Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Селекция на вакцинируемость: иммуногенетический и иммунологический анализ на каракульских овцах

--»а 'V ■-•■ .,

'3 •

Министерство здравоохранения СССР

II • и

Институт иммунологии

На правах рукописи ДУШАНОВ Абдукарим

СЕЛЕКЦИЯ НА ВАКЦИНИРУЕМОСТЬ: ИММУН0ГЕНЕТИЧЕС1ШЙ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НА КАРАКУЛЬСКИХ ОВЦАХ

14.00.36 — аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1991

■Работа выполнена в Самаркандском сельскохозяйственном институте и Институте иммунологии Минздрава СССР.

Научные консультанты: академик Р. В. ПЕТРОВ, ■чл.-кор. АМН СССР Р. М. ХАИТОВ. Официальные оппоненты: чл.-кор. ВАСХНИЛ В. В. ФИЛИППОВ, докт. мед. наук, проф. Л. П. АЛЕКСЕЕВ, докт. биол. наук Л. А. ЗАХАРОВА.

Ведущее учреждение — ордена Ленина Институт -биофизики Минздрава СССР.

в ... час. на заседании сп , х

Д 074.09.01 три Институте иммунологии Минздрава СССР по адресу: Москва, Каширское шоссе, 24, 'корп. .2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иммунология.

Автореферат разослан « . . . ».....1991 г.

Защита диссертации состоится

Ученый секретарь специализированного совета

докт. биол. наук А. В. КОЛОБОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Известно, что способность к иммунному ответу на конкретные антигены различного 'происхождения, в том числе инфекционного, находится под .генетическим контролем (Петров Р, В. и др., 1966, McDeviti, Sela, 1965, McDevitt, Benacerrai, 1965, Benacerraf, 1974, 1980). .К настоящему времени у животных и человека открыт и картирован ряд генов иммунного ответа, механизм действия которых интенсивно изучается (Петров Р. В. и др., 1981; Петров Р. В. и Хаитов Р. >М., 1988; Benacerraf, Germain, 1978; Sela, 19S0, Klein, 1987). Установлено, что иммунный ответ той или иной особи на разные антигены -зеегда конкретен; он может быть высоким на один антиген, а на другой наоборот низким. В последние годы получены замечательные результаты по изучению генов, влияющих на естественную резистентность к инфекции (Ska-mene е. а., 1985).

Получили широкое развитие и различные методы исследования генетики иммунного ответа. Иммунный ответ к узко специфичным и хорошо охарактеризованным антигенным детерминантам, кодируемый небольшим числом ir-генов, сегодня может 'быть детально изучен на панелях ижбредных линий мышей, в то'М числе, с помощью молекулярно-биологических методов (Schurr е. а., 1989).

Однако, в случае использования неинбредной популяции животных, полидетерминантных антигенных комплексов возможности использования методов прямого генетического.анализа суживаются. В этих условиях одним из важнейших методов исследования становится селекция популяций по иммунной отвечаемоети. И если она проходит успешно, и удастся 'получить лошуляции с разным уровнем иммунного реагирования, то их можно пытаться анализировать иммунногене-тическими методами. В силу вышеуказанных трудностей количество систематических исследований :по иммунной селекции невелико. Основы этого направления были заложены коллективом Biozzi и выполнены в строго фундаментальном плане.

В последние годы интенсивно ведутся крупные исследования ло выявлению генов устойчивости/чувствительности в популяциях животных и птиц в домашних условиях и на крупных фермах к возбудителям эпизоотически опасных инфекций ^van der Zij,pp, 1984, Caudle е. a., 1985). Однако комплексные исследования по селекции сельскохозяйственных животных, основанные на скрещивании и отборе особей по признаку силы иммунного ответа на ту или иную конкретную вакцину, т. е. по признаку вакцинируемости (способности активно вакцинироваться) ранее не проводились.

В то же время изучение генетической обусловленности высоты иммунного ответа на вакцину в частности, у овец каракульской породы, имеет не только теоретическое, но и большое практическое значение. При скрещивании особей различного типа иммунного реагирования можно получить животных с различной степенью иммунного ответа на те или иные вакцины. Это ¡может оказаться ¡полезным для разработки и 'планирования новой тактики и стратегии профилактики .против инфекций.

Цель и задачи исследования

Цель данной работы — изучить генетическую обусловленность антителогенеза у 'каракульских овец, определить возможность проведения иммуноселекции животных и разработать методы ее контроля, оценить влияние селекции на различные реакции иммунной системы: уровень функциональной активности субпопуляций Т- и B-лимфоцитов, естественную и приобретенную резистентность к инфекции.

Изучить эффективность вакцинации селектированных групп овец как коммерческими вакцинами, чак ватадашьши препаратами принципиально нового типа и с их помощью осуществить фенотипическую коррекцию иммунного ответа к инфекции. Для решения этой цели поставлены следующие задачи:

1. Исследовать генетические детерминированные различия в антительном ответе на антигены колибактериозной и саль-монеллезной вакцин у овец каракульской породы.

2. Изучить особенности и механизмы ласледова.ния характера иммунного реагирования, исследовать возможности проведения иммуноселекции для получения оппозитнореагирую-щих популяций животных.

3. Разработать метод оценки генетического полиморфизма популяций селектированных овец.

4. Исследовать иммунный статус каракульских овец в норме и в условиях иммуноселекции. Охарактеризовать Т- и B-системы лимфоцитов каракульских овец в количественном п функциональном аспектах.

5. Исследовать возможности использования вакцинирующих препаратов нового поколения, представляющих собой комплексы протективных антигенов и полимерного иммуностимулирующего носителя для проведения фенотипической коррекции иммунного ответа и приобретенной резистентности овец к инфекции у селектированных групп овец, дать оценку возможности применения этих вакцинирующих соединений в ветеринарной практике.

Научная новизна результатов исследования

Впервые проведена селекция овец каракульской породы по генетическому признаку иммунного реагирования на практически значимые антигены сальмонеллезной и колибактери-озной вакцин. В результате этой целенаправленной селекции по признаку силы антителогенеза при вакцинации получены оппозитнореагирующие популяции овец каракульской породы.

Впервые у овец каракульской породы выявлены четкие индивидуальные различия в иммунном ответе на один и тот же антиген. При. иммунизации колибактериознон и сальмонеллезной вакцинами зарегистрированы 3 типа иммунного реагирования: высокий, низкий и промежуточный. Подавляющее большинство особей (80—90%) в неселектированной популяции отвечают по промежуточному типу. Установлено, что среди животных, высокореагирующих на один антиген, имеются особи, слабореагирующие на другой.

Способность к высокому или низкому иммунному ответу у оппозитных групп овец закрепляется в поколениях потомков и наследуется доминантно. Признак контролируется значительным числом генов не относящихся к категории генов резистентности/чувствительности, а являющимися только генами иммунного ответа, 1г-генами. Контроль высокого и низкого ответа у оппозитных групп овец имеет отличия.

Обнаружено, что стадо каракульских овец, селектированных по признаку иммунного ответа к микро'бным антигенам, является однородным по антигенам II класса ГКГ, ответственным за развитие реакции СКЛ, но не содержит заметного числа особей-гомозигот по данным антигенам. Показано, что реакция СКЛ является высокочувствительным тестом, отражающим генетический полиморфизм популяций овец каракульской породы и может быть рекомендована для изучения степени инбридинга у других сельскохозяйственных животных.

Впервые проведен комплексный анализ иммунного статуса каракульских овец. Идентифицированы клеточные маркеры для Т- и В-лимфоцитов овец каракульской породы и проведено определение количества Г- и В-лимфоцитов в крови, лимфоидных и кроветворных органах животных. Проведена

оценка возрастных изменений. Изучены функциональные особенности отдельных популяций Т- и В-лимфоцитов в ответ на различные актив анионные стимулы. Установлено влияние иммуноселекции на В-клеточный пул овец, выразившееся в модификации ответа на МЛ.

Впервые обоснована и экспериментально подтверждена возможность использования искусственных комплексных соединений на основе изолированных протективных антигенов возбудителей инфекций и полимерного иммуностимулирующего носителя для фенотипической коррекции иммунного ответа и приобретенной резистентности к инфекциям у каракульских овец.

Практическая значимость работы

Результаты исследования открывают 'перспективу разработки новой экономически рентабельной тактики и стратегии профилактики инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных.

В результате систематической селекции по признаку высокого и низкого уровня синтеза антител и вакцинации корпускулярными сальмонеллезной и колибактериозной вакцинами лолучены высокореагиру.ющие на иммунизацию популяции овец, проявляющие высокую резистентность к указанным инфекциям после иммунопрофилактики. Схемы селекции на вакцинируемость овец включены в план селекционной работы Джизакского областного производственного объединения «Каракуль».

Идентифицированные в работе маркеры для лимфоцитов овец могут быть использованы для изучения степени иммуно-реактивности этого вида животных. Изученные в работе искусственные'иммунизирующие комплексные соединения, сконструированные на основе высокоочищенных антигенов возбудителей кишечных инфекций овец и полиэлектролитного носителя иммуностимулирующего действия, проявляющие выраженный 1г-независимый защитный эффект, представляют собой экспериментальную модель высокоэффективных вакцин. Эти искусственные иммунизирующие соединения могут быть успешно использованы в ветеринарной практике для создания высокоэффективной специфической профилактической системы от инфекционных заболеваний.

Результаты работы являются непосредственным решением задач раздела 03.01 .Н Государственной программы 0.69.07 «Разработать и внедрить в практику методы и средства диагностики и коррекции нарушений внутренней среды организма человека (поддержание иммунологического, генетического и метаболического гомеостаза)». Утверждено Постановлением ГКНТ СССР № 555 от 30.10.1985. Результаты проведенных

исследований использованы для решения задач, поставленных в разделе 03.01.Н «Разработать и подготовить для апробации искусственной вакцины к инфекционным возбудителям, обладающим слабой нммуногенностыо».

Апробация работы

Фрагменты работы доложены, обсуждены и одобрены на Всесоюзной конференции по проблемам ветеринарной иммунологии (Москва, 1982), на III съезде физиологов Узбекистана (Ташкент, 1983), на Всесоюзной конференции «Актуальные проблемы иммунологии, иммунодефицита, иммунокор-ректоры» (Владивосток, 1987), на Европейском симпозиуме иммунологов (Загреб, Югославия, 1987), на IV съезде физиологов Узбекистана (Ташкент, 1988), на собрании выездной секции фармакологии и токсикологии ВАСХНИЛ по проблеме фармакорегуляции воспроизводства и роста молодняка сельскохозяйственных животных (Самарканд, 1987), на IV Всесоюзном съезде патофизиологов (Кишинев, 1989), на Учредительном собрании международного общества по патофизиологии (Москва, 1991).

Диссертация апробирована на расширенном заседании кафедры нормальной и патологической физиологии сельскохозяйственных животных Самаркандского сельскохозяйственного института и на заседании секции № 1 Ученого совета Института иммунологии Минздрава СССР.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано в отечественной и зарубежной .печати 15 работ. Получено одно авторское свидетельство на изобретение.

Объем работы. Диссертация изложена на русском языке, объемомuf/j^y страницы машинописного текста и состоит из разделов: в/едение, обзор литературы, собственные исследования^, обсуждение, выводы, слисок^дитературы, иллюстрирована MJ рисунками и содержит ¿Ц*таблицы.

Список литературы включает jvTy источников, в том числе Mf&Jf-иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

В работе использовано 1244 каракульские овцы разного возраста, 8 каракульских ягнят в возрасте 1—3 дней, 12 кроликов породы Шиншилла в возрасте 8 месяцев массой от 3 до 4 кг, мелкие лабораторные животные (мыши и морские свинки). Ягнята и овцы находились на подсобном и пастбищном содержании; овцы в необходимых случаях подкармливались ячменем, комбикормом, сеном (люцерна).

Использованы коммерческие вакцины: формолтиомерса-ловая против сальмонеллеза овец (производства биофабрики, г. Армавир) и гидроокисьалюминиевая вакцина против коли-бактериоза овец (производства предприятия Узбекского НИИ ветеринарии, г. Самарканд). Иммунизацию овец коммерческими корпускулярными вакцинами проводили в возрасте 2 месяцев согласно наставлению по применению. В ряде экспериментов проводилась иммунизация искусственными вакцинирующими комплексами (ИВК) на основе О-полисахаридов (О-ПС) энтеробактерий, вирулентных для овец. Конъюгаты полисахаридов с синтетическими полиэлектролитами синтезированы в лаборатории искусственных антигенов Института иммунологии МЗ СССР. Специфические полисахариды выделены из S. abortus ovis штамм 372(04) и Е. coli штамм 320(078), 899(015), 857(086). Для получения конъюгатов в качестве носителя использован модифицированный сополимер акриловой кислоты и N-винилпирролидона эквимолярно-го состава — NA-5.

Для осуществления иммуноселекционной работы исходным поголовьем служили 590 голов каракульских овец и 76 голов баранов черной масти, крепкой конституции, нового ¡приплода, из которых в начале опыта, т. е. в первый год, для экспериментов взяты 100 ярочек и 25 баранчиков, а на следующий, т. е. на второй год, еще 490 ярочек и 51 баранчик. У всех подопытных животных до и через 2, 5, 8, 12, 20, 30, 45 'и 60 дней после иммунизации каждой вакциной определяли титр агглютининов в сыворотке крови методом агглютинации. Подопытные животные по силе иммунного ответа делились на три группы: высокореагирующие, среднереагирую-щие и низкореагирующие. 9 голов овец были высокореагиру-ющими как на колибактериозную, так и на сальмонеллезную вакцины, у них был одинаков титр антител на оба иммуноге-на — 1 : 1600. Исходя из величины иммунного ответа на вакцины отбирали подопытных овец для спаривания и разделили их на 4 группы:

1-я группа — высокореагирующие на колибактериозную вакцину — « = 60 $ и 1 ¿г;

2-я группа — высокореагирующие на сальмонеллезную вакцину — п = 65 9 и 1 б1;

3-я группа — низкореагирующие на колибактериозную вакцину — я=27 $ и 1 с?;

4-я группа — низкореагирующие на сальмонеллезную вакцину — п = 41 5 и 1 d .

Следует отметить, что овцы, высокореагирующие на обе вакцины, из-за отсутствия производителя двойного иммунного реагирования среди отобранных нами баранов, не выделены в отдельную группу.

Для осуществления иммуноселекции в двух сериях опыта по степени оппозитного иммунного реагирования участвовали 193 овцы и 4 производителя, т. е. овцы соответствующих опытных групп осеменялись одним наиболее близким по силе иммунного ответа производителем. Как в первой, так и во второй серии опытов в соответствующих группах использовались одни и те же производители, а остальные отобранные производители держались в запасе.

Осеменение животных осуществлялось искусственным и естественным путем. Скрещивание в каждой серии опытов осуществлялось поочередно по достижении подопытными животными 18—19-месячного возраста.

Специфические противоэшерихиозные и противосальмо-неллезные антитела в сыворотках овец определяли общепринятым методом бактериальной агглютинации. Для индикации использовали смесь убитых штаммов Е. coli (08, 09, 015, 026, Olli, 0119, 1213) или штамм S. abortus ovis № 372.

Специфические полисахаридные О-антигены (О-АГ) выделены из Salmonella abortus ovis штамм 372(04); Escherichia coli штамм 320(078), 899(015), 857(086) методом Boivin (1933). Полисахаридная фракция О-ангигена получена по методу Freeman (1942) в модификации Jann et al. (1968).

Для определения анти-О-антител в реакции пассивной ге-маглютинации (РПГА) получали эритроциарный О-диагно-стикум путем адсорбции О-АГ Boivin на клетках. Из вакци-онных штаммов Е. coli (08, 09, 015, 026, 078, 0111, 0117, 086, 0103) был изготовлен поливалентный эритроцитарный диаг-ностикум. Также был использован коммерческий диагности-кум против специфичностей S. abortus ovis. Постановку РПГА осуществляли микрометодом, используя микропанели для однократного применения, с помощью многоканальных микропипеток для титрования.

Проводилось выделение лимфоидных клеток из периферической крови, костного мозга и лимфоидных органов каракульских овец. Для выделения лимфоцитов из крови использовали взятую в стерильных условиях венозную кровь из яремной вены. Использовали метод центрифугирования в одноступенчатом градиенте плотности (A. Boyum, 1968).

Костный мозг выделяли из бедренных и больших берцо-. вых костей овец. После очистки от мышечно-сухожильной массы срезали эпифизы и с помощью шприца с иглой вымывали костный мозг средой 199 из костномозгового канала в стерильный стеклянный бюкс лимфатические узлы (ЛУ), тимус или селезенку извлекали и помещали в стерильные бюк-сы со средой 199 и мелко нарезали глазными ножницами. Приготовление клеточных суспензий производили при +4° С с соблюдением правил асептики.

Способность тимусзависимых Т-лимфоцитов формировать in vitro спонтанные розетки (Е-розетки) с эритроцитами барана явилось основой метода выявления Т-лимфоцитов в периферической крови экспериментальных животных.

Кровь барана, козы, морской свинки, мыши, стабилизированную гепарином, для выделения эритроцитов получали непосредственно в день постановки реакции. В период всех экспериментов для стабилизации стандартных условий использовали эритроциты одного и того же донора.

Для выявления спонтанных розеткообразующих лимфоцитов использовали методы В. М. Суроваса с соавт. (1976) и В. Л. Селодовникова (1979) адаптированные для сельскохозяйственных животных. Под микроскопом подсчитывали не менее 200 лимфоцитов, в том числе розеткообразующие клетки (РОК), и определяли их процентное содержание. Абсолютное количество Е-розеткообразующих лимфоцитов в 1 мкл крови находили по формуле.

B-лимфоциты овец идентифицировали по наличию иммуноглобулинов на поверхности клеточной мембраны. Для образования ЕА и ЕАС-РОК использовали сенсибилизированные соответствующими антисыворотками эритроциты быка (ЭБк). Для идентификации рецепторов к Fe фрагменту молекулы IgG на поверхности лимфоидных клеток использовали технику ЕА-розеток. На первом этапе 'проведения данной реакции (ЕА-розеток) необходимо приготовить индикаторные клетки, т. е. ЭБк, нагруженные антителами. В качестве источника антител служила сухая гемолитическая сыворотка (ГС), полученная из Московского НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова МЗ СССР. Для покрытия ЭБк антителами применяли гемолитическую сыворотку в субагглютинирующей концентрации, которую определяли с помощью реакции гемагглютинации. Подсчет ЕА-розеток 'проводили в тех условиях, что и при оценке результатов Е-розеткообразова-ния.

Принцип и условия постановки реакции ЕАС-розеткообра-зования соответствуют технике ЕА-розеток, только в данном тесте как индикаторные клетки используются ЭБ, покрытые антителами и комплементом. Для "приготовления индикаторных (ЕАС) клеток ЭБ, покрытые антителами (ЕА), сенсибилизировали комплементом сыворотки мышей, разведенной 6 раз вероналовым буфером.

Применили однонаправленный вариант реакции смешанной культуры лимфоцитов (СКЛ) (Hirschhorn et al., 1964), основанный на обработке одной из двух взаимодействующих клеточных популяций ингибитором синтеза ДНК (митомнци-ном С) для исключения возможности этих клеток трансформироваться и пролиферировать под влиянием несовместимых по антигенам главного комплекса гистосовместимости II клас-

са. Лимфоциты каждой особи исследовали перекрестно: как в качестве отвечающих (ОК), так и стимулирующих клеток (СК). Проводили исследование динамики развития реакции, регистрируя пролиферативную активность в тест-культурах через 48, 72, 96, 120, 144 часов инкубации. За 18 часов до прекращения инкубации в каждую лунку вносили радиоактивную метку: ЗН-тимидин в дозе 1 мкКюри. Далее меченые культуры переносили на стекловолоконные фильтры с помощью съемщика клеток — харвестера. Включение метки определяли на сцинтилляционном счетчике Mark III. Уровень реакции СКЛ выражали абсолютным количеством импульсов, зарегистрированных в триплетах в минуту (имп/мин).

Пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови (ЛПК) исследовали с помощью стимуляции РБТЛ фитомитогенами: фитогемагглютинином-П (ФГА-П), конка-навалином А (Кон А), митогеном лаконоса (МЛ). Реакцию выполняли в 96-луночных полисгироловых круглодонных планшетах. В качестве среды культуры при постановке реакции использовали среду RPMI 1640, обогащенную инактнви-рованной ЗСТ (10%). Исследовали стимулирующее действие фитомитогенов в различных концентрациях и в разные сроки инкубации культур клеток. Определенную дозу митогена испытывали в триплетах ( Злуиках). За 18 часов до окончания инкубации клеточных культур в лунки вносили радиоактивную метку — ЗН-тимидин. Меченые культуры инкубировали далее до определенного срока. Затем культуры клеток переносили на стекловолоконные фильтры. Радиоактивность меченых культур измеряли на счетчике в течение 1 минуты. Показатель активности РБТЛ представлял собой среднюю абсолютного числа импульсов, зарегистрированных в триплетах в минуту (имп/мин).

Антилимфоцитарные сыворотки против Т- и В-лимфоцитов овец получали после пятикратной иммунизации кроликов возрастающими дозами жизнеспособных тимоцитов и карио-цитов костного мозга новорожденных ягнят. Полученную АТС инактивировали нагреванием и проводили многоступенчатую адсорбцию. По окончании процедуры адсорбции проводили контроль полноты адсорбции побочных антител в ци-тотоксическом тесте с использованием клеток тимуса, периферической крови (ПК) и костного мозга (КМ). Специфичность АТС проверяли и другим способом, исследовали ее способность ингибировать РОК-

Эксперименты с целью изучения естественной и приобретенной резистентнности проводили на каракульских ягнятах в возрасте 2 месяцев, а также суягных овцах. Все подопытные животные отселекционированы по степени иммунного ответа либо на колибактериозную, либо на сальмонеллезную вакцины. Подопытные ягнята в зависимости от отвечаемости

на ту или же на другую вакцину подразделялись на 4 группы, а суягные овцы по реагируемости на сальмонеллезную вакцину — на 2 группы. В свою очередь, каждая группа подопытных животных подразделялась на подгруппы интактных и вакционированных коммерческими вакцинами: колибактери-озной или же сальмонеллезной, а также искусственными вакцинирующими комплексами на основе полиэлектролитов. Животные заражались высоковирулентными культурами S. abortus ovis-372 и Е. coli-320 с условной дозой 5 млрд. микробных тел на каждое животное. Микробные штаммы получали из ВГНК.И ветпрепаратов. Для заражения брали 18-часовые культуры возбудителей, выращенных на агаре Хоттингера. Культуры Е. coli вводили per os с молоком, инфицирование культурой S. abortus ovis осуществляли как ягнятам, так и суягным овцам внутрибрюшинно. Ягнят заражали не ранее чем через месяц после вакцинации, овцематок на 110—115 день суягности. Степень зараженности учитывали по гибели ягнят при заражении Е. coli, по бактеримии и заболеваемости у ягнят, то наличию абортов при заражении суягных овец культурой S. abortus ovis, одновременно проводили высевы из внутренних органов погибших животных, околоплодной жидкости абортированных плодов, а также из крови и кала зараженных животных. Учет клинической тяжести инфекции и гибели животных вели в течение 3 месяцев.

Полученные экспериментальные данные обрабатывали статистически, достоверность различий в выборках определялась с помощью критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Индивидуальные различия в иммунном ответе у каракульских овец при иммунизации коммерческими корпускулярными вакцинами

В соответствии с поставленными задачами в начальной стадии работы проведено исследование по выявлению индивидуальных различий в антителообразовании среди овец каракульской .породы яри иммунизации их колибактериозной и сальмонеллезной вакцинами. Данные о распределении животных ло силе иммунного ответа (высокая, низкая или средняя степень реакции) в популяции иммунизи.рованных овец приведены в табл. 1.

Из взятых в опыт животных наиболее высокую способность вырабатывать агглютинины на колибактериозную вакцину'проявили 51 ярочка (8,65%) и 6 баранчиков (8%). Таким образом число высокореагирующих особей в популяции было незначительным и не превышало 10%• Число низкоот-вечающих на Е. coli вакцину особей в популяции также бы-

Таблица 1

Распределение животных по силе иммунного ответа в популяции каракульских овец, иммунизированных колибактериозной и сальмонеллезной вакцинами

Вакцина Пол животных Всего животных Максим, титры антител

1 : 800 и выше 1:100 I : 200 1 :200 11 800

Колибактериозная Сальмонеллезная Ярочки Баранчики Ярочки Баранчики 590 76 590 76 51 6 65 7 27 4 41 4 503 66 484 65

ло низким — 4,56% ярочек и 5% баранчиков. Остальные особи заняли промежуточное положение по силе гуморального ответа и превалировали в ¡популяции—больше 80%. На 12— 20-й день ,после иммунизации каракульских ягнят вакциной кратность различия иммунного ответа оппозитнореагирующих особей составляла 12—28. Хотя динамика ответа варьировала у разных особей, максимума ответ достигал на 20-й день иммунизации (32-кратное увеличение по сравнению с фоном).

Результаты иммунизации животных против сальмонеллеза показали, что наиболее высокую (в титре 1 : 1600— 1 :3200) способность к развитию иммунного ответа проявили 11% ярочек и 9,2% баранчиков. Следует отметить, что иммунный ответ на сальмонеллезную вакцину на уровне популяции развивался раньше. Примерно у 50% животных, как самцов, так и самок, достигал максимума к 12 дню. Низкий иммунный ответ на сальмонеллезную вакцину наблюдался у 7% ярочек и у 5,2% баранчиков. Иммунный ответ на S. abortus ovis вакцину у высокореагирующих особей был в 16—32 раза выше по сравнению с низкореагирующими. Остальные особи по степени выработки агглютининов на сальмонеллезный антиген заняли промежуточное положение по сравнению с высоко- и слабореагировавшими животными. Интересно, что среди высокоотвечающих особей овец только 9 голов (ярочек 7,7%) отвечали на обе 'вакцины по высокому типу. Подавляющее большинство особей (92,3%) отвечало по высокому типу только на одну вакцину. Таким образом, анализ силы иммунного ответа в популяции овец каракульской породы при первичной иммунизации колибактериозной и сальмонеллезной вакцинами показал, что среди особей, высокореагирующих на один антигенный комплекс, были животные, низкоре-агирующие на другой антигенный комплекс и наоборот, что согласуется с положением о конкретности иммунного ответа выдвинутым Р. В. Петровым.

Селекция каракульских овец на вакцинируемость

Выделив популяции оцпозитнореагирующих овец, мы решали 'принципиальную задачу нашей работы — изучить возможность селекции овец на отвечаемость к вакцинам. Этапы скрещивания имели своей целью, с одной стороны, ¡получение животных с выраженным ¡признаком силы иммунного ответа (высоким или низким), с другой стороны, выведение достаточного для селекции количества таких животных.

Анализ уровня иммунного ответа у гибридов первого поколения показал, что большинство гибридов И1, полученные при скрещивании высокореагирующих на колибактериозный и сальмонеллезный антигены родителей, проявили способность вырабатывать соответствующие агглютинины на уровне родительских пар. При иммунизации колибактериозной вакциной высокореагирующих на нее родителей титр антител у Р1 гибридов был 1 :800 и выше, а три вакцинации сальмонел-лезной вакциной высокореагирующих на нее родителей — 1 : 1600 и выше (рис. 1, а, б). Сниженные титры антител зарегистрированы у 5 овец из 70 гибридов И1, полученных от высокореагирующих на колибактериозную вакцину родителей, (7,1%), а также в 6 (7,6%) случаях из 77 голов гибридов, полученных от овец высокореагирующих на сальмонеллезную вакцину.

Подавляющее большинство гибридов РI, полученных при скрещивании низкореагирующих как на колибактериозную (кроме трех особей), так и на сальмонеллезную (кроме четырех особей) вакцины родительских особей, проявило низкую способность вырабатывать агглютинины против этих вакцин (рис. 2, а, б). У указанных гибридов титры антител равны при вакцинации колибактериозной вакциной 1: 100 и (только в трех случаях 1:400), а при иммунизации сальмо-неллезной вакциной— 1:200 (только в четырех случаях 1 : 800), Иммунный ответ у 7 особей из 81 гибрида этой группы превысил титры антител у родителей.

Таким образом, в результате скрещивания 'процент особей, не наследовавших иммунную отвечаемость родителей, был незначителен, что свидетельствует о возможности эффективной селекции овец на отвечаемость к вакцинации. Полигенный характер наследования иммунной отвечаемости к сложным антигенным комплексам—вакцинам определяет характер сложного доминирования при передаче признака от родителей к потомкам. Этим можно объяснить появление при таких селекциях особей с инвертированным по отношению к родителям типом иммунной отвечаемости.

На следующих этапах скрещивания (поколения Р2 и РЗ) продолжали дальнейшую селекцию популяций овец по признаку иммунной отвечаемости. В литературе имеются данные

(Biozzi е. a., 1974), о том, что при направленном отборе в популяции неинбредных мышей линии Swiss по способности отвечать на эритроциты барана получили в 9-й генерации 30-кратные различия в титрах антител между высоко- и низ-кореагирующими субпопуляциями. В других экспериментах анализировали способность беспородных кроликов и мышей отвечать на бычий сывороточный альбумин (БСА). В 5-й генерации 90% животных, шрошедших селекционный отбор, способны высоко реагировать на БСА. Малое количество требующихся генераций при направленном отборе животных с контрастирующим ответом обнаружено в других работах (Lunney et. al„ 1981; Vaiman, 1978; Van der Zijpp, 1983, 1984; Warner et. al., 1987). Нам также удалось получить популяции оппозитнореагирующих каракульских овец при сравнительно небольшом числе поколений скрещивания. Особи F3— четвертое поколение оппозитнореагирующих овец, включая родителей — различались по своей генетически обусловленной способности вырабатывать антитела в 16—32 раза.

Таким образом, в целом, было получено достаточно стабильное закрепление в популяции признака высокой или низкой отвечаемости. Одной из причин этого мы видим в популя-ционных особенностях овец каракульской породы, которые мы также пытались проанализировать иммуногенетическими методами. Анализируя закономерности контроля иммунного ответа к вакцинам, можно отметить некоторые закономерности. Наиболее сложный характер отвечаемости на уровне популяции характерен для высокоотвечающих овец. Среди таких особей характерны варьируемость иммунного ответа, даже в поколении F3. Оставаясь высоким, такой ответ может иметь и особенности в динамике накопления антител. Способность к низкому иммунному ответу каракульских овец наблюдается более четко. В поколениях F2 и F3 выщепившихся особей по этому признаку не обнаружено.

Оценка степени генетического полиморфизма селектированных по силе иммунного ответа популяций овец

Выведение экономически ценных форм сельскохозяйственных животных и поддержание у них желательных качеств нуждается в критериях оценки селекционной работы. Искусственный отбор по желательным признакам проводится, как •правило, в немногочисленной по;пуляции, что неизбежно сопровождается близкородственным скрещиванием. Результатом такого инбридинга является снижение генетического •полиморфизма .популяции. Вследствие этого 'представляется обоснованным оценка степени генетического 'полиморфизма >в ин-бредной популяции.

Среди множества генетических систем млекопитающих наиболее изученной у большого числа видов в настоящее время является главная система гистосовместимости — МНС, ответственная за генетическую стабильность организма и иммунную защиту и имеющая аналогичное строение у всех изученных до сих пор видов, в том числе овцы (Puri е. а., 1985). Исследование МНС-фенотипа и генотипа на сегодня является одним из наиболее точных и информативных способов определения индивидуальности организма. Иммуногенетическое и иммунологическое исследования системы МНС, выполненные на популяционном уровне, позволяет определить частоту встречаемости и особенности распределения антигенов I и II классов в популяции, характеризуя тем самым генетическое разнообразие (полиморфизм) популяции и генетическую дистанцию до любой другой популяции данного вида.

Система МНС до настоящего времени интенсивно исследуется с помощью специальных реагентов, способных открывать конкретные антигены: типирующих антисывороток для идентификации антигенов I класса и антигенов II класса и типирующих клеток для выявления антигенов класса II. К сожалению, в нашей стране отсутствуют типирующие реагенты, необходимые для выявления антигенов I и II классов овец. Однако для оценки у них степени индивидуальных МНС-различий все же имеется принципиальная возможность. Дело в том, что реакция смешанной культуры лимфоцитов (СКЛ), исследованная в комбинациях между двумя тест-партнерами, позволяет количественно измерить степень их совместимости по антигенам класса II (у человека — по антигенам HLA-Dw и HLA-DR); аналог последнего выявлен, в частности, у крупного рогатого скота и овец (Andersson, Rast, 1988; Scott е. а., 1987). Мы сочли целесообразным использовать СКЛ для оценки степени инбридинга овец каракульской породы в стаде, в котором селекцию животных проводили по признаку силы иммунного ответа на сальмонеллезную вакцину.

Использовали овец каракульской породы, селектированных по признаку силы иммунного ответа (по уровню антите-логенеза) на сальмонеллезную вакцину, и неселектированных по данному признаку овец каракульской породы (труппа сравнения), из стада которых выделены и инбридированы овцы 1-й группы. Использовали гибриды F2 также с высоким иммунным ответом — потомков от скрещивания высокоотвечаю-щих особей Fl, т. е. использовали третье поколение высокоре-агирующих на сальмонеллезную вакцину овец каракульской породы.

Данные исследования СКЛ у каракульских овец при продолжительности инкубации культур в течение 120 часов представлены в табл. 2. Приведенные данные свидетельствуют, что СКЛ-ответ в тест-комбинациях, составленных из клеток

селектированных каракульских овец, является значительно более низким, чем в комбинациях со стимулирующими клетками от неселектированных животных: 4,1 ±0,4 и 25,0± ±2,2 имп/мин, соответственно, (Р<0,005); достоверно более высокими являются показатели реакции в тест-комбинациях между неселективными овцами в комбинациях, в которых лимфоциты неселективных овец стимулировали клетками селектированных особей: 4,1 ±0,4, 22,2±2,8 и 20,8±1,5 имп/мин, соответственно (Р<0,005).

Таблица 2

Уровень реакции СКЛ у каракульских овец на пике развития (120 часов)

Донор отвечающей популяции Показатель уровня реакции СКЛ (имп/минх 10" 3)

Донор стимулирующей популяции

се л ек тд р о в а н н ы й неселектированный

Селектированный Неселектированный 4,1 + 0,4 (я = 285) 20,8+1,5 (л =127) 25,0 + 2,2 (я = 87) 22,2 + 2,8 (п = 30)

Полученные результаты позволяют предположить, что резко сниженные показатели активности реакции СКЛ у селектированных каракульских овец возможно связаны с ограниченны полиморфизмом МНС-аллелей II класса, сложившегося в результате близкородственного скрещивания внутри ограниченной популяции.

Данное предположение основывается на анализе результатов исследования СКЛ у селектированных и неселектированных каракульских овец во взаимноперекрестных тест-комбинациях. Низкие уровни СКЛ ответа у селектированных каракульских овец, возможно, связаны со значительной степенью идентичности тест-партнеров по МНС-антигенам II класса. Низкий уровень СКЛ в данном случае может быть также связан и с гомозиготным состоянием овец в этом стаде. Однако такому предположению противоречат результаты экспериментов, приведенные в табл. 2, из которых следует, что каракульские овцы могут слабо реагировать при распознавании чужеродных антигенов, но одновременно быть активными стимуляторами, и наоборот.

Т. е., если бы в этом стаде доля гомозиготных особей была бы ощутимой, то уровни СКЛ в реципрокных тест-комбинациях отличались меньшим разбросом. Каракульские овцы из данного стада, возможно, имеют высокую частоту встречаемости определенных антигенов II класса, как следствие селекционной работы, но не приведшей пока к появлению заметной доли гомозигот. Таким образом, в результате прове-

денного исследования получены данные, свидетельствующие, что установленный в настоящем исследовании высокий уровень инбридинга уже у третьего поколения селектированных овец каракульской породы объясняется, вероятно, тем, что исходным материалом для селекции служили не случайные животные, а-частично уже селектированные особи по причине своей принадлежности к каракульской породе.

Изучение иммунного статуса овец каракульской породы

Оценка функциональных изменений иммунной системы овец в результате селекции на вакцинируемость потребовали специальных исследований по изучению иммунного статуса этого вида животных. Так как Т- и В-системы иммунитета являются базисными для любого вида млекопитающих, основное внимание было уделено разработке методов количественной оценки Т-, В-клеток и их функциональной активности. Проведено изучение и возрастных изменений иммунного статуса, в связи с тем, что иммунизация животных и селекция особой происходят в сравнительно молодом возрасте. Первостепенной задачей явились поиск и разработка адекватных условий и маркеров для идентификации Т- и В-лим-фоцитов у овец. Это делалось на основе феномена розеткооб-разования. При постановке реакции розеткообразования и поиск наиболее подходящего маркера для Т-лимфоцитов овец исходили из общебиологической закономерности, что Т-лим-фоциты имеют на своей поверхности макромолекулярные структуры — Е-рецепторы, присоединяющие гетерологичные эритроциты, образуя спонтанные Е-розетки. Поиск специфического эригроцитарного маркера для субпопуляций лимфоцитов проводили с использованием эритроцитов доступных лабораторных (мыши, морские свинки, кролики) и сельскохозяйственных (бык, коза) животных (рис. 3).

В результате исследований установлено, что ни один вид лимфоцитов овец не несет непосредственно поверхностного рецептора к эритроцитам быка. Наиболее активно розеткооб-разование проходило с Экз и лимфоцитами периферической крови; лимфоциты тимуса и селезенки давали самый высокий процент ЭКз-РОК. Для изучения поверхностных антигенов Т-лимфоцитов, а также для проверки специфичности формирования розеток готовили иммунную сыворотку к Т-лимфо-цитам овцы. Опыты с удалением Т-клеток с АТС в сочетании с последующим розегкообразованием позволили предположить, что ЭКз образуют розетки с клетками тимусного происхождения— Т-лимфоцитами. В-лимфоциты овец могут определяться в тестах ЕА- и ЕАС-РОК с ЭБк. Результаты этих тестов оказались близкими с розеткообразованием с эритроцитами морской свинки. Лимфоциты, образующие ЕА- и

Стпш ют розтповш^г^н^ь

JlOt.lv > I '

РОК,0/. 50

40

го

ю

о

я

I

(5

ь

12 3 4 5

ТС.^.» лг'тЛ

итактные лимфоциты

ш,

ш

т

'л.'-т'Х—

# 1

1

I

Й

т-

12 3 4 5 12 3 4 5

обработанные обработанные

антитишци- ттикостно-

тарной сыво- мозговой сыво-

риткои риткои

1 - эритроцит о / мыши

2 - эритроцита/ козы

3 -эритроциты морем и сбинкх;

4 - эритроциты кроликр

5 -эритроциты о'ы/т

ЕАС-РОК, в "основном, локализованы в костном мозге и чувствительны к обработке анти-В-сывороткой. Таким образом, нами с помощью двух методов — реакции розеткообразования и ЦТТ получены данные, характеризующие распределение популяций и субпопуляций Т- и В-лимфоцитов в различных лимфоидных органах овец каракульской породы. Эти методы могут быть использованы для количественного исследования Т- и В-лимфоцитов у каракульских овец.

Для изучения функциональной активности Т- и В-лпмфо-цитов в наших опытах использовали РБТЛ периферической крови овец, индуцированной мнтогенами: ФГА, КонА и МЛ. Исследование пролиферативной активности ЛПК овец каракульской породы в ответ на стимуляцию этими фитомнтоге-нами проведено с целью выяснения влияния искусственного отбора, проведенного по признаку силы иммунной реакции (антителогенеза) на сальмонеллезную вакцину овец этой породы на функциональную активность лимфоцитов. Так как исследование реакции бласттраисформации лимфоцитов каракульских овец до сих пор не проводилось, то возникла необходимость изучить характер развития РБТЛ. Исследована динамика реакции и ее уровень в зависимости от дозы ми-тогена.

Характер развития реакции типичен для РБТЛ, исследованной у других видов животных — пик реакции выявляется через 72 часа инкубации, стимулированных ФГА и КонА лимфоцитов периферической крови (рис. 4). Результаты исследования РБТЛ в трех группах (высокореагирующие, низкореа-гирующие, неселектированные) показали, что селекция животных по признаку силы иммунного ответа на сальмонеллезную вакцину практически не отражаются на реактивности Т-лимфоцитов периферической крови, стимулированных ФГА. Уровни РБТЛ, стимулированные КонА или ФГА, на сроках развития реакции 48—72—96 часов, достоверно не отличаются (Р>0,05). Использование различных концентраций КонА в исследовании динамики развития РБТЛ позволило обнаружить, что пик РБТЛ в сроки инкубации клеточных культур 48—72—96 часов индуцируется разными дозами КонА. Так, в группе селектированных овец, низкореагирующих на вакцину, концентрация КонА 20 мкг/мл оптимальна при сроке инкубации культур клеток 48 часов; 10 мкг/мл — 72 часа; 15— 20 мкг/мл — 96 часов. Но в группе селектированных овец, высокореагирующих на сальмонеллезную вакцину, нет заметного различия в оптимальных концентрациях КонА при сроках инкубации 48 часов (15 мкг/мл), 72 часа (10— 15 мкг/мл), 96 часов (10—15 мкг/мл). Нет различия и в группе неселектированных овец, где оптимальными концентрациями являлись 15—20 мкг/мл КонА. Несовпадение величин оптимальных концентраций КонА при разных сроках ин-

кубации лимфоцитов каракульских овец низкоотвечающей группы связано, вероятно, с включением в пролиферативную реакцию функционально различных субпопуляций Т-лимфо-цитов, характеризующихся неодинаковой чувствительностью к КонА на разных сроках развития РБТЛ.

РБТЛ высокоотвечающих на вакцину овец, индуцированная МЛ в культуре лимфоцитов, достигает максимума после 96—120 часов инкубации (рис. 4). Причем оптимальная концентрация МЛ равняется 0,25 мкг/мл при сроке инкубации культур 96 часов; а при инкубации в течение 120 часов оптимальная доза митогена составляет 1—2,5 мкг/мл. Концентрация митогена 2,5 мкг/мл оптимальна при инкубации МЛ-стимулированных культур в течение 48 и 72 часов. Иной характер РБТЛ, стимулированной МЛ, отмечен при исследовании низкоотвечающих овец. Пик пролиферации отмечен через 72 часа инкубации лимфоцитов при концентрации МЛ 0,5 и 1 мкг/мл. Однако не было достоверного отличия между уровнями РБТЛ, зарегистрированным через 72—96—120 часов инкубации культур, т. е. оптимальная концентрация МЛ на всех сроках инкубации равна 0,5—1 мкг/мл. Развитие РБТЛ, стимулированной МЛ, в группе неселектирован-ных, невакцинированных овец каракульской породы (контрольная группа) имеет такой характер: максимальный уровень пролиферации клеток зарегистрирован при сроке инкубации 120 часов при дозе митогена 2,5 мкг/мл. Уровни проявления РБТЛ через 72 и 96 часов достоверно не отличаются от уровня при инкубации в течение 120 часов, но оптимальная концентрация МЛ при этом меньше—1 мкг/мл. Можно предположить, что селекция по силе иммунного ответа вызвала изменения в составе В-клеточного 'пула в реакции на митогенные стимулы. РБТЛ, стимулированной МЛ, может быть использована для установления потенциальной способности животных разного генотипа к иммунному ответу (антителогенезу).

Анализ генетических механизмов резистентности селектированных овец к кишечным инфекциям

Связь между иммунным ответом и естественной резистентностью к инфекции не всегда однозначна. В связи с чем в последние годы механизмы естественной резистентности организма к инфекциям активно изучаются (Авербах М. М. и др., 1985; Зкагпепе е. а., 1981, 1985). Предполагается, что генетически детерминированное внутривидовое разнообразие животных в отношении восприимчивости к инфекции является следствием различий в функционировании различных звеньев иммунитета против данной инфекции (В 10221 и др., 1985).

hccjj^mfm фунщионмьнсм escrmuoc-

Т'7 1- И В~1№МФ0ШтВ №Щ СЕЛЕКТИВНЫХ

w ¡-шгтштш групп о$щ, стимули-

Р0№ ИШ ММТСГЕНДМИ

1-дь /сокоотбечающие на S aöortus ovis

2-низкоотдечающие на 5. aBortus ovis 3 - неселектиробанные

цмп/мии

72 час

20 40 60 до 100 120 фгя (мкг/мл)

имп/мин xfo3

96 час

72 час

¿О АО GO 80 100 120

КонД (мкг/мл)

120 час

0,25 0.50 1,00 2,00 2.50 5,0 МЛ (мкг/мл)

(1,510 2,5 5,0

МЛ (мкг/мл)

Предметом исследования этого раздела явилось изучение вопроса о связи различий в силе иммунного ответа у высоко- или низкореагирующих генетических групп овец на эше-рихиозную и сальмонеллезную вакцины с резистентностью животных к этим инфекциям. Существует ли разница в заболеваемости и гибели между оппозитнореагирующнми на ту нли иную вакцину группами овец при заражении их соответствующими вирулентными культурами? Проявляются ли эти различия у интактных и у вакцинированных коммерческими корпускулярными, или же искусственными вакцинирующими комплексными соединениями, овец? Исследовалась также возможность коррекции естественной резистентности организма овец с различной силой иммунного ответа на вакцинацию с помощью синтетических полиэлектролитов к инфекции. Выведение популяции овец с различным иммунным ответом к антигенам возбудителей кишечных инфекций позволяет провести уникальный анализ взаимосвязи естественного иммунитета и развития гуморального иммунного ответа. Таких данных для овец нами в литературе не обнаружено вне зависимости ог породы.

Эти опыты проведены на 72 каракульских ягнятах в возрасте 2 месяцев, а также на 33 суягных овцах. Все подопытные животные селектированы по степени иммунного ответа либо на колибактериозную, либо на сальмонеллезную вакцины. В каждой группе подопытных животных были подгруппы невакцинированных ягнят или овец, а из остальных животных в зависимости от степени отвечаемости на ту или другую вакцину, одна иммунизировалась коммерческой вакциной, а другая соответствующей искусственной полимерной вакциной. Вакцинацию искусственными вакцинирующими комплексами (ИВК) осуществляли в дозе 0,1 мг/кг веса по полисахариду.

Полученные нами данны 1 по естественной резистентности популяций линий овец свидетельствуют об отсутствии прямой взаимосвязи между способностью овцы к развитию гуморального иммунного ответа к антигенам возбудителей кишечных инфекций и резистентностью к этим инфекциям (табл. 3). То есть можно предполагать, что развитие иммунного ответа даже у высокоотвечающих овец опаздывает в сравнении с уровнем развития инфекции у овец. Это еще раз подтверждает давно принятую ветеринарами-практиками необходимость вакцинации с целью запуска специфического иммунного ответа как важного протективного механизма. Обобщая эти данные, можно заключить, что межпопуляционные различия селектированных по иммунному ответу к инфекционным антигенам овец проявляются не на уровне естественной резистентности, а на уровне приобретенного иммунитета. Это позволяет сделать важное предположение о том, что гены, контроли-

2*

19

Таблица 3

Резистентность интактных и иммунизированных коммерческой и искусственной полимерной противоэшерихиозной и сальмонеллезной вакцинами оппозитнореагирукнцих групп овец при заражении Е. coli штамм № 320-078 и S. abortus ovis штамм № 372-04

Выживае- Результаты

заражения

мость S. abortus ovis

Опиозитнореагирующие Типы животных

группы ягнят и овец вакцины при заражении высев аборти-

Е. coli, % из крови рован-

(ягнята), ные

% овцы, %

Высокореагирующие интактные ■'13% (3/9) 83 67

Низкореагнрующие интактные 0% (0/9) 100 100

Высокореагирующие ИВК 100% (9/9) 0 0

Низкореагнрующие ИВК 80% (8/10) 0 0

Высокореагирующие коммерч. 83% (5/6) 0 0

Низкореагнрующие коммерч. 0% (6/6) 83 100

рующие выраженность признака у селектированных овец не относятся к категории генов резистентности/чувствительности, а представляют собой гены иммунного ответа.

Селекция на гуморальный иммунный ответ овец каракульской породы позволила получить популяцию овец резистентных к инфекции после иммунизации обычной коммерческой корпускулярной вакциной. Таким образом, эффект защиты достигнут не путем разработки иммунопрепарата повышенной эффективности, а путем получения популяции генетически способной к высокому иммунному ответу. Коммерческая противоэширихиозная вакцина обеспечивала 83%-ную выживаемость овец при заражении, эффективность подобной сальмонеллезной вакцины по критериям высеваемости возбудителя от ягнят или абортированности суягных маток была 100%-ной. Однако эти препараты оказались крайне неэффективными при иммунизации низкоотвечающих овец.

При иммунизации ИВК различия в поствакцинальной резистентности групп овец к заражению были более мягкими, они нивелировались искусственным иммуногеном, т. е. отмечалась фенотипическая коррекция приобретенного иммунитета. Результаты этих опытов также свидетельствуют об эффективности искусственных вакцинирующих комплексов и о перспективности создания таких вакцинирующих соединений против различных возбудителей инфекций с использованием очищенного протективного антигена и полиэлектролита-поси-теля, обладающего иммуностимулирующим действием.

Какие реакции иммунной системы лежат в основе различий вакцинируемое™, то есть способствуют фенотипической

коррекции? Для ответа на этот вопрос мы изучали гуморальные и клеточные иммунные реакции у вакцинированных групп овец. Установлено, что все особи подопытных животных, вакцинированные коммерческими (как колибактериозной, так и сальмонеллезиой) вакцинами, отвечали в зависимости от генотипа. Так, особи (высокореагнрующие на колибактериоз-ную вакцину) группы подопытных животных при вакцинации колибактериозной корпускулярной вакциной на пике иммунного ответа (на 20-й день иммунизации) реагировали по высокому типу с накоплением специфических противоэширихи-озных антител в РА в титре 1 : 800 и 1 : 1600, а в РИГА — в титре 1:1024—1:2048, то все шесть представителей (низко-реагирующие на эту вакцину) при вакцинации данной вакциной проявляли иммунный ответ по низкому типу с накоплением специфических антител в РА в титре 1 : 100 и 1 :200, а в РИГА — 1:32—1 : 64. Точно такая же картина наблюдалась у оппозитнореагирующих групп на сальмонеллезную вакцину овец при вакцинации их коммерческой сальмонеллезиой вакциной.

Иная ситуация наблюдалась в подопытных группах каракульских ярочек и баранчиков, иммунизированных ИВК. Высокий тип иммунного ответа, независимо от генотипа подопытных животных, наблюдался, практически, у всех представителей, которые иммунизированы дозой 0,1 мг/кг веса животных по полисахариду. Доза 0,01 мг/кг для ИВК была субоптимальной. Полученные данные по гуморальному иммунному ответу у вакцинированных групп овец при сопоставлении с выживаемостью животных при заражении свидетельствуют, что в тех случаях, когда наблюдается эффективная защита животных, особенно низкореагирующих, отмечается индукция вакциной выработки специфических антител. Запуск такого ответа является важнейшим условием создания поствакцинальной резистентности к инфекции. С этой точки зрения работы по селекции популяций овец с генетически заложенными различиями именно по этому признаку нам представляются оправданными как в исследовательском, так и в прикладном плане.

Совокупность представленных в работе данных свидетельствует, что иммуноселекция, проведенная на каракульских овцах, представляет собой комплексный иммуногенетический феномен. Влияние селекции установлено не только на гуморальный иммунный ответ, но и на другие иммунобиологические реакции каракульских овец: поствакцинальный иммунитет, реакцию СКЛ, отвечаемость клеток in vitro при стимуляции митогенами. Это еще одно доказательство в пользу сложности системы Ir-генов, контролирующих ответ к бактериальным вакцинам.

выводы

1. Гуморальный иммунный ответ при иммунизации овец каракульской породы колибактериозной или сальмонеллез-ной вакцинами имеет четкие индивидуальные различия для каждого из иммуногенов и может быть определен как высокий, низкий или промежуточный. Подавляющее большинство неселективной популяции составляют особи с промежуточным типом реагирования.

2. В результате последовательных скрещиваний каракульских овец с оппозигным типом иммунного ответа в четвертом поколении получены высоко- и низкоотвечающие на каждую из вакцин группы овец.

3. Наследование способности к высокому или низкому иммунному ответу у овец селектированных групп носит характер сложного доминирования и контролируется значительным числом генов.

4. Селекция каракульских овец на вакцинируемость приводит к снижению уровня полиморфизма в каждой из выводимых популяций, оцениваемому по реакции СКЛ.

5. Популяции Т- и В-лимфоцитов каракульских овец несут мембранные рецепторы к нескольким видам аллогенных эритроцитов и могут быть охарактеризованы в реакциях розет-кообразования. Дифференциальными маркерами могут быть: для Т-лимфоцитов — эритроциты козы, для В-лимфоцитов — эритроциты морской свинки.

6. Содержание Т- и В-лимфоцитов у каракульских овец имеет тенденцию к увеличению с возрастом вне зависимости от силы иммунного ответа на испытанные антигены.

7. Пролиферативный ответ ЛПК каракульских овец на стимуляцию ФГА и КонА по условиям индукции и по динамике не имеет существенных отличий от РБТЛ других видов животных.

8. Иммуноселекция овец влияет на функциональную активность ЛПК in vitro в ответ на стимуляцию митогеном ла-коноса.

9. Гены, контролирующие иммунный ответ к кишечным вакцинам селектированных групп каракульских овец, относятся к категории генов иммунного ответа — Ir-генов, а не к генам естественной резистентности.

10. Высокоотвечающие популяции селектированных овец обеспечивают высокий уровень приобретенного иммунитета даже при иммунизации коммерческой корпускулярной вакциной умеренной иммуногенности.

11. Основным механизмом фенотипической коррекции про-тективного иммунитета у селектированных овец с помощью ИВК является независимая от генотипа индукция высокого гуморального иммунного ответа.

Опубликованные работы по теме диссертации

1. Петров Р. В., Хаитов Р. М., Бочкарев Н. Г., Душа-

нов А. Д. Генетика иммунного ответа каракульских овец лри вакцинации колибактериозной и сальмонеллезной вакцинами. Сообщ. 1 Индивидуальные различия в иммунном ответе.— Журнал микробиол., эппдемиол. и иммунобиология, 1982, № 10, стр. 81—83.

2. Душанов А. Д., Петров Р. В., Хаитов Р. М. Генетика иммунного ответа каракульских овец лри вакцинации колибак-териозной и сальмонеллезной вакцинами. Сообщ. 2 Анализ силы иммунного ответа у гибридов первого поколения.— Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиология, 1983, № 10, стр. 79—81.

3. Душанов А. Д. Иммунный ответ у гибридов первого 'поколения каракульских овец при вакцинации колибактериоз-ной и сальмонеллезной вакцинами. Тезисы научных сообщений III съезда физиологов Узбекистана.

4. Душанов А. Д. Субтюпуляции лимфоцитов овец формирующих розетки с эритроцитами разных видов животных.— Иммунология, 1986, № 5, стр. 24—26.

5. Petrov R. V., Khaitov R. M., Alekseeva N. Yii., Du-shanov A. D., Medvedev S. A., Nekrasov A- V. Synthetic vaccines against salmonellosis in experiments on laboratory and farm animals.— In abstract book of the Eighth European immunology meeting, Zagreb, 1987, p. 173.

6. Душанов А. Д., Петров P. В., Хаитов P. M. Генетика иммунного ответа каракульских овец при вакцинации коли-бактериозной и сальмонеллезной вакцинами. Анализ силы иммунного ответа у гибридов второго поколения и обратного скрещивания. — Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиология, 1987, № 1, стр. 80—84.

7. Априкян В. С., Сергеев Ю. О., Михайлова А. А., Душа-нов А. Д., Алферова Е. М., Кнбза С. В. Стимулирующее влияние миело'пептидов на выработку антител к антигенам бактерий рода Сальмонелл. — Иммунология, 1987, № 6, стр. 69— 70.

8. Сергеев Ю. О., Априкян В. С., Михайлова А. А., Душа-

нов А. Д. Использование миелопептндов для коррекции иммунного ответа к бактериям кишечной группы. Тезисы докладов Всесоюзной конференции «Актуальные проблемы иммунологии, иммунодефицнты и иммунокорректоры», Владивосток, 1987, стр. 57.

9. Душанов А. Д., Муртазаева М. У., Тилляев М. У. Коррекция иммунного ответа отпозитнореагирующих особен каракульских овец конъюгированными с полиэлектролитным стимулятором антигенами сальмонелл и эшерихнй. — Матер, секции фармакологии и токсикологии ВАСХНИЛ по пробле-

ме фармакорегуляции воспроизводства и роста молодняка сельскохозяйственных животных, Самарканд, 1987, стр. 289.

10. Душанов А. Д., Муртазаева М. У., Арборов А. А. Возрастная динамика содержания субпопуляций лимфоцитов в периферической крови овец. Тезисы научных сообщений IV съезда физиологов Узбекистана, 1988, стр. 65—66.

11. Душанов А. Д., Муртазаева М. У. Коррекция иммунного ответа каракульских овец синтетическими полиэлектролитами.—Тезисы докладов IV Всесоюзного съезда патофизиологов. Кишинев, 1989, стр. 1322.

12. Петров Р. В., Хаитов Р. М., Некрасов А. В., Борисова В. Н., Королева С. К., Алексеева Н. Ю., Душанов А. Д., Медведев С. А., Апарин П. Г., Нажмитдинов А. М., Доморад-ская Т. И., Богданова Н. Б. Способ получения .производного полисахарида микробного происхождения. — Авт. свид. на изобретение № 1462755, приоритет от 28 .марта 1986 года, зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР от 1 ноября 1988 года.

13. Душанов А. Д., Полунин А. И. Оценка степени инбридинга овец каракульской ¡породы, селектированных по признаку силы иммунного ответа, методом смешанной культуры лимфоцитов. — Иммунология, 1989, № 4, стр. 35—38.

14. Апарин П. Г., Душанов А. Д., Хаитов Р. М. Иммуноге-нетические аспекты взаимоотношений хозяин — паразит на модели сальмонеллезной инфекции. — Усп. совр. биол., 1990, том 110, вып. 3(6), стр. 378—395.

15. Dushanov A. D. Effect of vaccination by means commercial and synthetic colibacteriosis and salmonellosis vaccines of opposite responding genetic groups karakul sheep.—Constituent congress international society for pathophysiology. Moscou, 1991, p. 173. Abstracts.

lp. Dushanov A. D. Effect of vaccination by commercial and synthetic colibacteriosis and salmonellosis vaccines of high and low reactive denetic groups of karakul sheep. — Constituent congress international society for pathophysiology, Moscow, 1991, p. 358. Abstracts.

Подписано в печать 16.10.1991 г. Формат 60X90/16 Объем 1,5 п. л.+ 4 вкл. Тираж 100 экз. Заказ № 590.

Типография Московского горного института. Ленинский проспект, 6