Автореферат и диссертация по медицине (14.00.01) на тему:Функциональная активность CD56+ естественных киллеров при угрозе невынашивания беременности ранних сроков и влияние на нее сохраняющей терапии

На правах рукописи

003404069

ЛЕПИЛОВА ИРИНА БОРИСОВНА

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ С 1)56+ ЕСТЕСТВЕННЫХ КИЛЛЕРОВ ПРИ УГРОЗЕ НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ РАННИХ СРОКОВ И ВЛИЯНИЕ НА НЕЕ СОХРАНЯЮЩЕЙ ТЕРАПИИ

14.00.01 — акушерство и гинекология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских- наук

1 9 НОЯ ?009

ИВАНОВО-2009

003484069

Работа выполнена в Федеральном Государственном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н.Городкова Федерального агенства по высокотехнологичной медицинской помощи» Научные руководители -

Доктор медицинских наук Борзова Надежда Юрьевна

Доктор медицинских наук, профессор Сотннкова Наталья Юрьевна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Гречканёв Геннадий Олегович (ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия Росздрава»)

Доктор медицинских наук, профессор Дубнсская Лариса Арсеньевна (ГОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия Росздрава»)

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита состоится «_» декабря 2009 года в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 208.028.01 при Федеральном Государственном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» по адресу: 153045, г. Иваново, ул. Победы, 20.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Ив.НИИ МиД им. В.Н. Городкова Росмедтехнологий».

Автореферат разослан «_» ноября 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Панова И.А.

Актуальность проблемы

Актуальность проблемы невынашивания беременности (НБ) в современном акушерстве неоспорима и по-прежнему остается одной' из наиболее сложных и социально значимых. Частота этой патологии по различным литературным источникам составляет от 5,3 до 20 % [Макаров О.В., 2006], т.е. практически каждая 5-я беременность заканчивается самопроизвольным выкидышем или преждевременными родами. Еще более значимой проблему НБ делают современный низкий уровень рождаемости: -9,8%(2002), 10,4% (2004), 10,1% (2006), не обеспечивающий воспроизводство населения, снижение уровня повторных родов с 51 до 41 %, уменьшение доли детей с 22,6 % (2002) до 20,9% (2006), что обуславливает негативные тенденции, грозящие демографическими спадами и в дальнейшем. На протяжении последних лег снижается число беременностей (в 2002 г.-З млн.200 тыс., в 2006г.-3 млн. 160 тыс.), число бесплодных супружеских пар остается стабильно высоким - 4-5 млн. [Кулаков В.И., 2006; Радзинский В.Е.,2006]. Недонашивание беременности - одна из основных причин перинатальной заболеваемости и смертности. Около половины всех случаев мертворождений, ранней неонатальной и младенческой смертности приходится на долю недоношенных детей. Поэтому в сложившейся ситуации крайне важно сохранить каждую беременность, обеспечив рождение здорового ребенка.

В настоящее время в связи с широким развитием возможностей иммунологии репродукции изучение иммунологических аспектов беременности и ее невынашивания стало одним из самых актуальных и перспективных, и все больше исследователей приходят к выводу о тесной взаимосвязи и взаиморегуляции между эндокринной и иммунной системами, реализующейся на различных этапах репродуктивной функции [II. И^ЬираЛу, 2006].

В настоящее время имеется большое количество гипотез, пытающихся объяснить феномен неотторжения генетически и иммунологически чужеродного плода. Опираясь на иммунологические теории взаимоотношений мать-плод, можно выделить основные аспекты иммунологии невынашивания

беременности. В последние годы установлено, что неосложненная беременность сопровождается активацией лимфоцитов, в том числе и клеток с цитотоксической активностью [Сотникова Н.Ю., 2005] ЕК имеют важное значение в формирование децидуальной оболочки и развитии нормальной беременности [Сотникова Н.Ю., 2005, M. Peter, 2000]. Нарушение функции или количества ЕК ассоциируется с бесплодием неясного или иммунного генеза, невынашиванием, а также преэклампсией, синдромом задержки развития плода и эндометриозом [В.А. Сгоу, 2003]. В то же время, несмотря на большое число работ, посвященных роли ЕК при беременности, а особенно при угрозе ее прерывания остается неясной.

Согласно последним литературным данным, одним из основных гормонов, который ингибирует, опосредованно через Т-лимфоциты, реакцию отторжения плода является прогестерон. Известно, что на поверхности NK-клеток находятся так называемые киллер-активирующие и киллер-ингибирующие рецепторы. В результате взаимодействия прогестерона с рецепторами Т-клетки продуцируют прогестерон индуцированный блокирующий фактор (PIBF), который, воздействуя на "NK-клетки, смещает иммунный ответ матери на эмбрион в сторону Th -2 типа [G.S. Vince, 2000, В.А. Croy, 2003, G.. Chaouat, 2004]. При низком содержании прогестерона вырабатывается мало (P1BF), и происходит чрезмерная активация натуральных киллеров [J. Szekeres-Bartho,1997; T.A.Henderson,2005]. Однако, изучение не только содержания, но и функциональной активности естественных киллеров как на системном, так и на локальном уровне ранее не проводилось. Рандомизированные исследования по значимости тех или иных иммунологических аспектов невынашивания практически отсутствуют.

К настоящему времени нет единого мнения о целесообразности применения различных препаратов в составе терапии угрозы невынашивания беременности ранних сроков.

Цель: Оценить функцию ЕК у женщин с угрозой невынашивания беременности ранних сроков, разработать прогностические критерии угрожающих преждевременных родов и оценить влияние сохраняющей терапии на функцию ЕК. Задачи:

1. Дать оценку состояния репродуктивного и соматического здоровья женщин с невынашиванием беременности, последующего течения беременности и родов, состояния новорожденного после перенесенной угрозы прерывания беременности в I триместре.

2. Установить особенности функциональной активности естественных киллеров на системном и локальном уровне по продукции и рецепции ИЛ-2 и ИФНу у женщин с невынашиванием беременности ранних сроков.

3. Определить влияние сохраняющей терапии, в том числе с применением препарата "Дюфастон" на уровень и рецепцию цитокинов ( ИЛ-2 и ИФНу) и функциональное состояние естественных киллеров на системном уровне.

4. Разработать критерии прогнозирования угрожающих преждевременных родов у женщин с угрозой невынашивания ранних сроков.

Научная новизна исследования:

• Установлено, что самопроизвольный выкидыш ранних сроков беременности на системном уровне ассоциируется с высоким содержанием в крови СЭ56+ ЕК, повышенной рецепцией и продукцией 1Ь-2 и №N-7 СЭ56+ ЕК клетками, а также усилением рецепции и продукции 1Ь-2 и 1Р1Ч-у периферическими лимфоцитами в целом

• Установлены закономерности изменения индекса соотношения С025+/1Ь-2+ лимфоцитов в периферической крови женщин с

угрозой невынашивания беременности 1 триместра, позволяющие прогнозировать угрожающие преждевременные роды.

• Показано, что на локальном уровне при самопроизвольном выкидыше происходит снижение общего количества СЭ56+ ЕК на фоне усиления их функциональной активности.

• Выявлено, что в отличие от самопроизвольного выкидыша угроза прерывания беременности ранних сроков характеризуется повышением уровня С056+ ЕК без изменения их функциональной активности. Изменения количества и функциональной активности С056+ ЕК, а также периферических лимфоцитов более выражены при самопроизвольном выкидыше.

• Выявлены закономерности влияния сохраняющей терапии на количество и функциональную активность СЭ5б+ ЕК: включение препарата «Дюфастон» снижает изначально высокий уровень СЭ56+ ЕК, нормализует рецепцию и внутриклеточную продукцию 1Ь-2 и ШЫ-у С056+ ЕК клетками, что способствует снижению частоты невынашивания беременности и перинатальной патологии.

Практическая значимость:

В клиническую практику предложен способ прогнозирования угрожающих преждевременных родов у женщин с угрозой невынашивания ранних сроков на основании соотношения показателей относительного содержания СЭ25+ к ¡Ь-2 лимфоцитам в периферической крови. Положения, выносимые на защиту: 1. Угроза прерывания беременности в 1 триместре ассоциируется с изменением количества и функциональной активности С056+ ЕК в периферической крови, которые более выражены при самопроизвольном выкидыше. В децидуальной оболочке плаценты при раннем самопроизвольном выкидыше происходит снижение количества СБ56+ ЕК на фоне повышения их функциональной активности и увеличения концентрации 1Ь-2 и 1ЕКу в экстрактах децидуальной ткани.

2. Повышение соотношения С025+/1Ь-2+ лимфоцитов в периферической крови женщин с угрозой невынашивания беременности 1 триместра является критерием угрожающих преждевременных родов.

3. Включение препарата « Дюфастон» в комплексную терапию угрозы невынашивания беременности ранних сроков приводит к нормализации количества и функции периферических СЭ56+ ЕК, и способствует снижению частоты невынашивания беременности.

Внедрение результатов исследования в практику: По результатам исследования получен патент на изобретение «Способ прогнозирования угрожающих преждевременных родов у женщин с угрозой невынашивания ранних сроков». (патент на изобретение № 2344424 от 20.01.2009 года). Разработанный способ прошел предрегистрационные испытания в акушерской и гинекологической клиниках ФГУ «Ив.НИИ МиД им. В.Н.Городкова Росмедтехнологий».

Апробация работы: Основные положения работы доложены на конференции молодых ученых, посвященной 75-летию со дня рождения основателя института, профессора, заслуженного деятеля науки РФ, заслуженного врача РФ В.Н. Городкова (Иваново, НИИ МиД, 26 декабря 2007 года) и на конференции молодых ученых, посвященной памяти основателя института, профессора, заслуженного деятеля науки РФ, заслуженного врача РФ В.Н. Городкова (Иваново, НИИ МиД, 16 марта 2009 года).

Публикации: по теме диссертации опубликовано 11 печатных работ. Личное участие автора: диссертационная работа представляет собой самостоятельный труд автора. Все пациентки лично обследованы диссертантом в условиях акушерской и гинекологической клиник ФГУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова Росмедтехнологий», а также на базе ГУ «8-ая городская клиническая больница г. Иванова». Материал диссертации является результатом собственных исследований, которые были проведены в иммунологической лаборатории ФГУ «Ивановский научно-исследовательский

институт материнства и детства им. В.Н. Городкова Росмедтехнологий». Статистическая обработка полученных данных выполнена с использованием современных компьютерных программ. Структура п объем диссертации:

Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, три главы собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и практические рекомендации. Библиографический указатель включает 150 отечественных и 134 иностранных источника. Работа иллюстрирована 12 рисунками и 23 таблицами. Содержание работы: Материал и методы исследования

В условиях акушерской и гинекологической клиник ФГУ «Ивановского научно-исследовательского института материнства и детства им. В.Н.Городкова Росмедтехнологий», а также на базе ГУ «8-ой городской клинической больницы г. Иванова« обследованы 100 беременных женщин со сроком гестации 6-12 недель, и далее прослеживался исход беременности.

В зависимости от характера течения беременности, (наличие или отсутствие угрозы прерывания беременности), принципов медикаментозной терапии, исходов беременности выделены следующие клинические группы женщин:

- с угрозой прерывания беременности в первом триместре - I группа (п=50), из них:

- беременные, получающие в комплексном лечении угрозы прерывания «Дюфастон» - IA подгруппа (п=25);

- беременные, не получающих в комплексном лечении угрозы прерывания «Дюфастон» - 1Б подгруппа (п=25);

с начавшимся самопроизвольным выкидышем I триместра— II группа (п=23).

без угрозы прерывания в первом триместре беременности (идущие на медицинский аборт по желанию) - контрольная группа (п=27).

Материалом для исследования пациенток служила периферическая венозная кровь и децидуальная ткань плаценты, которую получали при медицинском аборте и самопроизвольном выкидыше. Образцы децидуальной ткани немедленно помещали в физиологический раствор и в течение 15-20 мин. доставляли в лабораторию клинической иммунологии «Ивановского НИИ материнства и детства им. В.Н.Городкова Росмедтехнологий». Все пациентки были обследованы на ВУИ методом ИФА и ПЦР. Наличие активной инфекции у женщин всех обследуемых групп служило критерием исключения.

Все беременные I группы получали комплексную терапию угрозы прерывания беременности. Пациенткам I А подгруппы в комплесную терапию дополнительно был включен препарат «Дюфастон» по 10 мг х 2 раза в день. Беременные с угрозой прерывания обследовались дважды: до начала проводимой терапии и через 2-3 недели после ее начала, а II и контрольной группы - однократно до инструментального опорожнения полости матки.

Выделение мононуклеарных клеток из децидуальной оболочки плаценты осуществляли безферментативным способом.

Выделение мононуклеарных клеток из периферической крови осуществлялось стандартным способом.

Получение экстрактов децидуальной ткани осуществлялось следущим способом: фрагменты децидуальной ткани отмывали от крови и от клеток трофобласта физиологическим раствором, перемешивая на магнитной мешалке в течение 15 минут. Кусочки децидуальной ткани подсушивали на фильтровальной бумаге, взвешивали и гомогенизировали с использованием гомогенизатора до однородной массы. К полученному гомогенату добавляли PBS в объеме равном изначальному весу децидуальной ткани (на 1 г ткани - 1 мл PBS). Взвесь помещали в пластиковые пробирки Falcon и подвергали замораживанию при -20 С в течение суток, Гомогенат размораживали, фильтровали через 8 слоев плотной марли и ультрацентрифугировали 30 мин при 4000 об/мин при температуре +4°С. Надосадочную жидкость разливали мелкими аликвотами и замораживали при -20°С до проведения иммуно-

ферментного анализа.

Поверхностный фенотип клеток и внутриклеточную экспрессию цитокинов определяли с помощью моноклональных антител (мАТ) методом двухцветной проточной цитофлюориметрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, USA).

Спонтанную внутриклеточную продукцию цитокинов оценивали непосредственно в только что выделенных фракциях клеток. Процедуру внутриклеточного окрашивания проводили в соответствии с инструкциями фирмы-производителя, используя коммерческий набор FIX & PERM cell permeabilization kit (CALTAG Laboratories, США) для пермеабилизации клеточной мембраны. Внутриклеточнуюпродукциго цитокинов оценивали в общей популяции лимфоцитов (IL-2+, IFNy+ лимфоциты).

Содержание цитокинов в крови и в экстрактах децидуальной ткани оценивали методом ELISA на микропланшетном ридере Multiscan EX Labsystems (Финляндия).

Статистическая обработка данных проводилась с расчетом среднего арифметического и ошибки среднего арифметического с использованием программы Microsoft Excel из комплекта Microsoft Office 2000.

Результаты исследования и их обсуждение:

Возраст обследуемых женщин колебался от 15 до 40 лет, подавляющее большинство женщин основных и контрольной групп было в возрасте 21-27 лет, т.е. в активном репродуктивном периоде. Однако, в группе женщин с угрозой прерывания беременности достоверно чаще встречались пациентки старшего репродуктивного возраста(>36 лет) - в 4,0% (р<0,05, по сравнению с группой контроля).

Также было установлено, что в группу с угрозой прерывания достоверно чаще по сравнению с группой контроля входили служащие 38,0% и 11,1% (р<0,01); и пациентки с высшим образованием 42,0% и 11,1% соответственно (р<0,01).

При оценке семейного положения установлено, что число пациенток, находящихся вне брака, было достоверно выше во II клинической группе по сравнению с группой контроля: 47,8% и 18,5% соответственно, (р<0,05), что согласуется с данными литературы о неблагоприятном влиянии данного фактора на течение и исход беременности.

При проведении анализа данных акушерско-гинекологического анамнеза установлено, что I и II основные группы по количеству первородящих достоверно не отличались от контроля: 76,0%, 43,48% и 62,96% соответственно (р>0,05); медицинских абортов в анамнезе: 38,0%, 69,57%, и 55,56%, соответственно (р>0,05). Однако, самопроизвольные выкидыши в анамнезе достоверно чаще по сравнению с контролем отмечены у пациенток с угрозой прерывания беременности: 20,% и 8,7% соответственно (р<0,05). Случаев привычного невынашивания беременности у женщин всех клинических групп не было. Также фактором исключения из обследования служила гиперандрогения.

Гинекологическими заболеваниями достоверно чаще страдали пациентки I и И клинических групп по сравнению с контрольной: 66,0%, 86,95% и 26,93% соответственно, (р<0,001 в обоих случаях).

Наиболее часто выявлялись воспалительные заболевания внутренних половых органов, которые достоверно чаще имели место у пациенток I и II основных групп по сравнению с контролем (36,0%, 34,78% и 11,11%, (р<0,02 в обоих случаях, соответственно).

Также у пациенток с угрозой прерывания достоверно чаще по сравнению с контролем гинекологический анамнез был отягощен эндометриозом (12,0% и 4,35% соответственно, р<0,02) и бесплодием (16,0% и 0,0% соответственно, р<0,01).

Таким образом, анализ акушерско-гинекологического анамнеза подтверждает литературные данные о роли нарушений репродуктивной функции и воспалительного фактора на развитие угрозы прерывания беременности.

Экстрагенитальная патология в анамнезе была выявлена у 90,0% женщин I основной клинической группы, у 34,78% - во II, и у 44,44% пациенток - в группе контроля (р<0,001 и р>0,05 соответственно по сравнению с контролем).

У женщин с угрозой невынашивания достоверно чаще, чем в контрольной группе выявлялись: хронический пиелонефрит (24,0% и 0,0% соответственно, р<0,001); диффузное увеличение щитовидной железы: (18,0% и 7,4% соответственно, р<0,02); НЦЦ по гипотоническому типу: (14,0% и 3,7% соответственно, р<0,02); ожирение: (14,0% и 3,7% соответственно, р<0,02).

Важным аспектом, проанализированным нами, явилась оценка течения беременности после перенесенной угрозы прерывания и ее исход. Однако, поскольку беременность у пациенток II и контрольной групп завершилась в 1 триместре, дальнейшее течение беременности и родов было проанализировано только у женщин I клинической группы.

Последующее течение беременности осложнилось рецидивом угрозы прерывания во II триместре у 60,0% беременных I группы, в том числе у 68,0% - пациенток 1А подгруппы и у 52,% - 1Б подгруппы, (р>0,05). В третьем триместре частота угрозы прерывания беременности среди пациенток I А и I Б подгрупп составила 40% и 44% соответственно, (р>0,05).

ФПН выявлялась в обеих подгруппах с одинаковой частотой - 40%, (р>0,05). Нарушение продуцирования околоплодных вод в виде много- и маловодия отмечалось лишь в 4% и только среди пациенток, не получающих в комплексном лечении препарат «Дюфастон». Как следствие ФПН, а также ряда других неблагоприятных факторов у 48% пациенток I А подгруппы развилась хроническая внутриутробная гипоксия плода, в I Б подгруппе частота данной патологии составила 40%, (р>0,05). Отставание фетометрических показателей у плодов как в I А, так и во I Б подгруппах было выявлено в 8% случаев (р>0,05). Развитие такого осложнения беременности, как гестоз, отмечено у 48% беременных обеих подгрупп. При анализе частоты развития гестоза было установлено, что в I А подгруппе чаще развивалась водянка: в 40,0% случаев, а в I Б - нефропатия: в 20,0%, (р>0,05).

Таким образом, наше исследование подтверждает данные литературы о высокой частоте различных осложнений беременности после перенесенной угрозы прерывания беременности в I триместре.

У 76% пациенток I группы беременность завершилась своевременными родами, в том числе: у 88%, пациенток, получающих препарат «Дюфастон», и лишь у 64% пациенток I Б подгруппы, (р<0,05).

Досрочное прерывание беременности среди женщин основной группы произошло в 24,0% случаев, т.е. практически у каждой четвертой. В I А подгруппе преждевременные роды произошли у 8,0% пациенток, самопроизвольные выкидыши у - 4,0%. Среди пациенток I Б подгруппы невынашивание беременности отмечалось в 3 раза чаще, чем среди пациенток, получающих в комплексном лечении препарат «Дюфастон»: преждевременные роды были у 24,0% женщин (р<0,05), самопроизвольные выкидыши у 12,0% (р<0,05).

Достоверных различий в частоте осложнений родов и послеродового периода между пациентками I А и 1 Б подгрупп выявлено не было.

Высокая частота различных осложнений беременности, а особенно, угрозы ее прерывания, отклонения от нормального течения родов не могут не сказаться на состоянии здоровья плода и новорожденного.

С перинатальной патологией родились 43,5% детей I группы, в том числе больными родились 59,1% новорожденных из I Б подгруппы, и 37,5% -из I А подгруппы, (р<0,05). В состоянии асфиксии легкой и средней степени тяжести родилось 37,5% детей I А подгруппы, а среди детей 1 Б этот показатель оказался выше и составил 59,0%, (р<0,05). Развитие конъюгационной желтухи отмечено у 8,3% новорожденных 1 А подгруппы и у 22,7% детей I Б подгруппы (р<0,05). На долечивание на второй этап выхаживания новорожденных и другие стационары было переведено 37,0% детей, первой группы, из них - 29,2% детей из I А подгруппы, и 45,4% из I Б подгруппы, (р<0,05).

Таким образом, нами было установлено, что в подгруппах женщин, получивших и не получивших в комплексном лечении угрожающего выкидыша препарат «Дюфастон», достоверных различий в дальнейшем течении беременности, в частности, рецидива угрозы прерывания, гестоза, ФПН, ХВУГП, много- и маловодия не было. Однако, в ходе проведенного исследования выявлено, что в группе пациенток, принимающих в комплексном лечении препарат «Дюфастон», в 3 раза реже отмечено досрочное прерывание беременности, а уровень здоровья новорожденных у пациенток этой подгруппы был достоверно выше, по сравнению с подгруппой женщин, не получавших «Дюфастон».

В последние годы установлено, что неосложненная беременность сопровождается активацией лимфоцитов, в том числе и клеток с цитотоксической активностью [Сотникова Н.Ю., 2005]. Одной из наиболее важных популяций лимфоцитов с цитотоксической активностью является популяция ЕК. У человека ЕК составляют около 15 % всех циркулирующих лимфоцитов и около 70 % децидуальных лейкоцитов в первом триместре беременности [М. Peter, 2001, Сотникова Н.Ю., 2005, Т.А. Henderson, 2005]. Нами проведена оценка содержания CD56+ ЕК и их функциональной активности на системном (периферической кровь) и локальном (децидуальная оболочка плаценты) уровнях у беременных I триместра при самопроизвольном выкидыше, угрозе прерывания беременности и при физиологическом течении гестационного процесса

Нами было установлено, что при самопроизвольном выкидыше I триместра в периферической крови женщин было выше, чем у женщин контрольной группы, количество CD56+ ЕК (р<0,001). Одновременно в периферической крови пациенток отмечалось более высокое, чем при физиологически протекающей беременности, содержание CD56+ ЕК, экспресс-сирующих рецепторы к IL-2 и IFNy (р<0,001 в обоих случаях). Кроме того, анализ полученных данных показал, что у женщин при СВ отмечался более высокий уровень CD56+ ЕК, внутриклеточно синтезирующих IL-2 и IFNy

(р<0,01 и р<0,05 соответственно). Однако при данной патологии не было выявлено изменений в сывороточном содержании 1Ь-2 и 1РЫу (р>0,05 в обоих случаях).

1Ь-2 является одним из цитокинов ТИ-1 типа, действие которого при беременности до конца еще не установлено, а данные об его продукции при беременности противоречивы [0.8. Утсе, 2000, В.А. Сгоу, 2003, в.. СЬаоиаЪ 2004]. Вероятно, усиленная продукция иммунокомпетентными клетками 1Ь-2 в начале беременности, особенно на системном уровне, является физиологичной, и определяет формирование специфического иммунного ответа матери на антигены плода. Снижение продукции 1Ь-2 у женщин с угрозой прерывания беременности может приводить к извращению реакции материнской иммунной системы на развивающийся плод и, по-видимому, может быть одним из неблагоприятных факторов, обуславливающих включение механизмов досрочного прерывания беременности.

Кроме того, нами установлено, что у женщин с СВ I триместра значительно возрастало количество лимфоцитов с рецепторами к 1Ь-2 и к №N-7 (СВ25+ и СЭ119+ клетки соответственно) (р<0,001 в обоих случаях). У женщин, беременность которых закончилась самопроизвольным выкидышем, был выше, чем у женщин с неосложненной беременностью, уровень периферических лимфоцитов, внутриклеточно продуцирующих 1Ь-2 и И-Ыу (р<0,01 и р<0,05 соответственно).

Нами установлено, что показатель соотношения периферических С025+/1Ь2+ лимфоцитов у беременных женщин с угрозой невынашивания в 1 триместре может служить прогностическим критерием угрозы преждевременных родов. На основании проведенного исследования разрабатан «Способ прогнозирования угрожающих преждевременных родов у женщин с угрозой невынашивания ранних сроков» (патент № 2344424 от 20 января 2009 года). Так, при значении данного соотношения равном или более 1,0 прогнозируется развитие угрожающих преждевременных родов. Точность

заявляемого способа составила 82,6%, специфичностью 76,9 %, чувствительностью 90,0 %.

В ходе настоящего исследования было также установлено, что в норме и при СВ на ранних сроках беременности С056+ клетки составляли доминирующую популяцию в лимфоцитарном инфильтрате децидуальной оболочки плаценты. Однако, при развитии СВ уровень децидуальных ЕК с фенотипом С056+ достоверно снижался (р<0,01).

Выявленные нами изменения количественных характеристик СВ56+ лимфоцитов децидуальной оболочки плаценты происходили на фоне увеличения содержания в децидуальной оболочке плаценты С056+ ЕК, экспресс-сирующих низкоафинные рецепторы к 1Ь-2, по сравнению с таковыми при неосложненной беременности I триместра (р<0,001). Однако следует отметить, что при данной патологии содержание децидуальных СЭ56+ ЕК, несущих на своей поверхности рецепторы к №N7 (СЭ56+С0119+ клетки), не отличалось от такового при физиологической беременности (р>0,05).

Нами также было установлено, что при самопроизвольном выкидыше I триместра на ранних сроках было достоверно выше, чем при неосложненной беременности тех же сроков, количество децидуальных СЭ56+ лимфоцитов, внутриклеточно продуцирующих как 1Ь-2, так и 1РЫу (р<0,05 и р<0,01 соответственно).

Параллельно нами было также установлено, что при самопроизвольном выкидыше в лейкоцитарном инфильтрате децидуальной оболочки плаценты заметно возрастало общее число лимфоцитов, несущих на своей поверхности рецепторы к 1Ь-2 и №N7, по сравнению с таковым при физиологической беременности (р<0,05 в обоих случаях).

Высокий уровень клеточных , популяций, внутриклеточно продуцирующих те или иные цитокины, не является абсолютным показателем их активности, так как определяет лишь потенциальные возможности клеток, но не. учитывает роль активационных и ингибирующих сигналов, определяя-ющих интенсивность продукции и секрецию цитокинов в ткани в целом. В

связи с этим, нас интересовало исследование содержания изучавшихся цитокинов в экстрактах децидуальной оболочки плацент I триместра при неосложненной беременности и самопроизвольном выкидыше. Как видно из результатов проведенного исследования, концентрация 1Ь-2 в экстрактах децидуальной ткани при самопроизвольном выкидыше была достоверно выше, чем при физиологической беременности I триместра (р<0,05). Кроме того, нами было установлено, что самопроизвольное прерывание беременности характеризовалось более высоким содержанием №N7 в экстрактах децидуальной оболочки плаценты по сравнению с таковым в те же сроки неосложненной беременности (р<0,05).

Таким образом, наши данные показали, что при развитии самопроизвольного выкидыша в I триместре беременности в децидуальной оболочке плаценты происходило изменение количества и функции С056+ ЕК, повышалось содержание 1Ь-2 и ШЫу.

Несомненный интерес представляет сравнение изменений в содержании и функциональной активности СБ56+ ЕК при самопроизвольном выкидыше и угрозе невынашивания 1 триместра, не завершившейся самопроизвольным выкидышем.

У женщин с угрозой невынашивания I триместра по сравнению с показателями женщин с неосложненной беременностью тех же сроков отмечалось увеличение в крови содержания СП56+ ЕК (р<0,001). Однако параметры, характеризующие функциональную активность С056+ ЕК, практически не отличались от таковых у женщин контрольной группы (р>0,05 во всех случаях).

В то же время, у них отмечались изменения функциональной активности периферических лимфоцитов. У женщин с угрозой невынашивания ранних сроков был выше, чем у женщин контрольной группы, уровень лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы к 1Ь-2 (р<0,01) и усиливалась внутриклеточная продукция 1Ь-2 и 1РЫу лимфоцитами периферической крови (р<0,001 и р<0,01, соответственно).

При самопроизвольном выкидыше I триместра было выше, чем при угрозе невынашивания тех же сроков, не сопровождавшейся самопроизвольным выкидышем, содержание в крови CD25+, CD119+ лимфоцитов (р<0,001 в обоих случаях), а также количество лимфоцитов, внутриклеточно продуцирующих IL-2 и IFNy (р<0,001 в обоих случаях). У них также выше был уровень CD56+ ЕК (р<0,05), а также уровень CD56+ ЕК, осуществляющих рецепцию (р<0,001 в обоих случаях) и внутриклеточную продукцию IL-2 и IFNy (р<0,001 и р<0,05, соответственно).

Таким образом, изменения в содержании и функциональной активности ЕК при самопроизвольном выкидыше и угрозе невынашивания в I триместре были сходными, но более выраженными при самопроизвольном выкидыше, чем при угрозе невынашивания беременности, не сопровождавшейся самопроизвольным выкидышем. По-видимому, углубление изменений в содержании и функции CD56+ ЕК может способствовать нарушению местного иммунного гомеостаза и самопроизвольному прерыванию беременности.

Согласно последним исследованиям в области медицины, на сегодняшний день в мире нет ни одного основанного на постулатах доказательной медицины лекарства, реально пролонгирующего беременность. Учитывая вышепреведенные данные, для сохранения беременности необходим лекарственный препарат, который ингибирует реакцию отторжения плода, опосредованную через Т- лимфоциты. В этом вопросе данные Радзинского В.Е. (2009г.) полностью солидарны с результатами, полученными Сидельниковой В.М. о том, что именно такими свойствами обладает ретропрогестерон -«Дюфастон». Препарат «Дюфастон», увеличивая синтез прогестеро.чиндуцирующего блокирующего фактора (PIBF), играет роль блокатора интерлейкинового каскада, что обусловливает его применение в лечении угрозы прерывания беременности в ранние сроки [Т.А. Henderson, 2005]. Иммунологические эффекты ПИБФ затрагивают как клеточные, так и гуморальные иммунные механизмы [В. .С. Choi, 2000 Т.А. Henderson, 2005,

Радзинский В.Е., 2008]. В последнее время «Дюфастон» получил широкое применение в акушерской практике.

Дюфастон - это препарат, иммунологическое действие которого подтверждено в официальных международных исследованиях и который целесообразно применять не для восполнения чаще всего мифического «дефицита» прогестерона, а для блокады интерлейкинового каскада [Радзинский В.Е., 2008; Сидельникова, 2008]. Проведенные нами исследования подтверждают иммуномодулирующее действие «Дюфастона». Установлено, что после проведенного курса сохраняющей терапии с применением препарата «Дюфастон» отмечалось достоверное снижение уровня в крови С056+ ЕК по сравнению с таковым до лечения (р<0,05), хотя их содержание и не достигало показателей контрольной группы (р<0,01). Традиционная сохраняющая терапия без включения препарата «Дюфастон не влияла на уровень С056+ ЕК (р>0,05). После проведенного курса лечения с включением препарата «Дюфастон» происходила нормализация уровня СБ56+ ЕК, экспрессирующих рецепторы к 1Ь-2 и ШЫу (р<0,05 в обоих случаях). Помимо этого, отмечалась нормализация содержания общего пула лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы к 1Ь-2, (р<0,05). После проведенного лечения с применением препарата «Дюфастон» в крови наблююдалось снижение содержания СП56+ ЕК, внутриклеточно продуцирующих ШЫу (р<0,05), при этом уровень С056+1РЫу+ клеток становился достоверно ниже, чем в контрольной группе (р<0,05). Одновременно после курса терапии с включением препарата «Дюфастон» происходила нормализация и общего содержания в крови лимфоцитов, внутриклеточно продуцирующих ШЫу (р<0,01) и 1Ь-2 (р<0,001). Отмеченное нами нормализующее влияние препарата «Дюфастон» на уровень внутриклеточной продукции 1Ь-2 и 1ГЫу следует рассматривать как позитивное и, вероятно, обуславливающее клиническую эффективность препарата. Как особо положительный момент, следует рассматривать нормализующее влияние препарата «Дюфастон» на внутриклеточную продукцию №N7, поскольку Хорошо известно, что 1Шу оказывает

эмбриотоксическое действие. Таким образом, полученные нами результаты позволяют сделать вывод о том, что применение препарата «Дюфастон» приводит к нормализации цитокинового каскада у женщин с угрозой невынашивания на ранних сроках гестации, снижает изначально высокую системную продукцию ШЫу, что, по-видимому, снимает блок продукции цитокинов Т-хелперами и способствует повышению продукции 1Ь-2.

Суммируя полученные результаты, можно прийти к следующему заключению. Угроза прерывания беременности в 1 триместре ассоциируется с изменением количества и функциональной активности СБ56+ ЕК в периферической крови, которые более выражены при самопроизвольном выкидыше. В децидуальной оболочке плаценты при раннем самопроизвольном выкидыше происходит снижение количества С056+ ЕК на фоне повышения их функциональной активности и увеличения концентрации 1Ь-2 и ГРЫу в экстрактах децидуальной ткани. Включение препарата «Дюфастон» в комплексную терапию угрозы невынашивания беременности ранних сроков приводит к нормализации количества и функции периферических СЭ56+ ЕК, способствует снижению частоты невынашивания беременности. Повышение соотношения С025+/1Ь-2+ лимфоцитов в периферической крови женщин с угрозой невынашивания беременности I триместра является критерием угрожающих преждевременных родов.

ВЫВОДЫ:

1. Угроза прерывания в I триместре достоверно чаще развивается у женщин старшего репродуктивного возраста, служащих, с высшим образованием; страдающих воспалительными заболеваниями гениталий, бесплодием, эндометриозом, невынашиванием беременности, а также . хроническим пиелонефритом, диффузным увеличением щитовидной железы, нейроциркуляторной дистонией, ожирением, варикозной болезнью вен нижних конечностей.

2. Самопроизвольный выкидыш ранних сроков беременности на системном уровне ассоциируется с высоким уровнем С056+ ЕК, повышенной рецепцией и продукцией 1Ь-2 и №N-7 С056+ ЕК клетками, а также усилением рецепции и продукции 1Ь-2 и №N-7 периферическими лимфоцитами в целом; на локальном уровне - со снижением общего количества СБ56+ ЕК на фоне увеличения пула СО56+ лимфоцитов, внутриклеточно продуцирующих 1Ь-2 и №N7, а также С056+ ЕК, экспрессирующих рецепторы к 1Ь-2 и уровня 1Ь-2+ и №N-7+децидуальных лимфоцитов в целом.

3. Установлено, что индекс соотношения лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы к 1Ь-2 и внутриклеточно продуцирующих 1Ь-2, может использоваться для раннего прогнозирования угрожающих преждевременных родов у женщин с угрозой невынашивания I триместра.

4. Угроза прерывания беременности ранних сроков характеризуется повышением уровня С056+ ЕК без изменения их функциональной активности. Изменения количества и функциональной активности С056+ ЕК, а также периферических лимфоцитов более выражены при самопроизвольном выкидыше.

5. Сохраняющая терапия с включением препарата «Дюфастон» снижает изначально высокий уровень СЭ56+ ЕК, нормализует рецепцию и внутриклеточную продукцию )Ь-2 и №N-7 С056+ ЕК клетками, а также функциональную активность общего пула периферических лимфоцитов. Проведение сохраняющей терапии без включения препарата «Дюфастон» не влияет на уровень СЭ56+ ЕК, но нормализует их функциональную активность. Применение препарата «Дюфастон» в терапии угрозы прерывания беременности способствует снижению частоты невынашивания беременности, уменьшению перинатальной патологии и улучшению здоровья новорожденных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

Для прогнозирования рецидива угрожающих преждевременных родов у женщин с угрозой невынашивания ранних сроков в 6-12 недель гестации необходимо определять соотношения показателей относительного содержания CD25+ к IL-2 лимфоцитам в периферической крови. При значении соотношения равном или более 1,0 прогнозируют развитие угрожающих преждевременных родов.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Лепилова И.Б. Влияние препарата дюфастон на внутриклеточный синтез цитокицов лимфоцитами периферической крови женщин с невынашиванием беременности ранних сроков [Текст] / И.Б.Лепилова II Неделя науки-2006: материалы науч. - практ. конф. студентов и молодых ученых ИвГМА. -Иваново, 2006. - С.11-13.

2. Влияние препарата ДЮФАСТОН на цитокиновый профиль беременных с угрозой невынашивания беременности ранних сроков [Текст] / Н.Ю. Борзова, JI.B. Посисеева, E.JI. Бойко, Н.Ю.Сотникова, Ю.С. Анциферова, A.B. Кудряшова, И.Б.Лепилова//Журнал РОАГ.-2006.-№4.-с.11-12.

3. Влияние препарата Дюфастон на цитокиновый профиль при невынашивании беременности ранних сроков [Текст] / Н.Ю. Сотникова, Ю.С. Анциферова, Н.В. Крошкина, Н.Ю. Борзова, И.Б. Лепилова // Russian Journal of Immunology.- 2006.-V. 9, Suppl.3.- P. 119-120.

4. Характеристика синтеза и продукции цитокинов у женщин с угрозой невынашивания беременности ранних сроков [Текст] / Н.В. Крошкина, Н.Ю. Сотникова, Н.Ю. Борзова, И.Б. Лепилова // Медицинская иммунология,- 2006.-Том 8. - № 2-3. - С.312.

5. Особенности внутриклеточной продукции и рецепции IFNy CD56+ лимфоцитами при невынашивании беременности [Текст] / Н.Ю. Сотникова, Н.В. Крошкина, Н.Ю. Борзова, И.Б. Лепилова // Ж. Физиология и патология иммунной системы.- 2006.- №10. - Прил. 1. - С.60.

6. Особенности продукции и рецепции цитокинов в децидуальной оболочке плаценты при самопроизвольном выкидыше [Текст] / Н.В. Крошкина, Н.Ю. Сотникова, И.Б. Лепилова, Н.Ю. Борзова/'/ Russian Journal of Immunology.-2007.-V. 9, Suppl.4.- P.92-93

7. Роль ранних нарушений продукции цитокинов в формировании патологии беременности [Текст] / Н.Ю.Сотникова, A.B. Кудряшова, Н.В. Крошкина, И.А. Панова, Н.С. Лукина, И.Б. Лепилова, М.И. Пелевина // Российский иммунологический журнал,- 2007.- Т.1(10).-№3-4,- С.258-265.

8. Функциональное состояние естественных киллеров в периферической крови и децидуальной оболочке у женщин с невынашиванием беременности ранних сроков [Текст] / И.Б.Лепилова, Н.Ю. Борзова, Н.Ю. Сотникова, Н.В.Крошкина И Вестник РУДН.-2009.-№6. - с.268-273.

9. Лепилова И.Б. Содержание и функциональное состояние естественных киллеров в периферической крови и децидуальной оболочке у женщин с невынашиванием беременности ранних сроков [Текст]/ Материалы X юбилейного Всероссийского научного форума « Мать и дитя». - М., 2009. -С.114-115.

10.Патент 2344424 Российская Федерация. Способ прогнозирования угрожающих преждевременных родов у женщин с угрозой невынашивания ранних сроков / Борзова Н.Ю., Сотникова Н.Ю., Крошкина Н.В., Лепилова И.Б.; заявитель и патентообладатель Ивановский науч. - исслед. ин ^ т материнства и детства. - № 2007126889; заявл. 16.07.07; опубл. 20.01.2009. Бюл. 2.

11. Local immune events in RSA [Text] / N.Yu. Sotnikova, N.V. Kroshkina, D.N. Voronin, I.B. Lepilova // Immunology of Reproduction Matherials of 12-th lut.symposium.- Varna, 2009,- P.46-47.

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ:

CD- cluster of differentiation (кластер дифференцировки лимфоцитов) Ig - иммуноглобулин

PIBF - прогестерон индуцированный блокирующий фактор Th - Т-хелпер АГ - антиген AT - антитело

ВУИ - внутриутробное инфицирование

ДО - децидуальная оболочка

EK(NK) - естественные киллеры

ИЛ(1Ь) - интерлейкин

ИКК - иммунокомпетентных клеток

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФН (IFN) - интерферон

НБ - невынашивание беременности

ПЦР- полимеразная цепная реакция

СВ - самопроизвольный выкидыш

УН - угроза невынашивания

ФБ - физиологическая беременность

ФПН - фетоплацентарная недостаточность

Подписано в печать 05.10.2009 г. Формат издания 60х84'/16. Печ. л. 1,5. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 1058.

Типография ГОУСПО Ивановского энерго колледжа, 153025, г. Иваново, ул. Ермака, 41. Тел.: 37-52-44, 32-50-89 E-mail: tip-l@mail.ru, www.tipl.ru