Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Механизмы нарушения цитокинопосредованной кооперации эозинофилов и иммунокомпетентных клеток при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови

На правах рукописи

□ОЗОБгТОЗ Колобовникова Юлия Владимировна

МЕХАНИЗМЫ НАРУШЕНИЯ ЦИТОКИНОПОСРЕДОВАННОЙ КООПЕРАЦИИ ЭОЗИНОФИЛОВ И ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК ПРИ ЛИМФОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ СИСТЕМЫ КРОВИ

14.00.16 - патологическая физиология 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации иа соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск-2007

003052703

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, академик РАМН, профессор, Заслуженный деятель науки РФ,

Рязанцева

Наталья Владимировна

Новицкий

Вячеслав Викторович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Агафонов

Владимир Иванович

доктор медицинских наук, профессор Логвинов

Сергей Валентинович

Ведущая организация: Российский НИИ гематологии и трансфузиологии, Санкт-Петербург

Защита состоится «_» _2007 г. в _часов на заседании

диссертационного совета Д 208.096.01 при Сибирском государственном медицинском университете (643050, г. Томск, ул. Московский тракт, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета (643050, г. Томск, пр. Ленина, 107)

Автореферат разослан «_»_2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Суханова Г.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы внимание исследователей привлечено к синдрому эозинофилии преимущественно с позиции изучения патогенеза аллергических заболеваний и паразитарных инвазий [Фассахов P.C. и соавт., 1992; Логинов А.С.и соавт., 1998; Джальчинова В. Б., Чистяков Г. М., 1999; Озерецковская H.H., 2000; Hamelmann Е., Gelfand E.W., 2001; Коровина H.A. и соавт., 2002; Семенкова E.H. и соавт., 2004; Das A.M. et al., 2005]. Однако с явлением гиперэозинофилии ассоциирован целый ряд опухолевых заболеваний, среди которых особое внимание привлекают миело- и лимфопролиферативные заболевания системы крови [Гриншпун Г.Д., Виноградова Ю.Е., 1983; Merz Н. et al., 1991; Хорошко Н.Д. и соавт., 1998; Воробьев А.И., 2003; Чучалин А.Г., 2003; Комарова JI.C. и соавт., 2004; Caruso R.A. et al., 2004; Ольшанская Ю.В. и соавт., 2005; Абдулкадыров K.M., 2006]. В настоящее время актуальной остается проблема интерпретации причин возникновения и последствий синдрома гиперэозинофилии у больных с гемобластозами.

Исследованиями последних лет показано, что эозинофил является одной из наиболее агрессивных эффекторных клеток воспаления [Анаев Э.Х. и соавт., 1994; Беклемишев И.Д., 1998]. Эозинофильные гранулоциты служат источником большого количества цитотоксических продуктов, повышенное содержание которых обусловливает формирование высокого микробицидного потенциала, направленного не только в отношении инородных субстанций, но и окружающих тканей, что способствует возникновению различных осложнений длительной гиперэозинофилии (эозинофильные васкулиты, эндокардиты, гастроэнтериты и др.) [Джальчинова В.Б., Чистяков Г.М., 1999; Воробьев А.И. и соавт., 2000; Dvorak A.M., Weller P.F., 2000; Волкова М.А., 2001; Чучалин А.Г., 2003; Ешану B.C., 2004]. Однако в свете современных данных эозинофильные гранулоциты рассматривают не только в качестве клеток-эффекторов, но и как важный фактор поддержания тканевого и иммунологического гомеостаза [Минеев В.Н. и соавт., 2000; Воробьев А.И., 2002; Бережная Н.М. и соавт., 2005]. Эозинофилы обладают способностью экспрессировать на своей поверхности разнообразные рецепторы и продуцировать широкий спектр биологически активных веществ. Лейкоциты эозинофильного ряда за счет секреции иммунорегуляторных цитокинов -интерлейкина (1ЦИ, IL-6, IL-2, IL-10 - участвуют в регуляции функций иммунокомпетентных клеток [Джальчинова В.Б., Чистяков Г.М., 1999; Волкова М.А., 2001; Ешану B.C., 2004].

Учитывая новые аспекты физиологического значения эозинофилов, особый интерес представляют данные об их способности взаимодействовать с иммунокомпетентными клетками макроорганизма. Важнейшую роль в становлении и стабилизации контактов между клетками играет цитокин-рецепторная сеть. Именно посредством цитокинов, синтезируемых и секретируемых клеткой, осуществляются лиганд-рецепторные взаимодействия за счет связывания растворимых веществ с аффинным рецептором на

клеточной поверхности [Кашкин К.Е., 1998; Ярилин А.А., 1999, 2001; Кетлинский С.А., 2002; Симбирцев А.С., 2002, 2004]. Так, иммунокомпетентные клетки, продуцирующие IL-3, IL-4, IL-5 и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) регулируют процессы пролиферации, дифференцировки и активации лейкоцитов эозинофильного ряда [Gulbenkian A.R. et al., 1992; Беклемишев И.Д., 1998; Минеев В.Н. и соавт., 2000; Намазова JI.C. и соавт., 2000; Nagase Н. et al., 2001; Воробьев А.И., 2002; Lampinen М. et al., 2004; Бережная Н.М. и соавт., 2005]. Существующая между клетками иммунной системы и эозинофилами взаимонаправленность эффектов обусловлена как иммуномодулирующим действием иммунокомпетентных клеток, так и способностью лейкоцитов эозинофильного ряда активировать иммуноциты и вызывать поляризацию иммунного ответа в ту или иную сторону за счет секреции иммунорегуляторных молекул. Дизрегуляция данных эффектов может обусловливать сдвиг процессов созревания, дифференцировки и активации эозинофилов, что приводит к их длительному пребыванию в периферической крови.

Цель исследования: установить роль нарушений цитокинопосредованной кооперации эозинофилов и мононуклеарных лейкоцитов в механизмах формирования синдрома эозинофилии при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Оценить морфо-функциональные свойства эозинофильных гранулоцитов периферической крови у пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями системы крови (лимфогранулематоз, множественная миелома и неходжкинские лимфомы), ассоциированными с синдромом эозинофилии.

2. Определить уровень эотаксина в сыворотке крови и установить особенности продукции мононуклеарными лейкоцитами периферической крови цитокинов (IL-3, IL-4, IL-5 и GM-CSF), регулирующих процессы пролиферации, дифференцировки и активации эозинофильных клеток, при гемобластозах, сопровождающихся синдромом эозинофилии.

3. Оценить состояние цитокин-рецепторного аппарата эозинофильных гранулоцитов (рецепторов к IL-3, IL-5 и эотаксину) у больных лимфопролиферативными заболеваниями системы крови, сопровождающимися выраженной эозинофилией.

4. Исследовать функциональный потенциал эозинофильных гранулоцитов в отношении экспрессии рецепторов к эозинофилстимулирующим цитокинам при инкубации клеток, полученных у пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями системы крови, сопровождающимися синдромом эозинофилии, с рекомбинантными формами IL-3, IL-5 и эотаксина in vitro.

Научная новизна. Впервые с привлечением культуральных, иммунологических и молекулярно-биологических методов исследования проведена комплексная оценка цитокинопосредованной кооперации эозинофилов и мононуклеарных лейкоцитов периферической крови при

гемобластозах, сопровождающихся эозинофилией. Установлено, что механизмы формирования синдрома эозинофилии, осложняющего течение лимфопролиферативных заболеваний системы крови, сопряжены с нарушением кооперативного взаимодействия эозинофильных гранулоцитов и мононуклеарных клеток, что выражается в увеличении продукции мононуклеарами IL-3, IL-5 и GM-CSF и повышении уровня эотаксина в сыворотке крови при возрастании экспрессии эозинофилами IL-3R, IL-5R и CCR3 в условиях дефицита Т-клеточного звена иммунной системы и сниженной секреции IL-4 мононуклеарными лейкоцитами периферической крови. Получены новые данные, касающиеся снижения резервной способности эозинофильных гранулоцитов презентировать рецепторы к IL-3 и IL-5 при инкубации in vitro клеток с рекомбинантными формами одноименных цитокинов. У пациентов с лимфогранулематозом, множественной миеломой и неходжкинскими лимфомами, сопровождающихся синдромом эозинофилии, впервые выявлены однотипные изменения морфо-функционального статуса эозинофильных гранулоцитов (увеличение содержания внутриклеточных катионных протеинов и пероксидазы, усиление фагоцитарной активности, наличие клеток с признаками дегрануляции и цитолиза). Установлено, что при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови, ассоциированных с выраженной эозинофилией, интенсификация кислороднезависимых и кислородзависимых процессов микробицидности опосредует формирование высокого цитотоксического потенциала эозинофильных гранулоцитов, что может обусловливать негативное влияние длительной гиперэозинофилии крови при гемобластозах.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные фундаментального характера о нарушении цитокинопосредованной кооперации эозинофилов и мононуклеарных лейкоцитов периферической крови при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови раскрывают новые патофизиологические аспекты формирования синдрома эозинофилии. Результаты исследования могут быть положены в основу разработки патогенетически обоснованных молекулярных технологий коррекции дизрегуляции кооперативного взаимодействия эозинофилов и иммунокомпетентных клеток при гемобластозах, ассоциированных с выраженной эозинофилией, с целью лечения и профилактики осложнений длительной гиперэозинофилии крови.

Положения, выносимые на защиту:

1. Механизмы формирования синдрома эозинофилии при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови сопряжены с нарушением цитокинопосредованной кооперации эозинофилов и мононуклеарных лейкоцитов.

2. Механизмы нарушения кооперации эозинофилов и мононуклеарных клеток при синдроме эозинофилии, осложняющем течение лимфопролиферативных заболеваний системы крови, опосредованы повышением продукции цитокинов, являющихся ключевыми в регуляции гомеостаза эозинофильных клеток (IL-3, IL-5, GM-CSF и эотаксина), при дисбалансе экспрессии эозинофилами

комплементарных им рецепторов (IL-3R, IL-5R и CCR3) в условиях дефицита Т-клеточного звена иммунной системы и сниженной секреции IL-4 мононуклеарными лейкоцитами.

3. При лимфопролиферативных заболеваниях системы крови (лимфогранулематоз, множественная миелома и неходжинские лимфомы), ассоциированных с синдромом эозинофилии, эозинофильные гранулоциты претерпевают выраженные однотипные нарушения морфологических и цитотоксических свойств клеток.

Апробация и реализация работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на Международном конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (Москва, 2005), I Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (Сочи, 2005), 5-й научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2006), VIII Конгрессе «Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении» (Москва, 2006), XII Межгородской научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2006), Российском медицинском форуме-2006 «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006), Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной памяти профессора H.H. Кеворкова «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (Пермь, 2006).

В работе приводятся результаты исследований, поддержанных Советом при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ РФ, «Молекулярные основы нарушения гомеостаза клеток крови при актуальных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы» (НШ-4153.2006.7), а также результаты научно-исследовательской работы «Роль нарушений межклеточной кооперации в механизмах формирования больших эозинофилий крови» (Государственный контракт №02.442.11.7056 от 26 октября 2005 г.), выполненной в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006 годы».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, из которых 5 -в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 9 рисунками и 13 таблицами. Библиографический указатель включает 251 источник (105 -отечественных и 146 - иностранных).

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящей работе представлены результаты комплексного обследования 130 больных (59 мужчин и 71 женщины в возрасте от 18 до 60 лет) со злокачественными заболеваниями системы крови (табл. 1): из них 97 пациентов с первичным обращением в стационар по поводу лимфопролиферативного заболевания системы крови и 33 пациента, находящихся на диспансерном учете и получавших от 2 до 6 курсов полихимиотерапии (не менее чем 1-3 года назад).

Все пациенты были обследованы до назначения терапии при поступлении в отделение гематологии Томской областной клинической больницы (главный врач - Заслуженный врач РФ Б.Т. Серых). Набор клинического материала осуществлялся при участии заведующей отделением гематологии В.Ю. Гранкиной и врача-гематолога E.H. Кнутаревой.

Все больные со злокачественными заболеваниями системы крови, ассоциированными с синдромом эозинофилии, были разделены на три группы. Первую группу составили 25 пациентов с лимфогранулематозом (по МКБ-10 рубрика С81): из них 9 - со смешанно-клеточным вариантом заболевания (С81.2), 10 - с нодулярным склерозом (С81.1), 6 - с лимфоидным преобладанием (С81.0). Среди больных лимфогранулематозом, согласно классификации, принятой в 1971 г. в Ann Arbor, выделяли пациентов со II Бб стадией процесса (2 человека), III Аб стадией (10 пациентов) и III Бб стадией (13 больных). Верификация диагноза проводилась на основании данных морфологического и иммунофенотипического исследований гистологических препаратов (наличие в опухолевом очаге типичных многоядерных клеток Березовского-Штернберга с фенотипом CD15, CD30).

Во вторую группу обследованных были включены 30 пациентов с множественной миеломой (рубрика С90.0 МКБ-10): их них 28 человек - с диффузно-очаговой формой миеломных инфильтратов, 2-е диффузной формой миеломных инфильтратов. Диагноз миеломной болезни устанавливался на основании обнаружения плазмоклеточной инфильтрации костного мозга (число плазмоцитов более 10%) и моноклональной Ig-патии (сывороточный М-компонент или белок Бенс-Джонса в моче), подтвержденных методами иммунохимического анализа сывороточных и мочевых иммуноглобулинов с привлечением метода иммунофиксации.

Третью группу обследованных составили 38 больных неходжкинскими лимфомами (рубрики С82 и С83 по МКБ-10): 20 человек с лимфомой из периферических (зрелых) клеток (12 - со зрелоклеточной лимфомой, 2-е пролимфоцитарной, 2-е лимфоцитарной, 4-е В-мелкоклеточной), 4 - с В-крупноклеточной, 14 — с фолликулярной. При этом у 16 пациентов с неходжкинскими лимфомами отмечали III Аб стадию процесса, у 22 - III Бб стадию. При диагностике неходжкинских лимфом обязательной являлась гистологическая оценка субстрата опухоли, дополненная иммунологическим и цитогенетическим методами исследования.

Таблица 1

Распределение здоровых доноров и пациентов со злокачественными заболеваниями системы крови в соответствии с использованными методами исследования

Методы исследования Группы обследованных

Здоровые доноры Пациенты с лимфогранулематозом Пациенты с множественной миеломой Пациенты с неходжкинскими лимфомами

Определение показателей лейкоцитарного звена периферической крови (общее количество лейкоцитов, абсолютное и относительное содержание эозинофилов и лимфоцитов) 22 38 41 51

Определение содержания внутриклеточных катионных протеинов и пероксидазы в эозинофильных гранулоцитах цитохимическим методом 19 23 27 35

Определение фагоцитарной активности эозинофилов периферической крови в НСТ-тесте 17 19 22 25

Морфологическое исследование эозинофильных гранулоцитов в условиях инкубации с антигеном O.felineus 18 19 21 26

Оценка количества эозинофилов, презентирующих рецепторы к IL-3, IL-5 и эотаксину, методом проточной цитофлуориметрии 15 14 15 17

Определение количества лимфоцитов крови, презентирующих CD3+, CD4+, CD8+ и С022+-маркёры иммуноцитохимическим методом 16 32 30 34

Исследование содержания IL-3, IL-4, IL-5 и GM-CSF в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов и уровня эотаксина в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа 18 33 31 35

Группу сравнения составили 37 пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями системы крови (из них: 13 больных лимфогранулематозом, 11 -множественной миеломой, 13 - неходжкинскими лимфомами) без синдрома эозинофилии с сопоставимыми характеристиками по полу и возрасту.

В контрольную группу были включены 22 здоровых донора с аналогичными характеристиками по полу и возрасту, не предъявлявшие на момент обследования жалоб соматического профиля.

Материалом исследования являлась венозная кровь обследованных лиц, взятая утром до приема пищи (кровь стабилизировали гепарином - 25 Ед/мл).

Определение общего количества лейкоцитов периферической крови и подсчет их отдельных морфологических форм проводили стандартными гематологическими методами [Меньшиков В.В., 1987].

Оценку содержания CD3+-, CD4+-, CD8+- и СБ22+-несущих лимфоцитов осуществляли иммуноцитохимическим методом с помощью набора реагентов фирмы «Dako» (Дания). При микроскопии идентифицировали окрашенный продукт иммуноферментной реакции, образовавшийся в местах связывания выявляемых антигенов. Положительно окрашенными считались лимфоциты, по окружности которых продукт реакции занимал не менее трети. Проводили подсчет 200 клеток, определяли процент положительно окрашенных клеток [Тотолян А.А. и соавт., 2002].

Мононуклеары выделяли в стерильных условиях из цельной венозной крови методом градиентного центрифугирования с использованием Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция) (р=1,077 г/см3). Выделенные клетки культивировали в течение 18 ч при температуре 37° и 5% С02 в полной культуральной среде (90% RPMI-1640 («Вектор-Бест», Новосибирск), 10% инактивированная эмбриональная телячья сыворотка («Биолот», Санкт-Петербург), 0,3 мг/мл L-глутамина) без митогена или с добавлением 10 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА) («Difco», Германия) для активации лимфоцитов [Хаитов P.M. и соавт., 1995]. Затем проводили оценку содержания цитокинов (IL-3, IL-4, IL-5 и GM-CSF) в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов и эотаксина в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа согласно инструкциям, предлагаемым производителями тест-систем («Ргосоп», Россия; «Biosource», Бельгия). Учет результатов иммуноферментного анализа производили с применением фотометра для микропланшетов «Multiscan ЕХ» («ThermoLabSystems», Финляндия) при длине волны 450 нм.

Выделение эозинофильных гранулоцитов проводили с использованием пятиступенчатого градиента Percoll («Amersham Biosciences АВ», Швеция) (1,070, 1,081, 1,090, 1,095 и 1,105) [Gartner I., 1980]. Выделенные клетки культивировали в течение 18 ч при температуре 37°С и 5% С02 в 96-луночных иммунологических планшетах в полной культуральной среде (90% RPMI-1640, 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 0,3 мг/мл L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина и 2мМ/мл HEPES («Flow», GB)). Затем проводили оценку морфо-функционального статуса эозинофильных гранулоцитов с использованием цитохимических методов исследования. Оценивали содержание пероксидазы в эозинофильных гранулоцитах методом Грэхема-Кнолля [Хейхоу Ф.Г.Дж., Кваглино Д., 1983; Меньшиков В.В., 1987]. Содержание неферментных катионных протеинов в эозинофилах периферической крови определяли цитохимическим методом М.Г. Шубича [Меньшиков В.В., 1987]. Морфологическое исследование эозинофильных гранулоцитов проводили в условиях их инкубации с антигеном O.felineus по методу Е.С. Нишевой и соавт. [1995]. Фагоцитарную активность эозинофилов периферической крови оценивали методом J.S. Steward et al. в модификации Б.С. Нагоева [Меньшиков В.В., 1987].

В рамках диссертационной работы проводили оценку состояния рецепторного аппарата эозинофилов, полученных у пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями системы крови, сопровождающимися синдромом эозинофилии, а также у здоровых доноров, in vitro без стимуляции и

в условиях инкубации эозинофильных клеток с рекомбинантными формами цитокинов. Для этого выделенные эозинофилы периферической крови культивировали в отсутствии стимуляции или с добавлением рекомбинантного (г) 1L-3 («Biosource», Бельгия), r-IL-5 («Biosource», Бельгия) или г-эотаксина («Biosource», Бельгия) в концентрации 10~8 г/мл. Клетки инкубировали в течение 18 ч при температуре 37° и 5% СОг- Оценку презентации мембраносвязанных форм рецепторов к IL-3, IL-5 и эотаксину на эозинофилах крови проводили методом проточной лазерной двухцветной цитометрии с использованием моноклональных антител к цитокиновым рецепторам, меченных флюоресцентными метками. Регистрацию презентации цитокиновых рецепторов на эозинофилах проводили согласно протоколу фирмы производителя («R&D Systems», США). Анализ образцов клеточных суспензий проводили на проточном цитометре Epics XL («Beckman Coulter», Франция) с применением автоматического программного обеспечения и методов сбора и анализа данных с высоким разрешением (1024 канала).

Статистический анализ результатов исследования проводили с использованием стандартного пакета программ Statistica 6.0. Проверку нормальности распределения количественных показателей осуществляли с применением критерия Shapiro-Wilk's. При соответствии нормальному закону распределения признака в исследуемых выборках гипотезы о равенстве средних выборочных величин проверяли с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Для оценки достоверности различий выборок, не подчиняющихся критерию нормального распределения, использовали критерий Kruskal-Wallis. С целью попарного сравнения показателей в исследуемых группах применяли критерий Манна Уитнни для независимых групп. Различие двух сравниваемых величин считали достоверным при уровне значимости р<0,05. Для выявления функциональных взаимосвязей между группами изученных параметров применяли корреляционный анализ путем вычисления г-коэффициента Спирмена [Боровиков В., 2001].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На сегодняшний день эозинофильный гранулоцит занимает одно из центральных мест при изучении патогенеза аллергических заболеваний и паразитарных инвазий: при аллергической патологии эозинофилы рассматриваются как основные компоненты ее развития, а при гельминтозах -как бесспорные факторы защиты. В то же время представления о роли эозинофилов и эозинофилии при формировании опухолевого процесса существенно ограничены.

Известно, что с явлением гиперэозинофилии ассоциирован целый ряд опухолевых заболеваний системы крови [Merz Н. et al., 1991; Трапезников H.H. и соавт., 1996; Хорошко Н.Д. и соавт., 1998; Морозова В.Т. и соавт., 2000; Волкова М.А., 2001; Чучалин А.Г., 2003; Семенкова E.H. и соавт., 2004; Абдулкадыров K.M., 2006]. Так, синдром эозинофилии является одним из проявлений опухоли миелоидной ткани и встречается при острых миело- и

миеломонобластном лейкозах, миелодиспластическом синдроме и других миелопролиферативных заболеваниях [Абдулкадыров K.M. и соавт., 2002]. Вместе с тем, выраженная эозинофилия и инфильтрация эозинофилами лимфатических узлов может наблюдаться при Т- и B-клеточных хронических лимфопролиферативных заболеваниях [Tavani А. et al., 2000; Мокеева P.A. и соавт., 2001; Ольшанская Ю.В. и соавт., 2005]. У обследованных нами пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями системы крови был выявлен синдром эозинофилии, который характеризовался высокими значениями количества эозинофилов в крови (у пациентов с лимфогранулематозом - 25,79±4,29% (р=0,003), множественной миеломой -16,86±2,63% (р=0,014), неходжкинскими лимфомами - 15,18±2,66% (р=0,042) при норме 2,18±0,06%). На сегодняшний день актуальной остается проблема интерпретации причин возникновения и последствий гиперэозинофилии у больных с неопластическими заболеваниями системы крови.

Общеизвестно, что эозинофил является одной из наиболее агрессивных эффекторных клеток воспаления [Джальчинова В.Б., Чистяков Г.М.,1999; Минеев В.Н. и соавт., 2000]. Наряду с этим, в современной литературе эозинофильные гранулоциты принято рассматривать в качестве регуляторов тканевого и иммунологического гомеостаза. Благодаря способности секретировать широкий спектр биологически активных веществ и экспрессировать на своей поверхности разнообразные рецепторные структуры, лейкоциты эозинофильного ряда принимают участие в регуляции функций иммунокомпетентных клеток, в процессах клеточной репарации, свертывания крови и др. [Джальчинова В.Б., Чистяков Г.М.,1999; Минеев В.Н. и соавт., 2000; Воробьев А.И., 2003; Бережная Н.М. и соавт., 2005].

Принимая во внимание новые аспекты физиологического значения эозинофилов, особый интерес, на наш взгляд, представляют данные об их способности взаимодействовать с иммунокомпетентными клетками макроорганизма.

Несмотря на значительные достижения в онкоиммунологии, представления о роли эозинофилов и эозинофилии в опухолевом процессе в настоящее время существенно ограничены. По данным литературы, эозинофилия, обнаруживаемая в крови и в области локализации опухоли у онкологических больных, в одних случаях может быть ассоциирована с благоприятным прогнозом, а в других - может явиться негативным признаком [Зеленова О.В., 2002; Бережная Н.М., 2005]. Противоопухолевую активность эозинофилов связывают с их способностью к фагоцитозу и цитотоксическому действию [Goldman М. et al., 2001].

Известно, что цитотоксический потенциал эозинофильных гранулоцитов осуществляется за счет кислороднезависимых и кислородзависимых механизмов микробицидности [Воробьев А.И., 2002]. К числу кислороднезависимых факторов цитотоксичности относится группа белков, важнейшим среди которых является большой основной протеин, реализующий свое цитотоксическое действие в комплексе с другими белками -эозинофильным катионным протеином и пероксидазой [Rothenberg M.D., 1987;

Джальчинова В.Б., Чистяков Г.М., 1999; Dvorak A.M., Weller P.F., 2000; Волкова M.A., 2001; Ешану B.C., 2004].

В ходе проведенного нами цитохимического исследования у пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями системы крови, сопровождающимися синдромом эозинофилии, было отмечено повышение содержания лизосомальных катионных белков и пероксидазы в эозинофильных гранулоцитах (у пациентов с лимфогранулематозом значения средних цитохимических коэффициентов (СЦК) содержания внутриклеточных катионных белков и пероксидазы оказались равными 2,93+0,02 усл. ед. (р=0,011) и 2,95±0,03 усл. ед. (р=0,043), соответственно, множественной миеломой - 2,95±0,06 усл. ед. (р=0,003) и 2,79±0,07 усл. ед. (р=0,039), соответственно, неходжкинскими лимфомами - 2,42±0,08 усл. ед. (р=0,041) и 2,69+0,07 усл. ед. (р=0,048), соответственно, при норме 2,17±0,07 усл. ед. и 2,53±0,07 усл. ед., соответственно). Увеличение содержания внутриклеточных катионных протеинов и пероксидазы в эозинофилах периферической крови у обследованных нами пациентов свидетельствует об усилении функциональной активности изученных клеток.

Согласно современным представлениям, эозинофильные гранулоциты относятся к группе полиморфноядерных лейкоцитов, обладающих способностью к фагоцитозу. Последний сопровождается образованием активных форм кислорода, крайне токсичных для многих микроорганизмов; вместе с тем они обладают выраженным повреждающим действием в отношении многих клеток организма [Маянский Д.Н., Урсов И.Г., 1997; Воробьев А.И., 2003]. Исследование фагоцитарной активности эозинофилов периферической крови у пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями, ассоциированными с выраженной эозинофилией, позволило констатировать факт увеличения количества диформазан-позитивных клеток в спонтанном НСТ-тесте по сравнению с аналогичными параметрами у здоровых доноров (у пациентов с лимфогранулематозом - 0,30±0,01 Г/л, р=0,001, множественной миеломой - 0,15±0,03 Г/л, р=0,039, неходжкинскими лимфомами - 0,12±0,02 Г/л, р=0,044, при норме 0,01 ±0,01 Г/л). При этом у обследованных нами пациентов показатели НСТ-теста, стимулированного пирогеналом, существенно не отличались от соответствующих базальных величин, что может свидетельствовать об угнетении потенциального резерва цитотоксичности лейкоцитов эозинофильного ряда в условиях их пролонгированной стимуляции.

В целом интенсификация кислородзависимых процессов киллинга в эозинофилах периферической крови, по-видимому, обусловлено их повышенной функциональной реактогенностью, в условиях которой эозинофилы могут реализовывать свой биоцидный потенциал при контакте с различными чужеродными белками, в том числе и с опухолевыми клетками.

Не вызывает сомнения тот факт, что адекватное функционирование клеток макроорганизма во многом определяется полноценностью их структур. В результате исследования морфологических особенностей эозинофильных лейкоцитов у больных гемобластозами, ассоциированными с синдромом

эозинофилии, в отсутствии антигенной стимуляции нами было зарегистрировано увеличение содержания эозинофилов с признаками повреждения ядра и цитоплазмы по сравнению с аналогичными показателями нормы (у пациентов с лимфогранулематозом - 8,70±1,02%, р=0,025, множественной миеломой - 6,89+0,83%, р=0,031, при норме 2,54±0,05%). В условиях инкубации с антигеном О^еНпеиБ количество морфологически измененных лейкоцитов эозинофильного ряда также статистически значимо превышало средние значения этих параметров в контрольной группе (у пациентов с лимфогранулематозом - 24,50±1,19%, р=0,023, множественной миеломой - 18,92±1,22%, р=0,029, неходжкинскими лимфомами - 19,50+0,18%, р=0,033, при норме 5,02±0,07%). Выявленные изменения морфологии эозинофильных гранулоцитов носили преимущественно характер дегрануляции и цитолиза (разбухшие клетки в 2 и более раз превышали размеры нейтрофилов, их оболочка была разорвана, отмечалось внеклеточное накопление эозинофильных гранул, в некоторых препаратах обнаруживался распад ядра на хроматиновые нити). Была зарегистрирована повышенная вакуолизация ядра и цитоплазмы эозинофильных гранулоцитов. Следует отметить, что повышение дегрануляции эозинофилов, выявленное нами при вышеуказанных нозологиях, с одной стороны, может являться следствием их гиперактивации, а, с другой, - быть фактором, потенцирующим цитотоксичность эозинофильных гранулоцитов.

Резюмируя вышеизложенное, следует подчеркнуть, что усиление кислороднезависимых и кислородзависимых механизмов киллинга эозинофилов, обнаруженное нами при злокачественных заболеваниях системы крови, ассоциированных с синдромом эозинофилии, обусловливает формирование высокого цитотоксического потенциала эозинофильных клеток, действие которого может реализоваться не только в отношении антигенных структур, но и клеток макроорганизма. Последнее обстоятельство, вероятно, обусловливает негативное влияние длительной эозинофилии крови на организм и может осложнять течение основного заболевания.

Согласно современным представлениям, механизмы формирования высокой эозинофилии при опухолевом процессе могут быть обусловлены продукцией хемотаксических факторов клетками некоторых опухолей [1ипск Р. е1 а!., 1999; Бережная Н.М., 2000; Воробьев А.И., 2000; АЬгаЬа1шеп АЛ7., 2000; Зеленова О.В. и соавт., 2002]. В то же время эозинофильная реакция может рассматриваться как своеобразный «иммунный ответ» на антигенную стимуляцию опухолевой тканью. Наконец, длительная эозинофилия и появление в кровотоке эозинофильных лейкоцитов с увеличенным сроком рециркуляции при опухолевых заболеваниях могут быть обусловлены подавлением или дефектами системы апоптотической гибели эозинофилов [Бережная Н.М. и соавт., 2005].

Принимая во внимание тот факт, что нарушение кооперативного взаимодействия иммунокомпетентных клеток и эозинофилов может обусловливать дизрегуляцию процессов пролиферации, дифференцировки и

активации эозинофильных гранулоцитов, мы провели исследование механизмов цитокинопосредованной кооперации эозинофилов и мононуклеарных лейкоцитов в реализации феномена эозинофилии при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови.

Известно, что иммунная система, обладая уникальными свойствами саморегуляции и самоуправления, осуществляет тесную интеграцию между основными системами макроорганизма и обеспечивает стабильность гомеостаза путем специфического распознавания и обезвреживания чужеродного материала [Ярилин А. А., 1997]. Доминирующее качество интегральной гомеостатической системы — избирательное вовлечение в иммунный ответ лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы и несущих определенную антигенную детерминанту [Кетлинский С.А., 2002; Симбирцев А.С., 2004].

Проведенный нами анализ показателей, характеризующих субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови у пациентов со злокачественными заболеваниями системы крови, сопровождающимися длительной эозинофилией крови, и у больных гемобластозами без синдрома эозинофилии позволил констатировать факт изменения параметров, характеризующих способность лимфоцитарных клеток экспрессировать маркеры клеточной дифференцировки. Так, у больных гемобластозами вне зависимости от нозологии и наличия эозинофилии периферической крови, отмечалось значительное уменьшение содержания CD3+-, CD4+- и С08+-клеток, а также снижение иммунорегуляторного индекса (CD4+/CD8+) по сравнению с соответствующими величинами у лиц контрольной группы. Выявленный нами Т-клеточный дефицит при лимфопролиферативных заболеваниях, с одной стороны, по-видимому, обусловлен способностью опухолевых клеток индуцировать иммуносупрессию, а, с другой, - может быть следствием усиления миграционных процессов клеток в опухолевую ткань, поскольку известно, что неопластически трансформированные клеточные элементы являются мишенями иммунной атаки со стороны нормальных Т-лимфоцитов, составляющих основу клеточной популяции пораженных лимфатических узлов [Зеленова О.В. и соавт., 2002; Воробьев А.И., 2003; Олейник Е.К. и соавт., 2006; Хват Н.С. и соавт., 2006; Чубукина Ж.В. и соавт., 2006]. Полученные нами данные подтверждаются результатами других исследователей, согласно которым, лимфопролиферативные заболевания системы крови характеризуются угнетением Т-клеточного звена иммунитета [Serrano D. et al. 1997; Ayoub J.P. et al., 1999; Воробьев А.И. и соавт., 2000; Лорие Ю.Ю., 2000; Смирнова О.В. и соавт., 2006].

Очевидно, что адекватное функционирование иммунной системы обусловлено взаимодействием широкого спектра клеток — макрофагов, Т- и В-лимфоцитов, фибробластов, нейтрофилов, эозинофилов и др. [Хаитов P.M. и соавт. 2000; Фрейдлин И.С., 2001]. Ключевую роль в установлении и стабилизации контактов между взаимодействующими клеточными элементами, в частности клетками крови, играет цитокин-рецепторная сеть [Беклемишев

И.Д., 1998; Кашкин К.Е., 1998; Ярилин А.А., 1999, 2001; Кетлинский С.А., 2002; Симбирцев А.С., 2002,2004].

Известно, что сбалансированность цитокиновой регуляции основывается на равновесии альтернативных по биологической активности пулов молекул, нарушение которого ведет к развитию патологии [Pritchard D.I. et al., 1993; Кетлинский C.A., 2002]. Согласно современным представлениям, поляризация иммунного ответа преимущественно в сторону Th-2 пути может обусловливать формирование синдрома эозинофилии при различных злокачественных новообразованиях, в частности при гемобластозах [Newcom S.R. et al., 1992; Медуницын Н.В., 1993; Бережная Н.М., 2000; Бережная Н.М. и соавт., 2005]. Данное обстоятельство связано со способностью многих цитокинов (IL-5, IL-4, IL-3 и GM-CSF), продуцируемых Th-2-лимфоцитами, участвовать в регуляции процессов пролиферации, дифференцировки и активации эозинофильных гранулоцитов [Gulbenkian A.R. et al., 1992; Беклемишев И.Д., 1998; Минеев В.Н. и соавт., 2000; Намазова JI.C. и соавт., 2000; Nagase Н. et al.! 2001; Воробьев А.И., 2002; Бережная Н.М. и соавт., 2005].

Ключевым медиатором, регулирующим функциональную активность эозинофилов, является IL-5, который избирательно стимулирует образование лейкоцитов эозинофильного ряда из их коммитированного предшественника (КОЕ-Эо). IL-5, а также IL-3 и GM-CSF активируют дегрануляцию эозинофильных гранулоцитов, что сопровождается высвобождением цитотоксичных протеинов, регулируют экспрессию интегриновых молекул (CDllb, CD18) и посредством ингибирования апоптотической гибели лейкоцитов эозинофильного ряда, пролонгируют время их пребывания в кровотоке [Yamaguchi Y. et al., 1991; Беклемишев И.Д., 1998; Бережная Н.М., 2000; Хаитов P.M., 2000; Nagase Н. et al., 2001; Воробьев А.И., 2002; Barnes P.J., 2003; Бережная Н.М. и соавт., 2005] (рис. 1).

Активация процессов пролиферации и дифференцировки клеток-предшественниц эозинофилов и функциональной активности зрелых эозинофильных клеток

Активация процессов дегрануляции эозинофилов с высвобождением биологически активных веществ

Активация механизмов цитотоксичности

эозинофилов

Ингибирование апоптотической гибели

эозинофилов

— Активация хемотаксиса эозинофилов

Рис. 1. Ключевые цитокины, модулирующие функциональную активность эозинофильных гранулоцитов [по данным И.Д. Беклемишева, 1998; A.A. Тотоляна, 2001; А.И. Воробьева, 2002]

Как показали проведенные нами исследования, у больных гемобластозами, ассоциированными с синдромом эозинофилии, отмечалось значимое увеличение уровней конституциональной продукции 1Ь-5, 1Ь-3 и СМ-СЭР мононуклеарными клетками периферической крови по сравнению с аналогичными значениями у здоровых доноров и пациентов со злокачественными заболеваниями системы крови без синдрома эозинофилии. В то же время значения индекса стимуляции продукции вышеуказанных цитокинов у больных гемобластозами, ассоциированными с высокой степенью эозинофилии, снижались более чем в 2 раза по сравнению с его уровнем у здоровых доноров, не отличаясь от показателей у пациентов без эозинофилии (рис. 2).

А

к

Ь

В

Сиощшпин ЦП Л ; >0:!.1И][ЛИ ИШ1СКС сшмулчшш

СО 'Здоровые доноры

Г: Пациенты с гемобластозами без Синдрома зозииофилии

■ Пациенты с лимфогранулематозом

■ Пациенты с множественной миеломой

О Пациенты с иеходжкипекими лнмфомами

1'ис. 2, Продукция 11,-5 (А), 11.-3 (Б) и вМ-СЙР (В) мононуклеарными лейкоцитами периферической крови у пациентов с л и м ф о п ро л и ф ерат и вн ы м и заболеваниями системы крови, ассоциированными с синдромом эозинофилии

Данное обстоятельство, по-видимому, свидетельствует о снижении резервной способности Th-2-лимфоцитов продуцировать эозинофилстимулирующие цитокины [Dirks W. et al., 1997; Jundt F. et al., 1999; Abrahamsen A.F., 2000].

По данным литературы, именно повышенная продукция IL-5 - ключевого медиатора, модулирующего функциональную активность эозинофилов, обусловливает формирование синдрома эозинофилии, сопровождающего аллергические заболевания и паразитарные инвазии. У обследованных нами пациентов с лимфогранулематозом и множественной миеломой, ассоциированных с синдромом эозинофилии, было обнаружено наличие корреляционных связей между базальной продукцией мононуклеарными лейкоцитами IL-5 и относительным количеством эозинофильных гранулоцитов, что подтверждает наличие тесной взаимосвязи между изучаемыми показателями (г=0,620, р<0,05 и г=0,735, р<0,05, соответственно).

Способностью активировать эозинофилы обладает также IL-4, который совместно с TNFa и IL-13, усиливает уровень экспрессии CD69 на мембране эозинофильных гранулоцитов, обусловливая тем самым снижение их апоптотической гибели [Luttmann W. et al., 1999] (рис. 1). В результате исследования содержания IL-4 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов у больных со злокачественными заболеваниями системы крови, сопровождающимися длительной эозинофилией крови, и у пациентов с гемобластозами без синдрома эозинофилии вне зависимости от нозологии было выявлено снижение конституциональной и индуцибельной продукции данного цитокина по сравнению с нормальными значениями (у пациентов с лимфогранулематозом медианные значения базальной и ФГА-стимулированнойпродукции IL-4 составляли - 18,17 (16,22-20,01) пг/мл, р=0,017 и 27,82 (27,22-28,98) пг/мл, р=0,041, соответственно, множественной миеломой - 18,44 (15,00-21,09) пг/мл, р=0,023 и 22,32 (19,09-22,67) пг/мл, р=0,001, соответственно, неходжкинскими лимфомами - 15,02 (13,45-20,10) пг/мл, р=0,031 и 21,73 (20,03-22,48) пг/мл, р=0,001, соответственно, у больных гемобластозами без синдрома эозинофилии - 17,56 (15,28-19,84) пг/мл, р=0,029 и 23,25 (20,93-25,57) пг/мл, р=0,019, соответственно при норме 26,43 (25,2127,58) пг/мл и 42,30 (32,31-54,30) пг/мл, соответственно). Выявленные изменения, скорее всего, следует рассматривать с позиции опухолевого процесса, поскольку известно, что IL-4 является мощным ингибитором роста опухолевых клеток как in vivo, так и in vitro. Дисбаланс продукции рассматриваемого цитокина при неопластических заболеваниях, по-видимому, может явиться одним из основных звеньев, способствующих снижению противоопухолевой защиты организма, и, как следствие, - неизбежной прогрессии заболевания.

Формирование высокой эозинофилии при гемобластозах может быть опосредовано действием эотаксина — хемокина, специфично действующего в отношении лейкоцитов эозинофильного ряда (рис. 1). Основными продуцентами данного медиатора являются эпителиальные клетки и сами эозинофилы. В связи с этим концентрацию эотаксина у больных с лимфопролиферативными заболеваниями системы крови, сопровождающимися

синдромом эозинофилии, мы оценивали в сыворотке крови. В ходе исследования было зарегистрировано значительное повышение уровня эотаксина в сыворотке крови у больных с лимфогранулематозом (115,0 (63,SIMO,5) пг/мл, р=0,045), тогда как у пациентов с множественной миеломой и у больных с неходжкинскими лимфомами значения данного показателя не отличались от контроля (р=0,069 и р=0,065) и аналогичных параметров у пациентов без эозинофилии (р=0,063 и р=0,070). Вместе с тем у больных лимфогранулематозом нами было обнаружено наличие корреляционных связей между концентрацией эотаксина и относительным содержанием эозинофилов периферической крови (г=0,502, р<0,05), что указывает на значительную роль данного хемокина в механизмах формирования феномена эозинофилии.

Таким образом, в результате проведенного нами исследования у пациентов со злокачественными заболеваниями системы крови, сопровождающимися синдромом эозинофилии, на фоне количественного дефицита Т-клеток выявлен существенный дисбаланс секреции мононуклеарными лейкоцитами ключевых медиаторов, принимающих участие в регуляции процессов пролиферации, дифференцировки и последующей активации эозинофильных гранулоцитов.

Не вызывает сомнения тот факт, что изучение молекулярных механизмов межклеточной кооперации заключается, с одной стороны, в оценке продукции медиаторов, опосредующих кооперативное взаимодействие клеток. С другой стороны, обязательным этапом подобных исследований является анализ клеточных рецепторных структур.

Согласно современным представлениям, эозинофилы на своей мембране несут разнообразные антигенные структуры, среди которых несомненный интерес представляют рецепторы для цитокинов [Воробьев А.И., 2001; Минеев В.Н. и соавт., 2001; Бережная Н.М. и соавт., 2005]. Показано, что эозинофилы презентируют рецепторы (R) к IL-3, IL-4, IL-5, IL-10, эотаксину (CCR3) и GM-CSF [Воробьев А.И., 2001; Минеев В.Н. и соавт., 2001; Бережная Н.М. и соавт., 2005] (рис. 3). Стимуляция эозинофильных лейкоцитов антигенными детерминантами приводит к синтезу определенного набора медиаторов, экспрессии соответствующих цитокиновых рецепторов и активации опосредуемых ими функций [Bochner В.S., 2000].

Проведенное нами исследование презентации рецепторов к IL-5, IL-3 и эотаксину в интактной культуре эозинофилов in vitro, полученных у больных гемобластозами, ассоциированными с синдромом эозинофилии, позволило констатировать факт увеличения абсолютного и относительного количества IL-5R-, IL-3R- и CCR3-no3HTHBHbix клеток по сравнению с аналогичными параметрами у здоровых доноров. При этом у больных неходжкинскими лимфомами содержание эозинофилов, несущих IL-3R, соответствовало нормальным значениям (рис. 4).

Установленное в результате настоящего исследования увеличение фракции эозинофильных клеток, презентирующих IL-5R, IL-3R и CCR3, у пациентов с гемобластозами может быть опосредовано, вероятно, влиянием одноименных медиаторов, секретируемых в избыточных концентрациях мононуклеарными лейкоцитами периферической крови, опухолевыми клетками или самими

Антигенные структуры, свойственные

гранулоцитарному;ростку \ /

4 CD 13 CD 33/

Рецепторы для цитокинов

GM-CSFR CCR3 "у IL-4R ^ 1L-6R

--VHl

Рецепторы для гистамина (Н^)

Рецептор для простагландинов

Рецептор для1 кортикостерондов

СО 9

СИ 69 Молекулы адгезии и активации СО 18

пь

"СО 37 С4

СЗс! Рецепторы для СЗЬ активированных компонентов

комплемента

FcRi

I FcRigp "" " I

I Рецепторы для иммуноглобулинов

Рис. 3. Рецепторный аппарат эозинофильных гранулоцитов [по данным А.И.

Воробьева, 2002; Н.М. Бережной и соавт., 2005]

эозинофилами. Вместе с тем, усиление рецепторэкспрессирующей способности эозинофильных гранулоцитов при синдроме эозинофилии, осложняющем течение гемобластозов, может быть результатом токсического действия неопластически трансформированных клеток крови.

При стимуляции эозинофильных клеток, полученных у пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями системы крови, сопровождающимися выраженной эозинофилией, in vitro рекомбинантным (г) IL-5, r-IL-З и г-эотаксином у всех обследованных пациентов вне зависимости от нозологии отмечалось повышение относительного и абсолютного содержания IL-5R- и ССЯЗ-несущих эозинофилов и абсолютного числа клеток эозинофильного ряда, экспрессирующих IL-3R по сравнению с аналогичными показателями в контрольной группе (рис. 4). При этом для определения соотношения клеток, несущих цитокиновые рецепторы в базальной культуре, к таковому в условиях инкубации с одноименными рекомбинантными цитокинами нами были рассчитаны индексы стимуляции. Значения индексов стимуляции презентации IL-5R и IL-3R у больных лимфогранулематозом и пациентов с множественной миеломой оказались достоверно ниже аналогичных показателей в норме. Индекс стимуляции экспрессии CCR3 у всех пациентов соответствовал контрольным значениям. Данное обстоятельство свидетельствует о снижении резервной способности эозинофильных гранулоцитов экспрессировать рецепторы к IL-5 и IL-3. По-видимому, при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови эозинофилы с изначально высокой способностью презентировать рецепторы к эозинофилстимулирующим цитокинам в условиях дополнительной стимуляции не способны адекватно воспринимать активационные цитокиновые сигналы.

А

%

Ьагальмая Стимулированная Индекс стимуляции

В

%

250 -

Баззль*1ая Стнмулиронаииая г- Индекс стимуляции

эотакснной!

ЕЗ Здоровые доноры Я Паинеигм с лимфогранулематозом ■ Панис1ггы с множественной мцеломой ЕЗ 1(аниеты с нечоджкинскими лимфомами

Рис, 4. Содержание 1Е_-5Е<- (А), 1Ь-ЗК- (Б) и ССКЗ-позитивных клеток (В) в культуре эозин офилой, полученных у пациентов с лимфопролифератиными заболеваниями системы крови, сопровождающимися эозинофилией

Дисбаланс экспрессии эозинофильными гранулоцитами рецепторов к цитокинам, модулирующим их функциональную активность, может являться еще одним механизмом, лежащим в основе длительного пребывания эозинофилов в периферической крови при гемобластозах. У пациентов с лимфогранулематозом это подтверждается наличием корреляции между относительным количеством клеток, презентирующих рецепторы к 1Ь-5 и эотаксину, и относительным содержанием эозинофильных гранулоцитов периферической крови (г=0,863, р<0,05 и г=0,641, р<0,05, соответственно).

В целом полученные нами результаты исследования свидетельствуют о том, что синдром эозинофилии, осложняющий течение лимфопролиферативных заболеваний системы крови, сопровождается увеличением продукции ключевых цитокинов, регулирующих процессы пролиферации, дифференцировки и активации эозинофилов, (IL-5, IL-3 и GM-CSF) мононуклеарами и уровня эотаксина в периферической крови на фоне количественного дефицита Т-клеточного звена иммунной системы и сниженной секреции IL-4 мононуклеарными лейкоцитами. В то же время у всех пациентов с гемобластозами зарегистрировано повышенное количество эозинофильных клеток, несущих рецепторы к IL-3, IL-5 и эотаксину. При дополнительном воздействии на эозинофильные клетки, полученных у пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями системы крови, сопровождающимися эозинофилией, in vitro рекомбинантных форм IL-3, IL-5 и эотаксина установлено снижение функционального потенциала эозинофильных гранулоцитов в отношении экспрессии IL-3R и IL-5R при неизменной способности эозинофилов презентировать рецептор к эотаксину. Кроме этого, у всех пациентов с гемобластозами, ассоциированными с синдромом эозинофилии, было выявлено напряжение кислороднезависимых и кислородзависимых процессов микробицидности, что обусловливает формирование высокого цитотоксического потенциала эозинофильных гранулоцитов.

Следует отметить, что при проведении сравнительного анализа результатов исследования у пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями системы крови, сопровождающимися эозинофилией, в зависимости от половых и возрастных критериев, а также факта наличия полихимиотерапии в анамнезе достоверных различий тестируемых показателей выявлено не было.

Таким образом, избыточная продукция цитокинов, являющихся ключевыми в регуляции процессов клеточного гомеостаза эозинофилов, мононуклеарными лейкоцитами, с одной стороны, и дисбаланс экспрессии рецепторного аппарата эозинофильных гранулоцитов, с другой, на наш взгляд, могут обусловливать нарушение кооперации изученных клеток и являться одним из механизмов, лежащих в основе пролонгированного пребывания эозинофилов в периферической крови при лимфогранулематозе, множественной миеломе и неходжкинских лимфомах. Выявленное нами увеличение цитотоксического потенциала эозинофильных гранулоцитов, действие которого может реализоваться не только в отношении антигенных структур, но и клеток макроорганизма, позволяет сделать предположение о негативном влиянии длительной эозинофилии крови, сопровождающей гемобластозы (рис. 5).

Анализ молекулярных механизмов цитокин-рецепторной кооперации иммунокомпетентных клеток и эозинофильных гранулоцитов значим не только с точки зрения вскрытия их природы. Он важен для понимания патогенеза

Ткани макроорганизма

(эндотелий сосудов, нервные волокна н др.)

Рис. 5. Схема нарушения кооперации иммунокомпетентных клеток и эозиофилов в механизмах формирования синдрома эозинофилии при гемобластозах (по данным А.И. Воробьева, 2002; Н.М. Бережной и соавт., 2005 и результатам собственных исследований (выделено)) ИКК — шшунокомпетентная клетка, Эо — эозинофил, БОП — большой основной протеин, ЭКП - эозинофильный катионный протеин, ЭП - эозинофильная пероксидаза, ЭК -эпителиальная клетка, «+» - положительное значение, «-»- отрицательное значение.

синдрома эозинофилии, развивающегося при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови, с целью поиска патогенетически оправданных путей его коррекции.

ВЫВОДЫ

1. Эозинофильные гранулоциты у пациентов с лимфогранулематозом, множественной миеломой и неходжкинскими лимфомами, сопровождающимися синдромом эозинофилии, претерпевают выраженные однотипные нарушения морфологических и цитотоксических свойств.

2. Морфологические изменения как интактных, так и индуцированных антигеном Ор1Б,1ЬогЫ8 ГеНпеиь эозинофильных гранулоцитов, полученных у больных лимфопролиферативными заболеваниями системы крови, ассоциированными с синдромом эозинофилии, характеризуются нарушением структуры ядра и цитоплазмы клеток, их дегрануляцией и макроцитозом.

3. Индукция кислороднезависимых и кислородзависимых механизмов микробицидности при синдроме эозинофилии, осложняющем течение лимфопролиферативных заболеваний системы крови (лимфогранулематоз,

множественная миелома и неходжкинские лимфомы), приводит к усилению цитотоксического потенциала эозинофильных гранулоцитов.

4. Механизмы формирования синдрома эозинофилии при лимфогранулематозе, множественной миеломе и неходжкинских лимфомах сопряжены с нарушением кооперации эозинофилов и мононуклеарных лейкоцитов, опосредованной цитокинами, регулирующими процессы пролиферации, дифференцировки и активации эозинофильных клеток.

5. Нарушение кооперации эозинофилов и мононуклеарных клеток у больных лимфопролиферативными заболеваниями системы крови, ассоциированными с синдромом эозинофилии, связано с повышением продукции мононуклеарами IL-3, IL-5 и GM-CSF и увеличением уровня эотаксина в сыворотке крови при возрастании экспрессии эозинофилами комплементарных им рецепторов (IL-3R, IL-5R и CCR3) в условиях дефицита Т-клеточного звена иммунной системы и сниженной секреции IL-4 мононуклеарными лейкоцитами периферической крови.

6. При дополнительном воздействии на эозинофильные клетки, полученные у пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями системы крови, сопровождающимися развитием синдрома эозинофилии, in vitro рекомбинантных форм IL-3, IL-5 и эотаксина снижается функциональный потенциал эозинофильных гранулоцитов в отношении экспрессии IL-3R и IL-5R при неизменной способности эозинофилов презентировать рецептор к эотаксину.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Литвинова Л.С., Колобовникова Ю.В., Рязанцева Н.В. Иммунорегуляторная роль интерлейкина-4 при гемобластозах // Тезисы докладов Международного конгресса «Иммунитет и болезни: от теории к терапии», Москва, 2005. - С. 170.

2. Изменение продукции IL-4 иммунокомпетентными клетками при хроническом описторхозе / Л.С. Литвинова, Ю.В. Колобовникова, Е.С. Григорьева, Е.В. Суворова, Н.В. Рязанцева, А.П. Зима, О.Б. Жукова // Тезисы докладов I Съезда физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека», Сочи, 2005. -С. 118-119.

3. Механизмы нарушения кооперации эозинофилов и иммуноцитов при формировании больших эозинофилий крови / В.В. Новицкий, Н.В. Рязанцева, Л.С. Литвинова, Ю.В. Колобовникова, Е.С. Григорьева, Е.В. Суворова // Бюллетень сибирской медицины. — 2006. - №2. - С. 52-61.

4. Цитотоксический потенциал эозинофильных гранулоцитов у больных с синдромом эозинофилии / Л.С. Литвинова, Ю.В. Колобовникова, E.H. Кнутарева, Е.С. Григорьева, Е.В. Суворова, В.В. Новицкий, Н.В. Рязанцева // Бюллетень сибирской медицины. -2006. - №3. - С. 26 - 31.

5. Цитокины и противовирусный иммунитет / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, В.В. Белоконь, А.П. Зима, О.Б. Жукова, И.О. Наследникова, Л.С.

Литвинова, Ю.В. Колобовникова, Н.Ю. Часовских // Успехи физиологических наук. - 2006. - Т. 137, №4. - С. 1-11.

6. Механизмы нарушения кооперации лимфоцитов и эозинофилов при гемобластозах, сопровождающихся синдромом эозинофилии / Н.В. Рязанцева, Л.С. Литвинова, В.В. Новицкий, С.Б. Ткаченко, Ю.В. Колобовникова, Е.С. Григорьева, Е.В. Суворова, E.H. Кнутарева, О.Б. Жукова // Медицинская иммунология. - 2007. - №3. - С. 21 - 27.

7. Механизмы нарушения цитокинопосредованной кооперации эозинофилов и иммуноцитов при формировании феномена эозинофилиии / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, Л.С. Литвинова, С.Б. Ткаченко, Ю.В. Колобовникова Е.С. Григорьева, Е.В. Суворова // Иммунология. - 2007. - № 2. - С. 45 - 55.

8. Особенности противопаразитарной реактивности организма при описторхозе / Л.С. Литвинова, Ю.В. Колобовникова, Е.С. Григорьева, Е.В. Суворова, В.В. Новицкий, Н.В. Рязанцева // Тезисы докладов 5-й научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины», Астрахань, 2006.-С. 142-144.

9. Изменение продукции ТЬ2-цитокинов мононуклеарными клетками при множественной миеломе / Л.С. Литвинова, Ю.В. Колобовникова, E.H. Кнутарева, Е.С. Григорьева, Е.В. Суворова, Н.В. Рязанцева // Тезисы докладов VIII Конгресса «Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении», Москва, 2006.-С. 19.

10. Изменения иммунологической реактивности при лимфогранулематозе / Л.С. Литвинова, Ю.В. Колобовникова, Е.С. Григорьева, Е.В. Суворова, Н.В. Рязанцева // Тезисы докладов XII-ой Межгородской научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии», Санкт-Петербург, 2006.-С. 53-54.

11. Изменение уровня продукции IL-5 иммунокомпетентными клетками при злокачественных заболеваниях системы крови, сопровождающихся синдромом эозинофилии / Л.С. Литвинова, Ю.В. Колобовникова, Е.С. Григорьева, Е.В. Суворова, В.В. Новицкий, Н.В. Рязанцева, О.Б. Жукова // Тезисы докладов Российского медицинского форума-2006 «Фундаментальная наука и практика», Москва, 2006. - С. 88.

12. Изменение продукции эозинофилстимулирующих цитокинов иммунокомпетентными клетками при описторхозе / Л.С. Литвинова, Ю.В. Колобовникова, О.Б. Жукова, Н.П. Чернышова, Е.С. Григорьева, Е.В. Суворова, В.В. Новицкий, Н.В. Рязанцева // Тезисы докладов Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной памяти профессора H.H. Кеворкова «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике», Пермь, 2006. — С. 43 - 44.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

КОЕ - колониеобразующая единица

HCT - нитросиний тетразолий

СЦК - средний цитохимический коэффициент

ФГА — фитогемагглютинин

CD - поверхностный кластер дифференцировки

CSF - колониестимулирующий фактор

GM-CSF - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

Ig - иммуноглобулин

IL - интерлейкин

Th - Т-хелперы

TNF - фактор некроза опухоли

Тираж 50. Заказ 221. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники. 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40.

Актуальность проблемы. В последние годы внимание исследователей привлечено к синдрому эозинофилии с позиции изучения патогенеза аллергических заболеваний и паразитарных инвазий [Фассахов Р.С. и соавт., 1992; Логинов А.С.и соавт., 1998; Джальчинова В. Б., Чистяков Г. М., 1999; Озерецковская Н.Н., 2000; Hamelmann Е., Gelfand E.W., 2001; Коровина Н.А. и соавт., 2002; Семенкова Е.Н. и соавт., 2004; Das A.M. et al., 2005]. Однако I известно, что с явлением гиперэозинофилии ассоциирован целый ряд опухолевых заболеваний (рак желудка, гипернефроидный рак почки, рак легких, поджелудочной железы, толстой кишки, шейки матки, яичников и др. [Гриншпун Г.Д., Виноградова Ю.Е., 1983; Мокеева Р.А. и соавт., 2000; Воробьев А.И., 2003; Caruso R.A. et al., 2004; Ольшанская Ю.В. и соавт., 2005]. Наряду с этим имеются многочисленные описания гиперэозинофилии при злокачественных новообразованиях системы крови, среди которых особое внимание привлекают миело- и лимфопролиферативные заболевания [Merz Н. et al., 1991; Хорошко Н.Д. и соавт., 1998; Чучалин А.Г., 2003; Семенкова Е.Н. и соавт., 2004; Абдулкадыров К.М., 2006]. В настоящее время актуальной остается проблема интерпретации причин возникновения и последствий синдрома гиперэозинофилии у больных с гемобластозами.

Исследованиями последних лет показано, что эозинофил является одной из наиболее агрессивных эффекторных клеток воспаления [Анаев Э.Х. и соавт., 1994; Беклемишев И. Д., 1998]. Эозинофильные гранулоциты служат источником большого количества цитотоксических продуктов, повышенное содержание которых обусловливает формирование высокого микробицидного потенциала, направленного не только в отношении инородных субстанций, но и окружающих тканей, что способствует возникновению различных осложнений длительной гиперэозинофилии (эозинофильные васкулиты, эндокардиты, гастроэнтериты и др.) [Джальчинова В.Б., Чистяков Г.М., 1999; Воробьев А.И. и соавт., 2000; Dvorak A.M., Weller P.F., 2000; Волкова М.А., 2001; Чучалин А.Г., 2003; Ешану B.C., 2004]. Однако в современной литературе эозинофильные гранулоциты рассматривают не только в качестве клеток-эффекторов, но и как важный фактор поддержания тканевого и иммунологического гомеостаза [Минеев В.Н. и соавт., 2000; Воробьев А.И., 2002; Бережная Н.М. и соавт., 2005]. Эозинофилы обладают способностью экспрессировать на своей поверхности разнообразные рецепторные структуры и продуцировать широкий спектр биологически активных веществ. Лейкоциты эозинофильного ряда за счет секреции иммунорегуляторных цитокинов - интерлейкина (IL)-4, IL-6, IL-2, IL-10 - участвуют в регуляции функций иммунокомпетентных клеток [Джальчинова В.Б., Чистяков Г.М., 1999; Волкова М.А., 2001; Ешану B.C., 2004].

Учитывая новые аспекты физиологического значения эозинофилов, особый интерес представляют данные об их способности взаимодействовать с иммунокомпетентными клетками макроорганизма. Следует отметить, что исследование природы кооперативных взаимодействий между иммуноцитами и другими клетками макроорганизма является принципиальным аспектом в изучении пусковых механизмов развития любого патологического процесса. Важнейшую роль в установлении и стабилизации контактов между клетками играет цитокин-рецепторная сеть. Именно посредством цитокинов, синтезируемых и секретируемых клеткой, осуществляются лиганд-рецепторные взаимодействия за счет связывания растворимых веществ с аффинным рецептором на клеточной поверхности [Кашкин К.Е., 1998; Ярилин А.А., 1999, 2001; Кетлинский С.А., 2002; Симбирцев А.С., 2002, 2004]. Так, иммунокомпетентные клетки, продуцируя IL-3, IL-4, IL-5, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), регулируют процессы пролиферации, дифференцировки и активации лейкоцитов эозинофильного ряда [Gulbenkian A.R. et al., 1992; Беклемишев И.Д., 1998; Минеев В.Н. и соавт., 2000; Намазова JI.C. и соавт., 2000; Nagase Н. et al., 2001; Воробьев А.И., 2002; Lampinen М. et al., 2004; Бережная Н.М. и соавт., 2005]. Существующая между клетками иммунной системы и эозинофилами взаимонаправленность эффектов обусловлена как иммуномодулирующим действием иммунокомпетентных клеток, так и способностью лейкоцитов эозинофильного ряда активировать иммуноциты и вызывать поляризацию иммунного ответа в ту или иную сторону за счет секреции иммунорегуляторных молекул. Дизрегуляция данных эффектов может обусловливать сдвиг процессов созревания, дифференцировки и активации эозинофилов, что приводит к их длительному пребыванию в периферической крови.

Цель исследованиях установить роль нарушений цитокинопосредованной кооперации эозинофилов и мононуклеарных лейкоцитов в механизмах формирования синдрома эозинофилии при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Оценить морфо-функциональные свойства эозинофильных гранулоцитов периферической крови у пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями системы крови (лимфогранулематоз, множественная миелома и неходжкинские лимфомы), ассоциированными с синдромом эозинофилии.

2. Определить уровень эотаксина в сыворотке крови и установить особенности продукции мононуклеарными лейкоцитами периферической крови цитокинов (IL-3, IL-4, IL-5 и GM-CSF), регулирующих процессы пролиферации, дифференцировки и активации эозинофильных клеток, при гемобластозах, сопровождающихся синдромом эозинофилии.

3. Оценить состояние цитокин-рецепторного аппарата эозинофильных гранулоцитов (рецепторов к IL-3, IL-5 и эотаксину) у больных лимфопролиферативными заболеваниями системы крови, сопровождающимися выраженной эозинофилией. •

4. Исследовать функциональный потенциал эозинофильных гранулоцитов в отношении экспрессии рецепторов к эозинофилстимулирующим цитокинам при инкубации клеток, полученных у пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями системы крови, сопровождающимися синдромом эозинофилии, с рекомбинантными формами IL-3, IL-5 и эотаксина in vitro.

Научная новизна. Впервые с привлечением культуральных, иммунологических и молекулярно-биологических методов исследования проведена комплексная оценка цитокинопосредованной кооперации эозинофилов и мононуклеарных лейкоцитов периферической крови при гемобластозах, сопровождающихся эозииофилией. Установлено, что механизмы формирования синдрома эозинофилии, осложняющего течение лимфопролиферативных заболеваний системы крови, сопряжены с нарушением кооперативного взаимодействия эозинофильных гранулоцитов и мононуклеарных клеток, что выражается в увеличении продукции мононуклеарами IL-3, IL-5 и GM-CSF и повышении уровня эотаксина в сыворотке крови при возрастании экспрессии эозинофилами IL-3R, IL-5R и CCR3 в условиях дефицита Т-клеточного звена иммунной системы и сниженной секреции IL-4 мононуклеарными лейкоцитами периферической крови. Получены новые данные, касающиеся снижения резервной способности эозинофильных гранулоцитов презентировать рецепторы к IL-3 и IL-5 при инкубации in vitro клеток с рекомбинантными формами одноименных цитокинов. У пациентов с лимфогранулематозом, множественной миеломой и неходжкинскими лимфомами, сопровождающихся синдромом эозинофилии, впервые выявлены однотипные изменения морфо-функционального статуса эозинофильных гранулоцитов (увеличение содержания внутриклеточных катионных протеинов и пероксидазы, усиление фагоцитарной активности, наличие клеток с признаками дегрануляции и цитолиза). Установлено, что при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови, ассоциированных с выраженной эозинофилией, интенсификация кислороднезависимых и кислородзависимых процессов микробицидности опосредует формирование высокого цитотоксического потенциала эозинофильных гранулоцитов, что может обусловливать негативное влияние длительной гиперэозинофилии крови при гемобластозах.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные фундаментального характера о нарушении цитокинопосредованной кооперации эозинофилов и мононуклеарных лейкоцитов периферической крови при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови раскрывают новые патофизиологические аспекты формирования синдрома эозинофилии. Результаты исследования могут быть положены в основу разработки патогенетически обоснованных молекулярных технологий коррекции дизрегуляции кооперативного взаимодействия эозинофилов и иммунокомпетентных клеток при гемобластозах, ассоциированных с выраженной эозинофилией, с целью лечения и профилактики осложнений длительной гиперэозинофилии крови.

Положения, выносимые на защиту:

1. Механизмы формирования синдрома эозинофилии при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови сопряжены с нарушением цитокинопосредованной кооперации эозинофилов и мононуклеарных лейкоцитов.

2. Механизмы нарушения кооперации эозинофилов и мононуклеарных клеток при синдроме эозинофилии, осложняющем течение лимфопролиферативных заболеваний системы крови, опосредованы повышением продукции цитокинов, являющихся ключевыми в регуляции гомеостаза эозинофильных клеток (IL-3, IL-5, GM-CSF и эотаксина), при дисбалансе экспрессии эозинофилами комплементарных им рецепторов (IL-3R, IL-5R и CCR3) в условиях дефицита Т-клеточного звена иммунной системы и сниженной секреции IL-4 мононуклеарными лейкоцитами.

3. При лимфопролиферативных заболеваниях системы крови (лимфогранулематоз, множественная миелома и неходжинские лимфомы), ассоциированных с синдромом эозинофилии, эозинофильные гранулоциты претерпевают выраженные однотипные нарушения морфологических и цитотоксических свойств.

Апробация и реализация работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на Международном конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (Москва, 2005), I Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (Сочи, 2005), 5-й научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2006), VIII Конгрессе «Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении» (Москва, 2006), XII Межгородской научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2006), Российском медицинском форуме-2006 «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006), Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной памяти профессора Н.Н. Кеворкова «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (Пермь, 2006).

В работе приводятся результаты исследований, поддержанных Советом при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ РФ, «Молекулярные основы нарушения гомеостаза клеток крови при актуальных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы» (НШ-4153.2006.7), а также результаты научно-исследовательской работы «Роль нарушений межклеточной кооперации в механизмах формирования больших эозинофилий крови» (Государственный контракт №02.442.11.7056 от 26.10.2005), выполненной в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 20022006 годы».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, из которых 5 -в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 9 рисунками и 13 таблицами. Библиографический указатель включает 252 источника (105 -отечественных и 147 - иностранных).

ВЫВОДЫ

1. Эозинофильные гранулоциты у пациентов с лимфогранулематозом,

W и 1 множественной миеломои и неходжкинскими лимфомами, сопровождающимися синдромом эозинофилии, претерпевают выраженные однотипные нарушения морфологических и цитотоксических свойств.

2. Морфологические изменения как интактных, так и индуцированных антигеном Opisthorhis felineus эозинофильных гранулоцитов, полученных у больных лимфопролиферативными заболеваниями системы крови, ассоциированными с синдромом эозинофилии, характеризуются нарушением структуры ядра и цитоплазмы клеток, их дегрануляцией и макроцитозом.

3. Индукция кислороднезависимых и кислородзависимых механизмов микробицидности при синдроме эозинофилии, осложняющем течение лимфопролиферативных заболеваний системы крови (лимфогранулематоз, множественная миелома и неходжкинские лимфомы), приводит к усилению цитотоксического потенциала эозинофильных гранулоцитов.

4. Механизмы формирования синдрома эозинофилии при лимфогранулематозе, множественной миеломе и неходжкинских лимфомах сопряжены с нарушением кооперации эозинофилов и мононуклеарных лейкоцитов, опосредованной цитокинами, регулирующими процессы пролиферации, дифференцировки и активации эозинофильных клеток.

5. Нарушение кооперации эозинофилов и мононуклеарных клеток у больных лимфопролиферативными заболеваниями системы крови, ассоциированными с синдромом эозинофилии, связано с повышением продукции мононуклеарами IL-3, IL-5 и GM-CSF и увеличением уровня эотаксина в сыворотке крови при возрастании экспрессии эозинофилами комплементарных им рецепторов (IL-3R, IL-5R и CCR3) в условиях дефицита Т-клеточного звена иммунной системы и сниженной секреции IL-4 мононуклеарными лейкоцитами периферической крови.

6. При дополнительном воздействии на эозинофильные клетки, полученные у пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями системы крови, сопровождающимися развитием синдрома эозинофилии, in vitro рекомбинантных форм IL-3, IL-5 и эотаксина снижается функциональный потенциал эозинофильных гранулоцитов в отношении экспрессии IL-3R и IL-5R при неизменной способности эозинофилов презентировать рецептор к эотаксину.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На сегодняшний день эозинофильный гранулоцит занимает одно из центральных мест при изучении патогенеза аллергических заболеваний и паразитарных инвазий: при аллергической патологии эозинофилы рассматриваются как основные компоненты ее развития, а при гельминтозах -как бесспорные факторы защиты. В то же время представления о роли эозинофилов и эозинофилии при формировании опухолевого процесса существенно ограничены.

Общеизвестно, что эозинофил является одной из наиболее агрессивных эффекторных клеток воспаления. Эозинофильные гранулоциты служат источником большого количества цитотоксических продуктов, повышенное содержание которых обусловливает формирование их высокого микробицидного потенциала [Джальчинова В.Б., Чистяков Г.М.,1999; Минеев В.Н. и соавт., 2000]. В современной литературе эозинофильные клетки также принято рассматривать в качестве регуляторов тканевого и иммунологического гомеостаза. Именно благодаря способности секретировать широкий спектр биологически-активных веществ и экспрессировать на своей поверхности разнообразные рецепторные структуры, лейкоциты эозинофильного ряда принимают участие в регуляции функций иммунокомпетентных клеток, в процессах клеточной репар&ции, свертывания крови и др. [Воробьев А.И., 2003; Бережная Н.М. и соавт., 2005].

Следует подчеркнуть, что одним из наиболее развивающихся направлений биомедицинских исследований в настоящее время становится изучение молекулярных аспектов нарушений межклеточных взаимодействий в патогенезе различных заболеваний. Очевидно, что межклеточная кооперация, осуществляя ключевую роль в регуляции гомеостаза клеток, определяет их развитие, направление дифференцировки, а также осуществление многих эффекторных клеточных функций [Ярилин А.А., 1999; Иванов А.А. и соавт., 2005]. Важную роль в становлении и стабилизации контактов между взаимодействующими клетками макроорганизма играет цитокин-рецепторная сеть. Посредством цитокинов, синтезируемых и секретируемых клеткой, осуществляются лиганд-рецепторные взаимодействия за счет связывания растворимых веществ с аффинным рецептором на клеточной поверхности [Ярилин А.А., 2001; Кетлинский С.А., 2002; Симбирцев А.С., 2002, 2004]. Изучение цитокинового профиля и способности клеток экспрессировать на мембране соответствующие рецепторы позволяет оценить характер межклеточных взаимодействий, дизрегуляция которых может обусловливать формирование патологического процесса.

Полученные нами результаты исследования свидетельствуют о том, что синдром эозинофилии, осложняющий течение лимфопролиферативных заболеваний системы крови, сопровождается увеличением продукции ключевых цитокинов, регулирующих процессы пролиферации, дифференцировки и активации эозинофилов (IL-5, IL-3 и GM-CSF), мононуклеарами и уровня эотаксина в периферической крови на фоне количественного дефицита Т-клеточного звена иммунной системы и сниженной секреции IL-4 мононуклеарными лейкоцитами. В то же время у всех больных гемобластозами, ассоциированными с эозинофилией, зарегистрировано повышенное количество эозинофильных клеток, несущих рецепторы к IL-3, IL-5 и эотаксину. При дополнительном воздействии на эозинофильные клетки, полученных у пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями системы крови, сопровождающимися эозинофилией, in vitro рекомбинантных форм IL-3, IL-5 и эотаксина установлено снижение функционального потенциала эозинофильных гранулоцитов в отношении экспрессии IL-3R и IL-5R при неизменной способности эозинофилов презентировать рецептор к эотаксину. Кроме этого, у всех пациентов с гемобластозами, ассоциированными с синдромом эозинофилии, было выявлено напряжение кислороднезависимых и кислородзависимых процессов микробицидности, что обусловливает формирование высокого цитотоксического потенциала эозинофильных гранулоцитов.

Активация ангиогенеза опухоли н формирование опухолевого микроокружения

Рис. 9. Схема нарушения кооперации иммунокомпетентных клеток и эозиофилов в механизмах формирования синдрома эозинофилии при гемобластозах (по данным А.И. Воробьева, 2002; Н.М. Бережной и соавт., 2005 и результатам собственных исследований (выделено)) ИКК - и\шу но компетентная клетка, Эо — эозинофил, БОП — большой основной протеин, ЭКП - эозинофилъный катионный протеин, ЭП - эозинофильная пероксидаза, ЭК - эпителиальная тетка, «+» ■ положительное значение, «-» - отрицательное значение.

Таким образом, избыточная продукция цитокинов, являющихся ключевыми в регуляции процессов клеточного гомеостаза эозинофилов, мононуклеарными лейкоцитами, с одной стороны, и дисбаланс экспрессии рецепторного аппарата эозинофильных гранулоцитов, с другой, на наш взгляд, могут обусловливать нарушение кооперации изученных клеток и являться одним из механизмов, лежащих в основе пролонгированного пребывания эозинофилов в периферической крови при лимфогранулематозе, множественной миеломе и неходжкинских лимфомах. Выявленное нами увеличение цитотоксического потенциала эозинофильных гранулоцитов, действие которого может реализоваться не только в отношении антигенных структур, но и клеток макроорганизма, позволяет сделать предположение о негативном влиянии длительной эозинофилии крови, сопровождающей гемобластозы (рис. 9).

В целом анализ молекулярных механизмов цитокин-рецепторной кооперации иммунокомпетентных клеток и эозинофильных гранулоцитов значим не только с точки зрения вскрытия природы этих механизмов. Он необходим для понимания патогенеза синдрома эозинофилии, развивающегося при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови, с целью поиска патогенетически оправданных путей его коррекции.