Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Функциональное состояние инсулин-продуцирующего аппарата поджелудочной железы и некоторые показатели аутоиммунитета при хроническом введении глибенкламида

? 01 9?

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ УКРАИНЫ

харьковский мадащинский институт

На правах рукописи

ГЛАДОК Александр Иванович

ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ШСУЛИй-ПРОДУЦЩ'УШЕГО . АППАРАТА ПОДШУДОЧНОЯ ЖЕЛЕЗЫ И НЕКОТОРЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ АУТОЙШУШТЕТА. ПРИ ХРОЯИЧШШ ЗВЩНКИ ШБШШМИДА

14.00Л7 - Нортяьпая физиология 14.00.03 - Эадокриаогопгя

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация та. соиоканаа ученой стапенг кандидата метотзшсквх наук

Харьков - 1392

У

■ Р&Зота выполнена в Харьковском НИИ эндокринологии ж

ВЕШ ГОРМОНОВ,

Научный руководитель - доктор медицинских наук

В.В. Полуорак

Официальные оппоненты - доктор иедшршсшпс наук,

профессор I.A. Стулий

. доктор мадягрзкскшс наук, профессор В.А. Чуйхо

Вэдущая организация - Киевский НИИ эндокринологах и

OÜS8ES веществ, г. Киов

Защита диссертации соотсигса февраля 1992 г.

_ ^ХГчас. _ /Сшш. па заседании специализированного совета Д 088.23.04 в Харьковехо^ медицинском ансгитуто (310022, Харьков—22, пр. Ленина» 4, аудитор®! клиника нарвшх болезней),,

С даооортадЕвй ш*но озвзгсвшться в бгбгготока . Харьковского, кеда®шоксго кнототута

; Авторофэра» разослан января 1932 года

J^effiit сеярэтарь специализированного совета-, fficl^ 2У<5ракова Л.Д.."

v

онш штщсшА работы

В настоящее время возросли требования к реальной компенсации сахарного диабета» что диктует необходимость повышения гффектквностя антидиабетической терапии, в частности, перорального использования сахароснижаадах сульфаниламидных препаратов. Последнее не возможно осуществить без уточнения путей реализации специфического (гзтогдикемического) эффекта указанных лекарственных средств, а также решения вопроса о влиянии длительной сульфакилаедотершшя на компенсаторные возможности панкреатических бета-клаток. Сведения литературы по этим вопросам крайне противоречивы (обзор В.В.Полуорак, А.И.Гладких, 1985). Заслуживает внимания сообщения о потенцирующем эффекте глибенклашда ж толбутамада на раз витке стрепто-зотощшового и аллоксаноього диабета у крыс / 1кеаа а1.» 1986; Ка*вива^ е* а1. , 1986/, хотя, с Другой сторона,приводятся данные о иоЕзменвшшм панкреатическом содержании инсулина, тенденции к повкаенному биосинтезу последнего и избирательном характере сюшанной реакции бета-клеток (только на глюкозу) при длете.^нал введении терапевтических и фармакологических доз глкбокклашдр. мшам / ЗоЬт1а1 еъ в1. г Г^ЗО/« Имеются предсэсчлки для постулирования еутоигшунного генеза изменений шеулин-продуцирущого аппарата поджелудочной азлэзк при судьфаниламидотерашш /А.С. Закс и соавт., 1983; а! а!., 1977; М 1'-аг1о ^ а!., 1933; С1е1сЬвап еХ а1. ,1984/.

До настоящего времени остаотся нерешенным вопрос о возможном участки хронической сульфанюгаыидотерагога в зволщиа сахарного диабета. Наличие клинических данных о сшгаании секреторного ответа йета-клеток, а также о развитии у части больных инсу-яян-неэавкскшм диабетом вторичной инсуяиновой зависимости после нороралыюй гераллл сахаросшггакци.сг сульфаниламидами обусловливает целесообразность глубокого изучения состояния инсу-джн-продунируицэго аппарата подаолудочной валезц (образования и выделения инсулина) и существенных механизмов возможного по-преждаэдого действия сульфаниламидов (в первую очередь в результате гиперстшуллдю! к ля развития аутоиммунных тергентнше реакций). •

Д02Р^£сД91О]задаа. Определить характер влияния хронической сульфанидамидотерадии на дкабетогеноз с учетом пола животных,

I. Характеристика эффектов длительной обработки глибэнкламвдом яивотных без наследственной предрасположенности к сахарному диабету на глнкозшй гомеостаз и функциональное состояние панкреатических бета-клеток (биосинтез и секреция; инсулина).

2. Выяснение роли длительной сульфаниламидотералки в эволюции инсулиаовоВ недостаточности у шшей со спонтанным генети-ческг-детершшировгяным сахарным диабетом.

.3. Исследование некоторых показателей аутоиллунитета, главкам образом, оргаяоспащфгческого, при длительней сульфанилами-дотерапии (димфоцпэрная гэ|ильграцш1 панкреатических остров-ют, спедефзческая сенсибилизация организма к антигенам подае-лудочвой голэзы ж комплемент-зависимая антитело-опосредованная цитотоксичность),

4. Установление участия мутаятного гена db (diabetes)

и пола животных в реализации бета-цитотрогшых эффектов гяибен-кламида.

5. Экспарааанзальное "изучение возыоетюотя направленного модулирования компбноаторннх свойств бета-хлаток (исследование нетрадиционных схем прнневания сульфаналаявдогэрапЕи a обоснование их использования при разработке пагогенотвчаских принципов лечения сахарного диабета Е тгпа),

Даущая новизна. ВяорЕыэ получены данные о влтшшп глибен-кгшмида на соиряхенкув данамэсу функционального состояния тосу-лан-продуцярущето аппарата подааяудочной гзяэзн и развития , таргеятннх (органосггещ^кчоских) аутоишунных реакций. 'Определена потеяцирукдая роль сахароснижавдего сульфаниламида, в эволюции инрулин-независншго сахарного диабета в нНсулин-завися-мую форму, а такие значение.муталтного гена db (aubetee) для проявления повреэдавдих бета-датотропних и ичмунотропшд эМ>о"-тов, индуцируемых хронической обработкой юшотянх глибонкла'-м-дом. ' ■■ •

2e¿peT£4ecssg д р^Хизе^кая^знази^ост^. Впервые в эксперименте доказана возможность трансформации природы сниженного секреторного ответа бета-клеток от функционального (кожтенса-

торная реакщш) к морфологическому (деструктивно-дистрофические изменения) при длительных сроках введения препарата. Получены доказательства инициирующего действия дательной суяьфанилаа®-дотярапии ш развитие аутоаграосш к панкреатическим бега-клер-кш (инсулит) /а.с, й 143965/, установлено значение дозы гена ¿ь и стада сЕовгавного даабзтогенеаа (независамо от пола яи-еотншс) для реализации альтернрувднх эффектов глибенкламида, обоснован ревертиваый характер индуцированных гяибенкламядш изменений после црекреденгя сульйашлагадотерапш. Теоретические предпосылки легли в основу патогенетического подхода при создашш цетодаческих рекомендаций по лечению больных сахарным диабетом П тша сахароснЕЩШзаии препаратами /"Использований суяьфаниламэдотерапии при сахарном дшЗате"/.

Положения, выносимые на заащту : ;

1. Глибенклашщ в терадэвтичасхшй дозе при длительном вве-

. деши оказывает повреЕдаадкй-эффект на морфо^ункцкональноа со- ■ стояние. панкреатических бета-клеток и шшщшрует развитие аутоиммунных реакций к антигенам панкреатических островков. :

2. У мышей С57ВУ к&лг - аь / аь с генемяаски детерминированным сахаркым диабетом хроническая сульфанила^ыдотора-тш потенцировала нарушения глзкозного гоиаоотаза нэзаглсимо от стада дааботогенеза и пола гивотшх, индуцируя развггие оргашспецифических аугоикцуннах реакций только па рашгшг1 этапах спонтанной инсулиновой зависимости. ." -

3. Реализация повраадащего Еф$екта глибенклавдда на пая- . креатлческпе бега-клатка к 'анрааеиносгь аутоиммунного шсудага зависят от доз» гена аъ (аутосошо-рецессщдай ген ' усиливает повроздаадяй эффект гшбёнклашда). .

4. Использование прерывистого способа обработки препаратом сшшает бета-цитото1ссически& эффект хрошгчяской суяьфанила-мвдотерапии и индуцированных оргшюспецифлческих аугошлушнх реакций. ,-."•■-• • • • -

Реа^зш^я^дэ^льтдгов^ос^сдо^^М«

I. Результаты исследования явились ватогеншжюст! бЗсо-» новшисм при проведения ряда клинических, работ: "Значение врэ» манного фактора в реализации паякреатичоского а етепанкреатл-ческого-механизма действа гднбешадздда /Ё.П, Тихонова,

B.B. Полторак, Л.й. Гладких ж соавг., 1990/.

2. По иятеряаяэа дисезртадгга аояучэпо авторское с?лдэ-тольстзо "Способ кодеднроваяяа сахарного диабета" /а. с. H43955S СССР ШШ 5 09 В 23/28/.

3. Изданы мзтодэтескяэ рекомендации "Использование сулы^а-нзламидотератак яри сахарном диабете" /Е.Л.Ткхсясеч, 3.3.Полтора?. „ Т.П.Левченко, З.Н.Бяохзгеа, А..И. Гладких/ и внедрены в раде областей Украинской ОС? (Терзопольской, Одесской, Луганской, Крымской, Ивано-ФранковскоЙ, КяеьскоИ).

4. На оснозаниа аояучзкныг дакних з Харьковском ЯШ эадо-кранологхпг и химии гормонов планируется дальнейшее изучение ?гэ-хашкт действия дгатояьной сульганплакидотврапик о дельэ повн-шеннл г@екткзпоста а предупреждения ее осложнений (з первую очередь, снагение часто?« развитая зторачной сульфзяилаждоре-зисгентности)„

¿ггообзз^я. Материалы дяссертацли долог.еяц на заседаниях Харьковского отделения Всоеоотного общества эндокринологов /1386, 19: Э, 1990, 1991/; патофизиологов /1957,. 1990, 1391/,на SI Зсесоязноы съезде патофизиологов /¿989/, на 17 Всесоюзном съезд? эндокринологов /1939/, на У я 71 съездах фармакологов Украинской CCI? /1985, 1Э30/. До материалам диссертация опубликовано 37 работ.

Объем 2ргос9ртеяш5. й!сгергадия изложена на /61 этражщаг махинолисного текста, вкдичая 24 габлкдаи 19 рисунков и мивро-йотохрафлй, состоит яз введения, обзора литературы, главк, по-сшпонкой дадаряагу я ытеодам, ислользованяш з работе, 2 глаз собственных исследований с обоуздбггаек полученных результатов, зазшязняя и выводов. Библиографический указатель охезтнвзот 235 нлЕлэяозакия, в та-л число 203 зарубояшг авторов,

Мата^иагщ л метс^^ксс^езоаго!^. Настоящая работа выполнена на 120 половозрелых хро::яхах-сгчазх города "япкшляа" (moca тола 2,2 - 3,0 xí), 118 крысах-еа'/дах популяции Бпстар (масса тела 0,lö - 0,22 кг) и на 133 Miciax обоего пола »дугантяоЯ линии С57Еь/к3JY (масса тела 0,015 - 0,013 кг). Ллеьсек-коз ядро ш&кЗ получено из огдета генетики }Ш биоглоделей АЖ СССР, лсслйдоваяпв проведано на полэзозрвлис С57?1./'.э-т?

носуцлс сугосо:>но-рацос<жш£.1 ГОН db В ГОМОЗИГОТНОМ 'сЪ

л гетероз::гет1!оа состояния, а такке без гена db

(d •*/ •* а) „ Ген db , располонакяый на 4-S хромосома 8-2 группы сцепления, з гоадэзкготном состоянии индуцирует у взрослых ггл-EOTjffix развитие инсулин-независимого сахарного диабета (!КЗСД), который в последующем трансформируется в зшсулин-завксгелуг. £ор- . цу (этот пароход происходит в 5 - б месячном еозрасте). Ген а f si sty) в гомозиготное еостояниа осветляет окраску аерстл и является маркерои оппоззтвой хромосом, не несущей гена аъ К началу воздействия гяибаннлададом возраст жеой составлял I и 3 м-цз. Б ьтал возрасте взятые в эксперимент г.нпи db •*■/•*■ üb находились соотгогствекно на стадии скрытого (базаяьная яорко-тикечпя) я улгафестного (базгяьнгя гипэргжкемля) 5ШЗСД. Контрольные шгЕОгшэ соответствующих генотипов баяи адекватна ошгт-ным по возрасту а толу. С цель» определения возможного влияния полоеш: различал на бета-цятотропннэ эффекты глибеккламяда в атой сараи исследований использованы кшв otfoero пола, Как и при я&тужции нкзиодозового стреатозотощшового диабета / Ute , F.oosini , I9?S/. Использованные две модели янсулиповой нэдос-таточсюсти, генетическп-детериинировазной и хиьшески-индуцируе-мой, характеризуютсл соответственно отсутствием и четкой выраженностью полового диморфизма при развитии сахарного диабета.

Г.т1б9,ткламкд (сахароешкалдай препарат П генерации, сико-уимы: манинил, гугявкон, даонил), наиболее агроко распространенный upenapav этой группы, вводился в терапевтической для животных дозе, а к.:окио - I мг/хг массы тела в день рзг оз д. /З.И.Корчин, ID8I; Schnittt et al. , 1980; Sodbyes et al., 1933/. Кипам препарат вводился при кратковременной обработка с ; помочь» зонда, при длительной (3 ы-ца) - с питьевой водой / Schaidt et , al. 1930/,'красам препарат подаешвали в корм, . а кроликам навеску препарата вводили ежедноачо per оэ . донт-рояьные як?, от ты получали аналогичным образом - placebo

Длительность введения препарата у шлей составила 14 дней. и 3 м-ца, 9 м-цеэ у кроликов я крыс. Для вачлононяя специфического бота-цетотр<шого эффекта глибенкламида в одной из серий псслсдотяая tra кроликах проведено изучзнле несахаросниааадего судьфсишвдда норсульфазола'з дозе I от/кг per оа ежедневно на протякснак Э м-цев.

S

Исследование функциональной активности бета-клеток в целостном организме проведено в базаяьнои состоянии и во время нагрузочных специфических тестов с глгкозой. У кроликов использована порораяьная и внутривенная нагрузки глюкозой (I г/кг массы тела per оа а 500 itr/кт массы тела внутривенно) после IB-часового голодания - ОПТ и ВТТГ. Взятие проб крови для определения содержания инсулина и гликег.от проводилось до-и через 30, 60, 120 ж 180 дан после шэрсральной нагрузки глюкозой и через 3, 5, 10, 30 и 60 vm после внутрттвенного es введения. Уровень ю.елуяорэвкгяЕного инсулина (ИРИ) б периферической кро-, вя характеризует.секреторный ответ бета-кяетск в услоэглх целостного организма. В связи с технически!ли трудностям нроввде-кия ОПТ и ВГГГ у бая использован внутрибрщхнннй тест о глтозой - ВВГТГ (2 г/кг иасси тела) с определением глжсэы крова до- и через 30, 60, 120 а 180 мян после нагрузки глюкозой, Кроме абсолютных показателей гликемии в определенные временные точки, олониади еэ ютегральнув величину на протяяенга всего теста / Hah» et al. , IS60/« '

Функцию бета-клеток la vivo оценивали также по пнтен-, сивности повышения гликэшш ж длгяеяьностя ее сохранения, при ■ моделировании острой инсулшовой недостаточности. введением ел-тиЕноулянозой сыворотки нерезких свинок (АЖ) по "oloaoy и • со val . /1955/. in vitro J" для определения, функциональной актавносга бага-клэтек использовала модель изолированных пан- . . креатических остроекоз крас Вдстар посла воздействия la vivo ' глибепкла-эдом.

Определение иноулина проведено радкопшунологичееким методом "двойных антител" Salee и Handle /1963/ О исполь-зовашем наборов института гзотопой /БУдапеат, Велория/, а также яайороз Института бгооргашгееской хпмиг АН БССР.

•', Панкреатические островки выделялась модифицированным могодом Woakalíwaldl / íiegler, Battler et al. , 1974/.По 5 островков сходной величина инкубировались а буфере Кребо-Р^и-гера с добавлением кг i-es , сывороточного альбумина и 13 аминокислот с 5 и 15 Ш глпкоэн. Посла окончания инкубация и взятия проб дал определения сокразди инсулина, остроЕ'ги. подвергались хаслотяой вхстраадс: / Hovwi, fey lor , I06S/

с после.вуюцк.1 определенней HPK.

Содержание сахара в крови определяли методом Хагэдорка-Пенсена, в серп: исследований, проведению: на мышах, гликозу -орто-толрдаяовкк методом с яоглоцыо наборов ЕЛО "EÍ0IAP",

Для оценки уровня антител х ДНК использованы набора -vnti ' - BfA !cit фврмн "Jteerohaíi" /Англия/, характеристика епе-Цсйаческсй сенсибилизации орггишзиа к антигенам поджелудочной яолезк проводилась по реакции икгибированпя мигранта лейкоцитов СР1Ш) с антигенами аодтелудочкой аеЛезн новорожденных ш-шеЯ. Сыворотку эхегоршантаяьшх животных йснользовали для определения кошлемент-зависакой антитело-опосредованной цито-, токсичности (КЗАОЦ)., направленной против клеток паккреатиче- ; - ских островков Еоворозденннх, крыс попуяяцпи Вистар,

Для БЕЯВленкя Еозможах деструктивна процессов, а также 'обнаружения ли-фоцитарноЗ инфильтрации додаелудочньк желез (ин-сулит) последние подвергали гистологическому исследованию, Окра- шивала препарата гемалокекдином Майера и эозином, для дз^ерон-сировка бета- и aroja-клегок яспользозаяа хрои-гшатоксиллн-' флоксинозш! пагод окраски но Гоморя.

Количествэнноэ выражение уровней глюкозы, инсулина, антител к дас представлено в Кевдународаой системе единиц (СИ) /Г, Лнппэрт, 1930/. Сгагкстичйский ачализ полученных результат тов проведен цо Сгьюдэязу-Фашеру /Н. Бейли, 1959/, а также не-J парамагричоекгош методами /£.0. Гублер, a.A. Генкян, 1973/. 3 дальнейшем при изложении фактического материала обсуадаптся статистически достозсршо различая, . . -

рю/дагАти иссвдшш и их обсщешш/

В первой частл исследования изучены некоторые показателя гормондтано-иотаболлческого гомеостаэа, главным образом, функциональное состояние бета-клоток псдкелудочйоЙ железы, у екво? та (кроликоа и крыс) при длительном введении гзотбенкламида,

Дина-шса секреторного ответа бетагклетоя на глюкозу, o:ips деленная. in v¿vc после длительного воздействия глябешелами-да в дозе, ¿.'Ызававдай'при однократном введении снижение глжен иш и поштнио иноудиткии, не коррелировала о состоянием;

глюкозкого гомеостазд. Отмечался.преходяща! характер сахароски-у/шдсго действия препарата на ¿¡азальнув глккешзд; достоверное падение сахара крок: обнаруживалось на протетэгси З-иссячного воздействия, з шслодувщек огрт эффеет из носил.закономерней характер. Снт*е;шн]5 секреторный ответ бзта-к.тетох на ,г/гкзкозу вплоть до полного ого отсутствия наблюдался через 3, 6 л 9 гл-цез, уменьшение толерантности к глюкозе отмечалось через 9 м-цев (табл. I). Сохранение нормальной толерантности х'глпкозэ в отсутствие секреторного ответа бета-клеток (3 и 6 к~цев) является. косвешшм подтверждением .экстраланкроагкческого дейст-вм сахаросшггаюка сульфаниламидов, провалирущем при их хроническом введении

При моделирования инсулиюзой недостаточности введением A15G наруионпе гшгерг.такэмнческого отвота на острую нейтрализация кнпудана специфическими аатотеламн (достоверно больная степень гкпбрг,т.шетш з более длительнее ее сохранение по сравнения о K0HTp0jrj'j.?ni улшоткы'.я} наблюдалось ухе после З-кеагшоЙ обработки препаратом (табл. 2).

Гистологическое исследование поджелудочных желез ягаоттос, обработанных препаратом на 'протшг.овия 3 м-цев, выявило в бета-клетках 20 - 24 % островков явления гидропическоЗ дистрофии, фрагмонтадаи и распад ядер. В 3 - 5 % островков о дистрофическими из.менонияия имел место аутоиммунный иноулит (г.с-^оцггар-пал гафильтрадея). До иере увеличения сроков ввсде:гая изменялась^ частота обнаружения дистрофических измэлезяй а их тягесть .(преимущественно гидроппческая дистрофия). Так, после 6-иесяч-,ной .обработки препаратом "в 40 - 50 % островков отмечены дест-руктявныо процессы, в 15 - 25 % из iras выявлена лголфоцегшдар-ная инфильтрация. У нгвотных, получавших гякбе:лсламяд на про-; нкеявя 9 м-цев, в 80 - 90 % островков отмечены явления гидро-пической дистрофик при отсутствии яямфоцоллюд.'тряой кнфильтра-цни.

Следует отметить равертивтай характер вшгвлэяжде нами бэ-та~цэтотохсических аффектом хронической судафаютатящотвраппи. Спустя два месяца после прекращения S-мэеячноЯ обработки кроликов гдибенкламздо;.'., вызывавшей исчезновение реагспи бвта-клэ-ток на фнзиологЕпеский секретогон, полностью восстановилась их

Таблица I

Иноулэдбиая (пмояь/л) у кроликов, получавших глибонхяамзд, к контрольных

но'время ВТТГ .

Т I Йсходнчй" Т - - -иостъ зоздаватвия | | уровень { 3 мин ; 5 мин } 10 мин \ 30 мин { 60 шта

Глдбвнкламид, 3 М-3» 5 191+61.1 270+41,3 309+С2.3 233+53,4 284+45,6 189+37,6

Контрольная груша 5 201+34,0 408+50,а 337+30,3 353д43,6 264+60,1 231^52,б

Р ' <0,05 -¿0,05 <0,05.

. 0,1>р1>0,06

ГлиОошслаьВД, 6 »-Ц5В Й 211*24,5 296+49.6 281+31,7 270^33,7 274±12,3 340+34,4 Контрольная группа '6 190+20,0 339+57,8 300+59,£ 272+71,4. 232+36,1 183+12,4

Р <0,05- <0,05 "

Глнбанкламид, 9 н-цев 5 157+15,5 152+14,0 154±14,5 147+14,2. 147+13,9 145+15,2

Контрольная группа 5 135+11,2 891*16.4. 238+10,3 2С8+10.7 24Щ3.8 148+14,0

,Р <0,р2 <0,01 <0,01 <0,02

?1 <0,05 <0,01 <0,{)Г <0,01

Условный обозначения: Р - при оранноншт данных, полученных у кивотныху казной группы о

исходным уровнем;

Р| - щит сравнения дашшх, полученных у подопытных к контрольных

ЗЕНВОТКЫХ.

V » - I

I

I V

JlO

I___

I t

rj

u>

СЦ P*

ОУ

ui со

SI

a>

Mi V

ax

M

<n

--

К 1 f I M I

в..

о о

м-'

й. V

о.

№

ф

С«,** О НО.

ч f-( Л» « О р» - «п GJ s г-

сГ со' ы о +1 у ю v о* áj о V 1

чс* ю я и . СО нн t'-

es t—t СО о s Cl IT) to о M •о в M о

0 о J-1 V 1 ? о. о +1 V a Y % со о V о V

оГ ►Ч о со и

41 1-4 Ю

•о о о

о о о" ¿IV V

ю !-)

С- У.

M о с

Ч"

M

с- м 1Я о

гГ

I-«

о m

£> О

t-í о

4v

см

я fV Й-

1Л

4,

ет Î

1

•н ■

о

с

xf О Ю

M О о

1-Г о о

$ V V

СО M

1р О Ol о

. о, о v

«5 ■ Ol со

<4« M . M

о о. '' о

■н

1гГ w> - о

И, Ра

в

I

а

ы

о

м. О

¿'V

о о м" о"

4v

to M

fr

Й-s. s

л

c^ щ ю о о. о

О, о о" ¿"VV

СО

t-< Й О И)

— ю о о

ООО

«У V V с?

M

to m M О

• A

n. о

•с и (С о

о, о

Ю 10 и о 3 8 m о (-Н О о

но" 4 v о* о V о V iß

«г и е-* M со гН

Cl cv U5 ■ '

% ÍW

to >

Г-1 Рч M Р-ч гх.

1Я W ' (П - ю

4

а

cu

Г)

функциональная активность, т.е. взличзша секреторного ответа панкреатическое бэта-клеток "глюкоза - инсулин" не отличалась от наблсдазаойся в контрольной группе яавотшсс.

При использовании панкреатических островков, -вцделещщх-у крыс, получавших в теченпз 3 м-цев глкбеккламлд (I кг/кг массн тела) отмечено умеренное повышение секреции инсулина, кнрущь-руемой высокой концентрацией глюкозы, а тагско его содержания в островках по оравнении о показателями, обнаруживаемые у контроль!^ клеотных (Р < 0,05) (табл. 3). йдесте с тем, при удлинении сроков сведения препарат-а (6 и 3 гл-цов) сокроторшй ответ бета-клаток на шоокую (15 мМ) концентрации гялкозы п инкубационной среде уменьшался и бнл достоверно нда, че;л в островках тшхактнш: жьотных. Наряду с этим, наблюдалось снижение содержали« стсуяида в изолированных панкреатических островках животных, обргботшшкх.тлибзнкламэдом (си. табл. 3).

Таблица 3

Вл&таг.е длительного введшгая глибо.чклашдя (I кг/кг массы тола) ка секреции и содеыдние • инсулина иэолирогшшыг.ш острргкаьаГкрнс

лг.х-ктср и для-! ! Концентрация глккозы в среде !0одор?лкие толькость воз- ! ! „ кикубаггш _ _ !инсулина-дойстгнк ! . 1 ' 12-Э.Г ! пмоль/ I !сэ~рёщи~к!5с7-тсёкр^я йпсу- ¡остоопок . ! ! ллюа-якзлъ/остМ лина-пмоль/ост-! _____„___!__'додод д 2 з _ 1Р£ВО,К_'_2_Ч_>_<-, ,!. _ _ _ _ „

Гтабоякдашнд,

• 3 к-ца 10 0,44*0,04 1,8%0,12 ^ 13,80+1;,10х' Контрольная -

1*ру::па ' 10 0,48+0,0'! 1,о2+0,15 10,54±0,С8

С с-аов 10 0,48+0,08- 0,90^0,09 8.24x0,72*'

"Контрольная

.труипа 10 0,60+0,11 ; 1,44±0,08 11,22+0,48

О ч-цоа 10 0,40+0,04 0,90+0,03 х) 7,8гi0,4Sx, Контрольная:

группа 10 0,35+0,08 1,43±0,12 12,46+0,62 Условное обспначеяие: х) - Р| < 0,05.

Вторая часть исследования проведена на :.миах С57Е1/кБЛ£ с гояетичосхи-дотеришированкоЯ предрасположенностью к сахарному дяабэту и посвя'дэна нзунзнкю влияния длительной сульфатгла-иидотератта на спонтанной даабетогснез, а также ваяснэшю зависимости бета-цототропного гомунотропиого аффектов глибенкл-шуда от дозн мутантного гена аь о учетом пола ялвотшаз.

При перорально« введения гллбенклам;да ¡дгаам С57Е1/Кс1У трех хенотанов ( т-»/*я| аъ */* аь» йь а ) с базальной норяоглшгешгей к началу эксперимента) на протяжшго! 3 месяцев установлено модяфяцируюцее влияние гена аъ на экрахенногть понрехдащого йета-цетотропного эффекта (сульфаниламида) в за-злсшяостп от доза гена аъ . Наибольшая степень альтергдкл отменою* у кивотньс: с двойной дозой гена аъ , о чаи свидетельствует позЕсленяв базальной к интегральной глякоюш во время ВБТТГ к концу эксперимента (табл. 4).

Таблица 4

Влшшео длительного введения глкбанкламидй О м-ца) на базальную ,н интэральнуо гликемию у милей С57ВЬ/>'з.7У с разной дозой гена йь

Изучаемое показатели

' £<£№3 ___- - -

' а■'•V* и ЛЬ-<■/■*• т. | <1Ъ-1

йЪ

!конт~ ! !конт- ! !конт-

•7-___

|опыт

Базальная гликемия (исходная) .:

Назальная гликемия

4,8

5,2 ±0.34

(к^сщу эксперймон-

6,2 ±0,23

6,9 ±0,23

6,1 ±0,44

6,5 ±0,42

5,7 ±0,42

6,4 ±0,15

17,1

12,3 а/ х х ±0,54 ±0,4ЭХ'

'ЛИК8- 40,1:

- ¿1Д

Интегральная гляко*- гт с мня (к концу оксяе- ^ Ля ркменга) в цолал, °

в т.ч.: у самцов 38,6 ±1,б4

у замок 37,9 : ±0,Й7

Х>1Х<0,05

39,5

32,6 32,8 ±0,50 ±0,86

35,5 ±0,29

44,1 ..ч 37,0 ±0,78 ' ¿0,32

47,5 _ч 33,4 ±0,34 ' ±0,84

±1',0Х)

34,7 ±0,03

43,6 ту30,С 45,6" 79,3

±1,12 ±х;э

46,8 „180,7 ±0,83~'+г,3

36,1 ±1.0

ИЗ,б») 1X4,4тч

№

Сооткесошк специфически эффектом,глЕбзнхлавдда к пслу итвотныг обнаружило отсутствие модулирующего влиянкя препарата на внразсанкость полового диморфизма глшозного гомаостаза. Так у И'ис описанных кьшей сэтвь/Кв^ с разной доэоЗ гена ¿ъ

для которых характерно отсутствие сакс-завпсгашх флкктуаяс&й глгь козного гоыеостаза, в том числе и спонтанной зволвдин генетиче-ски-детершйшроЕанного сахарного двабэта, новреадакций бета-ци-тотроашй эффект тлабенкламята был сопоставим у самцов к самок (см. табл. 4). Напротив, при моделировании низкодозового стреп-тезотоцжиового даабета с отчетливой половой диф^еренцеациой па-тологгш {внеокач чувствительность самцов) предшествуемая индук-цеи аасулгаовой нодостагочности 14-днзвкал обработка глкбанкла-иитаом оказывала достоверней превентивный эффект у самок к не Елкяла на интегральною гтакеиао у са-щоз, вызывая у последних резкое падсЕяе массы тимуса Стабя, 5).

, Таблица

Интегральна? гликемия (ммоль/д) и масса тимуса (от) у . са'.тцоЕ и самок милей С57ЕЬ/ке<?У - аъ +/-т ш посла . индукции низкодозоього стрептозотоцекотзого диабзта на фено предварительной 14-дневной обработки гдибенкламвдом (I мг/кг масса тала / день 1>ег ое . )

& 1 Характер | 1 _ ___1 ----'

грул-?- Еозде;гствдл ! я !гхэт«е- }масса I » !глже;>шяТ масса

^ ^ ^

! 5 !_6 ! 7 ! _ _8 _

9,0 5 3 7,7. 32,2

■ ±2',7 £2,3 ¿5,4

Р^0,05 ■ Р<0,05

30,2 52,5 28,0

¿3,3 ±4,3

_11___2___1_Д_!_ „4_

I ' IV ¿бенклакшг + 5 &5,Э стрептозотодан ¿3,5

П Страптозотсксен 5 92,3 ¿1,8

Р с0.05 Р1-П «¿0,001 Р1_п<0,05

Л Гяабанкламид 5 37,3 • 32,0 36,9 49,7

¿3,1 ¿3,7 ¿3,5 ¿4,9

ГУ Контрольная 5 36,Г 45,5 35,8 ' 48,5

ХТУПпа ¿3,4 ¿2,5 ¿2,9 ¿4,7

Рт гу ¿-0,001 ТттусО.ОСХ

<0,001 РЙ_|^0,05 Рт1_1у^0,05 РгТ_1У

РсЫУ-Ф.Об -¿0,05

Т - достовзрность руэдячнй показателей интегральной глмюп'л у самцов а оакок.

Установлено снижениэ сахаросн-лкавдого оффскта острой нагрузки глибенкламздом н ходе хронической оульЛакилг-.пц'отергиш!, ара этсм деоенспбализзрукх::^ эффект последней па панкреатзпо-схкэ бета-клетка развивался независимо от дозц <5Ь (табл. 5).

Таблица 5 ■

Злиянае однократного иероралыгого введения глибеяклатлда (I мг/кг масон тела) на гяикэузпо у шао?. с5?б:./КаЛУ с разной дозой гена аъ до- и поело З-месячноЗ. обработки . сульфаааламадоы

Изуча.е!.ый ! ! _Гояотип животгад _______

показатель | п ~ а_ьу* л_ ] _аь ■Ч* 4Ъ_

% СШЗЛ..1ЕЯ гликемии ка протязозот б-ча- • совогс нерлода до хрогпгческсЗ обработ- - •

ки препаратом .15 39,8+1,3 40,4*1,6 . 40,8+1,9

% ешконил Ш5Ш на протятгега 6-часового лмжода псе- • ле хронической обработка препаратом 15 20,5^1,7 19,7+3,1 21,6+2,:.'

Р ¿0,05 . <0,05 <0,05

% сннясяпя г.стеигя ■,.-.. на тютянзниа 6-ча- 1

сового порнода у '-. , , ■ • ' '

контрольных /СГЕОТ1ШХ не обработанных хронически гяибенкла- *

гладом ' Т5 41,212,4.. ЗоЗ,8±1,9 42,0^2,5

При гистологическом исследовании устгчоплепо, что у иииой с нуловоЯ дозой гопа; а.ъ' (о+/» я) ' , обработанных глибои-кламядом» яэлекия лям^опхтарноЯ гафыътрсцяи пшвсроатнчесыгх осгролсо? отсутствуют,- в то времч как у ашоН ль */-* т ц &ъ +/ ->-&ъ (а кору.оглкксмиеЯ к началу вподонля препарата) шявяеня ауто'гР':.тунные внеулитн (табл. 7),

Изучение' эффекта длительной оулз^лицла'.отдоторапга на «ено-тпчеекк-двторлйгаро.^гишй Дйабогогонвз по;-:таяло, что у со «крытой стэдней МССД к началу эхезорг.шта дллтольноо введение, но оказналя ягаяаая на скорость мткифветвци« диабета,

}

Таблица ?

Частота и выраженность шсулигов у ¡далей C57EI/KsJï с разной дозой Г9ка dt , обработанных глнбонклг'.гсдо:л (I ?.tr/¿ír массы тела на йротякипш 3 м-цев), и контрольных

Генотип еивохннх,- ! частота! в ' ! шсу.£ц£а „

характер воздействия! :нсулл~! (к-бо ! ~п ! >, г п: !

! та 'остров-! и 1 м ! Ао ! ~

1кол)_ i ___!___ 1___!___

а о

■Глабенклааид 0/5- 100 100 ■ — - ■

Контрольная группа .' 0/5 100 100 - - -

db га ' ' '

Глибенхлаивд 4/5 100 29 39 25 6

Контрольная группа 0/5 • . 100 . 100 - - - -

db ■

Г.г.:ба!2сла\вс5 (нормо- • гдикеикя к началу

тт-:~л) 5/5 100 19 37 35 2

Контрольная группа ' 1/5 100 83 .13 4

Гяибодклаыэд (галер- -, гликемия к началу

•опыта) 0/5 ' 100 100

Контрольная группа 'С/5 ' . 100 100 . - - -

покглало шгрьжоиность наруяаглй. гяпкозното гомаостаза, сцеки- . в долгую по базальной гмерглже.'лп!, кнчиная с IO-й недели обработки ¡шопаратом (17,6 ± 0,51 гаоль/л к 11,3 + 0,45 .-моль/л соответственно и опнгноЗ и контрольно" группах, I1 <0,05). Провиденный в отот период ВЬТГГ обнаружил ухудшение толерантности к глвкозе .у подотг.шнх кпеотшх {представлена -> виде интегральной гошомиз) (табл. 3).

При этом отмечэнд тенденция к логаглешпз титра антител к ¿ зусгс-ральной ДНК, vxpcxenuoe увожгюшгэ бота-цнтогохспчесхого sî^ciara сыворотки (см. табл. 8). У югеотшх с матфееяшм ffifJX'¡ дзктезыюа введение препарат повыпало спонтанную гипоргликег-жг пргло I¡-недельного гОздсГЬтвия (¿5,6 ¿коль/л и 10,1 ¿.0,92 ;.~оль/л соотьетствoîiïîo в опытной m контрольной группах, ?-0,0; ус'¿лизало сязгкенио тояорщимости к гаскозе и нкзш;ало нооахглис

¡ета-клеток во всех островках разной степени тяжести, не инду-ртруя развития аутоиммунного инсулита (явления лнмфоцитарной ифильграцки у данной группы животных отсутствовали) (см.табл.7).

Таблица 8

Интегральная гликемия и некоторые показатели ауто-иммунитета у иышей С57ВЬ/квЛУ - аъ ■»-/+ аь получавших глибенкламид, ж контрольных

¡Стадия даабетогенеза к началу обработки препаратом !зучаемыа ! и характер воздействия

шазателз | ^¡¿ей КОД _ I

!гш$енкламид! контроль

_ _Ман^естннй_1ИЗСД_ _ _ глибеннламзд! контроль

■яикемияво 148,5+2,27 102,5+2,83 141,7+8,89

!ремя ББТТГ Р <0 05 ,ммоль/л); г ^и,иэ

1бксс^острор- 22,2+3,8 9,3+2,0 :овых клеток) Р <0,02

гаи • • .

¡понтанная

индекс ) 1,92+0,43 0,7+0,11

0.71±0,03 1,14+0,15 влезы . КЗ = 0,05

тщещ н. 16,5+5,54 8,4±3,88

ДО (ед/ши

0,1:

-0,05

Р -¿0,05

40,5+4,13 Р <0,05 ■

0,94+0,29 0,47+0,07

3,5+2,13 <0,05

I00.3t3.22 28,0+2,08

1,26+0,10 1,59+0,25

12,75+1,03

Таким образом, в результате проведенных экспериментальных :сследоваяий получены доказательства повревдакцего влияния дли-ельяой сульфаниламядотерагош-на шюулин-продуцярущий аппарат ■оджелудочной яэлезы мшей' С57вь/Хвлг аь ■т'+аь с генетически-;етергегаированн1м сахарным диабетом кезависшга от стадии; забо-:евалия к/началу обработки препаратом и пола яивотных. Установки шпщииругя.1'й и/и,та потенщшрутещй эффект хронического вве-.енйя глибешдагвда на развитие н выраташюсть аутоиммунных рганоспецифэтеохта реакций о отчетливой корреляцией клаточно-6 звена аутодамунитста со стадией спонтанного даабетогенеза преобладза-.'г аутоншунного инсулита и антиген-специфической

Евгибищш миграции лейкоцитов у кквотных со скрытым И1ССД к началу сульфаниламидотерашш) (см. табл. 8).

Прерывистая обработка гетерозигот по гену йЬ глибенкламидом в той же дозе (I мг/кг массы тела), при аналогичной суммарной длительности воздействия (3 м-ца^.но при изменен® его ритма (чередование одномесядах периодов введения про пар; та г прекращения лекарственной обработки). не вызывала нарушений гдшозного гомеостаза: базальная и интегральная гликемия во время ВВГТГ не отличалась от таковых у интакпшх "животных (послздняя составила 32,6 ± 0,73 ммодь/л и 33,7^.0,81 шоль/л соответственно в контрольной и подопытной группах, Р < 0,051 При гистологическом исследовании подаелудочных желез этих еи-вотных не обнаружено лимфоцитарной инфильтрации в панкреатич« скшс островках, а также существенных деструктивных изменений по сравнении с контрольными животными." Кошлемент-зависимая -антитело-опосредованная цитотоксичность не' отличалась у иссж дуемых групп (подопытной и штакткой).. Таким образом, получены доказательства сникзния бэта-дятотоксического эффекта хронической обработки глибенкламидом при прерывистом его назначении. ' ; ' ■ - ■

• ВЫВОДЫ

1. Глибенкламид в терапевтической для кроликов дозе (I ыг/кг массы тела) при длительном введении (3-9 м-цев) сникал ссг-чреторнув активность панкреатических бета-клеток,повреждал морфоструктуру последних с результирующим- уменьшение! толерантности к глюкозе и инициировал развитие аутоиммунных реакций к антигенам пашфеатических островков (аутоиммунный инсулин). '

2. После прекращения (через 2 м-ца) 9-масячной обработга кроликов глибенкламидом наблюдалась реверсия бета-цитотокса-ческих аффектов хронической сульфаниламидотерапии (восстановление секреторной реакции бетаг-клеток на физиологический сек-ретоген и морфоструктуры панкреатических островков).

3. Мутантлые гены, аъ и т оказывали модифицирувдий эффект на развитио клеточных ауголщунных реакций к антигена!.

анкреатических островков у мышей csjsl/kbjt , полз-

авших терапевтическую дозу глибэнкламида (I мг/кг масса тела) а протяжении 3-х месяцев (аутошмунвнй инсулит выражен у ге-эрозигот и гомозигот по гену ¿ъ со скрытой стадией ИПЗСД к ачалу обработки препаратом и отсутствует у мышей m +/*- и с улевой дозой гена db. ).

4. Независимо от стадии спонтанного диабэтогепеза ген аъ :aiabetee) усиливал снижение толерантности к глжозе, на-лэдаемое при хроническом беспрерывном введении глибенклампда.

5. Установлен инищшрувщий и/жш потенцирующий эффект хро-ического введения глибешлалшда па развитие п выраженность утоишунных органоспецифических реакций у швпзй C57BL/RbJY-ib -+/-!■ áb с .отчетливой зависимостью клеточного звена аутошл-упитета от стадии спонтанного диабстсгснеза (преобладание утоимлунного инсулит а и антиген-специфической снпхбпцпи ми-рации лейкоцитов у гивотных со скрытый ИНЗСД к началу сульфа-з'лаглгдотерапли).

6. Длительное введение глибеккллмпда вызывало аитягенспе-;:фическое зигнблрованиэ миграции- лейкоцитов у мазей C57BI/ :ajy независимо от яалпти гена аъ. и усиливало бета-дтотокспческое действие оыЕоротки кроЕи у яивотных с нулевой ;озо2 гена аъ г у гомозигот по гену аъ со скрытой а ма-ифзстной стадияш. ИНЗСД к- началу обработки препаратом.

7. Хроническая (3-месячпая) обработка глнбешслэмидом мы-[ей мутантной линии C57BTi/t.-bJY в дозе Г да/кг массы те-:а per оа - сказывала десенсибчлизлруищее вллянне на чувствз-'ельнось нивотных к сахароснижающецу действию сульфаниламида [езависвмо от дозы гена аь .

8. У мышей C57BL/KsJy . , харахтеризугопихся отсутствии половой дифференциация глниозного гомеостаза я спонтанной полиция шсулшовой недостаточности: аяьтзрирувдаэ бота-цито-'рошше эффекты хронической (3-месятаой) обработки глибенкла-евдсп развивались независимо от пола яивотных.

На-подали нкзкодозового сгрептозотоцинового диабета г мшмй c57Ít/:<s<jY с четкой выраженностью патологии у

¡амцоз 14-дновпос предварительное введете глпбеккламида II мг/яг массы тела / день par os ) моделировало биологиче-.

ское действие цитостаигаа. сохраняя направленность полового диморфизма развивающихся реакций (снижало индуцируемую стреп-тозотощшом гвперглишш» у сшок и не изменяло ееусавдов, ш-энвая у ' последних щшшой тиштоксический &$фект,

IQ. .Ups npepHBECTöü скзсобе назначения глибенклаыида ыы-сда C57BiVKsJ - аь ю снижаются неблагоприятние бета-ЦЕтотокетгеесшге эффеетн к ядудированные органоспецифичоские аутокягуннне реакции, saЗдгдаеше при длительной сульфанилаьш-дотерашш.

Основные работы, сзуйягкованные до теш диссертации :

1. Полторак В.В., Гезд5пп; А.И., Ладо1убец E.B. Эффект длительного введения ддябаимаздда на бета-клетки нодЕодудоч-ной га лозы // У Ресд. -съезд фармакологов Украинской ССР: Тез, докл. - Запорожье,'1935. — С, 35-37.

2. Еолгорек Б.В., Гздзалг.А.И. Современные представления о панкреатических и ттаяашреатичеекдх механизмах действия пероральннх сахаросшзазсйх препаратов// Дробл. ендокриноло-пш. - 1985. - Т.'31. - & г. - С.'7&-65.

3. Значение вреиеназго фактора в реализации панкреатического и внопгшкроегичэгзкшо механизмов действия глнбенкламида / Е.П. Тихонова, В.В, Пплгсрак, Т.П. Левченко, А.И. Гладких и др. // Пробл. эвдекриноа. -1987.''- Т, 33,- S 2. С. 29-33.

4. Гладких А.й. Соетшдаю нейроэндскрхшнх клеток поджелудочной железы при дашгегьЕой сульфанзяашдотерашш // Ш Всс-соте, конф, до яейроаадш^тодогт: Тез. докл. - Ленинград,

. 1988. - С¿4279. . .. • .

5. A.c. й 1439688 003?, ШСЙ G 09 В 23/28; Способ моделирования сахарного дтсДета / В.В'. Поиорак, О.Й. Бриндак, К.О. Блох, А.И. Гладких."С.С. Нукдина (СССР). - & 4075975/ 28-14; Заявлено 09,06.88; Сщубл.23.11.88. Бол. S 43 // Открытия. Изобретении - 1908. — & 43. - С. 244.

6. Генетический татэтуш» чувствительности янсулярного вп-парата к иммунной септшв к биологическому действию тлибеккка-шда и стерптозстовдка © соавторстве с В.В. Полтора»,К.О.Блог О.И. Бриндак, К.И. Тур, ЕЗ. Беростовская, Е.В.Ладогубец. - . Ш Всесохз. съезд зпдокрзахЕСГов (25-27 октября 1909 г.): Тез. Докл., Ташкент, Г389. - С. 303-304.

7. Использование сульфавиламидотерашта при сахарном диабете: Метод, рекомендации / Харьковский НИКЭ и IT; 10 УССР; сост. Е.П. Тихонова, В.Б. Полторак, Т.П. Левченко, А.И. Гладких, З.Н. Блоэрща. - Харьков, 1989. - 21 с,

8. Гладких А.И. Влияние' длительной суяы$аниламвдот ерапии на спонтанную эволвдию генетически детерминированного сахарного диабета у мшей C57BL/KaJY db + / + db // 71 Респ. съезд фармакологов Украинской ССР: Тез, докл. - Харьков,1990. - С. 66. . '

9. Влияние дшггаиьного введения глибеяклашда на панкреатические бега-клетки а некоторые показатели аутошщнитета / В.В. Полторак, А.И. Гладких, О.И. Бриндак, К.О. Блох // Фарма-г.ол. з тсхсши. - IS30. - Т. 53. - В 6. - С. 40-43.

10. Влияние гяябанклаияда на спонтанную эволвдюэ генети-тасхи детерминированного сахарного диабета у шшей линии C5TBVKsJY. - db -ty + ab- / B.B. Полторак, А.Й. Гладких, 1.0; Блох и др. // Фармакол. и токсякол. - 1991. - Т. 54. -

& I. - С. 34-37.

«печатя 13.12.91 г.. формат 6Ш34 бумага для тоштельннх аппаратов, печать офсетная, ротапринт. ОП ХОУС, зап. fi 2i§2. тир. 100 эяэ зЫ, г. ХарькйТ ул. шршала Баранова, J8 28. ^^^