Автореферат и диссертация по медицине (14.00.30) на тему:Природная очаговость, эпидемиология, лабораторная диагностика туляремии в Краснодарском крае

АНТОНОВ Андрей Васильевич

ПРИРОДНАЯ ОЧАГОВОСТЬ, ЭПИДЕМИОЛОГИЯ, ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ТУЛЯРЕМИИ В КРАСНОДАРСКОМ КРАЕ

14.00.30 - эпидемиология 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ставрополь - 2005

Работа выполнена в Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор,

Ефременко Виталий Иванович

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Брюханов Александр Фирсович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Швиденко Инна Григорьевна

доктор медицинских наук Короткое Владимир Борисович

Ведущая организация:

Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится.

«~/01> -¿Ю*р 2005 г. в ^

на заседании диссертационного совета Д.208.078.01 по присуждению ученой степени доктора (кандидата) наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского научно-исследовательского противочумного института « Микроб»

Автореферат разослан

М ¿Щ&чРгШт.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, старший научный сотрудник

А А. Слудский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Туляремия в недавнем прошлом являлась одним из самых распространенных природно-очаговых заболеваний на территории России, что определяло внимание исследователей к этой опасной инфекции. Однако и в настоящее время заболевания туляремией в Российской Федерации регистрируются ежегодно, а в отдельные годы проявления инфекции принимают характер эпидемических вспышек вследствие активизации её природных очагов [Ефременко В.И., Грижебовский Г.М., 1997; Мещерякова И.С., 2003]. В последние годы заболеваемость туляремией носила в основном спорадический характер, за исключением вспышки в августе-сентябре 1999 г. в Кизлярском и Тарумовском районах Республики Дагестан, когда заболели 64 человека [Онищенко Г.Г., 2001; Тихенко Н.И. ссоавт. 2001].

Природные очаги туляремии на Северном Кавказе по своим ландшафтно-географическим и другим особенностям характеризуются широким разнообразием, и границы их до настоящего времени могут быть очерчены лишь ориентировочно. Особенности ландшафтно-географических условий обусловливают существование различных биоценозов, обеспечивающих циркуляцию возбудителя туляремии в природе и формирование нескольких типов природных очагов этой инфекции.

Т.В. Устин-Петрова [1963] выделила на территории Краснодарского края два ландшафтных типа природных очагов: равнинно-степной и предгорно-ручьевой. При этом к равнинно-степному типу были отнесены два территориально разобщенных очага, а именно: Западный (Приазовский) и Восточный (Прикубанский). В дальнейшем И.А. Калашников [1991], В.М. Костюковский [2001] и другие в своих работах также придерживались этой типологической классификации.

В настоящее время обширная территория (80-90%) Краснодарского края, ранее считавшаяся энзоотичной по туляремии, распахана под посевы сельскохозяйственных культур и заселена одними и теми же видами мелких млекопитающих и кровососущих насекомых. Результаты преобразующей деятельности человека привели не только к изменению биоце-нотической структуры очагов на территории Краснодарского края, но и к снижению их эпизоотического и эпидемического потенциала. Однако природные очаги туляремии продолжают активно функционировать и представляют постоянную эпидемическую опасность.

В связи с этим, первостепенное значение приобретают вопросы разработки научно-обоснованной тактики эпизоотологического надзора и совершенствование лабораторных методов исследования полевого материала на туляремию. Особую роль приобретают методы молекулярно-генетического анализа, результаты которого могут быть использованы в целях дифференциации циркулирующих на разных территориях штаммов туляремийного

микроба. Представляется необходимым дальнейшее изучение влияния антропогенного воздействия на пространственно-биоценотическую и функциональную структуру природных очагов туляремии в Краснодарском крае с целью получения объективной информации об их современном состоянии и планирования профилактических мероприятий.

Цель и задачи исследования

Цель работы - изучение особенностей ландшафтно-географической и биоценотиче-ской структуры природных очагов туляремии на территории Краснодарского края, их эпизоотической и эпидемической активности.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

изучить характер изменений пространственной и биоценотической структуры природных очагов туляремии на территории Краснодарского края в зависимости от антропогенного воздействия в период с 1971г. по 2004 г.;

охарактеризовать динамику эпизоотического процесса в разных частях нозоареа-ла туляремии в последние десятилетия;

изучить пространственно-временные особенности заболеваемости людей туляремией в Краснодарском крае;

- осуществить эпидемиологическое районирование территории Краснодарского края по степени риска заражения туляремией;

провести генетическое типирование штаммов туляремийного микроба; усовершенствовать методы лабораторного исследования полевого материала на туляремию.

Научная новизна работы

Получены новые данные о ландшафтно-географической и биоценотической структуре природных очагов туляремии в Краснодарском крае. Установлено, что природный очаг туляремии степного типа располагается в двух ландшафтно-географических районах -равнинно-степном и предгорном. По биоценотическим признакам он является полигосталь-ным и поливекторным. Роль основных носителей выполняют обыкновенная полевка, домовая и лесная мыши. Из переносчиков наиболее распространенными видами являются /. петт и Б. таг^паШ, обитающие во всех ландшафтах.

Впервые установлено, что Западный Приазовский и Восточный Прикубанский природные очаги туляремии степного типа на территории Краснодарского края стали в настоящее время относительно автономными друг от друга.

Интенсивное антропогенное воздействие на очаг туляремии степного типа в течение последних 30 лет привело к снижению его эпизоотической активности. Эпизоотические и

эпидемические проявления в очаге с 1971 г. по 2004 г. были зарегистрированы на территории десяти районов в юго-восточной части Краснодарского края и трех районов на западе.

На основании анализа эпидемических и эпизоотических проявлений туляремии за последние 30 лет впервые проведено эпидемиологическое районирование территории Краснодарского края по степени риска заражения туляремией и выявлены наиболее опасные в эпидемиологическом отношении районы Административные территории края разделены на две группы: районы повышенного и низкого риска заражения людей туляремией.

Впервые проведено генетическое типирование методом МЬУЛ штаммов туляремий-ного микроба, выделенных в Краснодарском и Ставропольском краях на территории очага туляремии степного типа, и выявлено девять генотипических вариантов возбудителя.

Показано, что на территории природных очагов туляремии Краснодарского края среди основных носителей имеет место циркуляция возбудителей бактериальных природно-очаговых инфекций: лептоспироза, кишечного иерсиниоза, листериоза, а также сальмонел-лезов и эризипелоида.

Установлено, что разработанная нами в соавторстве с М.П. Маевским селективная питательная среда может быть применена при эпизоотологическом обследовании территории для выделения чистой культуры туляремийного микроба и позволяет культивировать единичные микробные клетки Francisella tularensis.

Показана эффективность применения твердофазных иммунных сорбентов при исследовании воды природных водоемов на наличие возбудителя туляремии.

Научно-практическая значимость результатов исследования

Полученные в результате проведенных исследований данные позволили оценить характер и последствия антропогенного воздействия на природные комплексы в Краснодарском крае, обусловившие изменение интенсивности эпизоотического процесса в природных очагах туляремии, что явилось основанием для оптимизации проведения эпизоотологиче-ского надзора по туляремии, осуществления эпидемиологического мониторинга и планирования профилактических мероприятий.

Предложена дифференциация территории Краснодарского края по степени риска заражения туляремией, выявлены административные районы, наиболее опасные в эпидемиологическом отношении.

Показана практическая ценность УОТЯ-анализа при изучении генетического полиморфизма F.tularensis для выявления особенностей биоценотической структуры природных очагов туляремии и эволюционных взаимоотношений штаммов возбудителя, циркулирующих на отдельных участках очаговости

Предложены методы подготовки проб воды с применением твердофазных иммуно-сорбентов при проведении бактериологического и ПЦР анализа воды открытых водоемов на туляремию.

Показана эффективность применения питательной среды Маевского при исследовании полевого материала на туляремию. Среда проста в приготовлении, не требует стерилизации автоклавированием и добавки дополнительных компонентов при исследовании полевого материала.

На основании полученных данных разработаны методические рекомендации «Применение угольно-иммунных сорбентов для выделения туляремийного микроба из воды», одобренные Ученым Советом, утвержденные директором Ставропольского научно-исследовательского противочумного института 30.01.03 г. (протокол № 1); методические рекомендации «Применение полимеразной цепной реакции и магнитных иммунных сорбентов для выявления туляремийного микроба в воде открытых водоемов», одобренные Ученым Советом, утвержденные директором Ставропольского научно-исследовательского противочумного института 26.06.03 г., (протокол № 6); составлен «Атлас природного очага туляремии на Северном Кавказе», одобренный Ученым Советом, утвержденный директором Ставропольского научно-исследовательского противочумного института 28.01.05 г., (протокол №1).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В результате антропогенного воздействия природный очаг туляремии степного типа в современных условиях является наиболее активным на территории Краснодарского края. Он располагается в двух ландшафтно-географических районах - равнинно-степном и предгорном.

2. Анализ территориальной приуроченности официально зарегистрированных случаев туляремии среди людей и эпизоотических проявлений инфекции позволяет выделить на территории Краснодарского края районы высокого и низкого риска заражения, а также не энзоотичную по туляремии территорию.

3. В природном очаге туляремии степного типа на территории Краснодарского и Ставропольского краев циркулирует девять генотипов туляремийного микроба.

4. Методы лабораторной диагностики с применением угольных и магнитных иммунных сорбентов обеспечивают преимущества (по времени и чувствительности) при детекции возбудителя туляремии в воде природных водоемов по сравнению с традиционными приёмами лабораторной техники.

5. Использование питательной среды Маевского эффективно при исследовании полевого материала на туляремию.

Апробация работы и публикации результатов исследования

Изложенные в работе материалы были представлены и обсуждены на научно - производственных Советах Новороссийской противочумной станции (1997 - 2002 г.г.), Региональном совещании по профилактике карантинных и особо опасных инфекций, рабочем совещании ЦГСЭН по вопросам санитарной охраны территории Кавказа (Ставрополь, 1998 г.), юбилейной научно - практической конференции «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы» (Ставрополь, 2002), Межгосударственной научно- практической конференции «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003). Основные материалы диссертационной работы изложены в 16 научных публикациях.

Структура и объём работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 172 работы отечественных и 11 зарубежных авторов. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 рисунками и 10 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

В работе использованы данные по эпидемиологическому надзору за туляремией, предоставленные ЦГСЭН в Краснодарском крае; материалы Причерноморской противочумной станции, полученные в результате личного участия автора в проведении профилактических и противоэпидемических мероприятий по туляремии на территории Краснодарского края; данные карт эпидемиологического расследования случаев заболевания туляремией; архивные материалы Ставропольского НИПЧИ. В работе были использованы общепринятые методы эпидемиологического анализа [Ковалёва Е.П. с соавт., 1985; Черкасский Б.Л., 1990].

Эпизоотологический мониторинг осуществляли в соответствии с Приказом Минздрава России № 125 от 14.04.99. Учет численности грызунов осуществляли по общепринятой методике [Петрищева П.А., Олсуфьев Н.Г., 1964]. При изучении изменений численности кровососущих фаз развития клещей во времени использовали общепринятые показатели [Петрищева П.А., Олсуфьев Н.Г., 1964].

Культивирование возбудителя туляремии проводили на общепринятых средах [Приказ Минздрава России № 125 от 14.04.99]. При организации исследований полевого материала на сопутствующие бактериальные инфекции использовали «Методическое руководство по лабораторной диагностике иерсиниозов» (Алма-Ата, 1992), «Методические реко-

мендации по лабораторной диагностике кишечных иерсиниозов» (Иркутск, 1979); «Методические указания по выявлению типичных и атипичных форм возбудителя чумы, возбудителей псевдотуберкулеза, кишечного иерсиниоза и сальмонелеза при исследование полевого материала из природных очагов чумы (Алма-Ата, 1987); Лабораторная диагностика листериоза животных и людей, меры борьбы и профилактики, (Москва, 1987).

Для серологических исследований полевого материала использовали: диагностикум туляремийный антигенный эритроцитарный жидкий (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, Москва), диагностикумы кишечно-иерсиниозные эритроцитарные антигенные сухие- 03; 09 (ФГУП НИИВС, Санкт -Петербург), диагностикум псевдотуберкулезный эритроцитарный антигенный сухой (ФГУП НИИВС Санкт -Петербург).

Для постановки ПЦР использовали «Тест-систему для выявления ДНК Francisella Ш-larensis методом ПЦР» производства РосНИПЧИ "Микроб", исследования выполняли в соответствии с инструкцией изготовителя. Генотипирование проводили, как описано ^ Faгlow е1а1. [2001].

Композиционные туляремийные магноммуносорбенты готовились по методу Жар-никовой И.В. с соавт. [1997].

Индивидуальный индекс разнообразия УЭТК. локуса (Э1) рассчитывался как 1-Цчастоты аллелей)2. Расчет генетических дистанций и кластерный анализ выполняли методом иРОМЛ с использованием пакета компьютерных программ РНУЫР ^екеш1ет .Т., 2002]. Вычисление коэффициента достоверности для разностных вариационных рядов (метод парных сравнений) выполняли как описано [Венчиков А.И., Венчиков ВА., 1974].

Результаты исследований и обсуждение

Краснодарский край имеет весьма сложные и разнообразные ландшафты от Прику-банской низменности до высокогорья западной части Кавказского хребта. На его территории выделяют шесть ландшафтно-географических районов: равнинно-степной, лиманно-плавневый, предгорный, горный, причерноморский и таманско-сопочный [Стриханова Е.В. с соавт., 1968].

Ландшафтно-биоценотическая структура природных очагов туляремии края впервые была определена Е.В. Стрихановой с соавт. [1961]. Авторы выделили три ландшафтных типа природных очагов туляремии: Приазово-степной, Азово-дельтово-плавневый и Предгор-но-ручьевой. Т.В. Устин-Петрова [1963] выделила на территории края два ландшафтных типа природных очагов: равнинно-степной и предгорно-ручьевой, при этом к равнинно-степному типу были отнесены два территориально разобщенных очага, а именно Западный (Приазовский) и Восточный (Прикубанский). В дальнейшем Н.Г. Калашников [1991], В.М.

Костюковский [2001] и другие исследователи в своих работах также придерживались этой типологической классификации.

МП. Тарасов [1991], основываясь на анализе антропогенного воздействия на ландшафты, пришел к заключению о существовании на Северном Кавказе единого Пред-кавказского равнинно-предгорного очага, включающего равнинные и предгорные районы Предкавказья от Терско-Сунженского междуречья на востоке до Азовского побережья на западе. По принципу пространственной изоляции автор разделил Предкавказский равнинно-предгорный очаг на четыре района очаговости: Центрально-Предкавказский, Терско-Сунженский, Западно-Предкавказский предгорный и Западно-Предкавказский равнинный.

В течение последних десятилетий наблюдалось интенсивное антропогенное воздействие на природные комплексы Краснодарского края. В настоящее время в предгорных районах Краснодарского края в результате интенсивной вырубки лесов водяная полевка утратила свое эпизоотологическое значение, и роль основного носителя туляремии перешла к обыкновенной полевке. Основными видами, вовлекающимися в эпизоотологический процесс, являются обыкновенная полевка, домовая мышь и другие виды мелких млекопитающих. К началу XXI столетия антропогенное воздействие привело к остепнению и аридизации этих ландшафтов. С севера территория предгорного очага граничит с участками равнинно-степного туляремийного очага, расположенного в Прикубанской пойменной равнине, естественной границы между очагами не существует. В отличие от этого в 1950-1960-е годы здесь была распространена водяная полевка, достигавшая в отдельных биотопах высокой численности. Наличие водяной полевки явилось одной из причин, позволивших Е.В.Стрихановой с соавт. [1961], Л.Р. Петровой с соавт. [1963] и другим исследователям отнести этот очаг к предгорно-ручьевому ландшафтно-эпидемиологическому типу.

В лиманно-плавневом районе за последние десятилетия также произошли значительные изменения природного комплекса. Тростниковые плавни подверглись значительному осушению вплоть до Приазовских лиманов. В результате этого водяная полевка, которая считалась здесь одним из основных носителей, стала малочисленной. Прилегающая к Азовскому морю территория представлена густой сетью плавней, лиманов и проток, наличием нераспаханных и сухостойных участков, чередующихся с повсеместно расположенными здесь посевами сельскохозяйственных культур и лесозащитных полос.

Равнинно-степной район в Краснодарском крае занимает Азово-Кубанскую равнину, западную часть Кубано-Приазовской низменности и Прикубанскую наклонную равнину между средним течением р. Кубани на севере и предгорными районами на юге. Территория Прикубанской наклонной равнины и Кубано-Приазовской низменности в настоящее время

практически полностью распаханы и представляют собой сплошные сельскохозяйственные угодья, разделенные на части лесозащитными полосами. Залежных земель и сенокосньк угодий практически не сохранилось.

Наиболее массовыми видами мелких грызунов, которые регистрируются на всей природноочаговой по туляремии территории Краснодарского края, являются домовая и лесная мыши и обыкновенная полевка. В предгорных районах, кроме того, регистрируется высокая численность полевой мыши. Повсеместно встречаются землеройка белозубка, серый хомячок, кустарниковая полевка, землеройка бурозубка. Для равнинно-степных районов Краснодарского края характерно постоянное присутствие во всех стациях трех видов грызунов, которые являются фоновыми на этой территории: домовой и лесной мыши, обыкновенной полевки. По данным эпизоотологического обследования в этой ландшафтной зоне в осенне-зимний период с 1971 по 2004 гг., средний процент попадания упомянутых видов грызунов в ловушки составил - 6,4; 7,1 и 5,6%. Результаты учётов численности этих же видов мелких мышевидных, проведённых за период с 1990 г. по 2004 г., составили соответственно 1,8; 7,9; и 7,2 % попадания для предгорного района, 6,2; 6,9 и 10,7 % - для равнинно-степных районов Восточного Прикубанского очага и 5,3; 9,5 и 8,7 % - Западного Приазовского очага.

Анализ динамики численности домовой и лесной мышей и обыкновенной полевки по годам за период с 1973 по 2004 гг. свидетельствует о том, что на территории Краснодарского края наблюдаются годовые колебания численности этих грызунов. За время наблюдения благоприятными для жизнедеятельности названных видов грызунов были годы: 19731975, 1977-1978, 1981-1983, 1988-1989, 1995-1996, 1998-2002, т.е. в течение последних 30 лет наблюдалось шесть волн массового размножения домовой и лесной мыши и обыкновенных полевок. С 1994 г. на всей территории Краснодарского края прослеживается тенденция к увеличению общей численности массовых видов грызунов. Однако динамика численности отдельных видов мелких мышевидных грызунов в разных очагах имеет свои особенности. Так, пик численности домовой мыши в Западном Приазовском очаге (20,5% попадания в ловушки) наблюдался в 1994 г., пик численности обыкновенной полевки - в 1999 г. и 2002 г. (21,7 и 30,6% попадания), лесной мыши - в 1999 г. (15,3%). Вместе с тем в течение анализируемого периода времени наибольшая численность домовой мыши в Восточном степном очаге была зарегистрирована в 2000 г. (22,3%), обыкновенной полевки в 2001 г. (28,0%), лесной мыши в 2002 г. (26,4%). При этом, начиная с 1998 г. в Западном Приазовском очаге наблюдалось обострение эпизоотического процесса: штаммы туляремийно-го микроба были выделены от белозубки, кустарниковой полевки и полевой мыши, а в 2002 г - от обыкновенной полевки.

В период с 1971 г. по 2004 г., была установлена инфицированность туляремией следующих видов мелких млекопитающих на территории Краснодарского края: обыкновенная и кустарниковая полевки, лесная и домовая мыши, мышь - малютка, хомяк серый, полевая мышь, серая крыса, землеройка белозубка и землеройка бурозубка.

Нами проводился сбор клещей на территории 14 районов, расположенных на энзо-отичной по туляремии территории края. Всего, за период с 1981 г. по 2004 г. было собрано и исследовано на туляремию 115204 клещей, которые были представлены 12 видами: I.ricinus, I.hexagonus, I.vespertilionis, H. punctata, H. sulcata, H. concinna, В. annulatus, D. re-ticulatus, D. marginatus, H. plumbeum, R. rossicus, R. sangumeus. Наибольшее видовое разнообразие иксодовых клещей отмечается в лесных ландшафтах, а также дельтовых и долинных лугах, где обитают клещи 8-9 видов. В степных ландшафтах, в тростниковых плавнях и субальпийских лугах встречаются 1 - 4 вида клещей. В сборах на флаг, проведенных в весенний период, фоновым видом является D. marginatus - широко распространенный и многочисленный вид в равнинно-степном ландшафтном районе. Доля клещей этого вида в наших сборах составила 83,3-99,2% в Славяновском, Отрадненском и в Крымском районах края. От этого вида клещей при эпизоотологическом обследовании нами был выделен возбудитель туляремии в 1990 г. в Отрадненском и Успенском районах Краснодарского края. Вторым по численности видом после D. marginatus является /. ricinus.. Наиболее высокая встречаемость /. ricinus отмечена нами в предгорном ландшафтном районе - 69,2% по данным исследований, проводившихся в Майкопском районе.

На территории Восточного Прикубанского очага туляремии наблюдались три волны активизации эпизоотического процесса: в 1973-1974, 1978-1979, 1988-1989 гг. (рисунок 1). Эпизоотии протекали на фоне высокой численности фоновых видов мелких млекопитающих, превышающей в эти годы 25% попадания. На территории Западного Приазовского очага зарегистрировано две волны активизации эпизоотического процесса: в 1989 г. и в 1998 г. и по настоящее время, которые также проявились на фоне высокой численности фоновых видов мелких млекопитающих, составившей в эти годы 28,5-51,7% попадания по данным осенне-зимних обследований.

Наиболее значительными, повлекшими эпидемические осложнения, были пики эпизоотических проявлений, второй в 1988-1989 гг. и четвертый в 1998-2004 гг. На эти два периода активизации природных очагов туляремии пришлось 82% всех больных.

Эпизоотическая активность в Восточном Прикубанском очаге проявлялась на территории 10 районов, индекс эпизоотичности которых составил от 0,03 до 0,13 за 33-х летний период наблюдений В Западном Приазовском очаге за этот же период эпизоотия была зарегистрирована в 1989, 1998, 1999, 2000, 2002 и 2003 гг. в четырех районах: Красноар-

мейском, Ейском, Славянском и Крымском Индекс эпизоотичности для этих районов составил соответственно 0,03 и 0,16

Рисунок 1 Эпизоотическая активность природного очага туляремии на территории Краснодарского края

Результаты многолетнего изучения пространственной и биоценотической структуры, эпизоотологических особенностей Западного Приазовского и Восточного Прикубан-ского природных очагов туляремии на территории Краснодарского края свидетельствуют о том, что они стали в настоящее время относительно автономными друг от друга Эпизоотический контакт между этими очагами носит, по всей видимости, очень редкий характер в связи с изоляцией их территорий, произошедшей в результате антропогенного воздействия (распашкой значительных площадей и активным сельскохозяйственным оборотом земель) Этот вывод подтвержден результатами проведенного нами генотипирования штаммов ту-ляремийного микроба, который является специфическим и главным компонентом в биоценозе этих природных очагов (рисунок 2)

Молекулярно - генетический анализ 35 штаммов р ШЫгеюЪ показал, что для Западного Приазовского очага были характерны два генотипа, которые ранее не обнаруживались в степном очаге Центрального Предкавказья, что соответствует представлениям об относительной автономности Западного Приазовского очага [Устин-Петрова Н Ф 1963, Тарасов М П, 1991, Антонов А В с соавт, 2001] Вместе с тем штаммы, выделенные на территории Восточного Прикубанского очага в 1989 г, имели генотип, идентич-

ный со штаммами, выделенными в Ставропольском степном очаге в этом же году и ранее -в 1986 г

УЭТТИ генотип Год выделения, географический район -' 282 230 165 380 Ставропольский край 1953,1959 гг.

-2 282 230 165 389 Краснодарский край (Западный

Приазовский очаг) 2000 г.

-3 282 230 165 398 Краснодарский край (Западный

Приазовский очаг) 2000,2002Д003 гг., Новороссийский морской порх 1990 г. -* 282 230 165 425 Ставропольский край 2003 г.

В

-5 282 230 165 434 Ставропольский край 1948,1961, 1986,2003 гг.

-6 282 230 165 470 Ставропольский край 1948,1952, 1959,1973,1986 гг.

-9 303 230 165 470 Ставропольский край 2003 г. - 7 303 230 165 407 Ставропольский край 15*49 г.

-» 303 230 165 416 Ставропольский край 1986,1989 гг.

Краснодарский край (Восточный Прикубанский очаг) 1989 г

Рисунок 2 Результаты генотипирования штаммов р tutarensis по УОТЯ. локусам (дендро-грамма иРОМЛ кластерного анализа аллельных частот)

Таким образом, современное состояние природного очага туляремии степного типа характеризуется тем, что он является основным для большей части территории Краснодарского края и располагается в двух ландшафтно-географических районах - равнинно-степном и предгорном Этот тип природного очага занимает степную часть Кубано-Приазовской низменности (Западный Приазовский очаг), Азово-Кубанскую равнину и степную часть Прикубанской наклонной равнины между средним течением р Кубань на севере и подножьем Большого Кавказского хребта на юге (Восточный Прикубанский очаг)

Природный очаг туляремии степного типа, охватывающий территорию Краснодарского края, по биоценотическим признакам относится к полигостальным и поливекторным. Роль основного носителя выполняют мелкие мышевидные грызуны обыкновенная полевка, домовая и лесная мыши. Циркуляцию возбудителя туляремии осуществляют переносчики, среди которых наиболее распространенными видами являются D. marginatus и I. ricinus, обитающие во всех ландшафтах.

За период времени с 1964 г. по 2004 г. в Краснодарском крае были выявлены 20 больных туляремией, а в природных очагах туляремии выделены 123 штамма возбудителя. Случаи заболеваний регистрировались в семи календарных годах: в 1988, 1989, 1998, 2000, 2002,2003 и 2004 гг. Рост заболеваемости туляремией регистрировался преимущественно в осенние и зимние месяцы за исключением двух случаев (июнь, август).

Заболеваемость наблюдалась в шести районах и двух городах, из них 10 случаев в Крымском районе, по 2 случая в Успенском, Новопокровском и Анапском и по одному случаю в Кореновском, Белоглинском районах и городах Новороссийск и Тихорецк. Среди больных туляремией 12 человек являлись сельскими жителями, 8 - жители городов.

По возрасту больные распределялись следующим образом: 7-14 лет - два человека, 15-19 лет - один, 20-29 лет - четыре, 30-39 лет - шесть, 40-49 лет - пять, 50-59 лет - один, 60-69 лет - один человек. Среди больных было 15 мужчин (75%), три женщины (15%), двое детей (10%). Анализ возрастной заболеваемости свидетельствует о том, что наиболее пораженными являются лица трудоспособного возраста (20 - 49 лет).

По профессиональной занятости шесть больных являлись сельскохозяйственными работниками, пять служащими, четыре рабочими, три учащимися школ, два не работающими. Характер заболеваемости определялся условиями работы и жизни населения: в 55% случаев установлен сельскохозяйственный и охотничье-промысловый типы заражения. Заражение аспирационным путем произошло в трех случаях, контактным - в 10 и алиментарным в семи случаях. Факторами передачи и источниками возбудителя инфекции являлись зараженное грызунами зерно на зерноскладах, сено, вода отрытых водоемов, шкурки зайцев и мелкие млекопитающие.

По клиническим формам заболевания распределялись следующим образом, в шести случаях диагностирована гландулярная форма, в четырех - ульцерогландулярная, в трех -легочная, в четырех - ангинозно-гландулярная и в трех случаях желудочно-кишечная. Среди всех больных двое были привиты против туляремии, при этом один человек заразился через два, а второй через три года после вакцинации. Заболевания протекали в основном в среднетяжелой форме и в одном случае в тяжелой форме. Спорадический характер заболевания людей туляремией, свидетельствует с одной стороны об активности природных

очагов, а с другой - об уменьшении иммунной прослойки среди городского населения, проживающего в пределах природного очага (возможно за счет неучтенной миграции населения).

На основании данных анализа эпидемических и эпизоотических проявлений туляремии за период с 1971 г. по 2004 г. впервые проведено эпидемиологическое районирование территории Краснодарского края по степени риска заражения туляремией и выявлены наиболее опасные в эпидемиологическом отношении районы. Административные территории края разделены на две группы: районы повышенного и низкого риска заражения туляремией (рисунок 3).

Рисунок 3. Карта-схема распределения административных территорий Краснодарского края по степени риска заражения туляремией

К первой группе отнесены 14 районов, где до настоящего времени регистрируется эпизоотическая активность природного очага. Индекс эпизоотичности в этих районах колеблется от 0,06 до 0,16 за 30 лет наблюдения. В эту группу отнесены районы, в которых эпизоотическая активность отмечалась периодически в течение нескольких лет в разные

промежутки времени - индекс эпизоотичности более 0,1 (Крымский, Павловский, Новопо-кровский, Белоглинский, Отрадненский) и районы, на территории которых эпизоотические проявления туляремии были зарегистрированы однократно с 1971 г. по 2004 г. - индекс эпизоотичности менее 0,1. Можно практически с уверенностью говорить о существовании на этой территории стойких природных очагов туляремии в виде системы микроочагов с оптимальными биотопами и зонами выноса в период активизации эпизоотического процесса На эти районы приходится 95% всей заболеваемости туляремией по Краснодарскому краю.

Отсутствие заболеваемости в некоторых районах на территории активного очага можно объяснить оптимальным охватом вакцинацией групп риска населения, нельзя полностью исключить и наличие стертых, не диагностированных общей медицинской сетью, клинических форм туляремии.

Ко второй группе отнесены районы, в которых с 1971 г. не выявляется эпизоотическая активность природного очага туляремии, однако, эти районы находятся в ландшафтно-климатической зоне природной очаговости туляремии и ранее (до 1964 г.) на их территории регистрировались эпизоотические и эпидемические проявления туляремии. К этой же группе отнесены эпидемиологически благополучные районы, неэнзоотичные по туляремии, в которых отсутствуют факторы природной очаговости и никогда не выявлялись признаки эпизоотической активности этой инфекции. Однако, учитывая их географическую близость к активным природно-очаговым территориям, не следует исключать вероятности заносных случаев туляремии с сопредельных административных районов края.

Таким образом, на основании анализа эпидемиологической ситуации по туляремии в Краснодарском крае за последние 30 лет нами выявлены наиболее опасные в эпидемиологическом отношении районы. Представленные данные по районированию необходимы для планирования объёма и выработки тактики эпизоотологического мониторинга, проведения дифференцированных, адекватных эпизоотической обстановке мер профилактики в природном очаге туляремии, в том числе среди населения.

В качестве компонентов большинства очаговых экосистем обычно одновременно входят популяции нескольких патогенных и (или) условно-патогенных микроорганизмов [Э.И. Коренберг, 2001]. В результате исследования основных носителей туляремии в природных очагах Краснодарского края были выделены возбудители лептоспироза, листерио-за, кишечного иерсиниоза, а также сальмонеллеза и эризипелоида. Полученные нами результаты выявили циркуляцию на одной и той же территории края нескольких возбудителей инфекций с природной очаговостью.

Важным направлением работы противочумных учреждений является усовершенствование методов лабораторной диагностики туляремии, повышение их чувствительности и сокращение длительности анализа в целях получения своевременной информации об активности эпизоотических факторов и инфицированности возбудителем водной среды.

Предложенные нами усовершенствования методов лабораторной диагностики туляремии основаны на многолетнем опыте работы с полевым материалом. В связи с необходимостью исследования материала, загрязненного посторонней микрофлорой, и проб из объектов внешней среды актуальной является разработка и испытание селективных питательных сред для культивирования туляремийного микроба, а также методов его концентрирования на твердофазных сорбентах.

Нами в соавторстве М.П. Маевским сконструирована селективная питательная среда, удобная для работы в полевых условиях, поскольку она представляет собой сухой порошок, не нуждается в стерилизации автоклавированием, коррекции рН, фильтрации, добавлении естественных животных субстратов. Питательную основу этой среды составляет ферментативный гидролизат рыбы с добавлением дрожжевого экстракта, цистеин, глюкоза, растворимый крахмал, фиолетовый кристаллический, антибиотики, и другие ингредиенты [Маевский М П. с соавт., 1994 г.]. При посеве на среду имеет место рост единичных клеток туляремийного микроба (по стандарту мутности ОСО 42-28-85-86П), входящие в состав среды антибиотики подавляют рост посторонней микрофлоры, обеспечивая ее селективные свойства

В практике эпизоотологического обследования на туляремию эта селективная питательная среда применялась как для прямого посева полевого материала, так и для исследования органов биопробных животных. Нами доказана принципиальная возможность выделения чистой культуры туляремийного микроба в течение 2-3 суток при исследовании ик-содовых клещей и материала от грызунов прямым бактериологическим посевом в ходе эпизоотологического обследования в Отрадненском районе Краснодарского края в 1990 г. [М.П. Маевский с соавт., 1994 г.] и Крымском районе в 2000 г.

Эффективным средством повышения чувствительности методов детекции микроорганизмов является применение твердофазных иммуносорбентов. Использование последних значительно расширяет возможности и результативность мониторинга за обсемененностью туляремийным микробом объектов внешней среды за счет увеличения объема исследуемых проб, селективной концентрации искомого микроорганизма, очистки проб от загрязняющих компонентов.

Нами разработан метод применения угольно-иммунных сорбентов при исследовании воды из внешних водоемов на туляремию. Применение угольно-иммунного сорбента

позволяет достоверно увеличить вероятность выделения туляремийного микроба в пробах исследуемой воды при его низкой концентрации Полевые испытания метода подготовки проб воды из открытых водоемов с применением селективной концентрации микроба туляремии на УИС при бактериологическом исследовании проводятся нами с 2002 г Всего было исследовано 350 проб воды из шести районов Краснодарского края, в результате чего через биопробных животных были изолированы тринадцать штаммов р. tularensis.

Нами также изучена возможность применения магнитных иммунных сорбентов в экспрессном методе обнаружения возбудителя туляремии в комбинации с ПЦР. Как показали результаты экспериментальных исследований, чувствительность метода МИС+ПЦР при исследовании воды из внешнего водоема составляет Ш03 м к./мл

Применение магноммуносорбентов позволяет упростить этап концентрирования ту-ляремийного микроба в минимальном объеме пробы путем его селективной сорбции на магнитном носителе и очистки от ингибирующих примесей без применения метода центрифугирования, а также ускорить выделение ДНК из сорбированных микробных клеток. Предлагаемый метод может быть использован как метод ускоренного обнаружения возбудителя туляремии при расследовании вспышек заболевания водного характера

ВЫВОДЫ

1. Получены новые данные о ландшафтно-географической и биоценотической структуре природных очагов туляремии в Краснодарском крае Установлено, что природный очаг туляремии степного типа располагается в двух ландшафтно-географических районах - равнинно-степном и предгорном По биоценотическим признакам он является поли-гостальным и поливекторным Роль основных носителей выполняют обыкновенная полевка, домовая и лесная мыши Из переносчиков наиболее распространенными видами являются /. папш и Б. marginatus.

2. . Впервые показано, что в современных условиях Западный Приазовский и Восточный Прикубанский природные очаги туляремии степного типа на территории Краснодарского края стали относительно автономными друг от друга

3 Интенсивное антропогенное воздействие на очаг туляремии степного типа в течение последних 30 лет привело к снижению его эпизоотической активности Эпизоотические и эпидемические проявления в очаге в 1973-2004 гг были зарегистрированы на территории 10 районов в юго-восточной части Краснодарского края и 4 районов на западе

4 На основании анализа эпидемических и эпизоотических проявлений туляремии за последние 30 лет впервые проведено эпидемиологическое районирование территории Краснодарского края по степени риска заражения и выявлены наиболее опасные в эпидемиоло-

гическом отношении районы. Административные территории края разделены на две группы: районы повышенного и низкого риска заражения туляремией.

5. Выявлено девять генотипов р. tularensis, циркулирующих на территории Краснодарского и Ставропольского краев. Анализ их распространения показал, что для Западного Приазовского очага были характерны два из них. Штаммы, выделенные на территории Восточного Прикубанского очага в 1989 г., имели генотип, идентичный со штаммами, выделенными в Ставропольском степном очаге в этом же году и ранее в 1986 г.

6. Установлено, что на территории природных очагов туляремии Краснодарского края среди основных носителей имеет место циркуляция возбудителей бактериальных при-родно-очаговых инфекций: лептоспироза, кишечного иерсиниоза, листериоза, а также саль-монеллезов и эризипелоида.

7. Показано, что разработанная нами в соавторстве с М.П. Маевским селективная питательная среда может быть применена при эпизоотологическом обследовании территории для выделения чистой культуры туляремийного микроба и позволяет культивировать единичные микробные клетки р. tularensis. Среда проста в приготовлении, не требует стерилизации автоклавированием и добавки дополнительных компонентов при исследовании полевого материала.

8. Применение угольно-иммунного сорбента позволяет достоверно увеличить вероятность выделения возбудителя туляремии в пробах исследуемой воды при его низкой концентрации. Сочетанное применение магнитных иммунных сорбентов и ПЦР может использоваться как ускоренный предварительный метод обнаружения туляремийного микроба в воде открытых водоемов.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Костюковский В.М., Дранов И.Ю., Брудный Р.А., Антонов А.В., Тинкер Ю.А., Нагорная А.Ф., Штоль Л.И., Медяник И.М., Калашников Н.Г. Использование твердофазного варианта иммуноферментного метода при комплексном исследовании полевого материала на бактериальные и вирусные инфекции // Актуальн. вопр. эпиднад-зора в природа, очагах чумы: Тез. докл. к Всесоюзной науч.-практ. конф. - Ставрополь, 1985.-С. 150-151.

2. Антонов А.В., Костюковский В.М., Классовский И.Л., Калашников Н.Г., Морозов А.А., Штоль Л.И., Власенко Б.В. Исследования материала на туляремию в Краснодарском крае с использованием твердофазного варианта иммуноферментного метода // Особо опасн. инфек. на Кавказе: Тез. докл. к VI краев, научн. конфер., посвящ. 7019

летаю Великой Октябрьской социалистической революции. - Ставрополь, 1987. - С. 189-190.

3. Чернявская Е.Г., Свешников П.Г., Северин Е.С., Басилова Г.И., Антонов А В., Кос-тюковский В М. Пероксидазные пенициллиназные моноклональные тестсистемы для обнаружения возбудителя туляремии // Актуал. вопр. эпид., профил. и диагн. особо опасн. инф.: Тез. докл. итоговой научн. конф. 21-22 декабря 1989г. - Ставрополь, 1989.-С. 131.

4. Калашников Н.Г., Классовский И.Л., Антонов А.В., Костюковский В.М., Брудный Р.А., Сисюкин А.И. Природная очаговость туляремии в Краснодарском крае // Со-временн. аспекты профил. зооноз. инфек.: Тез. докл. науч. конф. - Ставрополь, 1991. - С. 78-80.

5. Маевский М.П., Костюковский В.М., Антонов А.В. Признаки Л-форм бактерий у возбудителя туляремии // Всесоюз. конфер. актуал. проблемы профилакт. туляремии. -Москва, 1991.-С. 64-65.

6. Маевский М.П., Васильева З.И., Болдина А.А., Брудный Р.А., Костюковский В.М., Антонов А.В., Кузнецов В.И. Сухая питательная среда для выделения возбудителя туляремии. // Всесоюз. конфер. актуал. проблемы профилакт. туляремии. - Москва, 1991.-С. 105-106.

7. Маевский М.П., Канатов Ю.В., Брудный Р.А., Васильева З.И., Антонов А.В., Костю-ковский В.М. Сухая агаровая среда для выделения и культивирования туляремийно-го микроба // Сб. науч. тр. вып. 1 - Новороссийск, 1994. - С. 223-225.

8. Костюковский В.М., Головко Э.Н., Брудный Р.А., Штоль И.Н., Маевский М.П., Антонов А.В., Дубаневич Б.А., Рябова Т.Е., Вислогузова Н.Г. Активизация природного очага туляремии на территории Краснодарского края // Природ.-очагов, особо опасн. инфекц. на Юге России, их профилак. и лаборатор. диагностика: Сб. науч. тр.- Астрахань, 2001.-С. 100-103.

9. Головко Э.Н., Штоль И.Н., Антонов А.В., Елдинова В.Е., Костюковский В.М. Применение сорбента для повышения чувствительности биологического метода при выделении возбудителей некоторых природно-очаговых инфекций из воды. // Природ. -очагов, особо опасн. инфек. на Юге России, их профилакт. и лаборатор. диагностика: Сб. науч. тр.- Астрахань, 2001. - С. 263-265.

10. Костюковский В.М., Антонов А.В., Дубаневич Б.А. Влияние факторов социально-экологической деятельности на активность природных очагов туляремии в Краснодарском крае // Актуал. асп. природн. очагов болезней' Мат. межрег. науч.-практ.

конф 16-17 октября 2001г, посвящ 80-летию Омского НИИЭМ, - Омск, 2001 - С 148-150

11 Головко Э Н , Елдинова М В , Костюковский В М , Антонов А В , Дубаневич Б А, Штоль И НО циркуляции в природном очаге туляремии возбудителей других бактериальных инфекций // Актуал пробл эпид безопасности - Ставрополь, 2002 - С 81-83

12 Костюковский В М, Головко Э Н , Пиликова О М, Антонов А В , Маевский М П, Дубаневич Б А, Малай В И, Кутишевская Е Ф, Елдинова В Е Эпизоотологическая и эпидемиологическая ситуация по природно-очаговым инфекциям в Краснодарском крае в 1999-2000гг // Актуал пробл эпид безопасности - Ставрополь, 2002 - С 128-131

13 Антонов А В , Маевский М П, Головко Э Н, Костюковский В М , Елдинова В Е Применение угольно-иммунного сорбента при исследовании воды открытых водоемов в природных очагах туляремии - Науч -практ работы, посвящ 80-летию санитарной службы - Краснодар, 2002 -С 135-136

14 Брюханов А Ф, Антонов А В, Еременко Е И, Грижебовский Г М , Тихенко Н И, Дегтярева Л В , Левченко Б И, Малай В И, Лямкин Г И Генотипирование штаммов туляремийного микроба - Журн микробиол, эпидемиол, иммунол, 2003 - №6 -С 59-62

15 Антонов А В К вопросу о природной очаговости туляремии в Анапском районе Краснодарского края // Российская Акад Естествозн Журн Фундаментальные исследования №1 - М, 2004 - С 35-36

16 Антонов А В Клинико-эпидемиологическая характеристика туляремии в Краснодарском крае // Мед микробиол - XXI век Матер всероссийс науч -практ конф, Саратов, 2004 -С 23-25

17 Дерлятко К И, Антонов А В , Дубаневич Б А , Корсунская С,А , Сержантова Л В, Елдинова В Е Краткая эпидемиолого-эпизоотологическая характеристика южной части Приазовского природного очага туляремии в 1998 -первой половине 2004 гг // Противочумн учрежд России и их роль в обеспечении эпидемиол благополуч населения страны Матер конф, посвящ. 70-летию Противочумного центра - Москва, 2004 -С 140-141

АНТОНОВ АНДРЕЙ ВАСИЛЬЕВИЧ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подп. к печати 05.04.2005 . Заказ 19. Формат 60x84 1 /16. Бумага офсетная Усл. изд. л. 1,0. Тираж 100 экз.

Отдел оперативной полиграфии СНИИЖК г. Ставрополь, пер. Зоотехнический 15

4J- 2447

19 Шй m

Актуальность проблемы.

Туляремия в недавнем прошлом являлась одним из самых распространенных природно-очаговых заболеваний на территории России, что определяло внимание исследователей к этой опасной инфекции. Однако и в настоящее время заболевания туляремией в Российской Федерации регистрируются ежегодно, а в отдельные годы проявления инфекции принимают характер эпидемических вспышек вследствие активизации её природных очагов [Ефременко В.И., Грижебовский Г.М., 1997; Мещерякова И.С., 2003]. В последние годы заболеваемость туляремией носила в основном спорадический характер, за исключением вспышки в августе-сентябре 1999 г. в Кизлярском и Тарумовском районах Республики Дагестан, когда заболели 64 человека [Онищенко Г.Г., 2001; Ти-хенко Н.И. с соавт. 2001].

Природные очаги туляремии на Северном Кавказе по своим ландшафтно-географическим и другим особенностям характеризуются широким разнообразием, и границы их до настоящего времени могут быть очерчены лишь ориентировочно. Особенности ландшафтно-географичсских условий обусловливают существование различных биоценозов, обеспечивающих циркуляцию возбудителя туляремии в природе и формирование нескольких типов природных очагов этой инфекции.

Т.В. Устин-Петрова [1963] выделила на территории Краснодарского края два ландшафтных типа природных очагов: равнинно-степной и предгорно-ручьевой. При этом к равнинно-степному типу были отнесены два территориально разобщенных очага, а именно: Западный (Приазовский) и Восточный (Прикубапский). В дальнейшем И.А. Калашников [1991], В.М. Костюковский [2001] и другие в своих работах также придерживались этой типологической классификации.

В настоящее время обширная территория (80-90%) Краснодарского края, ранее считавшаяся энзоотичной по туляремии, распахана под посевы сельскохозяйственных культур и заселена одними и теми же видами мелких млекопитающих и кровососущих насекомых. Результаты преобразующей деятельности человека привели не только к изменению биоценотической структуры очагов на территории Краснодарского края, но и к снижению их эпизоотического и эпидемического потенциала. Однако природные очаги туляремии продолжают активно функционировать и представляют постоянную эпидемическую опасность.

В связи с этим, первостепенное значение приобретают вопросы разработки научно-обоснованной тактики эпизоотологического надзора и совершенствование лабораторных методов исследования полевого материала на туляремию. Особую роль приобретают методы молекулярно-генетического анализа, результаты которого могут быть использованы в целях дифференциации циркулирующих на разных территориях штаммов туляремийного микроба. Представляется необходимым дальнейшее изучение влияния антропогенной воздействия на пространственно-биоценотическую и функциональную структуру природных очагов туляремии в Краснодарском крае с целью получения объективной информации об их современном состоянии и планирования профилактических мероприятий.

Цель и задачи исследования

Цель работы - изучение особенностей ландшафтно-географической и биоценотической структуры природных очагов туляремии на территории Краснодарского края, их эпизоотической и эпидемической активности.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- изучить характер изменений пространственной и биоценотической структуры природных очагов туляремии на территории Краснодарского края в зависимости от антропогенного воздействия в период с 1971 г. по 2004 г.;

- охарактеризовать динамику эпизоотического процесса в разных частях нозоареала туляремии в последние десятилетия;

- изучить пространственно-временные особенности заболеваемости людей туляремией в Краснодарском крае;

- осуществить эпидемиологическое районирование территории Краснодарского края по степени риска заражения туляремией;

- провести генетическое типирование штаммов туляремийного микроба;

- усовершенствовать методы лабораторного исследования полевого материала на туляремию.

Научная новизна работы

Получены новые данные о ландшафтно-географической и биоценотиче-ской структуре природных очагов туляремии в Краснодарском крае. Установлено, что природный очаг туляремии степного типа располагается в двух ланд-шафтно-географических районах - равнинно-степном и предгорном. По биоце-нотическим признакам он является полигостальным и поливекторным. Роль основных носителей выполняют обыкновенная полевка, домовая и лесная мыши. Из переносчиков наиболее распространенными видами являются I. ricinus и D. margmatus, обитающие во всех ландшафтах.

Впервые установлено, что Западный Приазовский и Восточный Прику-банский природные очаги туляремии степного типа на территории Краснодарского края стали в настоящее время относительно автономными друг от друга.

Интенсивное антропогенное воздействие на очаг туляремии степного типа в течение последних 30 лет привело к снижению его эпизоотической активности. Эпизоотические и эпидемические проявления в очаге с 1971 г. по 2004 г. были зарегистрированы на территории десяти районов в юго-восточной части Краснодарского края и трех районов на западе.

На основании анализа эпидемических и эпизоотических проявлений туляремии за последние 30 лет впервые проведено эпидемиологическое районирование территории Краснодарского края по степени риска заражения туляремией и выявлены наиболее опасные в эпидемиологическом отношении районы.

Административные территории края разделены на две группы: районы повышенного и низкого риска заражения туляремией.

Впервые проведено генетическое типирование методом MLVA штаммов туляремийного микроба, выделенных в Краснодарском и Ставропольском краях на территории очага туляремии степного типа, и выявлено девять генотипи-ческих вариантов возбудителя.

Показано, что на территории природных очагов туляремии Краснодарского края среди основных носителей имеет место циркуляция штаммов возбудителей бактериальных природио-очаговых инфекций: лептоспироза, кишечного иерсиниоза, листериоза, а также сальмонеллезов и эризипелоида.

Установлено, что разработанная нами в соавторстве с М.П. Маевским селективная питательная среда может быть применена при эпизоотологическом обследовании территории для выделения чистой культуры туляремийного микроба и позволяет культивировать единичные микробные клетки Francisella tillaren sis.

Показана эффективность применения твердофазных иммунных сорбентов при исследовании воды природных водоемов на наличие возбудителя туляремии.

Научно-практическая значимость результатов исследования

Полученные в результате проведенных исследований данные, позволили оцепить характер и последствия антропогенного воздействия на природные комплексы в Краснодарском крае, обусловившие изменение интенсивности эпизоотического процесса в природных очагах туляремии, что явилось основанием для оптимизации проведения эпизоотологического надзора по туляремии, осуществления эпидемиологического мониторинга и планирования профилактических мероприятий. Предложена дифференциация территории Краснодарского края по степени риска заражения туляремией, выявлены административные районы, наиболее опасные в эпидемиологическом отношении.

Показана практическая ценность УШП-анализа при изучении генетического полиморфизма Еш1агепьчя для выявления особенностей биоценотической структуры природных очагов туляремии и эволюционных взаимоотношений штаммов возбудителя, циркулирующих на отдельных участках очаговости.

Предложены методы подготовки проб воды с применением твердофазных иммуносорбентов при проведении бактериологического и ПЦР анализа воды открытых водоемов на туляремию.

Показана эффективность применения питательной среды Маевского при исследовании полевого материала на туляремию. Среда проста в приготовлении, не требует стерилизации автоклавированием и добавки дополнительных компонентов при исследовании полевого материала.

На основании полученных данных разработаны методические рекомендации «Применение угольно-иммунных сорбентов для выделения туляремий-ного микроба из воды», одобренные Ученым Советом, утвержденные директором Ставропольского научно-исследовательского противочумного института 30.01.03 г. (протокол № 1); методические рекомендации «Применение поли-меразной цепной реакции и магнитных иммунных сорбентов для выявления туляремийного микроба в воде открытых водоемов», одобренные Ученым Советом, утвержденные директором Ставропольского научно-исследовательского противочумного института 26.06.03 г., (протокол № 6); составлен «Атлас природного очага туляремии на Северном Кавказе», одобренный Ученым Советом, утвержденный директором Ставропольского научно-исследовательского противочумного института 28.01.05 г. (протокол №1).

Основные положения, выносимые на защиту

1. В результате антропогенного воздействия природный очаг туляремии степного типа в современных условиях является наиболее активным на территории Краснодарского края. Он располагается в двух ландшафтно-географичес-ких районах - равнинно-степном и предгорном.

2. Анализ территориальной приуроченности официально зарегистрированных случаев туляремии среди людей и эпизоотических проявлений инфекции позволяет выделить на территории Краснодарского края районы высокого и низкого риска заражения, а также не энзоотичную по туляремии территорию.

3. В природном очаге туляремии степного типа на территории Краснодарского и Ставропольского краев циркулирует девять генотипов туляремий-пого микроба.

4. Методы лабораторной диагностики с применением угольных и магнитных иммунных сорбентов обеспечивают преимущества (по времени и чувствительности) при детекции возбудителя туляремии в воде природных водоемов по сравнению с традиционными приёмами лабораторной техники.

5. Использование питательной среды Маевского эффективно при исследовании полевого материала на туляремию.

Апробация работы и публикации результатов исследования

Изложенные в работе материалы были представлены и обсуждены на научно-производственных Советах Новороссийской противочумной станции (1997 - 2002 г.г.), Региональном совещании по профилактике карантинных и особо опасных инфекций, рабочем совещании ЦГСЭН по вопросам санитарной охраны территории Кавказа (Ставрополь, 1998 г.), юбилейной научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы» (Ставрополь, 2002), Межгосударственной научно- практической конференции «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003).

Основные материалы диссертационной работы изложены в 17 научных публикациях.

Структура и объём работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 172 работы отечественных и 11 зарубежных авторов. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 рисунками и 10 таблицами.

выводы

1. Получены новые данные о ландшафтно-географической и биоценоти-ческой структуре природных очагов туляремии в Краснодарском крае. Установлено, что природный очаг туляремии степного типа располагается в двух ландшафтно-географических районах - равнинно-степном и предгорном. По биоценотическим признакам он является полигостальным и поливекторным. Роль основных носителей выполняют обыкновенная полевка, домовая и лесная мыши. Из переносчиков наиболее распространенными видами являются 1. ricinus и D. marginatus.

2. Впервые показано, что в современных условиях Западный Приазовский и Восточный Прикубанский природные очаги туляремии степного типа на территории Краснодарского края стали относительно автономными друг от друга.

3. Интенсивное антропогенное воздействие на очаг туляремии степного типа в течение последних 30 лет привело к снижению его эпизоотической активности. Эпизоотические и эпидемические проявления в очаге в 1973-2004 гг. были зарегистрированы на территории 10 районов в юго-восточной части Краснодарского края и 4 районах на западе.

4. На основании анализа эпидемических и эпизоотических проявлений туляремии за последние 30 лет впервые проведено эпидемиологическое районирование территории Краснодарского края по степени риска заражения и выявлены наиболее опасные в эпидемиологическом отношении районы. Административные территории края разделены на две группы: районы повышенного и низкого риска заражения туляремией.

5. Выявлено девять yNTR генотипов F. tularensis, циркулирующих на территории Краснодарского и Ставропольского краев. Анализ их распространения показал, что для Западного Приазовского очага были характерны два из них. Штаммы, выделенные па территории Восточного Прикубанского очага в

1989 г., имели УШИ генотип, идентичный со штаммами, выделенными в Ставропольском степном очаге в этом же году и ранее в 1986 г.

6. Установлено, что на территории природных очагов туляремии Краснодарского края среди основных носителей имеет место циркуляция возбудителей бактериальных природно-очаговых инфекций: лептоспироза, кишечного иерси-ниоза, листериоза, а также сальмонеллезов и эризипелоида.

7. Показано, что разработанная нами в соавторстве с М.П. Маевским селективная питательная среда может быть применена при эпизоотологическом обследовании территории для выделения чистой культуры туляремийного микроба и позволяет культивировать единичные микробные клетки Р. пйагетм. Среда проста в приготовлении, не требует стерилизации автоклавированием и добавки дополнительных компонентов при исследовании полевого материала.

8. Применение угольно-иммунного сорбента позволяет достоверно увеличить вероятность выделения возбудителя туляремии в пробах исследуемой воды при его низкой концентрации. Сочетанное применение магнитных иммунных сорбентов и ПЦР может использоваться как ускоренный предварительный метод обнаружения туляремийного микроба в воде открытых водоемов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итоги многолетних исследований эпизоотической активности, пространственной и биоцснотической структуры природных очагов туляремии на территории Краснодарского края позволяют констатировать, что очаг степного типа в течение всего периода наблюдений с 1971 г. и по настоящее время находится в активном состоянии. Однако интенсивная сельскохозяйственная деятельность человека на территории очага в последние десятилетия прошлого века привела к снижению его эпизоотической активности и изменению характера течения эпизоотий, которые регистрируются на ограниченных его участках. Эпизоотические и эпидемические проявления в степном очаге с 1971 г. по 2004 г. были отмечены в десяти административных районах в юго-восточной части Краснодарского края и четырех районах на западе. Известно, что активное антропогенное преобразование природных комплексов создает предпосылки для уменьшения эпизоотического потенциала степного очага туляремии, но не приводит к полному его оздоровлению, возбудитель туляремии продолжает циркулировать в биотопах, прилегающих к сельскохозяйственным угодьям, не подвергшихся вспашке [Пилипенко В.Г. с соавт., 1959; Пили-пенко В.Г., Щекина Т.А., 1978], чем обусловливается стойкость и длительность существования ареала инфекции.

В противоположность этому, антропогенное воздействие на очаги туляремии, расположенные в предгорном и лиманно-плавневом районах Краснодарского края, привело к снижению их эпизоотического потенциала или трансформации в другой ландшафтно-эпидемиологический тип. Так, в лиманно-плавневом районе тростниковые плавни подверглись значительному осушению вплоть до приазовских лиманов. В результате такого фундаментального воздействия водяная полевка, которая ранее являлась здесь одним из основных носителей, лишилась естественных мест обитания. В предгорных районах на пологих склонах широколиственные леса в течение многих лет подвергались активной вырубке в целях подготовки площади для пастбищ и сенокосов. В настоящее время это привело к остепнению и аридизации этих ландшафтов. Малые реки и ручьи пересыхают, поэтому и здесь водяная полевка становится редким видом и утратила свое эпизоотологическое значение, а роль основного носителя перешла к обыкновенной полевке.

По данным Е.В. Стрихановой с соавт. [1961, 1968], активные участки природных очагов туляремии за период с 1943 г. по 1960 г. регистрировались в лиманно-плавневых ландшафтах на западе края и предгорно-ручьевых на юго-востоке. Согласно нашим исследованиям, с 1973 г. эпизотии туляремии периодически регистрируются только в равнинно-степных и предгорных ландшафтах,

В настоящее время энзоотичные по туляремии территории, ранее отнесенные к трем ландшафтным типам, распаханы на 80 - 90% под посевы сельскохозяйственных культур и заселены одними и теми же видами грызунов, оставшиеся нетронутыми естественные ландшафты энзоотичной территории изолированы друг от друга ежегодно перепахиваемыми полями. Современное состояние природного очага туляремии степного типа характеризуется тем, что он является основным для большей части территории Краснодарского края и располагается в двух ландшафтно-географических районах - равнинно-степном и предгорном. Этот ландшафтный тип природного очага занимает степную часть Кубано-Приазовской низменности (Западный Приазовский очаг), Азово-Кубанскую равнину и степную часть Прикубанской наклонной равнины между средним течением р. Кубань на севере и подножьем Большого Кавказского хребта на юге (Восточный Прикубанский очаг).

Результаты проведенного нами многолетнего изучения пространственной и биоцепотической структуры, эпизоотологических особенностей Западного Приазовского и Восточного Прикубанского природных очагов туляремии на территории Краснодарского края свидетельствуют о том, что они стали в настоящее время относительно автономными друг от друга. Эпизоотический контакт между носителями инфекции в этих очагах носит, по всей видимости, очень редкий характер в связи с изоляцией их территорий, произошедшей в результате антропогенного воздействия (распашкой значительных площадей и активным сельскохозяйственным оборотом земель). Этот вывод подтвержден результатами проведённого нами генотипирования штаммов туляремийного микроба, который является специфическим и главным компонентом в биоценозе этих природных очагов. Молекулярно - генетический анализ 35 штаммов F. lularensis показал, что для Западного Приазовского очага были характерны два VNTR генотипа, которые ранее не обнаруживались в степном очаге Центрального Предкавказья, что соответствует представлениям об относительной автономности Западного Приазовского очага [Устин-Петрова Н.Ф., 1963; Тарасов М.П., 1991; Антонов A.B.с соавт., 2001]. Вместе с тем штаммы, выделенные на территории Восточного Прикубанского очага в 1989 г., имели VNTR генотип, идентичный со штаммами, выделенными в Ставропольском степном очаге в этом же году и ранее - в 1986 г.

Природный очаг туляремии степного типа, охватывающий территорию Краснодарского края, по биоценотическим признакам относится к полигос-тальным и поливекторным. Роль основного носителя выполняют мелкие мышевидные грызуны: обыкновенная полевка, домовая и лесная мыши. Циркуляцию возбудителя туляремии осуществляют переносчики, среди которых наиболее распространенными видами являются D. marginalus и I. ricinus, обитающие во всех ландшафтах.

Результаты природообразующей деятельности сказались не только на изменении структуры очагов на территории Краснодарского края, но и привели к снижению их эпизоотического потенциала (эпизоотии регистрируются значительно реже и не носят непрерывного характера). На территории Восточного Прикубанского очага туляремии наблюдались три волны активизации эпизоотического процесса: в 1973-1974, 1978-1979, 1988-1989 г.г. Эпизоотии туляремии протекали на фоне высокой численности фоновых видов мелких млекопитающих, превышающей в эти годы 25% попадания. С 1998 г. и по настоящее время (после длительного «межэпизоотического» периода с 1960 г.) эпизоотическая активность регистрируется в Западном Приазовском очаге, которая также проявилась на фоне высокой численности фоновых видов мелких млекопитающих в осенне-зимний период, составившей в эти годы 28,5-51,7% .

Эпизоотическая активность в Восточном Прикубанском очаге проявлялась на территории 10 административных районов, индекс эпизоотичности которых здесь колебался от 0,03 до 0,09 за 30-летний период наблюдений. В Западном Приазовском очаге за этот же период эпизоотии была зарегистрированы в четырех административных районах. Индекс эпизоотичности для этих районов составил соответственно от 0,03 до 0,15.

За период с 1989 г. по 2004 г. в крае было выявлено 20 больных туляремией. В природных очагах инфекции были выделены 123 штамма туляремий-ного микроба. Случаи заболеваний регистрировались в семи календарных годах: в 1988, 1989, 1998, 2000, 2002, 2003 и 2004 г.г. Возбудитель инфекции выделяли при эпизоотологическом обследовании в 13 календарных годах (1973, 1974, 1978, 1979, 1988, 1989,1990, 1998, 1999, 2000, 2002, 2003 и 2004 гг.). Заболеваемость людей туляремией наблюдалась в шести районах и двух городах, из них 10 случаев в Крымском районе, по два случая в Успенском, Новопокров-ском и Анапском и по одному случаю в Кореновском, Белоглинском районах и городах Новороссийск и Тихорецк.

В соответствии с данными о частоте регистрации эпизоотических проявлений инфекции и случаях заболеваний людей в природных очагах туляремии за период с 1973 г. по 2004 г., административные территории края можно условно разделить на две группы: районы повышенного и низкого риска заражения. Предложенная нами дифференциация территории края на группы районов по степени их эпидемиологической значимости имеет практическое значение для планирования объёмов и обоснования эффективной тактики проведения эпизоотологического мониторинга в природном очаге, осуществления профилактических мероприятий, в том числе специфической профилактики среди населения. При этом необходимо отметить, что регулярное эпизоотологическое обследование и изучение особенностей проявления эпизоотической активности позволит в дальнейшем корректировать принадлежность территории природной очаговости туляремии к конкретным типам ландшафта в динамике их антропогенной и природно-климатической трансформации.

Проблема существования так называемых «сочетанных» природных очагов и «смешанных» инфекций, привлекает в настоящее время все большее внимание исследователей [Коренберг Э.И., 2000]. О характере возможного взаимодействия всего комплекса микроорганизмов и их резервуаров на разных уровнях биологической организации почти ничего не известно. В конечном счете, распространение определенного возбудителя, как и любого биологического вида, зависит от наличия необходимых биотических и абиотических условий, которые формируются под влиянием зональных, интразональных и экстразональных факторов [Коренберг Э.И., 1983].

Таким образом, вероятность, характер и последствия взаимного влияния совместно существующих природно-очаговых инфекций требуют специального исследования. В связи с этим нами была изучена инфицированность грызунов, отловленных в природном очаге туляремии, патогенными для человека бактериями.

На территории Краснодарского края в границах ареала туляремии существуют природные очаги других инфекций как бактериальной, так вирусной природы. От мелких млекопитающих, основных носителей туляремии в природных очагах Краснодарского края, были выделены возбудители сальмонел-леза, листериоза, лептоспироза, кишечного иерсиниоза, эризипелоида. Полученные нами результаты выявили циркуляцию на одной и той же территории края нескольких возбудителей инфекций с природной очаговостью, что может усложнять дифференциальную диагностику случаев заболеваний и проведение противоэпидемических мероприятий. В условиях роста интенсивности контакта людей с природой не исключается обострение эпидемиологической обстановки но другим, кроме туляремии, инфекциям в сочетанных природных очагах упомянутых болезней, что следует учитывать при проведении медицинского наблюдения за населением.

В условиях снизившейся эпизоотической активности очагов туляремии и постоянно существующей в то же время угрозы заражения людей другими природноочаговыми инфекциями актуальным представляется дальнейшее совершенствование лабораторной диагностики полевого материала. Одним из актуальных направлений является усовершенствование методов лабораторной диагностики туляремии, повышение их чувствительности и сокращение длительности анализа в целях получения своевременной информации об активности эпизоотических факторов и инфицированности возбудителем объектов внешней среды, в первую очередь - воды.

Предложенные нами усовершенствования методов лабораторной диагностики туляремии основаны на многолетнем опыте работы с полевым материалом. В связи с необходимостью исследования материала, загрязненного посторонней микрофлорой, и проб из объектов внешней среды актуальной является разработка и испытание селективных питательных сред для культивирования туляремийного микроба, а также методов его концентрирования на твердофазных сорбентах.

При нашем участии [Маевский М.П.с соавт., 1994] сконструирована селективная питательная среда, удобная для работы в полевых условиях, поскольку она может быть приготовлена из сухого порошка, не нуждается в стерилизации автоклавированием, коррекции рН, фильтрации, добавлении естественных животных субстратов и других манипуляциях. Питательную основу этой среды составляет ферментативный гидролизат рыбы с добавлением дрожжевого экстракта, цистеин, глюкоза, растворимый крахмал, фиолетовый кристаллический, антибиотики, и другие ингредиенты. Среда является чувствительной, обеспечивая рост единичных клеток туляремийного микроба по

Ill стандарту мутности ОСО 42-28-85-86П, и селективной (содержащиеся в ней антибиотики подавляют рост посторонней микрофлоры при исследовании загрязненного материала).

В практике эпизоотологического обследования на туляремию эта селективная питательная среда применялась нами как для прямого посева полевого материала , так и для исследования органов биопробных животных. Нами была показана принципиальная возможность выделения чистой культуры туляре-мийного микроба в течение 2-3 суток при исследовании иксодовых клещей и материала от грызунов прямым бактериологическим посевом в ходе эпизоотологического обследования в Отрадненском районе Краснодарского края в 1990 г. и в Крымском районе в 2000 г.

Применение твердофазных иммуносорбентов значительно расширяет возможности и результативность мониторинга за обсемененностью туляре-мийным микробом объектов внешней среды за счет увеличения объема исследуемых проб, селективной концентрации искомого микроорганизма, очистки проб от загрязняющих компонентов.

Нами разработан метод применения угольно-иммунных сорбентов при исследовании воды из внешних водоемов на туляремию. Применение угольно-иммунного сорбента позволяет достоверно увеличить вероятность выделения туляремийного микроба в пробах исследуемой воды при его низкой концентрации. Применение подготовки проб воды из открытых водоемов методом селективной концентрации микроба туляремии на УИС при бактериологическом исследовании проводятся нами с 2002 года. Всего с использованием угольно-иммуных сорбентов было исследовано 350 проб воды из шести районов Краснодарского края, в результате чего методом биопробы было изолировано тринадцать штаммов F. tnlarensis.

Нами также изучена возможность применения магнитных иммунных сорбентов в экспрессном методе обнаружения возбудителя туляремии в комбинации с ПЦР. Как показали результаты экспериментальных исследований, чувствительность метода МИС+ПЦР при исследовании воды из внешнего водоема составляет 103 мк/мл.

Применение магноммуносорбентов позволяет упростить этап концентрирования туляремийного микроба в минимальном объеме пробы путем его селективной сорбции на магнитном носителе и очистки от ингибирующих примесей без применения метода центрифугирования, а также ускорить выделение ДНК из сорбированных микробных клеток. Предлагаемый метод может быть использован как метод ускоренного обнаружения возбудителя туляремии при расследовании вспышек заболевания водного характера.