Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Функциональная активность белка плазмы крови транскобаламина-11 у детей с острым лейкозом

На правах рукописи

ГУДКОВА Маргарита

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ БЕЛКА 1ШЗШ КРОВИ ТРАНСКОБАЛАШНА-11 У ДЕТЕЙ С ОСТРШ ЛЕЙКОЗОМ

(14.00.14 - онкология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в лаборатории эндогенных модифицирующих факторов канцерогенеза Онкологического научного центра им. Е Е Евохина РАМЕ

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Е Е Шсищева

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Л. Б. Горбачева доктор медицинских наук, профессор Л.А.Махонова

Ведущее учреждение - Российский Государственный Медицинский Университет, кафедра детских болезней N 1.

Защита состоится "_"_1997 г.

на заседании Специализированного Совета К 001.17.01 Онкологического научного центра им. Е Е Бдохина РАЫН (115478, г. Москва, Каширское ш. 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОНЦ РАМЕ

Автореферат разослан "_"_ 1997г.

Ученый секретарь

Специализированного Совета

доктор медицинских наук, профессор Е С. Турусов

1. Актуальность проблемы

Среди всех онкологических заболеваний детского возраста более 1/3 составляет острый лейкоз (ОЛ), из которых около 80Z представляет острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ). Современная химиотерапия наиболее эффективна при этой форме лейкоза ЕЫахонова JL А., 1973; Владимирская Е. Б., 1979, 1991; Дурнов Л.А. И соавт., 19913. Однако известен ряд факторов, существенно повышающих частоту рецидивов заболевания, к которым безусловно следует отнести нарушения метаболизма кобаламинов при ОЛ [ Мясищева Н. R , 1972-, 1990]. При прогностически неблагоприятных вариантах ОЛЛ детей обнаружено сниженное содержание кобаламинов в бластных клетках крови и костного мозга, а также меньшая чувствительность к терапии [Мясищева ЕЕ и соавт., 19873. Вследствие снижения синтеза кобаламиновых коферментов в кроветворных клетках возникают растройства нормального кроветворения, пищеварительной, иммунной и нервной систем. Нарушение функциональной активности белков, транспортирующих экзогенные кобаламины в цитоплазму, составляет важное звено в этиопатогенезе различных заболеваний. Поэтому актуально изучение системы транспорта кобаламинов в кроветворные клетки. Транспортным белком плазмы, ответственным за поступление предшественников кобаламиновых коферментов в клетки, является транскобаламин-11 (Tell) [Hall С.A., Finkler А.Е., 1965; 1967]. Известно, что генетический дефект синтеза ТсII обуславливает нежизнеспособность-детей с нарушением гемопоэтических и иммунологических функций в результате сниженного поступления кобаламинов в кроветворные клетки [Frater-Schroder М. ,1979;Hitzig V. Н. et al, 1979;Rosenblatt D. S. , Cooper B. A., 1987-, Иегер Л. ,1990]. Проявлением нарушенного обмена Toll в организме взрослого человека является также значительное увеличение его концентрации в плазме при патологических состояниях, связанных с интенсивной пролиферацией клеток воспалительных, аутоиммунных и некоторых злокачественных заболеваниях, включая лейкозы взрослых [Rachmilewitz В. et al, 1971; Rachmilewitz В. ,1979; Iensen Н. С. et al, 1983; Rana К. S. et al, 1987].

Поступление кобаламинов в цитоплазму происходит в результате связывания транскобаламином-П кобаламина плазмы и взаимодействия этого комплекса с TcII-рецептором (TcII-рц) поверхностной мембраны клетки. Таким образом, кобаламин плазмы, а также Тс II плазмы крови и его специфический рецептор на поверхностной мембране клетки составляют основные биохимические пока-

затели системы транспорта кобаламинов кровью. Известно, что концентрация кобадаминов в плазме при OJUI часто снижена Сниженное содержание кобаламинов в кроветворных клетках детей с ОЛЛ может быть обусловлено недостаточностью синтеза TcII-рц поверхностной мембраны лейкозных клеток шш изменением функциональной активности транспортного белка плазмы крови СШсшэва ЕЕ и соавт., 1987]. Предыдущими исследованиями, действительно, выявлена неоднозначность экспрессии TcII-рц поверхностной мембраны лейкозных клеток у детей с ОЛЛ [Мясищева ЕЕ ,1990; Орешин А.Е. 1990; Мясищева ЕЕ и соав., 1993]. Однако, данные по Tell плазмы крови детей с ОЛ, до проведения настоящего исследования в литературе отсутствовали. Вместе с тем, даже при нормальном уровне кобаламинов плазмы в условиях недостаточности Тс II в кроветворные клетки не поступает необходимого количества кобаламинов для нормальной жизнедеятельности. Нарушения в системе кроветворения вызывают сопряженные изменения иммунологического статуса и влияют на эффективность терапии. Поэтому для выяснения причин сниженного поступления кобаламинов в цитоплазму необходимы были исследования функциональной активности Тс II плазмы крови у детей с ОЛЛ.

Цель и задачи исследования Цель работы:

Изучение функциональной активности белка плазмы крови -транскобаламина II у детей с ОЛ, важного биохимического показателя системы транспорта кобаламинов кровью. Задача исследования;

I. Модифицировать биохимический метод количественного анализа Тс II плазмы крови для исследования у детей с ОЛ.

II. Количественная оценка транспортного белка-ТсII плазмы крови детей при нормальном состоянии кроветворения и с 0JL

III.Сравнительный анализ функциональной активности Tell, содержания кобаламинов плазмы и числа TcII-рц поверхностной мембраны лейкозных клеток у детей с ОЛЛ

IV. Оценка эффективности системы транспорта кобаламинов кровью у детей с ОЛЛ.

Научная новизна работы

Впервые у детей с ОЛ и в группе детей относительного контроля методом электрофореза с использованием радиоактивного циа-

нокобаламина исследовано содержание бедка плазмы крови - тран-кобаламина-11, ответственного за поступление в кроветворные клетки предшественников кобаламиновых коферментов, необходимых для нормального гемо- и лимфопозза.

Для идентификации транскобаламина II среди кобаламинсвязы-ваюшда белков плазмы крови впервые был применен метод его избирательной сорбции с использованием суспензии мембран зрелой плаценты человека, рецепторы ворсин которой имеют специфичность и высокое сродство связывания Тс II плазмы.

Установлено, что Тс II плазмы является важным внеклеточным фактором регуляции экспрессии его специфических рецепторов на поверхностной мембране лейкозных клеток у детей с OJL

Впервые на основе оценки эффективности системы транспорта кобаламинов в клетки крови у детей с ОЛЛ показана необходимость индивидуального подхода для выявления звена повреждения и выбора схемы метаболической коррекции нарушенного обмена кобаламинов в организме ребенка с помощью витамина В12 или кобаламиновых коферментов.

Научно-практическое значение работы

Адаптированный к клиническим исследованиям комплексный метод количественной оценки Тс II может быть применен при различных заболеваниях, включая заболевания кроветворной системы, а также для изучения синтеза и секреции Tell in vitro в клетках разного гистогенеза.

Получена количественная оценка белка плазмы крови - Тс II у детей с OJL Нормальное содержание Toll в плазме крови детей (относительный контроль) находит'.ся в пределах 640 - 1100 пМ. При OJLfy детей выявлена нормальная (770-1100 пМ), сниженная (330-600 пМ) и повышенная (1200-1650 пМ) концентрация.

Количественная оценка Тс 11 плазмы у детей с ОЛ восполнила недостающее звено в оценке эффективности системы транспорта кобаламинов в кроветворные клетки. Полученные данные обосновывают необходимость метаболической коррекции при нарушениях обмена кобаламинов у детей с 0JL Это перспективно для улучшения иммунологического статуса детей и повышения эффективности лечения, учитывая необходимость кобаламиновых коферментов для пролиферации и созревания кроветворных клеток.

- б -

Публикации и апробация работы

Основные материалы диссертации изложены и обсуждены в 6 печатных работах. Диссертация апробирована и рекомендована к еащите на совместной научной конференции лабораторий эндогенных модифицирующих факторов канцерогенеза, биохимии опухолей, иммунологии онкогенных вирусов НИИ канцерогенеза, группы метаболической коррекции НИИ детской онкологии и гематологии ОВД РАМН 19 июня 1997г.

Структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 104 страницах машинописного текста, включая схему, 13 рисунков и 8 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (1 глава), результатов собственных исследований (5 глав), заключения, выводов и списка цитируемой литературы (146 источников, из них 34 работы отечественных и 112 зарубежных авторов).

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

Диализ Tell плазмы крови

Тс II плазмы был исследован методом электрофореза кобала-минсвязываюших белков в полиакриламидном геле (ПААГ), с использованием радиоактивного цианокобаламина 57CCo]CNCbl фирма (Amersham) [Allen R. Н. , 1975; Quadros E.V. at al, 1986). Учитывая небольшое содержание Tell в плазме крови человека, предварительная отработка метода определения транспортного белка была проведена с использованием сыворотки крови кролика, наиболее богатой ТсII. Анализ концевой последовательности аминокислот в молекуле Тс 11 человека и кролика выявил их значительную гомологию, что свидетельствовало о существенном сходстве транспортного белка крови человека и кролика [Quadros E.V. et а1,198б]. Кровь для исследований получали из краевой вены уха кроликов питомника ОВД РАМН, выдерживали при температуре 37°С 1 час и центрифугировали при 500 g. Полученную сыворотку хранили при температуре -15°С до использования.

Для исследования микроколичества этого белка в малом объеме плазмы крови у детей с 0JI необходимо было адаптировать известный метод сГпрёделедая-ТсГ^ плазмы, по которому частично очищенный белок разделяли с помощью электрофореза в ПААГ. В связи с

этим, мы модифицировали отдельные этапы метода по обработке плазмы. Это позволило значительно уменьшить объем крови детей (1-2 мл), необходимый для анализа Toll. Использование дополнительных деталей в обработке плазмы крови позволило нам предложить комплексный метод определения Тс II для клинических исследований.

Данный метод включает ряд последовательных этапов:

1. Определение оптимальной концентрации радиоактивного циа-нокобаламина, необходимой для полного насыщения кобала-минсвязывающих белков сыворотки крови животных и плазмы крови человека;

2. Разделение кобаламинсвязываюших белков сыворотки и плазмы крови по электрофоретической подвижности;

3. Насыщение кобаламинсвязывающих белков плазмы крови гуани-дином - HCl для определения тотальной связывающей способности Тс II и кобалофилинов;

4. Идентификация Teil в группе кобаламинсвязывающих белков сыворотки и плазмы крови;

5. Определение ненасыщенной связывающей способности ТсII плазмы крови у детей;

6. Количественная оценка транспортного белка плазмы крови. Плазма крови была получена от детей в возрасте от 3,5 мес

до 14 лет,госпитализированных в НИИ ДОГ ОНЦ РАМН и детскую клиническую больницу N1 им. С. Морозова г. Москвы. Иммунофенотип лей-козных клеток ОЛЛ был установлен ведущим научным сотрудником лаборатории клинической радиоиммунологии НИИ КО ОНЦ Е Е Тупицы-ным, зав. лаб. диагностической гематологии НИИ детской гематологии МЗ РФ, профессором Р. Е Ленской. До начала лечения кровь (2мл) брали в стерильные пробирки, содержащие гепарин (50 ед/мл), центрифугировали при 500 g и отбирали плазму в стерильных условиях.

Электрофорез в ПААГ позволяет отделить ТсII от группы кобалофилинов плазмы, определить их тотальный уровень и ненасыщенную связывающую способность Tell, которая является наиболее важной характеристикой его функциональной активности tFrater-Schroder М. et al,1979; Quadros E.V. et al, 1986]. 1. Определение оптимальной концентрации: Оптимальная концентрация (2,5x10"*^/л) радиоактивного цианокобаламина, необходимая для полного связывания с Тс II плазмы, была определена нами с использованием метода Скзтчарда. Полноту насыщения при этом контролировали методом электрофореза в ПААГ.

2. Разделение кобаяаминсвязыващих белков плазмы по электрофоре-ттеской подвижности: Кобадамнсвяаывахяще белки разделяют по их электрофоретической подвижности на o¿ и ß -глобулиновые фракции [Hall С. A. , Fincler А. Е. , 1963, 1965]. Tel и ТсШ (кобалофилины) концентрируются в зоне характерной для o¿ -глобулиновой фракции, а Тс II локализуется в области, соответствующей ß -глобулинам. Электрофорез (4,5 ч, напряжение на электродах 180 V) насыщенных 57С Со]CNCbl белков проводили в щелочной буферной системе (рН-8,4) с трис-глициновым буфером при концентрации гелей 7,5% разделяющего (рН-8,9) и 5X концентрирующего (рН-б,7). По окончании электрофореза просчитывали радиоактивность отрезков геля (2,5 мм) на гамма-счетчике (MAG-510, фирма "Berthold") и на основе полученных данных определяли величину Rf для сравнительного анализа злектрофореграмм. При повторном разделении кобала-минсвязывающих белков плазмы крови получали полную воспроизводимость злектрофореграмм.

3. Определение общей юбадаминсвяэыващей способности белков плазмы крови: Для определения тотальной кобаламинсвязывающей способности, плазму крови обрабатывали солянокислым гуанидином (гуанидин-HCl). В процессе обработки гуанидином-В31 белки Tel, Tell, TelII освобождаются от эндогенных кобаламинов плазмы в результате диссоциации кобаламин-белкового комплекса Насыщение сыворотки и плазмы крови гуанидином-HCl (7.5М) проводили при комнатной температуре в соотношении (1:15) в течении 72 ч, с ваменой гуанидина-HCl каждые 24 ч. При насыщении плавмы крови 7,5 М гуанидином-HCl по методу [Allen R. Н. et al, 1972] в образце образовывался белковый коллоидный сгусток. При этом дальнейшая работа с образцом была затруднена. Во избежании образования сгустка перед помещением образца в раствор гуанидина, в пробу предварительно вносили 50 мкл 7,5 М гуанидина на 100 мкл плазмы (V:v/l:2). Для более полного насыщения кобаламинсвязыва-ющих белков 57[Со]CNCbl радиоактивность в образец вносили до диализа. С целью удаления эндогенных кобаламинов и гуанидина-HCl образец диализировали при температуре 5°С в течении 24 ч против 0,05 М калий-фосфатного буфера (КФБ). После насыщения гуанидином в течении 3-х суток объем образца несколько увеличивался. Поэтому для уменьшения объема пробы, необходимого для оптимального проведения электрофореза, в КФБ при диализе добавляли сахарозу (конечная концентрация IM). Перед нанесением пробы на ПААГ кобаламинсвязывающие белки повторно насыщали 57( Со] CNCbl. При таком режиме обработки плазмы крови гуаниди-

ном-HCl и радиоактивным цианокобаламином достиглось наиболее полное удаление эндогенных кобаламинов и насыщение кобаламинс-вязываюшда белков радиоактивностью > 98%.

4. Идентификация Tell в группе кобаламинсвязывающих белков плазмы крови: В общем спектре кобаламинсвязывающих белков плазмы крови ТсII идентифицируют, используя фермент нейраминидазу. Кобалофилины, в отличие от Tell, - сиалогдикопротеиды. Удаление сиаловых кислот с частичной потерей заряда снижает электрофоре-тическую подвижность кобалофилинов' iFrateг-Schroder M. ôt al, 1979]. Для освобождения сыворотки крови кролика от кобалофилинов (Tel и TelII) образцы предварительно обрабатывали нейрами-нидазой (отечественного производства,НИИ эпидемиологии и микробиологии, г. Нижний Новгород) нехолерных вибрионов активностью 0,002 ед/мл образца в течение 60 мин, при температуре 37°С. В результате воздействия нейраминидазы части молекулы сиаловых кислот отделяются по месту положения связей (2-3) и (2-8), которые являются ферментолабильными. Воздействие нейраминидазы изменяет структуру и обший поверхностный заряд молекул, что и проявляется при электрофоретическом разделении белков.

В дополнение к основному методу определения ТсII плазмы, мы впервые применили метод избирательной сорбции ТсII для его идентификации с использованием зрелой плаценты человека Плазму крови детей и зрелую плаценту человека до проведения анализа хранили при температуре -15°С. Суспензию мембран готовили перетиранием ворсистой ткани плаценты в охлажденной среде Игла при 5°С. Гомогенат освобождали от неразрушенных кусочков ткани центрифугированием на холоду 15 мин при 2300 g с последуюгцей 3-х кратной отмывкой средой Игла (5мл) при тех же условиях. Плазму крови (100 мкл), насыщенную 57 (CoICNCbl, инкубировали 16 мин при 37°С с суспензией мембран плаценты, плотность которой определяли с помощью ФЭК (У=300мкл). Присутствие специфических TcII-рецепторов на ворсинках плаценты определяло активность избирательной сорбции комплекса TcII+57[Co]CNCbl исследуемого образца плазмы. После инкубации исследуемого образца добавляли охлажденную среду Игла и центрифугировали для получения супернатанта, освобожденного от Tell. Затем методом электрофореза разделяли белки исходной плазмы и плазмы, не содержащей Тс II в результате обработки суспензией мембран плаценты, и на основе полученных электрофореграмм идентифицировали Тс II среди всех кобаламинсвязывающих белков плазмы крови.

5. Количественная оценка ТсII плазмы: Количественная оценка Тс II

в плазме крови детей была определена по величине суммарной радиоактивности изоформ белка на злектрофореграмме с учетом удельной радиоактивности препарата 57[Со]CNCbl и известного факта о связывании одной молекулой Тс II одной молекулы кобала-мина [Quadros Е. V. ,1986].

Статистическая обработка полученных данных: Результаты исследования обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента, для определения коэффициента корреляции между концентрацией Тс II плазмы крови и числом Тс11-рц на поверхностной мембране клеток крови применяли программу компьютерного анализа Turbo Pascal v. 7.0 (Borland International, USA).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Идентификация и количественная оценка Тс II в плазма крови детей

с острым лейкозом

Модифицированный комплексный метод был использован нами для изучения TelI у детей с острым лейкозом. Анализ Tell плазмы крови был проведен до начала лечения у 74 детей (49 - с острым .лейкозом, 25-е различными заболеваниями) в возрасте от 3,5 мес до 14 лет, госпитализированных в НИИ ДОГ ОНЦ РАЫН и детскую клиническую больницу N 1 им. С. Морозова г. Москвы.

Идентификация Тс И в _группе кобаламинсвявывакодх белков плазмы крови проведена с использованием фермента нейраминидазы. В результате изменения электрофоретической подвижности при этом воздействии кобалофилины (Tel и TelII), содержаще сиаловые кислоты, в условиях нашего разделения задерживались в эоне концентрирующего геля, а исследуемый ТсII оставался на прежнем месте (рис.1).

Нами впервые был применен метод избирательной сорбции Tell с помощью зрелой плаценты человека, рецепторы ворсин которой имеют специфичность и высокое сродство связывания 7сII плазмы. Взаимодействие суспензии мембран зрелой плаценты человека с ТсII освобождает плазму крови, насыщенную радиоактивным циано-кобаламином от связанного белкового комплекса (рис. 2). Метод избирательной сорбции Тс II с помощью суспензии мембран зрелой плаценты человека может быть использован и для идентификации этого белка, и для его количественного анализа Таким образом, идентификация транспортного белка в группе кобаламинсвязываадих

Рис.1. Идентификация Тс II в группе ксбаламинсвязываюцих белков сыворотки крови кролика

а) электрофореграмма сыворотки крови кролика пик 1 - кобалофилины (суммарно TcI+TcIII) пики 2 и 3 - Тс II

б) сыворотка кролика,обработанная нейраминидазой и гуанидином-НС1 пик - 1 отсутствует

пики- 2 и 3 на прежнем месте, увеличение в 2,5 раза кооаламинсвяэывьиощей способности ТсII

Рис.2. Идентификация ТсII в группе кобаламинсвязыващих белков с применением суспензии мембран зрелой плаценты человека

а) электрофореграмма плазмы крови ребенка (Ян-ч К, 4 лет, диагноз: пре-пре-В-ОЛЛ)

пик 1 - кобалофилины пик 2 - Tell

б) плазма крови того же ребенка после обработки суспензией мембран зрелой плаценты человека

пик 1 - без изменений

пик 2 - Тс II значительно снижен

белков плазмы крови может быть проведена двумя независимыми друг от друга методами, что повышает чувствительность качественного анализа при небольшом содержании Тс II в плазме крови человека. Следует подчеркнуть возможность использования данного метода также для определения содержания транспортного белка в плазме крови детей с различными заболеваниями.

Цри злектрофоретическом разделении белков плазмы крови детей в ПААГ в наших исследованиях кобалофилины располагались в области, характерной для «¿-глобулинов, a Tell, обладая меньшей подвижностью, локализовался в зоне Ji -глобулинов. При этом транспортный белок плазмы выявлялся как одним пиком, так и несколькими его изоформами, что коррелирует с данными литературы [Daoger S.P. et al, 1978, Frater-Schroder M. et al. 1979, Frater-Schroder M., J983J (рис.3 а,б,с ).

В связи с отсутствием данных о нормальном уровне ТсII в плазме крови у детей, мы исследовали содержание транспортного белка у практически здоровых детей и с заболеваниями крови без нарушения костномозгового кроветворения (п-25). При анализе полученных данных обнаружено, что у детей с нормальным состоянием кроветворения концентрация Тс II в плазме крови находилась в пределах 640 1ООО пМ, поэтому в качестве нормального ТсII плазмы была принята концентрация белка 855+43 пМ.

Ненасыщенная кобалашнсназывающая способность ТсII была исследована нами в плазме крови 49 детей с ОЛ. Результаты исследования выявили существенные различия в функциональной активности транспортного белка у обследованных детей (рис. 4).

Суммируя полученные данные о содержании ТсII плазмы крови детей в группе относительного контроля (п-25) и у детей с ОЛ (п-49), мы оонаружили, что в основной группе детей с ОЛЛ (п-39) были наибольшие различия в концентрации Тс 11 (рис. 5). Согласно данным проиедс-нного анализа, только у 35,9% обследованных детей выявлена нормальная концентрания Тс II в плазме крови. У остальных детей мы наблюдали как сниженную, так и повышенную концентрацию. Демонстративный пример отсутствия Тс II в плазме крови отражен на злектрофореграмме (рис. 3 с). У этого ребенка при тотальной бластной метаплазии костного мозга наблюдалась значительная анемия, лейко-тромбоцитопения, по-видимому, обусловленные недостаточным поступлением кобаламинов в кроветворные клетки из-за отсутствия Tell плазмы крови.

"(Co]CNCbl 10 вш/ыш

Rf

Рис. 3. Различная подвижность кобаламинсвязывающих белков плазмы крови у детей с ОМ

а) электрофореграмма в ПААГ ТсII и кобаиофилинов плазмы крови (Со-в С, 13 лет, диагноз: пре-пре-В-ОЛЛ)

пик 1 - кобалофилины, Rf-0,73 пик 2 - Tell, Rf-0,5

б) изоформы Tell плазмы крови ребенка (Аб-ва Г, 9 лет, диагоэ: пре-пре-В-ОЛЛ)

пик 1 - кобалофилины, Rf-0,73 пики 2 и 3 - ТсII, Rf-0,4;0,46 с) плазма крови ребенка (Ка-в Т, 4 лет, диагноз: пре-пре-В-ОЛЛ)

пик 1 - кобалофилины, Rf-0,73 отсутствие характерного пика -ТсII

Tell nU 2500 -

2000

1500

1000

600

0 0

ООО

й-

* ♦ XI

_KX.

0*0

* •• о

[ I I I I I a I I.

0-4

i i Л i.

■ ' I I I ■ I I I 1 ■ 1 I I 1 I I I I I I . . I . . I

5-8

g _i4 лет

Рис. 4. Концентрация Тс 11 в плазме крови детей при остром лейкозе ось абсцисс: количество обследованных детей разного

возраста (3,5 мес-14 лет) ось ординат: концентрация ТсII (пМ) в плазме крови детей Обозначения:

О - острый лимфобластный лейкоз п-39

Д- острый миелобластный лейкоз п-5

z - острый лейкоз смешанного фенотипа п-5 х - относительный контроль п-17

н - пределы нормы

Рис.5. Концентрация ТсII в плазме крови детей с ОЛЛ (п-39)

1 - нормальная концентрация (916+34 пЮ; п-35,9Х

2 - сниженная (450+31 п10; п-30,82 р<0,001

3 - повышенная (1418+68 пЮ; П-30.8Х

Сравнительный анализ активности Tell крови, содержания кобаламинов плазж и числа Tel I-рецепторов поверхностной мембраны лейкозиш клеток у детей с остры* лимфобластньы лейкозом

Учитывая неоднозначность экспрессии Тс II рецепторов на поверхностной мембране бластных клеток крови и костного мозга у детей с ОЛЛ, мы сопоставили функциональную активность Тс II плазмы с числом ТсП-рц. Взаимосвязь содержания Tell плазмы и экспрессией TcII-рц была определена, с помощью коэффициента корреляции (г), который характеризует меру линейной зависимости между исследуемыми величинами. Коэффициент корреляции (г--0,53) выявленный у 24 детей с ОЛ, свидетельствовал об обратной зависимости анализируемых величин. Обратная корреляционная зависимость между содержанием транспортного белка плазмы и числом TcII-рц поверхностной мембраны клеток крови была более значительна у детей с ОЛЛ (г=-0,70; р<0,01) (рис.6). Ери этом у большинства обследованных детей был диагностирован пре-пре-В (п=12) и у 4-х больных Т или пре-Т иммунологические варианты ОЛЛ. Основываясь на этих данных, можно полагать, что ТсII плазмы крови является важным внеклеточным фактором регуляции экспрессии его специфических рецепторов на поверхностной мембране лейкозных клеток.

Функциональная активность ТсII была также проанализировна у 25 детей с ОЛЛ, преимущественно пре-пре-В вариантом, с различным содержанием кобаламинов в плазме крови. Нашими исследованиями обнаружено, что у детей с ОЛЛ со сниженым содержанием кобаламинов плазмы, концентрация транспортного белка была неоднозначна. Нормальная концентрация Тс II (770-1090 пМ) в плазме крови наблюдалась только у 9 детей с пре-пре-В-ОЛЛ. Однако, у 13 детей (с пре-пре-В, Т-клеточным и смешанным фенотипом ОЛЛ) почти в равном соотношениии была выявлена, как сниженная (330-600 пМ), так и повышенная (1190-1640 пМ) концентрация транспортного белка плазмы. Вместе с тем у 3-х детей с высоким содержанием кобаламинов в плазме крови функциональная активность ТсII была снижена (0-615 пМ) (рис.7).

Оценка эффективности системы транспорта кобаламинов кровью у детей с острым лимфобластньм лейкозом

Количественный анализ Тс II в плазме крови детей с ОЛЛ проведенный нами, восполнил недостающее звено для исследования системы транспорта кобаламинов в кроветворные клетки. Возможность системного подхода в оценке эффективности транспорта ко-

TcII-рц число/кл

Рис.6. Корреляционная зависимость ТсII плазмы и числа его специфических рецепторов поверхностной мембраны клеток крови у детей с ОЛЛ (п=16) ось абсцисс: содержание Тс II в плазме крови

ось ординат: число TcII-рц на поверхностной мембране клеток крови

коэффициент корреляции г— 0,705 ; р<0,01 уравнение прямой имеет вид: YC i3 —0,41 х Mi] + 644,25

Рис. 7. Функциональная активность Tell в плазме крови при различном содержании кобаламинов плазмы у детей с ОЛл

Обозначения: I - концентрация Тс II (пМ)

II- содержание кобаламинов (СЫ) (пг/мл)

баламинов при остром лейкозе детей получена нами благодаря применению комплексного метода определения ненасыщенной кобала-минсвязывающей способности Тс II - основной характеристики функциональной активности транспортного белка плазмы крови. В результате проведеных исследований выявлена широкая вариабельность всех 3-х показателей системы транспорта, каждый.из которых может существенно влиять на поступление кобаламинов в лей-козные клетки. Очевидна поэтому необходимость индивидуального подхода при оценке транспорта кобаламинов в кроветворные клетки у детей с ОЛЛ. Для этого важно сопоставление всех 3-х биохимических параметров системы транспорта кровью кобаламинов индивидуально у детей с OJDL При этом могут быть выявлены разного рода изменения активности этих показателей, которые составляют реальный механизм сниженого поступления кобаламинов в клетки и вследствие этого нарушение нормального кроветворения. В качества примера могут быть рассмотрены полученные нами данные:

Функционально неактивный Тс II при высоком содержании кобаламинов в плазме крови и небольшом количестве TcII-рц на поверхностной мембране клеток крови .(Ка-в Т, 4 лет, диагноз:

пре-пре-В-ОЛЛ). Сниженные показатели кроветворения у этого ре-

1 ? Q

бенка (эритроциты 2x10 /л, НЬ-58 г/л, лейкоциты 0,5x10 /л,

тробоциты 20х109/л) могли быть вызваны недостаточным поступлением в кроветворные клетки кобаламинов, необходимых для нормального гемопоэза, вследствие нарушенного взаимодействия трас-портного белка с TcII-рц поверхностной мембраны лейкозных клеток. Высокое содержание кобаламинов в плазме при небольшом числе TcII-рц поверхностной мембраны лимфобластов в атом случае косвенно подтвержают нарушение транспортной функции Tell, который в физиологических условиях регулирует экспрессию TcII-рц поверхностной мембраны клетки.

Другим примером является сниженное содержание всех биохимических показателей системы транспорта кобаламинов в кроветворные клетки (Ро-н Д, 11 л, диагноз: Т+В-ОЛЛ). У этого ребенка при тотальной бластной метаплазии костного мозга и лейкоцитозе ( 19,39/л) наблюдалась анемия и тромбоцитопения (эритроциты 2,5х1012/л, тромбоциты 32,5х109/л), что указывало на глубокое поражение нормального кроветворения. Очевидно, изменение нормального кроветворения могло быть обусловлено сниженным содержанием транспортного белка, дефицитом кобаламинов в плазме и, как следствие, недостаточным поступлением кобаламинов в кроветвор-

ные клетки.

Иные соотношения в изменении активности биохимических показателей транспорта наблюдались у ребенка Ме-й М, 3,5 лет с диагнозом: npe-npe-B-OJUI), а именно, сниженное содержание транспортного бедка при повышенном уровне кобаламинов в плазме крови и высокой экспрессии TcII-рц поверхностной мембраны лим-фобластов. Сниженное содержание ТсII и его функциональной активности является в данном случае ведущим звеном повреждения нормального поступления в кроветворные клетки кобаламинов, несмотря на их высокую концентрацию в плазме, В этих условиях недостаточность внутриклеточного уровня кобаламинов отражает высокая экспрессия TcII-рц поверхностной мембраны кроветворных клеток. Это подтверждают экспериментальные данные oí увеличении экспрессии TcII-рц поверхностной мембраны при снижении уровня кобаламинов в лейкозных клетках. Известно, что синтез и экспрессия Tcll-рц поверхностной мембраны клеток лейкозных линий человека m vitro подчиняется up and down регуляции и сигналом к увеличению TcII-рц поверхностной мембраны служит сниженное содержание кобаламинов в лейкозных клетках [ Орешкин А. Е., Мя-сищева ЕЕ, 1989; Jacobsen D.W. et al, 1990]. Можно полагать поэтому, что у детей со сниженным уровнем кобаламинов в клетках крови в результате недостаточной функциональной активности Тс II плазмы, наблюдается высокая экспрессия TcII-рц поверхностной мембраны лейкозных клеток, благодаря аналогичному механизму регуляции. Высокие показатели содержания ТсII плазмы и TcII-рц поверхностной мембраны клеток крови при резко сниженном количестве кобаламинов плазмы крови были выявлены у ребенка Со-лэ Н, 14 лет, с диагнозом: пре-пре-В-ОЛЛ. В условиях снижения вне-и внутриклеточного уровня кобаламинов лейкозные клетки, способные к синтезу TcII-рц, зкспрессируют повышенное число рецепторов на мембране, подобно тому, как это выявлено при лейкозе мышей LI 210 [Орешкин А. Е. , Мясищева ЕЕ , 1990; Орешкин А. Е. и соав. , 1992]. В этом, вероятно, состоит компенсаторный механизм восполнения необходимого пула кобаламинов в пролиферирующих клетках. Изменения определенных звеньев этой системы у детей с ОЛЛ свидетельствуют о разных причинах, обуславливавших неэффективный транспорт кобаламинов в кроветворные клетки. Индивидуальная оценка этих биохимических показателей у детей с ОЛЛ представляет системный подход в исследовании нарушенного обмена кобаламинов в организме. Определение в каждом индивидуальном случае звена повреждения транспорта кобаламинов в клетки крови сущэст-

венно для выбора схемы метаболической коррекции обмена с использованием кобаламиновых коферментов. Последнее особенно важно в связи с тем, что дефектность Тс II или его рецепторов на поверхностной мембране лейкозных клеток у детей с ОЛЛ предполагает введение значительно большего количества цианокобаламина (витамина В12), чем это необходимо при выявлении сниженного содержания кобаламинов в плазме крови СМясищева ЕЕ и соавт. , 1987; Мясищева ЕЕ, 1991, 1993; Hitzig W. et al.1979; Herbert V. et al, 1989]. Это может быть достигнуто с помощью фармакологических количеств оксикобаламина или аденозилкобаяамина (кобами-да) отечественного производства для насыщения кроветворных, клеток путем диффузии.

Таким образом, результаты проведенных исследований определяют целесообразность одновременной оценки всех звеньев системы транспорта кобаламинов кровью для своевременной метаболической коррекции нарушенного обмена кобаламинов в организме ребенка. Это перспективно для улучшения их иммунологического статуса и повышения эффективности лечения, учитывая необходимость кобаламиновых коферментов для пролиферации и созревания кроветворных клеток.

ВЫВОДЫ

1. Транскобаламин II - белок плазмы крови человека, ответственный за транспорт в кроветворные клетки кобаламинов, необходимых для нормального гемо- и лимфопоэза, исследован у детей с ОЛ.

2. Идентификация Тс II в группе кобаламинсвязывающих белков плазмы крови впервые осуществлена методом избирательной сорбции с использованием зрелой плаценты человека Количественная оценка Тс II плазмы крови детей проведена модифицированным методом электрофореза в ПААГ с применением радиоактивного цианокобаламина.

3. Адаптированный для клинических исследований комплексный метод анализа Тс II может быть применен при различных заболеваниях кроветворной системы. При ОЛЛ у детей выявлены сушэст-венные различия ненасыщенной кобаламинсвязывающей способности Тс II плазмы крови - основной характеристики его функциональной активности.

4. Снижение концентрации кобаламинов и изменение активности ТсII в плазме крови или экспрессии TelI-рецепторов мембраны лимфобластов у детей с ОЛЛ составляют главные причины неэф-

- 20 -

фективного транспорта кобаламинов в кроветворные клетки.

5. Эффективность системы транспорта кобаламинов в клетки крови может Сыть определена путем индивидуальной оценки содержания Tell и кобаламинов плазмы крови, а также числа Tel I-рецепторов поверхностной мембраны клеток крови у детей с острым лимфобластным лейкозом.

6. Выявление звена повреждения на уровне Тс II или его рецепторов на поверхностной мембране клеток является основанием для выбора схемы метаболической коррекции нарушенного обмена кобаламинов в организме ребенка с использованием кобаламиновых коферментов.

Список научкьк работ по теш диссертации

1. Орешкин А. Е. , Гудкова ЕЕ , Мясищева ER Экспрессия рецепторов транскобаламина-II плазмолеммы лимфоцитов крови, стимулированных митогенами. Бюл. эксперим. онкол., 1992, т. 114, N 8, с. 185-187.

2. Мясищева Н. В , Орешкин А. Е. , Гудкова М. Е , Балакирев С. А. Различная экспрессия ТсII-рецепторов поверхностной мембраны кроветворных клеток у детей с острым лимфобластным лейкозом. Гематол. и трансфуз. , 1993, N.1, с. 36-38.

3. Мясищева а R , Ленская Р. В. , Орешкин А. Е. , Гудкова Ы. Е , Ту-пицын Е Е Фунциональная активность транскобаламина 11 плазмы крови и экспрессия его специфических рецепторов на поверхностной мембране кроветворных клеток у детей с острым лейкозом. Материалы Российской Конференции "От науки к практике" под патронажем Европейского Общества по детской гематологии и иммунологии. Санкт-Петербург. 1995, с. 108-109.

4. Гудкова М. В., Орешкин А. Е., Мясищева Е Е , Ленская Р. Е , Курдюков В. Б. Содержание транскобаламина 11 в плазме крови детей с острым лейкозом. Гематол. и трансфузиол. 1996, N 2, с. 10-13.

5. Myasishcheva N. V., Lenskaya R. V. , Orsshkin A. E., Typ its in N.N. , Gudkova M.V. , Linnell J.C. Expression of two types of surface membrane Cobalamin Coenzymes precursor receptor by blast cells in children with acute leukaemia Exp. Oncol. 1996, v. 18, N3, p. 255-261.

6. Гудкова M. E , Мясищева E R , Орешкин A. E., Ленская P. E Функциональная оценка системы транспорта предшественников кобаламиновых коферментов в кроветворные клетки детей с острым лимфобластным лейкозом. Эксперим. Онкология. 1997, май (принята в печать).