Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Роль бактерицидных механизмов фагоцитоза Francisella tularensis разных подвидов в патогенезе туляремии (экспериментальное исследование)

г, и

На правах рукописи

ТАТАРНИКОВ Станислав Александрович

РОЛЬ БАКТЕРИЦИДНЫХ МЕХАНИЗМОВ ФАГОЦИТОЗА ¡ КАМСНЕЫА ТШАКЕ!\ISIS РАЗНЫХ ПОДВИДОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ ТУЛЯРЕМИИ (экспериментальное исследование)

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 9 п с а г.л

¿и ¡0

Иркутск-2010

004616717

Работа выполнена в ФГУЗ «Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора».

Научный руководитель:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник доктор медицинских наук, профессор

Дубровина Валентина Ивановна

Попкова София Марковна Бодиенкова Галина Михайловна

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

с—^ £0

Защита состоится «_» 2010 г. в1Р" часов на заседании дис-

сертационного совета Д.001.038.02 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научном центре проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения РАМН по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при Учреждении Российской академии медицинских наук Научном центре проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения РАМН.

Автореферат разослан » НОЛ^Ок 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Шолохов Л.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Несмотря на продолжительную историю изучения туляремии и ее возбудителя, механизм патогенности туляремийного микроба недостаточно исследован. Возбудитель туляремии интересен и с точки зрения изучения механизмов иммуногенеза, поскольку обеспечивает развитие резистентности организма к повторному заражению.

Известно, что Francisella tularensis является одним из наиболее вирулентных микроорганизмов, заражающая доза которого для человека при аэрогенном заражении составляет 10 микробных клеток (Олсуфьев Н.Г., 1975; Ellis J. et al., 2002). Из-за высокой вирулентности туляремийный микроб рассматривается как один из наиболее вероятных средств биотерроризма (Домарадский И.В., 2005; Dennis D.G. et al., 2001; Lamps L.W. et al., 2004).

Природные очаги туляремии, выявленные первоначально в Северной Америке, а в последующие годы и в других регионах земного шара, обнаружены и на обширных территориях как России, так и ряда сопредельных государств, что создает потенциальную угрозу для проживающего здесь населения.

В соответствии с современными представлениями {Francisella tularensis taxonomy..., 2004), возбудитель туляремии - Francisella tularensis имеет четыре подвида - F. tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. holarctica, F. tularensis subsp. mediasiatica и F. tularensis subsp. novicida, которые различаются между собой по ряду биологических свойств, в том числе по кардинальному признаку - вирулентности для макроорганизма (Johansson A. et al., 2000).

Накопленные к настоящему времени научные сведения однозначно свидетельствуют о том, что патогенность бактерий, в том числе и F. tularensis, является биологически сложным полидетерминантным признаком, находящимся под контролем регуляторных систем как хромосомных, так и плазмидных генов, которые ответственны за синтез макромолекул, принимающих участие в развитии генерализованного инфекционного процесса (Анисимов А.П., 2002; Домарадский И.В., 2005; Ellis J. et al., 2002). Способность многих патогенных бактерий к паразитированию в фагоцитах, играющая важную роль в патогенезе инфекции, обусловлена генетическим детерминированием этого признака на хромосомном и (или) плазмидном уровнях (Thomas R.M. et al., 2007; Nano F.E., 2004).

Известно, что F. tularensis является внутриклеточным паразитом, поэтому ведущим звеном в защите организма хозяина является клеточный фактор (Олсуфьев Н.Г., 1975; Голубинский Е.П. и др., 1995; Дубровина В.И., 2002; Домарадский И.В., 2005; Ellis J. et al., 2002; Larsson P. et al., 2005). Очевидно, что выживание и последующее размножение туляремийного микроба в фагоците является начальным механизмом патогенеза инфекции (Tarnvik А., 1989; Antony L.S.D. et al., 1991; Ellis J. et al., 2002). Недавно показано, что туляремийный микроб может выживать и размножаться и внутри амебы Acanthamoebae castellani (Abd H. et al., 2003), что свидетельстует о возможной роли простейших в качестве резервуара туляремийной инфекции в окружающей среде.

В качестве немногих установленных детерминант вирулентности F. tularensis рассматриваются клеточная капсула (Hood A.M., 1977) и белок молекулярной массой 23 кДа, при инактивации которого снижаются вирулентность и способность туляремийного микроба выживать в макрофагах (Golovliov I. et al., 1997). Предполагается, что с белком 23 кДа связана также способность этого микроба подавлять образование макрофагами ФНО-а и ИЛ-1а (Telepnev M. et al., 2003).

Основное внимание исследователей в последние годы было направлено на изучение хромосомных факторов патогенности туляремийного микроба и их влияния на механизмы внутримакрофагального роста, внутриамебного выживания и вирулентности (Baron G.S., Nano F.E., 1998; Gray C.G. et al., 2002; Broekhuijsen M. et al., 2003; Nano F.E. et al., 2004; Lauriano C.M. et al., 2004; Nano F.E. et al., 2004; Lársson P. et al., 2005).

Работы, касающиеся фагоцитоза туляремийного микроба, затрагивают, в основном, отдельные этапы взаимодействия F tularensis с иммунокомпетентными клетками (Голубинский Е.П. и др., 1995; Павлович Н.В., 1996; Дубровина В.И., 2002; Оноприенко Н.Н., Павлович Н.В., 2003; Fortier А.Н. et al., 1994; Telepnev M. et al., 2003 ; Lai H.X. et al., 2004). Между тем, главное звено фагоцитоза - бактерицидные реакции фагоцитов при их взаимодействии с F. tularensis и закономерности этих реакций, - изучены в меньшей мере. В связи с этим, сравнительное изучение фагоцитоза туляремийного микроба с разными биологическими свойствами помимо научного интереса в раскрытии механизмов и особенностей этого процесса, будет способствовать пониманию патогенеза туляремии и, возможно, экспериментальному обоснованию механизмов его циркуляции в природных очагах.

На основании вышеизложенного, целью работы является выяснение роли бактерицидных механизмов фагоцитоза туляремийного микроба разных подвидов клетками иммунофагоцитарной системы в условиях in vitro и в динамике инфекционного процесса.

Для реализации поставленной цели последовательно решались следующие основные задачи:

1. Выявить особенности фагоцитарной способности макрофагов и полиморф-ноядерных лейкоцитов морских свинок при их взаимодействии в условиях in vitro с туляремийным микробом разных подвидов.

2. Исследовать особенности бактерицидных реакций фагоцитов экспериментальных животных в ответ на воздействие туляремийного микроба разных подвидов.

3. Дать сравнительную оценку действия F. tularensis разных подвидов на ци-токинпродуцирующую активность перитонеальных макрофагов белых мышей.

4. Выяснить особенности бактерицидных механизмов фагоцитоза F. tularensis разных подвидов в динамике развития инфекционного процесса.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное сравнительное исследование особенности формирования неспецифической резистентности организма экспериментальных

животных (белых мышей и морских свинок) к возбудителю туляремии с разными феногипическими свойствами.

Новыми являются сведения о том, что усиление продукции противовоспалительного (ИЛ-10) и провоспалительных (ФНО-а, ИЛ-1а, ИФН-у) цитокинов фагоцитами под действием туляремийного микроба зависит от его подвидовой принадлежности и вирулентности. Показано, что наиболее выраженным стимулирующим эффектом на синтез ИЛ-1а, ФНО-а, ИФН-у обладает Е ш1агет'к виЬзр. поукШа. Установлено, что снижение продукции ИЛ-1 а, ФНО-а, ИФН-у и активация ИЛ-10 фагоцитами животных, зараженных К т1агеп.ш эиЬзр. нЛагет'ш, приводит к угнетению их функциональной способности и, как следствие, - к снижению противоинфекционной защиты и гибели животного.

Экспериментально доказано, что бактерии К /м/агешгл вчЬвр. ко1агсНса и К Ш1агети хиЬэр. птШ<1а активируют, а Е 1и1агети' виЬвр. Шагетгз и Е Магет 'я БиЬзр. те/Ла.^1а11са ингибируют системы, способствующие захвату (адгезия и поглощение) и внутриклеточной деградации микроба (кислородзависимые, нитрок-сидзависимые и кислороднезависимые бактерицидные факторы).

Приоритетными являются данные о том, что ген, кодирующий белок Рс1рА, определяет ряд дополнительных факторов пагогенности, обусловливающих повышение устойчивости Е Ш1агеп$1з к фагоцитозу и последующей деструкции в макрофагах и ПЯЛ. Утрата у штаммов области рс!рА способствует выживанию экспериментальных животных, инфицированных возбудителем туляремии.

Теоретическое и практическое значение работы

На основании проведенных исследований молекулярно-биологических механизмов патогенеза туляремии показана роль бактерицидных систем (кислород-, нитроксидзависимых и кислороднезависимых) фагоцитоза.

Получены новые данные о бактерицидных реакциях фагоцитов и их функциональных изменениях в иммунокомлетентных органах экспериментальных животных при инфекционном процессе, вызванном Е ¡и!агешчз разных подвидов, которые дополняют теоретические знания и определяют направления изысканий в области изучения механизмов формирования резистентности макроорганизма к туляремийному микробу.

Для оценки неспецифической резистентности организма патогенетически обоснована возможность тестирования показателей функциональной способности клеток иммунофагоцитарной системы экспериментальных животных в ответ на введение патогена.

Экспериментально показано, что наличие областирс1рА ирс1рО в генетической структуре острова патогенности Е 1и1агетгя разных подвидов может частично объяснить взаимосвязь уровня вирулентности и его подвидовой принадлежности.

Материалы исследований, представленные в диссертации, использованы при составлении трех методических рекомендаций.

Разработанные методы внедрены в практику научно-исследовательской работы Иркутского противочумного института, Улан-Удэнского института общей и экс-

периментальной биологии СО РАН, Новосибирского ГНЦВБ «Вектор», СИФИБР СО РАН (г. Иркутск).

Научные и практически значимые материалы исследований включены в лекционные курсы дополнительного послевузовского образования при ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора.

Положения исследования, выносимые на защиту:

1. Цитокинпродуцирующая способность фагоцитов при взаимодействии с бактериями F. tularensis зависит от их подвидовой принадлежности и вирулентности. При внедрении F. tularensis subsp. holarctica и F. tularensis subsp. novicida медиаторы воспаления (ФНО-а, ИЛ-1а, ИФН-у) индуцируют активацию эф-фекторных функций клеток иммунофагоцитарной системы (микробицидность, цитотоксичность, продукция цитокинов, супероксидных и нитроксидных радикалов) в большей степени, чем F. tularensis subsp. tularensis и F. tularensis subsp. mediasiatica.

2. Бактерии F. tularensis subsp. tularensis и F. tularensis subsp. mediasiatica более устойчивы к фагоцитозу и последующей деструкции в макрофагах и ПЯЛ, чем F. tularensis subsp. holarctica. Фагоцитоз F. tularensis subsp. novicida клетками иммунофагоцитарной системы является завершенным. Факторами, повышающими устойчивость бактерий F. tularensis subsp. tularensis и F. tularensis subsp. mediasiatica к фагоцитозу, является их способность ингибировать кислородзависимые, кисло-роднезависимые и нитроксидзависимые бактерицидные системы фагоцитов.

Апробация работы

Материалы, изложенные в диссертации, представлены и обсуждены на международных научных конференциях: «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007); «Природно-очаговые инфекции» (Улан-Батор, 2008-2010); ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2010); Всероссийских научных конференциях: «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006); «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология» (Киров, 2008); «Современные аспекты эпидемиологического надзора и профилактики особо опасных инфекций» (Иркутск, 2009); конференциях молодых ученых и специалистов: «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины - 2008» (Санкт-Петербург, 2008); «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 2009); «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2009); «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2009); «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2010); региональных конференциях: «Научно-теоретическая конференция аспирантов и студентов Иркутского государственного университета» (Иркутск, 2007-2010); научных конференциях Иркутского противочумного института (Иркутск, 2004-2010).

Диссертация оформлена на основе материалов плановой темы (2006-2009 гг.) и результатов текущей НИР (2008-2010 гг.).

Публикации

По теме диссертации опубликованы 25 научных работ, в том числе 5 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, две в иностранных журналах.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, иллюстрирована 17 таблицами и 16 рисунками. Список литературных источников содержит 205 наименований, в том числе 152 - зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальными моделями в основных опытах (заражение, иммунизация, отбор проб крови, получение фагоцитов и т.д.) служили морские свинки (массой 300-350 г) и белые мыши (18-20 г). Всего в опытах использовано 865 животных: 635 - морских свинок, 230 - белых мышей. Животных выводили из эксперимента воздушной эмболией сосудов сердца в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (2003 г.).

При выполнении работы (заражение экспериментальных животных, постановка реакций фагоцитоза и т.д.) использовали 10 штаммов возбудителя туляремии—F. tula-rensis subsp. holarctica И-94, И-250, И-33 5, И-366,15 НИИЭГ (вакцинный); F. tularensis subsp. tularensis Schu; F. tularensis subsp. mediasiatica A-120, A-61; F. tularensis subsp. novicida F 6168, Utah 112, которые культивировали на желточном агаре Анциферова (ФГУЗ ИркутскНИПЧИ Сибири и ДВ Роспотребнадзора) при 37 °С в течение 2 суг.

Вирулентность и подвидовые различия штаммов тестировали на лабораторных животных (белых мышах и морских свинках) по биохимическим свойствам и различию в строении геномных областей pdpD и pdpA острова патогенности (FPI) по методу F.E. Nano с соавт. (2004). Фрагмент/7ф£> (720 п.н.) у всех штаммов амплифицировали методом ПЦР с праймерами: pdpD-lF, 5'-TGC ТТТ TAG TGG GTC ATG GA-3', и pdpD-lR, 5'-CTA CGG CAT AAA TGG CTG GT-3'; фрагмент pdpA (307 п.н.) - с праймерами pdpAl, 5'-CAA GTG CTT GTT GGT GGT AA-3' и pdpA2, 5'-TGA TGT TTG ACC TGA ATT AGT GG-3'. Олигонуклеотиды производства ЗАО «Синтол» (г. Москва).

Для воссоздания экспериментального инфекционного процесса морским свинкам вводили подкожно туляремийный микроб всех выбранных для исследования штаммов в дозе 100 КОЕ, белым мышам -1 КОЕ. Отбор материала для исследования (иммуно-компетентные клетки печени, селезенки, лимфатических узлов экспериментальных животных) проводили традиционным способом (Фрейддин И.С., 1984, 1986).

При изучении фагоцитарной активности клеток системы мононуклеарных фагоцитов использовали переживающую однослойную культуру перитонеадьных макрофагов (Фрейдлин И.С., 1984,1986). Интенсивность фагоцитоза оценивали по фагоцитарному индексу (ФИ), проценту активных фагоцитов (ПАФ), цитопатиче-скому действию бактерий и индексу завершенности фагоцитоза (ИЗФ). Активность глкжозо-б-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ, КФ 1.1.1.49) изучали по методу М.И. Прохоровой (1982), НАДФН-оксидазы (КФ 1.6.2. -) R.L. Baehner, D.G. Nathan (1968) в модификации (Голубинский Е.П. и др., 1995), NO-синтазы (NOS, КФ 1.14.13.39) - по методу S.J. Green с соавт. (1994) в нашей модификации (Дубровина В.И. и др., 2008), миелопероксидазы (МПО, КФ 1.11.1.7) и содержание неферментных катонных белков (НКБ) спектрофотометрически по методу JLM. Сомовой (2005). Для оценки интенсивности образования в фагоцитирующих клетках метаболитов кислорода использовали НСТ-тест (Park В.Н. et al., 1968). ИЛ-1а, ИЛ-10, ФНО-а, ИФН-у выявляли в культуре макрофагов с помощью иммуноферментного метода (Bender MedSystems GmbH, Вена, Австрия).

Все полученные материалы обработаны статистически стандартными параметрическими методами с использованием /-критерия Стьюдента и непараметрическим методом Манна-Уитни с применением стандартного пакета программ «Statistica», версия 6 (CopyrightOStat Soft, Inc 19842001, ИПЧИ 31415926535897) и пакета программ Microsoft Excel (2003) корпорации Microsoft. Для каждой выборки вычисляли средневыборочные характеристики: М - среднее арифметическое, 5 - среднее квадратичное отклонение, ш - ошибка среднего. Результаты считали достоверными, если вероятность ошибки была меньше 0,05 (р < 0,05) по отношению к контролю.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведено исследование биохимической активности и основных дифференциальных признаков возбудителя туляремии разных подвидов.

Показано, что у исследованных штаммов туляремийного микроба имеются отличия по дифференциальным признакам - ферментации глицерина и цитруллину-реидазной активности. Так, штаммы F. tularensis subsp. tularensis Schu, F. tularensis subsp. mediasiatica A-61, A-120 и F. tularensis subsp. novicida (F 6168, Utah 112) в отличие от F. tularensis subsp. holarctica (И-94, И-250, И-335, И-366) обладают этими признаками, что согласуется с имеющимися литературными данными (Ellis J. et al., 2002). Иная картина отмечена в отношении ферментов углеводного обмена, участвующих в образовании кислоты без газа из мальтозы, которые активны у штаммов возбудителя туляремии подвидов F. tularensis subsp. tularensis Schu, F. tularensis subsp. mediasiatica (A-61, A-120), F. tularensis subsp. holarctica (И-94, И-250, И-335, И-366) и неактивны у штаммов подвида F. tularensis subsp. novicida (F 6168, Utah 112).

Установлено, что штаммы F. tularensis subsp. novicida (F 6168, Utah 112) обладают способностью к образованию кислоты без газа из сахарозы, тогда как представители всех других исследованных подвидов лишены этой способности.

Результаты, полученные методом ПЦР с использованием праймеров для амплификации внутренних фрагментовnpdpD, показали, что амплифицирован-ные области pdpA иpdpD штаммов туляремийного микроба подвидов tularensis и novtcida схожи. Ген, кодирующий белок PdpD, отсутствует у штаммов F. tularensis subsp. holarctica. Обнаружено, что ДНК вакцинного штамма F. tularensis 15 не содержит ампликона для пары праймеров ПЦР при исследовании pdpD, но имеет ожидаемые ампликоны для pdpA. Ген, кодирующий белок PdpA, присутствует у всех исследованных штаммов, кроме F. tularensis subsp. mediasiatica А-61. Есть основания предполагать, что это связано с изменением вирулентности штамма при хранении.

Кратко резюмируя изложенные выше материалы, можно констатировать, что по совокупности проведенных исследований нами показано, что наличие области pdpA и pdpD в генетической структуре «острова патогенности» F. tularensis разных подвидов может частично объяснить межштаммовое различие вирулентности туляремийного микроба, а также продемонстрировать взаимосвязь генетической структуры острова патогенности туляремийного микроба с уровнем вирулентности и подвидовой принадлежности. Имеются основания предполагать, что ген, кодирующий белок PdpA определяет ряд дополнительных факторов патогенности, так как штамм возбудителя туляремии F. tularensis subsp. mediasiatica А-61, утративший в процессе длительного хранения область pdpA островка патогенности, не вызывает гибели экспериментальных животных.

1. Исследование in vitro фагоцитарной способности моно- и полинукле-арных фагоцитов морских свинок при взаимодействии с Francisella tularensis разных подвидов

Фагоцитоз как физиологическое явление включает целый ряд взаимосвязанных процессов, а его исход зависит от свойств как макро-, так и микроорганизма. Исходя из того, что механизмы фагоцитоза вообще и туляремийного микроба в частности, могут быть поняты только при комплексном исследовании, мы попытались изучить эффективность основных стадий взаимодействия фагоцит - микроб.

На первом этапе работы наиболее ответственным было решение о выборе экспериментальной модели и конкретного объекта исследования.

С учетом цели и задач исследования, литературных данных и собственного опыта работы в основных экспериментах в качестве экспериментальной модели избраны перитонеальные макрофаги и ПЯЛ 106 морских свинок весом 300-350 г как животных, восприимчивых и чувствительных к возбудителю туляремии. Фагоциты примировали бактериями F. tularensis всех отобранных для исследования штаммов в соотношении 1 : 50 в течение 30 и/или 180 мин при 37 °С.

Макрофаги морских свинок в условиях in vitro интенсивно поглощают клетки штаммов F. tularensis subsp. novicida и F. tularensis subsp. holarctica, что подтверждается более высокими показателями фагоцитарной активности клеток. Так, поглотительная способность ПМ в большей степени выражена в отношении F. tularensis Utah 112. ФЧ в этом случае по сравнению с другими исследованными штаммами было выше в 1,4-2,6 раза.

В ходе экспериментов установлено, что бактерии F. tularensis subsp. novicida (Utah 112) достоверно (P< 0,05) более активно подвергались киллингу ПМ (ФИ в 2,0-4,0 раза выше, чем у клеток штаммов F. tularensis subsp. holarctica, F. tularensis subsp. mediasiatica или F. tularensis subsp. tularensis Schu), при этом бактерии подвида F. tularensis subsp. holarctica и F. tularensis subsp. tularensis были в 1,5-2,0 (P < 0,05) раза устойчивее к захвату макрофагами. Тем не менее, только в случае с F. tularensis subsp. novicida (F 6168, Utah 112) фагоцитоз был завершенный (+11,7 ± 1,4; +8,3 ±0,9).

Достоверных различий показателей ИЗФ между F. tularensis subsp. tularensis Schu и F. tularensis subsp. mediasiatica (A-61) (-104,8 ± 12,2 и -101,5 ± 20,1 соответственно) не выявлено, а у подвида F. tularensis subsp. holarctica значения ИЗФ по сравнению с вакцинным штаммом были выше в 1,2-1,7 раза (ИЗФ = -103,5 ± 11,2).

Полученные нами экспериментальные данные свидетельствуют о том, что в отношении макрофагов, примированных бактериями подвида novicida, цитопати-ческий эффект выражен в меньшей степени, чем фагоцитов, контактировавших с микроорганизмами других подвидов. В этом случае фагоцитоза микробов деструктивные изменения в макрофагах возникали в более поздние сроки и в более умеренной форме, чем при фагоцитозе вирулентных клеток. Показано, что цитопатическое действие туляремийного микроба на макрофаги в целом можно расценить как слабовыраженное, тем не менее, наибольшее деструктивное воздействие на макрофаги оказывает F. tularensis Schu. Цитопатическое действие возбудителя туляремии всех исследованных штаммов, за исключением F. tularensis F 6168 (изменений не наблюдалось), на макрофаги зависело от продолжительности их взаимодействия: через 180 мин контакта с микробом количество разрушенных и поврежденных клеток было в 1,5-3,6 раза больше, чем через 30 мин (Р < 0,05).

При изучении влияния туляремийного микроба на фагоцитарную активность ПЯЛ морских свинок установлено, что бактерии F. tularensis 15 и F. tularensis subsp. novicida Utah 112 достоверно (P < 0,05) более активно подвергались перевариванию фагоцитами, чем другие варианты: ФИ равнялся 3,2 ± 0,3 и 2,9 ±0,3 соответственно, а для клеток штаммов F. tularensis subsp. holarctica, F. tularensis subsp. mediasiatica или F. tularensis subsp. tularensis Schu ФИ был в 1,5-8,0 раза ниже.

Существенные различия между штаммами наблюдали и при определении завершенности фагоцитоза туляремийного микроба разных подвидов. Зарегистрировано, что завершенный фагоцитоз при взаимодействии in vitro ПЯЛ с туляремийным микробом был в случае со штаммами F. tularensis subsp. novicida Utah 112, F 6168uF. tularensis 15 (ИЗФ: +39,6 ± 1,2;+24,1 ± 1,1;+63,8± 12,4 соответственно). Незначительные отличия показателей ИЗФ отмечены у F. tularensis subsp. tularensis Schu и F. tularensis subsp. mediasiatica (A-61), а у подвидов F. tularensis subsp. holarctica, F. tularensis subsp. novicida (F6168) и F. tularensis subsp. mediasiatica (A-120) варьировали от-12,4 ± 0,3 до-53,5 ±9,1, что свидетельствует о незавершенности фагоцитоза.

Полученные нами материалы свидетельствуют о том, что меньшим стимулирующим эффектом на выработку активных форм кислорода ПЯЛ в процессе взаимодействия с Е ш1агею1я обладает туляремийный микроб подвидов /к/агая'! (Е 1и1агет1$ 5сЬи) и тесИаз'шйса(Е Ыагепш А-120), что выражается в более низких значениях ЦПА у фагоцитов при их контакте с бактериями этих штаммов, по сравнению с другими подвидами Е П^агеп.чи (рис. 1). При этом показатели ЦПА в случае с Е ш1агет1з ЭсНи были ниже в 1,5 раза, чем при контакте фагоцитов с клетками Е ш1агепх1ч А-120 (Р < 0,05).

123456789 10 11 Штаммы F. tularensis

Рис. 1. Влияние туляремийного микроба разных подвидов на показатели кислород-зависимого метаболизма полиморфноядерных лейкоцитов морских свинок в НСТ-тесте (М ± т). Здесь и на рис. 3: * - Р < 0,05 по сравнению с контролем. 1 - F. tularensis 15; 2 - F. tularensis И-94; 3 - F. tularensis И-250; 4 - F. tularensis И-335; 5-K tularensis И-366; 6 -F. tularensis F 6168; 7 - F. tularensis Utah 112; 8 -F. tularensisA-61;9-F. tularensisA-120; 10-F. tularensisSchu; 11 -контроль.

Известно, что ключевым ферментом при переключении пути утилизации глюкозы с гликолитического на гексозомонофосфатный шунт является Г6ФДГ, катализирующая начальную реакцию окисления глюкозо-6-фосфата, при которой акцептором водорода является НАДФ (Фрейдлин И .С., 1984, 1986). Следует отметить, что в ПМ и ПЯЛ, примированных туляремийным микробом разных подвидов в условиях in vitro (инкубация при 37 °С в течение 180 мин), повышается каталитическая активность Г6ФДГ, наибольшее ее значение зарегистрировано в фагоцитах, взаимодействующих с F. tularensis subsp. novicida Utah 112 (22,2 ± 0,5). Менее интенсивно дегидрирование глюкозо-6-фосфата происходит при контакте с макрофагами туляремийного микроба F. tidarensis subsp. mediasiatica и F. tularensis subsp. tularensis Schu. Низкие значения индекса стимуляции Г6ФДГ отмечены в случае бактерий F. tularensis Schu (12,1 ± 0,5).

Результаты проведенных нами исследований по изучению влияния туляремийного микроба на активность НАДФ -Н-оксидазы свидетельствуют о стимулирующем влиянии франциселл на функционирование этого ферментного комплекса в фагоцитах (рис. 2), но, тем не менее, выявлены различия в активации этого фермента в зависимости как от подвидовой принадлежности туляремийного микроба, так и его вирулентности.

0,16 •-

I 0,08 --

□

О

0--1

И-366 F 6168 Utah 112 A-120 Schu Контроль

Штаммы F. tularensis

Рис. 2. Влияние туляремийного микроба разных подвидов на активность НДЦФ-Н-оксидазы перитонеапьных макрофагов морской свинки (М ± m); * - Р < 0,05 по сравнению с контролем.

Анализ данных, полученных в ходе эксперимента, позволил выявить низкую активность фермента в фагоцитах, контактировавших с F. tularensis подвидов tularensis (0,136 ± 0,010) и mediasiatica (0,139 ± 0,012) по сравнению с F. tularensis subsp. novicida Utah 112 и F. tularensis subsp. holarctica И-366, тем не менее, достоверных различий между этими подвидами не выявлено.

Наибольшее стимулирующее воздействие на каталитическую способность НАДФ-Н-оксидазы, а именно перенос электронов от субстрата к кислороду, оказывает туляремийный микроб подвидов novicida и F. tularensis subsp. holarctica И-366, показатели которых в обеих группах фагоцитов (ПМ и ПЯЛ) были выше в 1,3 раза (Р < 0,05) по сравнению с контролем.

Таким образом, примирование клеток иммунофагоцитарной системы туляре-мийным микробом в условиях in vitro сопровождается активацией в этих клетках Г6ФДГ и НАДФ-Н-оксидазы, что свидетельствует об усилении в них окисления глюкозы в гексозомонофосфатном шунте и о повышении скорости взаимопревращения НАДФ <-» НАДФ-Н. Связанная с этим активация КЗМ обеспечивает фагоцитам более высокий уровень бактерицидной способности, которая, тем не менее, носит дифференцированный характер и зависит от вирулентности F. tularensis.

Анализируя полученные данные по изучению активности NO-синтазы при взаимодействии туляремийного микроба с фагоцитами, можно сделать вывод о том, что стимуляция продукции N02~ происходит как перитонеальными макрофагами, так и ПЯЛ морской свинки (рис. 3). В наибольшей степени образование N02~, характеризующее активацию NO-синтазы, имело место при взаимодействии туляремийного микроба подвида novicida (F. tularensis Utah 112 - 5,6 ± 0,3). Достоверные показатели ингибирования активности NO-синтазы фагоцитов выявлены только при взаимодействии с F. tularensis subsp. tularensis Schu (1,7 ± 0,1) по сравнению с контролем - не стимулированные фагоциты (3,2 ±0,1 при Р < 0,05) и F. tularensis subsp. holarctica (от 3,4 ± 0,1 до 4,1 ± 0,2). Тенденция к ее снижению имела место в случае с F. tularensis subsp. mediasiatica (3,2 ±0,1 и 3,0 ± 0,1). Подобные результаты получены и другими исследователями, которые установили, в частности, что перитонеальные макрофаги крысы, инфицированные F. tularensis subsp. novicida in vitro, спонтанно высвобождают N02" в количествах, достаточных для подавления роста бактерий (Cowley S.C. et al., 1996). Возможно, это связано с более слабой патогенностью подвида К tularensis subsp. novicida, который также

отличается от других представителей вида К 1и1агеж1.'> и по антигенной структуре (Цимбалистова М.В., Павлович Н.В., 1998).

5 6 7 Штаммы F. tularensis

Рис. 3. Влияние туляремийного микроба разных подвидов на активность NO-синтазы перитонеапьными макрофагами морской свинки (М ± m); * - Р < 0,05 по сравнению с контролем.

В ходе эксперимента получены данные, свидетельствующие о том, что у туляремийного микроба подвидов tularensis и mediasiatica имеется тенденция к ингибированию активности кислороднезависимых бактерицидных систем фагоцитов по сравнению с контролем. Вместе с тем, при поглощении как F. tularensis subsp. holarctica, так и F. tularensis subsp. novicida экзоцитоз НКБ в ПЯЛ морских свинок происходит в 1,2 раза (Р< 0,05) активнее, чем у всех других, исследованных подвидов туляремийного микроба.

В целом, резюмируя представленный фактический материал, можно сделать заключение о том, что туляремийный микроб подвидов tularensis и mediasiatica, обладающий высокой активностью кислой фосфатазы (фактор патогенности F. tularensis), угнетает фагоцитарную способность клеток иммунофашцитарной системы, что, в свою очередь, приводит к незавершенности фагоцитоза. Подтверждением тому является снижение функциональной активности ПЯЛ и макрофагов при взаимодействии с F. tularensis subsp. tularensis и F. tularensis subsp. mediasiatica в большей мере, чем с представителями других исследованных подвидов.

2. Бактерицидные механизмы фагоцитоза F. tularensis в динамике инфекционного процесса, вызванного туляремийным микробом разных подвидов

Несмотря на то, что проблеме изучения возбудителя туляремии посвящено много работ, до сих пор некоторые вопросы иммуногенеза и патогенеза инфекции остаются нераскрытыми (Домарадский И.В., 2005; Ellis J. et al., 2002; Dennis D.T. et al., 2001). Имеющиеся в настоящее время данные литературы из-за их разрозненности и недостаточности сравнительных данных не позволяют пока определить факторы, играющие ключевую или, по крайней мере, ведущую роль в патогенезе Туляремии. Для решения проблемы, носят ли они универсальный или строго индивидуальный характер, необходимо комплексное сравнительное исследование.

В связи с этим, нами была предпринята попытка дать характеристику кис-лородзависимых, нитроксидзависимых и кислороднезависимых бактерицидных механизмов фагоцитоза морских свинок и цитокинпродуцирующую способность

иммунокомпетентных клеток белых мышей при взаимодействии с туляремийным микробом с разными фенотипическими свойствами в условиях in vivo. Для воссоздания экспериментального инфекционного процесса животным вводили подкожно туляремийный микроб всех выбранных для исследования штаммов в дозе 100 КОЕ/мл - 525 морским свинкам и 1 КОЕ/мл - 230 белым мышам.

Установлено, что на 3 сут. в фагоцитах лимфатических узлов морских свинок, инфицированных бактериями F. tularensis подвида holarctica, показатели ФЧ варьировали от 0,5 ± 0,1 до 0,9 ± 0,1 усл.ед.

Надо отметить, что на 3 и 6 сут. наблюдения в лимфатических узлах животных, инфицированных F. tularensis subsp. novicida F 6168 nF. tularensis subsp. mediasiatica A-l 20, показатели ФЧ были достоверно высокими по сравнению с F. tularensis 15, что может указывать на внутриклеточное размножение туляремийного микроба в лимфатических узлах морских свинок этой экспериментальной группы.

Низкие показатели фагоцитарной активности (ПАФ) клеток печени морских свинок выявлены на 3 сут. наблюдения у экспериментальных животных, инфицированных F. tularensis subsp. holarctica И-250 (3,3 ± 0,2 %), F. tularensis subsp. mediasiatica A-120 (4,0 ± 0,2 %) и F. tularensis subsp. tularensis Schu (3,2 ± 0,1 %), no сравнению с другими штаммами. Так, показатели ПАФ в клеток печени морских свинок, инфицированных F. tularensis subsp. holarctica (15, И-94, И-335, И-366), F. tularensis subsp. novicida (F 6168, Utah 112) и F. tularensis subsp. mediasiatica (A-61), на 3 сут. варьировали в пределах от 12,7 ± 1,1 % до 31,7 ± 5,2 % (Р < 0,05) и были в 3,8-9,6 раза выше по сравнению со значениями ПАФ у F. tularensis subsp. holarctica И-250 и F. tularensis subsp. mediasiatica A-120.

Ha 6 сут. показатели ПАФ клеток печени морских свинок, инфицированных туляремийным микробом подвидов tularensis (Schu), holarctica (И-250, И-335) и mediasiatica (А-120) в среднем в 1,3-7,1 раз ниже таковых у морских свинок, инфицированных бактериями остальных штаммов, взятых в эксперимент. Аналогичную закономерность наблюдали и на 9 сут. эксперимента. Надо отметить, что на 6 и 9 сут. наблюдения высокой фагоцитарной активностью обладали клетки печени морских свинок, зараженных F. tularensis subsp. novicida и F. tularensis subsp. mediasiatica (A-61).

Установлено, что после инфицирования морских свинок F. tularensis subsp. holarctica (за исключением вакцинного штамма F. tularensis 15) больших отличий по ФЧ на 3, 6, 9 сут. наблюдения нет (т.е. размножения микроба не установлено). На 6 и 9 сут. показано повышение этого показателя в 3,3-4,6 раза в случае с вакцинным штаммом, активное размножение микробов в фагоцитах печени морских свинок, инфицированных F. tularensis subsp. novicida (в 10,6-15,5 раза по сравнению с 3 сут.). Выявлено увеличение ФЧ у животных, зараженных F. tularensis Schu на 6 сут. в 2,5 раза по сравнению с 3 сут., но, тем не менее, их гибель наступала к 9 сут. Размножение бактерий в клеток печени (в 1,8-2,3 раза) морских свинок на 9 сут. отмечено в группе животных, инфицированных F. tularensis subsp. mediasiatica.

При изучении изменений активности КЗМ фагоцитов в динамике инфекционного процесса отмечен рост показателей НСТ-теста в группе животных, зараженных F. tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. mediasiatica A-120 и F. tularensis subsp. holarctica, на 9 сут., а в случае F. tularensis subsp. novicida и F. tularensis subsp. mediasiatica А-б 1 на 6 сут. наблюдения. Максимальной стимулирующей активностью КЗМ клеток иммунофагоцитарной системы обладает туляремийный микроб F. tularensis subsp. novicida и F. tularensis subsp. holarctica, наименьшие значения показателей НСТ-теста зафиксированы у животных, инфицированных F. tularensis subsp. tularensis и F. tularensis subsp. mediasiatica.

Выявленные в ходе эксперимента различия по влиянию туляремийного микроба с разными фенотипическими свойствами на КЗМ (показатели НСТ-теста) свидетельствует о неодинаковом уровне интенсивности в клетках иммунофагоцитарной системы «респираторного взрыва», что, в свою очередь, может являться обоснованием для интерпретации данных, полученных при изучении завершенности фагоцитоза.

Установленные в ходе экспериментов данные свидетельствуют о том, что показатели активности НАДФ'Н-оксидазы ИКК в лимфатических узлах морских свинок, инфицированных туляремийным микробом разных подвидов, по сравнению с вакцинным штаммом достоверно отличались от значений активности этого фермента только в случае с F. tularensis subsp. mediasiatica и F. tularensis subsp. tularensis (рис. 4).

Лимфатический узел Печень

123456789 10 123456789 10

Селезенка

1 23456789 10

Рис. 4. Активность НАДФ Н-оксидазы фагоцитов лимфатических узлов, печени и селезенки морских свинок, инфицированных F. tularensis (М ± т) на 3 сут.; * - Р< 0,05, ** - Р< 0,001 по сравнению с контролем). 1 - F. tularensis 15; 2 -F. tularensis И-94; 3-Я tularensis И-250; 4-F. tularensis И-335; 5 -F. tularensis И-366; 6 - F. tularensis F 6168; 7 - F. tularensis Utah 112; 8 - F. tularensis A-61; 9 - F. tularensis A-120; 10 - Я tularensis Schu.

Необходимо отметить, что бактерии подвидов F. tularensis subsp. tularensis и F. tularensis subsp. mediasiatica по сравнению с F. tularensis subsp. holarctica и F. tularensis subsp. novicida в условиях in vivo оказывают наибольший ингиби-рующий эффект на активность НАДФ-Н-оксидазы клеток печени и селезенки морских свинок. Вероятным объяснением этому является способность бактерий подвидов F. tularensis subsp. tularensis и К tularensis subsp. mediasiatica продуцировать кислую фосфатазу с высокой активностью, в отличие от голарктического подвида, поскольку этот энзим оказывает супрессирующее действие на «респираторный взрыв» (Reilly T.J. et al., 1996). Причем, если F. tularensis subsp. tularensis и F. tularensis subsp. mediasiatica синтезируют две формы фосфатазы - периплазматическую и мембранно-связанную, то штаммы F. tularensis subsp. holarctica обладают лишь второй формой фермента (Шиманюк Н.Я. и др., 1992). Высокая степень сходства геномов штаммов F. tularensis subsp. tularensis и F. tularensis subsp. mediasiatica, независимо от географического происхождения и их вирулентности отмечена рядом авторов (Цимбалистова М.В., Павлович Н.В., 1998; Broekhuijsen М. et al., 2003).

Как показало проведенное нами исследование, на 3 сут. инфекционного процесса существенных различий по влиянию туляремийного микроба штаммов F. tularensis А-61 (0,50 ± 0,02) и А-120 (0,48 ± 0,02) среднеазиатского подвида на активность НАДФ-Н-оксидазы в ИКК селезенки не выявлено. Показатели НАДФ Н-оксидазы в клетках печени морских свинок, зараженных бактериями штамма F. tularensis А-61, по сравнению с F. tularensis А-120, имели тенденцию к увеличению, но, тем не менее, различия между ними не были достоверными. Активность этого фермента ИКК селезенки и фагоцитов печени животных, инфицированных F. tularensis subsp. holarctica (И-94, И-250, И-335, И-366), была значительно выше (в 1,3-4,6 раза), чем аналогичный показатель у фагоцитов морских свинок, зараженных бактериями подвидов tularensis (F. tularensis Schu), mediasiatica (F. tularensis A-120, F. tularensis А-61) и novicida (F 6168, Utah 112). В целом, активность НАДФ-Н-оксидазы ИКК селезенки и клеток печени на 3 сут. эксперимента была самой высокой.

В динамике инфекционного процесса, вызванного туляремийным микробом подвида novicida, активность НАДФ-Н-оксидазы в ИКК печени морских свинок существенно не отличалась во все сроки наблюдения.

Показатели активности НАДФ-Н-оксидазы в гранулоцитах печени и селезенки морских свинок, зараженных туляремийными бактериями подвидов F. tularensis subsp. novicida F 6168, F. tularensis subsp. novicida Utah 112 и F. tularensis subsp. holarctica 15, И-94, на 6 сут. инфекционного процесса не имели достоверных различий. В этот же срок наблюдения значения показателей активности НАДФ-Н-оксидазы в ИКК селезенки животных, инфицированных F. tularensis subsp. holarctica 15, были в 1,2-1,9 раза выше, чем у морских свинок, зараженных туляремийным микробом этого же подвида (штаммы И-94, И-250, И-335, И-366).

В связи с имеющимися сведениями о наличии у франциселл каталазы, которая в свою очередь принимает участие в разложении перекиси, образуемой

при респираторном взрыве в фагоцитах при контакте с бактериями, тем самым снижая бактерицидную способность клеток, нами была предпринята попытка по изучению активности миелопероксидазной системы ИКК селезенки, лимфатических узлов и клеток печени, морских свинок, инфицированных F. tularensis разных подвидов.

Показано, что F. tularensis subsp. tularensis (Schu) и F. tularensis subsp. media-siatica (A-61 и A-120) ингибируют активность миелопероксидазной системы ПЯЛ морских свинок. Так, активность МПО в ИКК селезенки, лимфатических узлов и клетках печени животных, зараженных F. tularensis Schu, по сравнению с F. tularensis А-61 и А-120 была ниже в 1,8-3,6 раза (Р < 0,05).

Анализируя данные, полученные при изучении влияния F. tularensis subsp. novicida на активность МПО фагоцитов иммунокомпетентных органов морских свинок, можно отметить, что высокие показатели зарегистрированы в лейкоцитах печени и селезенки. Тем не менее, в ИКК лимфатических узлов животных, зараженных F. tularensis subsp. holarctica (15, И-94, И-366) по сравнению с другими исследованными штаммами, активность МПО во все сроки наблюдения была выше. Отмечено ингибирующее влияние F. tularensis subsp. tularensis на состояние миелопероксидазной системы ИКК морских свинок. Значения активности МПО у фагоцитов экспериментальных животных этой группы были в 1,5-5,9 раза ниже (при Р < 0,05) по сравнению с другими.

По нашему предположению, вероятным объяснением этому является наличие у франциссел подвида tularensis кислой фосфатазы с более высокой активностью, по сравнению с другими подвидами (novicida, mediasiatica, holarctica) и каталазы. Кислая фосфатаза является энзимом, который оказывает ингибирующий эффект на респираторный взрыв в фагоцитах. По мнению многих исследователей, кислая фосфатаза внутриклеточных патогенов рассматривается как фактор патогенности, который повышает способность бактерий выживать и размножаться в макроорганизме. Каталаза туляремийных микробов в условиях конкуренции с МПО фагоцитов утилизирует перекись водорода, образуемую в результате респираторного взрыва при фагоцитозе, снижая тем самым антибактериальный эффект системы МПО в отношении F. tularensis. В связи с этим считается, что каталаза играет важную роль в устойчивости бактериальных патогенов в отношении кислородзависимых бактерицидных механизмов фагоцитов и может быть отнесена к группе факторов персистенции бактерий (Брудастов Ю.А. и др., 2001).

При изучении влияния туляремийного микроба разных подвидов на продукцию N02~ нами показано (рис. 5), что F. tularensis subsp. holarctica 15 и F. tularensis subsp. mediasiatica A-120 оказывают достоверное стимулирующее воздействие на каталитическую способность NOS на 3 и б сут. с последующим снижением на 10 сут. по сравнению с контролем (клетки интактных животных). Так, у морских свинок, инфицированных F. tularensis 15, концентрация NOa~ была выше, чем в контроле, в 3,9 раза на 3 сут. наблюдения, в 1,5-на 6 сут. (прир < 0,05), а на 10 сут. различия не были достоверными (1,3 раза).

Е315В ЕЗИ-250 ИИ-366 El F 6168 EJA-120 ША61 ElSchu ПКоитропь

3 6 10

Срокнаблкщения, сут

Рис. 5. Влияние туляремийного микроба разных подвидов на активность NOS пери-тонеальных макрофагов в условиях in vivo (M ± m). * - Р < 0,05 по сравнению с контролем.

Следует отметить, что бактерии F. tularensis остальных штаммов усиливают внеклеточное накопление N02~ у морских свинок к 10 сут. наблюдения, но тем не менее это увеличение выработки N02~ у фагоцитов по сравнению с 3 сут. было достоверным (Р < 0,05) только в случае F. tularensis subsp. holarclica И-250 и F. tularensis subsp. tularensis Schu. Возможно, это связано с тем, что при воспалительном и иммунном ответе на антигенную стимуляцию экспрессируется индуцибельная форма NOS, каталитическая реакция которой ведет к медленному (постепенному) накоплению N02~.

Сравнительный анализ полученных данных между группами обследованных животных, в зависимости от инфицирующего агента, показал, что неспецифическая резистентность (ингибирующий эффект на выработку NO-синтазы фагоцитов) в ответ на внедрение патогена зависит от подвидовой принадлежности туляремийного микроба и его вирулентности.

Достоверное ингибирование активности NO-синтазы фагоцитов, выявленное нами при взаимодействии с F. tularensis subsp. tularensis, тенденция к ее снижению в случае с F. tularensis subsp. mediasiatica по сравнению с контролем (не стимулированные фагоциты) и F. tularensis subsp. holarctica, возможно, объясняется тем, что у туляремийных бактерий обнаружен ген, продукты которого являются антагонистами монооксида азота и могут противодействовать антимикробной активности фагоцита при внутриклеточной инфекции (Fang F.C., 1997; Broekhui-jsen M. et al., 2003).

Полученные в ходе эксперимента данные могут служить прогностическим критерием для отслеживания нарушений со стороны неспецифического иммунитета, вызванных внедрением возбудителя туляремии, и поиску адекватных мер их коррекции, так как NO, синтезируемый индуцибельной NOS, является важным медиатором воспалительных процессов и апоптоза (DeLeo F.R., 2004).

Цитокины регулируют реакции врожденного и адаптивного иммунного ответа при многих инфекционных болезнях, в том числе и туляремии (Олсуфьев Н.Г., Мещерякова И.С., 1982; Sjostedt A.B., 2005). ИЛ-1а выступает в качестве одного из главных медиаторов, ответственных за развитие неспецифических форм защиты, формирование местной воспалительной реакции и острофазного ответа

на уровне организма при инфекционном поражении (Johansson A. et al., 2004). ФНО-а играет чрезвычайно важную роль в ранние сроки возникновения воспалительной реакции, т.к. активирует эндотелий и способствует экспрессии адгезивных молекул, что приводит к прилипанию гранулоцитов к внутренней поверхности сосуда. Образуясь местно, в очаге воспаления или при инфекционном процессе, ФНО-а резко повышает фагоцитарную активность моноцитов и нейтрофилов, усиливая процессы перекисного окисления, способствует развитию завершенного фагоцитоза.

Известно, что при развитии неспецифического иммунитета против F. tularensis особая роль отводится и ИФН-у (Lindgren Н. et al., 2004), который не способен непосредственно оказывать влияние на инфекционный агент, но, тем не менее, воздействуя на макрофаги, усиливает их контакт с антителами, повышая способность распознавать антиген. У мышей отсутствие ИФН-у ведет к летальному исходу даже при наименьшей дозе заражения возбудителем туляремии (Домарад-ский И.В., 2005). По литературным данным ФНО-а и ИФН-у играют важную роль в развитии неспецифического иммунитета на начальной стадии инфекционного процесса, вызванного F. tularensis (Анисимов А.П., 2002). К основным противовоспалительным цитокинам относится ИЛ-10. Под его воздействием подавляется антигенпрезентирующая функция макрофагов, в связи со снижением экспрессии главного комплекса гистосовместимости II класса. Однако, при действии на макрофаги иммунных комплексов, продукция ИЛ-10 может резко возрастать, что ведет к снижению противоинфекционной защиты и развитию хронических инфекций. ИЛ-10, являясь иммунодепрессантом, ингибирует цитотоксическую активность, что связано с супрессией костимуляторной функции антигенпрезентирующих клеток (Johansson A. et al., 2004).

Сведения о сравнительном влиянии F. tularensis разных подвидов на способность мононуклеарных фагоцитов вырабатывать провоспалительные и противовоспалительные цитокины в имеющейся литературе отсутствуют. В связи с этим, следующим этапом наших исследований стало данное направление.

Цитокининдуцирующую активность фагоцитов (230 белых мышей массой 18-20 г.) изучали в динамике инфекционного процесса, вызванного туляремийным микробом с разными фенотипическими свойствами.

В контрольных пробах (клетки интактных животных) цитокины не обнаружены. Полученные нами результаты согласуются с литературными данными об отсутствии синтеза медиаторов воспаления без антигенной стимуляции и их продукции и секреции в ответ на действие инфекционных и воспалительных агентов, микробных токсинов, липополисахаридов и т.д. (Lindgren Н. et al., 2004).

Нами показано стимулирующее воздействие туляремийного микроба разных подвидов на выработку провоспалительных цитокинов (ИЛ-1а, ФНО-а, ИФН-у) перитонеальными макрофагами белых мышей in vivo во все сроки наблюдения.

Установлено, что продукция ИЛ-1а была максимальной на 3 сут. с момента заражения животных F. tularensis. Наибольший стимулирующий эффект на синтез этого цитокина фагоцитами оказывали бактерии F. tularensis subsp. novicida. В

данном случае концентрация ИЛ-1а была выше по сравнению с другими группами животных в 9,0 раз (Р < 0,05) и составляла 81,6 ±1,6 пкг/мл.

Показано, что в макрофагах белых мышей, зараженных Е ¡икзгетгя всех исследованных подвидов, продукция ФНО-а происходит во все сроки наблюдения, при этом наибольшие значения (Р < 0,05) уровня ФНО-а зарегистрированы у животных, инфицированных туляремийным микробом подвида поук1с!а (15,42 ± 1,12 пкг/ мл), а минимальная концентрация ФНО-а отмечена у белых мышей, зараженных бактериями Е Ш1агепя1х БиЬвр. Ыагети. Полученные в ходе эксперимента данные, на наш взгляд, могут частично объяснить ингибирующий эффект туляремийного микроба подвида Ы1агет1$ на бактерицидные механизмы фагоцитоза,

Показано, что достоверные максимальные значения концентрации ИФН-у были у мышей, инфицированных Е Ш1агет'ч зиЬяр. тесИа.ч1аИса и Е 1и1агет1.5 виЬар. иоу/«ййя, на 3 сут. после заражения. Наименьший уровень ИФН-у зарегистрирован в группе животных, зараженных туляремийным микробом подвида Ыагет'ю (рис. 6).

ОД виЬзр псплсШа БиЬзртесГ^аЬ'са

М. зиЬзр.МагсЬ'са ПР. №1. зиЬзрЛиЬгег^

Сроки наблюдения, сут

Рис. 6. Влияние Р. МагепБ/з разных подвидов на продукцию ИФН-у перитонеальными макрофагами белых мышей (М ± т).

В ходе экспериментов установлено, что перитонеальные макрофаги белых мышей, инфицированных Е /н/отет«, продуцируют ИЛ-10 во все сроки наблюдения независимо от подвидовой принадлежности. Высокие (Р < 0,001) значения ИЛ-10 отмечены в образцах, полученных от животных, зараженных Е Ш1агет1з виЬвр. /м/дгеш'м, в сравнении с другими подвидами. Так, в этом случае, на 3 сут. содержание ИЛ-10 было в 1,3-1,5 раза, на 6 сут. в 1,5-4,4 раза и на 9 сут. в 1,4-4,0 раза выше, чем в других пробах. Максимальные показатели ИЛ-10 имели место у мышей, зараженных Е Ш1агет1х виЬБр. 1и1агетЬ (92,0 ± 4,0), Е Ш1агет1$ виЬвр. тесИамайса (46,1 ± 2,1), Е 1и1агепя15 виЬэр. Ио1агсйса (63,0 ± 8,1) и Е ¡и!агеп.пч виЬэр. novicida (21,2 ± 0,7) на 6 сут. наблюдения. Тем не менее, во все сроки наблюдения минимальные значения содержания ИЛ-10 отмечены в супернатанте из перитонеального экссудата белых мышей, зараженных Е ш1агет'№ вчЬвр. novicida. Полученные нами данные согласуются с мнением других авторов о том, что в ответ на введение патогена в начальной стадии инфекционного процесса клетки иммунофагоцитарной системы секретируют провоспалительные цитокины, и лишь впоследствии сравнительно небольшое количество ИЛ-10 (Кузник Б.И., 2004).

Сравнительный анализ полученных данных указывает на то, что активность неспецифических защитных систем макроорганизма при взаимодействии с ту-

ляремийным микробом зависит от его подвидовой принадлежности. Нами установлено, что F. tularensis разных подвидов стимулирует продукцию фагоцитами провоспалительных цитокинов с максимумом значений на 3 сут. инфекционного процесса. Вероятным объяснением этому факту служит то, что именно в эти сроки туляремийный микроб попадает в регионарные лимфатические узлы, где происходит его размножение и развитие воспалительного процесса, так называемая фаза первичных, регионарно-очаговых и общих реакций (Олсуфьев Н.Г., 1975). Наиболее выраженным стимулирующим эффектом на продукцию провоспалительных цитокинов обладает F. tularensis subsp. novicida. Минимальные значения концентрации ИЛ-1а, ФНО-а, ИФН-у зарегистрированы в образцах, полученных от животных, зараженных F. tularensis subsp. tularensis. Таким образом, цитокинпродуцирующая способность клеток иммунофагоцитарной системы при взаимодействии с бактериями этого подвида снижена, медиаторы воспаления (ИЛ-1а, ФНО-а, ИФН-у) не обеспечивают достаточного уровня хемотаксиса гранулоцитов и моноцитов, усиление фагоцитоза и микробицидность фагоцитов, их дегрануляцию, продукцию и секрецию супероксидных и нитроксидных радикалов, вследствие чего наступает гибель животного.

Выявлено сходство реакций, обеспечивающих внутриклеточную инактивацию изученных микроорганизмов F. tularensis разных подвидов, что указывает на однотипность клеточных механизмов неспецифической резистентности макроорганизма. Универсальным свойством фагоцитов экспериментальных животных, проявляющимся при контакте и последующем внедрении F. tularensis subsp. novicida и, в отдельных случаях, F. tularensis subsp. holarctica, является активация механизмов микробицидности, связанных с «респираторным взрывом», в частности повышением активности НАДФ-Н-оксидазы, а также глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Общим итогом взаимодействия макрофагов и ПЯЛ с возбудителем туляремии с разными фенотипическими свойствами в большинстве случаев (70-80 %) является незавершенный характер фагоцитоза, вследствие чего обеспечивается возможность переживания и последующего размножения патогенных бактерий в макроорганизме. Главными причинами, лимитирующими реализацию бактерицидного потенциала фагоцитов морских свинок, является ингибирование F. tularensis subsp. tularensis и F. tularensis subsp. mediasiatica действия микробицидных факторов. Благодаря этому обеспечивается возможность длительное время персистировать в цитоплазме фагоцитов, что и объясняет незавершенный характер фагоцитоза.

Таким образом, очевидно, что дисбаланс бактерицидных процессов, развивающихся в фагоцитирующих F. tularensis (особенно подвида tularensis и в отдельных случаях - mediasiatica) клетках с угнетением широкого спектра функций фагоцитов, играет важную роль в проявлении патогенных свойств туляремийного микроба и исходе вызываемого им инфекционного заболевания. Результаты проведенных исследований дополняют новыми научными данными сведения о современном состоянии взаимоотношения микроб - фагоцит, пополняя теоретическую основу и намечая направления изысканий в области изучения механизмов формирования резистентности макроорганизма к возбудителю туляремии.

На основе полученных экспериментальных данных предложена концептуальная схема механизмов формирования резистентности организма к возбудителю туляремии с разными фенотипическими свойствами (рис. 7).

Ргапс1аеПа Шагет!*

$иЪ*р^ЮУ1сШа | | виЬвр. Ьо/агсйса | | 8цЬ5р. пккЙа5<аАса | | биЬар.^аге/Ы»

_ (*) | . 0 О

Макроорганизм

Фагоцитарноакгивные клетки

Кислородзави« симые (НСТ-тест, Г6ФДГ. НАДФН-оксидаза, МПО) и кислороднвзави-

еимые (НКБ) бактерицидные системы

Иммунокомпетентные органы

мдг Нитроксидзави-

симые (N0-

синтаза)

бактерицидные

системы

4 и!

Синтез цитокинов

Бластгранс-формация, пролиферация, дифференциация лимфоцитов

Созревание антигенспецифимеских лимфоцитов и плазмоцитов

Завершенность фагоцитоза

Р. Мэгепэ/з эр. ткМсШа -100 % Я <и!агеп$1$ $р. Ьо1агсИса - 80-90 "/<

Р. ¿и/а геля/а ер. Шагеп&з -100 % Р. (и/агепз(5 ар. теЛ^'айса - 40-50 %

Рис. 7. Концептуальная схема включения бактерицидных механизмов фагоцитоза Р. ?и/агел$& разных подвидов в эксперименте. | - активация; | - ингибирова-ние; (+) - завершенный, (-) - незавершенный фагоцитоз.

ВЫВОДЫ

1. Фагоцитоз Е ш/агетшз макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами экспериментальных животных является преимущественно незавершенным (70-80 %), вследствие чего происходит переживание и последующее размножение патогенных бактерий в макроорганизме. В отличие отЕ Магет1$ виЬзр. шЫгет'т,

F. tularensis subsp. mediasiatica и F. tularensis subsp. holarctica, фагоцитоз F. tula-rensis subsp. novicida клетками иммуиофагоцитарной системы носит завершенный характер.

2. Цитопатическое действие вирулентных туляремийных микробов выявляется у 40-60 % макрофагов морских свинок. При фагоцитозе микробов подвида novicida деструктивные изменения в макрофагах выражены слабо и возникают в более поздние сроки (180 мин), чем при фагоцитозе вирулентных микробов F. tularensis subsp. tularensis и F. tularensis subsp. mediasiatica (30 мин).

3. Функциональная способность клеток иммуиофагоцитарной системы в условиях как in vitro, так и in vivo в отношении F. tularensis subsp. novicida выражена в большей степени, чем F. tularensis subsp. tularensis и F. tularensis subsp. mediasiatica, что характеризуется высокими показателями НСТ-теста, активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, НАДФ-Н-оксидазы, миелопероксидазы, неферментных катионных белков и NO-синтазы.

4. Туляремийный микроб, независимо от подвидовой принадлежности, в условиях in vivo стимулирует синтез медиаторов воспаления (ИЛ-1 а, ФНО-а, ИФН-у). Цитокинпродуцирующая способность иммунокомпетентных клеток белых мышей при взаимодействии с F. tularensis subsp. novicida характеризуется высокими показателями ИЛ- 1а, ФНО-а, ИФН-у и низкими значениями ИЛ-10 по сравнению с F. tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. mediasiatica и F. tularensis subsp. holarctica, что обеспечивает запуск иммунных реакций, способствующих завершенности фагоцитоза в отношении возбудителя туляремии подвида novicida.

5. Предложена и научно обоснована концептуальная схема особенностей формирования резистентности организма экспериментальных животных к возбудителю туляремии разных подвидов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Особенности фагоцитоза туляремийного микроба разных подвидов /

B. И. Дубровина, С. А. Татарников [и др.] // Фундаментальная наука и практика: Российский медицинский форум. - Москва (18-20 окт. 2006 г.). - М., 2006. - С. 46.

2. Татарников С. А. Современное состояние вопроса роли клеточных факторов в патогенезе туляремии // Сиб.-Восток. - 2006. - Вып. 10. - С. 21-24.

3. Особенности патогенеза туляремии / В. И. Дубровина, Ж. А. Коновалова,

C. А. Татарников и др. // Деп. в ВИНИТИ 26.02.2007, № 166-В2007. - 13 с.

4. Возможность использования в целях диагностики и профилактики туляремии показателей неспецифической резистентности морских свинок в отношении Francisella tularensis 1 В. И. Дубровина, Ж. А. Коновалова, С. А. Татарников [и др.] // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стртегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ. - Саратов, 2007.-С. 198-200.

5. Активность фагоцитов при взаимодействии с туляремийным микробом разных подвидов / В. И. Дубровина, А. И. Бельков, Ж. А. Коновалова, С. А. Татар-

ников [и др.] // Вестник Иркутского университета: Ежегодная научн.-теор. конф. аспирантов и студентов: материалы. - Иркутск, 2007. - С. 13-14.

6. Определение функционального состояния фагоцитов в качестве показателя неспецифической защиты организма / В. И. Дубровина, Ж. А. Коновалова, О. Б. Колесникова, С. А. Татарников [и др.] // Реф. сб. - Саратов, 2008. - Вып. 11.- С. 14.

7. Функционально-метаболическая активность фагоцитов при взаимодействии с туляремийным микробом разных подвидов / В. И. Дубровина, С. А. Татарников [и др.] // Мед. паразитология и паразитарные болезни. -2008. -№ 1. - С. 17-21.

8. Влияние липополисахарида туляремийного микроба на метаболическую активность фагоцитов / В. И. Дубровина, В. В. Войткова, В. Б. Николаев, С. А. Татарников [и др.] // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - Иркутск, 2008. - Т. 60, № 2. - С. 65-67.

9. Влияние туляремийного микроба разных подвидов на бактерицидные системы фагоцитов / В. И. Дубровина, С. А. Татарников [и др.] // Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. - Киров, 2008. - С. 176.

10. Сравнительная оценка влияния ЛПС туляремийного микроба разных подвидов на активность бактерицидных систем фагоцитов in vitro / В. И. Дубровина, С. А. Татарников [и др.] // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: Материалы Междунар. симп., 2-4 июня 2008 г. - СПб., 2008. - С. 93.

11. Показатели функционального состояния иммунокомпетентных клеток экспериментальных животных при взаимодействии in vitro с липополисахаридом туляремийного микроба / В. И. Дубровина, Ж. А. Коновалова, С. А. Татарников [и др.] // Current issues on zoonotic diseases. - 2008. -№ 16. - P. 268-273.

12. Витязева С. А., Татарников С. А., Войткова В. В. Морфологическая оценка изменений иммунокомпетентных органов животных, инфицированных туляремийным микробом И XII Всероссийская мед.-биол. научн. конф. молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина», СПб, 18-19 апр. 2009 г.. - СПб., 2009. - С. 70-71.

13. Коновалова Ж. А., Татарников С. А., Войткова В. В. Цитокинпродуцирующая активность мононуклеарных фагоцитов при экспериментальной туляремии // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины : научн.-практ. конф. молодых ученых и специалистов, СПб (14 мая 2009 г. - СПб., 2009. - С. 49-50.

14. Идентификация геномных областей pdpD и pdpAy туляремийного микроба разных подвидов / С. А. Татарников [и др.] // Биологическая безопасность в современном мире: научн.-практ. конф. молодых ученых и специалистов научно-исслед. учреждений Роспотребнадзора, Оболенск, 21-22 апр. 2009 г. - Оболенск, 2009.-С. 69-71.

15. Изучение влияния Francisella tularensis in vivo на иммунный ответ макроорганизма экспериментальных животных / В. И. Дубровина, С. А. Татарников [и др.] // Журнал инфекционной патологии. - 2009. - Т. 16, № 3. - С. 103-104.

16. Морфологическая характеристика изменений иммунокомпетентных органов морских свинок, зараженных различными подвидами возбудителя туляремии

/ С. А. Витязева, Т. П. Старовойтова, В. И. Дубровина, С. А. Татарников [и др.] // Журнал инфекционной патологии. - 2009. - Т. 16, № 3. - С. 86-87.

17. Морфологическая оценка изменений в иммунокомпетентных органах морских свинок, зараженных Francisella tularensis разных подвидов / С. А. Витязева, Т. П. Старовойтова, В. И. Дубровина, С. А. Татарников [и др.] // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. - 2009. - Т. 64, № 4. - С. 77-79.

18. Саппо С. Г., Татарников С. А., Мазепа А. В. Характеристика патогенности возбудителя туляремии разных подвидов по экспериментально-морфологическим данным // Деп. В ВИНИТИ - Иркутск, 2009. - 35 с. - Библиогр.: 32 назв. - Рус. - 353 - В2009.

19. Саппо С. Г., Татарников С. А., Мазепа А. В. Патоморфологические изменения у морских свинок, вызываемые Francisella tularensis subsp. mediaasiatica // Журнал инфекционной патологии. - 2009. - Т. 16, №3 .-С. 189-190.

20. Саппо С. Г., Татарников С. А., Мазепа А. В. Патоморфологическая характеристика экспериментальной туляремии морских свинок, вызванной Francisella tularensis subsp. novicida I! Журнал инфекционной патологии. - 2009. - Т. 16, № 3. - С. 190.

21. Влияние липополисахарида туляремийного микроба разных подвидов на клеточные факторы иммунитета / Ж. А. Коновалова, В. В. Войткова, С. А. Татарников [и др.] // II Ежегодный Всероссийский Конгресс по инфекционным болезням. -М., 2010. - С. 150-151.

22. Influence of Francisella tularensis of different subspecies on cytokine-producing ability of phagocytes in experiment / Z. A. Konovalova, V. I. Dubrovina, S. A. Tatarnikov [et al.] // Current issues on zoonotic diseases. - 2010. - N 18. - P. 226-230.

23. Влияние туляремийного микроба разных подвидов на функциональную активность иммунокомпетентных клеток экспериментальных животных / В. И. Дубровина, С. А. Татарников [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. - 2010. -№105 (4).-С. 51-55.

24. Сравнительная характеристика гематологических изменений периферической крови морских свинок, зараженных различными подвидами возбудителя туляремии / С. А. Витязева, Т. П. Старовойтова, В. И. Дубровина, С. А. Татарников [и др.] // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. - 2010. - Т. 65, № 1. - С. 63-67.

25. Изучение областей генома pdpA и pdpD «островка патогенности» туляремийного микроба с применением ПЦР / В. И. Бельков, С. А. Татарников [и др.] // Вестник Иркутского университета: Ежегодная научн.-теор. конф. аспирантов и студентов. - Иркутск, 2010. - С. 45^46.

Список документов по внедрению научных достижений в практику:

1. Дубровина В. И., Коновалова Ж. А., Колесникова О. Б. Татарников С. А. и др. Определение функциональной способности фагоцитов в качестве показателя неспецифической защиты организма: Метод, рекомендации / Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. - Иркутск, 2008. - 10 с.

2. Витязева С. А., Старовойтова Т. П., Дубровина В. И., Татарников С. А., Войткова В. В. Оценка компенсаторно-восстановительных процессов организма животных, инфицированных туляремийным микробом разных по индексу нейтро-фильного сдвига и патологической зернистости нейтрофилов: Метод, рекомендации / Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. - Иркутск, 2009. - 7 с.

3. Николаев В. Б., Марков Е. Ю,, Татарников С. А. и др. Получение липополи-сахариднош антигена туляремийного микроба: Метод, рекомендации / Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. - Иркутск, 2010. — 5 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода

Г6ФДГ - глкжозо-6-фосфатдегидрогеназа

ИЗФ - индекс завершенности фагоцитоза

ИКК - иммунокомпетентные клетки

ИЛ - интерлейкины (1,6 и т.д.)

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФН-у - интерферон гамма

КЗМ - кислородзависимый метаболизм

кДа - килодальтон

КОЕ - колониеобразующая единица

пп - доза испытуемого агента, вызывающая гибель 50 % взятых

' 'М50 в опыт животных

мкМ - микромоль

м.м. - молекулярная масса

МПО - миелопероксидаза

НАДФ - никотинамидадениндинуклеотид фосфат

НАДФН - никотинамидадениндинуклеотид фосфат восстановленный

НСТ-тест - тест с нитросиним тетразолием

НКБ - неферментные катионные белки

ПАФ - процент активных фагоцитов

ПМ - перитонеальные макрофаги

п.н. - пар нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЯЛ - полиморфноядерные лейкоциты

СМФ - система мононукпеарных фагоцитов

ФИ - фагоцитарный индекс

ФНО-а - фактор некроза опухолей альфа

ЦПА - цитохимический показатель активности

FPI - остров латогенности F. tularensis

pdpA - область генома

pdpD - область генома

NO - окись азота

NOS - фермент NO-синтаза

subsp. - подвид (subspecies)

Подписано в печать 15.11.2010. Бумага офсетная. Формат 60x84'/ Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ №361-10. _

РИО НЦ PBX СО РАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1. Тел 29-03-37. E-mail: arleon58@gmail.com)

Актуальность проблемы

Несмотря на продолжительную историю изучения туляремии и ее возбудителя, механизм патогенности туляремийного микроба недостаточно исследован. Возбудитель туляремии интересен и с точки зрения изучения механизмов иммуногенеза, поскольку обеспечивает развитие резистентности организма к повторному заражению.

Известно, что Francisella tularensis является одним из наиболее вирулентных микроорганизмов, заражающая доза которого для человека при аэрогенном заражении составляет 10 микробных клеток [28, 196]. Из-за высокой вирулентности туляремийный микроб рассматривается как один из наиболее вероятных средств биотерроризма [12, 127, 198].

Природные очаги туляремии, выявленные первоначально в Северной Америке, а в последующие годы и в других регионах земного шара, обнаружены и на обширных территориях как России, так и ряда сопредельных государств, что создает потенциальную угрозу для проживающего здесь населения.

В соответствии с современными представлениями [131], возбудитель туляремии — Francisella tularensis имеет четыре подвида — F. tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. holarctica, F. tularensis subsp. mediasia-tica и F. tularensis subsp. novicida, которые различаются между собой по ряду биологических свойств, в том числе по кардинальному признаку — вирулентности для макроорганизма [101].

Накопленные к настоящему времени научные сведения однозначно свидетельствуют о том, что патогенность бактерий, в том числе и F. tularensis, является биологически сложным полидетерминантным признаком, находящимся под контролем регуляторных систем как хромосомных, так и плазмидных генов, которые ответственны за синтез макромолекул, принимающих участие в развитии генерализованного инфекционного процесса [2, 12, 196]. Способность многих патогенных бактерий к паразитированию в фагоцитах, играющая важную роль в патогенезе инфекции, обусловлена генетическим детерминированием этого признака на хромосомном и (или) плазмидном уровнях [55,190].

Известно, что F. tularensis является внутриклеточным паразитом, поэтому ведущим звеном в защите организма хозяина является клеточный фактор [10, 12, 14, 28, 188, 196]. Очевидно, что выживание и последующее размножение туляремийного микроба в фагоците является начальным механизмом патогенеза инфекции [62, 176, 196]. Недавно показано, что туляремийный микроб может выживать и размножаться и внутри амебы Acanthamoebae castellani [186], что свидетельстует о возможной роли простейших в качестве резервуара туляремийного патогена в окружающей среде.

В качестве немногих установленных детерминант вирулентности F. tularensis рассматриваются клеточная капсула [129] и белок молекулярной массой 23 кДа, при инактивации которого снижаются вирулентность и способность туляремийного микроба выживать в макрофагах [136]. Предполагается, что с белком 23 кДа связана также способность этого микроба подавлять образование макрофагами ФНО-а и ИЛ-1а [116].

Основное внимание исследователей в последние годы было направлено на изучение хромосомных факторов патогенности туляремийного микроба и их влияния на механизмы внутримакрофагального роста, внутри-амебного выживания и вирулентности [55, 69, 122, 158, 188, 189].

Работы, касающиеся фагоцитоза туляремийного микроба, затрагивают, в основном, отдельные этапы взаимодействия F. tularensis с иммуно-компетентными клетками [10, 14, 32, 35, 116, 149, 152]. Между тем, главное звено фагоцитоза - бактерицидные реакции фагоцитов при их взаимодействии с F. tularensis и закономерности этих реакций - изучены в меньшей мере. В связи с этим, сравнительное изучение фагоцитоза туляремийного микроба с разными биологическими свойствами помимо научного интереса в раскрытии механизмов и особенностей этого процесса, будет способствовать пониманию патогенеза туляремии и, возможно, экспериментальному обоснованию механизмов его циркуляции в природных очагах.

На основании вышеизложенного целью работы является выяснение роли бактерицидных механизмов фагоцитоза туляремийного микроба разных подвидов клетками иммунофагоцитарной системы in vitro и в динамике инфекционного процесса.

Для достижения поставленной цели последовательно решались следующие основные задачи:

1. Выявить особенности фагоцитарной способности макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов морских свинок при их взаимодействии в условиях in vitro с туляремийным микробом разных подвидов.

2. Исследовать особенности бактерицидных реакций фагоцитов экспериментальных животных в ответ на воздействие туляремийного микроба разных подвидов.

3. Дать сравнительную оценку действия F. tularensis разных подвидов на цитокинпродуцирующую активность перитонеальных макрофагов белых мышей.

4. Выяснить особенности бактерицидных механизмов фагоцитоза F. tularensis разных подвидов в динамике развития инфекционного процесса.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное сравнительное исследование особенности формирования неспецифической резистентности организма экспериментальных животных (белых мышей и морских свинок) к возбудителю туляремии с разными фенотипическими свойствами.

Новыми являются сведения о том, что усиление продукции противовоспалительного (ИЛ-10) и провоспалительных (ФНО-а, ИЛ-1а, ИФН-у) цитокинов фагоцитами под действием туляремийного микроба зависит от его подвидовой принадлежности и вирулентности. Показано, что наиболее выраженным стимулирующим эффектом на синтез ИЛ-1а, ФНО-а, ИФН-у обладает Р. Ш1агет($ БиЬзр. потс1с{а. Установлено, что снижение продукции ИЛ-1а, ФНО-а, ИФН-у и активация ИЛ-10 фагоцитами животных, зараженных Р\ Ыагет18 БиЬэр. Ш1агет1з, приводит к угнетению их функциональной способности и, как следствие, — к снижению противоинфекци-онной защиты и гибели животного.

Экспериментально доказано, что бактерии Р. ийагетгъ йиЬэр. Ь.о1агсйса и Р. Шагет1$ БиЬзр. novicida активируют, а Т7. ш1агет1Б БиЬэр. ийагет'м и Т7. ш1агет1Б эиЬзр. тей'ш81аИса ингибируют системы, способствующие захвату (адгезия и поглощение) и внутриклеточной деградации микроба (ки-слородзависимые, нитроксидзависимые и кислороднезависимые бактерицидные факторы).

Приоритетными являются данные о том, что ген, кодирующий белок Рс1рА, определяет ряд дополнительных факторов патогенности, обусловливающих повышение устойчивости Р. Ш1агет1$ к фагоцитозу и последующей деструкции в макрофагах и ПЯЛ. Утрата у штаммов области рс1рА способствует выживанию экспериментальных животных, инфицированных возбудителем туляремии.

Теоретическое и практическое значение работы

На основании проведенных исследований молекулярно-биоло-гических механизмов патогенеза туляремии показана роль бактерицидных систем (кислород-, нитроксидзависимых и кислороднезависимых) фагоцитоза.

Получены новые данные о бактерицидных реакциях фагоцитов и их функциональных изменениях в иммунокомпетентных органах экспериментальных животных при инфекционном процессе, вызванном Р. ш1агет18 разных подвидов, которые дополняют теоретические знания и определяют направления изысканий в области изучения механизмов формирования резистентности макроорганизма к туляремийному микробу.

Для оценки неспецифической резистентности организма патогенетически обоснована возможность тестирования показателей функциональной способности клеток иммунофагоцитарной системы экспериментальных животных в ответ на введение патогена.

Экспериментально показано, что наличием области рс1рА и рс1рО в генетической структуре «острова патогенности» Р. Ш1агет18 разных подвидов можно частично объяснить взаимосвязь уровня вирулентности и его подвидовой принадлежности.

Материалы исследований, представленные в диссертации, использованы при составлении методических рекомендаций:

Определение функциональной способности фагоцитов в качестве показателя неспецифической защиты организма» (Иркутск, 2008);

Оценка компенсаторно-восстановительных процессов организма животных, инфицированных туляремийным микробом по индексу нейтро-фильного сдвига и патологической зернистости нейтрофилов» (Иркутск, 2009);

Получение липополисахаридного антигена туляремийного микроба» (Иркутск, 2010).

Разработанные методы внедрены в практику научно-исследовательской работы Иркутского противочумного института, Улан-Удэнского института общей и экспериментальной биологии СО РАН, Новосибирского ГНЦ ВБ «Вектор», Иркутского СИФИБР СО РАН.

Научные и практически значимые материалы исследований включены в лекционные курсы дополнительного послевузовского образования при ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора.

Положения исследования, выносимые на защиту

1. Цитокинпродуцирующая способность фагоцитов при взаимодействии с бактериями Р. ш1агет1Б зависит от их подвидовой принадлежности и вирулентности. При внедрении Р. Нйагет'т БиЬзр. ¡ю1агсйса и Р. Ш1агепя15 subsp. novicida медиаторы воспаления (ФНО-а, ИЛ-1а, ИФН-у) индуцируют активацию эффекторных функций клеток иммунофагоцитарной системы (микробицидность, цитотоксичность, продукция цитокинов, супероксидных и нитроксидных радикалов) в большей степени, чем F. tularens is subsp. tularensis и F. tularensis subsp. mediasiatica.

2. Бактерии F. tularensis subsp. tularensis и F. tularensis subsp. mediasiatica более устойчивы к фагоцитозу и последующей деструкции в макрофагах и ПЯЛ, чем F. tidarensis subsp. holarctica. Фагоцитоз F. tularensis subsp. novicida клетками иммунофагоцитарной системы является завершенным. Факторами, повышающими устойчивость бактерий F. tularensis subsp. tidarensis и F. tularensis subsp. mediasiatica к фагоцитозу, является их способность ингибировать кислородзависимые, кислороднезависимые и нитроксидзависимые бактерицидные системы фагоцитов.

Апробация работы

Материалы, изложенные в диссертации, представлены и обсуждены на:

Международных научных конференциях: «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007); «Природно-очаговые инфекции» (Улан-Батор, 2008-2010);

Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2010);

Всероссийских научных конференциях: «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006); «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология» (Киров, 2008); «Современные аспекты эпидемиологического надзора и профилактики особо опасных инфекций» (Иркутск, 2009);

• конференциях молодых ученых и специалистов: «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины - 2008» (Санкт-Петербург, 2008); «Биологическая безопасность в современном мире»

Оболенск, 2009); «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2009); «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2009); «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2010);

• региональных конференциях: «Научно-теоретическая конференция аспирантов и студентов Иркутского государственного университета» (Иркутск, 2007-2010);

• научных конференциях Иркутского противочумного института (Иркутск, 2004-2010).

Диссертация оформлена на основе материалов плановой темы с № ГР 0120.0013859 (2006-2009 гг.) и результатов текущей НИР с № ГР 0120.0807000 (2008-2010 гг.).

Публикации: По теме диссертации опубликованы 25 научных работ, в том числе 5 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, две в иностранных журналах.

Личный вклад соискателя. Автору принадлежит ведущая роль в проведении экспериментов, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, иллюстрирована 17 таблицами и 16 рисунками. Список литературных источников содержит 205 наименований, в том числе 152 — зарубежных.

ВЫВОДЫ I

1. Фагоцитоз F. tularensis макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами экспериментальных животных является преимущественно незавершенным (70—80 %), вследствие чего происходит переживание и последующее размножение патогенных бактерий в макроорганизме. В отличие от F tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. mediasiatica и F. tularensis subsp. holarctica фагоцитоз F. tularensis subsp. novicida клетками иммунофагоцитар-ной системы носит завершенный характер.

2. Цитопатическое действие вирулентных туляремийных микробов выявляется у 40-60 % макрофагов морских свинок. При фагоцитозе микробов подвида novicida деструктивные изменения в макрофагах выражены слабо и возникают в более поздние сроки (180 мин), чем при фагоцитозе вирулентных микробов F. tularensis subsp. tularensis и F. tularensis subsp. mediasiatica (30 мин).

3. Функциональная способность клеток иммунофагоцитарной системы в условиях как in vitro, так и in vivo в отношении F. tularensis subsp. novicida выражена в большей степени, чем F. tularensis subsp. tularensis и F. tularensis subsp. mediasiatica, что характеризуется высокими показателями НСТ-теста, активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, НАДФ-Н-оксидазы, миелопе-роксидазы, неферментных катионных белков и NO-синтазы.

4. Туляремийный микроб, независимо от подвидовой принадлежности, в условиях in vivo стимулирует синтез медиаторов воспаления (ИЛ- 1а, ФНО-а, ИФН-у). Цитокинпродуцирующая способность иммунокомпетентных клеток белых мышей при взаимодействии с F. tularensis subsp. novicida характеризуется высокими показателями ИЛ-1а, ФНО-а, ИФН-у и низкими значениями ИЛ-10 по сравнению с F. tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. mediasiatica и F. tularensis subsp. holarctica, что обеспечивает запуск иммунных реакций, способствующих завершенности фагоцитоза в отношении возбудителя туляремии подвида novicida.

5. Предложена и научно обоснована концептуальная схема особенностей формирования резистентности организма экспериментальных животных к возбудителю туляремии разных подвидов.