Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Механизмы фагоцитоза и его роль при формировании резистентности организма к возбудителям чумы, псевдотуберкулеза и туляремии



На правах рукописи

ДУБРОВИНА Валентина Ивановна

МЕХАНИЗМЫ ФАГОЦИТОЗА И ЕГО РОЛЬ ПРИ ФОРМИРОВАНИИ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА К ВОЗБУДИТЕЛЯМ ЧУМЫ, ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА И ТУЛЯРЕМИИ (экспериментальное исследование)

14.00.16. - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Иркутск - 2004

Работа выполнена в Иркутском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте Сибири и Дальнего Востока Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные консультанты: член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор КолесниковаЛюбовьИльинична

засл. деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор

Голубинский Евгений Павлович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор

СкворцоваРаисаГригорьевна доктор медицинских наук, профессор Явербаум Павел Моисеевич

доктор биологических наук ЛоншаковаКлара Сергеевна

Ведущая организация

ГУ Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Защита состоится « ¿СС&К-Х,- 2004 г. в /О часов на заседании Диссертационного совета Д. 001.054.01 при ГУ «Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения РАМН» по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ «Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения РАМН»

Автореферат разослан 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Шолохов Л. Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Чума, псевдотуберкулез и туляремия, вызываемые соответственно Yersiniapestis, Y.pseudotuberculosis и Francisella tularensis, несмотря на разную этиологию, имеют ряд общих признаков: ведущим звеном в защите организма хозяина является клеточный фактор, отмечено сходство антигенной структуры возбудителей этих инфекций, все они относятся к при-родноочаговым болезням (Олсуфьев Н.Г., 1975; Исупов И.В. и др., 1982, 1997; КокушкинА.М. и др., 1993, 1998; Домарадский И.В., 1993, 1998; Cornells G.R. et al., 1998). Все три инфекции особенно актуальны в нашей стране, поскольку их природные очаги существуют на территории как собственно России, так и ряда смежных государств. В последние годы возбудители чумы и туляремии привлекли внимание и на общемировом уровне как наиболее вероятные средства биотерроризма (Онищенко Г.Г., 2003).

С развитием молекулярной биологии появляется возможность по новому оценить факторы патогенности бактерий. Сопоставление свойств трех микроорганизмов в аналогичных условиях взаимодействия с макроорганизмом позволит внести некоторую ясность в понимание закономерностей взаимоотношений хозяин-паразит.

Накопленные к настоящему времени материалы однозначно свидетельствуют о том, что патогенность бактерий, в том числе и рассматриваемых в настоящей работе, является биологически сложным, полидетерминантным. признаком, находящимся под контролем регуляторных систем как хромосомных, так и плазмидных генов, которые ответственны за синтез макромо-. лекул, принимающих участие в развитии генерализованного инфекционного процесса (Тимченко Н.Ф., 1997; Домарадский И.В., 1998; Кутырев В.В., 1999; Анисимов А.П., 2000; Bolin I. et al., 1982, 1989; Comelis G.R. et al., 1987, 1998). Способность многих патогенных бактерий к паразитированию в фагоцитах, играющая важную роль в патогенезе инфекции, обусловлена наличием у них плазмид вирулентности (Шурыгина И.А.и др., 1994,2003; Анисимов А.П., 2002; Tertti R. et al., 1987; Brubaker R.R., 1991; Prentice M.B. et al., 2001).

С точки зрения понимания механизмов иммуногенеза и определения в связи с этим стратегии иммунопрофилактики важную задачу представляет исследование причин кратковременности иммунитета после чумной инфекции и, наоборот, развитие у людей напряженного и продолжительного постинфекционного иммунитета при туляремии (Олсуфьев Н.Г., 1975; Домарадский И.В., 1993, 1998). Поскольку в механизмах резистентности к чуме и туляремии доминирующая роль отводится клеточным факторам (Васильева Г.И., 1990; Ледванов М.Ю. и др., 1994, 1997; Стукова Н.Ю. и др., 1997; Иванова И.А., 1998), логично допустить, что в формировании иммунитета большую роль играют структурно-функциональные изменения в клетках системы мононуклеарных фагоцитов, которые недостаточно исследованы. j Р0СБ^*ЦИ0НА^ЬНА* j

Одним из актуальных направлений, связанных с изучением иммуногенеза и, соответственно, — иммунопрофилактики инфекционных болезней является поиск средств, в том числе природного происхождения, способных потенцировать реакции клеточного иммунитета макроорганизма в ответ на введение иммуногенного препарата и тем самым повысить эффективность применяемых вакцин при одновременном снижении иммунизирующей дозы препаратов и уменьшении их побочного действия.

На основании вышеизложенного целью работы является раскрытие механизмов фагоцитоза и выяснение егороли в формированиирезистентно-сти организма к чуме, псевдотуберкулезу, туляремии иразработка на этой основе принциповповышения функциональной активности фагоцитов.

Для реализации поставленной цели последовательно решались следующие основные задачи:

1. Исследовать поэтапно (хемотаксис-»адгезия-»поглощение-» слияние фагосом с лизосомами-»бактерицидные реакции->исход) закономерности фагоцитоза чумного микроба разного фенотипического состояния, в том числе в Ь-форме, моно- и полинуклеарными фагоцитами чувствительного к возбудителю чумы животного.

2. Изучить влияние фракции I и «мышиного» токсина чумного микроба на бактерицидные механизмы фагоцитоза У. pestis.

3. Выяснить особенности взаимодействия псевдотуберкулезного микроба с клетками системы мононуклеарных фагоцитов морской свинки и влияние на эти процессы плазмид рУУ48 и р\М82.

4. Выяснить особенности механизмов фагоцитоза F. tularensis в динамике развития вакцинального и инфекционного процессов.

5. Провести поиск иммуномодуляторов природного происхождения и изучить характер их воздействия на клеточные и гуморальные факторы иммунитета у экспериментального животного.

6. Разработать концептуальную схему патогенетически обоснованных принципов коррекции функционального состояния фагоцитов при взаимодействии с Y.pestis.

Научная новизна

В результате впервые проведенного комплексного сравнительного исследования охарактеризованы по ряду важнейших параметров бактерицидные механизмы фагоцитоза чумного, псевдотуберкулезного, туляре-мийного микробов разного фенотипического состояния макрофагами и полиморфиоядерными лейкоцитами экспериментальных животных.

Установлено ингибирующее влияние фракции I чумного микроба на кислородзависимые бактерицидные системы фагоцитов экспериментальных животных и синтез монооксида азота перитонеальными макрофагами. «Мышиный» токсин снижает интенсивность кислородзависимого метаболизма макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ).

Впервые показано участие в бактерицидных механизмах фагоцитоза чумного микроба макрофагами морских свинок монооксида азота, а феномен активации NO-синтазной активности макрофагов под влиянием чумного микроба предложен для оценки иммунной перестройки макроорганизма.

Приоритетными являются данные о существенных различиях во взаимоотношениях фагоцитов и чумного микроба в исходной бактериальной (нативной) и L-формах. Установлено, что чумной микроб в L-форме медленнее поглощается и оказывает меньшее повреждающее действие на фагоцит, но в большей мере стимулирует активность окислительных (глю-козо-6-фосфатдегидрогеназы, НАДФ-Н-оксидазы) и гидролитических (ли-зоцима, катепсина, кислой фосфатазы) ферментов.

Экспериментально доказано, что псевдотуберкулезный микроб при взаимодействии с макрофагами и ПЯЛ подавляет активность зависимых от кислорода бактерицидных систем. Плазмидсодержащие (pYV48, pVM82) клетки Y. pseudotuberculosis ингибируют выраженность «респираторного взрыва», снижают активность супероксиддисмутазы, миелопероксидазы, а также содержание неферментных катионных белков и тем самым угнетают бактерицндную способность фагоцитов.

Установлено, что при фагоцитозе F. tularensis (вне зависимости от вирулентности) в макрофагах и ПЯЛ экспериментальных животных активируются системы, способствующие захвату (хемотаксис, адгезия, поглощение) и внутриклеточной деградации микроба путем активации кисло-родзависимых и кислороднезависимых бактерицидных факторов. В процессе иммуногенеза, вызванном вакцинным штаммом F. tularensis 15, выявлены активация и рост завершенности фагоцитарного процесса за счет повышения функциональной активности, в частности, бактерицидного потенциала макрофагов и полиморфноядерныхлейкоцитов. При инфекционном процессе, обусловленном клетками вирулентного штамма F. tularensis 777, повышается выраженность «респираторного взрыва», активность Г6ФДГ и НАДФ-Н-оксидазы, возрастает содержание неферментных катионных белков, но снижается активность миелопероксидазы.

Впервые найдены и предложены в качестве эффективных иммуномо-дуляторов при экспериментальной чумной инфекции препарат растительного происхождения — арабиногалактан и синтезированный на его основе железосодержащий препарат — феррогал. Установлено, что оба препарата стимулируют активность и бактерицидные механизмы макрофагов в отношении чумного микроба, антителогенез, цитокининдуцирующую активность (патенты на изобретение № 2208440 от20.07.03 и № 2194715 от20.12.02).

Достоверно показана принципиальная возможность повышения про-тективных свойств живой чумной вакцины при сочетанием применении с арабиногалактаном и феррогалом.

На основе полученных экспериментальных данных и литературных материалов сформулирована концептуальная схема патогенетически обо-

снованных принципов и механизмов коррекции функционального состояния иммунной системы макроорганизма.

Теоретическое и практическое значение работы

Результаты проведенных исследований дополняют новыми научными данными сведения о современном состоянии проблемы взаимоотношения микроб—фагоцит, пополняя теоретическую основу и намечая направления изысканий в области изучения механизмов формирования резистентности макроорганизма к возбудителям чумы, псевдотуберкулеза и туляремии.

Разработаны и внедрены в практику научных исследований новые экспериментальные приемы с использованием монослоя культуры макрофагов для сравнительной количественной оценки фагоцитоза Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, F. tularensisn активности ферментов макрофагов, определяющих их бактерицидный потенциал при фагоцитозе. Разработаны методологические подходы и принципы конструирования тест-системы для обнаружения антигенов чумного микроба в монослое макрофагов с помощью антител, меченных коллоидным золотом. Теоретически и практически обоснована возможность использования показателей активности N 0 -синтазы макрофагов для оценки иммунной перестройки организма.

Сформулировано и практически обосновано перспективное направление-поиска препаратов, стимулирующих функциональную активность системы фагоцитирующих лейкоцитов при вакцинальном процессе.

Впервые патогенетически обоснованы принципы коррекции функционального состояния системы мононуклеарных фагоцитов арабиногалак-таном и феррогалом при взаимодействии с Y. pestis EV.

Экспериментально показано, что арабиногалактан может быть использован в качестве средства экстенной профилактики чумы.

Материалы исследований, представленные в диссертации, использованы при составлении пяти методических рекомендаций:

♦ «Количественная оценка цитохимических показателей ферментативной активности микро- и макрофагов крови и экссудата методом ци-тоспектро-фотометрии» (1991 г.);

♦ «Обнаружение антигенов чумного микроба в монослое макрофагов с помощью антител, меченных коллоидным золотом» (1993 г.);

♦ «Способ определения активности супероксиддисмутаз» (1999 г.);

♦ «Способ определения активности глкжозо-6-фосфатдегидрогеназы и НАДФ-Н-оксидазы в макрофагах» (2000 г.);

♦ «Использование показателей NO-синтазной активности макрофагов для оценки иммунной перестройки организма» (2003 г.).

По результатам работы оформлено пять рационализаторских предложений (1983-2001 гг.).

Разработанные методы внедрены в практику научной работы Иркутского, Ставропольского, Ростовского-на-Дону противочумных институ-

тов, Улан-Удэнского института общей и экспериментальной биологии СО РАН, Новосибирского ГНЦВБ «Вектор», Новороссийской и Тувинской противочумных станций.

Положения исследования, выносимые на защиту

1. Внутриклеточная инактивация Y.pestis, Y. pseudotuberculosis и F. tularensis осуществляется с участием однотипных механизмов неспецифической резистентности макроорганизма. Универсальным свойством фа-гоцитов,проявляющимсяпривнедрении Y.pestis, Y.pseudotuberculosisили F. tularensis, является повышение активности систем кислородзависимого метаболизма. Фагоцитоз чумного, псевдотуберкулезного и туляремийно-го микробов макрофагами и ПЯЛ является преимущественно незавершенным. Чумной микроб в L-форме оказывает меньшее повреждающее действие на фагоциты. Фракция I и «мышиный» токсин чумного микроба ин-гибируют кислородзависимые и кислороднезависимые бактерицидные системы фагоцитов.

2. Плазмиды pYV48 и pVM82 как факторы патогенности Кpseudotuberculosis обусловливают повышение устойчивости псевдотуберкулезного микроба к фагоцитозу и последующей деструкции в макрофагах и ПЯЛ.

3. При фагоцитозе F. tularensis активируются системы, способствующие захвату и внутриклеточной деградации микроба путем активации кис-лородзависимых и кислороднезависимых бактерицидных факторов фагоцитов. В случае фагоцитоза микробов вакцинного штамма деструктивные изменения в макрофагах выражены в меньшей степени и наступают в более поздние сроки, чем при фагоцитозе вирулентных бактерий.

4. Арабиногалактан и феррогал оказывают стимулирующее действие на фагоцитарную активность и бактерицидные механизмы фагоцитоза пе-ритонеальных макрофагов морской свинки в отношении Y. pestis.

Апробация работы

Материалы, изложенные в диссертации, представлены и обсуждены на:

♦ международных научных конференциях — «Идеи Пастера в борьбе с инфекцией» (Санкт-Петербург, 1995), «Проблемы иерсиниозов и других актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2000), «Природно-очаговые инфекции» (Улан-Батор, 2000-2003), «Проблемы биологической и экологической безопасности» (Оболенск, 2000), «Современный эпидемический потенциал природных очагов чумы» (Талдыкурган, 2001), «Проблема инфекции в клинической медицине»;

♦ международном симпозиуме по противочумной стратегии (Байчен, КНР, 1999);

♦ V международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Санкт-Петербург, 2001);

• VIII съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням (Санкт-Петербург, 2002);

• международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней — прогресс и проблемы» (Санкт-Петербург, 2003);

• Всероссийских научных конференциях — «Экологозависимая патология» (Чита, 1999), «Проблемы медицины и биологии» (Кемерово, 1999), «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2000), «Фитотерапия, лазеротерапия и клинические аспекты использования в медицине инновационных технологий и функциональных продуктов на основе природных компонентов» (Черниголовка, 2002), «Актуальные проблемы микробиологической безопасности Российской Федерации» (Киров, 2003);

• Всероссийском научно-практическом молодежном симпозиуме «Экология Байкала и Прибайкалья» (Иркутск, 1999, 2000);

•'региональных научно-практических конференциях — «Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезней» (Ставрополь, 1993), научная конференция, посвященная 60-летию противочумного института Кавказа и Закавказья (Ставрополь, 1995), «Наука, образование, новые технологии» (Иркутск, 2000), «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Барнаул, 1999), «Актуальные аспекты природноочаговых болезней» (Омск, 2001), «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе» (Ставрополь, 2002), «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создание функциональных продуктов» (Москва, 2003), «Актуальные проблемы современной инфектологии» (Иркутск, 2003); научных конференциях Иркутского противочумного института (Иркутск, 1992—2004).

Диссертация оформлена на основе материалов плановых тем (1986— 2000 гг.) и результатов текущей НИР (2001-2004 гг.).

Публикации

Основное содержание работы отражено в 52 публикациях, из них 36 — в центральных издания, в том числе 14 — в рекомендованных ВАК, 9 — в зарубежных изданиях, в монографии «Функциональные особенности фагоцитов при инфекционном и вакцинальном процессе, вызываемом Francisella tularensis» и двух патентах на изобретения.

Объем и структура диссертации

Диссертация состит из введения, 6 глав, в которых представлены обзор литературы, материал и методы исследования, собственные результаты и их обсуждение, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 260 страницах, полученные результаты представлены в 66 таблицах, иллюстрированы 59 рисунками в виде графиков, диаграмм и микрофотографий.

Список использованной литературы содержит 400 источников, из которых 171 опубликован в отечественных и 237 — в зарубежных изданиях.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При выполнении работы (заражение и вакцинация экспериментальных животных, постановка реакций фагоцитоза, получение бактерий в L-форме, изоляция антигенных препаратов и т.д.) использовали штаммы Y.pestis И-2638, И-2887 и EV НИИЭГ (далее - EV), Y. pseudotuberculosis И-716, И-727 и 53, F tularensis 111 и 15 НИИЭГ (далее - 15). Все штаммы до включения в опыты хранились в лиофилизированном состоянии в музее живых культур НИПЧИ, обладают характерными для представителей соответствующего вида культурально-морфологическими и биохимическими свойствами.

Штамм Y.pestis И-2638 изолирован в 1977 г. от суслика длиннохвостого в Тувинском (Монгун-Тайгинском) природном очаге чумы, вирулентен при парентеральном введении для морских свинок (ЛД50 5 м.к.) и белых мышей (7,9 м.к.). Штамм Y.pestis И-2887 получен в европейской части России, ЛД50 для белых мышей составляет 10 м.к. Штамм Y. pestis EV — вакцинный, авирулентен для экспериментальных животных.

Штаммы Y. pseudotuberculosis выделены в регионах Сибири, принадлежат к I серовару. Штамм Y pseudotuberculosis И-716 содержит плазмиды вирулентности pYV48 и pVM82, И-727 — только плазмиду pYV48. Оба штамма вирулентны для мышей BALB/c, вызывая при внутрибрюшинном введении в дозах соответственно 108 и 5 х 108 м.к. гибель животных на 5—6 сут. Штамм Y. pseudotuberculosis 53 — селекционированный бесплазмидный, ави-рулентный для мышей.

Плазмидный состав Y. pseudotuberculosis анализировали в соответствии с методикой Т. Kieser (1984) в модификации СВ. Балахонова с соавт. (1999) на аппарате для вертикального гель-электрофореза при напряжении электрического поля не менее 4-5 в/см и источником УФ-излучения с длиной волны 254-302 нм. Для скрининга плазмид использовали суточные культуры псевдотуберкулезного микроба, выращенные на казеиново-дрожжевом пластинчатом агаре, содержащем триптозу.

Штамм F. tularensis 777 изолирован в 1963 г. в Республике Бурятия, вирулентен для белых мышей (ЛД50 1 м.к.). Штамм F. tularensis 15 — вакцинный, авирулентен для экспериментальных животных.

Для вакцинации морских свинок использовали живые чумную или туляремийную вакцины на основе штаммов Y. pestis EV и F. tularensis 15, для воссоздания экспериментального инфекционного процесса — штаммы Y. pestis И-2638, И-2887 и F. tularensis 777.

Чумной микроб в L-форме получали из клеток вакцинного (EV) и вирулентного (И-2638) штаммов по методике В.Д. Тимакова, Г.Я. Каган (1973) в модификации (Изучение роли Л-форм ..., 1990). Среду Л готовили добавлением в среду 199 0,1% глюкозы, 0,02 М MgCl2 (в качестве осмотических стабилизаторов), 10% нормальной лошадиной сыворотки и 200 ед./мл пенициллина (последний — в качестве L-трансформирующего фактора).

Антигенный состав бактерий изучали с помощью иммунофермент-ного анализа (ИФА), реакции двойной радиальной иммунодиффузии (РИД) и с помощью антител, меченных коллоидным золотом. Капсуль-ный антиген (фракция I, Ф1) чумного микроба получали из клеток вакцинного штамма Y. pestis EV тремя способами — фракционированием бульонного экстракта сернокислым аммонием, изоэлектрической преципитацией и одноэтапной гелевой фильтрацией. «Мышиный» токсин (МТ, ФИ) извлекали из культуральной жидкости, полученной при глубинном культивировании Y.pestisEV.

Экспериментальными моделями в основных опытах (заражение, иммунизация, отбор проб крови, получение фагоцитов и т.д.) служили беспородные морские свинки (весом 300—350 г) и белые мыши (18—20 г), в ряде случаев — кролики породы шиншилла (2,0—2,5 кг) и мыши линий BALB/c и СВА ХС 57 BL/F1. Всего в опытах использовано 4653 животных: 3400 — морских свинок, 30 — кроликов, 1200 — белых и 15 — линейных мышей, 8 — белых крыс. Количество животных в каждом опыте подбирали с расчетом получения статистически достоверных результатов. Животных из экспериментов выводили воздушной эмболией сосудов сердца.

Перитонеальные макрофаги получали по общепринятой методике (Учитель И.Я. и др., 1978) без предварительной стимуляции или после стимуляции внутрибрюшинным введением пептона, альвеолярные макрофаги — путем промывания средой 199 изолированных долей легкого (Фрейд-лин И.С, 1986). Источником ПЯЛ служил перитонеальный экссудат морских свинок (Hirsch J.G., 1956).

Лизосомы получали в соответствии с рекомендациями А. Баррет, М.Ф. Хит (1980) в нашей модификации.

Величины хемотаксиса фагоцитов определяли по методу М. Нельсона в изложении И.С. Фрейдлин (1986), в основе которого лежит оценка локомоторной способности фагоцитирующих клеток под агарозой. Адгезивные свойства макрофагов морских свинок исследовали по методу И.С. Фрейдлин (1986). В том и другом случаях рассчитывали индексы хемотаксиса (ИХ) и адгезии (ИА).

При изучении фагоцитарной активности клеток системы мононукле-арных фагоцитов использовали переживающую однослойную культуру пе-ритонеальных или альвеолярных макрофагов (Фрейдлин И.С, 1984,1986). Интенсивность фагоцитоза оценивали по фагоцитарному числу, проценту активных фагоцитов, цитопатическому действию бактерий и индексу завершенности фагоцитоза. Частоту слияния фагосом с лизосомами контролировали с помощью прижизненного флуорохромирования культуры клеток акридиновым оранжевым (Horwits M.A., 1984).

Активность лизоцима (КФ 3.2.1.17) в фагоцитах оценивали по способности фермента уменьшать мутность взвеси клеток Micrvcoccus luteus и регистрировали спектрофотометрически при 1 = 600 нм (Методы биохимических исследований, 1982). Для определения активности катепсина Д (КФ 3.4.23.5)

использовали метод M.L. Anson (1940) в модификации А.Дж. Баррета, М.Ф. Хита (1980). Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ, КФ 1.1.1.49) изучали по методам Р.П. Нарциссова (1969) и М.И. Прохоровой (1982), НАДФ-Н-оксидазы (КФ 1.6.2.) - по методу Р.П. Нарциссова (1969) и R.L. Baehner, D.G. Nathan (1968) в нашей модификации (Голубинский Е.П. и др., 1995), супероксиддисмутазы (СОД, КФ 1.15.1.1) — по методу Б.Н. Матюшина и др. (1991), NO-синтазы — по методу S.J. Green с соавт. (1994) в нашей модификации, кислой фосфатазы (КФ 3.1.3.2) — по методу F.I. Miggiano в модификации Т.Л. Бурой с соавт. (1991), миелопероксидазы (МПО, КФ 1.11.1.7) и содержание неферментных катонных белков (НКБ) — по методу В.Е. Пигаревского, Ю.А Мазинг (1981) и спектрофотометрически (Бурая Т.Л. и др., 1991), Для оценки интенсивности образования в фагоцитирующих клетках метаболитов кислорода использовали НСТ-тест (Park B.H. et al., 1968) и метод хемилюминесценции (ХЛ) (Allen R.C., Loose L.D., 1976). Электронно-микроскопическое изучение проводили в соответствии с методикой R.C. Graham, M.J. Karnovsky (1966). Интерлейкин-1 (ИЛ-1), интерлейкин-6 (ИЛ-6), фактор некроза опухоли-а (ФНО-а), интерферон-у (ИНФ-у) выявляли в культуре макрофагов с помощью иммуноферментного метода (тест-система на основе моноклональных антител, «Calteg», Канада). Содержание белка в препаратах определяли по О.Н. Lowry с соавт. (1951) и М.М. Bradford (1976). Статистическую обработку результатов опытов проводили по методам И.А. Ойвина (1960), И.П. Ашмарина, А.А. Воробьева (1962), Е.В. Монцевичюте-Эрингене (1964).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Механизмы фагоцитоза Yersinia pestis разных фенотипических форм

Полученные материалы дают основание констатировать, что уже на начальных этапах фагоцитарного процесса — хемотаксиса фагоцита в направлении чумного микроба и последующей его адгезии — характер взаимодействия фагоцит-микроб определяется свойствами как микробной, так и фагоцитарной клеток. Установлено, что по скорости хемотаксиса очевидным преимуществом обладают перитонеальные макрофаги, которые по этому признаку существенно превосходят ПЯЛ и особенно — альвеолярные макрофаги. Эти же макрофаги с большей скоростью мигрируют в направлении чумного микроба в бактериальной, чем в L-форме, что может быть связано с дефектностью последних по Ф1. Различия в скорости миграции фагоцитов, обусловленные вирулентностью объекта фагоцитоза, прослеживаются только в случае перитонеалъных макрофагов. Четкой зависимости хемотаксической активности альвеолярных макрофагов и ПЯЛ от вирулентности или фенотипического состояния чумного микроба установить не удалось.

Вакцинный штамм Y.pestis БУ при подкожной иммунизации морских свинок активирует хемотаксические функции фагоцитов в отношении чумного микроба. В наибольшей мере стимулируется подвижность перитоне-альных макрофагов. Альвеолярные макрофага и ПЯЛ, особенно первые, сенсибилизируются в процессе иммуногенеза в меньшей степени. Подвижность фагоцитов каждого из трех испытанных видов в направлении клеток вакцинного (БУ) и вирулентного (И-2638) штаммов примерно одинакова. Однако и макрофаги, и ПЯЛ иммунных морских свинок в отношении чумного микроба в Ь-форме менее подвижны, чем в бактериальной. Возможно, вследствие деградации клеточной стенки Ь-бактерии менее «привлекательны» для фагоцитов.

Перитонеальные макрофаги морских свинок превосходят альвеолярные и по адгезивной активности, что в равной мере относится к исходным авирулентным, вирулентным клеткам и их Ь-производным (табл. 1).

Таблица 1

Адгезивные свойства макрофагов морской свинки при фагоцитозе

Y.pestis (Mim)

Макрофаги У. pestis EV У. pestis И-2638

в бактериальной форме. в L-форме в бактериальной форме в L-форме

ИА у перитонеальных макрофагов

Интактных животных 43,5 ±0,2* 50,1 ± 0,9 30,4 ±0,4 36,3 ±0,8

Иммунных животных 54,7 ±0,9* 69,9 ±1,2* 49,6 ±1.7* 59,9 ±0,7'

ИА у альвеолярных макрофагов

Интактных животных 34.2 ±1,3 46,7 ±0,8 29,9 ±1,1 34,0 ±0,3

Иммунных животных 47,7 ±1.1 61,9 ±5,4 40,4 ±1,4 53,6 ±2,1

Примечание: * - р s 0,05.

При иммунизации животных У. pestis БУ адгезивная активность как перитонеальных, так и альвеолярных макрофагов ко всем объектам фагоцитоза существенно возрастает. Однако и в этом случае перитонеальные макрофаги обладают более высоким функциональным потенциалом, чем альвеолярные, поскольку после иммунизации ИА у первых быстро возрастает более чем в два раза, тогда как у вторых — на 75-80 %. Интересно, что адгезивная способность макрофагов при фагоцитозе чумного микроба вакцинного штамма (и в бактериальной, и в Ь-формах) статистически достоверно более выражена, чем клеток вирулентного штамма.

Контакт фагоцита с чужеродным объектом, достигаемый посредством хемотаксиса и адгезии, при определенных условиях обеспечивает следующую стадию их взаимодействия — поглощение, в результате которого

объект, в нашем случае — У. pestis, оказывается в фагосоме, которая далее сливается с лизосомой, формируя фаголизосому. Именно главным образом на этом этапе проявляется действие бактерицидных систем фагоцитов, в которых ключевую роль играют продуцируемые ими активные формы кислорода.

При изучении фагоцитарной активности установлено, что количество микробов, поглощенных макрофагами (перитонеальными и альвеолярными) и ПЯЛ морской свинки, если судить по фагоцитарному числу, нарастает по мере увеличения продолжительности взаимодействия с объектом фагоцитоза: через 3 ч контакта число микробов в фагоците в 1,5—2 и более раз выше, чем через 30 мин. Перитонеальные и альвеолярные макрофаги по фагоцитарной активности существенно превосходят ПЯЛ, но между собой по этому признаку различаются незначительно.

Выраженных различий в активности фагоцитов в отношении клеток вакцинного и вирулентного штаммов чумного микроба не отмечено. Обращает, однако, внимание, что и макрофаги обоих видов, и ПЯЛ по отношению к микробу в Ь-форме намного менее активны (р < 0,01), чем к клеткам в бактериальной форме. В перитонеальных макрофагах через 3 ч инкубации с микробами вакцинного и вирулентного штаммов У. pestis количество поглощенных клеток в бактериальной форме было соответственно в 2,2-8,6 и в 1,2—3,4 раза больше, чем клеток в Ь-форме. У альвеолярных макрофагов коэффициенты превышения составляют соответственно 1,9-2,6 и 3,2-5,2, у ПЯЛ - 1,6 и 1,9-2,0. Число фагоцитарноак-тивных клеток в отношении чумного микроба в бактериальной форме достигало у перитонеальных макрофагов 70—100 %, у альвеолярных — 70— 90 %, тогда как в отношении Ь-микроба не превышало 37—90 % и 30— 80 %, соответственно.

Предварительная иммунизация подопытных морских свинок не оказывает существенного влияния на фагоцитарную активность альвеолярных макрофагов и ПЯЛ. Перитонеальные макрофаги иммунных животных (при сравнении по фагоцитарному числу) превосходят, особенно в случае Ь-бактерий, аналогичные клетки интактных животных. Вместе с тем, число фагоцитарноактивных макрофагов обоих типов от иммунных животных независимо от объекта фагоцитоза достигало 100 %.

Фагоцитоз макрофагами и ПЯЛ чумного микроба независимо от его вирулентности (вакцинный штамм У. pestis БУ или вирулентный У pestis И-2638), морфологического состояния (в бактериальной или в Ь-формах) и преиммунизации животных-доноров носит в большинстве случаев (80— 90 %) незавершенный характер, то есть поглощенные клетки продолжают размножаться в фагоцитах.

Однако если ориентироваться не только на количественную, но и на качественную стороны взаимодействия фагоцит—микроб, то последствия их контакта в достаточно полной мере вскрывают материалы цитологического исследования.

Показано, в частности, что при взаимодействии с чумным микробом, особенно вирулентным штаммом Y.pestis И-2638, имеет место выраженное цитопатическое действие бактериальной клетки на фагоцит. Среди перитонеальных и альвеолярных макрофагов наибольшее количество поврежденных клеток регистрируется при фагоцитозе У.pestis (и БУ, и И-2638) в бактериальной форме. Чумной микроб в Ь-форме оказывает заметно меньшее деструктивное воздействие.

При изучении динамики фагоцитоза на ультраструктурном уровне отмечено, что макрофаги интактных и иммунных животных наиболее активно поглощают чумные микробы (и в бактериальной, и в Ь-формах) в первые 30 мин контакта с ними. На этом этапе фагоцитоза бактерии в Ь-форме можно наблюдать на поверхности макрофагов, на стадии поглощения многочисленными псевдоподиями, а также Енутри некоторых фаго-лизосом. Через 3 ч контакта количество бактерий в Ь-форме внутри фаго-лизосом увеличивается, некоторые микробные клетки находятся в стадии деления. Таким образом, по морфологическим данным можно говорить о размножении микробов в фаголизосомах макрофагов. В фагоцитах от иммунных животных происходит частичная деструкция некоторых микробов с одновременным размножением других. Часто этот процесс протекает в одной фаголизосоме.

В случае поглощения клеток вакцинного штамма У. pestis БУ проявления их цитотоксичности и деструкции фагоцитов были менее выраженными и наступали в более поздние сроки, чем при фагоцитозе вирулентных клеток чумного микроба.

Положительный эффект вызывала иммунизация морских свинок: полученные от них макрофага подвергались меньшему цитопатическом воздействию со стороны чумного микроба как в исходной бактериальной, так и Ь-формах, чем макрофаги интактных животных.

Для оценки функциональной активности фагоцитов, связанной с поглощением чумного микроба, мы исследовали интенсивность окислительно-восстановительных реакций в интактных и фагоцитирующих макрофагах и ПЯЛ морских свинок и линейных мышей.

С учетом этих данных интересную дополнительную информацию могло дать исследование хемилюминесцентного ответа фагоцитов при поглощении ими чумного микроба, в том числе в бескапсульном (Ь-форма) состоянии.

Полученные нами материалы свидетельствуют о том, что кинетика хемилюминесцентного ответа ПЯЛ экспериментальных животных на У. pestis характеризовалась двумя фазами — интенсивной вспышки сразу после соединения фагоцитов с микробом и постепенного затухания. Однако длительность фаз и интенсивность процесса у ПЯЛ морских свинок и белых мышей в значительной степени зависели как от происхождения и состояния самих лейкоцитов, так и свойств фагоцитируемого объекта (рис. 1).

У ПЯЛ интактных морских свинок при фагоцитозе чумного микроба в бактериальной форме показатель ХЛ достигал максимума через 15—18 мин, тогда как в Ь-форме — только через 30—40 мин. Несмотря на это, при фагоцитозе чумного микроба в Ь-форме хемилюминесцентный ответ был заметно более интенсивным, чем в случае клеток в бактериальной форме.

Хемилюминесцентный ответ ПЯЛ белых мышей при фагоцитозе У. был несколько иным. У лейкоцитов интактных животных ХЛ по степени выраженности при контакте с чумным микробом в бактериальной и Ь-формах была примерно одинаковой, причем хемилюминесценция достигала максимума через 11—14 и затухала через 60—100 мин — заметно быстрее, чем у ПЯЛ морских свинок. У ПЯЛ иммунных белых мышей хемилюминесценция при взаимодействии с У. оказалась более высокой, чем у лейкоцитов интактных животных. Важно при этом заметить, что хемилю-минесцентный ответ ПЯЛ иммунных белых мышей на чумной микроб в Ь-форме в 1,5 раза интенсивнее, чем на микроб в бактериальной форме.

Полученные результаты позволили заключить, что при фагоцитозе чумного микроба и в бактериальной, и в Ь-формах независимо от вида экспериментального животного увеличивается продукция активных форм кислорода, обеспечивающих бактерицидность ПЯЛ. Чумной микроб в Ь-форме при поглощении его лейкоцитами провоцировал более интенсивный «респираторный взрыв» и, следовательно, более интенсивную выработку активных форм кислорода, чем в бактериальной форме. Поскольку главное различие между чумными микробами в бактериальной и Ь-формах состоит в отсутствии (дефиците) у последних фракции I, имеются основания предполагать, что Ф1 оказывает блокирующее, вернее, — ингибирующее влияние на «респи-

раторный взрыв», тем самым снижая выработку активных форм кислорода (АФК) и, как следствие, — бактерицидную способность фагоцитов.

Дополнительные материалы для выяснения механизмов фагоцитоза чумного микроба получены при исследовании окислительной активности макрофагов и ПЯЛ в НСТ-тесте, результаты которого оценивали параллельно по степени восстановления нитросинего тетразолия в формазан (ЦПА, у.е.) и количеству формазанположительных клеток (ФП, %). Результаты исследования позволили констатировать, что фагоцитоз чумного микроба перитонеальными, альвеолярными макрофагами и ПЯЛ независимо от вирулентности штаммов индуцирует существенный рост активности кислородзависимого метаболизма в фагоцитах всех трех видов. Показатели НСТ-теста у макрофагов и ПЯЛ, фагоцитирующих У. pestis в бактериальной форме, оказались существенно ниже, чем в случае поглощения ими Ь-бак-терий. Предварительная специфическая иммунизация экспериментальных животных повышает функциональные способности макрофагов и ПЯЛ, что проявляется дальнейшей активацией продукции активных форм кислорода.

Характеристику бактерицидных факторов фагоцитов морской свинки при поглощении чумных микробов дополняют материалы изучения мие-лопероксидазы и неферментных катионных белков ПЯЛ в присутствии клеток авирулентного (Y.pestis БУ) и вирулентного (У.pestis И-2638) штаммов чумного микроба. Нами показано, что активность миелопероксидазы и содержание НКБ в ПЯЛ морских свинок в процессе фагоцитоза чумного микроба прогрессивно снижаются по мере увеличения продолжительности контакта фагоцита с микробом. Специфическая иммунизация морских свинок несколько повышает общий уровень активности миелопероксидазы ПЯЛ по сравнению с тем, что имеет место у лейкоцитов интактных животных, однако и в этом случае тенденция снижения активности миелопероксида-зы с увеличением продолжительности взаимодействия с микробом сохраняется. Подобная тенденция носит универсальный характер, поскольку примерно в равной мере наблюдается при фагоцитозе вирулентных и авиру-лентных клеток, микробов в бактериальной и Ь-формах (табл. 2).

Таблица 2

Активность миелопероксидазы полиморфноядерныхлейкоцитов _при фагоцитозе У.pestisИ-2638 (Mint)_

Объект фагоцитоза Время контакта Альвеолярные лейкоциты Перитонеальные лейкоциты

интактных животных иммунных животных интактных животных иммунных животных

в бактериальной форме 30 мин 2,00 ±0,01* 2,52 ±0,19* 1,83 ±0,10* 2,28 ±0,19*

180 мин 1,38 ±0,09* 1,47 ±0,09* 1,24 ±0,01* 1,32 ±0,19*

в 1,-форме 30 мин 1,84 ±0,20* 2,44 ±0,19* 1,76 ±0,20* 2,15 ±0,10*

180 мин 1,25 ±0,10* 1,34 ±0,19* 1,05 ±0,05* 1,18 ±0,12*

Контроль 2,95 ±0,20 3,25 ±0,01 2,78 ±0,10 2,80 ±0,19

Примечание: * - р <. 0,05.

Приведенные материалы затруднительны для однозначной оценки. Очевиден, однако, тот факт, что при поглощении чумного микроба — вирулентного или авирулентного, в бактериальной или Ь-формах — в фагоците развивается целый каскад взаимосвязанных реакций, направленных на ограничение патогенных функций микроорганизма. В качестве одной из таких реакций, безусловно, следует рассматривать и активацию кис-лородзависимого метаболизма (КЗМ), поскольку накопление активных форм кислорода повышает бактерицидные функции фагоцита по отношению к чужеродному агенту. Не совсем ясно с этой точки зрения то обстоятельство, что фагоцитоз У. pestis в Ь-форме сопровождается более высокими показателями, характеризующими окислительно-восстановительные процессы в фагоцитах, чем клеток в бактериальной форме. Вполне вероятно, что эти различия обусловлены не только неодинаковой стимуляцией физиологических функций фагоцитов. На наш взгляд, причиной этого явления может быть ингибирующее действие на кислородзависимый метаболизм Ф1, носителем которой является У. pestis в бактериальной форме.

Убедившись в том, что У.pestis, вступив во взаимодействие с фагоцитом, вызывает в нем серьезную модификацию бактерицидных реакций, мы в дальнейшем поставили задачу исследовать, влияет ли чумной микроб и каким образом на активность ферментов, задействованных в окислительных превращениях органических субстратов. С этой целью мы изучили активность одного из ключевых ферментов пентозомонофосфатного цикла — Г6ФДГ, катализирующей окисление глюкозо-6-фосфата, и НДДФ-Н-оксидазы, обеспечивающей регенерацию нуклеотидфосфата.

Результаты проведенного исследования показали, что фагоцитоз чумного микроба макрофагами и ПЯЛ сопровождается активацией Г6ФДГ, что свидетельствует об усилении окисления глюкозы в гексозомонофос-фатном шунте и, как следствие, — активной наработке НАДФ. Одновременно с активацией Г6ФДГ повышается активность НАДФ'Н-оксидазы, что обеспечивает регенерацию НАДФ, усиление бактерицидного метаболизма и соответственно — повышение бактерицидного эффекта в отношении поглощенных микроорганизмов.

В процессе иммуногенеза происходит модификация ферментативных систем, обеспечивающих антимикробное действие фагоцитов, о чем свидетельствует более высокий уровень активности Г6ФДГ и НАДФ-Н-окси-дазы в макрофагах и ПЯЛ иммунных животных (морских свинок).

Активация КЗМ обеспечивает фагоцитам более высокий уровень бактерицидной способности, которая, однако, носит дифференцированный характер в зависимости от свойств фагоцитируемого микроорганизма. Существенно более низкие показатели активности Г6ФДГ и НАДФ-Н-окси-дазы при фагоцитозе чумного микроба в бактериальной форме свидетельствуют об ограниченной способности У.pestisвЬ-форме ингибировать КЗМ фагоцитов, что может отражаться на его дальнейшей судьбе в макроорганизме.

Принято считать, что окислительную деградацию фагоцитированных микробов облегчает расщепление их лизосомальными ферментами, которые сами при этом модифицируются. Известно, например, что чумной микроб способен снижать активность ряда ферментов макрофагов, в том числе лизоцима, 5'-нуклеотидазы, и уменьшать количество НКБ (Зонова-И.В., 1989; Руднев СМ., 1992). Указанные обстоятельства побудили нас изучить активность лизосомальных ферментов, существенно определяющих киллерную способность фагоцитов — лизоцима, катепсина Д и кислой фосфатазы.

Проведенные эксперименты показали, что в фагоцитирующих чумной микроб перитонеальных макрофагах интактных морских свинок возрастает, по сравнению с контрольными значениями (нефагоцитирующие клетки), активность катепсина Д и особенно лизоцима, но заметно снижается активность кислой фосфатазы.

Динамика изменения активности лизосомальных ферментов ПЯЛ интактных морских свинок носит несколько иной характер, чем у макрофагов. Характерной особенностью ПЯЛ является высокий уровень в них активности лизоцима, который почти на порядок выше, чем в макрофагах (10,1—17,5 против 3,3—6,3), а при фагоцитировании чумного микроба еще более возрастает. В отличие от макрофагов, в фагоцитирующих ПЯЛ интактных животных возрастает активность не только катепсина Д, но и кислой фосфатазы.

Иммунизация морских свинок против чумы достоверно (р < 0,05) повышала активность лизосомальных ферментов как в нефагоцитирую-щих перитонеальных макрофагах, так и при фагоцитозе У. pestis. Вместе с тем, и на новом, более высоком уровне, основные закономерности, отмеченные при рассмотрении результатов опытов с макрофагами интакт-ных животных, сохранялись.

Выявлены определенные различия в ответной реакции фагоцитирующих и интактных перитонеальных макрофагов и ПЯЛ при взаимодействии с У. pestis БУ в бактериальной и Ь-формах. Если активность всех трех лизосомальных ферментов — лизоцима, катепсина Д и кислой фосфатазы — в фагоцитирующих макрофагах иммунных морских свинок была закономерно более высокой в случае поглощения чумного микроба в бактериальной, чем в Ь-форме, то в ПЯЛ интактных морских свинок, наоборот, активность катепсина и фосфатазы интенсивнее возрастала при фагоцитозе Ь-бактерий. На наш взгляд, столь выраженные различия в поведении фагоцитов иммунных и интактных животных обусловлены рядом факторов. Поскольку для иммунизации животных использовали клетки полноценного по антигенной структуре штамма У. pestis БУ, можно допустить, что киллерные функции фагоцитов иммунных животных направлены в первую очередь и на полноценные в антигенном отношении клетки. Не исключено, что подобные различия могут быть связаны и с неодинаковой ролью исследованных фагоцитов в иммуногенезе и судьбе поглощенного

материала. Известно, что ПЯЛ осуществляют уничтожение и деградацию фагоцитированных объектов, в чем задействованы благодаря своим бактерицидным свойствам лизоцим и кислая фосфатаза. В макрофагах, помимо киллинга, осуществляются обработка и подготовка антигенов для представления лимфоцитам, благодаря чему, возможно, активируется катеп-син Д, осуществляющий внутриклеточный протеолиз.

По имеющимся данным (Катурга Л.Н. и др., 1985), в организме теплокровного хозяина довольно быстро происходит реверсия чумного микроба из Ь- в обычную бактериальную форму, что сопровождается генерализацией инфекции с возникновением бактериемии. По мнению Л.Н. Классовско-го с соавт. (1981), при наличии благоприятных экологических условий единичные зверьки с генерализованной чумой могут положить начало развитию новой эпизоотической волны. С подобной версией можно, видимо, согласиться, однако она, тем не менее, не отвечает на вопрос, каким образом могут появиться первые особи с генерализованной инфекцией. В связи с этим следует, на наш взгляд, снова обратиться к роли в персистенции чумного микроба фракции I. С позиций полученных нами данных представляется до некоторой степени односторонним взгляд (Пустовалов В.Л., 1984), согласно которому Ф1, как один из факторов вирулентности связана не с устойчивостью чумного микроба к захвату фагоцитами, а с его способностью выживать и размножаться внутри клетки. Если принять во внимание наши материалы о том, что при отсутствии или дефиците у чумного микроба в Ь-форме Ф1 снижается способность фагоцитов к хемотаксису и адгезии, нельзя исключить того, что именно в таком виде возбудитель чумы как достаточно инертный чужеродный агент, может какое-то, иногда продолжительное, время переживать в организме животного, а при благоприятных условиях реверсировать в вирулентную форму.

Нами показано, что при иммунизации экспериментальных животных У. pestis БУ в фагоцитах стимулируются биохимические реакции, ответственные за внутриклеточную инактивацию и деструкцию бактерий. Тем не менее, фагоцитоз чумного микроба макрофагами и ПЯЛ в иммунном и тем более — в неиммунном организме носит, как отмечено выше, незавершенный характер. Поскольку роль индивидуальных антигенов возбудителя чумы в этом процессе остается нераскрытой, мы изучили влияние на активность бактерицидных систем и ультраструктуру фагоцитов Ф1 и «мышиного» токсина. Результаты проведенного исследования с применением комплекса биохимических, иммунохимических и электронно-микроскопических методов позволили констатировать, что и Ф1, и «мышиный» токсин представляют собой биологически активные субстанции чумного микроба, обладающие широким спектром воздействия на фагоцитарную клетку.

При подкожной инъекции в дозах до 20 мкг Ф1 способствовала росту числа формазанположительных клеток среди ПЯЛ крови морских свинок, что свидетельствует об ее участии в модификации КЗМ фагоцитов в целом, реализуемом путем воздействия на отдельные звенья фагоцитарного

процесса. Уже в первые минуты контакта с фагоцитом in vitro Ф! оказывает угнетающее воздействие на активность Г6ФДГ перитонеальных макрофагов, в меньшей мере — ПЯЛ морских свинок, хотя при парентеральном введении животным этот Аг каких-либо закономерных изменений в активности Г6ФДГ фагоцитов в период наблюдения (24 сут) не вызывал. Иным оказался характер воздействия Ф1 на НАДФ-Н-оксидазу — другого участника бактерицидной системы фагоцита. Материалы исследования свидетельствуют о том, что в макрофагах морских свинок, иммунизированных Ф1, уже через сутки, но особенно на 14—21 сут после введения фракции, происходит активация НАДФ-Н-оксидазы. Скорость окисления НАДФ-Н еще более возрастает в фагоцитирующих чумной микроб макрофагах. При иммунизации Ф1 в ПЯЛ морских свинок зафиксированы активация МПО, но заметное снижение уровня НКБ.

In vitrv Ф1 ингибировала NO-синтазу перитонеальных макрофагов морской свинки (рис. 2), что, естественно, приводило к снижению содержания в них такого мощного бактерицидного фактора, как монооксид азота.

Рис.2. Продукция монооксида азота перитонеальными макрофагами морской свинки под действием фракции I чумного микроба (М±т).

По этому свойству Ф1 отличалась от бактериальных клеток чумного микроба и изолированному из них ЛПС, которые, по нашим данным, активировали активность указанного фермента.

Под влиянием Ф1 модифицируется и активность лизосомальных ферментов фагоцитов. В перитонеальных макрофагах морской свинки снижается активность кислой фосфатазы, катепсина Д и лизоцима. В ПЯЛ в аналогичных условиях отмечено, наоборот, повышение активности всех четырех исследованных ферментов — кислой фосфатазы, лизоцима, катепсина Д и миелопероксидазы. По характеру и спектру воздействия на лизосомальные ферменты Ф1 существенно отличалась от целых клеток У увяИя БУ.

Заслуживающим внимание свойством оказалась способность Ф1 стимулировать продукцию ИЛ-1, ИЛ-би ФНО-а. Это обстоятельство позво-

ляет говорить о возможности активации при чумной инфекции работы компонентов цитокинового каскада, способствующей, в свою очередь, целенаправленному формированию иммунного ответа.

Таким образом, экспериментально показано, что как in vitro, так и in vivo Ф1 вызывает сдвиги в активности бактерицидных составляющих фагоцитов — продукции активных форм кислорода, НАДФ-Н-оксидазы, МПО, NO-синтазы, содержании НКБ, а также экспрессии ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО-а в фагоцитах морских свинок, которые количественно или качественно отличаются от изменений, вызываемых в аналогичных условиях родительскими клетками Y. pestis EV.

Согласно результатам исследования в НСТ-тесте, «мышиный» токсин уже в первые часы после внутрибрюшинного введения белым мышам модифицирует работу кислородзависимых бактерицидных систем ПЯЛ в целом, что проявляется в резком снижении в них уровней ЦПА и ФП — вплоть до нулевых значений через 12—24 ч инкубации токсина с фагоцитом (табл. 3).

Таблица 3

Показатели кислородзависимого метаболизма полиморфноядерных лейкоцитовкровибелыхмышейпослевведения«мышиноготоксина чумногомикробс(М ± т)

Сроки забора материала после введения токсина (час) ЦПА ФП

6 3,0 ± 0,3* 3,0 ±0,3*

12 1,0 ±0,4* 0

24 0 0

Интактные животные (контроль) 9,0 ±1.0 7.0 ±0,8

Примечание: * - р 2 0,01

Таким образом, токсин чумного микроба на ранних этапах фагоцитоза нарушает работу кислородзависимых бактерицидных систем фагоцитарных клеток. Однако, как и в случае Ф1, его воздействие на индивидуальные компоненты этих систем носит избирательный характер.

В первые часы после внутрибрюшинного введения белым мышам «мышиный» токсин заметно повышает активность Г6ФДГ альвеолярных макрофагов, но в последующие сроки (12—24 ч) она понижается, приближаясь к контрольному уровню.

Обратные тенденции зафиксированы в случае НАДФ-Н-оксидазы макрофагов: через 6 ч после введения «мышиного» токсина активность фермента ниже контрольного уровня, но через 12, а затем 24 ч повышается до уровня и даже выше уровня контрольных значений. Активность МПО ПЯЛ во все сроки наблюдения (6-24 ч) ниже контрольного уровня, а содержание НКБ в лейкоцитах под влиянием токсина возрастает.

Таким образом, воздействие (угнетение или активация) «мышиного» токсина чумного микроба на активность Г6ФДГ, НАДФ-Н-оксидазы, МПО и содержание НКБ в альвеолярных макрофагах и ПЯЛ крови белых мышей зафиксировано главным образом в первые часы после его введения. По мере выведения (разрушения или инактивации) токсина из организма показатели активности компонентов бактерицидной системы начинали нормализоваться и постепенно приближались к уровню активности в макрофагах и ПЯЛ интактных животных.

Результаты изучения влияния на лизосомальные ферменты макрофагов и ПЯЛ белых мышей «мышиного токсина» чумного микроба также свидетельствуют об его многовекторности. Если активность лизоцима и в макрофагах, и в ПЯЛ под влиянием токсина возрастает, то активность кислой фосфатазы и МПО — снижается. Активность катепсина Д в принятых условиях повышается под действием «мышиного» токсина в альвеолярных макрофагах и остается на одном уровне — в ПЯЛ.

При анализе полученных неоднозначных данных складывается впечатление, что как изолированные антигены, так и целые клетки чумного микроба вносят определенный дисбаланс в согласованную работу системы лизосомальных ферментов, препятствуя, возможно, таким образом, деградации микробов.

Исследование механизмов фагоцитирующей способности моно-и полинуклеарных фагоцитов морской свинки при взаимодействии с Yersina pseudotuberculosis

Для более глубокого понимания значимости процессов, протекающих при фагоцитозе чумного микроба мы попытались по аналогичной схеме и сходным методическим приемам исследовать эти же процессы при поглощении макрофагами и ПЯЛ другого представителя рода Yersinia — Y. pseudotuberculosis, усложнив, однако, задачу включением в опыты плаз-мидсодержащих и бесплазмидного вариантов этого микроба.

При изучении бактерицидного потенциала фагоцитов в отношении псевдотуберкулезного микроба получены результаты, показывающие, что на характер фагоцитарного процесса накладывают отпечаток не только особенности самих фагоцитов, но и межвидовые и внутривидовые особенности фагоцитируемых бактерий.

По скорости хемотаксиса в направлении псевдотуберкулезного микроба очевидным преимуществом обладают перитонеальные макрофаги, которые по этому признаку в 1,8—2,3 раза превосходят альвеолярные макрофаги. ПЯЛ по данному признаку занимают промежуточное положение. Различия в скорости миграции фагоцитарноактивных клеток обусловлены, кроме того, наличием и спектром плазмид у Y. pseudotuberculosis. Наибольшей хемотаксической активностью обладали фагоциты в отношении бесплазмидного варианта псевдотуберкулезного микроба, а скорость хемотаксиса фагоцитов в направлении одноплазмидных клеток была выше,

чем в сторону двухплазмидных клеток псевдотуберкулезного микроба (рй 0,05). Таким образом, уже на начальном этапе фагоцитоза псевдотуберкулезный микроб реализует защитные механизмы, которые особенно выражены у вирулентных плазмидсодержащих клеток.

Аналогичная закономерность отмечена и на следующих этапах — адгезии и поглощения, то есть непосредственно фагоцитоза. И макрофаги, и ПЯЛ наибольшую активность в отношении как плазмидсодержащих, так и бес-плазмидных клеток Y. pseudotuberculosis проявляют в первые 30 мин их взаимного контакта, однако и в этом случае конечные результаты зависели от свойств всех участников процесса. Плазмидсодержащие клетки, несущие экс-прессируемые плазмидопосредованные структуры, в частности, Уор-проте-ины, оказались более устойчивыми к поглощению альвеолярными, перито-неальными макрофагами и ПЯЛ, чем клетки, не содержащие плазмиды и, следовательно, — не эксперссирующие Уор-протеины. Об этом можно судить, прежде всего, по фагоцитарному числу, которое при поглощении макрофагами (перитонеальными и альвеолярными) и ПЯЛ микробов, содержащих одну (pYV48) или две (pYV48 и pVM82) плазмиды, было 2,0-2,5 раза меньше, чем в случае фагоцитирования бесплазмидных иерсгашй (табл. 4).

Таблица 4

Фагоцитарная активность перитонеалъныхмакрофагов в отношении Y. pseudotuberculosis(M ± т)

Объект фагоцитоза Фагоцитарное число ИЗФ

через 30 мин через 120 мин

У. pseudotuberculosis 53 5,5 ± 0,3 9.8 ±1,9 -43,2 ±1,8

У. pseudotuberculosis И-727 2,2 ±0,3* 3,2 ±1,1* - 46,6 ± 4,2

У. pseudotuberculosis И-716 2,5 ±0,1* 5,5 ± 0,9* -77,0 ±4,3*

Примечание: фагоцитарное число - среднее количество микробов, поглощенных одним фагоцитом; (-) - незавершенный фагоцитоз; * - р s 0,05.

Наличие или отсутствие у псевдотуберкулезного микроба плазмид отражалось и на частоте слияния фагосом с лизосомами. Полученные материалы позволяют считать, что ведущую роль в ингибировании этого процесса в фагоцитах играет плазмида pYV48. Однако при наличии у Y. pseudotuberculosis дополнительной плазмиды pVM82 ингибирующий э ф -фект на процесс слияния фагосом и лизосом усиливается.

Взаимодействие фагоцита с внутриклеточными Y.pseudotuberculosis, осуществляемое на уровне фаголизосом, протекает на фоне дисбаланса бактерицидных процессов, в которых ключевую роль играют активные формы кислорода.

В НСТ-тесте удалось показать, что направленность количественных изменений окислительно-восстановительных процессов под влиянием псев-

дотуберкулезного микроба в принципе тождественна у фагоцитов всех трех исследованных видов — перитонеальных, альвеолярных макрофагов и ПЯЛ. Однако активация КЗМ при фагоцитозе бесплазмидных клеток Y. pseudotuberculosis происходит более интенсивно, чем в случае поглощения псевдотуберкулезных микробов, несущих плазмиды pYV48 или pYV48:pVM82. Это обстоятельство свидетельствует об участии pYV-плаз-мид-опосредованных Yops в ингибировании КЗМ фагоцитов, в результате чего снижается выработка активных форм кислорода и соответственно — бактерицидная способность фагоцитов.

Для выяснения вопроса, на какие реакции кислородзависимого бактерицидного механизма фагоцитов влияют плазмиды pYV48 и pVM82 псевдотуберкулезного микроба, в перитонеальных и альвеолярных макрофагах и ПЯЛ морской свинки исследовали активность НАДФ-Н-оксидазы, супероксиддисмутазы и миелопероксидазы, а также Г6ФДГ.

Результаты экспериментов показали, что фагоцитоз Y. pseudotuberculosis сопровождается активацией в макрофагах Г6ФДГ и НАДФ'Н-оксидазы, что свидетельствует об усилении в них окисления глюкозы в гексозомонофос-фатном шунте и о повышении скорости взаимопревращения НАДФ!?НАДФ-Н. Связанная с этим активизация КЗМ обеспечивает фагоцитам более высокий уровень бактерицидной способности, которая, однако, носит дифференцированный характер в зависимости от исходных свойств микроорганизма, в частности, от наличия или отсутствия у него плазмид. При общей тенденции повышения активности обоих ферментов в присутствии певдотуберкулезного микроба более выраженный ее прирост отмечен в случае бесплазмидных клеток. Таким образом, плазмиды pYV48 и pVM82 играют роль фактора, угнетающего активность обсуждаемых ферментов. Основную роль в этом процессе играет плазмида вирулентности pYV48, поскольку дополнительная плазмида pVM82 лишь незначительно изменяет активность Г6ФДГ и НАДФ-Н-оксидазы (рис. 3).

Рис.3. Активностьглюкозо-6-фосфатдегидрогеназы перитонеальных макрофагов при фагоцитозе У. pseudotuberculosis (М ± т).

О нарушениях, обусловленных Y. pseudotuberculosis при внедрении внутрь макрофага или лейкоцита, свидетельствуют и результаты изучения функционирования миелопероксидазы и супероксиддисмутазы.

В соответствии с полученными данными, псевдотуберкулезный микроб при внутриклеточной локализации в макрофагах и ПЯЛ морской свинки снижает в них активность миелопероксидазы, однако более выраженными ингибирующими свойствами обладали клетки, содержащие плазмиду pYV48V и особенно комплекс плазмид (pYV48:pVM82).

Что касается СОД, то активность этого фермента в присутствии псевдотуберкулезного микроба и в макрофагах, и в ПЯЛ возрастала, но степень активации зависела от наличия или отсутствия у микроба плазмид: наиболее высокие показатели стимуляции отмечены в присутствии бес-плазмидных клеток, тогда как в присутствии клеток, содержащих плазми-ды, прирост активности фермента был достоверно ниже (рис. 4).

Отсюда следует, что плазмиднесущие псевдотуберкулезные микробы в большей степени, чем бесплазмидные, блокируют в макрофагах и ПЯЛ процесс превращения супероксида в перекись водорода, снижая этим самым бактерицидный эффект против них.

Весьма важным, с нашей точки зрения, является наблюдение, что, помимо отмеченных выше нарушений, в процессе фагоцитоза полиморф-ноядерными лейкоцитами псевдотуберкулезного микроба имеет место прогрессирующее снижение в них содержания неферментных катионных белков. При поглощении псевдотуберкулезного микроба, содержащего плазмиды рУУ48 и рУМ82, этот процесс протекает более активно, чем в случае фагоцитоза бесплазмидных микробов. Очевидно, что снижение уровня интралейкоцитарных катионных белков, возможно, в силу их секреторной дегрануляции, обусловленного присутствием патогенного микроорганизма, облегчает способность последнего к паразитированию в макроорганизме.

Аналогичная динамика отмечена и при исследовании в фагоцитирующих перитонеальных макрофагах и кислой фосфатазы: псевдотуберкулезный микроб ингибировал активность этого фермента, однако наиболее выраженный тормозящий эффект вызывали клетки, содержащие плазми-ды pYV48 или pYV48:pVM82.

Таким образом, проведенные исследования показывают, что наличие плазмид pVM82 и pYV48 повышает устойчивость иерсиний к фагоцитозу. Штаммы Y. pseudotuberculosis, несущие эти плазмиды, видоизменяют реактивность фагоцитов, в значительной мере нейтрализуя их защитные механизмы и бактерицидную способность.

Очевидно, что под влиянием проникшего в эукариотическую клетку псевдотуберкулезного микроба, прежде всего плазмидсодержащего, возникает дисбаланс защитных функций фагоцитов, что, безусловно, обеспечивает реализацию стратегии выживаемости микроба в макроорганизме и его сохранения как вида, о чем красноречиво свидетельствует дальнейшая судьба внутриклеточного паразита.

Наши наблюдения показывают, что фагоцитоз псевдотуберкулезного микроба (и не только плазмидсодержащих, но бесплазмидного штаммов) макрофагами и ПЯЛ носит незавершенный характер. Однако фагоцитированные иерсиний с плазмидами или только с плазмидой pYV48 более устойчивы к разрушению макрофагами и ПЯЛ, чем клетки контрольного бесплазмидного штамма. Электронно-микроскопически показано, что в первые 30 мин контакта фагоцит-микроб существенных различий в скорости поглощения бесплазмидных и плазмидсодержащих бактерий не отмечено. На этом этапе фагоцитоза бактерии можно было наблюдать на поверхности фагоцитов, на стадии поглощения многочисленными псевдоподиями, а также внутри единичных фаголизосом Однако при продолжении контакта число бактерий, несущих плазмиды pYV48:pVM82, внутри фаголизосом возрастало, а некоторые бактериальные клетки фиксировались на стадии деления, что свидетельствует о возможности размножения плазмидсодержащих клеток Y. pseudotuberculosis в фагоцитах.

Цитопатическое действие псевдотуберкулезного микроба изученных штаммов на макрофага и ПЯЛ (в отличие от эффекта, оказываемого чумным микробом) мы расцениваем как умеренное.

В структуре макрофагов и ПЯЛ уже в начальные сроки фагоцитоза иерсиний с плазмидами pYV48 и pVM82 или только с плазмидой pYV48 наблюдали вакуолизацию цитоплазмы, слияние фаголизосом с образованием вокруг них электронноплотных участков цитоплазмы. При фагоцитозе микробов бесплазмидного варианта проявления их цитотоксичности в отношении фагоцитов были выражены незначительно и только при продолжительном контакте они становились более отчетливыми.

Безусловно, отмеченные выше изменения нельзя относить исключительно за счет воздействия на фагоцитарную клетку плазмид псевдотуберкулезного микроба. Существенную роль в этом процессе могут играть и

другие факторы, в том числе эндотоксины Y. pseudotuberculosis. Отмечено, в частности, что ЛПС в больших дозах (100 мкг/мл) угнетает поглотительную и переваривающую функции фагоцитов, оказывает на них цитотокси-ческое действие, вызывая дегенерацию и гибель клеток (Исачкова Л.М., Плехова Н.Г., 1989).

Проведенные исследования показали, что плазмиды pYV48 и pVM82 обуславливают устойчивость иерсиний к фагоцитозу, подавлению активности фагоцитов, что приводит к снижению показателей завершенности фагоцитоза. Наши материалы согласуются с наблюдением, что плазмидопос-редованные структуры, в частности, секретируемые белки Yops, действуют как антифагоцитарные факторы, тем самым, обеспечивая выживание и размножение микроорганизмов в тканях хозяина (Lian С. et al., 1985).

Очевидно, феномен резистентности к фагоцитозу является характерным признаком вирулентных иерсиний, связанным с наличием у них родоспецифической резидентной плазмиды (Lcr, pYV, pCad) (Forsberg A., Rosqvist R., 1993; Forsberg A. et al., 1994; Cornells G.R. et al., 1998).

Имеются основания предполагать, что кластер генов плазмиды pVM82, расположенных на фрагменте 25 мДа, определяет ряд дополнительных факторов патогенности, так как штаммы возбудителя псевдотуберкулеза, содержащие обе вышеназванные плазмиды, изолируются, как правило, при эпидемических вспышках со значительным количеством заболеваний в тяжелых и осложненных формах.

Таким образом, очевидно, что дисбаланс бактерицидных процессов, развивающихся в фагоцитирующих Y. pseudotuberculosis (особенно плазмид-содержащих) клетках с угнетением широкого спектра функций мононук-леарных фагоцитов и ПЯЛ, играет важную роль в проявлении патогенных свойств псевдотуберкулезного микроба и исходе вызываемого им инфекционного заболевания.

Закономерности и механизмы фагоцитоза Francisella tularensis in vitro и в динамике инфекционного процесса

Сходство процессов, индуцируемых родственными представителями рода Yersinia (чумным и псевдотуберкулезными микробами) при их взаимодействии в фагоцитами, побудило нас исследовать по той же схеме характер воздействия на макрофаги и ПЯЛ экспериментального животного клеток авирулентного (F. tularensis 15) и вирулентного (F. tularensis 777) штаммов в условиях соответственно вакцинального и инфекционного процессов.

Результаты опытов по изучению спонтанного и индуцированного хемокинеза показали, что при парентеральном инфицировании морских свинок клетками вирулентного штамма F. tularensis 777, то есть при специфическом инфекционном процессе, скорость хемотаксиса перитонеаль-ных и альвеолярных макрофагов существенно (в 1,3—2,7 раза, /><0,05) снижается по сравнению с контрольным уровнем (макрофаги интактных животных) (рис. 5).

Рис. 5. Хемотаксис макрофагов морских свинок при инфекционном процессе, вызванном F. tularensis 111 (М ± т).

Между тем, при вакцинальном процессе, вызванном клетками ави-рулентного штамма F. tularensis 15, отмечено повышение хемотаксичес-кой активности макрофагов. Объяснить подобное кардинальное различие можно, видимо, только тем, что вирулентный туляремийный микроб in vivo оказывает на макрофаги деструктивное воздействие, ограничивающее их миграцию.

Несколько иные тенденции зарегистрированы при определении адгезивной активности фагоцитов в отношении туляремийного микроба. При инфицировании морских свинок клетками как вирулентного (F. tularensis 777), так и вакцинного (F. tularensis 15) штаммов способность перитонеальных и альвеолярных макрофагов к адгезии заметно снижалась уже с начальных этапов инфекционного или вакцинального процесса. Парадоксально, но при непосредственном контакте с F. tularensis 15 in vitro перитонеальные макрофаги как интактных, так и вакцинированных живой туляремийной вакциной морских свинок проявляют возрастающую адгезивную активность по мере увеличения продолжительности инкубации фагоцит—микроб. Высокая адгезивная активность фагоцитирующих клеток в этом случае может быть связана с отсутствием in vitro факторов, которые в макроорганизме ингибируют процесс адгезии.

Макрофаги морских свинок независимо от их происхождения (перитонеальные, альвеолярные, макрофаги печени) in vitro и in vivo интенсивно поглощают клетки штаммов F. tularensis 15 и 777, что подтверждается высокими показателями фагоцитарноактивных клеток и фагоцитарного числа. По данным световой и электронной микроскопии, бактерии локализуются на поверхности, в многочисленных псевдоподиях, в фагосомах фагоцита. Поглотительная способность возрастает в активированных пептоном макрофагах и макрофагах иммунизирован-

ных животных. Отмечено размножение туляремийного микроба в фаго-лизосомах макрофагов, что свидетельствует о незавершенности фагоцитоза туляремийного микроба. В отношении макрофагов иммунных морских свинок цитопатический эффект выражен в меньшей степени, чем фагоцитов интактных животных. В случае фагоцитоза авирулентных (вакцинных) микробов деструктивные изменения в макрофагах возникали в более поздние сроки и в более умеренной форме, чем при фагоцитозе вирулентных клеток.

Перитонеальные и альвеолярные макрофаги морских свинок, вакцинированных живой туляремийной вакциной, in vivo проявляли высокую фагоцитарную активность в отношении клеток вирулентного штамма F. tularensis 777, но при этом цитопатический эффект был слабо выражен, а фагоцитоз в отдельных случаях был завершенным. Это обстоятельство свидетельствует о возможности направленного воздействия на защитные функции макроорганизма при туляремийной инфекции.

Изменения со стороны фагоцитов, наступающие при их контакте с туляремийным микробом, носят не только морфологический характер. Не менее выражены и нарушения функционального характера, особенно бактерицидных систем фагоцита.

Судя по показателям ЦПА и ФП в НСТ-тесте, перитонеальные, альвеолярные макрофаги, макрофаги печени и ПЯЛ крови морских свинок, вакцинированных подкожно живой туляремийной вакциной F. tularensis 15, по способности восстанавливать нитросиний тетразолий в НСТ-тесте превосходят фагоциты интактных животных (табл. 5).

Сходная закономерность, но на заметно более высоком количественном уровне, зафиксирована и при изучении влияния F. tularensis 777 на КЗМ перитонеальных макрофагов и ПЯЛ морских свинок, инфицированных клетками вирулентного штамма (табл. 6).

Таблица 5

Показатели активности макрофагов и полиморфноядерныхлейкоцитов интактных и вакцинированных морских свинок в НСТ-тесте (М ± т)

Фагоциты Интактные животные Вакцинированные жиотные

ЦПА ФП ЦПА ФП

Перитонеальные макрофаги 148,0 ±4,4 69,0 ±1,1 179,0 ±9,1' 87,0 ±2,1*

Альвеолярные макрофаги 87,0 ±5,6 55,0 ±6,1 89,0 ± 6.1 59,0 ±1,8

Макрофаги печени 5,0 ± 0,3 3.0 ±0.3 23,0 ±9,1* 16,0 ±5.8*

ПЯЛ 4,0 ±0,9 4,0 ±0.6 7,0 ±1.1* 6.0 ±0,7

Примечание: * - ps0,05.

Таблица 6

ПоказателиактивностифагоцитовпризараженииР. tularensis 777 интактныхморских свинок в НСТ-тесте (М ± т)

Время от момента заражения Перитонеапьные макрофаги Альвеолярные макрофаги ПЯЛ

ЦПА ФП ЦПА ФП ЦПА ФП

6ч 148,0 ±4,4* 70,0 ± 2,0 110,0 ±5,5* 58,0 ±9,7 4,0 ± 0,4* 3,0 ±0,4

24 ч 197,0 ±9.0* 74,0 ± 5,0* 137,0 ± 8.4* 78,0 ±3,0* 14,0 ±1,3 10,0 ±1,0*

Зсут 249,0 ±5,0* 93,0 ± 0,4* 103,0 ±2,9* 62,0 ±1,4* 9,0 ± 2,5* 8,0 ±1,5*

6 сут 203,0 ± 1,5* 89,0 ± 0,8* 61,0 ±2,9 45,0 ±1,7* 41,0 ±2,5* 34,0 ± 2,9*

9 сут 230,0 ±7,1* 91,0 ±1,6* 128,0 ± 7,4* 71,0 ±2,0* 29,0 ± 5,4* 22,0 ± 6,9*

Контроль 98,1 ±1,2 62,2 ± 0,4 85,2 ±0,4 54,3 ±0,5 12,1 ±0.1 5,4 ± 0,2

Примечание: * - р s 0,05.

Фагоцитоз клеток вирулентного штамма F. tularensis 111 радикальным образом отражается и на люминесцентном ответе перитонеальных и альвеолярных макрофагов интактных и особенно иммунизированных морских свинок, что, как известно (Easmon C.S. et al., 1980), свидетельствует об интенсивности в них «респираторного взрыва».

Повышение общего энергетического уровня в фагоцитах морских свинок при вакцинации последних F. tularensis 15 или инфицировании клетками вирулентного штамма F. tularensis 777развивается на фоне разновекторных изменений в активности отдельных элементов их защитной системы.

Следует, прежде всего, отметить, что в перитонеальных макрофагах и ПЯЛ вакцинированных F. tularensis 15 и инфицированных F. tularensis 777 морских свинок отмечено значительное повышение активности Г6ФДГ и НАДФ'Н-оксидазы. Однако, если в фагоцитах иммунизированных животных повышается активность миелопероксидазы и снижается содержание неферментных катионных белков, то в фагоцитах животных, получивших клетки вирулентного штамма, соответствующие изменения носят противоположный характер.

В процессе иммуногенеза, вызванного F. tularensis 15, изменяется и активность лизосомальных ферментов фагоцитов морской свинки. При этом активность кислой фосфатазы и лизоцима в макрофагах вакцинированных животных повышается, тогда как активность катепсина Д — заметно снижалась.

Очевидным свидетельством изменения регуляторных взаимодействий лимфоцитов и макрофагов является увеличение в процессе иммуногенеза количества глобулинпродуцирующих клеток в органах иммунной системы (селезенка, лимфатические узлы), которое сопровождалось возрастанием титров иммуноглобулинов в сыворотке крови.

Результаты изучения функционального состояния системы мононук-леарных фагоцитов при инфекционном и вакцинальном процессе, выз-

ванном F. Ш1агет1з, свидетельствуют о морфологических и гуморальных сдвигах, происходящих в организме чувствительного к туляремии животного, однако, очевидно, что для понимания тонких механизмов фагоцитоза туляремийного микроба, обеспечивающих киллинг или, наоборот, его внутриклеточное размножение, необходимы дальнейшие исследования в этом направлении.

Выявленные функциональные нарушения при взаимодействии фагоцитов с Ш1аге№1я на ультраструктурном уровне проявляются разнообразными изменениями со стороны как микроорганизма, так и фагоцитирующих клеток. Вместе с тем, проявления цитотоксичности и деструкции фагоцитов при контакте с авирулентными микробами были менее выражены и наступали в более поздние сроки (4-6 ч), чем при фагоцитозе клеток вирулентного штамма (30 мин).

Разработка патогенетически обоснованных принципов коррекции функционального состояния системы мононуклеарных фагоцитов при взаимодействии с патогенными микроорганизмами

Материалы предыдущих глав, показывающие как сходство, так и особенности взаимодействия макроорганизма и его отдельных систем с возбудителями чумы, псевдотуберкулеза и туляремии, позволили прийти к выводу, что факторами, лимитирующими эффективность фагоцитоза у У У. р$еийоШЬегси1о$1$и& F. Ш1агетю, являются ингибирующее влияние микроба на процесс слияния лизосом с фагосомами, дисбаланс окислительного метаболизма фагоцитов, устойчивость бактерий к лизомальным ферментам фагоцитов и их способность после эндоцитоза покидать фагосому, избегая губительного действия микробицидных факторов фагоцита.

Из представленных и литературных данных следует также, что бактерии всех трех видов свои патогенные свойства, в том числе способность к внутриклеточному паразитированию, реализуют в соответствии с механизмами системы, опосредуемой секретируемыми белками наружной мембраны бактерий, контролируемыми на генном уровне. По общепринятому мнению, существует зависимость между вирулентностью штаммов возбудителей и степенью выраженности индуцированной ими иммунодепрессии, расцениваемой как важнейший фактор патоген-ности и как необходимое условие становления хронического инфекционного процесса. Отсюда становится ясным, что для повышения эффективности иммунного ответа, в частности фагоцитарной реакции, следует направленно воздействовать на те звенья процесса, которые подвергаются наибольшему супрессивному давлению, т.е. базироваться на патогенетически обоснованном подходе. Поскольку специфические факторы, влияющие на резистентность макроорганизма, не всегда достаточно эффективны, как это имеет место и при чуме, и при псевдотуберкулезе, определенные надежды в этом плане возлагаются на неспецифические иммуноиндукторы. Иммуномодулирующие препараты

необходимы также для повышения эффективности специфической иммунотерапии и иммунопрофилактики, экстренной индукции неспецифической резистентности в эпидемически опасной ситуации, при встрече с неизвестным возбудителем и в других случаях повышенного риска возникновения инфекции или безуспешности традиционных: средств терапии (Лазарева И.В., Алексин Е.К., 1985). Все это заставляет искать новые, более эффективные источники стимуляторов неспецифической резистентности организма.

Учитывая сходство механизмов фагоцитоза бактерий исследованных видов, моделью для коррекции фагоцитарного процесса была избрана Y. pestis. На выбор этой модели повлияли и известные данные о возможности повышения эффективности фагоцитоза такими преимущественно синтетическими препаратами как мурамилдипептид, ликопид, полиоксидо-ний, бемитил и другие (Игнатенко Л.А. и др., 1990; Земсков А.М., 1994; Авророва И.В. и др., 1996; Семенченко ТА, 2001).

В настоящее время для стимуляции неспецифической резистентности организма большое внимание уделяется полисахаридам растительного происхождения. Экспериментальное изучение препаратов растительного происхождения — сирингина, К-212, диквертина, арабиногалакта-на, феррогала, любезно предоставленных нам сотрудниками Иркутского института химии им. А.Е. Фаворского, на макрофаги, показало, что по физико-химическим свойствам, способу применения, доступности и, главное, иммуномодулирующим свойствам в качестве возможного иммуностимулятора избраны арабиногалактан и феррогал. Сведения об их применении для иммунностимуляции при чуме в доступной литературе отсутствуют.

Арабиногалактан (АГ) выделен из лиственницы сибирской Larix sibirica (Патент ..., 1999), а на его основе получен железосодержащий препарат — феррогал. Оба препарата обладают уникальными биологическими свойствами и большими потенциальными возможностями использования их в научных и медицинских целях (Красникова И.М. и др., 2002; Медведева С. А. и др., 2002).

В опытах с использованием морских свинок и белых мышей нами показано, что и АГ, и феррогал обладают иммуностимулирующими свойствами. Обращает внимание комплексность воздействия этих препаратов на иммунокомпетентные системы макроорганизма. При парентеральном введении совместно с живой чумной вакциной АГ и феррогал, особенно последний, активировали хемотаксические и адгезивные функции макрофагов в отношении Y. pestis EV, стимулировали поглотительную активность фагоцитов, обеспечивали почти двукратный рост завершенности фагоцитоза, стимулировали метаболическую активность перитонеальных макрофагов, усиливая их способность к восстановлению нитросинего тетразо-лия в диформазан, существенно повышали активность НАДФ-Н-оксидазы и суперокиддисмутазы, стимулировали продукцию монооксида азота, активировали синтез цитокинов - ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО -а (рис. 6, 7).

Рис. 6. Влияние феррогала на синтез монооксида азота фагоцитирующими перитоне-альными макрофагами иммунных морских свинок.

Рис. 7. Продукция интерлейкина-1 макрофагами белых мышей под влиянием араби-ногалактана и феррогала

И АГ, и феррогал при одновременном введении белым мышам с живой чумной вакциной (ЖЧВ) повышают протективную активность вакцины, что проявляется в существенном снижении средней иммунизирующей дозы в 4,8 раза в случае АГ и в 4,1 раза — феррогала. Заметное позитивное влияние АГ и феррогал оказывают на сроки гибели и продолжительность жизни белых мышей, зараженных У. И-2638.

Существенные сдвиги АГ и феррогал вызывают и в динамике антите-лообразования: уровень специфических антител (IgM и IgG) в сыворотке крови морских свинок, которым клетки вакцинного штамма У.БУ вводили совместно с АГ или феррогалом, в 1,5—2,0 раза выше, чем после вакцинации только ЖЧВ, причем гнгппуД|| и щ |итм птутд* ппттттптптн! в более ранние сроки, чем во

^национальная] библиотека

С-Петербург

05 ян

На основании литературных данных о механизмах иммуностимулирующего действия арабиногалактанов природного происхождения, а также результатов собственных исследований нами гипотетически представлены возможные механизмы биологического действия АГ (рис. 8).

Установленные в ходе экспериментов данные указывают на перспективность новых препаратов как корректоров дефектов фагоцитоза, а также на возможность использования их в качестве препаратов, повышающих неспецифическую резистентность организма против патогенных бактерий. Создание на основе АГ и феррогала биологически активных препаратов перспективно и в силу того, что запасы сырья для их производства значительны и легко воспроизводимы.

Таким образом, результаты проведенных исследований дополняют новыми научными данными сведения о современном состоянии взаимоотношения микроб—фагоцит, пополняя теоретическую основу и намечая направления изысканий в области изучения механизмов формирования резистентности макроорганизма к возбудителям чумы, псевдотуберкулеза и туляремии.

Выявлено сходство реакций, обеспечивающих внутриклеточную инактивацию изученных микроорганизмов Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и F. tularensis, что указывает на однотипность клеточных механизмов неспецифической резистентности макроорганизма. Универсальным свойством фагоцитов экспериментальных животных, проявляющимся при контакте и последующем внедрении Y.pestis, Y.pseudotuberculosisиF. tularensis, является повышение активности систем кислородзависимого метаболизма (механизмы микробицидности, связанные с «респираторным взрывом», в частности активацией НАДФ-Н-оксидазы, а также Г6ФДГ. Иммунизация экспериментальных животных чумной и туляремийной вакцинами на основе живых клеток сопровождается существенной стимуляцией реакций фагоцитов, ответственных за внутриклеточную инактивацию Y. pestis и F. tularensis.

Общим итогом взаимодействия макрофагов и ПЯЛ с возбудителями чумы, псевдотуберкулеза и туляремии в большинстве случаев является незавершенный характер фагоцитоза, вследствие чего обеспечивается возможность переживания и последующего размножения патогенных бактерий в макроорганизме. Главными причинами, лимитирующими реализацию бактерицидного потенциала фагоцитов интактных и иммунизированных морских свинок, являются ингибирование чумным, псевдотуберкулезным и туряремийным микробами процесса конъюгации фагосом с лизосомами, устойчивость к действию лизосомальных ферментов, способность после эндоцитоза покидать фагосому, избегая действия микроби-цидных факторов, благодаря чему обеспечивается возможность длительное время персистировать в цитоплазме фагоцитов, что и объясняет незавершенный характер фагоцитоза.

Рис. 8. Патогенетическое обоснование коррегирующего влияния арабиногалактана на систему мононуклеарных фагоцитов при ^ взаимодействии с У. ревИв.

Теоретически и практически обоснована возможность использования показателей активности NO-синтазы макрофагов для оценки иммунной перестройки организма.

Сформулировано и практически обосновано перспективное направление поиска препаратов, стимулирующих функциональную активность системы фагоцитирующих лейкоцитов при вакцинальном процессе.

Впервые патогенетически обоснованы принципы коррекции функционального состояния системы мононуклеарных фагоцитов арабиногалак-таном и феррогалом при взаимодействии с Y. pestis EV.

ВЫВОДЫ

1. Выявлено сходство реакций, обеспечивающих внутриклеточную инактивацию Y.pestis, Y. pseudotuberculosis и F. tularensis, что указывает на однотипность механизмов неспецифической резистентности макроорганизма. Универсальным свойством фагоцитов, проявляющимся при внедрении Y.pestis, Y. pseudotuberculosis или F. tularensis является повышение активности систем кислородзависимого метаболизма. При иммунизации животных чумной или туляремийной вакцинами в фагоцитах стимулируются реакции, ответственные за внутриклеточную инактивацию Y. pestis и F. tularensis, соответственно.

2. Фагоцитоз макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами Y.pestis, Y.pseudotuberculosis и F. tularensis является преимущественно незавершенным (70—80 %), что обеспечивает возможность переживания и последующего размножения патогенных бактерий в макроорганизме.

3. Чумной микроб в L-форме отличается от исходных родительских клеток большей стимуляцией окислительных и лизосомальных гидролитических ферментов фагоцита, но более заметной супрессией кислой фос-фатазы, что коррелирует с более низкими в отношении L-бактерий показателями фагоцитарной активности макрофагов и меньшим повреждающим действием их на фагоцит.

4. Фракция I чумного микроба ингибирует кислородзависимые и кис-лороднезависимые бактерицидные системы макрофагов и ПЯЛ, а также синтез монооксида азота перитонеальными макрофагами экспериментальных животных. In vivo «мышиный» токсин в три раза снижает интенсивность кислородзависимого метаболизма фагоцитов и уменьшает содержание в них неферментных катионных белков.

5. Плазмиды pYV48 и pVM82 псевдотуберкулезного микроба обусловливают его ингибирующее влияние на хемотаксис и адгезивные функции, кислородзависимые бактерицидные механизмы и кислороднезависи-мые механизмы, опосредованные катионными белками и лизосомальны-ми ферментами.

6. При фагоцитозе F. tularensis активируются системы, способствующие захвату и внутриклеточной деградации микроба путем активации кислородза-

висимых и кислороднезависимых бактерицидных факторов. При инфекционном процессе, обусловленном Р. Ы1агвт18 777, бактерицидные системы фагоцитов активируются в наибольшей степени.

7. Цитопатическое действие вирулентных туляремийных микробов выявляется у 60—70 % макрофагов морских свинок, в отношении макрофагов иммунных животных оно выражено в меньшей степени. В случае фагоцитоза микробов вакцинного штамма деструктивные изменения в макрофагах выражены слабо и возникают в более поздние сроки (4-6 ч), чем при фагоцитозе вирулентных микробов (30 мин).

8. Арабиногалактан и феррогал активируют фагоцитарную активность макрофагов морских свинок в отношении чумного микроба, стимулируют синтез монооксида азота, ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а, антителогенез и тем самым оказывают выраженное иммуномодулирующее действие, усиливая бактерицидный потенциал макроорганизма. Арабиногалактан предложен в качестве средства экстренной профилактики чумы.

9. Разработана концептуальная схема механизмов действия араби-ногалактана и патогенетически обоснованы принципы коррекции функционального состояния системы мононуклеарных фагоцитов при взаимодействии с бактериальными патогенами.

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. О вирулентности туляремийного микроба / Е.П. Голубинский, Г.И. Борсук, И.С. Бойкова, В.И. Дубровина и др. // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опас. инфекций: Тез. докл. — Волгоград, 1992.-С. 72.

2. Бойкова И. С. Активность НАДФЧН-оксидазы и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы при фагоцитозе чумного микроба / И.С. Бойкова, В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опас. инфекций: Материалы науч. конф., 21—22 октября 1992 г. - Волгоград, 1992. - С. 73-74.

3. Роль некоторых кислородзависимых систем при фагоцитозе чумного микроба/ И.В. Зонова, И.И. Осипенко, Г.И. Борсук, В.И.Дубровина и др. // Современ. аспекты природной очаговости, эпидемиол. и профи-лакт. особо опас. болезней: Материалы науч.-практ. конф., октябрь 1993 г. — Ставрополь, 1993. - С. 205-207.

4. К вопросу о механизме формирования иммунитета к туляремии / Г.И. Борсук, И.И. Осипенко, И.С. Бойкова, В.И. Дубровина и др. // Там же. -С. 176-178.

5. Эффективность применения серологических методов при исследовании органов диких животных, зараженных чумой в эксперименте / М.П. Рудник, М.П. Маевский, В.И. Дубровина и др. // Соврем. аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилакт. особо опас. болезней: Материалы науч.-практ. конф., октябрь 1993 г. - Ставрополь, 1993. - С. 266-267.

6. Голубинский Е.П. Фагоцитоз Л-форм чумного микроба макрофагами восприимчивых к чуме животных / Е.П. Голубинский, Г.И. Борсук, В.И. Дубровина // Актуал. пробл. профилакт. особо опас. и природноочаго-вых инфекционных болезней: Материалы науч. конф., июнь 1994 г. — Иркутск, 1994. - С. 30.

7. Голубинский Е.П. Кислородзависимый метаболизм при фагоцитозе Л-форм чумного микроба / Е.П. Голубинский, И.С. Бойкова, В.И. Дубровина //Актуал. пробл. профилакт. особо опас. и природноочаговых инфекционных болезней: Материалы науч. конф., июнь 1994 г. — Иркутск, 1994. — С. 31—32.

8. Голубинский Е.П. Активность бактерицидных систем фагоцитов у интактных и иммунизированных против туляремии морских свинок / Е.П. Голубинский, И.С. Бойкова, В.И. Дубровина//Журн. микробиол. — 1995.-№2.-С. 77-79.

9. Дубровина В.И. Состояние бактерицидных систем макрофагов при фагоцитозе Л-форм Yersinia pestis/В.И. Дубровина // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: Материалы Международ, симп., 6—10 июня 1995 г. — СПб., 1995.-С. 129.

10. Фагоцитоз Л-форм чумного микроба макрофагами и полиморф-ноядерными лейкоцитами / Е.П. Голубинский, Г.И. Борсук, И.В. Зонова, В.И. Дубровина // Актуал. вопр. профилакт. особо опас. и других инфекционных заболеваний: Материалы науч.-практ. конф., 1995 г. — Ставрополь, 1995. -С. 260-262.

11. Дубровина В.И. О реверсии Л-форм чумного микроба в организме морской свинки / В.И. Дубровина, Г.И. Борсук, Е.П. Голубинский // 100-летие образования противочум. службы России: Материалы науч.-практ. конф., 16-18 сентября 1997 г. - Саратов, 1997. - С. 38-39.

12. Дубровина В.И. Об особенностях и механизмах фагоцитоза Yersinia pestis в L-форме / В.И. Дубровина // Деп. ВИНИТИ, 1998. - № 2216-В98. -

17 с.

13. Бактерицидные механизмы фагоцитоза Yersiniapseudotuberculosis с различным набором плазмид / Е.П. Голубинский, В.И. Дубровина, СВ. Балахонов, Г.И. Борсук // Пробл. инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера: Материалы науч. конф., 10-11 апреля 1998 г. - Новосибирск, 1998. - С. 34-35.

14. Особенности фагоцитоза Yersiniapseudotuberculosis с различным набором плазмид / Е.П. Голубинский, Г.И. Борсук, СВ. Балахонов, В.И. Дубровина // Инфекционные болезни: «Новое в диагностике и терапии»: Материалы науч. конф., 1998 г. - СПб., 1998. - С. 21.

15. Golubinsky E.P. Mechanisms of L-form Yersinia pestis phagocytosis / E.P. Golubinsky, V.I. Dubrovina, G.I. Borsuk // Medische Microbiologie: Materials of 7th International Congress on Yersinia, 14—16 June 1998. — Nijmegen, 1998.-P. 30.

16. Функциональное состояние мононуклеарных фагоцитов морской свинки при вакцинальном и инфекционном процессах, вызванных Francisella

tularensis/E.П. Голубинский, В.И.Дубровина, Г.И. Борсук, Н.А. Суханов //Жури, инфекционной патологии. —1998. — Т. 5, № 4. — С. 56-58.

17. Дубровина В.И. Особенности фагоцитоза Yersiniapestis в L-форме / В.И. Дубровина//Деп. ВИНИТИ, 434 В99. -1999. - 17 с.

18. Фагоцитоз Yersinia pseudotuberculosis с различным набором плаз-мид / В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский, Г.И. Борсук и др. // Пробл. медицины и биологии: Материалы Всерос. науч. конф., 1999 г. — Кемерово, 1999.

- С. 122-123.

19. Влияние плазмиды вирулентности Yersinia pseudotuberculosis на фагоцитоз / В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский, Г.И. Борсук и др. //Акту-ал. вопр. инфекционной патологии: Материалы науч.-практ. конф., 1999 г. -Барнаул, 1999. - С. 78-79.

20. Дубровина В.И. Реверсия L-форм Yersiniapestis в организме чувствительных к чуме животных /В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский, Г.И. Борсук// Chinese J. Control Endemic Disease. - 1999. - № 14. - С. 196-198.

21. Рудник М.П. Динамика образования антител и элиминации антигена при экспериментальной чуме у основных носителей очагов Сибири / М.П. Рудник, В.И. Дубровина, Т.И. Иннокентьева // Chinese J. Control Endemic Disease. - С. 217-219.

22. Использование иммуномодуляторов природного происхождения для коррекции дефектов фагоцитоза при псевдотуберкулезной инфекции / В.И.Дубровина, Е.П. Голубинский, Г.И. Борсук и др. // Забайкальский медицинский вестник. — 1999. — № 1-4. — С. 43.

23. Особенности фагоцитоза Yersinia pseudotuberculosis с разным набором плазмид / В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский, Г.И. Борсук и др. // Медицинская паразитология. — 1999. - № 4. — С. 50—53.

24. Коррекция дефектов фагоцитоза при псевдотуберкулезной инфекции / В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский, Г.И. Борсук и др. // Инфекции, обусловленные иерсиниями (иерсиниоз, псевдотуберкулез), и другие актуальные инфекции: Материалы международн. конф., 2000 г. — СПб. — 2000.

- С. 19.

25. Molecular bases of Yersiniapseudotuberculosispatogenicity and increase of phagocyte activity by natural immunomodulatory / V.I. Dubrovina, E.P. Golubinsky, G.I. Borsuk at al. // Scientific J. Centre Control Res. Natural Infect. Diseases. - 2000. - № 8. - P. 153-157.

26. Коновалова Ж.А. Современные представления об особенностях и механизмах фагоцитоза Yersinia pseudotuberculosis / Ж.А. Коновалова, В.И. Дубровина //Scientific J. Centre Control Res. Natural Infect. Diseases. — 2000.- №8. -P. 158-163.

27. Дубровина В.И. Изучение иммунокоррегирующих свойств экспериментальных препаратов природного происхождения при фагоцитозе псевдотуберкулезного микроба/ В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский, Ж.А. Коновалова и др. // Экология Байкала и Прибайкалья: Материалы науч.-практ. конф., 20 октября 2000 г. - Иркутск, 2000. - С. 71.

28. Дубровина В.И. Арабиногалактан лиственницы при коррекции дефектов фагоцитоза / С.А Медведева, Г.П. Александрова, В.И. Дубровина и др. // Химия и технология растительных веществ: Материалы Всерос. науч. конф., 2000 г. - Сыктывкар, 2000. - С. 153.

29. Особенности фагоцитоза Yersinia pseudotuberculosis с различным плазмидным спектром / В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский, Ж.А. Коновалова и др. // Пробл. биологической и экологической безопасности: Материалы международн. конф., 22-25 мая 2000 г. - Оболенск, 2000. - С. 177-178.

30. Дубровина В.И. Некоторые аспекты молекулярно-физиологичес-ких механизмов фагоцитоза Yersiniapseudotuberculosis /В.И. Дубровина// Депон. ВИНИТИ. - 2000. - № 2166-ВОО. - 19 с.

31. Дубровина В.И. Синтез окиси азота перитонеальными макрофагами морской свинки под действием арабиногалактана / В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский, Ж.А. Коновалова // Природноочаговые болезни человека: Материалы Всерос. науч. конф., октябрь 2001 г. — Омск, 2001. — С. 218-219.

32. Роль антигенов Yersiniapestis в процессе иммуногенеза в эксперименте / В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский, Г.И. Борсук и др. // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. — 2001. — Вып. 4. — С. 121—124.

33. Дубровина В.И. Современные аспекты фагоцитоза Yersinia pseudotuberculosis / В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский, Ж.А. Коновалова //Журн. инфекционной патологии. - 2001. - Том 8, № 2-3. - С. 102-108.

34. Арабиногалактан лиственницы сибирской — природный иммуно-модулятор / СА Медведева, Г.П. Александрова, М.Ю. Сайботалов и др. // Актуал. пробл. создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Материалы V междун. съезда, 5—7 июля 2001 г. — СПб., 2001. — С.104-106.

35. Сравнительное изучение иммунокоррегирующих свойств экспериментальных препаратов природного происхождения при фагоцитозе Yersinia pseudotuberculosis/ В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский, Г.И. Бор-сук и др. // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. — 2001. — №3. - С. 44-46.

36. Иммуномодулирующее свойства арабиногалактана лиственницы сибирской / В.И. Дубровина, С.А. Медведева, Г.П. Александрова и др. // Фармация. - 2001. - № 5. - С. 26-27.

37. Dubrovina V.I. Effect of Yersinia pestis plasmids on nitric oxide synthesis in guinea pig macrophages / V.I. Dubrovina, E.P. Golubinsky // Scientific J. Centre Control Res. Natural Infect. Diseases. - 2001. - № 9. - P. 28-30.

38. Изучение влияния арабиногалактана на протективные свойства Yersinia pestis EV/ В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский, Т.А. Иванова и др. // Сибирь-Восток. - 2002. - № 3 (51). - С. 8-10.

39. Дубровина В.И. Функциональные особенности фагоцитов при инфекционном и вакцинальном процессе, вызываемом Francissela tularensis/ В.И. Дубровина. — Иркутск: Вост.-Сиб. издательская компания, 2002. — 119 с.

40. Изучение влияния железосодержащего производного арабинога-лактана на фагоцитоз Yersiniapestis/ В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский, ЖА. Коновалова и др. //Актуал. пробл. эпидемической безопасности: Материалы науч. конф., 2002 г. - Ставрополь, 2002. - С. 90-92.

41. Влияние арабшюгалактана и его железосодержащего производного на цитокининдуцирующую активность Yersinia pestis EV / В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский, С. А. Медведева и др. // Пробл. инфекции в клинической медицине: Материалы науч. конф. 5-6 декабря 2002 г. — СПб., 2002. - С. 105-106.

42. Studing of immunocorrective properties of ferrum containing arabinogalactan derivative / V.I. Dubrovina, E.P. Golubinsky, T.T. Shkaruba et al. // Scientific J. Centre Control Res. Natural Infect. Diseases. - 2002. - № 10. -P. 49-52.

43. Изучение влияния феррогала на протективные и цитокининдуци-рующие свойства Yersinia pestis EV/ В.И.Дубровина, Е.П. Голубинский, СА. Медведева и др. // 100-летие академика АМН СССР СП. Карпова: Материалы межрегиональн. конф., октябрь 2003 г. — Томск, 2003. — С. 71.

44. Studing of ferrogale effect on protective properties of Yersinia pestis EV / V.I. Dubrovina, E.P. Golubinsky, T.T. Shkaruba et al. // Scientific J. Centre Control Res. Natural Infect. Diseases. - 2003. - № 11. - P. 112.

45. Влияние арабиногалактана и его железосодержащего производного на активность макрофагов в отношении Yersinia pestis EV в процессе иммуногенеза/ В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский, Ж.А. Коновалова и др. // Сибирь-Восток. - 2003. - № 2 (62). - С. 14-15.

46. Арабиногалактан лиственницы — полимерная матрица для биогенных металлов / СА. Медведева, Г.П. Александрова, В.И. Дубровина и др. // Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения. — 2002.-№7.-С. 45-49.

47. Металлопроизводные арабиногалактана, способ получения ме-таллопроизводных арабиногалактана: Патент РФ № 2194715 РФ, МПК А61 К 47/48. / Г.П. Александрова, С.А. Медведева, Л.А. Грищенко, В.И. Дубровина. - № 2000 121112; Заявл. 04.08.00; Опубл. 20.12.02, Бюл. № 35.

48. Средство, обладающее противоанемической и иммуномодулятор-ной активностью: Патент РФ № 2208440 РФ, МПК А61 К 31/715, 33/26. / С.А. Медведева, Г.П. Александрова, И.А. Тюкавкина и др. № 2001 120324; Заявл. 20.07.01; Опубл. 20.07.03, Бюл. № 20.

49. Влияние антигенов Yersinia pestis на синтез окиси азота перитоне-альными макрофагами морской свинки / В.И.Дубровина, Е.П. Голубинский, Т.Ю. Загоскина и др. // Ликвидация и элиминация инфекционных болезней — прогресс и проблемы: Материалы международн. конгр., 4-5 сентября 2003 г. - СПб., 2003. - С. 131.

50. A method for preparation ofnano-dimensional particles for biomedical purposes / G.P. Aleksandrova, L.A. Grischenko, A.V. T'kov et al. // «Materials of Sibiria» «Nano-science and Technology»: Materials of III Conference, 2-6 June 2003. - Novosibirsk, 2003. - P. 394.

51. Влияние арабиногалактана и его производных на функциональную активность макрофагов / В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский, ЖА Коновалова и др. // Журн. инфекционной патологии. — 2003. — Т. 10. — № 4. — С. 42-43.

52. Immunomodulating properties of larch arabinogalactan / S.A. Medvedeva, G.P. Aleksandrova, V.I. Dubrovina, ZhA Konovalova // Poster. Biotechnology and Industry. - 2003. - P. PD044.

Список документов по внедрению научных достижений

в практику

1. Количественная оценка цитохимических показателей ферментативной активности микро- и макрофагов крови и экссудата методом цитос-пектрофотометрии: Метод. рекомендации / Е.П. Голубинский, И.И. Осипенко, Г.И. Борсук, В.И. Дубровина // Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. - Иркутск, 1991. - 10 с.

2. Обнаружение антигенов чумного микроба в монослое макрофагов с помощью антител, меченных коллоидным золотом: Метод, рекомендации / В.И. Дубровина, О. А. Гольдберг// Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. - Иркутск, 1993. - 10 с.

3. Способ определения активности супероксиддисмутазы в полимор-фноядерных лейкоцитах и макрофагах при фагоцитозе Yersinia pseudotuberculosis: Метод, рекомендации / Е.П. Голубинский, В.И. Дубровина, Г.И. Борсук, ЖА. Коновалова// Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. - Иркутск, 1999. - 5 с.

4. Способ определения активности НАДФЧН-оксидазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы полиморфноядерных лейкоцитов и макрофагов при фагоцитозе Yersiniapseudotuberculosis: Метод. рекомендации / Е.П. Голубинский, В.И. Дубровина, Г.И. Борсук, ЖА. Коновалова // Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. - Иркутск, 2000. — 4 с.

5. Использование показателей NO-синтазной активности макрофагов для оценки иммунной перестройки организма: Метод, рекомендации / В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский, С. А. Витязева // Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. — Иркутск, 2003. — 5 с.

Подписано в печать 19.03.2004. Бумага офсетная, формат 60х8471/16

Гарнитура Таймс. Усл. печ. л. 1,9 _Тираж 100 экз. Заказ № 125-04._

РИО НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1. Тел 29-03-37)

»12245

Актуальность проблемы

Чума, псевдотуберкулез и туляремия, вызываемые соответственно Yersinia pesiis, Y. pseudotuberculosis и Francisella tularensis, несмотря на разную этиологию, имеют ряд общих признаков: ведущим звеном в защите организма хозяина является клеточный фактор, отмечено сходство антигенной структуры возбудителей этих инфекций, все они относятся к природноочаговым болезням [32, 33, 65, 73, 105, 377]. Все три инфекции особенно актуальны в нашей стране, поскольку их природные очаги существуют на территории как собственно России, так и ряда смежных государств. В последние годы возбудители чумы и туляремии привлекли внимание и на общемировом уровне как наиболее вероятные средства биотерроризма [106].

С развитием молекулярной биологии появляется возможность по-новому оценить факторы патогенности бактерий. Сопоставление свойств трех микроорганизмов в аналогичных условиях взаимодействия с макроорганизмом позволит внести некоторую ясность в понимание закономерностей взаимоотношений хозяин-паразит.

Накопленные к настоящему времени материалы однозначно свидетельствуют о том, что патогенность бактерий, в том числе и рассматриваемых в настоящей работе, является биологически сложным, полидетерминантным признаком, находящимся под контролем регуляторных систем как хромосомных, так и плазмидных генов, которые ответственны за синтез макромолекул, принимающих участие в развитии генерализованного инфекционного процесса [80, 142, 143, 197, 377, 389]. Способность многих патогенных бактерий к паразити-рованию в фагоцитах, играющая важную роль в патогенезе инфекции, обусловлена наличием у них плазмид вирулентности [3, 99, 107, 123, 387, 390].

С точки зрения понимания механизмов иммуногенеза и определения в связи с этим стратегии иммунопрофилактики важную задачу представляет исследование причин кратковременности иммунитета после чумной инфекции и, наоборот, развитие у людей напряженного и продолжительного постинфекционного иммунитета при туляремии [32, 33, 75, 105]. Поскольку в механизмах резистентности к чуме и туляремии доминирующая роль отводится клеточным факторам

14, 46, 51, 53, 58, 145], логично допустить, что в формировании иммунитета большую роль играют структурно-функциональные изменения в клетках системы мононуклеарных фагоцитов, которые недостаточно исследованы.

Одним из актуальных направлений, связанных с изучением иммуногенеза и, соответственно, иммунопрофилактики инфекционных болезней является поиск средств, в том числе природного происхождения, способных потенцировать реакции клеточного иммунитета макроорганизма в ответ на введение иммуноген-ного препарата и тем самым повысить эффективность применяемых вакцин при одновременном снижении иммунизирующей дозы препаратов и уменьшении их побочного действия.

На основании вышеизложенного целью работы является раскрытие механизмов фагоцитоза и выяснение его роли в формировании резистентности организма к чуме, псевдотуберкулезу, туляремии и разработка на этой основе принципов повышения функциональной активности фагоцитов.

Для реализации поставленной цели последовательно решались следующие основные задачи:

1. Исследовать поэтапно (хемотаксис—►адгезия—►поглощение—►слияние фагосом с лизосомами—►бактерицидные реакции—►исход) закономерности фагоцитоза чумного микроба разного фенотипического состояния, в том числе в L-форме, моно- и полинуклеарными фагоцитами чувствительного к возбудителю чумы животного.

2. Изучить влияние фракции I и «мышиного» токсина чумного микроба на бактерицидные механизмы фагоцитоза Y. pestis.

3. Выяснить особенности взаимодействия псевдотуберкулезного микроба с клетками системы мононуклеарных фагоцитов морской свинки и влияние на эти процессы плазмид pYV48 и pVM82.

4. Выяснить особенности механизмов фагоцитоза F. tularensis в динамике развития вакцинального и инфекционного процессов.

5. Провести поиск иммуномодуляторов природного происхождения и изучить характер их воздействия на клеточные и гуморальные факторы иммунитета у экспериментального животного.

6. Разработать концептуальную схему патогенетически обоснованных принципов коррекции функционального состояния фагоцитов при взаимодействии с Y. pestis.

Научная новизна

В результате впервые проведенного комплексного сравнительного исследования охарактеризованы по ряду важнейших параметров бактерицидные механизмы фагоцитоза чумного, псевдотуберкулезного, туляремийного микробов разного фенотипического состояния макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами экспериментальных животных.

Установлено ингибирующее влияние фракции I чумного микроба на кисло-родзависимые бактерицидные системы фагоцитов экспериментальных животных и синтез монооксида азота перитонеальными макрофагами. «Мышиный» токсин снижает интенсивность кислородзависимого метаболизма макрофагов и ПЯЛ.

Впервые показано участие в бактерицидных механизмах фагоцитоза чумного микроба макрофагами морских свинок монооксида азота, а феномен активации NO-синтазной активности макрофагов в процессе иммуногенеза предложен для оценки иммунной перестройки макроорганизма.

Приоритетными являются данные о существенных различиях во взаимоотношениях фагоцитов и чумного микроба в исходной бактериальной (нативной) и L-формах. Установлено, что чумной микроб в L-форме медленнее поглощается и оказывает меньшее повреждающее действие на фагоцит, но в большей мере стимулирует активность окислительных (Г6ФДГ, НАДФ Н-оксидазы) и гидролитических (лизоцима, катепсина, кислой фосфатазы) ферментов.

Экспериментально доказано, что псевдотуберкулезный микроб при взаимодействии с макрофагами и ПЯЛ подавляет активность зависимых от кислорода бактерицидных систем. Плазмидсодержащие (pYV48, pVM82) клетки У. pseudotuberculosis в большей мере, чем бесплазмидные, ингибируют интенсивность «респираторного взрыва», снижают активность супероксиддисмутазы, миелопе-роксидазы, а также содержание неферментных катионных белков и тем самым угнетают бактерицидную способность фагоцитов.

Установлено, что при фагоцитозе F. tularensis (вне зависимости от вирулентности) в макрофагах и ПЯЛ экспериментальных животных активируются системы, способствующие захвату (хемотаксис, адгезия, поглощение) и внутриклеточной деградации микроба путём активации кислородзависимых и кисло-роднезависимых бактерицидных факторов. В процессе иммуногенеза, вызванном вакцинным штаммом F. tularensis 15, выявлены активация и рост завершенности фагоцитарного процесса за счет повышения функциональной активности, в частности бактерицидного потенциала макрофагов и полиморфноядер-ных лейкоцитов. При инфекционном процессе, обусловленном клетками вирулентного штамма F. tularensis 111, повышается выраженность «респираторного взрыва», активность Г6ФДГ и НАДФ-Н-оксидазы, возрастает содержание неферментных катионных белков, но снижается активность миелопероксидазы.

Впервые найдены и предложены в качестве эффективных иммуномодуля-торов при экспериментальной чумной инфекции препараты растительного происхождения - арабиногалактан и синтезированный на его основе железосодержащий препарат - феррогал. Установлено, что оба препарата стимулируют фагоцитарную активность и бактерицидные механизмы макрофагов в отношении чумного микроба, антителогенез, цитокининдуцирующую активность (патенты на изобретение № 2208440 от 20.07.03 и № 2194715 от 20.12. 02).

Достоверно показана принципиальная возможность повышения протектив-ных свойств живой чумной вакцины при сочетанием применении с арабинога-лактаном и феррогалом.

На основе полученных экспериментальных данных и литературных материалов сформулирована концептуальная схема патогенетически обоснованных принципов и механизмов коррекции функционального состояния иммунной системы макроорганизма.

Теоретическое и практическое значение работы

Результаты проведенных исследований дополняют новыми научными данными сведения о современном состоянии проблемы взаимоотношения микроб-фагоцит, пополняя теоретическую основу и намечая направления изысканий в области изучения механизмов формирования резистентности макроорганизма к возбудителям чумы, псевдотуберкулеза и туляремии.

Разработаны и внедрены в практику научных исследований новые экспериментальные приемы с использованием монослоя культуры макрофагов для сравнительной количественной оценки фагоцитоза Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, F. tularensis и активности ферментов макрофагов, определяющих их бактерицидный потенциал при фагоцитозе. Разработаны методологические подходы и принципы конструирования тест-системы для обнаружения антигенов чумного микроба в монослое макрофагов с помощью антител, меченных коллоидным золотом. Теоретически и практически обоснована возможность использования показателей активности NO-синтазы макрофагов для оценки иммунной перестройки организма.

Сформулировано и практически обосновано перспективное направление поиска препаратов, стимулирующих функциональную активность системы фагоцитирующих лейкоцитов при вакцинальном процессе.

Впервые патогенетически обоснованы принципы коррекции функционального состояния системы мононуклеарных фагоцитов арабиногалактаном и фер-рогалом при взаимодействии с Y. pestis EV.

Экспериментально показано, что арабиногалактан может быть использован в качестве средства экстренной профилактики чумы.

Материалы исследований, представленные в диссертации, использованы при составлении пяти методических рекомендаций:

• «Количественная оценка цитохимических показателей ферментативной активности микро- и макрофагов крови и экссудата методом цитоспектро-фотометрии» (1991 г.);

• «Обнаружение антигенов чумного микроба в монослое макрофагов с помощью антител, меченных коллоидным золотом» (1993 г.);

• «Способ определения активности супероксиддисмутазы» (1999 г.);

• «Способ определения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и НАДФ Н-оксидазы в макрофагах» (2000 г.);

• «Использование показателей NO-синтазной активности макрофагов для оценки иммунной перестройки организма» (2003 г.).

По результатам работы оформлено пять рационализаторских предложений (1983-2001 гг.).

Разработанные методы внедрены в практику научно-исследовательской работы Иркутского, Ставропольского, Ростовского-на-Дону противочумных инстатутов, Улан-Удэнского института общей и экспериментальной биологии СО РАН, Новосибирского ГНЦВБ «Вектор», Новороссийской и Тувинской противочумных станций.

Положения исследования, выносимые на защиту

1. Внутриклеточная инактивация Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и F. tula-rensis осуществляется с участием однотипных механизмов неспецифической резистентности макроорганизма. Универсальным свойством фагоцитов, проявляющимся при внедрении Y. pestis, Y. pseudotuberculosis или F. tularensis является повышение активности систем кислородзависимого метаболизма. Фагоцитоз чумного, псевдотуберкулезного и туляремийного микробов макрофагами и по-лиморфноядерными лейкоцитами является преимущественно незавершенным. Чумной микроб в L-форме оказывает меньшее повреждающее действие на фагоциты. Фракция I и «мышиный» токсин чумного микроба ингибирует кислород-зависимые и кислороднезависимые бактерицидные системы фагоцитов.

2. Плазмиды pYV48 и pVM82 как факторы патогенности Y. pseudotuberculosis обусловливают повышение устойчивости псевдотуберкулезного микроба к фагоцитозу и последующей деструкции в макрофагах и ПЯЛ.

3. При фагоцитозе F. tularensis активируются системы, способствующие захвату и внутриклеточной деградации микроба путем активации кислородза-висимых и кислороднезависимых бактерицидных факторов. В случае фагоцитоза микробов вакцинного штамма деструктивные изменения в макрофагах выражены в меньшей степени и наступают в более поздние сроки, чем при фагоцитозе вирулентных бактерий.

4. Арабиногалактан и феррогал оказывают стимулирующее действие на фагоцитарную активность и бактерицидные механизмы фагоцитоза перитонеаль-ных макрофагов морской свинки в отношении Y. pestis.

Апробация работы

Материалы, изложенные в диссертации, представлены и обсуждены на:

- международных научных конференциях: «Идеи Пастера в борьбе с инфекцией» (Санкт-Петербург, 1995), «Проблемы иерсиниозов и других актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2000), «Природно-очаговые инфекции» (Улан-Батор, 2000-2002), «Проблемы биологической и экологической безопасности» (Оболенск, 2000), «Современный эпидемический потенциал природных очагов чумы» (Талдыкурган, 2001);

- международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы» (Санкт-Петербург, 2003);

- международном симпозиуме по противочумной стратегии (Байчен, КНР, 1999);

- V международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Санкт-Петербург, 2001);

- Всероссийских научных конференциях - «Экологозависимая патология» (Чита, 1999), «Проблемы медицины и биологии» (Кемерово, 1999), «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2000);

- Всероссийском научно-практическом молодежном симпозиуме «Экология Байкала и Прибайкалья» (Иркутск, 1999, 2000);

- Межрегиональной конференции, посвященной 100-летию академика АМН СССР С.П. Карпова (Томск, 2003);

- Региональных научно-практических конференциях: «Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезней» (Ставрополь, 1993), «Наука, образование, новые технологии» (Иркутск, 2000), научная конференция, посвященная 60-летию противочумного института Кавказа и Закавказья (Ставрополь, 1995), «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Барнаул, 1999), «Актуальные аспекты при-родноочаговых болезней» (Омск, 2001), «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе» (Ставрополь, 2002); научных конференциях Иркутского противочумного института (Иркутск, 1992-2004).

Диссертация оформлена на основе материалов плановых тем (1986-2000 гг.) и результатов текущей НИР (2001- 2004 гг.).

Публикации: Основное содержание работы отражено в 52 публикациях, из них 36 - в центральных изданиях, в том числе 14 - в рекомендованных ВАК, 9 - в зарубежных изданиях, в монографии «Функциональные особенности фагоцитов при инфекционном и вакцинальном процессе, вызываемом Francisella tularensis» и двух патентах на изобретения.

Объем и структура диссертации

выводы

1. Выявлено сходство реакций, обеспечивающих внутриклеточную инактивацию Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и F. tularensis, что указывает на однотипность механизмов неспецифической резистентности макроорганизма. Универсальным свойством фагоцитов, проявляющимся при внедрении Y. pestis, Y pseudotuberculosis или F. tularensis является повышение активности систем кислородзависимого метаболизма. При иммунизации животных чумной или ту-ляремийной вакцинами в фагоцитах стимулируются реакции, ответственные за внутриклеточную инактивацию соответственно Y. pestis и F. tularensis.

2. Фагоцитоз макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и F. tularensis является преимущественно незавершенным (70-80%), что обеспечивает возможность переживания и последующего размножения патогенных бактерий в макроорганизме.

3. Чумной микроб в L-форме отличается от исходных родительских клеток большей стимуляцией окислительных и лизосомальных гидролитических ферментов фагоцита, но более заметной супрессией кислой фосфатазы, что коррелирует с более низкими в отношении - L-бактерий показателями фагоцитарной активности макрофагов и меньшим повреждающим действием их на фагоцит.

4. Фракция I чумного микроба ингибирует кислородзависимые и кисло-роднезависимые бактерицидные системы макрофагов и ПЯЛ, а также синтез монооксида азота перитонеальными макрофагами экспериментальных животных. In vivo «мышиный» токсин в три раза снижает интенсивность кислородзависимого метаболизма фагоцитов и уменьшает содержание в них неферментных катионных белков.

5. Плазмиды pYV48 и pVM82 псевдотуберкулезного микроба обусловливают его ингибирующее влияние на хемотаксис и адгезивные функции, кислородзависимые бактерицидные механизмы и кислороднезависимые механизмы, опосредованные катионными белками и лизосомальными ферментами.

6. При фагоцитозе F. tularensis активируются системы, способствующие захвату и внутриклеточной деградации микроба путем активации кислород-зависимых и кислороднезависимых бактерицидных факторов. При инфекционном процессе, обусловленном F. tularensis 111, бактерицидные системы фагоцитов активируются в наибольшей степени.

7. Цитопатическое действие вирулентных туляремийных микробов выявляется у 60-70% макрофагов морских свинок, в отношении макрофагов иммунных животных оно выражено в меньшей степени. В случае фагоцитоза микробов вакцинного штамма деструктивные изменения в макрофагах выражены слабо и возникают в более поздние сроки (4-6 ч), чем при фагоцитозе вирулентных микробов (30 мин).

8. Арабиногалактан и феррогал активируют фагоцитарную активность макрофагов морских свинок в отношении чумного микроба, стимулируют синтез моноОксида азота, ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а, антителогенез и тем самым оказывают выраженное иммуномодулирующее действие, усиливая бактерицидный потенциал макроорганизма. Арабиногалактан предложен в качестве средства экстренной профилактики чумы.

9. Разработана концептуальная схема механизмов действия арабиногалактана и патогенетически обоснованы принципы коррекции функционального состояния системы мононуклеарных фагоцитов при взаимодействии с бактериальными патогенами.