогда как доля С0133+клеток статистически значимо выше в концентрате ПК. Однако, абсолютное количество ГСК статистически значимо выше в продукте цитафереза Г-КСФ мобилизованной периферической крови (табл. 25).

Таблица 25. Субпопуляции ГСК в трансплантационном материале

Параметр Концентрат ПК Продукт цитафереза Р

п = 47 п = 15

Доля (%) от лимфоцитов

С034+ (*) 1,37±0,029 1,13±0,25 0,44

СВ34+С0133+ 0,44±0,05 0,08±0,029 <0,0001

СЮ4+С0133~ 0,5б±0,1б 0,72±0,029 0,577

С034+С038~ 0,74±0,08 0,86±0,09 0,43

С034+СБ7Г 0,79±0,09 1,02±0,09 0,176

СБ34+С062Ь+ 0,61±0,06 0,87±0,08 0,028

С034ТС044' 0,9±0,08 1,14±0,017 0,165

С034*С0117+ 0,46±0,04 0,1±0,03 <0,0001

С034+С0бГ 0,42±0,05 0,72±0,16 0,02

С034+СБ38+ 0,74±0,074 1,1±0,12 0,018

СШЗЗ+СШ06* 0,46±0,0б 0,21 ±0,08 0,035

сбш+сбзГ 0,8±0,08 0,84±0,22 0,832

Абсолютное количество /мкл

С034т(*) 810±43 1256±126 0,23

СШ4+СО!33+ 196±24 95±28 0,03

СБ34+С061* 198±35 857±112 <0,0001

С034+СБ38+ 353±56 1309±217 <0,0001

СР34+С071+ 383±71 1124±198 <0,0001

СОПЗЧЛЭЮб" 193±2б 250±44 0,28

С0133+СБЗГ 367±46 1001±20б <0,0001

* - для расчетов общего количества СЭ34+клеток в концентрате ПК п = 1095

Таблица 26. Эффективность клонирования трансплантационного материала

Параметр Концентрат ПК Продукт цитафереза Р

п = 178 п = 15

ЭК (х 105 эксплантированных мононуклеарных клеток)

Суммарное количество 104,7±8,3 87,63±12,34 0,555

КОЕ-ГЕММ 35,24±0,6 16,4±3,1 <0,0001

КОЕ-ГМ 22,22±0,82 26,31±3,17 0,17

КОЕ-Г 17,78±0,87 21,2±2,64 0,271

КОЕ-М 12,92±0,78 16,3±2,19 0,223

КОЕ-Э 1б,53±0,33 9,2±1,6 <0,0001

Количество клеток-предшественников в 1 мл.

Суммарное количество 21997±1259 94680±8826 <0,0001

КОЕ-ГЕММ 7158±426 14198±2361 <0,0001

КОЕ-ГМ 4382±228 24356±3117 <0,0001

КОЕ-Г Зб2б±296 19768±2726 <0,0001

КОЕ-М 2607±244 17126±2644 <0,0001

КОЕ-Э 3406±212 12232±1421 <0,0001

Соотношение клеток-предшественников.

КОЕ-ГЕММ 33,65±1,72 18,34±1,93 0,011

КОЕ-ГМ 21,22±0,81 29,4±1,12 0,004

КОЕ-Г 16,98±0,83 23,71±1,17 0,021

КОЕ-М 12,34±0,76 18,23±0,93 0,027

КОЕ-Э 15,78±0,84 10,29±0,86 0,061

При этом эффективность клонирования выше в концентрате ПК, но абсолютное количество клеток предшественников всех линий гемопоэза, в том числе КОЕ-ГЕММ и КОЕ-Э, значительно выше в продукте цитафереза, тем не менее, основное количество клеток-предшественников в нем представлено гранулоцитарно-макрофагальными предшественниками, в отличие от концентрата ПК, где преобладают наиболее ранние предшественники гемопоэза (КОЕ-ГЕММ) (табл. 26).Уровень спонтанного апоптоза остается также ниже в продукте цитафереза Г-КСФ мобилизованной периферической крови в отличие от концентрата ПК, повторяя картину ПК и периферической крови до проведения соответствующих процедур процессинга (табл. 27).

Таблица 27. Уровень спонтанного апоптоза клеток трансплантационного материала

Параметр Концентрат ПК Продукт цитафереза Р

Апоптоз лейкоцитов (%) П,26±1,37 3,8±0,5б 0,054

Лимфоцитов 4,42±0,77 3,4±0,58 0,639

Моноцитов 15,06±2,67 4,2±0,81 0,149

Гранулоцитов 29,17±2,9б 2,7±0,78 0,002

СБ34+ клеток 2,27±0,12 2,61±0,23 0,327

Усовершенствование организационных принципов работы банков пуповинных и периферических клеток для клинических целей Банк ПК (БПК) представляет собой систему взаимодействующих подразделений, направленных на сбор, обработку, тестирование, хранение, отбор и выдачу клеток ПК для проведения аллогенной трансплантации гемопоэтических клеток-предшественников. БПК требует формирования строгой структуры подразделений и технического оснащения, а также ведения документации по всем вопросам, включая технологический процесс (инструкции, протоколы всех манипуляций), обучение персонала, контроль качества.

На основании результатов работы сужены, рекомендованные стандартами КеСогй, стандартные противопоказания для безвозмездного донорства ПК, так как показано, что ряд осложнений течения беременности (угроза прерывания беременности, анемия, много и маловодие, фетоплацентарная недостаточность, внутриутробная гипоксия плода) и родов (удлинение периода изгнания, обвитие пуповиной, гипоксия в родах, приводящая к мекониальному окрашиванию околоплодных вод) не приводят к снижению качества трансплантационного материала.

Полученные референтные значения и степень расхождения значений клеточного состава ПК, полученные с помощью автоматического анализатора клеток крови и микроскопии окрашенных мазков, позволили оптимизировать методику технологических

расчетов при проведении внутренней отбраковки образца ПК и проведении технологических этапов процессинга ПК.

Проведенная оценка эффективности процедуры лейкоконцентрации при различных особенностях течения беременности родов и технологических этапов сбора ПК позволила выработать алгоритм отбора образцов ПК на проведение процедуры автоматической концентрации или выделение методом двойного центрифугирования.

Таким образом, внедрение результатов проведенной работы позволило оптимизировать процесс работы БСК и получать наиболее эффективный трансплантационный материал.

ВЫВОДЫ

1. Установлены референтные значения клеточного состава ПК доношенных новорожденных. При использовании автоматического гематологического анализатора АВХ Регига 60 С+ количество лейкоцитов составило 17,24±0,16х109/л, абсолютное количество нейтрофилов - 8,41±0,10хЮ9/л, лимфоцитов - 5,54±0,06х10%, моноцитов - 2,42±0,03х109/л, эозинофилов - 0,64±0,16х109/л, базофилов - 0,23±0,01х105/л. Количество эритроцитов составило 4,40±0,01х10'2/л, концентрация гемоглобина -157,4±0,4б г/л, количество тромбоцитов - 307,54±1,97хЮ9/л.

2. При определении количества нейтрофилов при помощи микроскопии был получен достоверно больший уровень, чем при определении при помощи автоматического счетчика. Уровень лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и базофилов, наоборот оказался выше при определении с помощью автоматического счетчика. Полученные закономерности зависели от количества лейкоцитов и нормобластов и не зависели от сроков гестации, количества лейкоцитов, степени разведения образца ПК антикоагулянтом, времени, прошедшего после родов до начала сбора и обработки ПК.

3. Количество С034+клеток в ПК составило 0,83±0,023 % от общего числа ядросодержапщх клеток. Количество наиболее ранних клеток-предшественников -СВ34+СЩЗЗ+клеток составило 0,46±0,05 %. Количество мезенхимальных стволовых клеток - СБ133+СШ06+ - 0,48±0,07 %, а эндотелиальных клеток-предшественников -СБ133+С031+ - 0,88±0,11 % от общего числа ядросодержапщх клеток. В ПК преобладают ранние клетки-предшественники гемопоэза (КОЕ-ГЕММ) - 35,3 %.

4. Количество миелоидных предшественников (КОЕ-ГМ, КОЕ-Г, КОЕ-М), также как и количество СБ34+клеток зависит от количества нормобластов в ПК. У новорожденных с большим количеством нормобластов в ПК количество С034+клеток и миелоидных клеток-предшественников статистически значимо выше (р<0,01).

5. Выявлена зависимость показателей ПК от пола новорожденного. Показано, что у девочек уровень лейкоцитов выше, чем у мальчиков. При этом у девочек относительное количество нейтрофилов больше, а лимфоцитов, моноцитов и эозинофилов меньше. У мальчиков СШ4+клеток больше, чем у девочек, как в относительном, так и в абсолютном количестве. Также у мальчиков статистически значимо больше количество КОЕ-ГМ в 1 мл ПК.

6. Внутриутробная гипоксия приводит к снижению количества С034+клеток, эффективности клонирования и повышению уровня спонтанного апоптоза лейкоцитов. При острой гипоксии в родах количество С034+клеток, эритроцитов, концентрация гемоглобина статистически значимо выше, жизнеспособность лейкоцитов и гемопоэтических стволовых клеток ПК не изменяется.

7. Полученный при помощи процедуры концентрации ПК, основанной на процессе седиментации эритроцитов под действием гидроксиэтилкрахмала, трансплантационный материал имеет объем 20,0 мл, содержит 39,0±0,48хЮ6/мл лейкоцитов и 1,37±0,029 % С034+клеток и не отличается от ПК по соотношению основных субпопуляций лейкоцитов и ГСК.

8. Эффективность лейкоконцентрации повышается при сборе ПК после отделения плаценты, удлинении промежутка, между сбором ПК и началом ее обработки, максимальна при массе образца ПК без учета тары от 40 до 120 грамм и содержании антикоагулянта в пределах 20-40 %. Установлено ее снижение при удлинении времени между родами и сбором ПК более 5 минут, при содержании антикоагулянта в образце менее 20% и более 40%. Отмечается общая тенденция увеличения редукции эритроцитов при обработке МАВК по сравнению с МДЦ независимо от анализируемого параметра.

9. Полученный при помощи Г-КСФ индуцированной мобилизации периферической крови и одной процедуры сепарации трансплантационный материал имеет средний объем 83,4±1,4 мл и содержит 188,4±16,3х10б/мл лейкоцитов, представленных, в основном, лимфоцитами, и 1,13±0,25 % СШ4+клеток, не отличается по соотношению субпопуляций ГСК от мобилизованной периферической крови и значительно превосходит по количеству ГСК всех ростков гемопоэза концентрат ПК.

10. Концентрация мобилизационных цитокинов (1Ь-8, в-СЭР, ММР-9) в сыворотке ПК доношенных новорожденных статистически значимо выше, чем в сыворотке крови здоровых доноров, но статистически значимо ниже, чем при мобилизации ГСК Г-КСФ у пациентов с онкогематологическими заболеваниями и при лечении медикаментозной цитопении.

11. Создана эффективная векторная система доставки генетического материала в неделящиеся клетки на базе модифицированного вируса иммунодефицита человека 1 типа с использованием в качестве промежуточной ступени вектора pBluescript SK(+/-). Эффективность трансфекции С0133+клеток составила 32%.

12. Активированные формы генов Notch 1 и Notch 2 вызывают угнетение колониеобразующей активности СБ133+клеток ПК человека, статистически значимое повышение уровня спонтанного апоптоза С0133+клеток ПК человека, причем Notch 2 приблизительно в два раза активнее, чем Notch 1, что позволяет управлять пролиферативной активностью ГСК.

13. При сравнении различных популяций стволовых клеток крови в способности восстанавливать донорский гемопоэз у мышей NOD/SCID, выявилась тенденция преобладания СШЗЗ+клеток над CD133~CD34+ (2,23±0,26 % и 0,68±0,14 % соответственно, р<0,001). В случае трансплантации негативного контроля - CD 133" CD34~KneTKH, человеческие С045+клетки не обнаруживаются, что свидетельствует о перспективах использования CD133TCK для трансплантации.

14. Обосновано и внедрено изменение рекомендованного стандартами NetCord списка противопоказаний для безвозмездного донорства ПК, усовершенствование методики технологических расчетов при проведении внутренней отбраковки образца ПК и проведении технологических этапов процессинга ПК, алгоритм отбора образцов ПК на проведение процедуры автоматической концентрации или выделение методом двойного центрифугирования, что позволило оптимизировать процесс работы БСК и получать наиболее эффективный трансплантационный материал

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные значения показателей клеточного состава ПК рекомендуется использовать в качестве референтных значений при проведении анализа крови у новорожденных первых суток жизни, как при использовании автоматического анализатора клеток крови, так и при подсчете клеток крови при светооптической микроскопии.

2. Данные о расхождении результатов подсчета клеток ПК при помощи автоматического анализатора клеток крови и проведении светооптической микроскопии рекомендуется использовать при технологических расчетах в работе банков ПК.

3. Полученные данные о влиянии особенностей течения беременности и родов на количество СВ34+клеток ПК рекомендуется использовать при определении

показаний и противопоказаний к сбору клеток ПК для безвозмездного донорства.

4. Количество нормобластов статистически значимо взаимосвязанное с количеством CD34+icneTOK и колониеобразующей активностью, рекомендуется учитывать, как дополнительный, благоприятный признак при проведении отбраковки ПК на этапе первичного тестирования.

5. Для изучения приживления и дифференцировки различных популяций гемопоэтических стволовых клеток человека рекомендуется использовать описанную модель на основе трансплантации ГСК предварительно облученным NOD/SCID мышам.

6. Для прогнозирования эффективности мобилизации СВ34+клеток рекомендуется использовать число гранулоцитов периферической крови. Мобилизацию С034+клеток у пациентов в ремиссии онкологических и онкогематологических заболеваний рекомендуется начинать при восстановлении гемопоэза и достижении числа гранулоцитов более 2000/мкл.

7. Рекомендуется дополнить стандартный список противопоказаний и включить в число противопоказаний для безвозмездного донорства такие особенности течения беременности, как анемия беременных во второй половине беременности, срок гестации менее 37 недель и более 40 недель, возраст матери более 40 лет, многоплодие и 4-е и более роды.

8. При массе образца ПК без учета тары более 120 г. следует отдать предпочтение МДЦ.

При процентном содержании антикоагулянта в образце ПК 20-40% выделение концентрата может осуществляться любым способом, при снижении процентного содержания антикоагулянта - методом выбора является МАВК.

9. Процедура сбора ПК, проводившаяся позднее 10 минут после пересечения пуповины, приводит к значительному снижению жизнеспособности клеток ПК. Имеется тенденция к снижению жизнеспособности лейкоцитов и гемопоэтических стволовых клеток ПК при повышении длительности периода ожидания дальнейшей обработки образца ПК более 20 часов после окончания процедуры сбора.

10. Модифицированная авторами векторная система, созданная на базе ВИЧ-1, способная обеспечить эффективный перенос исследуемого генетического материала в неделящиеся клетки, а также показанное эффективное влияние генов Notch 1 и Notch 2 на колониеобразующую активность и уровень спонтанного апоптоза CD133+i«ieTOK рекомендуется использовать при моделировании биологических свойств стволовых клеток человека.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Румянцев С.А., Щигленко Н.А., Иванова А.А., Астрелина Т.А., Осипова Е.Ю., Владимирская Е.Б. Механизмы действия гранулоцитарного колониестимулирукяцего фактора (Г-КСФ) на клетки крови человека. УП Российский Национальный Конгресс «Человек и лекарство», Москва, 2000, стр. 254.

2. Vladimirskaya Е.В., Kaznatcheev K.S., Osipova E.Yu., Astrelina T.A., Roumiantsev S.A. Apoptosis of peripheral blood leukocytes in children survived from acute lymphoblastic leukemia. Acute leukemias IX. Basic Research, Experimental Approaches and Novel Therapies, Springer, 2001, p. 147-152.

3. Румянцев СЛ., Осипова Е.Ю., Астрелина T.A., Сторожаков Г.И., Скоробогатова Е.В., Владимирская Е. Б. Влияние гранулоцитарного колониестимулируюгцего фактора на клеточный состав периферической крови. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2002, Т.1, №1, с.66-69.

4. Румянцев С.А., Осипова Е.Ю., Астрелина Т.А., Плясунова С.А., Кожич Е.А., Скоробогатова Е.В., Владимирская Е.Б. Влияние Г-КСФ на степень и характер мобилизации кроветворных предшественников. Материалы научно-практической конференции «Современные проблемы гематологии и трансфузиологии», Киров 2002, стр. 113.

5. Румянцев С.А., Осипова Е.Ю., Астрелина Т.А., Кожич Е.И., Скоробогатова Е.В., Владимирская Е.Б. Влияние гранулоцитарного колониестимулируюгцего фактора на динамику количества СБ34+клеток периферической крови. Тезисы докладов IX российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 2002, стр. 383.

6. Румянцев С.А., Осипова Е.Ю., Астрелина Т.А., Плясунова С.А., Владимирская Е.Б. Влияние гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на колониеобразующую способность костного мозга и периферической крови у детей со злокачественными новообразованиями. Тезисы докладов IX российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва, 2002, стр. 383.

7. Roumiantsev S.A., Vladimirskaya Е.В., Osipova E.Yu., Astrelina T.A. The effect of G-CSF on the dynamic of hemopoietic precursors in blood and bone marrow. 7th Congress of the European Hematology Association, Florence Italy, 2002, p. 342.

8. Румянцев C.A., Осипова Е.Ю., Астрелина T.A., Сторожаков Г.И., Скоробогатова Е.В., Владимирская Е.Б. Влияние гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на клеточный состав периферической крови. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2002, т. 1. №2, стр. 90.

9. Vladimirskaya Е.В., Kaznatcheev K.S., Osipova E.Yu., Astrelina T.A., Roumiantsev S.A. Apoptosis of peripheral blood leukocytes in children survived from acute lymphoblastic leukemia. Abstract International symposium "Acute leukemias IX. Basic Research, Experimental Approaches and Novel Therapies", Munich, Germany, 2003, p. 252-258.

10. Румянцев С.А., Владимирская Е.Б., Румянцев А.Г. Механизмы Г-КСФ-индуцированной мобилизации гемопоэтических стволовых клеток. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии 2003, т. 2, №4., стр. 5-10.

11. Румянцев С.А., Осипова Е.Ю., Астрелина Т.А., Сторожаков Г.И., Скоробогатова Е.В., Владимирская Е.Б. Влияние гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на клеточный состав периферической крови. X Российский Национальный' конгресс «Человек и лекарство», Москва 2003, стр. 333.

12. Roumiantsev S.A., Osipova E.Yu., Astrelina T.A., Storozhakov G..I., Vladimirskaya E.B. Effect of granulocytic colony-stimulating factor on peripheral blood cells composition. Leukemia Vol. 17, N 3,2003, P.670

13. Roumiantsev S.A., Osipova E.Yu., Astrelina T.A., Plyasunova S.A., Radigina T.V., Vladimirskaya E.B. The mechanism of G-CSF induced CD34+cells mobilization. The Hematology Journal 2003.,Vol.4, Suppl.2, p.18.

14. Румянцев С.А., Осипова Е.Ю., Астрелина Т.А., Владимирская Е.Б. Влияние Г-КСФ на клеточный состав крови и костного мозга человека. Пособие для врачей. Москва. «МАКС Пресс», 2003, 30 с.

15. Roumiantsev S.A., Osipova E.Yu., Astrelina T.A., Storozhakov G..I., Vladimirskaya E.B. The mechanism of G-CSF induced CD34+ mobilization. The Hematology Journal, 2004, vol. 5, suppl. 2, p. 238.

16. Пурбуева Б.Б., Осипова Е.Ю., Астрелина T.A., Владимирская Е.Б., Румянцев С.А. Колониеобразуюгцая активность мезенхимальных стволовых клеток кроветворного микроокружения у детей Тезисы докладов XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва 2005, стр.221

П.Румянцев С.А., Осипова Е.Ю., Астрелина Т.А., Райкина Е.В., Владимирская Е.В. Влияние сывороточного уровня IL-8 и ММР-9 на эффективность Г-КСФ-индуцированной мобилизации С034+клеток. Клиническая лабораторная диагностика, 2005, №9, стр. 45-46

18. Владимирская Е.Б., Майорова O.A., Румянцев С.А., Румянцев А.Г. Биологические основы и перспективы терапии стволовыми клетками. Москва, «Медпрактика-М», 2005,391 с.

19. Румянцев С.А., Абдуллаев Р.Т., Сухин Г.М., Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Плясунова С.А., Сабирова С.Э., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Майорова O.A. Влияние гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на динамику уровня спонтанного апоптоза клеток крови и костного мозга. Вопросы современной педиатрии, 2006, т.5, №1, стр. 4.

20. Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Абдуллаев Р.Т., Плясунова С.А., Сабирова С.Э., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Майорова O.A., Румянцев С.А. Состав пула стволовых клеток пуповинной крови доношенных новорожденных. Вопросы современной педиатрии, 2006, т.5, №1, стр. 79.

21. Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Абдуллаев Р.Т., Плясунова С.А., Сабирова С.Э., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Майорова O.A., Румянцев С.А. Иммунологическая характеристика лимфоцитов пуповинной крови доношенных новорожденных. Вопросы современной педиатрии, 2006, т.5, №1, стр. 79.

22. Румянцев С.А., Астрелина Т.А., Осипова Е.Ю., Абдуллаев Р.Т., Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Плясунова С.А., Майорова O.A., Владимирская Е.Б. Прогностические факторы эффективности Г-КСФ-индуцированной мобилизации С034+клеток. Вопросы современной педиатрии, 2006, т.5, №1, стр. 497

23. Майорова O.A., Яковлева М.В., Румянцев С.А., Подколзина Э.А., Сухин Г.М., Спиридонова Е.И., Лебедева Л.Л. Организационные принципы создания и функционирования банков пуповинной крови (по стандартам NetCord и FAHCT). Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2005, т.4, №2, стр. 7-12.

24. Ипатов С.Е., Румянцев С.А., Sutton R.E., Румянцев А.Г. Создание генных векторов на базе вируса иммунодефицита человека типа 1 для работы со стволовыми гемопоэтическими клетками человека. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2005, т.4, №2, стр. 92-97.

25. Ипатов С.Е., Румянцев С.А., Sutton R.E., Румянцев А.Г. Способность CD133+CD34- и CD133-CD34+ клеток пуповинной крови человека обеспечивать донорский гемопоэз у NOD/SCID мышей. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2005, т.4, №2, стр. 97-102.

26. Боякова Е.В., Румянцев С.А,, Сухин Г.М., Плясунова С.А., Шутьева А.Б., Сабирова С.Э., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Абдуллаев Р.Т., Яковлева М.В., Майорова O.A., Субпопуляции лимфоцитов пуповинной крови доношенных новорожденных, Российский иммунологический журнал, 2006, т. 9., Suppl 3, cip. 134;

27. Волкова Е.В., Румянцев С.А, Сухин Г.М., Плясунова С.А., Шутьева А.Б., Сабирова С.Э., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Абдуллаев Р.Т., Яковлева М.В., Майорова O.A., Количество CD34+ и CD133+ клеток пуповинной крови доношенных новорожденных, Российский иммунологический журнал, 2006, т. 9., Suppl 3, стр. 134;

28. Плясунова С.А., Румянцев С.А., Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Абдуллаев Р.Т., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Яковлева М.В., Майорова O.A. Сравнительный анализ определения клеточного состава пуповинной крови при помощи микроскопии и автоматического счетчика, Российский иммунологический журнал, 2006, т. 9., Suppl 3, стр. 136;

29. Плясунова СЛ., Румянцев С.А., Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Абдуллаев Р.Т., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Яковлева М.В., Майорова O.A. Зависимость клеточного состава пуповинной крови от пола и веса новорожденных, Российский иммунологический журнал, 2006, т. 9., Suppl 3, стр. 114;

30. Румянцев С.А., Плясунова С.А., Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Спиридонова Е.И., Абдуллаев Р.Т., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Яковлева М.В., Майорова O.A. Клеточный состав пуповинной крови в зависимости от осложнений беременности и родов, Российский иммунологический журнал, 2006, т. 9, Suppl 3, стр. 116;

31. Румянцев С.А., Плясунова С.А., Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Спиридонова Е.И., Абдуллаев Р.Т., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Яковлева М.В., Майорова O.A. Клеточный состав пуповинной крови в зависимости от гипоксии во время беременности и родов, Российский иммунологический журнал, 2006, т. 9., Suppl 3, стр. 115;

32. Подколзина ЭЛ., Румянцев СЛ., Плясунова СЛ., Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Спиридонова Е.И., Абдуллаев Р.Т., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Яковлева М.В., Майорова O.A. Факторы, влияющие на эффективность выделения лейкоцитарной фракции пуповинной крови, Российский иммунологический журнал, 2006, т. 9., Suppl 3, стр. 137;

33. Подколзина ЭЛ., Румянцев СЛ., Плясунова СЛ., Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Спиридонова Е.И., Абдуллаев Р.Т., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Яковлева М.В., Майорова O.A. Сравнение эффективности процедуры выделения лейкоцитарной фракции пуповинной крови ручным и аппаратным методом, Российский иммунологический журнал, 2006, т. 9., Suppl 3, стр. 136;

34. Абдуллаев Р.Т., Румянцев СЛ., Сухин Г.М., Плясунова СЛ., Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Подколзина ЭЛ., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Яковлева М.В., Майорова O.A. Уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов, гранулоцитов и CD34+ клеток пуповинной крови, периферической крови и костного мозга, Российский иммунологический журнал, 2006, т. 9., Suppl 3, стр. 133;

35. Румянцев СЛ., Плясунова СЛ., Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Подколзина ЭЛ., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Спиридонова Е.И., Майорова O.A. Клеточный состав пуповинной крови у доношенных новорожденных. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2006, т.5, №4, с.23-29.

36. Румянцев СЛ., Плясунова СЛ., Панков Д.Д., Сахаровская Е.Л., Спиридонова Е.И., Майорова O.A. Клеточный состав пуповинной крови в зависимости от пола и массы тела новорожденных. Российский педиатрический журнал, 2006, №6, стр. 39-46.

37. Румянцев СЛ., Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Панков Д.Д., Сахаровская Е.Л., Майорова O.A. Состав лейкоцитарного пула и гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови доношенных новорожденных. Российский педиатрический журнал, 2007, №1, стр. 14-19.

38. Румянцев СЛ., Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Плясунова СЛ., Сабирова С.Э., Спиридонова Е.И., Подколзина ЭЛ., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Майорова O.A. Гемопоэтические стволовые клетки пуповинной крови доношенных новорожденных. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2007, т.6, №1, c.l 1-

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

BAS - (basophile) количество базофилов крови (х109/л) CD - (clasters of differentiations) кластер дифференцировки DMEM - модифицированная среда Дулбекко EOS - (eosinophil) количество эозинофилов крови (х10'/л) НСТ (hematocrit) гематокрит

HES 200 - 6% гидроксиэтилкрахмал с молекулярной массой 200 ООО дальтон HGB (hemoglobin) концентрация гемоглобина (г/л) ICAM - intracellular aghesion molecule. IL-8 - interleukine 8.

IRES - внутренний рибосомальный сайт проникновения

LFA - leukocyte fimction-associated molecule.

LTC-IC - long-term culture-initiating cells.

LYM - (lymphocyte) количество лимфоцитов крови (х105/л)

МСН (mean corpuscular hemoglobin) среднее содержание гемоглобина в эритроцитах (пг) МСНС ( mean corpuscular hemoglobin concentration) средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах (г/л)

MCV (mean corpuscular volume) средний объем эритроцитов (фл/фемтолитры)

MNC - (mononuclear cells) мононуклеарные клетки

MON (monocytes) количество моноцитов (хЮ'/л; %)

MON - (monocyte) количество моноцитов крови (х109/л)

MPV ( mean platelet volume) средний объем тромбоцитов (фл/фемтолитры)

NEU - (neutrophile) нейтрофилы

NK - (natural killer) натуральные киллеры

NOD/SCID - тяжелая комбинированная иммунная недостаточность NRBC (nuclear red blood cell) нормобласты(/100лейкоцитов)

PCT (platelet crit) тромбокрит (%), отражает долю объема цельной крови, занимаемой тромбоцитами

PDW (platelet distribution width) ширина распределения тромбоцитов по объему, характеризует

степень анизоцитоза (%)

PLT (platelet) количество тромбоцитов

RBC (red blood cells) количество эритроцитов крови (х1012/л)

RDW (red cells distribution width) показатель гетерогенности эритроцитов по объему,

характеризует степень анизоцитоза

SDF - stromal-derived factor.

VCAM - vascular cell adhesion molecule.

VLA - very late antigen.

WBC - (white blood cells) количество лейкоцитов крови (хЮ'/л)

YFP - желтый флуоресцирующий протеин

АЧГ - абсолютное число гранулоцитов.

Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор.

ГСК - гемопоэтические стволовые клетки

КОЕ-ГЕММ - колониеобразующая единица смешанная

КОЕ-Г - колониеобразующая единица гранулоцитарная

КОЕ-ГМ - колониеобразующая единица гранулоцитарно-макрофагальная

КОЕ-М - колониеобразующая единица макрофагальная

КОЕ-Э - колониеобразующая единица эритроцигарная

МАВК- метод автоматического выделения клеток

МДЦ - метод двойного центрифугирования

ММП-9 - матрикс-металлопротеиназа-9.

OJUI - острый лимфобластный лейкоз.

OMJ1 - острый миелобластный лейкоз.

ПК - пуповинная кровь

ПП - пролиферативный потенциал.

ПХТ - полихимиотерапия.

ФПН - фетоплацентарная недостаточность.

Заказ №417. Объем 2 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 wwvv.postator.ru

Троиышигпшй* MHQRHMMX ГСМвПОЭтаЧССКНК стволовых клеток {ГСК) являете* важным компонентом терапии при многих гематолошческих заболеваниях, врожденны* нарушениях иммунной системы, наследственных анемиях, нскогорых болезнях обмена н -злокачественных новообразованиях (Thomas ED, 1990; Афлиаскь Б.В. н сонет 1W. Bcnsmgcr W. et al., 1995; Schmitz N, « al. 1995, Савченко В Г и соавт. 1996; Румянцев АХ . 1996; Птушжнн В.В., 1997; Rubiiulein Р., 1999; GJuckman Е., 2004). однако, поиск подход ящего донора костного мозга - дорогой и длительный путь, н иногда ЛЯЩКНТ не дожинает до трансплантации (Falkenburg J Л К.1996: Афанасьев Б,В, и coain I99S. Gluekman Е, 2000) Вероятность того, 'по для пациентов, принадлежал!»!N к этническим меньшинствам, найдется HLA-ндентпчный неродственный донор, может бытъеше меньше, поскольку встречаемость определенных HLA-тапов в различных этнических группах значительно варьирует (Armilage J , 1994). Создание банков пуповинной крови (ПК) в значительной степени облегчает поиск материала л/и траиеллаигаиин. что в сочетании с лешевипюй получении такою материала и легкой его доступностью является предпосылкой для увеличения количества трансплантаций ГСК ПК (Wagner J. Е. 1992, Hams D. Т-. [996. KoglerG., 1996. Dtula К, 1998; Rubinstein P-, 1999, Olucknwi E-, 2005). Технологии получения ГСК ПК ддя последующей крюкоисерМШН требуют разработки условий контроля течения беременности и родов и поиска надежных прошостичсския факторов пригодное™ получаемого материала для последующей трансплантации Известно, что состоя клеток ПК отражает течение беременное™ и родов, а также перенесенных заболеваний. Несмотря м многочисленные исследования кдеточзюго состава ПК ("Моппк B.L. 1979; Stokman РА. 1992, Atoerai Р.А. 1992; Торубарова Н А-1993; Cairo M S , 2005; Araviia S,, 2005) отсутствуют референтные значения клеточного состава ПК доношенных и недоношенных новорозкденных Появившиеся в последнее время сообщения о различии клеточного состава ПК в зависимости от пола и массы тела новорожденною, вида родоразрешення. сроков, прчииедти* после родов н сбора ПК до начат протеса обработки, (Cairo M.S., 2005; Aiavjla S,. 2005) демонстрируют влияние множества факторов 1гд клеточный с ос тал ПК и, кок следствие этого, но '>ффекп111НОСТь циппцкн трансплантационного материала Кроме того. ПК имеет некоторые физиодотчеемк отличия от периферической крови взрослого человека (Solves р, 2005, Bradley М В, 2005). в связи с чем исследование состава и характеристик клеток ПК» проводимое при помошн автоматических счетчиков, не вполне удовлетворительно.

Успех траисплантаимн во многом зашкпт от достаточного количества ГСК, поэтому, важным вопросам при применении ПК в клинике является оценка трансплантата. в основе которой лежит опредс«имс количества н жизнеспособности ГСК, содержащихся ш трансплантационном материале (Bender J G., 1994; Coo/ale* B E , 1997; Traineau R„ Allan D.S., 2002; CoUa S V d al, 2002, Manno M P et al., 2002).

В течение последних I0 лег в качестве источника гсыопоэтнческнх стволовых клеток все чаше используют мобилизованную при помощи Г-КСФ периферическую кровь (BeiBinger W et al. 1995; Schmita N. et al. 1995; Масчаи A-A-, 1995; Афанасьев Б.В и соавт 1996; Савченко В.Г н соавт. 19%), в связи с чем, важно определить условия и механизмы воздействия Г-КСФ на систему гемопоэза, лл* получения наиболее эффективного трансплантационного материала (Asano S-. I99J, Welle К~. d ai, 1996, Kronenwctt R. et al, 2000; CulJer C. el al. 2001. Miuanjla NA., <Я al., 2002).

Исполиоцамне различных источников ГСК для трансплантации, а также использование множества технологически приемов для получите непосредственного траисплантациоинот материал» irJ ПК и периферической крови требует тщательного описания и сравнения кпеточиого состава и характеристик ГСК л различных источниках н определение факторов, оказывающих га них влияние.

Изучение н разработка -(ехиошгнй модедлромниа биологических свойств ГСК ПК также представляется актуальной задачей, так как в таком случае можно получить возможность влиять и степень и наирпялеиность и* диффереяинроаки (McdcalT D., 1989; Ogav.1 М. 1993; Умтаий-Йгшеу 0. et al, 1998} Разработка генных векторов «третей» генерации на базе вируса иммунодефицита человека первого шла позволяет проводить работу с няеицвша КЛСТКаш, к которым относится бадыииисцю ГС К. что лист возможность получить эффективную н безопасную модель ЛЯП итмеиення свойств ГСК п клинических целях (Hawky R. ct aL. 1987. Dull Т. ct at. 1998, SuHon R E , 2002. Marino M. et ftl, 2002; Foilenzi A. 2002). Выбор в качестве индуктора'нкгибктора протнфератниной аК1НМЮС1Н стэоловьи клеток генов id еемсЛства Nolch наиболее перспективен. тик как они принимают участие в процессах, как самообновления клеточной популяции, так н «ПНИЩИ! аитидифференпировочных клеточных программ (Wcinnwmier G. et в]., 1992; Artavanis-Tsakonai S. et aL, 1995; Lewit J., 19%, L Wu , 2000, Baldi A, et al. 2004),

Гак-нм оброни, решение указанных вопрос» позволит отнмиэнровать технологам заготовки, |||*и|еесиигя и моряфшшщ ГСК ПК и Периферической крови для клинического использования.

Цель: разработать и внедрить и практику научно вбцошише методы сбора, тестирования и хранения гемолитических споломи клеток иуноаинной и периферической крови для неродственны* трансплантаций, а также щучить возможность моделировании их биологически* свойств для клинического применения

Задачи;

1 Охарактеризовать клеточный состав IUC, определить количество п субполуляцм CD34' я CD133'клеток, а также колониеобразукицую активность ГСК ПК доношенных новорожденных

2, Palpatio гать и внедрить систему критериев для оценки и отбора шемцциыпк доноров Г1К с целью получения максимально эффективного трансплантационного материала

J Изучит» механизмы мобилнзаци* ГСК периферической крови прл использовании Г-КСФ у здоровых доноров и пациентов с различными оикогематологнческнми звбемошпиямн

4 Усовершенствовать и внедрить пшяолга проценипи ПК и мобимпидаи ГСК периферической крови дня получения максимально эффективною трансплшгтационного материала 5, Охарактеризовать клеточный состав и жизнеспособность трансплантационное материма ПК и мобилизованной периферической крови 6- Разработать эффективную техмололпо недедироваиия биологических свойств ГСК для клинических Целей

7. Обосновать и ywnepQteilcmdtem. оргаинтяшюиние принципы работы банков ПК И стандарты работы с ГСК ПК для практических целей

Научная новшня

Получены референтные значении состава ПК с использованием автоматического анализатора юнгток крови и михроскоини окрашенных мазков, определены величины расхождения результатов и факторы, влияющие на разницу определения Определено количество основных субпопуляцнй лимфоцитов, CD34' и С0133*клетоК Функциональная оценка ГСК ПК доношенных новорожденных изучена на модели пннммевбрюошии ш vito.

Проведена опенка влияния ТПНРИ беременности и родов, острой и хронической гипоксии «лоза на показатели кл#точ1н>го состава ПК доношенных новорожденных, впервые показаны различия клеточного состава ПК в зависимости от по.за и массы тела новорожденного, причем эти различия независимы друг от друга.

Впер*ме получены референтные значения уровня СЛОГГШЮГО плоптоза основных клеточные популяций ПК. обработанной по разработанным стандартам, базирующимися nil системе NetCord Определит степень И характер вгтняиия особенностей течения беременное™ н родов, а также основных технологических параметров ироцессннга на жизнеспособность клеток ПК.

Отработана технология процедуры леВкокоинентрацни при различии* смгютпих беременное га, родом, новорожденного и технологических параметрах ПК. подробно охаротсри юван клеточный состав концентрата ПК, являющегося троне плантаилоиным материалом

Изучен характер и степень «шикни препаратов Г-КСФ на состав н жизнеспособность клеток периферической кроин при МПОЛНЯШ протоколов мобилизации №Hfltniw:ax стволонмх клеток у морских доноров, детей с различными омкогематопагичсскимя ЯЁШКНШНШН в ремиссии с целью шугаюгачиоИ трансплантации и при лечении медикимсиютиой шгтопеннн Определены концентрации мобилизующих иитокннои и ферментов 1L-8, G-CSF, ММР-9 в сыворотке ПК доношенных новорожденных н псриферагческой крови при использовании препаратов Г-КСФ у дстеП с различными онкогематологнческимн заболеваниями н здоровых доноров. Определено количество основных субпому ля икй лимфоцитов, СО 34' н CD133 "клеток, а ив модели колониеобразоваикя ш vitro изучено количество и состав ГСК мобилизованное! периферической крови и продукт* пнтафереэо, валяющегося трансплантационным материалом.

Впервые показана возможность эффективной трикфекиии генов в неделнпшеся клетки при помощи ыопфшфонюшо вируса иммунодефицита человека t tuiu (ВИЧ-]) Впервые на модели NODVSCID мышей ППЯН1 возможность изучения ЮЮЛЮТЯЧВСКОЙ дифферент! ров хн CD] 33'меток ПК человека Модифицированная авторами вентерная система, созданная на б«е 8ИЧ-1. способная обеспечить тффстнисый перенос исследуемого генетического материала в иеделяпшеся кдеткн, а также показанное эффективное угнетение колоииеобразующей активности и увеличение уровня спонтанного апоптоз» CD 133" клеток генами Notch 1 it Notch 2, могут быть нспольювлны irpn моделировании биологических свойств ГСК человека.

Рпработан комплекс практических рекомендаций по усовершенствованию технологических ооеришй отбора лоиорсв, сбора, иропессннга н тестирования Г1К дм последующей фмкплшпаши. а также по усовершенствованию протоколов мобилизации ГСК периферической крови

Прлкшчсское значение

Практическое значение работы заключается в установлении референтных значений ПК, как при использовании автоматического анализатора клеток крови, так н при подсчете клеток крови при светооптнческой микроскопии Получены значения, характеризующие состав лейкоцитов ПК. которые рекомендуется использовать в качестве факторов, определяющих показания н противопоказания к сбору ГЕК для безвозмездного донором ГСК- Кроме того, полученные ланцис имеют важное практическое значение при проведении технологических расчетов в работе банков стволовых клеток.

Практическое значение имеют данные объективной опенки эффективности методов сбора ПК, различных способов процесеиига ПК с целью получения подготовленного к хранению трансплантационного материала в также выявленные золнсимостн эффективности процессинга ПК от особенностей течении беременности, ролов и ряда технологических элементов

Эффективное п. иобнлишши и сбора ГСК периферической крови зависит от количества циркулирующих Гршулоцитой н ряда вторичных посредников (IL 8. ММР-9), что позволяет оптимизировать процедуру мобилизаций it получения более эффективного трансплантационного материала у пациентов в ремиссии различных онкогематолошчсскнх заболеваний.

Полученные ершинггелыше характеристики количества и жизнеспособности ГСК в трансплантационном материал* ПК и мобилизованной периферической крови могут использовал** я качестве стандартов по определению качества заготавливаемого Трансплантационного материала в банке стволовых клеток.

Модифицированная авторами векторная система, созданная на бане ВИЧ ■ 1, способна* обеспечить эффективный перенос исследуемого генетического материала в нелеляпикся клетки, а также показанное эффективное влияние генов NotcVi Н и Notch 2 ил ко,зоннеобразуюптую активность и уровень спонтанного апоптоза ОШ'мепК минут быть использованы при моделировании биологических сяойств ЛШШШ клеток человека Отработана модель для изучения приживления и днффереиилрояки различных нонуляций гемопозпиюских стволовых клеток человека на основе трансплантации предварительно облученным NOD'SCtD мышам 1рякп(4«и>е значение выполненной работы заключается я разработке рекомендаций но отбору потенциальных доноров ПК, методикам сбора ПК и соблюдению временных параметров и зависимости от Индивидуальных характеристик каждого образца ПК.

Киедр*иие в практику

Результаты исследования внедрены в работу ФГУ ФНКП детской гематолоши, онкологии н иммунологии Росздрйва. ГУЗ «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения г. Москвы». Основные положения н выводы диссертации используются в подготовке специалистов гематологов, онкологов и иммунологов itn кафедре клинической гематологии, онколопт и иммунопатологии с курсом поликлинической и социальной педиатрии ФУ В РГМУ. По теме диссертации опубликовано 38 работ, в том числе пособие для врачей «Влияние Г-КСФ на клеточный состав крови и костного мозга человекам (2003) и монография «Биологические основы и перспективы терапии стволовыми клетками» (2005).

Результаты работы доложены на IV Российском Национальном конгрессе «Человек н Лекарство», .Москва, в апреле 1997 т. t Съезде детских онкологов и гематологов России, Москва, в ноябре 1997 г., I Российском симпозиуме «Биологические основы герапни онкогемвтологнческнх заболеваний у дез ей», Москва, в феврале 1999 г. VII Российском Национальном конгрессе «Человек и Лекарство», Москва, в апреле 2000 г. It Российском симпозиуме «Биологические основы терапии онкогсматологнческих заболеваний у детей », Москва, в феврале 2001 г, III Российском симпозиуме «Биологические основы терапии онкогемятоло| нчееких заболеваний у детей'-. Москва, в феврале 2003 г„ IV Российском симпозиуме «Биологические основы терапии оикогемптологнческих заболеваний у детей», Москва, в феврале 2005 г, 1 Всероссийском съезде гематологов, 16-18 апреля 2002 г, [X Российском Национальном конгрессе "Человек и Лекарство". Москва, в апреле 2002 г. 7е Meeting of (he European Hematology Association, Florence. Italy n none 2002., X Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» в апреле 2003 года, Москва, 5* International Symposium on Leukemia зд<1 Lymphoma, Amsterdam, The Netherlands в марте 2003, S1" Annual Congress of the European Hematology Association, Lyon, France в июне 2003, 9* Congress of the European Hematology Association. Geneva, Switzerland в июне 2004, 6* International Symposium and Expert Workshops on Leukemia and Lymphoma, Amsterdam, the Netherlands в марте 2005, XII Российском национальном конгрессе « Человек и лекарство» в апреле 2005,3 Г* Annual Meeting of the European Group f<w Blood and Marrow Transplantation, Prague, Czech RcpuMtc в марте 2005, на научном конгрессе Science Workshop, Halwerslon, Texas, в апреле 2004 г, на Национальном конгрессе CAGT Cell & Gene Therapy, The Woodlands, Houston, Texas, в марте 2003., на съезде Медицинскою Колледжа Ёзйлор, The Warwick Hotel, Houston, Texas, в феврале 2004., собраниях лабораторий департамента Молекулярной вирусологии и микробиологии. Медицинского Колледжа Бзйлор, Houston, Texas, в 2002-2004 гт, на конгрессе «Национальные дни лабораторной медицины России», Москва, в октябре 2005, на X Съезде педиатров России, Москва, в феврале 2006, и

Российском Съезде гематоиогон н трансфузнологоа. Мост в апреле 2006. Всероссийской конференции РНОИ, Курск, в мае 2006. Российском конгрессе я Новые технологии в перинатоэопан», Москва, в ноябре 2006.

Работа выполнена и ФГУ «Федеральный иаучно-клнннчсскнй центр детской гематологии, онкологии н иммунологии» РМЦрт (директор ФГУ ФНКЦ ДГОИ • члеи-коррсспондеит РАМН, доктор исямршШ наук, профессор А Г Румянцев), на бате лаборатории регуляции кроветворения (зов- - л б.и Осипом Е Ю). лаборатории контроля количества и жи"И(есиасобиостн стволовых клеток ГУЗ «Банк стволовых клеток Департамента UfKHCXpUKHU г Москвы" {директор - д.м а , профессор О.А.Майорова), лаборатории моделирования н МДМН» векторных систем ВИЧ-1, (зав Dr Richard Е SuHont MD, PhD ), департамента молекулярной виратогин н микробиологии (зав. Dr Janet S. BuleL PhD.). Медицинского колледжа Бзйлор (президент Dr Ralph D. Feigjft. MD,), Хьюстон, Техас. США.

выводы

I, Установлены референтные значения клеточного состава ПК доношенных новорожденных. При использовании автоматического гематологического анализатора АВХ РеШта 60 С+ количество лейкоцитов составило niWO.lteKftj, абсолютное количество нсЯтрофилов - 8.4 f ±0.10* 109/л. лимфоцитов - 5,54*0,06х 10*/я. моноцитов - 2,42±О.ОЗ*10*/л, эозинофияов 0,64*0,16* бюофклов - 0,23*0.01 * Количество эритроцитов составило 4,40±0,01хЮ,1/л. концентрация гемоглобина 157.4*0.46 г/л. количество тромбоцитов 307,54*1,97* 10*/л,

2- При определении количества нсНтрофнлов прн помаши микроскопии был получен достоверно больший уровень, чем при определении при помошн автоматическою счетчика Уровень лимфоцитов, моноцитов, эозинофшюв и базофилов, наоборот оказался выше при определении с помощью автоматического счетчика. Полученные закономерности зависели от количества лейкоцитов и нормобластов и не зависели от сроков гсстации, количества лейкоцитов, степени разведения образца ПК антиимгулянтом. времени, прошедшего после ролов до начала сбора и обработки ПК

3- Количество С034<клеток в ПК составило 0,43*0,023 % от обикго числа ядросодержащнх меток. Количество наиболее ранних кл сток-ире дикствеиников CD34*CD133" клеток составило 0,46±0jK %. Количество мезеихимальных стволовых клеток - CD1334TD106" - 0,48*0.07 а яцпешншх кдсток-предшссгвеиннков -CDI33*CD3f 0,88*0.11 % ОТ общею числа илросодержащнх клеток В ПК преобладают рвииие кдетки-предшествеиникн гемопояа (КОЕ-ГЕММ) - 35,3 %.

4 Количество миелондиых предимственинков (КОЕ-ГМ. КОЕ-Г, КОЕ-М), также квх и количество CD34*клеток зависит от количества нормобластов в ПК. У новорожденных с большим количеством нормобластов в ПК количество С034"клеток и мнелоидимх клеток-предшественников статистически значимо выше (р<0,01).

5 Выявлена зашкичостя, показателей ПК от попа новорожденного Показано, 'гто у девочек уровень лейкоцитов выше. чем у мальчиков При этом у девочек относительное количество нейтрофнлов больше, п лимфоцитов, моноцитов н зозинофилов меньше. У мальчиков CD34* клеток больше, чем у девочек, как в относительном, так н в абсолютном количестве. Также у мальчиков статистически значимо больше количество КОЕ-ГМ в 1 мл ПК.

6, Внутри vrpo&ii а* гипоксия приводит * снижению количества СВД4' клеток, эффективности клонирования и повышению уровня спонтанного апоптоза лейкоцитов При острой гипоксии в родах количество С034*ютсток, эритроцитов, концентрация гемоглобииа статистически значимо выше, жзпнеспософюстъ лейкоцитов и гемопозтювекнх стволовых клеток ПК не изменяется.

7. Полученный при помощи процедуры концентрации ПК, основанной на процессе седиментации эритроцитов под действием г ндро кс и л ти л крахмала, трансплантационный материал имеет объем 20,0 мл, содержит 39.0±0,48xl0%ui лейкоцитов к 1.37±0,029 % С034*клеток и не отличается от ПК по соопвШНПЮ основных субпопуляций лейкоцитов и ГСК,

8, Эффективность дейкокониентраши повышается при сборе ПК после отделения плаценты, удлинении промежутка межлу сбором ПК и началом се обработки, максимальна при массе обратив ПК бет учета тары от 40 до 120 грамм н содержании аитикоагулязгга в пределах 20-40 % Уста1ювлено ее снижение при удлинении времени между ролами и сбором ПК более 5 минут, при содержании а1гтнкоатуля1ста в образце менее 20% и более 40% Отмечается обитая тенденция увеличения редукции эритроцитов при обработке МАВК по сравнению с МДЦ независимо от анализируемого параметра

9. Полученный при помощи Г-КСФ индуцированной мобилизации периферической крови и одной процедуры сеиаралин траисплантапиоииыЯ материал имеет средний объем 83,4±J,4 мл н содержит 188,4s]63*Ю'/мл лейкоцитов, представленных, в основном, лямфедгнмн, и 1,13<±0,25 % CD34"клеток, ие отличается по соотношению субпопуляций ГСК от мобилизованной периферической кровн и значительно превосходит но количеству ГСК веек ростков гемопоэза концентрат ПК

10. Концентрация мобилизационных иитокинов (IL-8, G-CSF. ММР-9) в сыворотке ПК доношенных новорожденных статистически значимо выше, чем в сыворотке крови здоровых доноров, но статистически шачнмо ниже, чем при мобилизации ГСК Г-КСФ у пациентов с оикогематояогическимн заболеваниями н при лечении медикаментозной шпопевкн.

11. Создана эффективная векторная система доставки генетического материала а неделящисся клетки на базе модифицированною вируса иммунодефицита человека I типа с использованием в качестве промежуточной ступени вектора pBlucscript SfC{+/-). Эффективность троисфскини CD133'клеток составила 3294.

12. Ламинированные формы генов Nolch 1 и Notch 2 вытыкают угнетение колоннеобрюзукиасй активности CD Ш'клеток ПК человека, статистически значимое повышение уровня спонтанного апоптоза СОШ'клеток ПК человека, причем Notch 2 приблизительно в два раза активнее, чем Notch [, что позволяет управлять продиферятивной активностью ГСК,

13. При сравнении разд^иых популяций стволовых клеток кровн в способности восстанавливать донорский гемоно» у мышей NOD/SCID. выявилась тенденция преобладания CDt33+KnerOK над CD133 CD34* (2^3±0Д6 % н 0,68±0,14 % соответствсшю. р<0.001). В елгие трансплантаций неготилиою контроля CD 133" CD34 клетки, человеческие С045"клетки ие обнаруживаются, «гто свидетельствует о перспективах использования CD133TCK для трансп.-ктташш

14 Обосновано и внедрено изменение рекоменлованного стандартами NctCord списка противопоказаний лля бетиозмстдногс донорства ИКГ усовершенствование методики технологических расчетов при проведении внутренней отбраковки образна ПК н проведении технологически* itmioa процессинга ПК. алгтфитм отбора образцов ПК на проведение процедуры автоматической к он устрани н или выделение методом двойного центрифугировании, что позволило он [имитировать процесс работы БСК и получал, наиболее эффективный трансплантационный материал