Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Феноменология иммунного ответа на Т-независимые антигены 2-го типа

На правах рукописи %

ЧЕРНЫШОВА Ирина Николаевна

ФЕНОМЕНОЛОГИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА НА Т-НЕЗАВИСИМЫЕ АНТИГЕНЫ 2-ГО ТИПА

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2012

005018744

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Сидорова Екатерина Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Нагиева Фирая Галиевна ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН заведующая лабораторией гибридных клеточных культур

доктор биологических наук Данилова Татьяна Абрамовна ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России ведущий научный сотрудник лаборатории регуляции иммунитета

Ведущая организация:

ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина»

Защита состоится 17 мая 2012г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН по адресу: 105064, Москва, Малый Казенный пер., д. 5а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН

Автореферат разослан «А6» циа^ЮНг. Ученый секретарь диссертационного совета

РАМН

кандидат биологических наук

И.В. Яковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Антигены (АГ) подразделяются на тимус-зависимые (ТЗ) и тимус-независимые (ТН) АГ. В свою очередь, ТН АГ делятся на антигены 1-го (ТН-1) и 2-го (ТН-2) типов. ТН-1 АГ, например ли-пополисахариды (ЛПС), обладают митогенной активностью и индуцируют образование иммуноглобулинов (ИГ) любыми В клетками. В низких дозах ТН-1 АГ ведут себя как «обычные» иммуногены и стимулируют В клетки со специфическими ИГ-рецепторами [Coutinho A. et al, 1974; Рое W.J. et al, 1976].

ТН-2 АГ представляют собой гетерогенную группу соединений. К ним относятся многие бактериальные полисахариды, полимеризованный флагел-лин, АГ-компоненты некоторых вирусов, а также синтетические АГ - поли-винилпироллидон (ПВП), полипептиды из D-аминокислот, конъюгаты гапте-нов с ТН-носителями и др. В отличие от ТН-1 АГ митогенной активностью они не обладают [Mond J.J. et al, 1995; Сидорова E.B, 2002].

Ответ на ТН-2 АГ не рестриктирован по МНС, хотя Т клетки и Т-факторы могут на него влиять [Mond J.J. et al, 1995; Jeurissen A. et al, 2004]. AT, образующиеся в ходе ответа на ТН-2 АГ, в основном относятся к IgM изотипу, хотя в некоторых случаях образуются AT IgG и IgA классов [Snapper С.М. et al, 1992; Fagarasan S et al, 2000; McKisis M.D. et al, 2000].

Молекулярные и клеточные механизмы образования AT к ТН-2 АГ до сих пор до конца не выяснены; мало данных о феноменологии иммунного ответа, не изучены взаимодействия В клеток, отвечающих на ТН-2 АГ, с другими клеточными популяциями, не установлен механизм переключения синтеза ИГ с IgM на IgG и IgA изотипы и т.д. Ответы на эти и другие вопросы имеют не только теоретическое, но и практическое значение. ТН-2 АГ входят в состав многих бактерий и некоторые вирусов, вызывающих ряд опасных заболеваний (менингиты, пневмонии, грипп и др.). ТН-ответ на них - «первая линия» защиты организма от инфекции. Поэтому изучение иммунного ответа на ТН-2 АГ может оказаться полезными для разработки подходов к конст-

руированию вакцина основе ТН-2 АГ. Все это говорит об актуальности настоящего исследования.

Цель исследования: изучение феноменологии и механизмов гуморального иммунного ответа мышей на ТН-2 АГ.

Задачи исследования

1. Разработать методы выявления клеток, продуцирующих АТ и тотальные ИГ, при иммунизации мышей ТН-2 АГ.

2. Определить зависимость иммунного ответа от дозы, времени и природы ТН-2 АГ in vivo.

3. Сравнить иммунный ответ мышей на ТЗ, ТН-1 и ТН-2 АГ in vivo.

5. Выяснить роль различных субпопуляций В клеток мыши (Lyb5+, Lyb5- и CD5+) в иммунном ответе на ТН-2 АГ in vivo и in vitro.

Научная новизна

S Разработаны методы выявления единичных клеток селезенки мыши, образующих АТ к ТН-2 АГ.

Охарактеризована феноменология иммунного ответа мышей на ТН-2 АГ. S Впервые показано, что иммунизация мышей ТН-2 АГ приводит к увеличению числа В клеток, образующих не реагирующие с антигеном неспецифические/ поликлональные ИГ. S Впервые продемонстрировано, что одновременное введение мышам ТЗ и ТН-2 АГ вызывает суммацию числа клеток, продуцирующих неспецифические ИГ, индуцированные каждым из антигенов в отдельности. В отличие от этого одновременное введение двух ТН-2 АГ к суммации числа клеток, продуцирующих неспецифические ИГ, индуцированные каждым из антигенов, не приводит.

Разработана оригинальная схема получения поликлональной сыворотки мышей, специфичной к Lyb5.2 антигену зрелых В лимфоцитов мыши. S Впервые показано, что в образовании неспецифических ИГ, индуцированных ТН-2 АГ, как и в образовании специфических АОК, основная роль принадлежит зрелым В клеткам мыши; при этом основное количест-

во антител и неспецифических ИГ, индуцированных ТН-2 АГ, продуцируется СБ5+ В-1 клетками.

Практическая значимость

Настоящая работа относится к исследованиям фундаментального характера. В ней использованы оригинальные методические подходы, позволяющие оценивать роль разных субпопуляций В лимфоцитов мыши в иммунном ответе на ТН-2 АГ. Получены новые данные, расширяющие представления о механизмах развития гуморального иммунного ответа на ТН-2 АГ. Поскольку значительная часть бактериальных и часть вирусных антигенов относится к ТН-2 АГ, в защите от которых основную роль играют В-1 лимфоциты, изучение механизмов их активации ТН-2 АГ может быть полезным для разработки подходов к созданию вакцин.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Иммунизация мышей ТН-2 АГ вызывает появление АТ-продуцентов (АОК), и увеличивает число продуцентов тотальных ИГ (ИГОК). В результате возрастает число В лимфоцитов, образующих индуцируемые антигеном неспецифические ИГ, не реагирующие с введенным антигеном.

2. Совместное введение мышам ТЗ и ТН-2 АГ вызывает появление АОК к обоим антигенам и суммацию числа клеток, продуцирующих неспецифические ИГ, индуцированные каждым из введенных антигенов.

3. Совместное введение мышам двух ТН-2 АГ вызывает образование АОК к каждому из них, но не приводит к суммации числа клеток, продуцирующих индуцированные антигенами неспецифические ИГ.

4. При иммунизации мышей ТН-2 АГ за образование АТ и неспецифических ИГ отвечают зрелые ЬуЬ5+ В лимфоциты. Основное количество антител и неспецифических ИГ, индуцированных ТН-2 АГ, образуют СБ5+ В-1 лимфоциты.

Апробация материалов диссертации и публикации

Материалы диссертационной работы обсуждены на Всероссийской научной конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-

Петербург, 2002; 2005), Международных иммунологических конгрессах (Монреаль, Канада, 2004; Рио-де-Жанейро, Бразилия, 2007), Европейском иммунологическом конгрессе (Париж, Франция, 2006), Международных иммунологических конференциях (Бостон, США, 2008; Сан-Франциско, США, 2009; Осака, Япония, 2010).

Апробация диссертации состоялась 29.02.2012г. года на научной конференции отдела иммунологии ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН.

По теме диссертации опубликовано 24 печатные работы, из них 8 в изданиях, рекомендованных ВАК, 4 в иностранных изданиях.

Структура и объем диссертации

Материалы диссертации изложены на 131 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (две главы), главы «Материалы и методы», результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов и списка литературы. Библиография включает 172 отечественных и зарубежных источников. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 18 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Животные. В опытах использовали самок мышей линий BALB/c, DBA/2, СВА весом 16-18 г и xid-мышей линии CBA/N. В качестве комплемента использовали сыворотку морских свинок. Антисыворотки, специфичные к ИГ мыши, получали от кроликов. Используемые в работе эритроциты выделяли из крови баранов.

Антигены. В качестве ТЗ АГ использовали: а) эритроциты барана, б) водорастворимый антиген бараньих эритроцитов (ВРАБЭ), полученный по методу (Seman М. et al, 1972), в) инактивированный вирус гриппа штамм A/PR8/34 (H1N1), (НИИВС РАМН, Москва). В качестве ТН-1 АГ использовали ЛПС Е. coli 055:В5 (Sigma), а в качестве ТН-2 АГ - полисахарид пневмококка типа III (SIII), любезно предоставленный проф. J. Humphrey (Англия), а (1—>3) декстран (Деке) Leuconostoc mesenteroides, полученный от д-ра

М.Е. Преображенской, за что приносим ей глубокую благодарность, фиколл 400 (Фик) (Pharmacia) и синтетический полимер - поливинилпирро-лидон с мол.массой 350 кДа (ПВП) (Serva). Кроме того использовали конъю-гат динитрофенила с фиколлом (ДНФ-Фик), полученный по методу (Inman J.K., 1975).

Сыворотки, антисыворотки, антитела, конъюгаты, магнитные бусы.

Для постановки иммунохимических реакций использовали: сыворотки ин-тактных и иммунизированных мышей разных линий, кроличью антисыворотку, специфичную к ц -цепям IgM мыши. В качестве AT использовали афинно очищенные AT козы к ИГ мыши (IgM+IgG+IgA) (ICN). Пероксидаз-ный конъюгат AT барана к IgG кролика синтезирован в лаборатории.

Для разделения спленоцитов на Т и В клетки использовали монокло-нальные анти-Thy 1.2 AT, полученные из гибридомы к Thy 1.2, любезно предоставленной д-р. Червонским A.B.; моноклональные AT (монАТ) крысы к CD5 АГ лимфоцитов мыши, выделенные из супернатанта гибридомы 53.7.8., любезно предоставленной проф. L. Herzenberg (Stanford University, USA); AT мыши против CD5.2 АГ мыши (Caltag); цитотоксические AT мыши против CD5 (Lyl.2) АГ мыши (Cedarlane). Для иммуномагнитной сепарации клеток использовали магнитные бусы к pan Т маркеру лимфоцитов мыши и бусы, сенсибилизированные AT барана против IgG крысы или AT козы против IgG мыши (Dynal, Norway).

Приготовление магнитных бус, сенсибилизированных антителами к CD 5 антигену спленоцитов мыши. Для сенсибилизации магнитных бус М450 использовали монАТ мыши (Caltag) или монАТ крысы к CD5 АГ мыши. Обработку бус AT проводили согласно протоколу (Dynal).

Для удаления CD5+ В клеток были приготовлены 3 типа магнитных бус: 1) бусы М450, покрытые монАТ мыши или крысы к CD5 АГ мыши; 2) бусы, сенсибилизированные AT козы против IgG мыши и покрытые затем анти-С05 AT мыши; 3) бусы, покрытые сначала AT козы к IgG крысы, а за-

тем монАТ крысы против CD5 АГ мыши. Наиболее эффективными для удаления CD5+ В клеток оказались последние магнитные бусы. Иммуномагнитная сепарация сплеиоцитов мыши. Для удаления CD5+B клеток из суспензии спленоцитов мыши использовали два подхода. В первом случае CD5+ В клетки удаляли с помощью магнитных бус, покрытых анти-CD5 AT. Во втором случае спленоциты сначала обрабатывали анти-С05 AT крысы, а затем удаляли из суспензии CD5+ клетки с помощью магнитных бус, покрытых AT к IgG крысы. В ряде случаев из суспензии спленоцитов сначала удаляли Т клетки с помощью pan Т (Thy 1.2) магнитных бус. «Розетки» (клетка, присоединившая 3-5 бусин) осаждали на магните. Не связавшиеся с бусами клетки (обедненные по CD5+ лимфоцитам) использовали в функциональных тестах.

Индукция иммунного ответа in vivo и in vitro. Для индукции первичного иммунного ответа in vivo мышам BALB/c, СВА и CBA/N внутривенно вводили ПВП, SIII, Деке, Фик и ЛПС - 2 мкг/мышь, ДНФ-Фик и вирус гриппа A/PR8/34 - 5 мкг/мышь, ВРАБЭ - 500 мкг/мышь. В ряде опытов антигены в различных сочетаниях и в тех же концентрациях вводили попарно. Селезенку извлекали на 4 сутки после иммунизации и готовили моноклеточную суспензию.

Для индукции иммунного ответа in vitro по модифицированному методу [Michell R.J., Dutton R.W., 1967] в культуру спленоцитов добавляли имму-ногенные концентрации антигенов: ВРАБЭ -50 мкг/мл, вирус гриппа A/PR8/34 - 5 мкг/мл, ПВП и ЛПС - 10 нг/мл, ДНФ-Фик - 30 нг/мл. По окончании инкубации клетки собирали, отмывали и суспендировали в среде RPMI1640.

О величине иммунного ответа судили по количеству IgM-AOK и IgM-ИГОК. Для их выявления использовали метод локального гемолиза в геле агарозы [Jerne N.K., 1963] с незначительными модификациями и клеточный иммуноферментный анализ (ELISPOT) [Moller S.A., Borrebaeck С.А., 1985] в модификации Логуновой H.H. (1986).

Число клеток, образующих неспецифические ИГ (НИГОК), рассчитывали по разности между количествами ИГОК и АОК; число НИГОК, индуцированных АГ (инНИГОК), определяли по разности между количествами НИГОК в суспензиях иммунных и нормальных спленоцитов. Результаты выражали в виде числа продуцентов AT и ИГ в пересчете на млн спленоцитов. Постановка реакции цитотоксичности. Микровариант реакции ставили в 96-луночных круглодонных плейтах. В лунки вносили равные объемы суспензии клеток-мишеней, антисывороток/AT в различных разведениях и комплемент. Контролями служили пробы клеток, инкубируемых: а) с антисыворотками/AT без комплемента, б) с комплементом без AT, и в) просто в среде. По окончании инкубации определяли жизнеспособность клеток с помощью трипанового синего. Цитотоксический индекс (ЦИ) вычисляли по формуле:

ЦИ = [(а - б)/(100 - б)] х 100, где а - процент мертвых клеток в лунках с антителами и комплементом, б - процент мертвых клеток в лунках с комплементом.

Макровариант реакции ставили в пробирках и использовали для: 1) удаления Т клеток с помощью анти-Thy монАТ, 2) удаления Lyb+5 В лимфоцитов с помощью анти-ЬуЬ5.2 антисыворотки и 3) удаления CD5+ В спленоцитов с помощью цитотоксических анти-СБ5 AT мыши. К спленоцитам (после удаления эритроцитов) добавляли соответствующие AT и комплемент в подобранных заранее разведениях, инкубировали клетки час при +37°С и определяли ЦИ. Затем клетки отмывали средой RPMI 1640 и определяли в клеточных суспензиях количества АОК и ИГОК.

Статистическая обработка результатов. Данные представлены в виде М±ш, где М - среднее арифметическое, m - стандартное отклонение. Достоверность различий между средними показателями оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ Первая часть работы была направлена на изучение феноменологии иммунного ответа мышей на ТН-2 АГ.

Динамика иммунного ответа на ТН-2 антигены. Мышам ВАЬВ/с вводили БШ или ПВП (2 мкг/мышь) и на разные сроки после иммунизации в суспензии спленоцитов определяли количества АОК и ИГОК методом локального гемолиза в геле агарозы и рассчитывали число НИГОК.

Однократное введение ТН-2 АГ индуцировало появление АОК, рост числа ИГОК и НИГОК и появление НИГОК, индуцированных этими АГ (инНИГОК), т.е. вызывало и специфическую, и неспецифическую/ поликло-нальную активацию В лимфоцитов (табл. 1 и 2).

Таблица 1. Динамика иммунного ответа на ПВП

Дни после иммунизации ПВП Число продуцентов на 106 спленоцитов

АОК ИГОК НИГОК инНИГОК

0 3 ± 2 680 ± 98 677 ± 97 0

3 33 ±3 850±126 817±124 140 ±28

4 88 ±9 1271 ±200 1183±192 506 ± 95

5 41 ±5 961±132 920±128 243 ± 32

7 10 ± 2 798±123 788±121 111 ±25

10 4±2 588 ± 82 584 ±81 0

Таблица 2. Динамика иммунного ответа на §111

Дни после иммунизации SIII Число продуцентов наЮ6 спленоцитов

АОК ИГОК НИГОК инНИГОК

0 2 ± 1 1991±185 1975 ±184 0

3 17 ± 2 2585 ±229 2568 ± 228 379 ± 86

4 99 ±24 3107 ± 331 3008 ±308 1019 ±125

5 118 ±29 2629 ± 308 2511 ±280 522 ± 97

7 18 ± 4 2409 ±264 2391 ±201 402 ± 78

10 11 ±3 1714± 152 1703±150 0

В динамике появления АОК и ИГОК наблюдался четкий параллелизм:

максимальное их количество достигалось на 4-5 сутки, затем снижалось и на 7-10 дни возвращалось к исходному уровню. Об уровне неспецифической стимуляции свидетельствует количество инНИГОК. Эти клетки появлялись (как и АОК) после введения и ПВП, и БШ, достигая максимума также к 4-му дню; затем их число постепенно снижалось, и на 10-й день выявить их вооб-

ще не удавалось. Это свидетельствует о том, что появление индуцированных НИГОК обусловлено введением ТН-2 АГ.

Динамика ответа на ТН-2 АГ оказалась в целом сходна с таковой при иммунизации животных ТЗ АГ [Агаджанян М.Г. и др, 1981], хотя амплитуда ответа на ТН-2 АГ была намного ниже.

Зависимость иммунного ответа от дозы введенных ТН-2 и ТЗ антигенов. Известно, что величина специфического ответа зависит от дозы введенного АГ. В то же время в опытах с ТЗ АГ было показано, что in vitro при высоких концентрациях антигена часть В лимфоцитов может связывать его неспецифически и активироваться таким способом [Bach М.A et al, 1983]. Для определения зависимости ответа от дозы ТН-2 АГ мышам BALB/c вводили от 10"2 до 1 мкг ПВП/мышь и для сравнения ТЗ-АГ - эритроциты барана в дозах 10б -5х108/мышь. На 4-е сутки определяли количества АОК и ИГОК методом локального гемолиза в геле агарозы и рассчитывали число НИГОК.

Данные, представленные в табл. 3, свидетельствуют о том, что увеличение дозы и ТЗ, и ТН-2 АГ приводит к пропорциональному увеличению количеств АОК и НИГОК, соответственно. Образование последних проявлялось в широком диапазоне доз ТН-2 АГ. Повышение числа НИГОК вызывало уже введение низких доз АГ; АОК выявлялись при более высоких концен-трацияхТН-2 АГ. Таким образом, результаты, полученные при иммунизации мышей ТН-2 АГ, в принципе, не отличались от таковых при введении ТЗ АГ. Таблица 3. Зависимость иммунного ответа от дозы введенного антигена

Антиген Доза антигена Число АОК на 10б спл. Число НИГОК на 106 спл.

Эритроциты барана, кл./мышь - 1±0,3 1582±218

10ь 1,3±0,4 2182±419

107 4,1±1,1 3789±858

5x10s 1234±255 4677±610

ПВП, мкг/мышь - 1,7±0,4 2559±221

1x10"2 4,5±1,6 3833±349

lxlO"1 30±4 4066±576

1 69±8 4461±332

Зависимость иммунного ответа от природы ТН-2 антигена. Имму-ногенные свойства разных ТЗ АГ неодинаковы. Следовало установить зависимость иммунного ответа и от природы ТН-2 АГ. Для этого мышей ВАЬВ/с иммунизировали Деке, 8111, Фик и ПВП (по 2 мкг/мышь). Для сравнения использовали иммунизацию ТН-1 АГ (ЛПС - 1 мкг/мышь) и ТЗ АГ (эритроциты барана - 5х108/мышь и вирус гриппа А/РІ18 - 5 мкг/мышь).

Иммунизация мышей ТЗ АГ приводила к четко выраженному специфическому ответу и неспецифической активации спленоцитов. Количества АОК на эритроциты барана и вирус гриппа увеличивались соответственно от 10± 3 до 1234±116/млн и от 8±2 до 989±158/млн спленоцитов (~ в 120 раз), числа ИГОК - соответственно от 1583±340 до 5911±508/млн и от 1527±181 до 4860±392/млн клеток (~ в 3,4 раза) и количества НИГОК - соответственно от 1572±337 до 4677±390/млн и от 1519±179 до 3871±234/млн спленоцитов в 2,7 раза). Оба ТЗ АГ вызывали появление индуцированных ими НИГОК (3105/млн и 2352/млн спленоцитов, соответственно, для эритроцитов барана и для вируса гриппа).

Картина иммунного ответа на введение ТН-1 и ТН-2 АГ оказалась несколько другой. Известно, что ЛПС, обладающий митогенной активностью, в низких дозах вызывает специфический иммунный ответ [Соигіпііо А. еі аі, 1974]. Использование иммуногенной и митогенной концентраций ЛПС показало, что при дозах, не превышающих 0,5-1 мкг/мышь, наблюдается «обычный» для ТН-2 АГ специфический ответ и появление индуцированных НИГОК. Однако даже при иммуногенных дозах ЛПС поликлональная активация превышала «обычную» неспецифическую поликлональную стимуляцию В лимфоцитов ТН-2 АГ. Возможно, дело в остаточной митогенной активности даже низких доз ЛПС.

Сравнительное изучение ответа на разные ТН-2 АГ показало, что их иммуногенная активность неодинакова (Рис. 1, А-Г). Наименее иммуноген-ным оказался Фик (Рис. 1, Б.), а наиболее иммуногенным БІІІ (Рис.1, Г). Так иммунизация мышей Фик вызвала рост числа АОК от 47±7 до 102±23/млн

спленоцитов, ИГОК - от 2760±446 до 3880±547/млн и НИГОК - от 2713±439 до 3778±527/млн, т.е. увеличение числа АОК, ИГОК и НИГОК относительно нормы, соответственно, составило 55±10, 1120±101 и 1065±86/млн клеток. Введение мышам SIII индуцировало рост числа АОК от 30±4 до 500±72/млн , ИГОК от 1500±261 до 4900±356 и НИГОК от 1470±258 до 4400±284, т.е. увеличения количеств АОК, ИГОК и НИГОК оказались наибольшими по сравнению с другими ТН-2 АГ (Деке и ПВП,) и составили, соответственно, 470±68, 3400±98 и 2930±32/млн спленоцитов. Такая же картина наблюдалась и в отношении образования НИГОК, индуцированных этими ТН-2 АГ, -наименьшее их количество выявлялось при иммунизации Фик (1065/млн), а наибольшее (2930/млн) также после введения SIII.

I | - в норме ¡23 - при иммунизации

Рис. 1. Иммунный ответ на ТН-2 антигены (А - ПВП, Б - Фик, В.- Деке, Г.- 8111).

Анализ полученных результатов позволяет заключить, что действие ТЗ, ТН-1 и ТН-2 АГ в принципе сходно. Вместе с тем в ответе на них имеются и

различия: так амплитуда иммунного ответа на ТЗ и ТН АГ неодинакова. ТЗ АГ вызывают значительно больший специфический ответ, чем ТН-2, а ТН-1 АГ - значительно более выраженную поликлональную активацию, чем ТЗ АГ. Следует подчеркнуть, что хотя, согласно общепринятой точке зрения, ТН-2 АГ не являются митогенами [Mond JJ. et al, 1995; Сидорова Е.В., 2002], их введение приводит к неспецифическому/ поликлональному ответу, хотя и не очень высокому.

Механизм неспецифической стимуляции В клеток под влиянием ТН-2 АГ до сих пор неясен. Представлялось интересным выяснить, как влияет на специфический ответ и неспецифическую/ поликлональную активацию одновременная иммунизация мышей разными типами АГ - ТЗ и ТН-2 или двумя ТН-2 АГ. Очевидно, что если каждый из антигенов вызывает появление индуцированных НИГОК, то при их совместном введении можно ожидать суммацию числа последних.

Влияние одновременного введения ТЗ и ТН-2 или двух ТН-2 антигенов на специфический и поликлоиальиый ответ. Ранее было показано, что одновременное введение двух ТЗ АГ или ТЗ и ТН-2 АГ приводит, во-первых, к появлению АОК на каждый из них, а во-вторых, к суммации числа НИГОК, индуцированных антигенами [De Vos-Cloetens С. et al, 1971; Агад-жанян М.Г. и др., 1981]. Аналогичные результаты были получены и нами при иммунизации мышей ВРАБЭ и ПВП.

Число НИГОК после введения ВРАБЭ возросло с 2800±267 до 10492±759 /млн спленоцитов, соответственно количество НИГОК, индуцированных ВРАБЭ, составило 7692±494/10б клеток. После иммунизации ПВП число НИГОК увеличилось от 2755±246 до 5050±600/млн клеток и также привело к появлению индуцированных НИГОК в количестве 2295± 356/10б клеток. Суммарное количество индуцированных НИГОК при введении ПВП и ВРАБЭ должно было составить 9987±84б/106 спленоцитов. Действительно совместное введение этих антигенов вызвало рост числа АОК на каждый из них (от 245±39 до 1913±109/млн клеток для ПВП и от 200±19 до

2896±232/млн спленоцитов для ВРАБЭ), увеличение количества НИГОК с 255±317 до 13091±701/106 клеток и, соответственное, появление индуцированных НИГОК - 10536±384/млн спленоцитов. Таким образом, одновременное введение ТЗ и ТН-2 АГ привело к ожидаемой суммации числа индуцированных НИГОК (Рис. 2, 1).

Аналогичная картина наблюдалась в наших опытах in vitro. На 4-е сутки культивирования спленоцитов мышей СВА в присутствии иммуногенных доз ЛПС и ПВП одновременно была отмечена и специфическая, и неспеци-

I

фическая/ поликлональная стимуляция В клеток. Число НИГОК, индуцированных совместным введением ТН-1 и ТН-2 АГ (19101±2062/млн), практически равнялось сумме чисел НИГОК, индуцированных ПВП (3273±570/млн клеток) и ЛПС (15681±2180/млн клеток) в отдельности. I Таким образом, одновременное введение как ТЗ и ТН-2, так и ТН-1 и

ТН-2 АГ приводило к суммации чисел НИГОК, индуцированных антигенами.

Принципиально другая картина наблюдалась при совместном введении двух ТН-2 АГ (Рис. 2, 2-5).

Рис. 2. Образование индуцированных НИГОК при раздельном и совместном введении ТЗ и ТН-2 АГ или двух ТН-2 АГ (1. ПВП+ВРАБЭ; 2. ПВП+Декс; 3. Декс+Фик; 4. Дек+ЭШ; 5. ПВП+8Ш).

і

Одновременная иммунизация двумя ТН-2 АГ в любом сочетании приводила к появлению специфичных для каждого антигена АОК и росту числа ИГОК, однако количество появляющихся индуцированных антигенами НИГОК при этом обычно не превышало их числа, индуцированного наиболее иммуногенным из двух использованных в паре ТН-2 АГ. Ни в одном случае суммации числа индуцированных НИГОК при одновременном введении двух ТН-2 АГ, в отличие от иммунизации парой ТЗ и ТН-2 АГ, обнаружить не удалось (Рис. 2), [Гаврилова М.В.и др., 2007].

Ограничение неспецифической активации при одновременном введении двух ТН-2 АГ могло быть связано с общим угнетением иммунного ответа из-за использования суммарно большей дозы АГ (4 мкг вместо оптимальных 2 мкг/мышь). Однако было показано, что на образование АОК одновременная иммунизации разными парами ТН-2 АГ не влияла. Это значит, что доза введенных ТН-2 АГ не является супрессивной. Таким образом, отсутствие суммации числа индуцированных НИГОК при одновременной иммунизации двумя ТН-2 АГ с общей супрессией иммунного ответа не связано.

Наличие суммации числа индуцированных НИГОК при введении пары ТЗ и ТН-2 АГ позволило предположить, что в неспецифическую активацию (как и в специфическую), индуцируемую ТЗ и ТН-2 АГ, вовлекаются разные субпопуляции В лимфоцитов. В настоящее время известны 4 субпопуляции В клеток, характеризующиеся разными поверхностными маркерами и разными свойствами [Сидорова Е.В., 2002, 2006]. Выяснению роли разных субпопуляций В клеток в иммунном ответе на ТН-2 АГ были посвящены следующие серии опытов.

Роль Lyb5+ и Lyb5- В лимфоцитов в иммунном ответе на ТН-2 антигены. Ранее было показано, что у нормальных мышей ТЗ АГ индуцируют образование AT как зрелыми (Lyb5+), так и незрелыми (Lyb5-) В лимфоцитами, а ТН-2 АГ индуцируют АТ-образование только в зрелых Lyb5+ В клетках [Ahmed A. et al, 1977; Smith H.R. et al, 1985]. Неспецифическая/ поликло-нальная активация при этом вообще не исследовалась. Чтобы выяснить, ка-

кие В клетки отвечают за неспецифическую активацию, индуцируемую ТЗ и ТН-2 АГ, сравнивали ответ на эти антигены у мышей конгенных линий СВА и CBA/N. У xid-мышей CBA/N нарушены конечные этапы дифференцировки В лимфоцитов, что приводит к отсутствию у них популяции зрелых Lyb5+ В клеток [Scher I., 1982; Subbarao В. et al, 1982; Сидорова E.B, 1993].

Иммунизация ТЗ АГ как in vivo, так и in vitro (табл. 4 и 5) индуцировала образование АОК и рост числа ИГОК и НИГОК у мышей обеих линий; число АОК коррелировало с числом НИГОК. Введение ТН-2 АГ индуцировало появление АОК и рост числа НИГОК только у мышей СВА.

Таблица 4. Иммунный ответ мышей СВА и CBA/N на ТЗ и ТН-2 антигены in vivo

Линия мышей Антиген Число продуцентов на 106 спл.

Прирост 1 АОК Прирост ИГОК Прирост НИГОК

СВА ТЗ ВРАБЭ 2043 ± 775 10633 ±943 8590 ± 963

ТН-2 ДНФ-Фик 772 ±234 4244±1231 3473±1132

ПВП 205 ± 85 3380 ±540 3179 ±504

CBA/N ТЗ A/PR8/34 1326±150 5567 ±756 4240 ± 905

ВРАБЭ 5775 ±860 18258 ±2942 12483 ±2082

ТН-2 ДНФ-Фик 10 ± 8 1071 ±660 1064 ±656

ПВП 75 ±67 1455 ±263 1378 ±267

Таблица 5. Иммунный ответ мышей СВА и CBA/N на ТЗ и ТН-2 антигены in vitro

Линия мышей Антиген Число продуцентов наЮ6 спл.

Прирост АОК Прирост ИГОК Прирост НИГОК

СВА ТЗ A/PR8/34 712 ±312 5628±1315 5106±1366

ТН-2 ДНФ-Фик 410 ± 80 5050±1550 4640 ±1630

ПВП 267 ±78 3767 ±2100 3547 ±2030

CBA/N ТЗ A/PR8/34 770 ±312 7178 ±2372 6466 ± 2020

ТН-2 ДНФ-Фик 35 ±25 - -

ПВП 6±6 567 ± 567 567 ± 567

1 Прирост количеств АОК, ИГОК и НИГОК, индуцируемый введением АГ, рассчитывали как разность между их значениями в иммунных и нормальных суспензиях спленоцитов

Полученные данные позволили оценить роль зрелых В лимфоцитов в иммунном ответе на ТН-2 АГ и продемонстрировали, что появление не только АОК, но и значительной части НИГОК при этом обусловлено Lyb5+B лимфоцитами.

Для подтверждения этого вывода были проведены прямые опыты по сравнению количеств АОК и НИГОК в нормальных и лишенных Lyb5+ В клеток суспензиях спленоцитов. Удаление Lyb5+ В лимфоцитов из суспензии проводили с помощью сыворотки, содержащей цитотоксические анти-ЬуЬ5 антитела.

Получение поликлональной анти-ЬуЬ5 сыворотки. Сложность получения AT к Lyb5 АГ состоит в том, что такие AT не удается индуцировать иммунизацией xid-мышей CBA/N, лишенных Lyb5+ В лимфоцитов, клетками мышей СВА, обладающими такими клетками. Более эффективным подходом оказалось использование аллотипических различий по Lyb5 АГ у мышей разных линий. Известны два аллотипа Lyb5 АГ: Lyb 5.1 (его экспрессируют В клетки мышей линии DBA/2) и Lyb 5.2 (у В клеток мышей линий СВА, BALB/c, C57BL/6). Взаимная иммунизация, в принципе, позволяет индуцировать анти-ЬуЬ5 AT. Этот подход был применен Ahmed A. et al (1977) для получения поликлональной анти-ЬуЬ5.1 сыворотки. Аллотип Lyb5.1 встречается у мышей значительно реже, чем аллотип Lyb5.2, поэтому получение специфичной анти-ЬуЬ5.2 сыворотки представляет больший интерес, расширяя область исследований.

Нами был разработан подход для получения анти-ЬуЬ5.2 сыворотки [Chernishova I.N. et al, 1998]. В его основу легли данные работы Черняховской И.Ю. и др. (1988) по созданию толерантности, индуцированной с помощью циклофосфамида. Постулировалось, что иммунизация мышей DBA/2 (Lyb5.1, H-2d) спленоцитами мышей СВА (Lyb5.2, H-2k) вызывет образование специфичных анти-ЬуЬ5.2 AT, если мышей DBA/2 предварительно толери-ровали спленоцитами мышей CBA/N (Lyb5-, H-2k). (Толерирование клетками мышей CBA/N необходимо для того, чтобы при последующей иммунизации

мышей ОВА/2 клетками мышей СВА не образовывалось АТ к Н-2к антигенам мышей СВА).

Для толерирования мышей ЭВА/2 их тимэктомировали, через месяц внутривенно вводили по 108 спленоцитов мышей СВА/Ы и через 24 часа после этого - циклофосфамид (200 мг/кг веса). Толерированных мышей Б В А/2 многократно иммунизировали спленоцитами мышей СВА. Сыворотку брали индидуально на 5-й день после последней иммунизации. Наличие в сыворотке АТ к ЬуЬ5.2 АГ проверяли в цитотоксическом тесте, используя в качестве клеток-мишеней спленоциты мышей СВА (ЬуЬ5.2, Н-2к) и СВА/Ы (ЬуЪ5-Н-2к). Подход позволил получить специфическую анти-ЬуЬ5.2 сыворотку [СІїегпізЬоуа Ш. ЄІ аі, 1998].

Таблица 6. Влияние удаления ЬуЬ5+ В клеток на число АОК и НИГОК в суспензии спленоцитов мышей, иммунизированных ПВП

Иммунные Число продуцентов/ млн спленоцитов Угнетение,%

спленоциты, обработанные: АОК игок НИГОК инНИГОК АОК инНИГОК

581 9623 9042 4542

±40 ±467 ±431 ±192 j

норм. сывороткой мышей DBA /2 540 ±50 8409 ±445 7869 ±398 3369 ±225 7 26

анти-Lyb 5.2 283 6568 6285 1785 51 61

сывороткой ±52* ±578 ±527 ±96*

Различия средних значений АОК и индуцированных НИГОК в опытной и контрольной группах достоверны на уровне значимости р<0,05 (*)

Обработка анти-ЬуЬ5.2 сывороткой спленоцитов мышей ВАЬВ/с (алло-тип ЬуЬ5.2), иммунизированных ПВП, снижала число АОК на 44% (51% -7%), а число индуцированных НИГОК - на 35% (61% - 26%), (табл. 6). (Обработка антисывороткой нормальных спленоцитов такого эффекта не вызывала)2. Это прямо подтвердило вывод о том, что при иммунном ответе на ТН-2 АГ, не только АОК, но и значительная часть НИГОК относится к ЬуЬ5+ В клеточному пулу.

2 в суспензии нормальных спленоцитов число НИГОК составляло 4500 ± 620 /млн клеток

В 80-х годах прошлого века было показано, что на части В лимфоцитов экспрессируется маркер Т клеток - CD5 [Herzenberg L.A. et al, 1984; Youinou P. et al, 1999; Сидорова E.B., 2002] и установлено, что именно CD5+ В-1 клетки отвечают на ТН-2 АГ [Mond J.J. et al, 1995; Whitmore A.C. et al, 2004]. Оказалось также, что субпопуляции Lyb5+ и CD5+ В клеток «перекрываются» [Smith H.R. et al, 1985]. Поэтому было решено исследовать роль CD5+ В клеток в иммунном ответе на ТН-2 АГ.

Роль CD5+ В клеток в иммунном ответе на ТН-2 антигены. Для выяснения роли CD5+ В клеток в образовании AT и неспецифических ИГ под действием ТН-2 антигенов CD5+В лимфоциты удаляли из суспензии спле-ноцитов мышей, иммунизированных ТН-2 АГ, с помощью aiiTH-CD5 магнитных бус (Dynal) или цитотоксических aHTH-CD5 AT (Cedarlane).

Для удаления CD5+ В клеток с помощью магнитных бус использовали два способа: либо спленоциты мыши инкубировали с бусами, покрытыми ан-th-CD5 AT, либо клетки сначала обрабатывали анти-СБ5 AT крысы, а затем инкубировали с бусами, содержащими AT к IgG крысы. Последний способ позволил повысить выход «розеток» до 12% (вместо 0,4% при первом способе) и был использован в экспериментах в качестве основного. Поскольку около 40% CD5+ лимфоцитов селезенки относится к Т клеткам, для более полного удаления CD5+ В клеток из суспензии сначала удаляли Т клетки с помощью pan Т магнитных бус. Образующиеся «Т-» и «В-розетки» удаляли на магните; суспензию, обедненную CD5+ В лимфоцитами, использовали для определения количеств АОК и ИГОК.

В суспензии спленоцитов нормальных мышей после удаления Т клеток было выявлено 534±45 АОК к ПВП и 4384±604 ИГОК/млн клеток, число НИГОК при этом составило 3850±560/106 клеток (табл. 7). В суспензии спленоцитов мышей, иммунизированных ПВП, после удаления Т клеток, было выявлено 1347±78/106 АОК и 8801±875/10б ИГОК и число НИГОК составило 7454±798/10б клеток. Таким образом, введение ПВП индуцировало специфический и неспецифический ответы, о чем свидетельствовал прирост коли-

честв АОК, ИГОК и НИГОК - 813±33, 4417±274 и 3604±240/млн спленоци-тов, соответственно.

Таблица 7. Влияние обработки суспензии спленоцитов нормальных и иммунизированных ПВП мышей ВАЬВ/с анти-С05 магнитными бусами на количество АОК, ИГОК и НИГОК__

Спленоциты Число продуцентов на 106 спленоцитов

АОК ИГОК НИГОК Прирост АОК Прирост ИГОК Прирост НИГОК

Норма льные -Т клетки 534± 45 4384± 604 3850± 560

- и Т и С05+В клетки 492± 50 4819± 613 4327± 565

Иммун ные к ПВП -т клетки 1347± 78 8801± 875 7454± 798 813± 33 4417± 274 3604± 240

-Ти СЭ5+В клетки 965± 82* 5248± 605 4283± 526* 473± 35 429± 12 нет

Различия средних значений в группах иммунных спленоцитов с удаленными Т клетками и после удаления Т и С05+ В клеток достоверны на уровне значимости р<0,05 (*)

Удаление СБ5+ В клеток из суспензии нормальных спленоцитов на фоновые количества АОК, ИГОК и НИГОК практически не повлияло. В то же время, удаление С05+ В клеток из суспензии иммунной селезенки привело к снижению числа АОК, ИГОК и НИГОК до 965±82, 5248±605 и 4283±526/106 спленоцитов, соответственно. В результате прирост числа АОК составил 473±35/10б против 813±33/106 клеток, т.е специфический ответ уменьшился ~ на 40%. Еще сильнее снизился неспецифический ответ: прирост ИГОК составил 429±12/106 против 4417±274/10 6, а прирост НИГОК вообще отсутствовал.

При использовании для удаления С05+ В клеток цитотоксических ан-ти-СБ5 АТ (СескгНпе) и комплемента получены аналогичные результаты (табл. 8). Обработка нормальных спленоцитов анти-СБ5 АТ на фоновые количества АОК и НИГОК практически не влияла. Такая же обработка «иммунной суспензии» снизила числа АОК и НИГОК, приросты которых

уменьшились и составили, соответственно, 286±87 и 415±166/млн спленоци-тов. Таким образом, обработка спленоцитов цитотоксическими анти-СБ5 АТ вызвала снижение специфического и неспецифического ответов на 40 и 48% , соответственно.

Таблица 8. Влияние цитотоксических анти-СБ5 антител на количество АОК, ИГОК и НИГОК в суспензиях спленоцитов нормальных и иммунизированных ПВП мышей ВАЬВ/с_

Спленоциты Число продуцентов/млн спленоцитов

АОК ИГОК НИГОК Прирост АОК Прирост НИГОК

Нормальные 236 ± 92 2245±592 2033± 560

Нормальные + комплемент 189 ±79 2233± 577 2096± 526

Нормальные + АТ и комплемент 277± 83 2244± 468 1966±434

Иммунные 735±134 3561±460 2826±450 499±130 793±204

Иммунные + комплемент 625±143 3675±745 3050±671 456±106 954±425

Иммунные + АТ и комплемент 564±116* 2945±594 2381±535** 286±87* 415±166*

Различия между средними показателями в иммунных группах до и после обработки АТ и комплементом достоверны на уровне значимости р<0,05(*) или р<0,01(**)

Полученные данные позволяют заключить, что за специфический ответ и неспецифическую/ поликлональную активацию В клеток под действием ТН-2 АГ у мышей отвечает одна и та же субпопуляция В клеток, а именно СБ5+ В лимфоциты3. Эти данные согласуются с результатами \Vhitmore А.С. еі а1 (2004), которые обнаружили АОК к ПВП в СБ5+ В-1 компартменте у трансгенных мышей, все В клетки которых экспрессировали ИГ-рецепторы, специфичные к ПВП.

Таким образом, в настоящей работе показано, что основные параметры иммунного ответа на ТЗ и ТН-2 АГ (временная, дозовая зависимость, индук-

3 В не вошедших в диссертацию опытах по определению содержания АОК и индуцированных АГ НИГОК в популяциях В-1 и В-2 клеток было показано, что именно С05+ В-1а лимфоциты ответственны за синтез и секрецию анти-ПВП АТ и индуцированных ТН-2 АГ неспецифических ИГ [вйогоуа Е.У еї аі, 2003; Гаврилова М.В и др, 2007]

ция образования неспецифических ИГ) принципиально сходны, хотя величина ответа различна. Подтвержден параллелизм в образовании АТ и индуцированных АГ неспецифических ИГ под действием разных ТН-2 АГ. Полученные данные подтверждают высказанное ранее предположение о том, что в специфическом и неспецифическом/ поликлональном ответах на ТЗ и ТН-2 АГ участвуют разные субпопуляции В лимфоцитов: на ТН-2 АГ отвечают, в основном, В-1 лимфоциты. Способность ТН-2 АГ индуцировать образование неспецифических ИГ в СЭ5+ В-1 клетках, играющих роль «первой линии» защиты организма от патогенов, часто содержащих ТН-2 АГ, позволяет предположить наличие у этих белков неизвестной нам пока функции. Очевидно, что для полного представления о роли индуцируемых АГ неспецифических ИГ и механизмах их образования В-1 клетками требуются дальнейшие исследования.

ВЫВОДЫ

1. Иммунизация мышей различными Т-независимыми антигенами 2-го типа (ТН-2 АГ) индуцирует появление не только антитело-образующих клеток (АОК), но и увеличение числа продуцентов неспецифических иммуноглобулинов (НИГОК).

2. Иммунный ответ и неспецифическая активация В лимфоцитов мыши зависят от дозы, времени и природы введенного ТН-2 АГ.

3. Совместное введение мышам Т-зависимого (ТЗ) и ТН-2 АГ вызывает суммацию числа клеток, продуцирующих неспецифические иммуноглобулины (ИГ), индуцированные каждым из антигенов.

4. Совместное введение мышам двух ТН-2 АГ к суммации числа клеток, продуцирующих неспецифические ИГ, индуцированные ТН-2 АГ, не приводит.

5. Разработан оригинальный способ получения цитотоксической антисыворотки к ЬуЬ5.2 антигену В лимфоцитов мыши.

6. Неспецифические ИГ, индуцированные ТН-2 АГ, как и специфические антитела, продуцируются зрелыми ЬуЬ5+ В клетками селезенки мыши.

7. Основное количество антител и неспецифических ИГ, индуцированных ТН-2 АГ, образуют CD5+ В-1 клетки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1.Агаджанян МГ, Смирнова ИН, Сидорова ЕВ. Зависимость образования продуцентов антигензависимых неспецифических иммуноглобулинов от дозы Т-зависимого и Т-независимого антигенов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины,- 1986,-№8-С. 206-208.

2. НН. Логунова, ИН. Чернышова, ЕВ. Сидорова. Изучение роли различных субпопуляций В-лимфоцитов мыши в иммунном ответе на Т-независимые антигены // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины,-1995,-№4,-С. 402-405.

3. Chernishova IN, Kondratieva ТК, Sidorova EV. A new approach to obtain Lyb5-specific antiserum//Immunol Lett.- 1998-Vol. 62,-P. 15-18.

4. IN Chernyshova, ТВ Borisova, JA Emelyanzeva, EV Sidorova. Role of different lymphocyte subpopulations in the formation of non-specific immunoglobulins induced by antigen injection // Immunol Lett.- 1999.- Vol. 67 - P. 113-116.

5. Гаврилова M.B., Чернышова И.Н., Сидорова E.B. Роль различных субпопуляций В-лимфоцитов мыши в иммунном ответе на Т-независимые антигены 2-го типа //VI Всероссийская научная конференция «Дни иммунологии в СПб 2002».- Медицинская иммунология.-2002-Т. 4.(№2).- С. 119120

6. E.V. Sidorova, Lu Li-Sheng, В. Devlin, I. Chernishova, M. Gavrilova. Role of different B-cell subsets in the specific and polyclonal immune response to T-indpendent antigens type 2 // Immunol Lett.- 2003,- Vol. 88 - P. 37-42.

7. Irina N.Chernyshova, Marina V.Gavrilova, Ekaterina V. Sidorova. В Cell Activation by T-Independent Antigens Type 2 (abstract) // 12-th International Congress of Immunology, Montreal, Canada-2004.- P 29B

8. I.N. Chernyshova M.V. Gavrilova E.V. Sidorova TI-2 dependent polyclonal В cell activation. Role of CD5+ В cells (abstract 61) // Crossroads between Innate

and Adaptive Immunity. Hilton Conference Center. Rhodes, Greece- 2005-Vol.21.-P. 83

9. Чернышова И.Н.; Гаврилова M.B.; Сидорова E.B. Активация B-лимфоцитов мыши Т-независимыми антигенами 2-го типа (тезисы) // Медицинская иммунология,- 2005- Т. 7 (№2-3).- С. 125-126 (доклад) IX Всероссийская научная конференция СПб.

10. Гаврилова М.В., Чернышова И.Н., Сидорова Е.В. Роль различных субпопуляций В лимфоцитов в иммунном ответе на ТН-2 антигены // Аллергология и Иммунология,- 2006,- Т. 7 (№ 3) - С. 260-261.

11. М. Gavrilova, I. Chernyshova, Е. Sidorova. Role of B-l and B-2 cells in the immune response to alpha (1-3) dextran // Abstracts of 16th European Congress of Immunology (Paris, France).- 2006 - PB-1324 - P. 98

12. Гаврилова M.B., Чернышова И.Н., Сидорова E.B. Роль различных субпопуляций В-клеток в иммунном ответе на Т-независимые антигены 2-го типа // Медицинская иммунология,- 2007,- Т. 9.(№ 1).- С. 39-47.

13. Chernyshova I.N., Gavrilova M.V., Sidorova E.V. T-independent antigens type 2 and polyclonal В cell activation // Abstracts of 13-th International Congress of Immunology - 2007.- Rio-de-Janeiro (Brazil)

14. Дьяков И.Н., Гаврилова M.B., Чернышова И.Н., Сидорова Е.В. Функциональная активность В-лимфоцитов в перитонеальном окружении // Российский Иммунологический Журнал. Тезисы доклада,- 2008.- Т.2.- №2-З.-С. 120.

15. Дьяков И.Н., Григорьев И.В., Сидорова Е.В., Чернышова И.Н. Функциональная активность В-клеток мыши. Роль микроокружения // Медицинская иммунология - 2008 - Т. 10 (№1).- С. 51-58.

16. Дьяков И.Н., Гаврилова М.В., Чернышова И.Н., Сидорова Е.В. Влияние микроокружения на функциональную активность В-лимфоцитов мыши // Биологические мембраны,- 2008,- Т. 25,-№ 5.- С. 360-366.

17. Dyakov I.N., Gavrilova M.V., Chernyshova I.N., Sidorova E.V. Effect of Microenvironment on Functional Activity of Murine B-Lymphocytes // Biochem-

istry (Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology - 2008-Vol. 2,-№4.-P. 312-317.

18.M.B. Гаврилова; И.Н. Чернышова, E.B. Сидорова. Клеточные взаимодействия при иммунном ответе на поливинилпирролидон in vitro // Российский Иммунологический Журнал. Тезисы доклада,- 2008 - Т.2.- №2-3-С.119.

19.I.N. Chernishova, M.V. Gavrilova, E.V. Sidorova. T-independent antigens type 2 as policlonal В cell activators// New Immunology Research Developments. Nova Science Publishers.- 2008 - ISBN 978-1-60021-701-2.

20.Chernyshova Irina, Gavrilova Marina, Sidorova Ekaterina. Immune response to T-independent antigens in vitro (abstract) // FOCIS (Session of Immunoregulation) Boston. - 2008.

21.Marina Gavrilova, Irina Chernyshova, Ekaterina Sidorova. Response of mouse B-l and B-2 cells to T-independent antigens type 2 in vitro (тезисы доклада) // Federation of Clinical Immunological Society (FOCIS).- San-Francisco-2009,- F.71

22.Chernyshova I., Gavrilova M., Sidorova E. Cell interactions in the immune response to T-independent antigens in vitro (abstract) // 4-th International Conference "B cells and Immunity".- 2010.-0saka (Japan)

23.И.Н. Чернышова, M.B. Гаврилова, E.B. Сидорова. Модельная система для изучения клеточных взаимодействий и механизмов иммунного ответа на Т-независимые антигены // Биологические мембраны - 2010 - Т. 27(5).-С. 387-393.

24.I.N. Chernyshova; M.V. Gavrilova; E.V. Sidorova . Model System for Study of Cell Interactions and Mechanisms of Immune Response to T-Independent Antigens of Type 2 in vitro // Biochemistry (Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology.- 2010,- Vol. 4(4).- P. 343-348.

Смирнова И.Н. = Чернышова И.Н.

Заказ № 67-а/03/2012 Подписано в печать 19.03.2012 Тираж 85 экз. Усл. п.л. 1,2

N

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-maihzak@cfr.ru