Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Функциональное состояние естественных киллерных клеток периферической крови и костного мозга у больных неходжкинскими лимфомами

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКИ ФЕДЕРАЦИИ НОВОСИБИРСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

-л

5 . На правах рукописи

КУЛЯГИН Алек адццр Дмитриевич

ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ЕСТЕСТВЕННЫХ КИЛЛЕРНЫХ КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕ С1С ОЙ КРОВИ И КОСТНОГО МОЗГА ЪГ БОЛЬНЫХ НБХОДШЦШСКИМИ ЛИМФОМАМИ.

14.00.29. - гематология и переливакяе крови 14.00.36. - аллергология и иммунология

Лытореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 1996

Работа выполнена в Новосибирском медицинском институте и I Институте клинической иммунологии СО РАМН.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор М.И.Лосева кандидат медицинских наук, доцент И.А.Лисуков

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук В.С.Кожевников кандидат медицинских наук, доцент Л.Ю.Зюбина

Ведущее учреждение: Гематологический научный центр РАМН.

Защита состоится "...." ................ 1996 г. в......час.

на заседании диссертационного совета К 084.52.03. в Новосибирска медицинском институте (630091, г. Новосибирск, Красный проспект 52).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирском медицинского института (Красный проспект, 52).

Автореферат разослан ...........у...............1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета К 084.52.03.

доктор медицинских наук, профессор В.И.Шарапов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность исследования.

В последние 20 лет наблюдается устойчивый рост заболеваемости неходжкинскими злокачественными лимфомами (НКЛ) (Williams М.Е.,1994). Тесные ыорфо-функциональные связи опухолевых клеток с нормальным иммунопоэзом обуславливают актуальность изучения противоопухолевого иммунитета и возможностей его коррекции у больных НКЛ. Большое значение при этом уделяется функционированию естественных киллерных клеток (ЕКК). Среди эффекторов обладающих естественной киллерной активностью наибольшее внимание привлекают натуральные киллерные (НК) и лимфокин-активированные киллерные (ЛАК) клетки. В экспериментальных моделях и при некоторых первичных иммунодефицитах показана роль дефектов ЕКК в возникновении НХЛ (Lotzova Е., 1983, Ломакин М.С., 1990).

Функциональная активность ЕКК при НХЛ существенно нарушена (Muhonen Т., 1987, Mehta В.А., 1989, Злочевская Л.Л.,1990). У первичных больных НХЛ описано снижение цитотоксичности НК-клеток периферической крови, что в частности связывают с угнетением продукции цитотоксического фактора НК-клеток (НКЦФ), нарушением повторного связывания НК-клеток с мишенями. В то же время, анализ литературы не позволяет объяснить индивидуальные различия активности НК- и ЛАК-клеток у больных НХЛ. Противоречиво оцениваются особенности функционирования ЕКК на различных этапах опухолевой прогрессии НХЛ. Недостаточно изучена активность ЕКК костномозгового происхождения. Отсутствует анализ изменений ЕКК в зависимости от наличия и степени поражения костного мозга.

Достижения в изучении регуляции ЕКК выявили возможность генерации лимфокин-активированных киллерных (ЛАК) клеток. Сформировалось новое направление в иммунотерапии больных НХЛ и другими опухолями, основанное на использовании цитокинов (интерлейкин-2, интерфероны и др.), повышающих активность ЕКК (Rosenberg S.A., 1985). Однако факторы, определяющие противоопухолевые свойства ЕКК и показания к применению цитокинов у больных НХЛ, изучены недостаточно.

Эти положения определили цель и задачи исследования.

Цель исследования.

Изучить особенности функционирования клеток с естественной киллерной активностью для обоснования дифференцированной иммунотерапии на различных этапах опухолевой прогрессии неходжкинской лимфомы.

Задачи исследования.

1. Дать характеристику цитотоксической активности НК-клеток периферической крови и костного мозга у больных НХЛ в зависимости от стадии, морфологического варианта, фазы заболевания.

2. Оценить генерацию ЛАК-активности в культурах мононуклеарных клеток периферической крови и костного мозга у больных НКЛ.

3. Изучить цитотоксичность супернатантов ЛАК-клеток и особенности продукции фактора некроза опухолей-альфа (ФНОа) ЛАК-клетками при НКЛ.

4. Провести сопоставление показателей активности ЕКК и клинических характеристик больных НХЛ для выявления клинико-иммунологических типов и показаний к применению цитокинов, регулирующих активность ЕКК.

5. Определить in vitro возможность генерации цитотоксичности МНК периферической крови против свежевыделенных клеток НХЛ и острого лимфобластного лейкоза под влиянием спленоперфузата.

Научная новизна.

Впервые проведено комплексное исследование функциональной активности НК- и ЛАК-клеток периферической крови и костного мозга у больных КХЛ. Обнаружено, что снижение НК-активности против линии К562 коррелирует со степенью поражения костного мозга. Одновременно с этим у больных с вовлечением костного мозга выявлена повышенная спонтанная цитотоксичность МНК против НК-резистентной линии Raji. При сравнительном анализе показано, что НК-активность МНР: костного мозга ниже чем в периферической крови.

Установлены особенности функционирования ЛАК-клеток у больных НХЛ. Возможность генерации ЛАК-активности в культурах МНК периферической крови и костного мозга характерна для подавляющего большинства больных. Однако, уровень цитотоксичности ЛАК-клеток у больных НХЛ в 1,5 раза ниже контроля. Полное угнетение активности ЛАК-клеток обнаружено только у больных с лейкемизированной НХЛ. Эффективность генерации ЛАК-клеток выше в культурах МНК костного мозга, чем б периферической крови, особенно на ранних этапах вовлечения костного мозга в опухолевый процесс.

При изучении дистантных механизмов функционирования ЛАК-клеток выявлено снижение цитотоксичности ЛАК-супернатантов против линии К562 у части больных в активной фазе заболевания. Указанный дефект имеет относительно автономный характер, так как клеточная цитотоксичность в этой группе больных сохранена. Обнаружен дисбаланс в продукции ФНОа ЛАК-клетками, выражающийся в повышении

спонтанной и снижении стимулированной рИЛ-2 продукции.

Выявлена способность спленоперфузата к генерации in vitro цитотоксической активности МНК периферической крови здоровых доноров против свежевыделенных аллогенных опухолевых клеток лимфобластной НХЛ и В-клеточного острого лимфобластного лейкоза.

Комплексный анализ функциональной активности НК-, ЛАК-клеток и клинических характеристик больных НХЛ позволил выявить "инертный", "активированный" и "депрессивный" типы Функционирования ЕКК. Указанные типы формируются на разных этапах поражения костного мозга и являются отражением межсистемных взаимодействий иммунной системы, гемопоэза и опухолевого клона при прогрессии НХЛ.

Практическая значимость работы.

Результаты исследования дают экспериментальные обоснования иммунотерапии, направленной на коррекцию функционирования ЕКК у больных НХЛ. Выявленные в работе индивидуальные особенности и типы функционирования ЕКК при различных вариантах специфического поражения костного мозга позволяют прогнозировать эффективность применения рИЛ-2 и методов адоптивной иммунотерапии.

Высокая эффективность генерации ЛАК-клеток в культурах МНК костного мозга у больных НХЛ определяет перспективность их использования в качестве эффекторов для проведения иммунотерапии.

Способность спленоперфузата генерировать цитотоксичность МНК против свежевыделенных опухолевых клеток НХЛ и ОЛЛ открывает возможности его использования в иммунотерапии больных НХЛ.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Опухолевая прогрессия НХЛ, характеризующаяся специфическим поражением костного мозга сопровождается угнетением Функциональной активности НК-клеток. Одновременно с этим на этапе вовлечения костного мозга обнаруживается способность МНК периферической крови к спонтанному лизису клеток линии Raji, резистентных к НК-клеткам. МНК костного мозга у больных НХЛ проявляют меньшую КК-активность, чем МНК периферической крови, В ремиссии НХЛ цитотоксичность НК-клеток нормализуется.

2. Генерация активности ЛАК-клеток в культурах МНК периферической крови и костного мозга, стимулированных рИЛ-2, обнаруживается у всех категорий больных НХЛ, за исключением случаев лейкемизации НХЛ. Уровень цитотоксичности ЛАК-клеток у больных НХЛ ниже, чем у здоровых доноров. Эффективность генерации ЛАК-клеток против линии Raji в культурах МНК костного мозга выше, чем периферической крови, особенно у больных с вовлечением костного мозга.

3. У больных НХЛ выявляются нарушения дистантных механизмов ЛЙК-активности, проявляющиеся в снижение суммарного цитотоксического потенциала ЛАК-супернатантов и дисбалансе продукции ФНОа.

4. При опухолевой прогрессии НХЛ формируются типы функционирования ЕКК, зависящие от степени специфического поражения костного мозга.

- "Инертный тип", характеризуется дефектами дистантных механизмов противоопухолевой активности НК- и ЛАК-клеток при сохранении нормального уровня клеточно-опосредованной цитотоксичности. Выявляется у больных без специфического поражения костного мозга, в том числе на стадиях генерализации опухоли.

- "Активированный тип", характеризуется умеренной НК-депрессией с одновременным выявлением спонтанной цитотоксичности МНК против линии ЕаЛ1, высокой эффективностью генерации ЛАК-клеток костного мозга, повышенной спонтанной продукцией ФНОа. Выявляется у больных на ранних этапах поражения костного мозга.

"Депрессивный тип", характеризуется выраженным подавлением клеточно-опосредованных и дистантных механизмов противоопухолевой активности ЕКК и развивается при прогрессирующем поражении костного мозга по типу лейкемизации.

5. Спленоперфузат обладает способностью генерировать цитотоксиче.скую активность МНК периферической крови здоровых доноров против свежевыделенных опухолевых клеток НХЛ и ОЛЛ.

Внедрение и апробация результатов исследования. Материалы диссертации доложены на научно-практических конференциях врачей г. Новосибирска (1994-96 гг), на 53, 54 и 55 сессиях молодых ученых Новосибирского медицинского института (1992-94 гг), на заседаниях общества гематологов (1995-96 гг). Результаты исследования используются в педагогическом процессе на кафедрах клинической иммунологии и госпитальной терапии педиатрического Факультета Новосибирского медицинского института. Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 - в центральной печати.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 149 страницах и включает введение, обзор литературы, главу материалы и методы, результаты исследований, обсуждение, выводы и практические рекомендации. Иллюстрирована 17 таблицами, 11 рисунками и 5 выписками из историй болезни. Библиографический указатель включает 203 источника (36 отечественных и 167 иностранных авторов).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Клинико-гематологическая характеристика больных НХЛ.

Исследования проведены у 51 больного НХЛ с давностью заболевания от 1 месяца до 6 лет. Средний возраст больных - 53 года, 495» - мужчины, 51% - женщины. В активной Фазе находился 41 пациент (31 - до начала лечения, 10 - в рецидиве или прогрессии на первой линии ПХТ). Повторные исследования проведены у 13 больных, в том числе у 8 - до лечения и в ремиссии. 10 больных обследованы только в ремиссии. Больные получали программную ПХТ (CHOP, NHL-3, RAC0F-LA0F, 8-недельная программа). Обследование проводилось не ранее чем через 3 недели после последнего курса ПХТ.

Варианты НХЛ низкой степени злокачественности (НСЗ) (согласно Рабочей формулировке) были определены у 7 (14%), промежуточной степени злокачественности (ПСЗ) - у 33 (65%), высокой степени злокачественности (ВСЗ) - у 11 больных (21%).

Согласно классификации Ann Arbor у 12 больных (23,5%) была выявлена II, у 13 (25,5%) - III, у 26 (51%) - IU стадия НХЛ. У 21 больного IU стадия устанавливалась в связи с поражением костного мозга без вовлечения других нелимфатических органов. Выявление до 25% опухолевых клеток в ниелограмме расценивалось как вовлечение костного мозга (п=11). Наличие более 25% опухолевых клеток в сочетании с редукцией нормальных ростков гемопоэза расценивалось как лейкемизация (n=10). У 9 больных с Ш стадией определялось поражение нелимфатических органов, в том числе у 4-х в сочетании с поражением костного мозга. Плевра вовлекалась у 4, легкие у 2, почки у 2, желудок у 2, печень у 1 и ЦНС у 1 больного. В 2 случаях имелись большие локальные опухолевые массы с прорастанием в кожу.

В качестве группы сравнения обследовано 30 здоровых доноров.

Выделение и культивирование мононуклеарных клеток (МНК).

Использовалась гепаринизированная венозная кровь и костный мозг, полученный при диагностических стернальных пункциях или трепанобиолсиях. МНК выделяли центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина. Культивирование клеток проводили в планшетах (0,4 х 10е кл/мл) или в стеклянных флаконах (1,5 х 10е кл/мл) при 37°С в увлажненной атмосфере (5% COz) в среде RPMI-1640 (НПО "Вектор"), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, 5 мМ HEFES-буфера, 0,3 мг/мл L-глютамина, 100 мкг/мл гентамицина.

Получение эффехторных лимфоцитов и клеток-мипеней.

При изучении НК-активности эффекторами служили свежевыделенные МНК. Для получения ЛАК-клеток МНК инкубировали 96 часов во

Флаконах с рИЛ-2 (100 Ед/мл, НПО "Вектор"). Контрольные культуры не содержали ИЛ-2. Для оценки влияния спленоперфузата МНК инкубировали в течение 96 часов в культуральной среде, содержащей 30% спленоперфузата. По истечении срока инкубации производили сбор супернатантов ЛАК-клеток и контрольных МНК в пластиковые пробирки. Клетки использовались в качестве эффекторов в мембранотоксическом тесте. Супернатанты хранились при температуре -18°С и в дальнейшем тестировались на цитотоксичность и содержание ФНОа.

Мишенями служили клетки линий К562 (эритромиедоидная, НК-чувствительная) и Raji (Б-лимфобластоидная, НК-резистентная, ЛАК-чувствительная). Кроме этого использовались опухолевые клетки, выделенные из лимфатического узла больного Р. (крупноклеточная НХЛ), периферической крови больного К. (лейкемизированная лимфобластная НХЛ), больного М. (В - ОЛЛ) и больного К. (пре-В-ОЛЛ). Жизнеспособность клеток-мишеней по окраске трепановым синим была для линий выше 90%, для свежевыделенных мишеней - выше 60%.

Мембранотоксический тест.

Цитотоксичность эффекторных клеток и супернатантов определяли в мембранотоксическом тесте. Для этого мишени метили аН-уридином в течение 4-х часов и после отмывки вносили в планшеты в количестве 10 тыс. на лунку. Затем вносили клетки-эффекторы (400 тыс. на лунку) или супернатанты (30% V/V). Планшеты инкубировали в течение 18 часов. По окончании сроков инкубации определяли радиоактивность нуклеопротеидных фракций клеток-мишеней. Процент цитотоксичности (ПЦ) рассчитывали по формуле ПЦ - (1 - О/К) х 100%, где К -уровень радиоактивности (имп/мин) в контроле (лунки содержащие клетки-мишени), 0 - то же в опыте (лунки, содержащие клетки-мишени и эффекторные клетки или тестируемые супернатанты).

Тестирование супернатантов на содержание ФНО-альфа.

Концентрацию ФНО-альфа (нг/мл) в супернатантах ЛАК-клеток и конрольных МНК проводили иммуноферментным методом с использованием тест-систем НПО "Протеиновый контур", г. Санкт-Петербург.

Статистическая обработка полученных результатов.

Статистическая обработка проводилась на персональном компьютере. Стандартная обработка вариационных рядов включала подсчет значений средних арифметических величин (М) и ошибок средних (т). Статистическая значимость отличий вариационных рядов оценивалась непараметрически с использованием U - критерия Вилконсона-Манна-Уитни, корреляция - по коэффициенту Спирмена.

- 7 -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Натуральная килдерная (НК) активность МНК периферической крови и костного мозга у больных НХЛ.

В активной фазе НХЛ (п=41) выявлено снижение НК-активности МНК периферической крови против линии К562: 38,9 + 3,3% (57,6 + 2,2% в группе доноров, р<0.01). Цитотоксическая активность колебалась от О до 81% (в группе доноров от 39 до 69%) и только в 22% случаев была в интервале 50 - 65% (в группе доноров в 715! случаев).

Распространение опухолевого процесса внутри лимфатической системы не ассоциировалось с угнетением НК-активности. Так цитотоксичность у больных со II стадией (п=7) составила 54,0 + 6,2% и 54,0 + 4,9% - у больных с III стадией (п=10). Однако колебания индивидуальных показателей при II (30 - 77%) и при III стадии (33 - 81%) били значительно выше чем в группе доноров. Так только у 43% больных с II стадией и у 40% больных с III стадией цитотоксичность била в пределах 50 - 65%. В то же время у больных с Ш стадией НХЛ (п = 24) обнаружено значительная НК-депрессия -27,3 + 3,9% (от 0 до 56%, в 8% случаев в пределах 50-65%), что ниже уровня доноров и больных с II и III стадиями НХЛ (р < 0.01).

У больных с ГО стадией НХЛ формирование НК-депрессии было связано с поражением костного мозга (рис.1).

70'

60

О

ДОНОРЫ

ы к/м-

и К/М+

и АЕЙС

Рнс.1. НК-активность МНК периферической крови у больных Ш стадии с различной степенью поражения костного мозга.

При отсутствии поражения костного мозга (п=5), несмотря на агрессивное течение заболевания, НК-активность была снижена незначительно - 50,0 + 3,3% и не отличалась от показателей при II и III стадиях НХЛ. При вовлечении костного мозга (п=10) обнаружена умеренная НК-депрессия - 34,9 + 1,9% (в 8/10 случаев в пределах 30-453!). Наиболее низкая НК-активность (9,6 + 3,5%) наблюдалась при лейкемизации НХЛ (п=9). При этом степень НК-депрессии не зависела от процента циркулирующих опухолевых клеток. Так у 2 больных со значительным (32 и 80%) количеством опухолевых клеток в гемограмме цитотоксичность составила соответственно 21 и 19%, а у 2 других больных с низкой циркуляцией опухолевых клеток (1 и 3%), была полностью подавлена. Очевидно НК-депрессия при лейкемизации НХЛ объясняется метапластическим вытеснением НК-предшественников. Это согласуется с данными по острым лейкозам (Lotzova Е., 1987).

НК-активность у больных с рецидивом НХЛ (п=8) достоверно не отличалась от группы больных обследованных до лечения (п=33) -42,1 £ 10,5% и 39,1 + 3,45% соответственно. Так же не выявлено достоверных отличий между больными с разными гистологическими вариантами НХЛ (34,6 ± 13,2% при лимфомах НСЗ, 41,7 + 4,3% при ПСЗ, 35,5 + 6,7% при ВСЗ). Более высокая НК-активность при НХЛ ПСЗ объясняется относительно меньшим процентом больных с поражением костного мозга.

МКК костного мозга проявляли меньшую НК-активность, чем МНК периферической крови (27,4 £ 4,0% и 39,2 + 5,4% соответственно, р<0.05), при корреляции мевду собой (г = 0.78, р<0.01) (табл.1).

Таблица 1.

Сравнительная оценка НК-актнвности МНК периферической крови и костного мозга в активной фазе НХЛ (парные выборки).

1 t Группы обследованных ', Цитотоксическая Перифер. крови активность МНК ! Костного мозга 1 1 t 1 Р

Все больные (п = 16) 39,2 + 5,4 27,4 + 4,0 < 0,05

II-III стадия (и = 5) 59,0 +5,4 39,4 + 3,7 < 0,01

IU стадия (п = 11) 30,2 + 5,7 21,9 + 4,8* > 0,05

1. к/мозг- (п = 3) 50,7 + 4,8 36,7 + 4,7 < 0,05

2. к/мозг+ (п = 4) 34,0 +4,1 27,8 + 4,6** > 0,05

3. лейкемизация (п = 4) 11,0 + 5,3 5,0 + 2,9*** > 0,05

Примечания. * - р < 0,01 относительно больльных II-III стадии;

#* - р < 0,05 относительно больных подгруппы 1; ж** - р < 0,01 относительно больных подгрупп 1 и 2.

При распределении больных по стадиям и степени поражения

костного мозга изменения НК-активности костного мозга совпадают с

периферической кровью. Так, НК-активность у больных с IU стадией оказалась в 2 раза ниже чем при II-III стадии и зависела от степени поражения костного мозга. У больных без поражения костного мозга НК-активность была на уровне II-III стадии, при вовлечении

- в 1,5 раза ниже и полностью угнетена при лейкемизации. Различия между показателями костного мозга и периферической крови у больных с поражением костного мозга становятся недостоверными.

Параллельно с изучением НК-активности оценивалась цитотоксичность МНК против линии Raji. СвежеЕыделенные МНК доноров не проявляли значимой цитотоксичности (6,3+3,2%), что согласуется с данными о НК-резистентности линии Raji. В активной фазе НХЛ (п = 18) выявлено повышение спонтанной цитотоксичности МНК периферической крови (14,6 ± 2,5%, р<0.01). При этом, имелась связь с распространенностью опухоли: 11,6 ± 4,0% при II-III стадии и 16,6+3,4% при 10 стадии. Наиболее высокие показатели (в среднем 19,7 + 5,0%) наблюдались у больных с вовлечением костного мозга.

МНК костного мозга у 7 из 13 больных также проявляли повыпенную цитотоксичность против линии Raji (в среднем 10,3 + 2,3%). При этом цитотоксическая активность в группе больных с вовлечением костного мозга была в 2 раза выше, чем при II-III стадии - 14,0 + 4,2% и 7,3 + 5,5% соответственно (р<0.05).

Проведенный анализ позволяет констатировать, что опухолевая прогрессия НХЛ, сопровождающаяся вовлечением костного мозга и лейкемизацией характеризуется угнетением функциональной активности НК-клеток периферической крови и костного мозга. Эти изменения не зависят от гистологического варианта НХЛ и от времени обследования

- до лечения или в фазе рецидива. На ранних этапах поражения костного мозга, протекающих без вытеснения нормальных ростков гемопоэза, одновременно с умеренной НК-депрессией повышается спонтанная цитотоксичность МНК против НК-резистентной линии Raji, что свидетельствует о своеобразной активации ЕКК. Вероятно миграция опухолевых клеток в костный мозг создает особые условия Функционирования предшественников ЕКК с экспансией клонов, проявляющих наибольшую активность против лимфомных клеток и супрессией клонов, лизирующих клетки линии К562. Это подтверждается данными Fuchshuber P.R. (1992) об относительной специфичности цитолитической активности различных клонов ЕКК.

У больных (п=18) в Фазе ремиссии НК-активность периферической крови против линии К562 составила 60,1 ± 2,9%, что в 1,5 раза превышало показатель активной фазы НХЛ (р<0.01) и не отличалось от

уровня доноров. Достоверное возрастание цитотоксичности обнаружено при IÜ стадии НХЛ (с 27,3 ± 3,9% до 55,3 + 5,6%, р<0.01), тогда как при II-III стадии было менее значительным (с 54,0 + 3,6% до 63,8 + 3,0%, р<0.05). Более наглядно восстановление НК-активности в ремиссии демонстрирует динамика индивидуальных показателей (рис.2). Цитотоксичность возрастала в 5 из 6 случаев, наиболее значительно у больных IU стадии с исходно низкой НК-активностью.

5

§

I

и

м

■0

о!-:-1-1-1

ДО ЛЕЧЕНИЯ РЕМИССИЯ

Рис.2.Индивидуальные показатели НК-активности в динамике лечения.

НК-активность МНК костного мозга также повышалась в фазе ремиссии НХЛ. Уровень цитотоксичности, изученный у 6 больных в Фазе ремиссии НХЛ, составил 45,5 ± 5,8 %, что достоверно превышает (р < 0.05) аналогичный показатель в активной фазе НХЛ.

Спонтанная цитотоксичность МНК периферической крови против линии ИаЛ в ремиссии (п=5) снижалась до нормы (6,0 + 3,4%).

Таким образом, при редукции опухолевой массы повышается НК-активность МНК периферической крови и костного мозга против линии К562 и нормализуется спонтанная цитотоксичность против линии Очевидно это обусловлено снижением негативных влияний опухоли (трансформирующий рост фактор бетта, простагландины). Одновременно выключается активация ЕКК, относительно селективных против линии 1?а;11. Учитывая наибольшую динамику НК-активности у больных с поражением костного мозга можно предполагать, что в ремиссии НХЛ восстанавливается нормальное функционирование НК-предшественников.

- 11 -

Генерация ЛАК-активности у больных НХЛ.

В группе доноров цитотоксичность контрольных МНК, инкубированных без рИЛ-2, против линии К562 составила 46,9 ± 4,9%, против линии Raji - 10,4 + 3,5%. ЛАК-активность превышала (р<0,01) контроль и составила 67,4 £ 3,9% против линии К562 и 34,0 +2,6% против линии Raji. Следовательно, рИЛ-2 в 1,4 раза повышал цитотоксичность против линии К562 и в 3,3 раза против линии Raji.

В активной фазе НХЛ (п=30) рИЛ-2 повышал цитотоксичность МНК периферической крови против линии К562 в 1,4 раза (с 36,4 + 4,5 до

50.2 ± 4,1%, р<0.05), против линии Raji в 1,9 раза (с 12,7 + 2,4 до 24,0 + 3,3%, р<0.01). Следовательно, эффективность генерации ЛАК-клеток против линии К562 не отличалась от доноров, а против линии Raji была снижена в 2 раза. Цитотоксичность ЛАК-клеток против обеих линий оказалась ниже, чем у доноров (р<0.01).

Сравнительный анализ генерации ЛАК-клеток периферической крови у больных с II-III (п=12) и IÜ (п=13) стадиями заболевания выявил различия, связанные с типом мишеней. ЛАК-активность против линии К562 была достоверно ниже при ГО стадии, чем при II-III (45,4 + 5,4 и 59,6 + 5,3% соответственно, р<0.05). Цитотоксичность контрольных МНК так же была ниже при IÜ стадии: 31,0 + 5,7 против

47.3 ± 6,2% при II-III стадии (р<0.05). Эффективность генерации оказалась несколько выше у больных ГО стадии: рИЛ-2 повышал цитотоксичность в среднем в 1,5 раза, а у больных II-III стадий -в 1,3 раза. Цитотоксичность контрольных МНК и ЛАК-клеток у больных II-III стадий не отличалась от донорского уровня, тогда как при IU стадии эти показатели были з 1,5 раза ниже. Следовательно, прогрессия заболевания характеризовалась равномерным снижением спонтанной и ЛАК-активности против НК-чувствительных мишеней.

ЛАК-активность против НК-резистентной линии Raji у больных II-III и ГО стадий не различалась: 24,0 £ 4,7 и 24,0 + 4,8%, (спонтанная - 14,3 + 4,8 и 11,5 + 2,6%). Однако, эффект рИЛ-2 остается более высоким у больных ГО стадии (ЛАК-активность выше спонтанной в 2,1 разг., тогда как при. II-III стадиях - в 1,7 раза).

У больных IU стадии ЛАК-активность против линии К562 коррелировала со степенью поражения костного мозга (табл.2). При использовании линии Raji подобная закономерность не обнаружена. Цитотоксичность оказалась наибольшей у больных с вовлечением костного мозга, достоверно не отличаясь от донорского уровня. При лейкемизированной НХЛ эффективной генерации ЛАК-клеток против НК-резистентных мишеней достичь не удалось.

Таблица 2.

Зависимость эффективности генерации ЛАК-клеток у больных НХЛ 10 стадии от наличия и степени опухолевого поражения костного мозга.

Тип Цитотоксическая активность (%)

эффекторов против линии К562 ! против линии ВаЛ

I. Больные без вовлечения костного мозга (п=4)

Контрольные МНК 43,0 + 2,1 ! 8.7 + 9,2

ЛАК-клетки 64,7 + 2,9 ! 23,5 + 3,5

II. Больные с вовлечением костного мозга (п=9)

Контрольные МНК 33,3 + 9,6 | 15,2 + 2,6

ЛАК-клетки 47,8 + 4,3 * ! 32,0 + 6,6

III. Больные в фазе лейкемизации (п=5)

Контрольные МНК 20,2 + 10,5 ! 3,7 + 2,3

ЛАК-клетки 30,2 + 9,8 ** ; 6,3 + 5,4 **

Примечание. * - р < 0.05 относительно I группы;

*# - р < 0.05 относительно I и II групп.

Цитотоксичноеть ЛАК-клеток против обоих типов мишеней была несколько выше у больных с НХЛ НСЗ - 54,0 + 4,7% против линии К562, 28,0 + 7,6% против линии Иа,Д, однако, различия с больными НХЛ ПСЗ (49,9 + 6,2% и 24,3 + 4,7%) и ВСЗ (47,7 + 9,1% и 20,7 + 5,9% соответственно) были недостоверными.

У больных в ремиссии (п-10) цитотоксичность контрольных МНК и ЛАК-клеток против линии К562 составили соответственно 51,4 + 6,9 и 64,3 + 6,3%, что выше (р < 0.01) чем у больных в активной фазе заболевания и не отличается от уровня доноров. ЛАК-активность против линии БаЛ повышалась слабо (с 24,0 + 3,3 до 28,0 + 2,3%).

Сравнительное изучение генерации ЛАК-клеток в культурах МНК периферической крови и костного мозга, проведенное у 20 больных в активной фазе НХЛ, не выявило достоверных различий в уровне цитотоксичности (табл.3).

Таблица 3.

Сравнительная оценка генерации ЛАК-клеток периферической крови и костного мозга в активной фазе НХЛ против линий К562 и На.)!.

Тип эффекторов Цитотоксическая активность (%) МНК периферической ! МНК костного крови 1 мозга Р

Контрольные МНК ЛАК-клетки Контрольные МНК ЛАК-клетки Против линии К562 36,1 ± 4,5 | 29,8 + 3,4 49,8+5,1 | 43,6 +4,1 Против линии ЕаЛ 12,3 + 1,9 | 10,4 + 1,6 22,9+3,5 ; 23,9+2,9 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05

Исключение составили больные II-III стадий, у которых при использовании линии К562 цитотоксичность ЛАК-клеток оказалась достоверно выше в периферической крови (63,4 ± 5,0 против 51,2 + 5,8%, р<0.05). При Ш стадии различия между показателями периферической крови и костного мозга отсутствуют.

При использовании линии Eaji эффективность генерации ЛАК-клеток оказалась выше в костномозговых культурах. ЛАК-активность превышала спонтанный уровень в 2,3 раза, а в периферической крови в 1,8 раза, что согласуется с данными Caldera L.H. (1992).

У больных 10 стадии ЛАК-активность МНК костного мозга против линии К562 прямо зависела от степени его специфического поражения: 55,7 + 9,9% у больных без вовлечения костного мозга, 42,4 + 4,6% -с вовлечением и 21,0 + 6,4 при лейкемизации. В противоположность этому наиболее эффективная генерация ЛАК-клеток против линии Raji выявлена у больных с вовлечением костного мозга - 29,3 + 5,4%, что в 3,3 раза выше контрольного уровня (8,8 ± 2,5%), хотя различия с больными без вовлечения недостоверны (28,3 + 2,0 и 11,3 + 2,2% соответственно). При лейкемизации ЛАК-активность МНК костного мозга, как и в периферической крови, подавлена (6,7 + 5,9%).

Следовательно, возможность генерации ЛАК-клеток из МНК периферической крови к костного мозга выявлена во всех категориях больных, за исключением больных с лейкемизированной НКЛ. Депрессия ЛАК-активности зависит от стадии НХЛ, степени поражения костного мозга, фазы заболевания и типа мишеней.

Процессы генерации ЛАК-клеток регулируются значительным количеством цитокинов (Soné 5.,1993). В связи с этим, была изучена возможность повышения цитотоксичности МНК здоровых доноров против свежевыделенных клеток НХЛ и ОЛЛ под влиянием комплекса нативных цитокинов, содержащихся в спленоперфузате (СП). Цитотоксичность МНК против клеток НХЛ повышалась под влиянием спленоперфузата в 6 раз (с 3,3 ± 1,8% до 20,3 + 4,1%, р<0,01 ), против клеток ОЛЛ - в 3 раза (с 5,9 + 2,0% до 16,9 ± 6,8, р<0,05). Цитотоксичность ЛАК-клеток, генерированных в присутствии рИЛ-2 составила 18,3 + 5,2% против клеток НХЛ и 18,4 + 6,0% против клеток ОЛЛ. Таким образом, стимулирующий эффект спленоперфузата достоверно не отличался от рИЛ-2. Выраженное повышение противоопухолевых свойств МНК под влиянием спленоперфузата можно объяснить синергичными эффектами различных цитокинов (ИНФг, ФНОа, ИЛ-2, КСФ), присутствующих в данном препарате (Черных Е.Р., 1994).

Состояние дистантных механизмов противоопухолевой активности ЛАК - клеток у больных НХЛ.

Изучение дистантных механизмов ЛАК-активности (продукция ИНФг, ФНОа и др.) представляет интерес в связи с оппозитными эффектами некоторых цитокинов на лимфомные клетки и с особенностями их продукции при НХЛ. Изучена цитотоксичность супернатантов ЛАК-клеток (ЛАК-СН) против линии К562 и концентрация в них ФНОа.

В активной фазе НХЛ (п=20) обнаружено снижение цитотоксичности ЛАК-СН по сравнению с донорами (п = 13) (13,9 ± 2,8 и 22,5 + 2,2% соответственно, р< 0.01). Уровень цитотоксичности ЛАК-СН более 10% проявлялся у 11 из 20 больных и у 12 из 13 доноров. В ремиссии (п=6) цитотоксичность ЛАК-СН повышалась до донорского уровня (20,3 + 2,2%). Клинические характеристики больных с цитотоксичностью ЛАК-СН более 10%, в среднем 22,3 + 3,0% (п=11) и менее 10%, в среднем 3,6 + 1,4% (п=9) существенно не различались.

Концентрация ФНОа в контрольных супернатантах больных НХЛ в 2 раза превышала донорский уровень (0,52+0,1 против 0,22+0,12 нг/мл, р < 0.05). В то же время, продукция ФНОа ЛАК-клетками у больных НХЛ имела тенденцию к снижению (0,71+0,12 против 0,98+0,39 нг/мл у доноров). В связи с этим, стимулирующий эффект рИЛ-2 на продукцию ФНОа у больных в активной фазе НХЛ оказался существенно ниже чем у здоровых доноров и статистически недостоверным. У больных НХЛ в ремиссии изменения в продукции ФНОа не выявлялись (спонтанная -0,34 ± 0,15, стимулированная рИЛ-2 - 1,14 + 0,42 нг/мл, р < 0.05).

Тенденция к повышению спонтанной продукции ФНОа прослеживается уже при II (0,44 + 0,25 нг/мл) и III стадии (0,47 + 0,2 нг/мл), однако становится достоверной только при Ш стадии (0,57 + 0,14 нг/мл). Из 6 больных с наиболее высокой спонтанной продукцией ФНОа (более 0,9 нг/мл) у 5 была Ш стадия, в том числе у 3 с вовлечением костного мозга. Известно, что продукция ЛАК-клетками ФНОа существенно повышается при стимуляции опухолевыми клетками (Калинина А.Р.,1992, БсЫагЪгепЪгиЪег й.«!. , 1993). В связи с этим, повышенная спонтанная продукция ФНОа у части больных НХЛ может быть связана с циркуляцией опухолевых клеток. Стимулированная продукция ФНОа оказалась несколько выше при III стадии (0,84 + 0,39 нг/мл), хотя различия со II (0,61 ±0,29 нг/мл) и Ю стадиями (0,69 + 0,15 нг/мл) не достоверны. Связи продукции ФНОа с гистологическим вариантом НХЛ не выявлено. Снижение эффекта рИЛ-2 вероятно связано с "преактивированностью" продуцентов ФНОа.

Цитотоксичность ЛАК-СН коррелировала с концентрацией в них ФНОа (г=0.75, р<0.01). Таким образом, дисбаланс в продукции ФНОа может частично объяснять снижение цитотоксического потенциала ЛАК-СН. Однако, учитывая отсутствие достоверной корреляции между изученными показателями у здоровых доноров (г=0,12, р>0.05), можно предполагать сложные нарушения в продукции цитотоксических Факторов ЛАК-клетками. Это согласуется с данными литературы о синергизме цитотоксических Факторов в ЛАК-СН (СЪопй А. Б.,1989) и резистентности линии К562 к рФНОа (Кетлинский С.А., 1992).

Взаимоотношения клеточных и дистантных механизмов иллюстрирует анализ в группах больных с различным уровнем цитотоксичности ЛАК-СН. Активность ЛАК-клеток против линии К562 у больных с нормальной цитотоксичностыо ЛАК-СН (более 10%) оказалась выше чем у больных с низкой цитотоксичностыо - 62,6 + 4,1 и 45,7 ±. 6,2% соответственно, р<0.05. При этом ЛАК-активность против линии К562 высоко положительно коррелировала с концентрацией ФНОа в ЛАК-СН (г=0,74; р < 0,01). У доноров корреляция не наблюдалась (г = 0,03).

ЛАК-активность против линии ИаЛ в сравниваемых группах не различалась (28,8 + 3,2 и 29,9 ± 5,1%). Корреляция с продукцией ФНОа была недостоверной (г=0.32, р>0.05), а у доноров еще слабее (г=0.05). Это согласуется с данными Калининой А.Р., (1993) о ростостимулирующем действии рФНОа на линию БаЛ.

Таким образом, связь между нарушениями цитокиновых и клеточных механизмов ЛАК-активности обнаруживается при использовании НК-чувствительных мишеней. В то же время, ЛАК-активность против НК-резистентных мишеней не зависит от цитотоксического потенциала ЛАК-СН и продукции ФНОа, и находится на высоком уровне. При этом нарушения дистантных механизмов выявляются уже при II-III стадиях, тогда как падение НК- и ЛАК-активности характерно для ГО стадии.

Ремиссия заболевания сопровождается нормализацией

цитотоксичности ЛАК-СН и продукции ФНОа ЛАК-клетками. Поэтому нарушения дистантных механизмов функционирования ЛАК-клеток в активной фазе НХЛ можно связывать с непосредственными влияниями опухоли (негативная регуляция ЛАК-предшественников, активация продуцентов ФНОа), исчезающими в результате полихимиотерапии.

Особенности функциональной активности ЕКК у больных НХЛ на разных этапах опухолевой прогрессии.

Комплексное изучение состояния ЕКК в активной Фазе НХЛ выявило основные варианты отклонений от показателей здоровых доноров. Наиболее характерными из них оказались: 1. снижение НК-активности;

2. повышение цитотоксичности свежевыделенных МНК периферической крови против линии Raji; 3. снижение цитотоксичности ЛАК-клеток; 4. снижение суммарного цитотоксического потенциала ЛАК-СН против клеток линии К562; 5. дисбаланс продукции ФНОа ЛАК-клетками.

Клинический анализ обнаружил зависимость частоты и степени нарушений от стадии заболевания и от степени поражения костного мозга. Сочетания отдельных нарушений и клинических характеристик больных формируют 3 основных типа функциональных изменений ЕКК, характерных для опухолевой прогрессии НХЛ.

I. "Инертный тип". Характеризуется: 1. Сохранными показателями прямой противоопухолевой активности НК- и ЛАК-клеток, которые практически не меняются в период клинико-гематологической ремиссии; 2. Нормальной спонтанной цитотоксичностью МНК против НК-резистентной линии Raji; 3. Нормальной или сниженной спонтанной продукцией ФНОа; 4. Снижением цитотоксического потенциала ЛАК-СН и стимулированной рИЛ-2 продукции ФНОа.

Указанные характеристики выявлены у 45% из общей группы обследованных больных с различными гистологическими вариантами, подавляющее большинство из которых (90%) имели II или III стадию заболевания. Также "инертный" тип был обнаружен у больных с IÜ стадией НХЛ без поражения костного мозга. Следовательно, главной клинической особенностью данной группы больных было отсутствие вовлечения в опухолевый процесс костного мозга.

II. "Активированный тип". Характеризуется: 1. Умеренной депрессией НК-активности с одновременным повышением спонтанной цитотоксичности МНК против линии Raji; 2. Снижением ЛАК-активности против линии К562, при сохранении высокой цитотоксичности ЛАК-клеток против линии Raji; 3. Высокой эффективностью генерации ЛАК-клеток против линии Raji в культурах МНК костного мозга; 4. Повышенной спонтанной продукцией ФНОа, при сниженном ответе на стимуляцию рИЛ-2; 5. Снижением цитотоксического потенциала ЛАК-СН.

"Активированный тип" обнаружен у 30% обследованных больных. Из них 63% имело вовлечение костного мозга. Очевидно, данный тип Формируется на ранних этапах поражения костного мозга.

III. "Депрессивный тип". Характеризуется: 1. Глубоким падением НК-активности МНК периферической крови и костного мозга; 2.Подавлением генерации ЛАК-клеток из МНК периферической крови и костного мозга; 3. Депрессией спонтанной и стимулированной продукции ФНОа; 4. Снижением цитотоксического потенциала ЛАК-СН.

"Депрессивный тип" выявлен у 21% обследованных больных при лейкемизации НХЛ. Основными патогенетическими механизмами депрессии НК- ЛАК-активности можно считать метапластическое вытеснение опухолевым клоном костномозговых предшественников ЕКК.

Выделенные типы функциональных изменений ЕКК отражают этапность взаимодействий опухоли, иммунной системы и гемопоэза при прогрессии НХЛ, вне зависимости от морфологического варианта. Это дает экспериментальное обоснование иммунотерапии, направленной на повышение противоопухолевых свойств ЕКК (рИЛ-2, перенос ЛАК-клеток), эффективность которой наряду с чувствительностью опухоли, зависит и от исходного состояния системы ЕКК у больных НХЛ.

Результаты исследования позволяют предполагать наибольшую перспективность указанных методов иммунотерапии при "активированом типе" функциональных изменений ЕКК у больных с вовлечением костного мозга. ИЛ-2 может потенцировать выявленную активацию клонов ЕКК с относительной специфичностью к лимфомным клеткам, аналогом которых в эксперименте была линия Raji. Костный мозг при вовлечении в опухолевый процесс становится доступным источником тумор-инфильтрирующик лимфоцитов для длительного клонирования in vitro и дальнейшего клинического применения. Наконец, умеренная НК-депрессия в этой категории больных определяет более выраженный иммунокоррегирующий эффект рИЛ-2, чем у больных с исходно нормальной НК-активностью ("инертный тип"). В противоположность этому, "депрессивный тип", характерный для больных с лейкемизацией НХЛ, определяет наименьшую потенциальную эффективность терапии рИЛ-2, что связано с глубокими структурными и функциональными нарушениями ЕКК и слабым ответом на цитокиновую коррекцию.

Эти обоснования находят ряд косвенных подтверждений в литературе. При большей чувствительности in vitro лимфомных клеток ВСЗ к аутологичным ЛАК-клеткам (Oshimi К.,1986), наибольшая эффективность рИЛ-2 в исследовании J.-M.Tourani (1991) была показана при лимфомах НСЗ, которые характеризуются практически 100% вовлечением костного мозга. ЛАК-клетки, генерированные из МНК лимфатических узлов больных НХЛ, глубоко угнетены (Nadkarni J.J.,1993), а в костном мозге выявляется высокая ЛАК-активность.

Таким образом, анализ собственных материалов и данных литературы раскрывает природу индивидуальных особенностей активности ЕКК и на основании выделения типов функционирования ЕКК ("инертный", "активированный", "депрессивный") определяет показания к назначению рИЛ-2 и ЛАК-терапии у больных НХЛ.

- 18 -ВЫВОДЫ.

1. Снижение НК-активности МНК периферической крови и костного мозга при НХЛ тесно связано с наличием и степенью опухолевого поражения костного мозга и не зависит от гистологического варианта заболевания. При этом, у первичных больных НХЛ обнаруживается повышенная спонтанная цитотоксичность МНК периферической крови против лимфобластоидной линии Raji, резистентной к НК-клеткам.

2. При НХЛ сохранена эффективная генерации ЛАК-клеток под влиянием рИЛ-2. Уровень цитотоксичности ЛАК-клеток против НК-резистентных мишеней не зависит от стадии заболевания, гистологического варианта, но достоверно снижен относительно показателей здоровых доноров. У больных с вовлечением костного мозга эффективность генерации ЛАК-клеток в костномозговых культурах выше, чем в периферической крови.

3. Активная фаза НХЛ характеризуется нарушениями в дистантных механизмах противоопухолевой активности ЛАК-клеток. Снижается суммарный цитотоксический потенциал ЛАК-супернатантов против линии К562 и обнаруживается дисбаланс продукции ФНОа, выражающийся в повышенной спонтанной продукции со снижением ответа ка стимуляцию рИЛ-2. Указанные нарушения выявляются уже при локальных стадиях заболевания, когда клеточно-опосредованные механизмы НК- и ЛАК-активности существенно не страдают.

4. В фазе ремиссии НХЛ цитотоксическая активность НК-клеток восстанавливается до донорского уровня, повышается эффективность генерации и цитотоксичность ЛАК-клеток, нормализуются дистантные механизмы функционирования ЛАК-клеток.

5. Нарушения в системе ЕКК при опухолевой прогрессии НХЛ происходят поэтапно с формированием характерных типов функционирования НК- и ЛАК-клеток. "Инертный", "активированный" и "депрессивный" типы функционирования ЕКК определяют необходимость дифференцированного подхода к назначению больным НХЛ рИЛ-2 и других цитокинов, повышающих противоопухолевые свойства ЕКК.

6. Спленоперфузат по данным in vitro способен генерировать цитотоксическую активность МНК периферической крови против свежевыделенных клеток НХЛ и острого лимфобластного лейкоза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Комплексная оценка клеточно-опосредованных и дистантных механизмов противоопухолевого действия ЕКК с определением типа Функционирования, рекомендуется для индивидуализации показаний к

иммунотерапии (рИЛ-2, ЛАК-терапия, ТИЛ-терапия) у больных НХЛ. По данным in vitro в активной Фазе заболевания наиболее перспективным является применение рИЛ-2 у больных с вовлечением костного мозга при выявлении "активированного типа" Функционирования НК- и ЛАК-клеток. При наличие "депрессивного типа", сопряженного с лейкемизацией НХЛ, использование рИЛ-2 малоперспективно, и может рассматриваться только после достижения клинико-гематологической ремиссии. У больных без признаков поражения костного мозга, с превалированием нарушений дистантных механизмов ("инертный тип") для повышения продукции дистантных цитотоксических факторов (ФНОа, ИНФг) рекомендуется дополнительная активация эффекторов in vitro опухолевыми мишенями (аутологичные опухолевые клетки или гистогенетически близкие опухолевые линии).

2. Костный мозг больных НХЛ может использоваться как дополнительный или альтернативный источник противоопухолевых эффекторов (ЛАК-клетки) для проведения иммунотерапии.

3. Повышенный уровень спонтанной продукции ФНОа (более 0,34 нг/мл) в ремиссии заболевания у больных со специфическим поражением костного мозга может служить дополнительным критерием остаточной опухолевой массы и вероятности рецидива НХЛ.

4.Комплекс нативных цитокинов, содержащийся в спленоперфузате, in vitro генерирует цитотоксическую активность МНК против свежевыделенных лимфомных клеток и может быть рекомендован для включения в программы адоптивной иммунотерапии больных НХЛ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЯ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Кулагин А.Д., Шевела Е.Я., Лисуков И.А. Нарушения в механизмах иммунобиологического надзора при опухолевой прогрессии неходжкинеких лимфом. // Тез. докл. межвузовской научной конференции "Интеллектуальный потенциал Сибири", Новосибирск, 1994.- Т.2. - С.13.

2. Черных Е.Р., Оевела Е.Я., Конина Н.А., Халдояниди С.К., Кулагин А.Д., Никонов С.Д., Лисуков И.А. Влияние перфузата ксеноселезенки на гекопоэз и противоопухолевую активность естественных киллерных клеток. // Аллергология и клиническая иммунология.- 1994. - N2. - С. 72 - 75.

3. Кулагин А.Д., Лисуков Н.А., Цветков А.Г., Черных Е.Р., Никонов С.Д. Применение перфузата ксеноселезенки в программной терапии гемобластозов. // Тез. докл. четвертой научно-практической

конференции врачей "Актуальные вопросы современной медицины", Новосибирск, 1994. - С.141 - 142.

4. Кулагин А.Д., Шевела Е.Я., Лисуков H.A. Цитотоксическая активность мононуклеаров периферической крови больных неходжкинскими лимфомами против клеток линии К562. // Тез. докл. 55-й конференции студентов и молодых ученых Новосибирского медицинского института, Новосибирск, 1994. - С.111.

5. Кулагин А.Д., Шевела Е.Я., Лисуков И.А., Черных Е.Р., Крючкова И.В., Ушакова Г.Ю., Лосева М.Н. Перспективы иммунотерапии неходжкинских лимфом: изучение генерации лимфокин-активированных киллерных (ЛАК) клеток in vitro. // Тез. докл. пятой научно-практической конференции врачей "Актуальные вопросы современной медицины", Новосибирск, 1995,- Т.1. - С.50 - 51.

6. Кулагин А.Д., Шевела Е.Я. Экстрацеллюлярная цитотоксичность ЛАК-клеток у больных неходжкинскими лимфомами. // Тез. докл, научной сессии сотрудников НМИ к 50-летию Победы. Новосибирск,

1995. - Т.2. - С.197.

7. Кулагин А,Д., Шевела Е.Я., Крючкова И.В., Ковынев И.Б., Лисуков И.А., Черных Е.Р., Лосева М.И. Влияние поражения костного мозга на активность естественных киллерных клеток у больных неходжкинскими лимфомами. // Тез. докл. шестой научно-практической конференции врачей "Актуальные вопросы современной медицины", Новосибирск,

1996,- Т.2. - С.332 - 334.

8. Кулагин А.Д., Шевела Е.Я., Лисуков H.A., Черных Е.Р., Лосева М.И. Генерация лимфокин-активированных киллерных клеток у больных неходжкинскими лимфомами. // Гематол.и трансфузяол.- 1996,- Т.41. N4. - С. 21 - 24

9. Кулагин А.Д., Шевела Е.Я., Лисуков И.А., Черных Е.Р., Лосева М.И. Состояние естественной киллерной активности мононуклеарных клеток периферической крови и костного мозга при опухолевой прогрессии неходжкинских лимфом. // Иммунология.- 1996. - N5. - С. 52 - 54.

Подписано к печати 8 октября 1996 г.

Формат 60 х 84/16. Заказ N 0914. Тираж 100 экз. Объем 1 п.л. Типография RISO, г. Новосибирск, Красный проспект 52, 1996 г.