Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Комплексная оценка качества криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови для клинического применения

На правах рукописи

Кобзева Ирина Владимировна

КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА КАЧЕСТВА КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ ДЛЯ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

14.01.21 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

5 Ш 2014

Санкт-Петербург - 2014

005549815

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства" (ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России).

Научные руководители:

доктор медицинских наук - Астрелина Татьяна Алексеевна доктор медицинских наук, профессор - Бубнова Людмила Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Калинина Наталья Михайловна, главный научный сотрудник отдела лабораторной диагностики ФГБУ "Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. A.M. Никифорова" МЧС России

доктор медицинских наук, доцент Смолянинов Александр Борисович, заведующий НИЛ клеточных технологий Северо-Западного Государственного Медицинского университета имени И.И. Мечникова, заслуженный рационализатор Российской Федерации, генеральный директор Покровского банка стволовых клеток

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства"

Защита состоится « 2014 года в часов

на заседании диссертационного Совета Д 208.074.01 при ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России по адресу 191024, г. Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, д.16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Татьяна Валентиновна Глазанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Эффективность первых аллогенных трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) пуповинной крови (ПК) у пациентов с различными заболеваниями привела к широкомасштабному развитию клинических исследований в данной области (Gluckman Е., 2010; Wagner J.E., 2010; Broxmeyer, Н.Е., 2011).

Благодаря уникальным свойствам клеток ПК, относительной простоте и безопасности их заготовки, на сегодняшний день ПК стала одним из наиболее востребованных альтернативных источников гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) во многих странах мира (Gluckman Е., 2011; Ballen К., 2013). Ежегодно в мире проводится более 3000 алло-ТГСК ПК пациентам с различными заболеваниями (Rocha V., 2010).

С целью обеспечения систематической заготовки ГСК ПК для длительного криохранения и использования их в клинической практике было создано 160 успешно функционирующих банков ПК, в которых на криохранении находится более 600 000 тестированных концентратов ПК (Welte К., 2010; Lauber S., 2010; URL:http://ww\v.bmdw.org/). Современная система банков ПК позволяет в короткие сроки накопить большое количество тестированных концентратов ПК, создать общественный регистр и подобрать подходящего донора для большинства пациентов, нуждающихся в проведении алло-ТГСК (Navarrete С., 1998; Armitage S., 1999; Brown J., 2000; Davey S., 2004, Бубнова Л.Н., 2008).

Успех алло-ТГСК ПК во многом зависит от качества криоконсервированных ГСК ПК (Rubinstein Р. 2009; Wagner J.E., 2002; Gluckman Е., 2005; Абдулкадыров K.M., 2006).

Проведенные в различных странах исследования по оценке качества ГСК ПК продемонстрировали достаточный процент сохранения ГСК во время криохранения (Broxmeyer Н.Е. 2003, 2011; Zinno F., 2011). Рядом зарубежных авторов были показаны преимущества криохранения концентратов ПК в автоматизированном криокомплексе «BioArchive» и «mini-Bioarchive» (Rubinstein P., 2004; Miura J., 2008). В России аналогичные исследования единичны. В 2012 году были представлены данные по оценке сохранности CD45+, CD45+/CD34+ клеток, колониеобразующей способности ГСК ПК и длины теломер в зависимости от различных способов криоконсервирования (программное и неконтролируемое замораживание) и краткосрочного криохранения (Карпова Н.С, 2012). Также было проведено исследование по изучению влияния метода выделения ядросодержащих клеток (ЯСК) на ГСК ПК (сохранность и жизнеспособность CD45+, CD45+/CD34+ клеток) до и после криохранения в течение 7,0 ±0,42 месяцев (Хурцилава О.Г., 2012).

Одним из наиболее перспективных направлений является поиск оптимального комбинированного криопротектора, способного сохранить качество ГСК ПК для дальнейшего клинического применения (Cilloni D., 1999; Galmes А., 1999; Halle P., 2001; Bakken A.M., 2003). В России было проведено только одно исследование по оценке влияния стандартного комбинированного криопротектора ДМСО в сочетании с декстраном 40 (Pall, Великобритания) на качество ГСК ПК (Смолянинов А.Б., 2009).

Степень разработанности темы

Вышеизложенные данные не охватывают весь комплекс по оценке качества ГСК ПК, необходимый для более полной характеристики трансплантационного материала. Не завершены исследования, направленные на поиск новых оптимальных комбинированных криопротекторов с использованием отечественных материалов, которые обеспечивали бы достаточное количество и функциональную сохранность ГСК ПК после криохранения. Востребовано постоянное получение новых данных о распределения частот HLA- гаплотипов в регистрах банков ПК для целенаправленного поиска совместимых образцов ГСК ПК, что особенно актуально для многонациональной России. Все это обуславливает актуальность настоящего исследования.

Цель исследования

Оценить качество криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, находящихся на длительном хранении в автоматизированном системе «BioArchive®», для клинического применения.

Задачи исследования

1. Изучить клеточный состав концентратов пуповинной крови и биологические характеристики гемопоэтических стволовых клеток (количество CD45+/CD34+ клеток, жизнеспособность CD45+ клеток, колониеобразующую активность) до и после длительного криохранения.

2. Определить влияние методов обработки, концентрации гемоконсерванта CPDA, величины гематокрита на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови.

3. Исследовать влияние отечественного комбинированного криопротектора ДМСО+реополиглюкин, предложенного в Московском банке стволовых клеток, на качество криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови.

4. Проанализировать иммуногенетические характеристики общественного регистра и эффективность подбора гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в г. Москве.

5. Разработать алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации, с учетом международных рекомендаций NETCORD-FACT (International Standards for Cord Blood Collection, Processing, Testing, Banking, Selection and Release).

Научная новизна работы

Впервые в России представлена комплексная оценка качества криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови (биологические и иммуногенетические характеристики), находящихся на длительном криохранении в автоматизированной системе «BioArchive®».

Изучение клеточного состава концентратов пуповинной крови и биологических характеристик гемопоэтических стволовых клеток после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» показало, что общее количество ядросодержащих клеток незначительно снижается, преимущественно за счет фракции гранулоцитов, колониеобразующая активность гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови сохраняется на достаточно высоком уровне. Это позволяет использовать клеточный концентрат пуповинной крови в качестве альтернативного источника гемопоэтических стволовых клеток.

Выявлено, что на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови во время криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» влияют метод выделения, величина гематокрита после лейкоконцентрации и концентрация гемоконсерванта CPDA в концентрате пуповинной крови перед криохранением.

Установлено, что отечественный комбинированный криопротектор ДМСО+реополиглюкин позволяет сохранять высокое качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови во время криохранения и может использоваться для длительного криохранения.

Впервые проанализирован характер распределения HLA-гаплотипов в общественном регистре гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови г. Москвы и показано, что характер распределения в целом соответствует славянам центральной и восточной Европы, а частота вероятности совместимости пары донор - реципиент по 3- генам HLA - системы (локусы А, В, DRB1) составляет 1:218.

Впервые разработан алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации с учетом международных рекомендаций NETCORD - FACT.

Теоретическая и практическая значимость

Криоконсервированные гемопоэтические стволовые клетки пуповинной крови после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» являются качественным материалом для применения в клинической практике.

В результате проведенного исследования установлены факторы, влияющие на клеточный состав концентрата пуповинной крови и биологические характеристики гемопоэтических стволовых клеток после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®», которые необходимо учитывать при использовании клеточных концентратов пуповинной крови в клинической практике: метод выделения ядросодержащих стволовых клеток, величина гематокрита после процесса лейкоконцентрации и концентрация гемоконсерванта CPDA до криохранения.

Доказана возможность использования отечественного комбинированного криопротектора ДМСО+реополиглюкин при заготовке гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови для длительного криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®».

Иммуногенетические особенности общественного регистра гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови Московского банка стволовых клеток позволяют проводить целенаправленный поиск совместимых образцов гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови для пациентов из различных регионов России.

Предложенный алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации с учетом международных рекомендаций NETCORD -FACT, позволит усовершенствовать работу в подобных учреждениях.

Методология и методы исследования

В работе использованы общенаучные (анализ проспективный и ретроспективный, обобщение данных), частные научные методы (лабораторные, клинические) и методы математической статистики.

На первом этапе исследования изучались клеточный состав пуповинной крови и биологические характеристики гемопоэтических стволовых клеток до и после длительного криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®». Выявлено влияние методов обработки пуповинной крови, содержания гемоконсерванта CPDA, величины гематокрита на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после криохранения. Далее установлена целесообразность использования отечественного комбинированного криопротектора ДМСО+реополиглюкин при заготовке концентратов пуповинной крови для длительного криохранения. Проведен анализ иммуногенетических характеристик общественного регистра гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, включающий характер распределения HLA-гаплотипов и эффективность подбора совместимых образцов гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в г. Москве. На заключительном этапе проведенной работы разработан алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации, с учетом международных рекомендаций NETCORD-FACT.

Положения, выносимые на защиту

1. Предложенный комплекс по оценке биологических характеристик криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в автоматизированной системе «BioArchive®» всесторонне характеризует качество трансплантационного материала.

2. Методы обработки пуповинной крови, концентрация гемоконсерванта CPDA и величина гематокрита перед криохранением оказывают влияние на биологические характеристики криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови.

3. Комбинированный отечественный криопротектор ДМСО+реополиглюкин, предложенный в Московском банке стволовых клеток, является эффективным криоконсервирующим раствором и может использоваться для длительного криохранения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови.

4. Алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации и разработанный с учетом международных рекомендаций NETCORD-FACT, усовершенствует работу общественных регистров гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в подобных учреждениях.

Степень достоверности и апробация результатов диссертации

Достоверность результатов исследования подтверждается объемом фактического материала и использованием современных методик статистической обработки.

Апробация диссертации проведена 4 марта 2014 г. на расширенном заседании Проблемной комиссии №3 ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России.

Материалы диссертации доложены на: XV конгрессе педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2011г.), международном симпозиуме «ACUTE LEUKEMIAS XIII Biology and Treatment Strategies» (Мюнхен, 2011г.), 37 Международном симпозиуме Европейской группы ЕВМТ (Париж, 2011г.), на V международном симпозиуме «Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей и взрослых памяти Раисы Горбачевой» (Санкт-Петербург, 2011г.), на V научно-практической конференции «Современная гематология. Проблемы и решения» (Москва, 2011г.), на Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии» (Беларусь, 2011г.), на XXXIX сессии «Мультидисциплинарный подход к гастроэнтерологическим проблемам» (Москва, 2013г.), на VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2013г.), международной конференции 8th East-West «Immunogenetics conference» (Вена, 2014).

Внедрение результатов в практику

Результаты исследования были внедрены в практику работы Государственного бюджетного учреждения здравоохранения «Банка стволовых клеток Департамента здравоохранения города Москвы».

Результаты диссертационной работы войдут в Методические рекомендации "Алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации и разработанный с учетом международных рекомендаций NETCORD-FACT».

Публикации результатов исследований

По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ, из них 4 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации результатов диссертационных исследований.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 48 таблицами и 7 рисунками. Библиография включает 147 источников, из них 13-отечественных и 134-зарубежных авторов.

Личный вклад автора

Автором лично выполнялись регистрация, обработка и криоконсервация образцов пуповинной крови; проводилось тестирование гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови; паспортизация криоконсервированных концентратов ПК; изъятие и разморозка концентратов пуповинной крови; осуществлялась выдача клеточных концентратов пуповинной крови в клинические центры. Проводился сбор анамнестических данных

реципиентов ГСК; анализ полученных данных, статистическая обработка и обобщение результатов исследования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В исследование были включены:

1. 600 криоконсервированных клеточных концентратов ПК, изъятых из автоматизированной системы «ВюАгсЫуе®» (ТЬегтпс^епез(з, США) для оценки клеточного состава и биологических характеристик ГСК (Таблица 1).

Таблица!

Характеристика криоконсервированных концентратов пуповиннон крови (п=600)

Срок хранения (год) (M±SD) Объем концентрата ПК (мл) (M±SD) % CPDA (M±SD) % Гематокрит (M±SD) %ДМСО (M±SD)

2,90±1,30 20,06±0,08 30,31±0,27 40,60± 17,00 10,00±0,28

Примечание: M±SD -среднее + стандартное отклонение среднего

Ежегодно с 2006 по 2011 года проводилось плановое контрольное изъятие и размораживание концентратов ПК, что составляло 6% от всего заложенного клеточного материала.

2. 4800 крнокопсервнрованных клеточных концентратов ПК, находящихся на криохранении в автоматизированной системе «BioArchive®» и внесенных в общественный регистр ГСК ПК г. Москвы за период с 2004 по октябрь 2013 гг. Для изучения частоты встречаемости гаплотипов методом независимой последовательной рандомизации было отобрано 200 концентратов ПК с образцами периферической крови родителей (п=400).

3. 100 криоконсервированных клеточных концентратов ПК, заготовленных и изъятых для оценки влияния отечественного комбинированного криопротектора- 50% раствор ДМСО + реополиглюкин (10% декстрана ср. мол. масса 30000-40000 в изотоническом растворе), производитель «ПанЭко», Россия. В качестве контрольной группы использовали комбинированный криопротектор - 55% раствор ДМСО + декстран - 40 (5% раствор декстрана ср. мол. масса 35000-45000 в изотоническом растворе), производитель «PallGmbh», Германия.

4. 56 криоконсервированных клеточных концентратов ПК, переданных в клинические центры для проведения алло - ТГСК ГСК пациентам с различными заболеваниями.

Сбор пуповинной крови осуществляли у доношенных новорожденных при наличии развернутого информированного согласия роженицы и отсутствии стандартных общемировых абсолютных противопоказаний. ПК собирали в закрытую систему для сбора крови (Green Cross, Корея), которая содержала стандартное количество гемоконсерванта CPDA (цитрат + фосфат натрия + декстроза + аденин). Степень разведения образцов ПК гемоконсервантом CPDA зависела от объема собранной ПК. Концентрация гемоконсерванта CPDA рассчитывали по формуле:

(Количество CPDA (грамм) в мешке для сбора ПК -¡- (Вес мешка для сбора ПК с цельной ПК-Вес мешка (грамм) для сбора ПК без CPDA) х 100%

Образцы поступившей ПК регистрировались и отбраковывались при ее несоответствии (первичная отбраковка).

Выделение ЯСК ПК проводили в асептических условиях двумя методами: двойного центрифугирования (МДЦ) с использованием центрифуги "Cryofiige 5500i" и плазмоэкстрактора "Auto Volume Expressor" и автоматического выделения клеток (МАВК) с помощью клеточного сепаратора «Sepax S1000» (Biosafe, Switzerland).

Криоконсервирование и криохранение клеточных концентратов ПК осуществляли после выделения ЯСК. Непосредственно перед процессом криоконсервации в каждый концентрат ПК вводили криоконсервирующий раствор ДМСО с декстраном-40 или с реополиглюкином (п=100) до конечной концентрации ДМСО 10%. В дальнейшем все обработанные концентраты ПК подвергали немедленной криоконсервации в автоматизированном системе «BioArchive®» (ThermoGenesis, США).

Размораживание концентратов ПК проводили после их изъятия из автоматизированной системы «BioArchive®» по методике П. Рубенштейна, предложенной в 1998году, без отмывания от криопротектора.

Тестирование клеточных концентратов ПК

1. В процессе обработки ПК определяли групповую принадлежность и проводили инфекционный контроль - вторичная отбраковка (бактериальное и вирусологическое исследование).

2. Оценивали клеточный состав концентратов ПК до и после криохранения: количество ЯСК (гранулоциты, нормобласты, лимфоциты, моноциты) и мононуклеарных клеток (МНК -лимфоциты, моноциты) определяли при помощи:

• автоматического гематологического анализатора АВХ Pentra 60С Plus (HORIBA АВХ Diagnostics Inc., FRANCE) в режиме автоматической аспирации с определением 26 параметров.

• морфологической оценки мазков, окрашенных по методу Паппенгейма-Крюкова (комбинированная окраска фиксатором-красителем Мая-Грюнвальда и краской Романовского). 3. Изучали биологические характеристики ГСК ПК

а) Количество ГСК ПК оценивали по экспрессии мембранных маркеров в реакции прямой иммунофлюоресценции с моноклональными антителами CD34 и CD45 при помощи проточной цитометрии FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Оценивали процентное соотношение от общего количества лейкоцитов и абсолютное количество CD34+ клеток в 1 мл ПК каждого образца.

б) Колониеобразующую активность клеток ГСК ПК определяли при помощи культивирования клеточной суспензии ПК в метилцеллюлозе в течении 14 суток при температуре 37°С в С02- инкубаторе. В дальнейшем производили подсчет количества колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 х 105 эксплантированных клеток: KOE-mix, КОЕ-ГМ, КОЕ-Г, КОЕ-М, КОЕ-Эр.

в) Жизнеспособность ядросодержащих клеток ПК оценивали с помощью красителя 7-ADD, поникающего через цитоплазматическую мембрану клетки и связывающегося с ДНК, определением количества CD45+ негативных 7-ADD клеток на проточном цитофлуометре FACSCalibur.

4. Проводили молекулярно-генетическое типирование локусов А, В и С HLA I класса и локусов DRB1 и DQB1 HLA II класса. Геномную ДНК выделяли из свежих или замороженных образцов ПК методом сепарации на магнитных частицах с использованием коммерческих наборов BioSprint 15 DNABloodkit(«Qiagen», США). Также для выделения ДНК использовали автоматизированную систему «KingFisher». HLA генотипирование проводили методом SSO (Sequence Specific Oligonucleotides) и с помощью аллель-специфических праймеров (SSP - Sequence Specific Primer).

Анализ применения криоконсервированных ГСК ПК

Качество клеточных концентратов ПК, выданных клиническим центрам (ФГУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева г. Москвы, ИДГиТ СПГМУ МЗ и CP РФ им. академика И.П. Павлова, ФГБУ «РДКБ» Минздравсоцразвития России и ГБУЗ НО «Нижегородский ОЦК») для проведения алло-ТГСК, оценивали после их применения согласно представленным «эпикризам применения ГСК ПК» с 2006 по октябрь 2013 гг. Была получена следующая информация: номер истории болезни, возраст, половая принадлежность и вес пациента, диагноз, проведенное лечение до трансплантации, режим кондицинирования, осложнения во время введения концентратов ПК, сроки восстановления нейтрофилов, тромбоцитов, наличие отторжения или недостаточности работы трансплантата, развитие острой и/или хронической РТПХ, исход трансплантации, трансфузии донорских тромбоцитов, повторные трансплантации, состояние пациента после трансплантации ГСК ПК (жив, умер - дата смерти, причина), дата последнего контакта с пациентом.

Статистическая обработка результатов

Проводилась для вариационных рядов с параметрическим распределением с помощью однофакторного дисперсионного анализа и оценкой по критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони и тесту Ньюмена-Кейлса; для вариационных рядов с непараметрическим распределением с помощью критерия Крускалла-Уоллеса и критерия Манна-Уитни. Для оценки равенства долей использовали Z-тест. Корреляционный анализ проводили с использованием уравнений линейной регрессии и по методу Спирмена для рядов с непараметрическим распределением. Полученные результаты обработаны методами вариационной статистики в программах Microsoft Excel, Microsoft Access, Statistica 6.0, «Biostat» с двупольной таблицы при помощи программы «OpenEpi» (Open Source Epidemiologic Statistics for Public Health), версия 2.3 (2009/20/05). Частоты встречаемости гаплотипов определяли прямым подсчетом. Различия между сравниваемыми параметрами считали статистически значимыми при р<0,05.

Основные результаты исследования Влияние криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» на качество ГСКПК

Клеточный состав до и после криохранения был проанализирован у 600 концентратов ПК (Таблица 2).

Таблица 2

Клеточный состав концентратов пуповинной крови до и после криохранения (п=600)

Показатель До криохранения После криохранения % сохранения

ЯСКх107/мл (M±SD) 3,67 ±0,97* 3,13±0,80* 87,01±13,30

МНКх107/мл (M±SD) 1,72±0,56 1,79±0,60 100,4±9,20

Нейтрофилы х107/мл (M±SD) 1,94±0,62* 1,46±0,51* 78,60±12,20

Примечание: М±ЭО -среднее + стандартное отклонение среднего, * - различия достоверны при р<0,05

После криохранения концентратов ПК было выявлено достоверное снижение абсолютного количества ЯСК ПК (с 3,67±0,97х10?/мл до 3,13±0,8х107/мл) и нейтрофилов (с 1,94±0,62х107/мл до 1,46±0,51х107/мл). Процент сохранения ЯСК составил 87,01±13,3%, нейтрофилов - 78,6±21,2%.

Достоверного изменения абсолютного количества МНК после криохранения концентратов ПК выявлено не было: 1,72±0,56х107/мл и 1,79±0,60х107/мл соответственно. Процент сохранения МНК составил 100,4±9,20%.

При анализе субпопуляционного состава общей фракции ЯСК было выявлено перераспределение соотношения между лимфоцитами и гранулоцитами до и после криохранения (Рисунок 1).

_л п, р=0,04

р=0,02 51 , р

ч 60 1 43,1 41,3

Н Ш '»"■» 11

120"хШ^'г—дшь—ша —^

лимфоциты моноциты нейтрофилы эозинофилы базофилы ■ до криохранения после криохранения

Рисунок I. Субпопуляционный состав ядросодержащих клеток пуповинной крови до и после криохранения

Достоверного влияния криохранения в автоматизированной системе «ВюАгсЫуе®» на жизнеспособность ЯСК (С045+7АА0-) в клеточных концентратов ПК выявлено не было. Абсолютное количество С1)45+/СП34+ клеток после криохранения концентратов ПК достоверно снижалось с 0,13±0,08х106/мл до 0,089±0,05х106/мл, процент сохранения С045+/СЭ34+ клеток составил 93,7±5,3% (Таблица 3).

Таблица 3

Жизнеспособность ядросодержащих клеток (С045+7АА0-) и количество С1)45+/СВ34+ _клеток в концентратах пуповннной крови до и после крнохранения (ч=600)_

% С045+7АА0"(М±80) С045+/С034+х106/мл (М±8Г))

До криохранения После криохранения До криохранения После криохранения % сохранения

99,30 ±1,27 97,90 ±1,42 0,13 ±0,08* 0,089 ±0,05* 93,70 ±5,30

Примечание: М±80 - среднее + стандартное отклонение среднего, * - различия достоверны при р<0,05

При оценке колониеобразующей активности ГСК ПК было показано, что количество колоний КОЕ-гшх, КОЕ-Г, КОЕ-М, КОЕ-ГМ и КОЕ-Эр во время криохранения клеточных концентратов ПК достоверно снижалось (Таблица 4).

Таблица 4

Колониеобразующая активность гемопоэтических стволовых клеток пуповннной крови во

время криохранения (п=600)

Показатель До криохранения (М±8Б) После криохранения (М±80) % сохранения (М±8Б)

КОЕ-пт х105 МНК 26,91±4,06* 25,90±8,37* 99,30 ± 3,38

КОЕ-Г хЮ5 МНК 19,05±3,23* 17,03± 4,41* 85,03 ± 5,56

КОЕ-М х10й МНК 13,71±3,26* 12,40±3,60* 81,30±3,28

КОЕ-ГМ х10ь МНК 19,50±2,4* 17,29±4,92* 82,34±9,80

КОЕ-Эр х105 МНК 21,62±7,69* 13,64±3,17* 69,40±5,70

Примечание: М±ЭО -среднее + стандартное отклонение среднего, * - различия достоверны при р<0,05

Таким образом, проведенное исследование показало, что после криохранения в автоматизированной системе «ВюАгсЫуе®» отмечается достоверное снижение количества ЯСК, преимущественно за счет фракции гранулоцитов, уменьшение количества С045+/СП34+ клеток и всех КОЕ. Однако качество ГСК ПК (процент сохранения ЯСК, СП45+/С034+ и колониеобразующая активность) остается высоким.

Влияние методов лейкоконцентрации на качество ГСК ПК после криохранения в автоматизированной системе «ВюАгсИЬе®»

Все криоконсервированные концентраты ПК были разделены на две группы в зависимости от метода лейкоконцентрации:

> Криоконсервированные концентраты ПК, полученные МАВК - 256

> Криоконсервированные концентраты ПК, полученные МДЦ - 344

При анализе клеточного состава концентрата ПК (Рисунок 2) было выявлено, что процент сохранения нейтрофилов в криоконсервированной ПК был достоверно ниже в группе образцов, обработанных МДЦ 80,21±2,10% по сравнению с группой образцов, обработанных МАВК: 85,31±3,80%, р<0,05 (Рисунок 2).

Р<0,05

ЯСК МНК Нейтрофилы

и МАВК (п=256) м МДЦ (п=344)

Рисунок 2. Влияние методов лейкоконцентрации на клеточный состав концентрата пуповннной крови после криохранения

При сравнении жизнеспособности ЯСК (С1)45( 7ДД1)-) в обеих группах криоконсервированных образцов ПК статистически значимых различий до и после криохранения выявлено не было. Процент сохранения С045+/С034+ клеток после криохранения ПК был достоверно выше в группе образцов, обработанных МАВК 95,61±4,70% по сравнению со второй группой образцов - 84,52±5,10%, р<0,05 (Рисунок 3).

р<0,05

__А._

£ 100 и

о 80

о.

с

60

"МАВК (п=256) иМДЦ(п=344)

Рисунок 3. Влияние методов лейкоконцентрации на сохранение С045+/С034+ клеток после криохранения концентратов пуповинной крови

При оценке колониеобразующей активности ГСК до и после криохранения концентратов ПК в обеих группах достоверных различий выявлено не было.

Таким образом, криоконсервированные концентраты ПК, полученные методом автоматического выделения клеток, после долгосрочного криохранения в автоматизированной системе «ВюАгсЫуе®» содержат достоверно больше нейтрофилов и С045+/С034+клеток, по сравнению с концентратами ПК, полученными методом двойного центрифугирирования.

Влияние величины гематокрита на качество ГСК ПК после криохранения в автоматизированной системе «ВюАгсИЬе®»

Все размороженные концентраты ПК были разделены на две группы в зависимости от величины гематокрита после лейкоконцентрации:

> Криоконсервированные концентраты ПК с гематокритом от 12% до 39% - 286

> Криоконсервированные концентраты ПК с гематокритом от 40% до 69% - 314

Влияние величины гематокрита на клеточный состав ПК после криохранения представлено на рисунке 4.

р<0,05

84.83 89,51.........................96:27".............................7<) ¿д........79-22.....................

т.шт

100

£ 80

н X 60

о 40

с 20

0

ЯСК

мнк

Нейтрофилы

и гематокрит 12-39% (11=286) ш гематокрит 40-69% (11=314)

Рисунок 4. Влияние величины гематокрита на клеточный состав концентрата пуповинной крови после криохранения

Процент сохранения ЯСК при величине гематокрита в концентрате ПК от 40% до 69% был выше - 89,51±4,54%, чем в группе с более низкой величиной - 84,83±4,98%, р<0,05. При анализе количества МНК и нейтрофилов в концентрате ПК после криохранения в зависимости от величины гематокрита достоверно значимых различий получено не было.

При оценке жизнеспособности ЯСК ПК (С'045+7АА0-) до и после криохранения в обеих группах клеточных концентратов ПК статистически значимых различий получено не было. Процент сохранения СЭ45+/С034+ клеток в концентрате ПК с гематокритом от 12% до

39% был достоверно выше, чем в группе с более высокой величиной гематокрита - 96,32 ±3,46% и 90,06±5,83% соответственно, р<0,05 (Рисунок 5).

..р<0,05.

100 95 90 85

/

X

96,32

90,06

■ШШ-

Игематокрит 12-39% (п=286) и гематокрит 40-69% (п=314)

Рисунок 5. Влияние гематокрита на сохранение С045+/С034+клеток в концентрате пуповинной крови после криохранения

При оценке колониеобразующей активности ГСК до и после криохранения концентратов ПК, статистически значимых различий в группах получено не было.

Таким образом, концентрат ПК с величиной гематокрита от 12% до 39%, после криохранения содержит достоверно больше СП45+/СП>34+ клеток и меньше ЯСК, по сравнению с концентратом ПК с большей величиной гематокрита: процент сохранения 96,32±3,46% против 90,06±5,83% и 84,83±4,98% против 89,51±4,54%, р=0,01 и соответственно.

Влияние концентрации гемоконсерванта СРОА на качество ГСК ПК после криохранения в автоматизированной системе «В¡оАгсИ¡ре®» Все изъятые концентраты ПК были разделены на две группы:

> Криоконсервированные концентраты ПК с величиной гемоконсерванта СРЭА от 15% до 29%-236

> Криоконсервированные концентраты ПК с величиной гемоконсерванта СРОА от 30% до 60% -364

Статистически значимых различий при оценке количества ЯСК и нейтрофилов после криохранения концентратов ПК в зависимости от концентрации гемоконсерванта СРОА получено не было (Рисунок 6).

ЯСК МНК Нейтрофилы

Рисунок 6. Влияние концентрации гемоконсерванта СРОА на клеточный состав концентрата пуповинной крови после криохранения

Процент сохранения МНК после криохранения концентратов ПК с концентрацией гемоконсерванта СРОА от 15 % до 29% был достоверно выше по сравнению с более высоким содержанием СРЭД от 30% до 60% - 99,73±1,88% и 96,01±5,70% соответственно, р=0,03.

При сравнении содержания жизнеспособных ЯСК ПК (С045+7АА0-) после криохранения статистически значимых различий получено не было.

Процент сохранения С045+/С034+ клеток в группе клеточных концентратов ПК с концентрацией гемоконсерванта СРОА от 30% до 60% был достоверно выше, по сравнению с группой с величиной гемоконсерванта СРЭА от 15 % до 29% - 98,96±0,28% и 88,52±0,58% соответственно, р<0,05 (Рисунок 7).

р<0,05

"CPDA 15-29% (n=236) Ш CPDA 30-60% (n=364)

Рисунок 7. Влияние концентрации гемоконсерванта CPDA на сохранение клеток CD45+/CD34+ после криохранения концентратов пуповинной крови

Колониеобразующая активность ГСК ПК в обеих группах концентратов до и после криохранения достоверно не изменялась.

Таким образом, показано, что клеточный концентрат ПК криоконсервированный с концентрацией гемоконсерванта CPDA от 30% до 60% после криохранения содержит больше CD45+/CD34+ клеток и меньше МНК по сравнению с концентратом ПК с более низким содержанием CPDA.

Влияние отечественного криопротектора ДМСО+реополиглюкин на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови

Для оценки влияния комбинированного отечественного криопротектора ДМСО+ реоплолиглюкин на качество ГСК ПК из автоматизированной системы «BioArchive®» было изъято 100 концентратов ПК. В качестве контрольной группы было изъято 100 концентратов ПК ранее криоконсервированных с использованием криопротектора ДМСО+декстран 40. Медиана криохранения в обеих группах составила 2 года (1-3). МАВК в группе ДМСО + реополиглюкин было получено 64 концентрата и 54 концентрата в группе ДМСО + декстран 40. 36 концентратов ПК из группы ДМСО + реополиглюкин и 46 из группы ДМСО + декстран 40 были получены МДЦ. Процент ДМСО в конечном продукте в первой группе составил 10,1% (9,8-10,2), во второй группе - 10% (9,7- 10,1).

При сравнении клеточного состава концентратов ПК и биологических характеристик ГСК достоверных различий в обеих группах клеточных концентратов получено не было, т.е. предложенный отечественный комбинированный криопротектор ДМСО + реополиглюкин сохранял высокое качество ГСК ПК во время криохранения, как и ДМСО + декстран 40 (Таблица 5-7).

Таблица 5

Клеточный состав концентрата пуповинной крови до и после криохранения в зависимости

от вида криопротектора

Криопротектор ЯСКх107/мл (M±SD) МНКх107/мл (M±SD) Нейтрофилы х10'/мл (M±SD)

1 группа концентратов ПК До После % сох-я До После % сох-я До После % сох-я

3,40 ±0,12 2,93 ±0,09 88,60 ±3,00 1,70 ±0,17 1,40 ±0,06 92,20 ±2,00 1,92 ±0,01 1,44 ±0,05 78,32 ±2,10

2 группа концентратов ПК 4,60 ±0,23 3,60 ±0,02 89,20 ±2,00 2,10 ±0,12 1,70 ±0,09 96,00 ±0,96 2,40 ±0,13 1,76 ±0,09 77,36 ±0,75

Р 0,08 0,8 0,7 1,00 0,99 0,86 0,58 0,99 0,51

Примечание: 1 - группа концентратов ПК с криопротектором ДМСО +декстран 40 (п=100); 2 - группа концентратов ПК с криопротектором ДМСО + реополиглюкин (п=100), До - до криохранения, После -после криохранения, % сох-ия - процент сохранения клеток после криохранения

«п

.. 88,52

-Л-

1

Таблица 6

Колониеобразующая активность гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в зависимости от вида комбинированного криопротектора

Крио KOE-mii xlO'MNC КОЕ-Г xlO'MNC КОЕ-М xlO'MNC KOE-rMxlO'MNC КОЕ-Эр XlO'MNC

про (M±SD) (M±SD) M±SD) MiSD) M±SD)

тек До Пос- До Пос- До Пос- До Пос- До Пос

тор ле СОХ-ИЯ ле сох-ия ле СОХ-ИЯ ле СОХ-ИЯ -ле сох -ия

1 34,36 30,90 91,20 22,30 19,80 83,26 15,42 14,50 87,90 22,70 18,22 83 ,2 27,7 12,3 75,6

± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

6,08 1,90 1,90 1,90 1,20 0,96 1,60 1,80 1,80 5,50 1,90 2,0 2,60 1,9 2,10

2 52,60 41,30 89,50 23 ДО 20,30 84,7 15,80 15,50 88,56 22,10 19,20 85,2 27,9 12,8 73,7

± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

2,60 2,10 0,60 1,32 1,60 0,60 2,80 8,30 0,60 1,20 1,80 0,9 2,50 1,7 2,30

Р 0,54 0,70 0,61 0,09 0,36 0,12 0,87 0,9 0,61 0,54 0,25 0,2 0,09 0,12 0,45

Примечание: 1 - криопротектор ДМСО +декстран 40 (п=100); 2 -криопротектор ДМСО + реополиглюкин (п=100). До - до криохранения. После - после криохранения, % сох-ия - процент сохранения колоний после криохранения

Таблица 7

Количество CD45+/CD34+ клеток и жизнеспособность ядросодержащих клеток до и после

криохранения концентратов пуповинной крови в зависимости от криопротектора

Вид криопротектора CD34+/CD45+ х10ъ/ мл (M±SD) CD45+7ADD-(%) (M±SD)

До После % сох-ия До После

ДМСО + декстран 40 (п=100) 0,18±0,02 0,15±0,05 86,26±0,70 98,90±0,4 9 91,12±0,21

ДМСО+ реополиглюкин (п=100) 0,19±0,03 0,16±0,20 87,2±0,40 98,50±0,86 89,93±0,69

Р 0,66 0,53 0,36 0,5 0,67

Примечание: До - до криохранения, После - после криохранения, % сох-ия - процент сохранения клеток после криохранения

Анализ иммуногенетических характеристик общественного регистра и эффективность подборов гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в городе Москве Особенности общественного регистра ГСК ПК г. Москвы

За период с 2004 г. по октябрь 2013 г. в Московский банк стволовых клеток поступило 11565 образцов ПК. В процессе тестирования 5733 (49,57%) обраца ПК были отбракованы, из них 441 концентрат (7,69%) по причине наличия инфекционных маркеров. 5832 концентрата ПК (50,43%) были заложены на криохранение в автоматизированную систему «ВюАгсЫуо®». В общественный регистр ГСК ПК было передано 4800 (41,50%) криоконсервированных образцов ПК, прошедших инфекционный контроль и НЬА-генотипирование по 5-ти локусам (А, В, С, ОЯВ1, ОС>В1). Клеточный состав концентратов ПК, жизнеспособность ЯСК, количество С045+ЛЛ)34+ клеток и колониеобразующая активность ГСК ПК представлены в таблице 8.

Таблица 8

Характеристика концентратов пуповинной крови общественного регистра гемопоэтических

стволовых клеток пуповннной крови (п=4800)

Показатель M±SD

ЯСКх10"/в концентрате 1666,6 ±738,90

МНКхЮ6/в концентрате 500,14±221,70

%CD45+7AAD-/b концентрате 98,03 ±5,51

CD45+/CD34+x106/ в концентрате 7,24 ±8,86

КОЕ- mix х Ю'МНК 31,20±7,52

Продолжение таблицы 8

КОЕ-Г х Ю'МНК 22,61±1,12

КОЕ-Мх Ю'МНК 16,91±3,65

КОЕ-ГМ х Ю'МНК 27,52 ±2,43

КОЕ-Эрх Ю'МНК 31,73±б,14

Средний объем криоконсервированной ПК составил 20,2±1,2 мл.

При анализе количественного распределения ЯСК в концентратах ПК общественного регистра были получены следующие данные: 702 (15%) концентрата ПК содержали от 363,05 до 999,9x106 ЯСК, что позволяет их использовать для трансплантации у пациентов с весом до 30 кг; 2810 (60%) концентратов ПК содержали от 1000,0 до 1999,9 хЮ6 ЯСК, что дает возможность их использовать для пациентов с весом более 30 кг; 1171 (25%) концентратов содержали от 2000,0 до 4628,ОхЮ6 ЯСК, что позволяет их использовать для пациентов с весом более 60 кг.

В настоящем исследовании была изучена частота встречаемости 2-х локусных (В/С и 01Ш1/1Х}В1), 4-х локусных (В/СЯЖВШС>В1) и 5-ти локусных (А/В/С/01ШШС>В1) гаплотипов. Наиболее часто встречаемые гаплотипы представлены в таблице 9.

Таблица 9

Распределение НЬА - гаплотипов в популяции Московского региона

НЬА-гаплотипы Частота встречаемости (%)

В/С

В*44/С*05 5,60

В*07/С*07 7,90

В*13/С*06 8,40

В*08/С*07 8,40

В*35/С*04 8,90

Ш1В1/0(2В1

О11В1*15/ОС>В1*06 11,10

01Ш1*01/одв1*05 11,10

О11В1*07/ОС>В1*02 13,00

01Ш1*04/0(2В1*03 13,00

0яв1»11/0с>в1*03 14,40

В/С/ОНВ1Л)<2В1

В* 15/С *03ЛЖВ 1 *04/1)С>В 1 * 03 3,01

В*07/С*07ЛЖВ 1*15ЛХ}В 1*01 3,48

В*18/С*07ЛЖВ1*11/ОС)В1*03 3,48

В*08/С*07/ОЯВ 1 *03/Б(ЗВ 1 *02 7,46

в*13/с*0бюав1*07/00в1*02 8,45

А/В/С/О ИВ 1 /Б 0 В1

А*24/В*18/С*07/ОКВ1*11/БОВ1*03 1,63

А*30/В* 13/С*06Ю1Ш1*07/ОдВ1 *02 1,63

А*25/В* 18/С* 12Ю11В1 * 15ЮОВ1 *06 1,96

А*24/В*13/С*06ЛЖВ1*07ЯХ2В1*02 2,29

А*01/в*08/с*07/0яв1*03/00в1*02 3,92

Таким образом, характер распределения НЬА-гаплотипов в популяции Московского региона в целом соответствует таковому у славян центральной и восточной Европы.

Технология поиска неродственных доноров ГСК ПК в Московском банке стволовых клеток основана на подборе пар донор-реципиент, совместимых по 3 генам НЬА- системы и

состоит из ряда последовательных этапов, направленных на обнаружение наиболее подходящего трансплантата конкретному больному.

Этапы подбора доноров ГСК ПК

1.«Запрос на поиск донорских ГСК ПК» из клинического центра

2. Подбор всех совместимых и частично совместимых образцов ГСК ПК по 3 генам НЬА-системы (локусы А, В и БИВ!) на уровне базового разрешения.

3. Выдача результатов поиска с информацией о клеточном составе концентратов ПК и биологических характеристиках ГСК в клинические центры.

4. Запрос из клинического центра на проведение НЬА-типирования по локусу ЭИВ1 на уровне высокого разрешения у отобранных образцов ГСК ПК.

5. Заявка из клинического центра/запрашивающей организации на резервирование или изъятие данных образцов ГСК ПК для последующего клинического использования.

6. Проведение верифицирующего НЬА-типирования резервированных образцов ГСК ПК перед их использованием в клинических центрах согласно международным стандартам.

За период с 2006 по октябрь 2013 гг. в Московский банк стволовых клеток поступило 516 запросов из разных клинических центров. В 448 случаях (86,82%) были выявлены предварительно совместимые и частично совместимые образцы ГСК ПК по 3 генам НЬА-системы - локусы А, В и 01Ш1 на уровне базового разрешения. В 68-ми случаях (13,18%) не удалось обнаружить подходящие образцы ГСК ПК.

В 268 случаях (59,82%) по запросу в базе общественного регистра ГСК ПК были выявлены частично совместимые образцы ГСК ПК с 2 несоответствиями по генам НЬА- А или В (4/6), в 134-х случаях (29,91%) - с 1 или 2- несоответствиями по генам НЬА- А или В (5/6 и 4/6). В 22-ти случаях (4,91%) были обнаружены частично совместимые образцы ГСК ПК с 1 несоответствием по НЬА-А или В (5/6). Предварительно совместимые образцы по трем генам НЬА - системы были выявлены в 24-х случаях (5,36%), из них в 4-х случаях дополнительно были обнаружены образцы ГСК ПК со степенью совместимости 4/6, в 8- ми со степенью совместимости 5/6 и 4/6, в 7-ми - 5/6.

Вероятность подборов донорских образцов ГСК ПК по 3 генам НЬА-системы (локусы А, В и ОИВ1) со степенью совместимости 6/6 на уровне базового разрешения в общественном регистре Московского банка стволовых клеток составила - 1:218 (Таблица 10).

Таблица 10

Вероятность подборов донорских образцов гемопоэтических стволовых клеток _пуповинной крови с различной степенью совместимости_

Степень совместимости Вероятность подбора

6/6 1:218

5/6 1:28

4/6 1:12

По дополнительным запросам клинических центров у предварительно совместимых донорских образцов ГСК ПК с реципиентом выполнялось НЬА-типирование по локусу БИВ 1 на уровне высокого разрешения.

Срок подбора донорских образцов ГСК ПК с момента обращения клинического центра в Московский банк стволовых клеток составлял не более 2 суток, включая НЬА-типирование на уровне высокого разрешения по локусу НЬА-ОЯВ1 у отобранных образцов.

Анализ применения криоконсервироеанных гемопоэтических стволовых клеток

пуповинной крови

По запросу четырех клинических центров (ФГУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева г. Москвы, ИДГиТ СПГМУ МЗ и СР РФ им. академика И.П. Павлова, ФГБУ «РДКБ»

Минздравсоцразвития России, ГБУЗ НО «Нижегородский ОЦК») за период с 2006 по октябрь 2013 гг. было выдано 56 криоконсервированных клеточных концентратов ПК от 47 доноров (9 образцов ПК были разделены в процессе заготовки клеточного материала). Из них трансплантировано - 52 концентрата (в связи с ухудшением соматического состояния пациента в предтрансплантационном периоде 4 концентрата ПК было утилизировано).

Медиана криохранения концентратов ПК составила 48 месяцев (24-72 месяцев). Характеристика концентратов ПК, выданных для клинического применения, представлена в таблице 11.

Таблица 11

Показатель M±SD

ЯСКх10"/в концентрате 1161,89±47,68

МНКх106/в концентрате 549,89±54,67

CD45+/CD34+X10"/ в концентрате 9,46±1,67

КОЕ- mix х Ю'МНК 29,70 ±4,39

КОЕ-Г х Ю'МНК 20,76 ±2,82

КОЕ-М х Ю'МНК 30,04 ±16,52

КОЕ-ГМ х Ю'МНК 27,50 ±3,11

КОЕ-Эрх Ю'МНК 36,44 ±4,73

За период с 2008 по октябрь 2013 гг. было выполнено 29 алло-ТГСК ПК 28 пациентам (одному пациенту была проведена повторная алло-ТГСК ПК в связи с первичным неприживлением трансплантата). Медиана возраста пациентов на день трансплантации составила 3 года (от 3 месяцев до 45 лет). Пациентов мужского пола -18, женского - 10.

Распределение пациентов ГСК по нозологиям и характеристика доноров представлены в таблицах 12, 13.

Таблица 12

Распределение реципиентов гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови по

нозологиям (п=28)

Нозология п %

Острый лимфобластный лейкоз 5 17,86

Острый миелобластный лейкоз 6 21,43

Ювенильный миеломоноцитарный лейкоз 4 14,29

Миелодиспластический синдром 2 7,14

Приобретенная апластическая анемия 2 7,14

Мукополисахаридоз 4 14,29

Остеопетроз 1 3,57

Первичный иммунодефицит 2 10,71

Врожденная нейтропения Костмана 1 3,57

Таблица 13

Характеристика доноров гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови (п=29)

Тип донора п

НЬА- идентичный сибс (6/6) , 3

НЬА- идентичный сибс (6/6) и неродственный донор со степенью совместимости 5/6 2

НЬА- идентичный неродственный донор (6/6) 1

НЬА-идентичный неродственный донор (6/6) и донор со степенью совместимости 5/6 4

Неродственный донор со степенью совместимости 5/6 15

Неродственный донор со степенью совместимости 4/6 4

Согласно полученным отчетным формам (п=27) все пациенты получили миелоаблативные химиотерапевтические режимы кондиционирования согласно установленному диагнозу. В 16-ти случаях в качестве источника ГСК использовалась 1 единица криоконсервированной ПК, в 9-ти случаях 2 единицы ПК от разных доноров, в 2-х случаях - 3 единицы ПК от разных доноров.

Характеристика трансплантата для клинического применения представлена в таблице 14.

Таблица 14

_Характеристика трансплантата ПК (п=27)_

Показатель м±во

Объем концентрата ПК (мл) 35,72±14,87

ДМСО (мл/кг) 0,74±0,46

ЯСКх107/кг 15,07±9,05

МНКхЮ'/кг 7,31±4,82

С045+/С034+ хЮ'/кг 2,58±3,18

Тяжелых реакций на инфузию ГСК ПК отмечено не было. В 5-ти случаях (18,5%) были зарегистрированы транзиторные реакции: 2-х случаях - тошнота и рвота, в 1-ом - гипертензия и тошнота на момент трансфузии донорских клеток, и в 2-х случаях - макрогематурия и гипертензия.

По данным представленных эпикризов применения криоконсервированной ПК приживление донорских ГСК к 100 дню посттрансплантационного периода было зарегистрировано в 15 случаях (55,6%), неприживление (отторжение) в 12 (44,4%). Медиана восстановления гранулоцитопоэза - составила 24 дня (20-31). Восстановление тромбоцитопоэза к 100 дню было достигнуто у 10-ти пациентов (37,3%) в среднем на 28 день. Острая РТПХ развилась в 7 случаях (25,9%), при этом во всех случаях 1-Й степени. В настоящее время, согласно представленным данным из трансплантационных центров, 16 пациентов (59,2%), перенесших алло-ТГСК, живы.

Проведенный анализ продемонстрировал, что клеточный концентрат ПК после криохранения в автоматизированной системе "ВюАгсЫуе®" является полноценным источником ГСК и может быть использована в клинической практике.

Алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими

центрами

В результате проведенных исследований был разработан алгоритм работы общественного банка ГСК ПК (Рисунок 8).

После отбора потенциальных доноров ПК, получения информированного согласия роженицы в дородовом периоде, осуществляли сбор ПК без вмешательства в процесс родов только после рождения ребенка и доставляли ее в регистратуру Московского банка стволовых клеток. Далее проводились регистрация поступившей ПК в базе данных и первичная отбраковка образцов ПК («чистый» вес меньше 60 грамм, нарушение герметичности мешка, неправильное заполнение документации, наличие тромбов и гемолиза, нарушение температурного режима в процессе хранения и транспортировки). В дальнейшем проводили обработку ПК двумя методами с учетом установленных показаний МДЦ и МАВК. После выделения ЯСК все концентраты ПК подвергали немедленной криоконсервации в автоматизированном системе «ВюАгсЫуе®».

Все криоконсервированные концентраты ПК подвергались тестированию с определением групповой принадлежности, клеточного состава, биологических характеристик ГСК, проводили инфекционный контроль, НЬА-генотипирование по 5-ти генам (локусы А,В,С, йЯВ! и й<2В1). В последующем осуществлялась вторичная отбраковка концентратов ПК по

итогам инфекционного контроля. После паспортизации данные о криоконсервированном концентрате ПК вносились в общественный регистр ГСКПК.

При получении из клинических центров/запрашивающей организации запроса на поиск совместимого донорского образца ГСК ПК, в информационной базе Московского банка стволовых клеток осуществлялся подбор всех совместимых и частично совместимых образцов ГСК ПК по трем генам НЬА-системы- локусы А, В и СКВ 1 на уровне базового разрешения. В случае полной или частичной совместимости донорского образца ГСК ПК с реципиентом по генам НЬА - системы, по дополнительному запросу клинических центров у отобранных образцов ГСК ПК выполнялось НЬА-типирование по локусу НЬА-ОЯВ1 на уровне высокого разрешения. При полной/частичной совместимости донорских ГСК ПК с реципиентом осуществлялось их резервирование в базе данных регистра; перед проведением алло-ТГСК ПК проводилось верифицирующее НЬА-типирование резервированных донорских образцов ПК и передача их в клинический центр.

После проведения трансплантации ГСК ПК из клинических центров получали эпикризы применения ГСК ПК для оценки качества выданных концентратов ПК.

Эпикриз клинического

применения

♦

Передача концентратов ПК

в клинические центры

#

Отбор

е НЬА-типирование на уровне базового ра'

Ц е

¿1

Резервирование совместимых образцов ГСК ПК

НЬА- типирование по локусу 0ИВ1 на уровне высокого разрешения у совместимых образцов ГСК ПК

Подбор всех первично-совместимых образцов ГСК ПК по генам НЬА-системы на уровне базового разрешения

Запрос на подбор донорских ГСКПК из клинических центров

ПК

доноров

Получение информированного согласия роженицы

Сбор ПК

Регистрация образцов ПК Обработка образцов ПК

о

Первичная отбраковка «центратов ПК

МДЦ

МАВ

1 ■Ь ::

Криоконсервация концентратов ПК

Тестирование концентратов ПК

НЬА-типирование по 5-ти генам (локусы А,В,С, 1ЖВ1 и 0()В1)науровнеб разрешения

Паспортизация К1 ПК

Внесение данных концентратов ПК в общественный регистр ГСК ПК

Рисунок 8. Алгоритм клиническими центрами

взаимодействия Московского банка стволовых клеток с

Таким образом, проведенное исследование продемонстрировало, что оценка качества криоконсервированных ГСК ПК, предназначенных для клинического применения, является ключевым моментом в работе каждого современного банка ПК. Целесообразно проведение полного комплекса по оценке качества заготовленного материала всесторонне характеризующего трансплантационный материал и включающего: исследование клеточного состава концентратов ПК, биологических и иммуногенетических характеристик ГСК ПК после криохранения.

ВЫВОДЫ

1. После криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» клеточный состав концентратов пуповинной крови и биологические характеристики гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови незначительно изменяются. Отмечается снижение общего количества ядросодержащих клеток и нейтрофилов (процент сохранения - 87,01% и 78,6% соответственно); CD45+/CD34+ клеток (процент сохранения 93,7%); колониеобразующей активности гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови (процент сохранения KOE-mix-99,3%, КОЕ-Г - 85,03%, КОЕ-М - 81,3%, КОЕ-ГМ - 82,34% и КОЕ-Эр - 69,4%).

2. Клеточный концентрат пуповинной крови, полученный методом автоматического выделения клеток, после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» содержит больше нейтрофилов и CD45+/CD34+iüieTOK, по сравнению с концентратом пуповинной крови, полученным методом двойного центрифугирирования (85,31% против 80,21% и 95,61% против 84,52, соответственно).

3. Клеточный концентрат пуповинной крови с величиной гематокрита от 12% до 39% после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» содержит больше CD45+/CD34+KneTOK и меньше ядросодержащих клеток, по сравнению с более высокой величиной гематокрита (процент сохранения - 96,32 % против 89,06% и 84,8% против 89,51%, соответственно).

4. Клеточный концентрат пуповинной крови с концентрацией гемоконсерванта CPDA от 30% до 60% после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®», содержит больше CD45+/CD34+iyieTOK и меньше мононуклеарных клеток по сравнению с концентратами пуповинной крови с более низкой концентрацией гемоконсерванта CPDA (98,96% против 88,52% и 99,73% против 96,01%, соответственно).

5. Отечественный комбинированный криопротектор - ДМСО+реополиглюкин сохраняет качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови во время криохранения.

6. Частота вероятности совместимости пары донор - реципиент по 3 генам HLA системы (локусы А, В, DRB1) по данным общественного регистра гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в Московском банке стволовых клеток составляет 1:218, а характер распределения гаплотипов в целом соответствует таковому у славян центральной и восточной Европы.

7. Разработан алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации с учетом международных рекомендаций NETCORD -FACT.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При использовании криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в клинической практике необходимо учитывать, что после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» процент сохранения ядросодержащих клеток составляет 87%, a CD45+/CD34+ клеток 93%.

2. Метод выделения ядросодержащих клеток, величину гематокрита и гемоконсерванта CPDA до криоконсервирования пуповинной крови рекомендуется учитывать при оценке трансплантационного материала для конкретного больного.

3. Отечественный комбинированный криопротектор - ДМСО+реополиглюкин целесообразно использовать при заготовке клеточных концентратов пуповинной крови для длительного криохранения.

4. Алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации и разработанный с учетом международных рекомендаций NETCORD - FACT рекомендуется использовать при создании, работе и усовершенствовании подобных учреждений.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ В РЕЦЕНЗИРУЕМЫХ НАУЧНЫХ ИЗДАНИЯХ:

1. Кобзева И.В. Оценка качества криоконсервированной ПК до и после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» в Московском банке стволовых клеток /Кобзева И.В., Астрелина Т.А., Яковлева М.В., Карпова Е.Э., Круглова Я.А., Боякова Е.В., Шахпазян Н.К., Гомзяков А.Е.// Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.-2013.- Т.8, №1 - С. 19-23.

2. Кобзева И.В. Алгоритм работы Московского банка-регистра стволовых клеток /Кобзева И.В., Астрелина Т.А., Яковлева М.В., Карпова Е.Э., Круглова Я.А. [и др]// Клеточная трансплантология и тканевая инженерия,- 2013.-Т.8, №2. - С. 69-74.

3. Кобзева И.В. Результаты работы регистра доноров пуповинной крови московского банка стволовых клеток/ Кобзева И.В., Астрелина Т.А., Яковлева М.В., Карпова Е.Э., Круглова Я.А., Боякова Е.В., Лебедева Л.Л., Пухликова Т.В., Шахпазян Н.К., Гомзяков А.Е. //Журнал Гематология и трансфузиология.- 2013. - Т.58, №3.- С.13-18.

4. Кобзева И.В. Системный подход к обеспечению качества гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови для клинического применения /Кобзева И.В., Астрелина Т.А., Яковлева М.В., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Лебедева Л.Л., Боякова Е.В., Круглова, Я.А., Шахпазян Н.К., Скоробогатова Е.В., Паина О.В. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия,- 2011.-Т.6, №1.- С.55-58.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ В ДРУГИХ ИЗДАНИЯХ:

1. Кобзева И.В. Контроль качества в организации работы государственного банка стволовых клеток города Москвы /Кобзева И.В., Астрелина Т.А., Яковлева М.В., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Лебедева Л.Л. [и др.]// Менеджмент качества в сфере здравоохранения и социального развития.- 2011.- №1.- С.129-133.

2. Кобзева И.В. Оценка качества и безопасности использования криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови/ Кобзева И.В., Астрелина Т.А., Яковлева М.В., Карпова Е.Э., Лебедева Л.Л., Боякова Е.В., Круглова,

Я.А., Шахпазян Н.К., Скоробогатова Е.В., Паина О.В. // Материалы V научно-практической конференции «Современная гематология. Проблемы и решения». - М., 2011.- С. 22-23.

3. Кобзева И.В. Пуповинная кровь как источник гемопоэтических стволовых клеток для аллогенной трансплантации у детей / Кобзева И.В., Астрелина Т.А., Яковлева М.В., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Лебедева Л.Л., Боякова Е.В., Круглова, Я.А., Скоробогатова Е.В., Паина О.В. // Материалы XV Конгресса педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии»,- М., 2011.- № 409,- С. 410.

4. Кобзева И.В. Оценка безопасности применения криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови / Кобзева И.В., Карпова Е.Э., Астрелина Т.А., Яковлева М.В., Круглова, Я.А., Боякова Е.В., Лебедева Л.Л., Скоробогатова Е.В., Паина О.В.// Материалы XXXIX сессии «Мультидисциплинарный подход к гастроэнтерологическим проблемам»,- М., 2013.- С 156-157.

5. Кобзева И.В. Качество и безопасность применения криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови / Кобзева И.В., Карпова Е.Э., Круглова Я.А., Боякова Е.Э., Лебедева Л.Л., Скоробогатова Е.В., Паина О.В., Астрелина Т.А., Яковлева М.В. // Материалы VII Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития».- М.,2013. - С. 36-37.

6. Яковлева М.В. Вирусный контроль в мезенхимальных стволовых клетках для клинического применения / Яковлева М.В., Астрелина Т.А., Шахпазян Н.К., Гомзяков А.Е., Авсарагов А.Б., Кобзева И.В., Карпова Е.Э.,Скоробогатова Е.В. // Материалы XXXIX сессии «Мультидисциплинарный подход к гастроэнтерологическим проблемам»,- М.,

2013,- С. 167-158.

7. Irina Kobzeva. Quality umbilical cord blood hematopoietic progenitor cells cryopreservation banking in Moscow / Irina Kobzeva, Tatiana Astrelina, Elena Karpova //40th Annual Meeting of the European Society for Blood and Marrow Transplantation.-Milan, 2014,- Vol.49.- Р-590,- S484.

8. Kobzeva I.V. Umbilical cord blood as a source of hematopoietic stem cells for allogeneic transplantation / Kobzeva I.V., Podkolzina E.A., Karpova E.E., Lebedeva L.L., Kruglova Ya. A., Skorobogatova E.V., Paina O.V., Astrelina T.A., Yakovleva M.V. // Annals of Hematology. -2011.-Vol.2.-№1.- SI 12.

9. Kobzeva I.V. Umbilical cord blood stem cells for allogeneic transplantation / Kobzeva I.V., Podkolzina E.A., Karpova E.E., Lebedeva L.L., Kruglova Ya. A., Skorobogatova E.V., Paina O.V., Astrelina T.A., Yakovleva M.V. // Bone Marrow Transplantation.-2011.-Vol. 46. №1.- P.555.-S134.

10. Kobzeva Irina V. Quality and safety when using cryopreserved umbilical cord blood / Kobzeva Irina V., Tatiana A. Astrelina, Mariya V. Yakovleva, Elena E. Karpova, Elena V. Skorobogatova, Olesaya V. Paina, Lidia L. Lebedeva, Nicolay K. Shakhpazyan, Elena V. Boyakova, Yanna A. Kruglova. //Cellular Therapy and Transplantation.- 2011.-Vol. 3. -№12,- P. 3.

11. Lebedeva L.L. Distribution of HLA haplotype frequencies in Russian populations of Moscow and St-Petersburg / Lebedeva L.L., Pukhlikova T.V., Kobzeva I.V., Astrelina T.A., Sokolova I.V., Pavlova I.E., Bubnova L.N.// 8th East-West Immunogenetics conference.- Austria,

2014.-P.31.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Алло-ТГСК - аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток

ГСК - гемопоэтические стволовые клетки

ПК - пуповинная кровь

КМ - костный мозг

ЯСК - ядросодержащие клетки

МНК - мононуклеарные клетки

о.РТПХ - острая реакция «трансплантат против хозяина» хр. РТПХ - хроническая реакция «трансплантат против хозяина» CD - (clasters of differentiations) кластер дифференцировки AT - антителла

CPDA - гемоконсервант (цитрат + фосфат натрия + декстроза + аденин) HLA - (Human leukocyte antigen) человеческие лейкоцитарные антигены ПЦР - полимеразная цепная реакция ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДМСО - Диметилсульфоксид

7-ADD - проникающий краситель 7-аминоактиномицин D

МАВК - метод автоматического выделения клеток

МДЦ - метод двойногоцентрифугирования

KOE-mix - колониеобразующая единица смешанная

КОЕ-Г - колониеобразующая единица гранулоцитарная

КОЕ-ГМ - колониеобразующая единица гранулоцитарно-макрофагальная

КОЕ-М - колониеобразующая единица макрофагальная

КОЕ-Э - колониеобразующая единица эритроцитарная

% сох-ия - процент сохранения

Подписано в печать: 22.05.14 Тираж: 100 экз. Заказ № 1094 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект, д. 74 (495)790-47-77; www.reglet.ru