Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фитохимическое исследование и усовершенствование стандартизации сырья и препаратов алоэ древовидного и каллизии душистой

005008644

На правах рукописи

ИБРАГИМОВ ТИМУР АЛГАСАНОВИЧ

ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СТАНДАРТИЗАЦИИ СЫРЬЯ И ПРЕПАРАТОВ АЛОЭ ДРЕВОВИДНОГО И КАЛЛИЗИИ ДУШИСТОЙ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Пятигорск - 2011

1 2 ЯНВ 20Т2

005008644

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор Челомбитько Вячеслав Александрович

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Лазарян Джон Седракович доктор фармацевтических наук, профессор Фурса Николай Сергеевич

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия Мин-здравсоцразвития России

Защита диссертации состоится «21» января 2012 г. в 900 часов на заседании диссертационного совета Д 208.069.01 при ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России (357532, Ставропольский край, Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «20» декабря 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Современные условия жизни человека (неблагоприятная экологическая обстановка, стрессовые ситуации, гиподинамия и др.) обусловили так называемые «болезни цивилизации» - заболевания, связанные с ослаблением адаптационных механизмов организма, снижением иммунитета. Прогрессирующий рост числа этих заболеваний, часто являющихся причиной потери трудоспособности и даже инвалидизации, делает актуальной проблему разработки высокоэффективных лекарственных средств (ЛС) адаптогенного и иммуностимулирующего действия - препаратов биогенных стимуляторов.

В медицинской практике в качестве биогенных стимуляторов в настоящее время используются лекарственное сырье из растений, грибов, животных, лиманных грязей, торфа. Наряду с известными преимуществами, фитопрепараты близки к эндогенным биорегуляторным соединениям. Тем не менее, круг биостимуляторов ограничивается несколькими видами сырья — алоэ древовидное, каланхоэ перистое, очиток большой, березовый гриб (чага). Наиболее известным из них являются листья алоэ - многолетнего суккулента, на основе которого производятся экстракт жидкий, сок, линимент, сироп и таблетки.

Несмотря на относительно полные сведения о составе биологически активных веществ (БАВ) алоэ древовидного (антраценпроизводные, флороглюци-ды, углеводы, протеиды и др.), до сих пор неизученным остается вопрос о влиянии неблагоприятных условий хранения сырья на качественные и количественные изменения БАВ. Решение этого вопроса позволит оптимизировать не только технологию фитопрепаратов, но и их стандартизацию с привлечением наиболее информативных физико-химических методов. Это особенно необходимо, учитывая, что действующая нормативная документация регламентирует качество фитопрепаратов алоэ по неспецифичным показателям (содержанию не характерного для алоэ истизина, сумме восстановителей и др.) с применением малоинформативных методов контроля или вообще не предусматривая количественного определения (для сока). Кроме того, за счет выявления новых групп БАВ и более полного их использования можно расширить рамки использования сырья алоэ.

Кроме алоэ, в качестве объекта своего исследования мы использовали оранжерейный многолетний суккулент - каллизию душистую (Callisia fragraus Wood.) в народе называемый золотой ус, или домашний женьшень. Возможной причиной того, что препараты из каллизии до сих пор не появились среди используемых биостимуляторов является то, что химический состав растения мало изучен.

Таким образом, более глубокое изучение состава БАВ алоэ древовидного и каллизии душистой, разработка методов получения суммы БАВ из них для создания J1C является актуальной проблемой для фармацевтической науки.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось теоретическое и экспериментальное обоснование возможности получения лекарственных средств на основе исследования состава БАВ листьев алоэ древовидного и побегов каллизии душистой.

Для достижения этой цели необходимо решить следующие задачи:

1. Провести анализ современного состояния исследований по химическому составу, методам анализа и стандартизации препаратов из листьев алоэ и побегов каллизии с обоснованием необходимости и возможности их дальнейшего изучения;

2. Определить основные морфолого-анатомические диагностически значимые признаки и числовые показатели сырья листьев алоэ древовидного и побегов каллизии душистой;

3. Изучить химический состав листьев алоэ древовидного и побегов каллизии душистой, выделив при этом основные группы БАВ;

4. Изучить влияние консервации при низкой температуре листьев алоэ на состав основный БАВ и биологическую активность;

5. Оптимизировать технологию получения сока из листьев алоэ, прошедших консервацию;

6. Разработать новые методы стандартизации сырья листьев алоэ и побегов каллизии, а также фитопрепаратов на их основе (сок алоэ, жидкий экстракт алоэ, сок каллизии);

7. Представить нормативную документацию ( ФСП и ТУ на сырье и препараты), регламентирующие подлинность и качество лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов из него.

Научная новизна работы. Изучен химический состав листьев алоэ древовидного и побегов каллизии душистой и доказана возможность выделения из них суммы БАВ для получения различных ЛС.

На основании морфолого-анатомического исследования выявлены основные анатомо-диагностически значимые признаки листьев алоэ (I) и побегов каллизии (II). Для I это клетки верхней и нижней эпидермы полигональной формы, устьица (тетраперигенный тип) редкие, овальные клетки хлоренхимы, наличие идиобластов с пучками рафид, в мезофилле обнаружено большое количество слизистых клеток и алоиновых клеток. Для II эти признаки установлены впервые: в горизонтальных побегах - наличие удлиненных клеток эпидермиса, для вертикальных побегов — наличие крупного тонкостенного эпидермиса верхней листовой пластинки с включением рафид. Устьица тетрацитного типа, коллатеральные пучки закрытые.

Проведено систематическое фитохимическое изучение основных групп БАВ (антраценпроизводных, флороглюцидов, кумаринов, флавоноидов, фено-локислот, органических кислот, липидов, углеводов, аминокислот и др.) в выделенных с помощью методов избирательной жидкостной экстракции фракциях экстрактивных веществ. Для этих целей использованы современные физико-химические методы анализа (ВЭЖХ, ВЭТСХ, хроматоденситометрия, спектроскопия и др.).

Показано, что листья алоэ содержат флороглюциды, антраценпроизводные, кумарины, фенолокислоты, каротиноиды, хлорофиллы, углеводы, органические кислоты, аминокислоты, сапонины, биогенные элементы. Наличие трех последних групп БАВ в листьях алоэ установлено впервые. Кроме других выделенных соединений, впервые выделены и идентифицированы алоэнин, умбеллиферон, эс-кулетин, 2"-0-ферулоилалоэзин, 7-гидрокси-2,5-диметилхромон, 4-метокси-6-(2',4'-дигидрокси-6'-метилфенил)-пирон-2. Кроме того, впервые в листьях алоэ

обнаружены: хлорофиллы, фруктоза, сахароза, 15 аминокислот, 9 биогенных элементов. Установлено высокое содержание алоэнина и алоэ-эмодина, что подтвердило их роль как индикаторных компонентов алоэ.

Впервые установлен химический состав БАВ побегов кашшзии душистой. Установлено наличие антраценпроизводных, кумаринов, фенолокислот, флавоноидов, каротиноидов, хлорофиллов, углеводов, аминокислот, биогенных элементов. Из индивидуальных представителей перечисленных групп БАВ впервые выделены и идентифицированы скополетин, умбеллиферон, алоэ-эмодин. Обнаружены аскорбиновая, галловая, цикориевая, кофейная и феруло-вая кислоты, кверцетин, кемпферол, виолаксантин, лютеин, р-каротин, 14 аминокислот, 7 биогенных элементов.

Данные исследования показали наличие богатого комплекса БАВ, что определило развитие новых и совершенствование известных технологий использования растительного сырья, а также методы контроля качества фитопрепаратов.

Изучение влияния на состав БАВ низкой температуры (+4 °С) при продолжительном хранении листьев алоэ позволило установить разное накопление некоторых групп соединений. Установлено, что при 10-суточной экспозиции листьев при низкой температуре в каждой из груш БАВ (аминокислот, углеводов, органических кислот, фенольных соединений и антраценпроизводных) по разному происходит максимальное увеличение концентрации в сырье. Это позволило оптимизировать технологию сока в сравнении с традиционной технологией: использовать листья, подвергшиеся охлаждению в течение 10 суток, отделять сок от листьев после ферментации биомассы (35 °С, 2 часа) и ее быстрого охлаждения. Подобная оптимизация позволила достичь более выраженного антарадикального (на 6,7%) и стимулирующего действия сока на рост дрожжевых клеток (на 17%) по сравнению с контролем (Р<0,05).

Обоснованы методы, показатели и нормы качества листьев, сока и жидкого экстракта алоэ, побегов и сока каллизии, регламентирующие контроль фитопрепаратов по основным действующим веществам.

Практическая значимость результатов исследования. Пересмотрены ФС «Листья алоэ древовидного свежие», «Алоэ сок», «Алоэ экстракт жидкий для инъекций» с целью регламентации контроля качества по наличию и содержанию специфичных для алоэ соединений (алоэнина и алоэ-эмодина) с применением информативных физико-химических методов анализа (ВЭТСХ, спек-трофотометрия (СФ)). Кроме того, новые редакции ФСП дополнены разделами: «Анатомо-диагностические признаки сырья», «Содержание золы обшей», «Микробиологическая чистота».

Оптимизирована технология получения нативного сока из листьев алоэ, позволяющая увеличить не только его выход в среднем на 5,3%, но и экстрактивных веществ на 14,48%.

Предложено проведение стандартизации побегов каллизии и сока калли-зии путем идентификации и количественного определения восстанавливающих Сахаров, белков и аминокислот методом СФ. В разработанные проекты ТУ также внесены еще товароведческие и микробиологические показатели. Материалы внедрения

1. ФСП «Алоэ экстракт жидкий, раствор для подкожного введения». Получено регистрационное удостоверение (ЛСР-007787/09-05102009).

2. Проект ФСП «Алоэ древовидного листья свежие». Справка о передаче проекта ФСП после согласования с ЗАО «Вифитех» получена от ГУ ВИ-ЛАР (г. Москва).

3. Проект ФСП «Алоэ сок». Справка о передаче проекта ФСП после согласования с ЗАО «Вифитех» получена от ГУ ВИЛАР (г. Москва).

4. ТУ 9373-011-17491338-2008 «Каллизии душистой побеги свежие». Согласованы с ЗАО «Вифитех» и утверждены в ГУ ВИЛАР (г. Москва).

5. ТУ 9168-012-17491338-2008 «Сок «Золотой ус». Согласованы с ЗАО «Вифитех» и утверждены в ГУ ВИЛАР (г. Москва).

6. Технологическая инструкция по заготовке, первичной переработке, транспортировке и хранению свежих побегов каллизии душистой. Утверждены в ЗАО «Вифитех».

Положения, выдвигаемые на защиту:

- теоретическое и экспериментальное обоснование использования листьев алоэ древовидного и побегов каллизии душистой для выделения суммы БАВ с целью разработки на их основе JIC;

- результаты изучения морфолого-анатомических признаков, числовых показателей и состава БАВ листьев алоэ и побегов каллизии;

- данные по исследованию влияния низкой температуры хранения листьев алоэ на состав БАВ и биологические свойства;

- оптимизация технологии и изучение физико-химических характеристик сока из листьев алоэ и побегов каллизии;

- обоснование методов стандартизации, показателей и норм качества листьев алоэ, побегов каллизии и фитопрепаратов, полученных на их основе.

Апробация работы. Основные фрагменты диссертационной работы доложены и обсуждены на международной научной конференции (Астрахань, 2010); 2 Российских фитотерапевтических съездах (Москва, 2008, 2010); российской научно-практической конференции (Владикавказ, 2009) и 4 региональных научных конференциях по фармации, фармакологии и подготовке кадров (Пятигорск, 2008,2009,2010,2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 6 в рекомендуемых изданиях ВАК РФ.

Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Минздравсоцразвития России» (номер государственной регистрации 01200108441).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 153 страницах, состоит из введения, пяти глав, общих выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 31 рисунком и 40 таблицами. Библиография включает 155 источников, из которых 69 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектами исследования явились листья алоэ древовидного (Aloe arbores-cens var. natalensis Mill.) сем. асфоделовые (Asphodelaceae), побеги каллизии душистой (Callisia fragrans Wood.) сем. коммелиновые (Commelinaceae), полученные в 2006-2010 гг. от специализированного экспериментального хозяйства СГАУ им. Н.И. Вавилова (г. Саратов) и из ботанического сада института общей и прикладной биологии СО РАН (г. Улан-Удэ). Заготовку листьев алоэ проводили в течение года, побегов каллизии - в период, когда число междоузлий у бокового стебля достигало не менее 6 штук. Объектами исследования также служили экспериментальные образцы сока и жидкого экстракта алоэ производства ЗАО «Вифитех». Пробы для исследования хранили в условиях, соответствующих требованиям ГОСТ 17768-90.

Для установления морфолого-анатомических признаков и товароведческих показателей сырья использовали общепринятые методики и терменоло-гию, описанные в ГФ XI и XII изданий и Фармакогнозия. Атлас. Самылина и др., 2007 г.

Для получения фракций, содержащих различные группы БАВ, использовали: гексан (ГОСТ 13647-78), хлороформ (ГОСТ 20015-88), этилацетат (ТУ 18-16291-80), спирт этиловый 95% (ГОСТ 18300-82), спирт н-бутиловый (ГОСТ 600678), воду очищенную (ФС 42-2619-97). Для разделения, выделения, обнаружения и количественного определения БАВ в листьях алоэ, побегах каллизии и полученных из них фитопрепаратах использовали качественные реакшш, спектральные, хроматографические, денситометрические, поляриметрический, титриметриче-ские, гравиметрические и др. методы анализа.

Содержание аминокислот методом ВЭЖХ определяли на аминокислотном анализаторе «Ашшо Acid Analyzer Т 339 M» в лаборатории патологии обмена веществ ГНИУ животноводства и кормопроизводства (г. Ставрополь).

Минеральный состав растительных объектов изучали методом эмиссионного спектрографического анализа (метод испарения из кратера угольного электрода) (филиал ФГУ «Пятигорский центр стандартизации, метрологии и сертификации», г. Ессентуки).

Валидационные характеристики методик количественного определения БАВ оценивали по показателям: специфичность, линейность, прецизионность, правильность.

Использовали условия хранения листьев алоэ, описанные В.П. Филатовым, путем упаковки свежих листьев в пакет и выдерживания в темноте при температуре +4 °С до 20 суток.

Испытание микробиологической чистоты листьев алоэ, побегов каллизии и фитопрепаратов, полученных на их основе, проводили в соответствии с ОФС «Микробиологическая чистота» ГФ XII издания.

Антирадикальную активность сока из листьев алоэ оценивали по методу ОРРН-азэау путем улавливания радикалов дифенилпикрилгидразила. Влияние сока из листьев алоэ на рост дрожжевых клеток оценивали с помощью «дрожжевого теста» на питательной среде Ридера, состоящей из пекарских дрожжей, неорганических солей и глюкозы.

Морфолого-анатомическое изучение листьев алоэ древовидного и побегов каллизии душистой

Во избежание фальсификации сырья и попадания в него примесей других видов нами выявлены основные морфолого-анатомические диагностически значимые признаки для листа алоэ древовидного и побегов каллизии душистой.

Алоэ древовидное - многолетнее суккулетное тепличное растение. Его листья очередные мясистые сочные стеблеобъемлзощие, мечевидные длиной от 25 до 65 см. С верхней стороны они вогнутые, снизу - выпуклые, по краю шиповато-зубчатые. Листья удлиненно-мечевидные с шиповатыми краями.

В качестве анатомо-диагностически значимых признаков можно выделить клетки верхней и нижней эпидермы листа с прямыми стенками в большей степени полигональной (4-7-гранной) формы. Устьица (тетраперигенный тип) редкие, погруженные, окружены 4 клетками эпидермы, встречаются как с верхней, так и с нижней стороны листа. Среди овальных клеток хлоренхимы видны идиобласты, содержащие крупные пучки рафид оксалата кальция. В хлоренхи-ме листа расположены клетки с коричневым мелкозернистым содержимым

(алоиновые клетки). Клетки обширной сердцевины (мезофилла) заполнены слизистым содержимым (рисунок 1).

Каллизия душистая - многолетнее травянистое суккулетное тепличное растение. Сырьем являются горизонтальные побеги, состоящие из 9 - 12 и более звеньев цилиндрической формы диаметром до 1 см, которые имеют недоразвитые листья длиной 1 - 2 см. В сырье допускается присутствие вертикальных олиственных побегов каллизии, имеющих цилиндрическую формы диаметром до 3 см. Они имеют крупные, простые, ланцетовидные листья длиной до 30 см, шириной до 6 см, сидячие, заостренные на конце.

В качестве анатомо-диагностически значимых признаков побегов каллизии душистой следует выделить устьица тетрацитного типа на эпидерме побега и на нижней стороне листьев, рафиды и игольчатые кристаллы в эпидерме листа, присутствие простых многорядных волосков.

Рисунок 1 - Фрагменты поперечного среза листа алоэ древовидного (а), вертикального и горизонтального побегов каллизии душистой (б)

Изучение товароведческих показателей и состава БАВ листьев алоэ древовидного и побегов каллизии душистой

С целью обоснования норм качества растительного сырья по числовым показателям проведен товароведческий анализ. Для листьев алоэ и побегов каллизии соответственно установлены значения показателей в следующих интервалах (в %): потеря в массе при высушивании 92,5-95,4, 86,4^-91,5; зола общая 3.0-3,4, 9,1-41,1; минеральные примеси 0,26-0,36, 0,20 -0,35: доля изломанных листьев, побегов 5,0-^9,4, 5,7-;-9,5; отсутствие органических примесей.

С помощью методов избирательной жидкостной экстракции, последовательно используя различные растворители, из сырья были выделены различные фракции экстрактивных веществ, в которых по групповым качественным реакциям предварительно установлен состав основных групп БАВ (табл. 1).

Таблица 1 — Качественный состав БАВ листьев алоэ и побегов каллизии

Результаты анализа БАВ во Результаты анализа БАВ во фрак-

фракциях, выделенных из алоэ циях, выделенных из каллизии

Группы БАВ 5 5 X % § § * О М 5 к 5 6 & 0 1 § О

в о о & ш 5 а еэ г* О* к § 1 т о 11 11 й 03 8 о. 03 О. к О га

£ £ О § 1 СР о. £ Я с О £ к Я а.

Флороглюциды - + + - - - - - - -

Антраценпроиз-водные - + + ± - - +++ - - -

Кумарины - + + + - - +++ - - -

Флавоноиды - - - - - - ± + - -

Катехины

Белки и амино- - - - - + - - - - +

кислоты

Углеводы - - - + + - - - + +

Сапонины - + ± + - - ± - - -

Каротиноиды + - - - - + - - - -

Алкалоиды, азо- - - - - - - ± - - -

тистые основания

Примечание: «+» - положительный эффект реакций; «±» - слабо выраженный эффект реакций;«-» - отрицательный эффект реакций.

Разделение полученных фракций на компоненты проведено методом колоночной хроматографии на силикагеле с использованием градиентного элюи-рования различными системами растворителей: петролейный эфир - ацетон (гексановая фракция), гексан - этилацетат (хлороформная фракция), хлороформ - спирт этиловый 95% (этилацетатная фракция), спирт метиловый - вода - кислота фосфорная конц. (этилацетатно-бутанольная фракция).

При анализе веществ, элюированных из гексановых фракций листьев алоэ и побегов каллизии, комбинированным методом ВЭТСХ-денситометрии на хрома-тограммах обнаружены две зоны пятен, которые по характерным окраскам в видимом и УФ (365 нм) свете до и после детектирования отнесены к каротиноидам и хлорофиллам. Идентифицировать индивидуальных представителей этих групп соединений в алоэ не удалось, в отличие от элюированных из гексановой фракции каллизии веществ: каротиноиды - виолаксантин (13,95% к фракции), лютеин (9,43%), |3-каротин (1,96%), а также хлорофиллы а (35,76%) и в (10,61%).

Изучение физико-химических характеристик веществ, выделенных из некоторых фракций алоэ и каллизии, позволило в сравнении со стандартными образцами идентифицировать эти соединения и методом ВЭТСХ-денситометрии определить их количественное содержание (табл. 2).

Таблица 2 - Результаты идентификации и количественного определения

веществ, выделенных из исследуемых фракций алоэ и каллизии

Элюеит' Физико-химические характеристики веществ Идентифицированные соединения Содержание во фракции, о/ 70

Хтах в УФ спектре (СНзОН), им Температура плавления. °С Молярная масса, г/моль Время удерживания (ВЭЖХ), мин

Хлороформная фракция алоэ

I, 100:0 252,287; +NaOH: 237, 286 219 270 Алоэ-эмодин 23,11±1,16

I, 95:5 215,245, 300,324 231 162 Умбеллиферон 10,89±0,54

I, 95:5 230, 244, 305 212 241 4-метокси-6-(2,,4'-дигидрокси-б'-метилфеши)-пирон-2 16,04±0,80

I, 85:15 250,290; +NaOH: 258, 320 255 190 7-гидрокси-2,5-диметилхромон 10,34±0,51

I, 80:20 261,305, 355 269 178 Эскулетин 8,56±0,42

Хло 0оформиая фракция каллизии

I, 100:0 252,287; +NaOH: 237,286 218 270 Алоэ-эмодин 3,3±0,18

I, 95:5 230,255, 299, 345 202 192 Скополстин 14,3±0,72

I, 95:5 215,300, 324 231 162 Умбеллиферон 42,8±2,16

Этилацетатная фракция алоэ

II, 85:15 230, 253, 300,320 153-156 2"-0- ферулоилалоэзин 4,55±0,21

II, 80:20 262,297, 362 АлоинА 7,13±0,35

11, 80:20 297, 353 Алоин В 7,48±0,37

II, 80:20 232, 307 145-147 410 Алоэнин 29,32±1,46

Этилацетатно-бутанольная фракц ия каллизии

III 2,875 Аскорбиновая кислота 26,03±1,30

111 3,313 Галловая кислота 38,12±1,91

III 5,708 Кофейная кислота 2,97±0,15

III 6,512 Цикориевая кислота 7,16±0,36

III 7,927 Феруловая кислота 0,50±0,03

III 27,110 Кверцетин 6,51±0,33

III 63,510 Кемпферол 0,22±0,02

Примечание: I: гексан - этилацетат; П: хлороформ - спирт этиловый 95%;

III: метанол - вода - кислота фосфорная конц. (80:120:1) 13

В спиртовых фракциях методом ВЭТСХ в системе: этилацетат - спирт изо-пропиловый - кислота муравьиная (10:7:3) путем детектирования зон адсорбции 0,2% спиртовым раствором карбазола в сравнении со стандартными образцами обнаружены низкомолекулярные углеводы: глюкоза (Ш" 0,508), фруктоза (М 0,495), сахароза (ЯГ 0,184) в алоэ; глюкоза (М 0,508), ксилоза (Ш" 0,323), рамноза (ЯГ0,215) в каллизии. Также методом ВЭТСХ, но, используя другую систему растворителей: ацетон - аммиак - спирт этиловый 95% - хлороформ - вода (30:11:5:3:1), с последующим денситометрическим сканированием хроматограм-мы в спиртовой фракции алоэ установлено содержание органических кислот: яблочной (44,83% к фракции), щавелевой (6,21%), малоновой (3,45%).

В водорастворимой фракции из листьев алоэ методом ВЭЖХ установлено наличие 15 аминокислот с суммарным содержанием 42,95% к сухому остатку фракции, из которых 8 являются незаменимыми (41,72% всех аминокислот). В водорастворимой фракции из побегов каллизии выявлено 14 аминокислот с содержанием 12,03% к сухому остатку фракции, в т.ч. 8 незаменимых аминокислот (49,63% всех аминокислот) (табл. 3).

Таблица 3 - Содержание аминокислот в водорастворимых фракциях,

полученных из листьев алоэ и побегов каллизии

Аминокислоты Концентрация во фрак- Концентрация во фрак-

ции из алоэ, % ции из каллизии, %

Аспарагиновая кислота 5,01±0,15 1,02±0,05

Треонин* 3,12±0,09 0,60±0,02

Серин 3,07±0,09 0,77±0,03

Глутаминовая кислота 4,22±0,13 1,71 ±0,07

Глицин 4,15±0,14 0,77±0,03

Алании 4,42±0,15 0,85±0,04

Валин* 3,24±0,11 0,77±0,03

Пролин 2,03±0,06 -

Изолейцин* 2,45±0,10 0,34±0,02

Лейцин* 4,28±0,13 0,77±0,03

Тирозин 2,13±0,06 0,94±0,05

Фенилаланин* 1,41 ±0,06 0,34±0,02

Гистидин* 1,15±0,05 0,85±0,03

Лизин* 1,05±0,05 0,77±0,03

Аргинин* 1,22±0,05 1,53±0,06

Примечание: «*» - незаменимые аминокислоты.

Для анализа углеводов водорастворимые фракции освобождали от мешающего влияния аминокислот (с помощью трихлоруксусной кислоты) и подвергали кислотному гидролизу трифторуксусной кислотой. Методом ВЭТСХ-денситометрии установлен углеводный состав гидролизатов фракций алоэ и кал-лизии соответственно (в %): галактуроновая кислота - галактоза - арабиноза -рамноза - глюкоза - ксилоза (77,8:6,9:6,3:4,4:4,1:0,4); галактуроновая кислота -галактоза - арабиноза - рамноза - ксилоза (69,8:9,4:7,8:6,4:6,4). Преобладание галактуроновой кислоты в продуктах гидролиза обеих фракций позволило отнести исследуемые углеводы к пектиновым веществам.

С использованием эмиссионного спектрографического анализа установлен элементный состав исследуемых водорастворимых фракций, по которому можно выделить следующий порядок изменения концентраций элементов в алоэ: 1л > В > Ca>K>Mg = P = Se>Zп>Cц,вкaллизии:Ca»K>P>Na = Mg>Si>Fe>Mn.

На основании проведенных фотохимических исследований полученные результаты изучения состава БАВ можно резюмировать в виде табл. 4. Таблица 4 - Качественный состав БАВ листьев алоэ древовидного и побегов

каллизии душистой

Группы БАВ Листья алоэ Побеги каллизии

Антрахиноны Алоэ-эмодин, алоины А и В (барбалоин), алоэнин, 4-метокси-6-(2',4'-дигидрокси-6'-метилфенил)-пирон-2 Алоэ-эмодин

Кумарины Умбеллиферон, эскулетин, ванилиновая кислота, 2"-0-ферулоилалоэзин Скополетин, умбеллиферон

Флавоноиды - Кверцетин, кемпферол

Фенолокислоты Феруловая, кофейная, цикоревая, хлорогеновая Галловая, кофейная, цикоревая, феруловая

Органические кислоты Яблочная, щавелевая, малоновая Аскорбиновая

Углеводы Галактуроновая кислота, галактоза, арабиноза, рамноза, глюкоза, ксилоза, фруктоза, сахароза, пектины Галактуроновая кислота, галактоза, арабиноза, глюкоза, ксилоза, рамноза, пектины

Аминокислоты 15 14

Каротиноиды и хлорофиллы Р-каротин, р-эсакаротин, криптоксантин, висшаксан-тин, лютеин, хлорофиллы а и в, феофетин а ив

Биогенные элементы Са, К, М& Р, Ц В, Бе, 2п, Си Са,К,М&Р,Ка, Ре,Мп

Полученные данные свидетельствуют о многообразии состава БАВ, как в алоэ, так и каллизии. Накопление в листьях алоэ алоэнина (1,29% к массе сухого сырья), алоэ-эмодина и его производных (алоинов) (0,99% к массе сухого сырья) с учетом обусловленности ими специфической фармакологической активности определило возможность стандартизации фитопрепаратов алоэ по содержанию алоэнина и алоэ-эмодина. Аналогичное заключение можно сделать по содержанию углеводов (1,82% к массе сухого сырья) и аминокислот (1,48% к массе сухого сырья) в побегах каллизии. Следует отметить также высокие концентрации органических кислот в листьях алоэ (11,05%) и побегах каллизии (2,65%), а также аминокислот (9,21%) в листьях алоэ.

Исследование влияния консервации листьев алоэ, по оптимизации технологии сока и изучение его биологических свойств

Учитывая известные сведения о накоплении веществ иммуностимулирующего действия в процессе хранения листьев алоэ при пониженной температуре, нами исследована зависимость качественного и количественного состава БАВ от продолжительности воздействия низкой температуры. Установлена положительная динамика изменения количественного состава БАВ. Максимальное увеличение концентрации аминокислот (в 2 раза), углеводов (в 1,8 раз), органических кислот (в 1,4 раз) достигается на 10 сутки экспозиции листьев алоэ. Повышение содержания фенольных соединений (в 1,2-1,3 раз) и особенно производных алоэзина (в 1,3-7,3 раз), алоэ-эмодина (в 1,3 раз), алоэнина (в 1,1 раз) наблюдается на 5 сутки, полисахаридов (в 1,2 раз) - 15 сутки. Полученные данные позволили пересмотреть технологию, показатели и нормы качества фитопрепаратов.

В сравнении с традиционной технологией сока, модифицированная технология предполагает использование листьев, подвергшихся охлаждению (+4 °С) в течение 10 суток, отделение сока от листьев под вакуумом после ферментации биомассы (35±2 °С, 2 часа) и быстрого ее охлаждения. Подобная оптимизация привело к увеличению выхода сока до 90,9% (на 5,3%) и концентрации в нем экстрактивных веществ до 3,5%.

Изучение антирадикальной активности сока методом DPPH-assay (in vitro) показало достоверное (Р<0,05) увеличение степени связывания радикалов дифенилпикрилгидразила на 6,7% и снижение минимальной радикал - ингиби-рующей концентрации (1С5о) на 25% по сравнению с контролем. С применением питательной среды Ридера (метод in situ) установлена достоверно выраженная (Р<0,05) способность сока потенцировать рост клеток дрожжей (на 17%) по сравнению с контролем.

Стандартизация листьев алоэ, побегов каллизии и фитопрепаратов на их основе

Действующие фармакопейные статьи регламентируют идентификацию фитопрепаратов алоэ по групповым качественным реакциям, не позволяющим достоверно обнаружить индикаторные компоненты (алоэнин, алоэ-эмодин), а для количественного анализа предлагают определение неспецифичного соединения - истизина (в листьях), суммы восстановителей (в жидком экстракте) или вообще не регламентируют количественное определение (в соке). В связи этим, нами пересмотрены методы анализа, показатели и нормы качества в новых редакциях ФСП. Параметры качества растительного сырья и фитопрепаратов на их основе, включенные в проекты ФСП, разработаны и оформлены в соответствии с ОСТ 91500.05.001-00.

При разработке методик стандартизации мы придерживались принципа унификации в ряду: растительное сырье - JIC. Установление подлинности листьев, сока и жидкого экстракта алоэ предложено проводить путем обнаружения алоэнина и алоэ-эмодина следующими методами:

- ВЭТСХ в системе - этилацетат : спирт этиловый 95% : вода (7:2:1), проявитель - 5% спиртовой раствор калия гидроксида; на хроматограмме должно быть 2 пятна: одно желто-оранжевое, после проявления в УФ свете (365 нм) становится розовым, имеет Rf 0,741 (алоэ-эмодин), другое пятно с ярко-голубой флюоресценцией в УФ свете при 365 нм, имеет Rf 0,591 (алоэнин);

- СФ применительно к хлороформному извлечению, приготовленному для последующего количественного анализа; в спектре поглощения должна на-

блюдаться характерная полоса с максимумом 430±2 нм, минимумом 395±2 нм, что соответствует спектру стандартного образца алоэ-эмодина;

- СФ применительно к этилацетатному извлечению, приготовленному для последующего количественного определения; в спектре поглощения должна наблюдаться характерная полоса с максимумом 307±2 нм, минимумом 300±2 нм, что соответствует УФ спектру стандартного образца алоэнина.

Количественное определение предложено проводить:

- по сумме антраценпроизводных (в пересчете на алоэ-эмодин); для этого разработана методика, предусматривающая кислотный гидролиз и окисление алоинов до алоэ-эмодина, экстрагируемого хлороформом и имеющего в спектре поглощения характерную полосу, описанную выше;

- по сумме фенольных соединений (в пересчете на алоэнин); для этого разработана методика, основанная на этилацетатном извлечении алоэнина, имеющего в УФ спектре поглощения описанную характерную полосу.

Применительно к трем фитопрепаратам алоэ методики количественного определения являются специфичными, прецизионными, правильными, зависимость анализируемых показателей □ линейной.

Основные показатели и нормы качества листьев, сока и жидкого экстракта алоэ, включенные в проекты ФСП, представлены в табл. 5.

Содержание суммы антраценпроизводных в пересчете на алоэ-эмодин при аналитической длине волны 430±2 нм составляет: 29,2-30,8 мг % в листьях алоэ, 32,9-35,1 мг % в соке алоэ, 1,0-1,1 мг % в жидком экстракте.

Содержание суммы фенольных соединений в пересчете на алоэнин при аналитической длине волны 307±2 нм составляет: 44,0-46,0 мг % в соке алоэ, 1,19-1,25 мг % в жидком экстракте алоэ.

Таблица 5 - Основные показатели и нормы качества листьев алоэ и

фитопрепаратов на его основе, предусмотренные в проектах ФСП

Показатели «Алоэ древовидного листья свежие» «Алоэ сок» «Алоэ экстракт жидкий, раствор для подкожного введения»

РН 5,0-6,8

Потеря в массе при высушивании Не менее 92,0%

Сухих веществ Не менее 3,0%

Золы общей Не более 4,0%

Органических примесей Не допускается

Минеральных примесей Не более 0,4%

Изломанных листьев Не более 10,0%

Подлинность: - алоэ-эмодин, алоэиин (метод ВЭТСХ) - алоэ-эмодин (метод СФ) - алоэнин (метод СФ)

2 пятна: одно желто-оранжевое, после проявления - розовое (ЯГ 0,741), другое - с ярко-голубой флюоресценцией в УФ свете (Ш" 0,591)

Максимум поглощения для хлороформного извлечения 430±2 нм

- Максимум поглощения для этилацетатного извлечения 307±2 нм

Количественное определение: - сумма антраценпрою-водных в пересчете на алоэ-эмодин (метод СФ при 430 нм) - сумма фенольных соединений в пересчете на ачоэнин (метод СФ при 307 нм)

Не менее 0,020% Не менее 0,025% Не менее 3,3 мг %

Не менее 0,035% Не менее 4,6 мг %

Микробиологическая чистота ГФ XII категория 3.2

С целью контроля качества побегов и сока коллизии предложены методики обнаружения и количественного определения восстанавливающих Сахаров, белков и аминокислот. Определение восстанавливающих Сахаров основано на кислотном гидролизе углеводов до образования глюкозы с последующим ее взаимодействием с кислотой пикриновой в щелочной среде. Продукт реакции - пикра-миновая кислота имеет в спектре поглощения характерную полосу с максимумом 356±2 нм, минимумом 450±2 нм, что соответствует спектру поглощения продукта взаимодействия стандартного образца глюкозы. Методика количественного определения применительно к побегам и соку каллизии является специфичной, линейной, прецизионной, правильной. Содержание суммы восстанавливающих Сахаров в пересчете на глюкозу при аналитической длине волны 356±2 нм составляет 1,7719

1,87% в побегах каллизии, 12,99-13,59% в соке каллизииОпределение белков и аминокислот предложено проводить по реакции их взаимодействия с нингид-рином. Продукт реакции имеет в спектре поглощения характерную полосу с максимумом 566±2 нм, минимумом 488±2 нм, соответствующую спектру поглощения продукта взаимодействия стандартного образца глутаминовой кислоты. Применительно к побегам и соку каллизии методика количественного определения является специфичной, прецизионной, правильной, зависимость анализируемых показателей - линейной. Содержание суммы белков и аминокислот в пересчете на глутаминовую кислоту при аналитической длине волны 566±2 нм составляет 0,17%, в побегах каллизии, 1,24-1,28% в соке каллизии.

Показатели качества побегов и сока каллизии приведены в табл. 6.

Таблица 6 - Основные показатели и нормы качества побегов и сока каллизии душистой, предусмотренные в проектах ТУ

Показатели «Каллизии душистой побеги свежие» «Сок «Золотой ус»

РН 4,7-6,3

Потеря в массе при высушивании Не менее 85,0%

Сухих веществ Не менее 1,5%

Золы общей Не более 12,0%

Органических примесей Не допускается

Минеральных примесей Не более 0,4%

Изломанных листьев Не более 10,0%

Подлинность: - восстанавливающие сахара (метод СФ) - белки и аминокислоты (метод СФ)

Максимум поглощения в спектре продукта взаимодействия с кислотой пикриновой 356±2 нм

Максимум поглощения в спектре продукта взаимодействия с нингидрином 566±2 нм

Количественное определение: - восстанавливающие сахара в пересчете на глюкозу (метод СФ) - белки и аминокислоты в пересчете на глутаминовую кислоту (метод СФ)

Не менее 1,70% Не менее 1,85%

Не менее 0,12% Не менее 0,13%

Микробиологическая чистота ГФ XII категория 3.2

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Теоретически и экспериментально обоснована необходимость дальнейшего изучения и получения из листьев алоэ и побегов каллизии более современных, конкурентно способных препаратов, благодаря использованию более современных методов их стандартизации.

2. Выявлены морфолого-анатомические диагностически значимые признаки сырья исследуемых двух видов для подтверждения их подлинности; определены нормы качества листьев алоэ и побегов каллизии по числовым показателям.

3. Установлен состав БАВ листьев алоэ (в пересчете на сухое сырье): антрацен-производные (0,99%); флороглюциды (1,53%); кумарины (0,66%); аминокислоты (9,21%); фенолокислоты; каротиноиды; хлорофиллы; органические кислоты; углеводы. Впервые выделены и идентифицированы алоэнин, умбеллиферон, эскулетин, 2"-0-ферулоилалоэзин, 7-гидрокси-2,5-диметилхромон, 4-метокси-6-(2',4'-дигидрокси-6'-метилфенил)-пирон-2. Установлено высокое содержание алоэнина (1,29%), алоэ-эмодина (0,35%), алоина А (0,31%) и алоина В (0,33%). Выявлено накопление биогенных элементов (1л, В, Са, К, Р, 8е, Си).

4. Впервые установлен состав БАВ побегов каллизии (в пересчете на сухое сырье): углеводы (1,82%); аминокислоты (1,48%); органические кислоты (2,65%); флавоноиды (0,24%); кумарины (0,20%); антраценпроизводные (0,01%); каротиноиды (4,38 мг %); хлорофиллы (8,0 мг %). Выявлено наличие биогенных элементов (Са, К, Р, N3, М&, 51, Ре, Мл).

5. Установлено, что низкая температура хранения листьев алоэ способствует максимальному увеличению концентрации (в 1,2-2 раза) фенольных соединений, аминокислот, углеводов, органических кислот.

6. Оптимизирована технология сока алоэ путем использования листьев, подвергшихся охлаждению в течение 10 суток, и отделения сока от листьев после ферментации биомассы. Наряду с увеличением выхода сока (на 5,3%), достигнуто более выраженное антирадикалыюе (на 6,7%) и стимулирующее действие сока на рост дрожжевых клеток (на 17%).

7. Разработаны проекты ФСП «Алоэ древовидного листья свежие», «Алоэ сок», «Алоэ экстракт жидкий, раствор для подкожного введения», регламентирующие определение алоэнина и алоэ-эмодина. Разработаны проекты ТУ «Кал-лизии душистой побеги свежие», «Сок «Золотой ус», предусматривающие определение содержания восстанавливающих Сахаров, белков и аминокислот.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Оленников, Д.Н. Химический состав сока каллизии душистой (Callisia fragrans Wood.) и его антиоксидантная активность (in vitro) / Д.Н. Оленников, И.Н. Зилфикаров, A.A. Торопова, Т.А. Ибрагимов // Химия раст. сырья. - 2008. - № 4. - С. 95-100.

2. Оленников, Д.Н. Химический состав сока Callisia fragrans. 1. Фенольные соединения / Д.Н. Оленников, Т.А. Ибрагимов, И.Н. Зилфикаров, В.А. Челомбитько // Химия прир. соединений. - 2008. - № 6. - С. 627-628.

3. Ибрагимов, Т.А. Фармакогностическое исследование побегов каллизии душистой (микроскопия) / Т.А. Ибрагимов, Д.Н. Оленников, И.Н. Зилфикаров, U.M. Елисеева// Фармация. - 2008. 7. - С. 24-26.

4. Оленников, Д.Н. Совершенствование методов стандартизации препарата «Сок алоэ» / Д.Н. Оленников, И.Н. Зилфикаров, Т.А. Ибрагимов, В.А. Челомбитько // Фармация. - 2009. - № 1. - С. 16-18.

5. Оленников, Д.Н. Исследование химического состава алоэ древовидного (Aloe arborescens Mill.) / Д.Н. Оленников, И.Н. Зилфикаров, Т.А. Ибрагимов // Химия раст. сырья. - 2010. - № 3. - С. 77-82.

6. Оленников, Д.Н. Химический состав сока алоэ древовидного (Aloe arborescens Mill.) и его антиоксидантная активность (in vitro) / Д.Н. Оленников, И.Н. Зилфикаров, A.A. Торопова, Т.А. Ибрагимов // Химия раст. сырья. - 2010. - № 3. - С. 83-90.

7. Зилфикаров, И.Н. Анализ фенольных соединений сока алоэ древовидного методом ВЭЖХ / И.Н. Зилфикаров, Т.А. Ибрагимов, В.А. Челомбитько // I Рос. фитотерап. съезд: Сборн. науч. тр. (г. Москва, 14-16 марта 2008 г.). - М.: Изд-во Федерал, науч. клинико-эксперим. центра традиционных методов диагностики и лечения Росздрава, 2008. - С. 245-246.

8. Ибрагимов, Т.А. Анализ фенольных соединений сока каллизии душистой методом ВЭЖХ / Т.А. Ибрагимов, В.А. Челомбитько, И. Н. Зилфикаров, Д.Н. Оленников II Там же. - М., 2008. - С. 246-247.

9. Ибрагимов, Т.А. Фармакогностическое исследование побегов каллизии душистой (фитохимия) / Т.А. Ибрагимов, В.А. Челомбитько, И.Н. Зилфи-каров И Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / под ред. М.В. Гаврилина / Пятигорская ГФА. -Пятигорск, 2008. - Вып. 63. - С. 34-38.

Ю.Ибрагимов, Т.А. Влияние процесса биостимуляции на химический состав листьев алоэ древовидного / Т.А. Ибрагимов, В.А. Челомбитько, И.Н. Зилфикаров // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / под ред. М.В. Гаврилина. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2009. - Вып. 64. - С. 50-54.

П.Ибрагимов, Т.А. Морфолого-анатомическое исследование сырья алоэ древовидного / Т.А. Ибрагимов, И.Н. Зилфикаров, В.А. Челомбитько П Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики: сб. науч. тр. Всерос. науч.-практ. конф. 28-30 окт. 2010 г. - Владикавказ, 2010. - С. 3942.

12.Ибрагимов, Т.А. Сравнительное исследование аминокислотного состава сырья и препаратов алоэ древовидного / Т.А. Ибрагимов, В.А. Челомбитько, И.Н. Зилфикаров // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / под ред. М.В. Гаврилина. -Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2010. - Вып. 65. - С. 66-67.

13.3илфикаров, И.Н. Усовершенствование методов стандартизации препарата «Алоэ экстракт жидкий» / И.Н. Зилфикаров, Т.А. Ибрагимов, В.А. Челомбитько // Фундаментальные и прикладные проблемы получения новых материалов: исследования, инновации и технологии: междунар. конф. (4; 2010; Астрахань): материалы ... - Астрахань, 2010. - С. 47-49.

14.Ибрагимов, Т.А. Усовершенствование технологии нативного сока алоэ древовидного / Т.А. Ибрагимов, И.Н. Зилфикаров, Э.Ф. Степанова // П Рос. фитотерап. съезд: Сборник науч. трудов съезда, г. Москва, 22-23 октября 2010. Приложение к журналу «Традиционная медицина» № 3 (22) 2010. - М.: Изд-во профессиональной ассоциации натуротерапевтов, 2010.-С. 139-140.

15.Ибрагимов, Т.А. Исследования по разработке проекта фармакопейной статьи «Каллизии душистой побеги свежие» / Т.А. Ибрагимов, В.А. Челомбитько, И.Н. Зилфикаров // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / под ред. М.В. Гаврилина. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2011. - Вып. 66. - С. 100-102.

ИБРАГИМОВ ТИМУР АЛГАСАНОВИЧ

ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СТАНДАРТИЗАЦИИ СЫРЬЯ И ПРЕПАРАТОВ АЛОЭ ДРЕВОВИДНОГО И КАЛЛИЗИИ ДУШИСТОЙ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати «19» декабря 2011 г. Формат бумаги 60x84/16 Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Министерства здравоохранения и социального развития России» (357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)