Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Особенности дифференцировки и созревания дендритных клеток под воздействием факторов различной природы

На правах рукописи

ЧИКИЛЕВА ИРИНА ОЛЕГОВНА

ОСОБЕННОСТИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ И СОЗРЕВАНИЯ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ ФАКТОРОВ

РАЗЛИЧНОЙ ПРИРОДЫ

14.00.36 -аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

<0/ ^¿У

Москва-2006

Работа выполнена в ГУ Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН и ОАО «Институте инженерной иммунологии»

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор Михаил Валентинович Киселевский Кандидат биологических наук Раиса Николаевна Василенко

Официальные оппоненты:

1. Доктор медицинских наук профессор Всеволод Андреевич Ляшенко

2. Доктор биологических наук профессор Валентина Николаевна Байкова

Ведущее учреяедение: Институт иммунологии, МЗ СР РФ.

Защита состоится /¿^лЛ'Сл 2006 г. в /^-¿УО часов на

заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН (105064, г. Москва, Малый Казенный переулок, д. 5а)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН

Автореферат разослан « » /У^Л7!^? 2006 г. Ученый секретарь диссертационного ?

кандидат биологических наук

И. В. Яковлева

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Исследование свойств дендритных клеток (ДК) представляет собой одно из наиболее интересных и перспективных направлений современной иммунологии. Это обусловлено тем, что ДК играют ключевую роль в инициации и регулировке реакций врожденного и приобретенного иммунитета [Fernandez N. et al., 2002, Ferlazzo G. et al., 2004, Rossi M. & Young J. W., 2005, Schott M., 2006].

Функциональная активность ДК зависит от различных факторов. Так, в зависимости от состава среды, условий культивирования клеток-предшественников, факторов созревания и др. можно получить ДК с различными свойствами. Одни из них будут индуцировать иммунный ответ по Thl/Th2 типу, другие, наоборот, активировать регуляторные Т-клетки (Трег) и приводить к иммуносупрессии (толерогенные ДК). Известно, что факторы созревания, прибавляемые к ДК при инкубации с антигеном, существенным образом влияют на их способность к миграции в лимфатические узлы и представлению антигена Т-лимфоцитам [Dhodapkar М. V. & Bhardwaj N., 2000, Schott М., 2006].

Как было показано в недавних работах, ЛПС различных видов бактерий и даже ЛПС одного и того же штамма, культивируемого в различных условиях, по-разному действуют на иммунную систему хозяина [Dixon D. R. & Darveau R. P., 2005]. Несмотря на то, что ЛПС традиционно используют в лабораторной практике в качестве индуктора созревания ДК, отсутствуют данные о сравнительном действии на ДК ЛПС различных видов бактерий. Отсутствуют также данные о действии на ДК ряда белковых факторов вирулентности бактерий. Исследование действия на ДК различных бактериальных антигенов могло бы способствовать уточнению особенностей патогенеза инфекционного процесса и разработке новых подходов к получению вакцин.

Наряду с факторами, повышающими функциональные свойства ДК, существуют соединения, способные ингибировать их активность. Например, ИЛ-10 снижает способность ДК созревать в ответ на провоспалительные

факторы, что приводит к развитию толерогенных ДК, которые не только не стимулируют иммунные реакции, а даже подавляют их [Rossi М. & Young J. W., 2005, Wallet, M. A. et al., 2005]. ДК играют важную роль в индукции и поддержании иммунных реакций на аллергены при астме [Lipscomb М. F. & Masten В. J., 2002]. Один из естественных механизмов предотвращения развития гиперчувствительности к аллергенам, предположительно, заключается в подавлении экспрессии молекул антигенной презентации главного комплекса гистосовместимости 11-го типа (ГКГ-II) на поверхности ДК легких под влиянием аутокринного ИЛ-10 [Lipscomb М. F. & Masten В. J., 2002]. Анализ данных литературы свидетельствует от том, что ИЛ-452 - естественный антагонист ИЛ-4 не активирует последующий сигнальный каскад и конкурирует с ИЛ-4 за общую для них цепь рецептора ИЛ-4Ра. Соотношение этих двух форм ИЛ-4 в организме, по мнению некоторых авторов, играет важную роль в патогенезе атопической астмы [Glare Е. М. et al., 1999, Seah G. Т. et al., 2001] и такого аутоиммунного заболевания, как системный склероз [Sakkas L. I. et al., 1999]. Действие ИЛ-452 на ДК до сих пор не было исследовано.

Ряд исследователей продемонстрировали негативное влияние некоторых ганглиозидов на ДК и другие антигенпредставляющие клетки (АПК) [Shurin G. V., 2001, Shen W. et al., 2002, Wölfl M. et al., 2002, Caldwell S. et al., 2003, Peguet-Navarro J. et al., 2003]. Ганглиозиды — мембранные гликосфинголипиды, содержащие сиаловую (нейраминовую) кислоту. Они представлены в мембранах абсолютно всех клеток и выполняют многообразные биологические функции, включая регуляцию роста, дифференцировки и гибели клеток [Spiegel S. and Merrill, А. Н. JR., 1996]. Качественный состав ганглиозидов изменен в опухолевых клетках [Portoukalian J. et al. 1979, Tsuhida Т. et al., 1987]. Известно, что ганглиозиды способны отщепляться с поверхности опухолевых клеток в окружающую их среду [Bernhard Н. et al., 1989, Portoukalian J. et al., 1993], что вносит значительный вклад в вызываемую раковыми клетками иммуносупрессию [Ladisch S. et al. 1987, Li R. et al., 1995, Heitger A. et al., 1996,

McKallip R. et al., 1999, Deng W. et al., 2000, Kudo D. et al., 2003]. Исследование влияния различных ганглиозидов на ДК представляет собой новое и перспективное направление в иммунологии, существенное для клинической практики при лечении опухолевых заболеваний.

Несмотря на большое количество исследований, посвященных ДК и все возрастающий интерес к ним, многие аспекты их развития (пути дифференцировки, созревания, факторы, влияющие на их способность к представлению антигена и т.д.) изучены не достаточно полно. Все изложенное выше и определило цель настоящего исследования

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ Изучение особенностей дифференцировки и созревания дендритных клеток под действием факторов бактериального (ЛПС, белковые факторы) и эукариотического происхождения (ганглиозиды, цитокины).

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Определить морфологические и иммунофенотипические характеристики ДК при использовании в качестве индукторов созревания ЛПС условно-патогенных и патогенных бактерий {Escherichia coli, Shigella sonnei, Salmonella typhi, Yersinia pestis, Francisella iularensis).

2. Провести сравнительное исследование действия белковых антигенов Y. pestis (фактора вирулентности LcrV и капсульного белка СаП) на иммунофенотип ДК.

3. Исследовать секрецию ДК ФНО-а и ИЛ-1 в присутствии антигенов Y.pestis LcrV и СаП. 7

4. Определить иммунофенотип ДК при их дифференцировке в присутствии ганглиозида GM 1.

5. Изучить особенности иммунофенотипа ДК, дифференцирующихся из моноцитов периферической крови человека в присутствии альтернативного сплайс-варианта ИЛ-4 (ИЛ-482).

6. Исследовать влияние ИЛ-452 на активацию транскрипционного фактора STAT6.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Препараты бактериальных ЛПС значительно различаются по способности индуцировать созревание ДК - от выраженной индукции созревания (ЛПС E.coli) до полного отсутствия эффекта (ЛПС F.tularensis). Белковые факторы вирулентности Y.pestis СаП и LcrV способны модулировать процесс созревания ДК.

2. Ганглиозид GM1 из бычьего мозга подавляют экспрессию на поверхности ДК мыши молекул костимуляции при их развитии из костномозговых предшественников, но не влияет на иммунофенотип полностью развившихся ДК человека.

3. ИЛ-452 не способен стимулировать экспрессию молекул костимуляции (CD 8 6) и антигенной презентации (HLA-DR). При длительной инкубации ДК в присутствии избытка ИЛ-482 наблюдается слабое снижение экспрессии HLA-DR, индуцируемой ИЛ-4. Этот эффект может быть объяснен супрессивным действием альтернативной формы цитокина на активацию ИЛ-4 транскрипционного фактора STAT6.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА Впервые проведено сравнительное изучение особенностей дифференцировки и созревания ДК под действием факторов бактериального (ЛПС, белковые факторы) и эукариотического происхождения (ганглиозиды, цитокины).

Препараты бактериальных ЛПС значительно различаются по способности индуцировать созревание ДК. Наиболее эффективным индуктором созревания дендритных клеток является ЛПС E.coli. ЛПС возбудителя чумы Y. pestis характеризуется менее выраженной способностью индуцировать созревание ДК, а ЛПС возбудителя туляремии F. tularensis вообще не способен индуцировать созревание ДК.

Впервые показано, что белковые факторы вирулентности ЬсгУ и СаП У.резШ оказывают неоднозначное действие на иммунофенотип ДК человека. Секретируемый фактор вирулентности ЬсгУ подавляет экспрессию маркера зрелости ДК СБ83, но стимулирует экспрессию молекул костимуляции СБ80. Капсульный антиген СаП является мощным индуктором секреции ФНО-а и созревания ДК.

Установлено, что ганглиозид вМ1 из бычьего мозга угнетает нормальную дифференцировку ДК мыши, приводя к уменьшению экспрессии молекул костимуляции.

Впервые исследовано действие альтернативной формы ИЛ-4 (ИЛ-452) на диффренцировку ДК. Показано, что ИЛ-452, в отличие от ИЛ-4, не поддерживает экспрессию молекул костимуляции СБ86 и антигенной презентации ГКГ-Н НЬА-ОЯ на поверхности ДК. ИЛ-452 слабо подавляет экспрессию НЬА-БК, индуцируемую ИЛ-4 и оказывает супрессивное действие на активацию транскрипционного фактора БТАТ6, индуцируемую ИЛ-4.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Результаты, полученные при исследовании влияния факторов бактериального и эукариотического происхождения на дифференцировку и созревание ДК, могут быть использованы для оптимизации методов получения вакцин на основе ДК.

Полученные данные об особенностях действия ЛПС возбудителей особо опасных заболеваний {У.резИз и РЛи1агеп51э) и белковых антигенов У.резШ на ДК могут иметь существенное значение для выяснения механизмов взаимодействия патогенных микроорганизмов с иммунной системой хозяина, а также для отбора антигенных компонентов с целью конструирования противоинфекционных профилактических и терапевтических вакцин.

Присутствие иммуносупрессивных ганглиозидов в опухолевых лизатах при нагрузке ими препаратов ДК может существенным образом повлиять на эффективность таких противоопухолевых препаратов. В работе было показано, что ганглиозид вМ1 не влияет на иммунофенотип полностью развившихся

незрелых ДК человека при кратковременной культивации с ним (3 суток). Таким образом, он, по-видимому, не способен негативно повлиять на способность ДК, нагруженных опухолевым лизатом, представлять опухолевые антигены.

Толерогенные ДК могут быть использованы для подавления иммунных реакций при аутоиммунных заболеваний и трансплантации органов. Настоящая работа позволяет предположить, что подобного типа ДК могут быть получены в присутствии ИЛ-482.

Результаты исследований используются в циклах лекций курса «Вакцинопрофилактика» и курса по иммуноонкологии ММА им. И. М. Сеченова.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы исследования доложены на 5-ом конгрессе РААКИ, 2002 г., Москва; на 18-ом Международном Конгрессе по раковым исследованиям, 2002 г., Осло, на XXII Конгрессе Европейской академии аллергологии и клинической иммунологии, 2003 г., Париж, на 16-м Европейском Конгрессе по иммунологии, 2006 г., Париж. Апробация диссертационной работы состоялась 27 апреля 2006 года на совместной научной конференции ОАО Института Инженерной Иммунологии, ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина, РАМН, ГосНИИОХТ и ММА им. И.М. Сеченова.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, в том числе 5 в изданиях, рекомендованных ВАК.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 114 листах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (4 главы), описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и обсуждения (7 глав), выводов и списка литературы (240 источников, 6 отечественных и 234 зарубежных). Текст иллюстрирован 17 таблицами и 21 рисунком.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе было использовано 200 мышей линий СВА весом 20-23 г., содержащихся в условиях вивария ГУ РОНЦ РАМН.

Препараты

ЛПС: E.coli (Sigma), S.sonnei (препарат любезно предоставлен доктором Апариным П. Г., Институт иммунологии, МЗиСР РФ); ЛПС Salmonella typhi (препарат «Пирогенал», филиал «МЕДГАМАЛ» ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи), Y.pestis (вакцинный штамм EV) (любезно предоставлен доктором Анисимовым А. П., ГНИИ прикладной микробиологии г. Оболенск, Московская обл.); F.tularensis (любезно предоставлен доктором Хлебниковым В. С., Институт инженерной иммунологии, пос. Любучаны, Московская обл.). Различные препараты ЛПС были получены методом горячей фенольно-водной экстракции [Westphal О. & Jann К., 1965]. Рекомбинантные белковые антигены Y.pestis СаП и LcrV получены в Институте инженерной иммунологии, пос. Любучаны, Московская обл.

Препарат ганглиозида GM1 из бычьего мозга (Sigma).

Рекомбинантные цитокины: ГМ-КСФ и ИЛ-4 человека и мыши (BioSourcelnternational). Человеческий рекомбинантный ИЛ-452 получен в Институте инженерной иммунологии, пос. Любучаны, Московская обл., как описано в работе: [Птитцын Л. Р. и др., 1999]. Человеческий рекомбинантный ФНО-а (любезно предоставлен Шингаровой Л. Н., Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН).

Получение ДК из моноцитов периферической крови человека и костного мозга мыши

ДК человека получали по стандартной методике [Sallusto F. & Lanzavecchia

А., 1994] из моноцитов периферической крови (МПК) путем их культивации в течении 6 суток в полной среде (RPMI 1640, 10% фетальная телячья сыворотка (ФТС)) в присутствии человеческих рекомбинантных ИЛ-4 (10 нг/мл - 200 U/мл) и ГМ-КСФ (10 нг/мл - 500 U/мл) в СОг-инкубаторе (Jouan) при 37°С в атмосфере 5% С02

ДК мыши получали по стандартной методике путем инкубации мышиного костного мозга в течение 7 дней в CCh-инкубаторе (Jouan) при 37°С в атмосфере 5% СОг в полной среде в присутствии мышиных ИЛ-4 (10 нг/мл) и ГМ-КСФ (10 нг/мл) [Mayordomo J. I. et al., 1995].

Анализ фенотипа ДК

Определение уровня экспрессии антигенов на поверхности клеток проводили методом проточной цитофлюориметрии с использованием моноклональных антител, меченных флуоресцентными красителями (Caltag Laboratories, BD Biosciences Pharmingen и e-Biosciences, США). Для учета неспецифического связывания антител с клетками использовали изотипические контроли. Для анализа экспрессии двух маркеров одновременно был использован метод обработки клеток антителами к разным белкам, конъюгированными с метками, дающими флюоресценцию в разных областях спектра (флюоресцеинизотиоционат (FITC) и фикоэритрин (РЕ)). Результаты учитывали на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, США).

Обработка ДК человека и мыши препаратами ЛПС и белковыми

антигенами Y.pestis Cafl и LcrV

Через 6 суток инкубации к незрелым ДК человека добавляли ЛПС E.coli, S.sonnei, S.typhi, F.tularensis, Y.pestis в одной и той же дозе (1 мкг/мл). Контрольные незрелые ДК продолжали инкубировать в среде с ИЛ-4 и ГМ-КСФ. Через 2 суток клетки собирали и анализировали экспрессию поверхностных маркеров.

Измерения были проведены с использованием крови 10 здоровых доноров. В каждом опыте сравнивали воздействие разных ЛПС на ДК, полученные из крови одного и того же донора.

На 7-ые сутки к ДК мыши добавляли ЛПС E.coli, Y.pestis или F.tularensis (1 мкг/мл). Инкубацию с данными препаратами продолжали еще 2-ое суток, после чего исследовали экспрессию поверхностных маркеров.

Антигены СаП и LcrV (5 мкг/мл) добавляли к незрелым ДК на 6 сутки инкубации. Исследовали также действие на ДК антигена LcrV в присутствии

ЛПС E.coli (1мкг/мл). Инкубация с препаратами продолжалась 2 суток до анализа фенотипа клеток.

Исследование влияния ганглиозида GM1 на фенотип ДК человека и мыши.

Раствор ганглиозида GM1 (25 мкг/мл) добавляли к уже развившимся из МПК незрелым ДК человека на 6-ые сутки инкубации или к костномозговым предшественникам ДК мыши на 3-й сутки инкубации. Инкубация с препаратом ганглиозида продолжалась 3 суток. Во время инкубации присутствовали все цитокины (ИЛ-4 и ГМ-КСФ), необходимые для дифференцировки и предотвращения дедифференцировки ДК в моноциты/макрофаги. Определение концентрации ИЛ-1 и ФНО-а методом ИФА Концентрацию цитокинов определяли в культуральной среде при помощи готовых наборов для ИФА (ПроКон, Россия) согласно инструкции производителя на приборе Multiscan (LKB, Швеция).

Исследование влияния ИЛ-482 на дифференцировку ДК человека

при разных концентрациях ГМ-КСФ

Прилипшие мононуклеары периферической крови инкубировали в СОг-инкубаторе (Joan) при 37°С в атмосфере 5% СОг в течение 6 суток в полной среде (RPMI 1640 с 10% ФТС), с добавлением следующих комбинаций человеческих рекомбинантных цитокинов: 1) ИЛ-4 (10 нг/мл - 200 U/мл) и ГМ-КСФ (10 нг/мл - 500 U/мл) - для получения обычных незрелых ДК; 2) ГМ-КСФ (10 нг/мл - 500 U/мл); 3) ИЛ-452 (100 нг/мл) и ГМ-КСФ (10 нг/мл - 500 U/мл); 4) ИЛ-4 (10 нг/мл - 200 U/мл) и ГМ-КСФ (1 нг/мл - 50 U/мл).

На 6-ые сутки инкубации клетки, которые инкубировали при пониженной дозе ГМ-КСФ (1 нг/мл), отмывали и далее культивировали 2-5 суток со следующими комбинациями цитокинов: 1) ИЛ-4(10 нг/мл)+ГМ-КСФ(1 нг/мл); 2) ИЛ-4(10 нг/мл)+ГМ-КСФ( 1 нг/мл)+ ИЛ-452(1000нг/мл); 3) ГМ-КСФ(1 нг/мл); 4) ИЛ-4 82 (100 нг/мл)+ГМ-КСФ( 1 нг/мл).

Исследование действия ИЛ-402 на активацию транскрипционного фактора STA Т6

Постнатальные тимоциты получали из частей тимуса, удаляемых при плановом хирургическом лечении врожденных пороков сердца у детей. Суспензию тимоцитов человека получали путем измельчения тимуса в стеклянном гомогенизаторе в полной среде. Крупные агрегаты удаляли фильтрацией.

Тимоциты инкубировали в СОг-инкубаторе (Jouan) при 37°С в атмосфере 5% СОг в предварительно прогретой до 37°С среде RPMI 1640 без сыворотки (2x107 клеток/мл) в плоскодонном планшете в течение 40 минут со следующими комбинациями цитокинов: ИЛ-4 (100 нг/мл), ИЛ-482 (100 и 1000 нг/мл), смеси ИЛ-4 (100 нг/мл ) и ИЛ-452 (1000 нг/мл), контрольный образец инкубировали без всяких факторов. Лизировали клетки в RIPA-буфере (50 мМ HEPES pH 7.5, 150 мМ NaCl, 6 мМ ЭДТА, 2 мМ ингибитор тирозиновых фосфотаз -ортованадат натрия, 1% Igepal СА-630, 1 % дезоксихолат натрия, 0,1% додецилсульфат натрия (SDS), 1 мМ дитиотреитол (DTT), 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF) с добавлением коктейля из ингибиторов протеаз апротинина, лейпептина, бензамидина и пепстатина А) один час при 4°С. DTT, ортованадат натрия, PMSF и другие ингибиторы протеаз всегда добавляли непосредственно перед использованием. Разделяли экстракты путем электрофореза в вертикальном денатурирующем 8% полиакриламидном геле.

Осуществляли перенос белков (Вестерн-блоттинг) при 4°С на нитроцеллюлозную мембрану ECL (AmershamPharmaciaBiotech, США) на приборе MiniHoefTer (AmershamPharmaciaBiotech, США) в течение 1 часа при 25 В и токе не выше 400 мА.

Тотальный STAT6 и его фосфорилированную форму выявляли на мембране при помощи специфических антител к STAT6 (BioSourcelnternational, Бельгия) и к фосфорилированнному STAT6 (Sigma, США). Вторичные антитела - антикроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma,

США). Связывание с антителами выявляли при помощи хемилюминесцентного субстрата для пероксидазы ECL (AmershamPharmaciaBiotech, США).

Статистическая обработка данных.

Для статистической обработки данных были использованы программы WinMDI 2.8 (обработка результатов, полученных при помощи проточной цитофлуорометрии) и Microsoft Office Excel 2003.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Известно, что только зрелые ДК способны эффективно представлять антиген Т-лимфоцитам и при условии состоявшихся корецепторных взаимодействий запускать реакции адаптивного иммунного ответа. Мы провели сравнительное изучение влияния препаратов ЛПС условно-патогенных и патогенных микроорганизмов (E.coli, S.sonnei, S.typhi, Y.pestis и F.tularensis) на созревание ДК человека и мыши.

ДК получали in vitro из моноцитов периферической крови человека или из костномозговых предшественников мыши путем их культивирования в течение 6 суток в присутствии комбинации ИЛ-4 (10 нг/мл) и ГМ-КСФ (10 нг/мл) стандартным методом. В результате были получены незрелые ДК человека с типичными морфологией и фенотипом. Это были крупные округлые клетки неправильной формы с эксцентрично расположенным ядром и пенистой цитоплазмой. Фенотип незрелых ДК человека полностью соответствовал данным литературы: HLA-DR+, CD14-/low, CD80-/low, CD86+, CD83_/low, CD40-/low [Morse, M. A. et al., 1999, Hasebe H. et al., 2000, Piemonti, L. et al., 2000, Triozzi, P. L. et al., 2000]. Незрелые ДК мыши представляли собой слабо прилипающие к пластику крупные клетки неправильной формы с фенотипом МНС-И+, CD14low, CD80+, CD86low, CD83', CD40low.

В качестве референс-препарата мы использовали ФНО-а - классический индуктор созревании ДК. Под действием ФНО-а, были получены зрелые ДК человека с фенотипом CD 14", CD80+, CD86high, CD83+, CD40+.

Прибавление ЛПС различных видов бактерий в качестве индуктора созревания к незрелым ДК показало, что в наибольшей степени ДК человека

активировали эндотоксин Е.соИ и ЛПС Б.яоппег (табл. 1). Об этом судили по увеличению экспрессии молекул костимуляции (СБ80 и СБ86), антигенного представления ГКГ-И НЬА-БЯ и маркера зрелых ДК - СБ83. Традиционный индуктор созревания ДК ФНО-а (10 нг/мл) активировал экспрессию СБ83 гораздо лучше любого из препаратов ЛПС, а также несколько сильнее стимулировал С080. Однако экспрессия другой молекулы костимуляции (СБ86) под его влиянием была в 2 раза ниже уровня, достигнутого при активации ДК эндотоксином Е.соИ. ФНО-а стимулировал экспрессию данной молекулы костимуляции в той же степени, что и препараты ЛПС У.резИз, Злоппег и Б.фрЫ.

Таблица 1

Сравнение действия ЛПС различных видов бактерий на созревание ДК

человека

Поверхностный маркер ФНО-а (референс- препарат) ЛПС различных видов бактерий

E.coli S.sonnei S. typhi Y.pestis F.tularensis

CD14 0* 33±3 32±3 12±2* 22±2* о*

CD801 44±5* 26±2 32±5 0* 14±1* 0*

CD862 2±0,2* 4±0,5 2±0,2* 2±0,2* 2±0,2* 0*

HLA-DR2 Не измеряли 1,75±0,07 Не измеряли Не измеряли 1,70±0,07 0*

CD831 87±5* 27±2 20±2 11±1* 12±1* 0*

1 Среднее значение увеличения экспрессии маркера по сравнению с незрелыми

ДК, %.

2 Экспрессия маркеров CD86 и HLA-DR составляла во всех исследованных образцах 100%, поэтому приведены данные об увеличении среднего геометрического интенсивности флуоресценции по сравнению с незрелыми ДК, раз. Эта величина характеризует увеличение экспрессии молекул белка на поверхности клеток.

* Достоверность разности групп ДК при стимуляции их ЛПС S.sonnei, S. typhi, Y.pestis, F.tularensis либо ФНО-а по сравнению с ДК, активированными ЛПС E.coli, р<0,05.

Интересно, что ЛПС Y.pestis - возбудителя чумы, индуцировал созревание ДК человека гораздо слабее, чем эндотоксин E.coli. Неожиданные результаты были получены при исследовании ЛПС внутриклеточного патогена — возбудителя туляремии - F.tularensis, который оказался абсолютно не способным вызывать созревание ДК, так как не стимулировал экспрессию ни молекул ГКГ-П HLA-

DR, ни молекул костимуляции (CD80, CD86), ни маркера зрелых ДК CD83, что можно рассматривать как эволюционно сложившуюся приспособительную реакцию микроорганизма для ускользания от иммунного ответа хозяина.

Сходные результаты были получены при действии эндотоксинов E.coli, Y.pestis и F.tularensis на незрелые ДК мыши.

Таким образом, большинство бактериальных ЛПС активируют созревание ДК. Это проявляется в экспрессии маркера CD83, молекул костимуляции (CD80, CD86), антигенного представления (ГКГ-Н HLA-DR) и определяет их способность эффективно представлять антиген Т-лимфоцитам. Тем не менее, степень активации ДК под влиянием ЛПС различных видов бактерий - неодинакова. Наименее выражена она у возбудителей особо опасных инфекций - чумы и туляремии. Так, необычный инертный ЛПС F.tularensis, оказался не способным индуцировать дифференцировку ДК в их зрелые формы.

В процессе работы, используя комбинацию различных концентраций ИЛ-4 и ГМ-КСФ для получения незрелых ДК, мы выявили одну интересную особенность. А именно, при низкой концентрации ГМ-КСФ (1 нг/мл), но обычной концентрации ИЛ-4 (10 нг/мл) из мононуклеаров периферической крови человека развивалась необычная популяция ДК с морфологией и фенотипом, типичными для незрелых ДК, но с повышенной экспрессией маркера зрелых ДК CD83 (45%). Незрелые ДК, полученные таким способом мы использовали в дальнейшем как модельную систему для оценки действия ряда исследуемых нами соединений на ДК.

Известно, что многие факторы вирулентности бактерий оказывают супрессивное действие на иммунную систему хозяина [Lipscomb М. F. & Masten В. J., 2002]. Мы сравнили действие двух антигенов Y.pestis -секретируемого белкового фактора вирулентности LcrV и белка капсулы - Cafl на незрелые ДК, отличающиеся высоким уровнем экспрессии CD83 (табл. 2).

Таблица 2

Действие антигенов ЬсгУ и СаП У. реэНз на созревание ДК человека

Поверхностный маркер Уровень экспрессии поверхностных маркеров на ДК, %.

Незрелые ДК +ЬсгУ +СаП

СБ80 7±1 18±3* 67±7*

ств 89±7 85±8 85±6

СБ83 48±4 19±2* 48±5

*Различие между незрелыми ДК и +ЬсгУ, +СаП достоверно при р<0,05. Примечание: Незрелые ДК получали в условиях низкой концентрации ГМ-КСФ (1нг/мл) и обычной концентрации ИЛ-4 (10 нг/мл).

Выявлено, что ЬсгУ снижал'экспрессию на поверхности ДК человека

маркера зрелости СБ83 (с 45 до 19%), р<0,05, при незначительном повышении уровня экспрессии костимулирующей молекулы СБ80, тогда как СаП способствовал значительному повышению уровня СБ80 (с 7 до 67%), р<0,01 и не изменял уровень экспрессии маркера зрелых ДК. Известно, что СаП У. реяНз имеет структурное сходство с ИЛ-1 и взаимодействует с его рецептором, что может приводить к продукции провоспалительных цитокинов ДК, в частности ФНО-а. [АЬгашоу V. М. е1 а1., 2001, 2002]. Под действием этого антигена ДК продуцировали ФНО-а, тогда как ЬсгУ не обладал этой способностью (рис. 1).

1800

1600

| 1400

с

1200

X

ж 1000

р

X 800

Л X 600

«

о 400

200

0

нее

СаП

1сгУ

Рис 1. Действие антигенов У.резИз СаП и ЬсгУ на секрецию ДК ФНО-а

Примечание: тБС — незрелые ДК; * - различие между образцом, стимулированным СаП, и другими образцами достоверно при р<0,01.

Ни один из антигенов не оказал влияния на секрецию ИЛ-1. Учитывая выявленные особенности Cafl, можно рассматривать вопрос о его включении в состав противочумных вакцин.

Интересно, что сочетание LcrV с ЛПС E.coli приводило к стимуляции экспрессии CD83. Повышение экспрессии этого маркера в присутствии только ЛПС (1 мкг/мл) составило (32±4)%, a LcrV (5мкг/мл) с ЛПС (1 мкг/мл)-(61±6%), р<0,05. На основании этих данных LcrV, вероятно, также может быть включен в состав противочумных вакцин, но после проведения дополнительных исследований по подбору оптимальных условий, при которых он будет проявлять свойства иммуностимулятора.

По данным ряда авторов ганглиозиды, в особенности отщепляемые от поверхности опухолевых клеток, обладают мощным иммуносупрессивным действием [Ladisch S. et al. 1987, Li R. et al., 1995, Heitger A. et al., 1996, McKallip R. et al., 1999, Deng W. et al., 2000, Kudo D. et al., 2003].

Мы установили, что ганглиозид GM1, полученный из бычьего мозга, существенно нарушал дифференцировку незрелых ДК из костномозговых предшественников мыши при его прибавлении на ранних этапах инкубации (3 сутки) в среду культивирования в присутствии стандартной концентрации цитокинов (ИЛ-4 - 10 нг/мл, ГМ-КСФ - 10 нг/мл). Об этом можно было судить по значительному снижению экспрессии молекул костимуляции CD86 и маркера мышиных макрофагов/моноцитов и ДК F4/80, а также по проявлению тенденции к понижению экспрессии других молекул костимуляции (CD40 и CD80) (табл. 3). И. М. Молотковская и др. показали, что ганглиозид GM1 конкурентно ингибирует связывание ИЛ-4 с его рецептором [Molotkovskaya I. М. et al., 1999]. Этим, вероятно, можно объяснить подавление дифференцировки мышиных ДК из костномозговых предшественников в присутствии данного ганглиозида.

Однако на иммунофенотип уже сформировавшихся из моноцитов незрелых ДК человека при последующей инкубации с ними в течение 3 суток препарат ганглиозида влияния не оказывал. Таким образом, при

кратковременной инкубации ДК человека с опухолевыми лизатами, содержащими ганглиозид вМ1, при получении противоопухолевых дендритно-клеточных вакцин можно не учитывать возможности ингибирующего действия на них данной формы ганглиозидов.

Таблица 3

Влияние ганглиозида ОМ1 на дифференцировку незрелых ДК из костномозговых предшественников мыши

Поверхностный маркер ДК Среда культивирования для получения незрелых ДК

ИЛ-4 (ЮР (1 1г/мл)+ ГМ-КСФ 0 нг/мл) ИЛ-4 (10 нг/мл)+ ГМ-КСФ (10 нг/мл) + ганглиозид вМ1

% СГМи % СГМ

СБ80 66±4 44±7 61±5 39±2

СБ86 21±4 9,7±0,6 8±2* 7±0,6

СБ40 24±4 16±1 20±3 15±1

Б4/80 90±3 37±5 73±4* 23±2*

Примечение. СГМ - среднее геометрическое интенсивности флуоресценции.

* - различия в экспрессии маркеров между незрелыми ДК и ДК в присутствии ганглиозида достоверны, р<0,05

На следующем этапе работы мы исследовали влияние ИЛ-452,

альтернативного сплайс-варианта ИЛ-4, на экспрессию на поверхностной

мембране ДК молекул костимуляции СБ86 и антигенного представления НЬА-

БЯ, играющих ключевую роль в презентации антигена Т-лимфоцитам и

активации реакций адаптивного иммунного ответа. Экспрессия этих маркеров, в

значительной степени регулируется ИЛ-4 [ЬЩг М. В. е1 а1., 2002, БеБго Е. Ь. е1

а1., 2004]. ИЛ-452 представляет собой естественный антагонист ИЛ-4 [А1ашаз Б.

Р. & а1., 1996, АппоЬи У. е1 а1., 1999].

Для оценки влияния альтернативной формы ИЛ-4 на дифференцировку

ДК к моноцитам периферической крови человека в первые сутки от начала

культивирования прибавляли либо стандартную комбинацию цитокинов (ИЛ-4

- 10 нг/мл и ГМ-КСФ-10 нг/мл), либо комбинацию ГМ-КСФ (10 нг/мл) с ИЛ-

452 (100 нг/мл), либо только ГМ-КСФ (10 нг/мл). К нашему удивлению,

разницы между исследуемыми образцами выявить не удалось и уровень

экспрессии CD86+/HLA-DR+ составил во всех случаях 80-85%. Объяснением этому факту, по-видимому, могут служить данные М. В. Lutz et al., которые показали, что для эффективной экспрессии на поверхности мышиных ДК молекул костимуляции и ГКГ- II достаточно одного ГМ-КСФ в стандартной концентрации, добавление такой же дозы ИЛ-4 не увеличивает их экспрессию [Lutz М. В. et al., 2002]. Однако, как выяснили авторы, при низкой концентрации ГМ-КСФ присутствие ИЛ-4 было абсолютно необходимо для формирования незрелых ДК с нормальным уровнем молекул костимуляции и ГКГ- II.

В ранее приведенных нами результатах исследований для получения незрелых ДК человека из моноцитов периферической крови человека мы уже использовали низкую концентрацию ГМ-КСФ (1 нг/мл) при обычной концентрации ИЛ-4 (10 нг/мл). Этот метод снова был нами использован для изучения влияния ИЛ-482 на ДК. Для того чтобы выявить, как влияет ИЛ-452 на дифференцировку ДК, полученных при низкой концентрации ГМ-КСФ, на 6-ой день инкубации проводили полную замену среды культивирования и прибавляли низкую концентрацию ГМ-КСФ (1 нг/мл) (группа 1); или его сочетания с ИЛ-4 в стандартной концентрации (10 нг/мл) (группа 2); либо с ИЛ-482 (100 нг/мл) (группа 3) (табл.4).

Таблица 4

Влияние альтернативной формы ИЛ-4 (ИЛ-48) на экспрессию незрелыми ДК

поверхностных молекул CD86 и HLA-DR при инкубации в течение 2 суток.

№№ группы Комбинации цитокинов, прибавленные к незрелым ДК Уровень экспрессии поверхностных молекул, %

CD867 HLA-DR* CD86V HLA-DR" CD867 HLA-DR* CD867 HLA-DR*

1 ГМ-КСФ (1 нг/мл) 4±1 1±0,5 40±4* 55±4*

2 ИЛ-4 (10 нг/мл) ГМ-КСФ (1 нг/мл) 3±1 2±1 12±2 82±5

3 ИЛ-452 (100 нг/мл) ГМ-КСФ (1 нг/мл) 5±1 2±1 35±2* 58±5*

Примечание: после прибавления цитокинов к незрелым ДК, полученным в присутствии низкой концентрации ГМ-КСФ (1 нг/мл), но стандартной концентрации ИЛ-4 (10 нг/мл);

* Достоверность различий по сравнению с группой 2, р<0,05

Через 2 суток определяли экспрессию поверхностных маркеров на ДК, дифференцировавшихся под действием этих комбинаций цитокинов. Наиболее информативными с нашей точки зрения были маркеры костимуляции СБ86 и антигенного представления ГКГ-Н НЬЛ-БЯ. Для более точной оценки функциональных особенностей ДК использовали двойную флуоресцентную метку (СВ86+/НЬА-БК+). Это позволило проследить за популяциями клеток, экспрессирующими оба маркера одновременно, либо только один из них. Выявлено, что в присутствии низкой концентрации ГМ-КСФ (группа 1) уже через 2 суток инкубации наблюдалось значительное уменьшение численности популяции клеток, несущих оба маркера на поверхности, по сравнению с ДК, которые инкубировали с ИЛ-4 и ГМ-КСФ (группа 2) (55±4% и 82±5%, соответственно). Это произошло главным образом из-за утраты клетками молекулы костимуляции СБ86, так как одновременно возросла доля клеток, экспрессирующих только СБ867НЬА-В11+ (40±4%) . При добавлении ИЛ-482 к низкой дозе ГМ-КСФ наблюдалась та же самая картина, что и в присутствии одного лишь ГМ-КСФ, то есть, в отличие от ИЛ-4, его альтернативная форма оказалась не способна поддерживать одновременную экспрессию молекул костимуляции СБ86 и антигенного представления ГКГ-П на поверхности клеток (С086+/НЬА-0К+ фракция клеток группы 3). Полученные данные свидетельствуют, что ИЛ-482, в отличие от ИЛ-4, не противодействует обратной дифференцировке незрелых ДК, которая проходит с понижением их способностей к представлению антигена.

При длительном культивировании ДК (5 суток) в присутствии избытка ИЛ-482 (1000 нг/мл) с комбинацией низкой концентрации ГМ-КСФ (1 нг/мл) и стандартной концентрации ИЛ-4 (10 нг/мл) было выявлено, что происходило незначительное уменьшение (на 10%) экспрессии НЬЛ-БЯ на ДК, по сравнению с образцом, который культивировался то же время в присутствии ИЛ-4 (10 нг/мл) и ГМ-КСФ (1 нг/мл) (рис.2). Уровень экспрессии СБ86 между сравниваемыми образцами не отличался. Это свидетельствует о том, что при

длительном культивировании в присутствии избытка ИЛ-452 снижается экспрессию НЬА-Б11, которую способен индуцировать ИЛ-4.

Подобная разница в действии двух форм ИЛ-4, очевидно, объясняется тем, что ИЛ-452 не способен активировать сигнальный каскад ИЛ-4, так как связывается лишь с высокоаффинной цепью гетеродимерного рецептора ИЛ-4 (ИЛ-Ра), но не со вспомогательным компонентом (общая у-цепь, либо а-цепь рецептора ИЛ-13) [УавШеу А. М. е1 а1., 2003].

а.

б.

85%

75%

10° 10' 10» Ю1 10*

ре

10° 10' 10* 101 10* РЕ

Рис. 2. Действие альтернативной формы ИЛ-452 на экспрессию молекул НЬА-БЯ на поверхности ДК через 5 суток инкубации.

Примечение.^а) ИЛ-4(10 нг/мл)+ГМ-КСФ(1нг/мл); б) ИЛ-4(10 нг/мл)+ГМ-КСФ(1нг/мл)+ ИЛ-452( 1 ОООнг/мл).

2)еуеЩз - число событий (клеток), РЕ - логарифм интенсивности флюоресценции, соответствующий длине волны свечения РЕ, М1 - маркер, обозначающий клетки, флюоресценция которых выше флюоресценции в изотипическом контроле

3)изотипический контроль обозначен простой черной линией, а экспериментальные образцы, меченные антителами к НЬА-ОЯ, конъюгированными с РЕ — заштрихованная гистограмма.

Таким образом, незрелые ДК, которые инкубировались в присутствии ИЛ-482 характеризуются сниженной способностью к представлению антигена, по сравнению с ДК, развившимися в присутствии ИЛ-4, так как несут на своей поверхности меньшее количество молекул костимуляции CD86 и антигенной презентации HLA-DR.

Это важное наблюдение, так как известно, что один из естественных механизмов предотвращения развития гиперчувствительности к аллергенам, предположительно, заключается в подавлении экспрессии молекул ГКГ-П на поверхности ДК под влиянием аутокринного ИЛ-10 [Lipscomb М. F. & Masten В. J., 2002]. В нашем исследовании подобная функция выявлена у ИЛ-452.

Надо отметить, что для экспрессии молекул костимуляции CD 86 и ГКГ-П под действием ИЛ-4 необходима активация транскрипционного фактора STAT6, участвующего в развитии иммунных реакций по ТЬ2-типу [Deszo Е. L. et al., 2004]. STAT6 активируется при фосфорилировании консервативного остатка тирозина в его структуре [Takeda К. et al., 1997]. Активацию STAT6 под действием ИЛ-4, ИЛ-482 и их комбинации исследовали в реакции иммуноблоттинга (рис.3). Для этого тимоциты человека обрабатывали ИЛ-4, ИЛ-482 или их комбинацией с целью активации STAT6 в клетках. Затем получали лизат клеток, который вносили в лунки полиакриламидного геля. После переноса образовавшихся в результате электрофореза белковых полос на нитроцеллюлозную мембрану ее инкубировали со специфическими антителами к фосфорилированной форме STAT6 (рис.3 А) и тотальному STAT6 (форсфорилированному и нефорсорилированному - контроль за эквивалентностью нанесения белка) (рис.3 Б). Интенсивность всех полученных в контроле полос (1-5) (рис.3 Б) была одинаковой, что свидетельствовало о содержании одинакового количества белка во всех исследованных пробах (рис.3 А и Б). В опытном образце (рис.3 А) наименее интенсивно была выражена полоса 2, которая соответствовала культивированию тимоцитов с ИЛ-482 (1000 нг/мл). То есть ИЛ-482 приводил к снижению содержания эндогенной фосфорилированной формы STAT6, то есть ингибировал его.

Наиболее интенсивная полоса 4 соответствовала культивированию тимоцитов в присутствии ИЛ-4 (100 нг/мл), то есть ИЛ-4 активировал БТАТ6. При добавлении избытка ИЛ-452 (1000 нг/мл) к ИЛ-4 (100 нг/мл) интенсивность полосы (полоса 5) снижалась, что доказывает ингибирующее действие ИЛ-452 на активацию БТАТ6 под воздействием ИЛ-4. А. Б.

12345 12345

....... II, ---■ ■ •' Г Г11, ~■ -' ■■> V'?'1 г■ з

1, . .»« ...........Ли 0 А К . о к,»-'1 ■■■' . ••".'■.■.■' ■ . .ч

- ■ ■ . ... • .'Г 1 " .* I

»ми» <Ммм» <МИ| 1Я0Я* .

* - . ' " ' ..........■ « ' *** -а .. **

- » ' 4

Рис. 3. Активация БТАТ6 в тимоцитах человека при действии на них ИЛ-4 или ИЛ-452.

Примечание. 1 - контроль - тимоциты инкубировали в 11РМ1 1640, 2 - + ИЛ-452 (1000нг/мл), 3 - +ИЛ-452 (100нг/мл), 4 - +ИЛ-4 (100нг/мл), 5 - +ИЛ-4 (100нг/мл)+ИЛ-452 (1000нг/мл).

А. - проявление проводили с антителами к фосфорилированному БТАТ6 Б. - проявление проводили с антителами к тотальному БТАТ6. - контроль нанесения эквивалентного количества белка.

Под влиянием ИЛ-452 происходило подавление как эндогенной, так и

индуцированной ИЛ-4 активности транскрипционного фактора БТАТ6. По всей

видимости, ингибирование активности транскрипционного фактора БТАТб

является одним из механизмов, за счет которого ИЛ-452 снижает экспрессию

молекул НЬА-БК, индуцируемую ИЛ-4.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что соединения бактериального (ЛПС, белковые факторы вирулентности) и эукариотического (ганглиозиды, цитокины) происхождения могут активировать или ингибировать экспрессию костимулирующих молекул и молекул антигенного представления на ДК.

2. Наиболее эффективным индуктором созревания дендритных клеток является ЛПС Е.соИ, в меньшей степени У.резГ/з, а ЛПС РЛи1агепвй не вызывает созревания дендритных клеток.

3. Секретируемый белковый фактор вирулентности Y.pestis 'LcrV подавляет экспрессию маркера зрелости ДК CD83, но в присутствии ЛПС E.coli LcrV обладает адъювантным действием на экспрессию CD83.

4. Капсульный антиген Y.pestis Cafl стимулирует повышение экспрессии на ДК костимулирующей молекулы CD80 и способствует индукции ДК ФНО-а.

5. Ганглиозид GM1 из бычьего мозга приблизительно в 2 раза понижает экспрессию молекул костимуляции CD86 дендритными клетками мыши при их получении из костного мозга в его присутствии, однако не влияет на иммунофенотип уже сформировавшихся дендритных клеток человека.

6. Альтернативная форма ИЛ-4 (ИЛ-482) не способна поддерживать экспрессию молекул костимуляции (CD86) на поверхности дендритных клеток, а также понижаем, при длительной культивации в присутствии ее избытка, экспрессию молекул антигенного представления ГКГ-И HLA-DR, индуцируюмую ИЛ-4.

7. ИЛ-482 выступает конкурентным ингибитором активации транскрипционного фактора STAT6 в ответ на стимуляцию клеток ИЛ-4.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Воробьев А. А., Киселевский М. В., Халтурина Е. О., Чикилева И. О. Методы получения дендритных клеток из различных источников.//РААКИ. 5-й конгресс. Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии. Сборник трудов. - 2002. - т.2. - с. 330.

2. Тугуз А. Р., Громова Е. Г., Анисимова Н. Ю., Чикилева И. О., Титов К. С., Киселевский М.В. Продукция IFN-a нейтрофилами, мононуклеарными клетками и спленоцитами онкологических больных с постоперационными осложнениями.// Вестник интенсивной терапии. - 2003. - № 3. - с. 48-50.

3. Воробьев АА., Халтурина Е.О., Чикилева И.О., Киселевский М.В. Дендритные клетки и их дифференцировка под влиянием различных типов бактериального липополисахаридаУ/Цитокины и воспаление. Материалы 1-й российской школы по иммунотерапии. 2003 -Т2 .-№3 .-С.45.

4. Чикилева И. О., Халтурина Е. О., Киселевский М. В. Современные подходы и направления в иммунотерапии и иммунопрофилактике злокачественных новообразований.// Молекулярная Медицина. - 2003. - т. 2. - с. 40-47.

5. Чикилева И. О., Халтурина Е. О., Мазуров Д. В., Львов В. А., Шмиголь В. И., Апарин П. Г., Шингарова Л. Н., Василенко Р. Н., Абрамов В. М., Даненко Ф. В., Киселевский М. В. Влияние различных типов бактериального липополисахарида на дифференцировку дендритных клеток человека.// Молекулярная медицина. - 2003. - т. 3. - с. 54-58.

6. Анисимова Н. Ю., Тугуз А. Р., Чикилева И. О., Киселевский М. В., Голубев И. Н., Вершинина М. Ю., Воробьев А. А. Выявление возможных механизмов повышения содержания растворимых рецепторов цитокинов sIL-4R, sIL-6R, sTNF-RI, sTNF-RII в крови здоровых доноров и онкологических больных.//Иммунология. - 2003. - №2. - с.80-82.

7. Лебединская О. В., Чикилева И. О., Лебединская Е. А., Шехмаметьев Р. М., Мелехин С. В., Киселевский М. В. Клеточный состав и его морфогистохимическая характеристика в культурах мононуклеарных лейкоцитов периферической крови здоровых доноров при воздействии липополисахаридных комплексов Yersinia pestis.//YcnexH современного естествознания. - 2006. - № 5. - с. 72-73.

8. Chikileva I. О., Abramov V. М., Tuguz A. R., Vasilenko R. N., Buydenok Y. V., Kiselevsky M. V. Generation of dendritic cells using mononuclear cells from several sources.// Intern. J. Cancer. - 2002. - p. 452.

9. Davidov M.I., Khalturina E.O., Chikileva I.O., Titov ICS., Ter-Ovanesov M.D., Demidov L.V., Kiselevsky M.V. The implication of adoptive immunotherapy in gastric cancer patients after total gastrectomy with splenectomyУ/Fifth international gastric congress. 2003.-Poster presentation. Abstract P. 158.

10. Khalturina E., Chikileva I., Vorobiev A., Kiselevskiy M. Influence of various types bacterial lipopolisaccharide on a differentiation of human dendritic cells.// EAACI. 2003. -Poster session. Abstract № 1043.

11. Tchikileva I., Vasilenko R., Vasil'ev A., Kiselevsky M., Abramov V. Influence of IL-4 alternative splice-variant on human dendritic cells and thymocytes .//1st Joint Meeting of European National Societies of Immunology - 16th European Congress of Immunology. - 2006. - Poster Session Abstract № 1425.00.

12. Tuguz A. R., Abramov V. M., Vasilenko R. N., Chikileva I. O., Buydenok Y. V., Kiselevsky M. V., Ptitsyn L. V., Vasiliev A. M. Influence of IL-4d2 - IL-4 form derived by alternative splicing, on cytotoxicity of peripheral blood mononuclear cell (PBMC) and granulocytes towards NK-sensitive K-562 cell line.// Intern. J. Cancer. - 2002. - p. 445

13. Tuguz A. R., Polozky B. E., Buydenok Y. V., Chikileva I. O., Titov K. S., Kiselevsky M. V. Correction of immunosuppression in gastric cancer patients after total gasterectomy with splenectomy., Intern. J. Cancer, 2002, p. 249

14. Vasilenko R. N., Puchkova G. Yu., Kosarev I. V., Khodyakova A. V., Vasiliev A. M., Chikileva I. O., Sharova N. I., Yarilin A. A., Ptitsyn L. P., Abramov V. M. IL-4 and IL-4delta2 as a system of immune response regulation.// J. Interferon&Cytokine Res. - 2001. - vol. 21. - P-l-53.

15. Vasilenko R., Puchkova G., Chikileva I., Khodyakova A., Ptitsyn L., Vasiliev A., Pchelinzev S., Abramov V. IL -452 takes part in regulation of Thl and Th2 type immune response.// Intern. J. Immunorehabilitation. - 2001. - vol. 3. - p. 33.

16. Vasilenko R., Vasiliev A., Chikileva I., Khodyakova A., Puchkova G., Kulikova N., Kosarev I., Andreev S., Ptitsyn L., Pavlov V., Khlebnikov V., Uversky V., Kiselevsky M., Abramov V. IL-4 and IL-4delta2 system in host defense mechanism against allergic and tumor diseases.// Proc. 2nd International Conference on Tumor Microenvironment Progression, Therapy & Prevention. -2002.-p. 115-119.

17. Vasiliev A. M., Vasilenko R. N., Kulikova N. L., Andreev S. M., Chkileva I. O., Puchkova G. Yu., Kosarev I. V., Khodyakova A. V., Khlebnikov V. S., Ptitsyn L. R., Shcherbakov G. Y., Uversky V. N., DuBuske L. M., Abramov V. M. Structural and functional properties of IL-452, an alternative splice variant of human IL-4.// J. Proteome Res. - 2003. - vol. 2. - № 3. - p. 273-281.

Подписано в печать 12.10.06 г. Формат бОх 84/16. Тираж 100 экз. Заказ № 517

Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН им. H.H. Блохина РАМН

115478, Москва, Каширское ш., 24

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Исследование свойств дендритных клеток (ДК) представляет собой одно из наиболее интересных и перспективных направлений современной иммунологии. Это обусловлено тем, что ДК играют ключевую роль в инициации и регулировке реакций врожденного и приобретенного иммунитета [66, 67, 182, 192].

Функциональная активность ДК зависит от различных факторов. Так, в зависимости от состава среды, условий культивирования клеток-предшественников, факторов созревания и др. можно получить ДК с различными свойствами. Одни из них будут индуцировать иммунный ответ по Тх1/Тх2 типу, другие, наоборот, активировать регуляторные Т-клетки (Трег) и приводить к иммуносупрессии (толерогенные ДК). Известно, что факторы созревания, прибавляемые к ДК при инкубации с антигеном, существенным образом влияют на их способность к миграции в лимфатические узлы и представлению антигена Т-лимфоцитам [54, 192].

Как было показано в недавних работах, ЛПС различных видов бактерий и даже ЛПС одного и того же штамма, культивируемого в различных условиях, по-разному действуют на иммунную систему хозяина [57]. Это обусловлено тем, что тонкие модификации структуры ЛПС вызывают существенные изменения в связывании данного бактериального продукта со сложной системой рецепторов многоклеточных хозяев [57]. Несмотря на то, что ЛПС традиционно используют в лабораторной практике в качестве индуктора созревания ДК, отсутствуют данные о сравнительном действии на ДК ЛПС различных видов бактерий. Отсутствуют также данные о действии на ДК ряда белковых факторов вирулентности бактерий. Исследование действия на ДК различных бактериальных антигенов могло бы способствовать уточнению особенностей патогенеза инфекционного процесса и разработке новых подходов к получению вакцин.

Наряду с факторами, повышающими функциональные свойства ДК, существуют соединения, способные ингибировать их активность. Например, ИЛ-10 снижает способность ДК созревать в ответ на провоспалительные факторы, что приводит к развитию толерогенных ДК, которые не только не стимулируют иммунные реакции, а даже подавляют их [182, 231]. ДК играют важную роль в индукции и поддержании иммунных реакций на аллергены при астме [121]. Один из естественных механизмов предотвращения развития гиперчувствительности к аллергенам, предположительно, заключается в подавлении экспрессии молекул антигенной презентации главного комплекса гистосовместимости П-го типа (ГКГ-П) на поверхности ДК легких под влиянием аутокринного ИЛ-10 [121]. Анализ данных литературы свидетельствует от том, что ИЛ-452 - естественный антагонист ИЛ-4 не активирует последующий сигнальный каскад и конкурирует с ИЛ-4 за общую для них цепь рецептора ИЛ-4Ра. Соотношение этих двух форм ИЛ-4 в организме, по мнению некоторых авторов, играет важную роль в патогенезе атопической астмы [77, 194]. Действие ИЛ-452 на ДК до сих пор не было исследовано.

Ряд исследователей продемонстрировали негативное влияние некоторых ганглиозидов на ДК и другие антигенпредставляющие клетки (АПК) [33, 162, 196, 197, 233]. Ганглиозиды - мембранные гликосфинголипиды, содержащие сиаловую (нейраминовую) кислоту. Они представлены в мембранах абсолютно всех клеток и выполняют многообразные биологические функции, включая регуляцию роста, дифференцировки и гибели клеток [206]. Качественный состав ганглиозидов изменен в опухолевых клетках [165, 224]. Известно, что ганглиозиды способны отщепляться с поверхности опухолевых клеток в окружающую их среду [24, 166], что вносит значительный вклад в вызываемую раковыми клетками иммуносупрессию [51, 86, 112, 117, 132]. Исследование влияния различных ганглиозидов на ДК представляет собой новое и перспективное направление в иммунологии, существенное для клинической практики при лечении опухолевых заболеваний.

Несмотря на большое количество исследований, посвященных ДК и все возрастающий интерес к ним, многие аспекты их развития (пути диффе-ренцировки, созревания, факторы, влияющие на их способность к представлению антигена и т.д.) изучены не достаточно полно. Все изложенное выше и определило цель настоящего исследования

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ Изучение особенностей дифференцировки и созревания дендритных клеток под действием факторов бактериального (ЛПС, белковые факторы) и эукариотического происхождения (ганглиозиды, цитокины).

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Определить морфологические и иммунофенотипические характеристики ДК при использовании в качестве индукторов созревания ЛПС условно патогенных и патогенных бактерий {Escherichia coli, Shigella sonnei, Salmonella typhi, Yersiniapestis, Francisella tularensis).

2. Провести сравнительное исследование действия белковых антигенов Y. pestis (фактора вирулентности LcrV и капсульного белка Cafl) на иммунофенотип ДК.

3. Исследовать секрецию ДК ФНО-а и ИЛ-1 в присутствии антигенов Y.pestis LcrV и Cafl.

4. Определить иммунофенотип ДК при их дифференцировке в присутствии ганглиозида GM1.

5. Изучить особенности иммунофенотипа ДК, дифференцирующихся из моноцитов периферической крови человека в присутствии альтернативного сплайс-варианта ИЛ-4 (ИЛ-452).

6. Исследовать влияние ИЛ-482 на активацию транскрипционного фактора STAT6.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА Впервые проведено сравнительное изучение особенностей дифференцировки и созревания ДК под действием факторов бактериального (ЛПС, белковые факторы) и эукариотического происхождения (ганглиозиды, цито-кины).

Препараты бактериальных ЛПС значительно различаются по способности индуцировать созревание ДК. Наиболее эффективным индуктором созревания дендритных клеток является ЛПС E.coli. ЛПС возбудителя чумы Y. pestis характеризуется менее выраженной способностью индуцировать созревание ДК, а ЛПС возбудителя туляремии F. tularensis вообще не способен индуцировать созревание ДК.

Впервые показано, что белковые факторы вирулентности LcrV и Cafl Y.pestis оказывают неоднозначное действие на иммунофенотип ДК человека. Секретируемый фактор вирулентности LcrV подавляет экспрессию маркера зрелости ДК CD83, но стимулирует экспрессию молекул костимуляции CD80. Капсульный антиген Cafl является мощным индуктором секреции ФНО-а и созревания ДК.

Установлено, что ганглиозид GM1 из бычьего мозга угнетает нормальную дифференцировку ДК мыши, приводя к уменьшению экспрессии молекул костимуляции.

Впервые исследовано действие альтернативной формы ИЛ-4 (ИЛ-482) на диффренцировку ДК. Показано, что ИЛ-482, в отличие от ИЛ-4, не поддерживает экспрессию молекул костимуляции CD86 и антигенной презентации ГКГ-П HLA-DR на поверхности ДК. ИЛ-482 слабо подавляет экспрессию HLA-DR, индуцируемую ИЛ-4 и оказывает супрессивное действие на активацию транскрипционного фактора STAT6, индуцируемую ИЛ-4.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Результаты, полученные при исследовании влияния факторов бактериального и эукариотического происхождения на дифференцировку и созревание ДК, могут быть использованы для оптимизации методов получения вакцин на основе ДК.

Полученные данные об особенностях действия ЛПС возбудителей особо опасных заболеваний (Y.pestis и F.tularensis) и белковых антигенов Y.pestis на

ДК могут иметь существенное значение для выяснения механизмов взаимодействия патогенных микроорганизмов с иммунной системой хозяина, а также для отбора антигенных компонентов с целью конструирования противо-инфекционных профилактических и терапевтических вакцин.

Присутствие иммуносупрессивных ганглиозидов в опухолевых лизатах при нагрузке ими препаратов ДК может существенным образом повлиять на эффективность таких противоопухолевых препаратов. В работе было показано, что ганглиозид GM1 не влияет на иммунофенотип полностью развившихся незрелых ДК человека при кратковременной культивации с ним (3 суток). Таким образом, он, по-видимому, не способен негативно повлиять на способность ДК, нагруженных опухолевым лизатом, представлять опухолевые антигены.

Толерогенные ДК могут быть использованы для подавления иммунных реакций при аутоиммунных заболеваниях и трансплантации органов. Настоящая работа позволяет предположить, что подобного типа ДК могут быть получены в присутствии ИЛ-482.

Результаты исследований используются в циклах лекций курса «Вакци-нопрофилактика» и курса по иммуноонкологии ММА им. И. М. Сеченова.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ДК кожи (необычные клетки с многочисленными отростками - ветвями - «дендритами») были впервые описаны Лангергансом уже в 1868-м году [84]. Однако на тот момент ничего не было известно относительно их функций, предполагалось даже, что они представляют собой особые нервные клетки. Стейнман и Кон (Steinman and Cohn) в 1973-м году идентифицировали ДК в селезенке мышей [210].

На данный момент твердо установлено, что ДК представляют собой мощные профессиональные АПК, обладающие уникальной способностью индуцировать первичный иммунный ответ [4, 22, 84, 103]. ДК примируют наивные Т-клетки, а также активируют клетки памяти. Кроме того, ДК способны активировать В-клетки и ЕК [66, 78,103].

ДК играют наиважнейшую роль в инициации и регулировке иммунных реакций, направленных против вирусов, бактерий и других патогенных микроорганизмов. Существуют также данные, указывающие на то, что ДК могут запускать противоопухолевые иммунные реакции [54]. В настоящее время ряд исследователей ведут работы с целью внедрения в клиническую практику препаратов на основе ДК для лечения или предотвращения инфекционных и опухолевых заболеваний [54, 103, 121, 153].

2.1. Характеристика ДК.

Стейнман и Кон описывают ДК, как крупные клетки, которые отличаются неправильностью формы, имеют многочисленные выступы мембраны, включая дендриты, напоминающие формой иглы, выпуклые псевдоподы, вуалевидные ламелиоподы [210]. По их наблюдениям, ДК мышиной селезенки сначала прикрепились к пластику, но после культивирования в течение ночи отлипли, что, наряду с их низкой плотностью, позволило отделить их от макрофагов [210-212]. В отличие от макрофагов, ДК мышиной селезенки не фагоцитировали [211-212].

Последующие исследования показали, что ДК, в отличие от моноцитов/макрофагов, постоянно экспрессируют на высоком уровне молекулы ГКГ главного комплекса гистосовместимости) П-го класса [214]. Особое положение ДК среди других АПК объясняется их невероятно высокими способностями стимулировать первичный ответ Т-лимфоцитов как в аллогенной смешанной лейкоцитарной реакции (CJ1P), так и в антигенспецифических системах [93, 213]. Эта особенность ДК определяется не только большой плотностью молекул ГКГ на поверхности ДК, но и высоким уровнем экспрессии костимулирующих молекул В7-1 (CD86), В7-2 (CD80).

Фенотипически ДК охарактеризовать достаточно сложно, так как до сих пор не обнаружено абсолютно специфических маркеров на их поверхности [84, 127]. Обычно их определяют как Lin"MHCII+ клетки, так как на их поверхности отсутствуют линейные маркеры, свойственные В-, Т-клеткам, ЕК, моноцитам/макрофагам (CD 19, CD3, CD 16, CD56, CD 14), но отмечается высокая плотность молекул ГКГ-П.

Морфологические и функциональные характеристики ДК существенным образом меняются при их развитии [84]. Разделяют предшественники ДК, незрелые и зрелые ДК. ДК происходят из костного мозга [174]. Небольшое количество предшественников ДК (а также зрелых и рециркулирующих форм) находятся в крови и выходят из кровяного потока в ткани. В тканях локализованы незрелые формы ДК, которые именуются интерстициальными ДК. Клетки Лангерганса населяют эпидермис и другие типы эпителия, где они также находятся в незрелой форме. Незрелые ДК имеют длинные мембранные выступы и служат детекторами патогенных микроорганизмов.

ДК захватывают бактерии, вирусы, мертвые или умирающие клетки, белки и иммунные комплексы путем фагоцитоза, пиноцитоза или опосредованного рецепторами эндоцитоза. Далее антигенный материал процессирует-ся и представляется в комплексе с молекулами ГКГ. Обычно АПК представляют экзогенные антигены в контексте с молекулами ГКГ-П CD4+ Т-лимфоцитам, а эндогенные, синтезированные внутри клетки (например, вирусные белки) - в комплексе с молекулами ГКГ-1 CD8+ Т-лимфоцитам. Однако у ДК существует альтернативный путь процессинга экзогенных антигенов (апоптических или некротических опухолевых клеток, иммунных комплексов и т. д.), который позволяет им представлять их в комплексе с молекулами ГКГ-1 также и CD8+ Т-лимфоцитам [9, 70, 81]. Этот процесс называют кросс-презентацией. Липидные и гликолипидные антигены патогенных микроорганизмов, а также собственных тканей презентируются на CD1 (CD1 a-d) молекулах, которые структурно напоминают молекулы ГКГ-1, но специализированы для связывания с липидами, а не с пептидами [99,138]. Антигенные липиды в комплексе с CD1 распознаются некоторыми Т-клетками, а также специализированными ЕКТ-клетками.

После захвата и процессинга антигенного материала ДК начинают созревать. Созревание ДК происходит под воздействием ряда консервативных факторов бактериальной или вирусной природы, так называемых РАМР -патоген-ассоциированных молекулярных структур (вирусной РНК и ее аналогов, компонентов бактериальной клеточной стенки), а также провоспали-тельных факторов, секретируемых при проникновении в организм микробов.

Например, при инфицировании организма грамотрицательными бактериями ведущую роль в индукции созревания ДК будет играть важный структурный компонент их наружной мембраны - ЛПС. Молекулы ЛПС состоят из гидрофильного гетерополисахарида и ковалентно связанного липидного компонента - липида А [180]. Гетерополисахарид подразделяется на сильно вариабельную О-специфическую цепь и более консервативный коровый оли-госахарид.

При росте и лизисе бактерий часть ЛПС отщепляется в окружающую среду. Свободный ЛПС представляет собой мощный бактериальный токсин, именуемый эндотоксином [180]. Однако, в отличие от многих других бактериальных токсинов, ЛПС не убивает сам по себе клетки и не ингибирует клеточные процессы, а требует для своего токсического действия активного ответа клеток хозяина. Согласно современным знаниям, ЛПС взаимодействует через липид А с рядом клеток, включая мононуклеарные клетки, эндотелий, гладкую мускулатуру, полиморфноядерные гранулоциты и тромбоциты [73].

В качестве РАМР ЛПС служит сигналом опасности для эффекторов врожденного иммунитета, в том числе и для ДК [95]. Главным рецептором ЛПС принято считать комплекс То11-подобного рецептора (TLR) 4 с CD 14 и дополнительной молекулой MD-2, который присутствует на поверхности ДК. Однако ЛПС способен взаимодействовать также с рядом других клеточных молекул, начиная с интегринов (CDllb/CD18) и кончая рецепторами хемо-кинов. Особо важную роль в процессе распознавания и ответа на ЛПС играют макрофаги/моноциты, продуцирующие под его воздействием биоактивные липиды, реактивные формы кислорода, оксид азота N0, ряд провоспали-тельных цитокинов (ФНО-а, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12) и хемокины [73]. Умеренный уровень данных медиаторов воспаления способствует развитию защитных реакций организма на инфекцию. Однако их избыток может быть крайне опасен, ведет к сильному повышению температуры, гипотензии и даже к гибели от необратимого шока.

По мере созревания ДК в значительной степени теряют способность эндоцитировать и процессировать антигены [185]. Однако зрелые ДК сохраняют способность презентировать иммуногенные пептиды, не требующие предварительного процессинга внутри клетки [185]. Зрелые ДК стабильно экспрессируют на своей поверхности комплексы молекул ГКГ с пептидами [37]. От незрелых ДК они отличаются также экспрессией характерного маркера зрелых ДК - CD83, кроме того, в значительной степени возрастает количество костимулирующих молекул. Зрелые ДК экспрессируют ряд молекул адгезии (CD54), способствующих взаимодействию с Т-лимфоцитами и хемо-киновые рецепторы, такие как CCR7, которые необходимы для миграции в лимфатические узлы [186]. Кроме того, только зрелые ДК секретируют значительное количество цитокинов и хемокинов, необходимых для хемотаксиса и активации Т-клеток и других эффекторов иммунной системы (FLT3L, Г-КСФ, ИЛ-1а, -1(3, -2, -12, -6, CCL-2, -3, -4, -5, -17, -22, MIP-2) [39, 78]. Созревающие ДК мигрируют из тканей в афферентные лимфатические сосуды, где принимают форму вуалевидных клеток. В лимфатических узлах они полностью созревают и превращаются в интердигитатные ДК Т-зоны, где стимулируют специфический иммунный ответ Т-лимфоцитов. Интердигитатные ДК также присутствуют в миндалинах и белой пульпе селезенки.

выводы

1. Впервые показано, что соединения бактериального (ЛПС, белковые факторы вирулентности) и эукариотического (ганглиозиды, цитокины) происхождения могут активировать или ингибировать экспрессию костимули-рующих молекул и молекул антигенного представления на ДК.

2. Наиболее эффективным индуктором созревания дендритных клеток является ЛПС E.coli, в меньшей степени Y.pestis, а ЛПС F. tularensis не вызывает созревания дендритных клеток.

3. Секретируемый белковый фактор вирулентности Y.pestis LcrV подавляет экспрессию маркера зрелости ДК CD83, но в присутствии ЛПС E.coli LcrV обладает адъювантным действием на экспрессию CD83.

4. Капсульный антиген Y.pestis Cafl стимулирует повышение экспрессии на ДК костимулирующей молекулы CD80 и способствует индукции ДК ФНО-а.

5. Ганглиозид GM1 из бычьего мозга приблизительно в 2 раза понижает экспрессию молекул костимуляции CD86 дендритными клетками мыши при их получении из костного мозга в его присутствии, однако не влияет на иммунофенотип уже сформировавшихся дендритных клеток человека.

6. Альтернативная форма ИЛ-4 (ИЛ-452) не способна поддерживать экспрессию молекул костимуляции (CD86) на поверхности дендритных клеток, а также понижает, при длительной культивации в присутствии ее избытка, экспрессию молекул антигенного представления ГКГ-П HLA-DR, инду-цируюмую ИЛ-4.

7. ИЛ-452 выступает конкурентным ингибитором активации транскрипционного фактора STAT6 в ответ на стимуляцию клеток ИЛ-4.

чумных вакцин без потери их иммуногенности, но в присутствии низких доз какого-либо иммуностимулятора. 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Несмотря на огромное количество исследований в отношении ДК и все возрастающий интерес к ним, наше знание об их развитии (путях дифферен-цировки, созревания, факторах, влияющих на их способность к представлению антигена и т.д.) все еще не достаточно полно. В данной работе было прослежено развитие и созревание ДК под воздействием различных факторов (белковых, ЛПС, ганглиозидов), как эукариотического, так и бактериального происхождения.

F. Sallusto и F. Lanzavecchia разработали эффективный метод получения ДК in vitro из моноцитов чекловека в присутствии комбинации ИЛ-4 и ГМ-КСФ [184]. Эта же комбинация цитокинов используется для развития мышиных ДК из КМП [130]. Для получения ДК из костного мозга мышей зачастую с достаточной эффективностью используется один лишь ГМ-КСФ [124, 125]. Первооткрыватели метода получения ДК человека из моноцитов отмечали, что АПК, хоть и с меньшей эффективностью и худшими способностями к презентации антигена, развиваются из моноцитов в присутствии одного из факторов (ГМ-КСФ либо ИЛ-4) [184]. Недавно появилась работа К. С. Roy et al. [183], разработавших эффективную методику получения ДК, не уступающих по своим способностям представлять антиген ДК, развившимся в присутствии традиционной комбинации цитокинов, под воздействием одного лишь ИЛ-4. Противоречие их данных с результатами основоположников метода получения ДК из моноцитов F. Sallusto и F. Lanzavecchia можно объяснить благодаря исследованию М. В. Lutz et al., показавших, что ИЛ-4 и ГМ-КСФ синергично участвуют в повышении уровня молекул костимуляции и ГКГ-П на поверхности ДК, компенсируя недостаток одного из цитокинов [125].

Нами было исследовано влияние на экспрессию на поверхности ДК молекул костимуляции (CD86) и ГКГ-П HLA-DR ИЛ-482, альтернативного сплайс-варианта ИЛ-4, в котором отсутствуют аминокислоты, закодированные во втором экзоне [12, 205], при разных концентрациях в среде ГМ-КСФ. При нормальной концентрции ГМ-КСФ (10 нг/мл) не наблюдалось разницы в экспрессии данных маркеров между клетками, которые выращивались со стандартной комбинацией ИЛ-4 и ГМ-КСФ, либо в присутствии одного лишь ГМ-КСФ, либо ГМ-КСФ и ИЛ-482. Однако при низкой концентрации ГМ-КСФ (1 нг/мл) наблюдалась совершенно другая картина. В присутствии пониженного содержания ГМ-КСФ, но нормальной концентрации ИЛ-4 развивались клетки с морфологией и фенотипом, типичным для ДК, полученных из моноцитов по стандартной методике. Единственное отмеченное отличие заключалось в повышенной доле клеток, несущих маркер зрелых ДК CD83. В отличие от ИЛ-4, его альтернативная форма оказалась не способна поддерживать экспрессию молекул костимуляции и ГКГ-П на поверхности клеток. Мало того, цитокин ингибировал экспрессию молекул ГКГ-П, индуцированную ИЛ-4. Подобная разница в действии двух форм ИЛ-4, очевидно, объясняется тем, что ИЛ-482 не способен активировать сигнальный каскад ИЛ-4, так как связывается лишь с высокоаффинной цепью гетеродимерного рецептора ИЛ-4, но не со вспомогательным компонентом (общая у-цепь, либо а-цепь рецептора ИЛ-13) [225]. Таким образом, как и в случае В-, Т-клеток и моноцитов [17, 19], альтернативная форма ИЛ-4 действует на ДК как антагонист ИЛ-4.

Кроме того, в данной работе был прослежен вероятный механизм ин-гибиторного действия ИЛ-482 на экспрессию молекул ГКГ-П HLA-DR. Было показано, что по мере повышения концентрации альтернативной формы ИЛ-4 в среде происходит подавление как эндогенной, так и индуцированной ИЛ-4 активности транскрипционного фактора STAT6. Активность данного фактора необходима для экспрессии молекул костимуляции CD86 и ГКГ-П [52, 125], а также для развития CD4+Тх2-клеток [176].

Последнее время весьма активно исследуются иммуносупрессивные факторы. К ним относят как белки, так и небелковые факторы эукариотического и бактериального происхождения. В этой работе было исследовано воздействие на ДК иммуносупрессивного белка возбудителя чумы Yersinia pestis антигена вирулентности LcrV и липида - ганглиозида GM1 из бычьего мозга. Белок LcrV подавил экспрессию на поверхности ДК человека маркера зрелости CD83, но несколько стимулировал молекулу костимуляции CD80. В присутствии ЛПС E.coli данный антиген кооперативно стимулирловал экспрессию CD83. Таким образом, его воздействие на ДК оказалось неоднозначным, несмотря на ряд исследований, показавших его подавляющее воздействие на макрофаги [191, 195, 199-201, 203]. Параллельно было показано, что кап-сульный антиген Yersinia pestis Cafl, структурно сходный с ИЛ-1 [7, 8], стимулирует секрецию у ДК ФНО-а и является индуктором их созревания.

Функции ганглиозидов весьма разнообразны: рецепция микробных токсинов, регуляция клеточного роста, диффреренцировки и гибели [206]. Ряд опухолей отщепляет ганглиозиды в межклеточное пространство, подавляя таким образом иммунный ответ [24, 51, 86, 112, 117, 132]. Как было показано в нашей работе, ганглиозид GM1 существенно нарушает развитие ДК из КМП мыши, но не влияет на уже сформировавшиеся из моноцитов ДК человека. Негативное воздействие других ганглиозидов на ДК и другие АПК было отмечено в ряде работ других исследователей [33, 162,196,197, 233].

Бактериальный ЛПС традиционно используется как один из мощных факторов созревания ДК [4, 22, 54, 59, 89]. Однако в литературе отсутствуют данные о сравнении воздействия ЛПС различных бактерий на ДК. Было проведено сравнительное исследование влияния на созревание ДК препаратов ЛПС E.coli, S.sonnei, S.typhi («Пирогенал»), Y.pestis и F.tularensis. Препарат ЛПС внутриклеточного паразита - возбудителя туляремии - F. tularensis оказался абсолютно не способен вызывать созревание ДК. В наибольшей степени активировал ДК эндотоксин E.coli. ЛПС Y.pestis, хоть и индуцировал созревание ДК, но гораздо слабее, чем эндотоксин E.coli. По-видимому, в ходе своей эволюции некоторые патогенные бактерии оказались способны модифицировать без потери жизнеспособности даже столь консервативную структуру, как ЛПС, так чтобы она активировала слабее или даже вовсе не активировала ДК (ЛПС F.tularensis). Вероятно, это представляет собой один из способов снизить реакции иммунной системы организма хозяина.

Вакцинация препаратами ЛПС F.tularensis оказывает профилактическое протективное воздействие при последующем инфицировании вирулентными штаммами бактерий [105]. Отсутствие у него свойств эндотоксина делает его абсолютно апирогенным, что значительно снижает побочные эффекты при вакцинации ЛПС F.tularensis [105]. Однако для более эффективной вакцинации препаратами на его основе может потребоваться добавление иммуностимуляторов.

Таким образом, ряд факторов существенно влияет на иммунофенотип ДК. Изменения в иммунофенотипе ДК отражают степень их зрелости (экспрессия маркера CD83) и способность к презентации антигена (молекулы костимуляции CD80 и CD86, ГКГ-П HLA-DR).

Большинство бактериальных ЛПС активируют созревание ДК, но в разной степени. Способностью активировать ДК обладает также капсульный белок Y.pestis Cafl. Необычный инертный ЛПС F.tularensis, у которого отсутствуют свойства эндотоксина, не способен индуцировать дифференциров-ку ДК в их зрелые формы.

Ганглиозид GM1 и альтернативная форма ИЛ-4 угнетают нормальную дифференцировку ДК, так как в их присутствии падает экспрессия молекул костимуляции и/либо ГКГ-П HLA-DR.

Фактор вирулентности Y.pestis LcrV, подавляющий активность макрофагов, имеет неоднозначное влияние на иммунофенотип ДК. Кроме того, его влияние на ДК меняется в зависимости от присутствия в среде веществ, активирующих ДК (ЛПС, ФНО-а).