Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Феноменология и некоторые закономерности рецепторзависимой и рецепторнезависимой адгезии нейтрофилов

г 5 ОД

На правах рукописи ЧЕЛЫШЕВ Игорь Владимирович

"Феноменология и некоторые закономерности рецепторзависимой и рецепторнезависимой адгезии нейтрофилов"

14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Нижний Новгород, 1997

Работа выполнена в Нижегородской государственной медицинской академии и Медицинском колледже г.Олбани (Университет штата Нью-Йорк).

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор А.Н.Маянский

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук Артифексов С.Б. Доктор биологических наук Новиков В.В.

Ведущая организация: Казанская Медицинская Академия

Защита состоится сентября 1997 года в 14.00 на

заседании диссертационного совета К084.39.03 по присуждению ученой степени кандидата медицинских наук в Нижегородской государственной медицинской академии по адресу: 603005, г.Н.Новгород, пл.Минина, 10/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородской государственной медицинской академии по адресу: Нижний Новгород, ул. Медицинская, ЗА.

Автореферат разослан 17 августа 1997 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Конторщикова К.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ Полиморфноядершле лейкоциты (ПМЛ) являются жизненно важным компонентом системы неспецифической клеточной резистентности организма к бактериальной инфекции (Weissman I.I., Cooper M.D., 1993; Paul W.E., 1993). Под влиянием тканевого повреждения происходит формирование очага нейгрофилъной инфильтрации, являющегося квинтэссенцией острого воспаления (Мечников И.И., 1898). Элиминация агента, вызвавшего острое воспаление, осуществляется, главным образом, нейтрофилами (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989). Помимо миграции в очаги патологии, имеет место постоянный выход нейтрофилов из кровеносного русла в ткани и на поверхность слизистых (Murphy Р., 1976). Такая естественная миграция нейтрофилов обеспечивает, вместе с другими системами, предотвращение бактериальной инвазии в экстравазальные ткани. Как физиологический, так и патологический выход ПМЛ из кровеносного русла обязательно требует адгезии ПМЛ на эндотелиоцитах и компонентах тканевого матрикса. Наряду с ключевой ролью в инициации острого воспаления, адгезия ПМЛ имеет весьма важное значение в его разрешении, поскольку элиминация патогена часто осуществляется путем фагоцитоза, требующего адгезивного контакта с мишенью, или под действием деструктивных субстанций ПМЛ, секретируемых последними в состоянии сцепления с субстратом в очаге воспаления. Недавно был вскрыт еще один существенный механизм, действующий в периоде угасания острого воспаления и также зависимый от адгезивных реакций ПМЛ - фагоцитоз апоптозных нейтрофилов макрофагами (Savill J.C. et al., 1989). При этом варианте элиминация "излишка" ПМЛ не сопровождается освобождением деструктивных компонентов нейтрофильных гранул в окружающую среду. Благодаря этому обеспечивается ускорение репарации и минимизация субституции пораженных тканей.

Учитывая сказанное выше, нетрудно понять интенсивность, с которой в настоящее время изучаются адгезивные реакции ПМЛ. Несмотря на огромный объем информации, накопленный в результате этих исследований, ряд важных аспектов адгезии ПМЛ не получил освещение в литературе.

Прежде всего, обращает на себя внимание тот факт, что в большинстве работ изучается только начальная стадия адгезии, максимум до 60й мин пребывания клеток на субстрате. Между тем, логика процесса говорит о том, что с течением времени количество клеток, прикрепленных к адгезивной поверхности, должно снижаться. Изучение адгезии ПМЛ на IgG-сефарозе и СЗЬ-сефадексе в нашей лаборатории показали, что данный феномен действительно имеет место (Чеботарь И.В., Коныпшша Т.М., 1989). При этом ЛДГ (как маркер разрушения клеток) в среде инкубации не обнаруживалась. Это могло говорить либо о десорбции клеток с сохранением целостности цитоплазматической мембраны, либо об инактивации ЛДГ в супернатанте и/или присутствии ее в среде в недоступной для индикации активности форме (например, в микровезикулах) после разрушения адгезированных ПМЛ. Очевидно, что обнаружение свидетельств в пользу какого-либо варианта и его дальнейшее изучение способствовало бы лучшему пониманию регуляции динамики острого воспаления и могло открыть новые подходы к его фармакологической коррекции.

Следующим неясным аспектом является возможная гетерогенность популяции нейгрофшюв в реакциях IgG-опосредованной адгезии. Известно, что нешрофилы физически (центрифугированием) могут быть разделены на две субпопуляции, которые существенно отличаются друг от друга по способности образовывать розетки с эритроцитами, покрытыми IgG (Klempner M.S., Gallin J.I., 1978). О каких-либо проявлениях подобной гетерогенности ПМЛ при адгезии к IgG-покрытой поверхности ничего неизвестно, однако, некоторые особенности показателей прикрепления ПМЛ к IgG-субстратам могут быть интерпретированы с этих позиций (Чеботарь И.В., 1989).

Наконец, не охарактеризовано изменение реактивности ПМЛ, адгезированных на различных субстратах по отношению к стимулам, действующим через рецепторы, аналогичные таковым для лигандов субстрата. Такая ситуация вполне реальна in vivo: при некоторых видах иммунокомплексной патологии происходит отложение ИК на мембранах альвеол (экзогенный аллергический альвеолиг) и клубочков почек (иммунокомплексный гломерулонефрит) (Roitt I., 1996). Последующая аккумуляция ПМЛ на мембранах, обусловленная взаимодействием фиксированных иммунных комплексов с рецепторами ПМЛ (адгезия через Fey и/или СЗЬ рецепторы), детерминирует повреждение мембран продуктами секреции адгезированных ПМЛ. Нередкое присоединение вторичной инфекции приводит к ситуации, когда ПМЛ, прикрепленные к субстрату посредством Fey и/или СЗЬ рецепторов, подвергаются дополнительной стимуляции через аналогичные рецепторы бактериями, опсонизированными комплементом и/или антителами (гомологичная рестимуляция). Определение характера изменения реактивности ПМЛ при данных обстоятельствах означало бы прояснение важного момента в патогенезе указанных процессов.

ЦЕЛЬ НАСТОЯЩЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Изуче1ше феноменологии, механизмов и функциональных последствий адгезии ПМЛ к IgG. Изучение функциональных последствий адгезии ПМЛ к коллагену, СЗЬ и DEAE-сефадексу..

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Определить механизм снижешы количества нейгрофилов, адгезированных на IgG-поверхносги in vitro, с течением времени.

2. Изучить возможную гетерогенность нейгрофилов в реакциях IgG-зависимой адгезии.

3. Охарактеризовать изменения функционально-морфологического статуса ПМЛ и состояния адгезивной поверхности после продолжительного контакта на модели IgG-зависимой адгезии.

4. Изучить кислородзависимуто реактивность

нейтрофилов, адгезированных на рецепгорзависимых и рецепторнезависимом сорбентах, к различным стимулам.

НОВИЗНА РАБОТЫ Впервые подробно изучены механизмы десорбции нейтрофилов с IgG-субстратов. Доказано отсутствие гетерогенности ПМЛ в реакциях IgG-зависимой адгезии и участие первоначально не адгезировавшихся клеток в замедлении кинетики десорбции. Обнаружен феномен снижения сорбционной емкости IgG-покрытой поверхности при длительном физическом контакте с нейгрофилами и вскрыт его механизм - селективное связывание компонентов мембранных протеинов ПМЛ с поверхностью. Описаны изменения функционально-морфологического статуса нейтрофилов после естественной десорбции с IgG-покрьпых поверхностей: апоптозные изменения в значительной части клеточной популяции, снижение мембранной экспрессии FcyRII и FcyRIII.

Изучено изменение статуса реактивности ПМЛ, находящихся в состоянии рецепторзависимой и рецепторнезависимой адгезии, к гомологичным и гетер о логичным рецепторзависимым стимулам.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ В ходе исследования получена новая информация о механизмах и феноменах адгезии фагоцитов в патологии. Изучение гетерогенности нейтрофилов в реакциях IgG-зависимой адгезии, а также постдесорбционных изменений ПМЛ и адгезивной поверхности позволяет существенно расширить представления о регуляции воспалительной реакции. Обнаруженные in vitro феномены (пролонгирующий эффект первоначально неадгезированных нейтрофилов на IgG-зависимую адгезию популяции этих клеток, снижение сорбционной емкости рецепгорзависимых субстратов, селективное связывание мембранных протеинов с IgG-покрытой поверхностью, апоптозные изменения ПМЛ при адгезии, угнетение реактивности адгезированных ПМЛ к гомологичной рестимуляции) могут во многом детерминировать характер иммунокомплексного воспаления

на биомембранах (аллергический альвеолит, ИК-гломерулонефрит). Полученная нами информация будет полезна при разработке новых методов и препаратов для коррекции данных патологических состояний.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Умеш>1пение количества адгезированных ПМЛ на поверхностях, покрытых IgG, с течением времени связано с десорбцией клеток, сохраняющих гаггегральность плазматической мембраны.

2. Постдесорбционные изменения ПМЛ заключаются в индукщш апоптоза в значительной части клеточной популяции, уменьшении количества мембранных Fcy рецепторов II и III, но не I типа.

3. Пролонгированный (360-420 мин) контакт ПМЛ с поверхностями, покрытыми IgG и СЗЬ, приводит к снижению сорбционной емкости данных субстратов к свежей порции ПМЛ. В случае IgG-зависимой адгезии этот феномен сопровождается оставлением селективных протеинов мембраны ПМЛ на поверхности сорбента.

4. Нейтрофилы, адгезированные на различных рецепгорзависимых (покрытых IgG, СЗЬ, коллагеном I типа) и рецепторнезависимом субстрате (DEAE-сефадекс) в большинстве случаев демонстрируют пониженный по сравнению с ингакгаыми клетками хемилюминесцентный ответ на различные стимулы. Изменение хемилюминесцентного ответа адгезированных ПМЛ зависит от типа сорбента, стимулятора и усилителя ХЛ (лтомшюл или люцигенин).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из 3 глав, введения, заключения, выводов и списка литературы (6 отечественных и 187 иностранных источников), 15 рисунков и 4 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе исследованы нейтрофилы 258 здоровых людей. Проведено 247 анализов усиленной ХЛ лейкоцитов, 195 опытов по изучению специфической и неспецифической адгезии ПМЛ, в 53 экспериментах изучена экспрессия Fcy

рецепторов ПМЛ на FACS, проведена световая микроскопия 74 цитопрепаратов ПМЛ. Проведено 13 экспериментов по мечению наружных компонентов мембраны ПМЛ изотопом I125, выполнено 9 авторадиографий.

В качестве моделей рецепгорзависимых поверхностей были использованы декстрановые гранулы (сефадекс, сефароза, цитодекс-3) и 96-луночные планшеты, покрытые IgG, СЗЬ-фактором комплемента аш коллагеном.

ПМЛ выделяли из периферической венозной крови здоровых добровольцев путем центрифугирования на градиенте плотности Histopaque® (Sigma Diagnostics, США) согласно рекомендациям фирмы-изготовителя.

При оценке адгезии учитывали процент клеток, закрепленных на адгезивной поверхности на разных сроках.

Интегральность клеточной мембраны ПМЛ определяли в пробах исключения трипанового синего и иодида прогащня.

Для характеристики изменения морфофунк-ционального статуса нейтрофилов после десорбции использовали световую микроскопию препаратов, окрашенных по Гимзе, и определение количества Fey рецепторов трех классов на поверхности клеток проточно-щггофлюориметрическим методом.

В целях определения протеинов, оставленных на IgG-поверхности после десорбции нейтрофилов, клетки метили суправитально изотопом I125 (Owen Е., Knight V.A., Thomas H.W., 1973), инкубировали на IgG-поверхности до полной естественной десорбции, затем измеряли поверхностно-связанную радиоактивность.

Молекулярную массу связанных с IgG-поверхносгью протеинов определяли методом авторадиографии после электрофореза образцов в подиакриламидном геле с додевдшеульфатом натрия {SDS-PAGE} (Laemmli U.K., 1970).

Кислородзависимую реактивность адгезированных нейтрофилов характеризовали по интенсивности люминол-или люцигенин-зависимой хемилюминесценции, (ЛЗХЛ и ЛюцЗХЛ, соответственно), индуцированной форболмиристат-ацетатом (РМА), агрегированным IgG или

СЗЬ-опсоннзированным зимозаном (STZ).

Для оценки достоверности средней арифметической выборки и разницы средних, арифметических 2 выборок использовали 1-сгатисгику (применяли тесты для парных и независимых выборок). Значения I, соответствующие р < 0.05, были приняты как критерии достоверности.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для проверки возможной гетерогенности ПМЛ в реакциях ^С-опосредованной адгезии мы протестировали способность нейгрофилов, не адгезировавшихся за 30 мин к ^О-плашпсту, к повторной адгезии в тех же условиях на свежей адгезивной поверхности. Результаты продемонстрировали отсутствие какого-либо различия в проценте прикрепившихся клеток между свежей популяцией ПМЛ и клетками, собранными го супернатанта после первоначальной инкубации на сорбенте (23.00±1.5% и 23.4±2.00%, соответственно).

Таким образом, было доказано отсутствие гетерогенносш нейгрофилов в реакциях ^С-опосредовашгоп адгезии. Принимая во внимание полученные ранее данные о неполной адгезии популяции нейгрофилов к ^С-поверхности (Чеботарь И.В., 1989) при отсутствии ограничения по ее площади, данный результат указывает на существование внутрипопуляционного регуляторного механизма, определяющего долю прикрепившихся клеток в данных условиях.

Для определения природы снижения количества ПМЛ, ассоциированных с адгезивной поверхностью на поздних сроках инкубации (лизис или десорбция), мы использовали методики, позволяющие одновременно продемонстрировать наличие клеток в среде и оценить их жизнеспособность: световую микроскопию цитопрепаратов, окрашенных трипановым синим, и проточную щггофлюориметрию с окраской иодидом пропидия. Согласно полученным данным, к моменту полного исчезновения ПМЛ с адгезивной поверхности (420 мин) жизнеспособность клеток претерпевает лишь незначительное снижение (с 99.0+0.4% до 94.0+3.0% по трплановому синему и с 98.0±0.5% до 92.0±1.5% по иодиду

пропидия). То же самое верно в отношение чистоты популяции ПМЛ, которая падала (с 97.0±0.6% до 94.0±1.6%) за счет увеличения содержания клеточных обломков и агрегатов в популяции. Увеличение числа клеточных обломков свидетельствовало о лизисе части клеток, но в крайне незначительных масштабах. Таким образом, нами были получены прямые доказательства того, что снижение количества адгезированных на ^О-планшете ПМЛ с течением времени объяснялось десорбцией клеток, сохранивших интегральность цитоплазматической мембраны.

Поскольку нейтрофилы, не прикрепившиеся на момент наступления пика адгезии к ^О-планшегу (на ЗОЙ мин), сохраняли способность к зависимой сорбции, возникла вероятность интерпретации процесса адгезии как постоянного эквилибриума между прикреплением и откреплением различных ПМЛ, который являлся равновесным в фазе плато и смещенным в сторону десорбирующихся клеток в фазе десорбции. Подобная схема событий приводила бы к ускорению десорбции ПМЛ в случае устранения неадгезировавшихся к ЗОЙ мин клеток из супернатанга. Экспериментальная проверка подтвердила это предположение (Рис.1).

время инкубации нейтрофилов в 1дС-планшете, мин

Рис.1. Кинетика адгезии нейтрофилов (начиная с пика адгезии) к ^С-планшегу в присутствии (♦) и отсутствии (■)

неадгезировавшихся к ЗОЙ мин клеток в среде инкубации.

Полученные результаты свидетельствуют о пролонгирующем влияние первоначально неадгезировавшихся клеток на адгезию популяции нейтрофилов. Реализация подобного влияния может заключаться в постепенном замещении десорбирующихся клеток или замедлении их десорбции

Идентификация: процесса, приводящего к постепенному естественному снижению количества нейтрофилов на 1дО-поверхности, с десорбцией клеток поставила вопрос о выяснении механизмов данного явления. Немаловажное значение этой проблемы объясняется, с одной стороны, тем, что управление десорбцией ПМЛ с поверхностей, покрытых может открыть новые

возможности в терапии иммунокомплексной патологиии, а с другой стороны, терминация контакта нешрофила с субстратом в данном случае может иметь много общего с аналогичным, но также совершенно неизученным процессом, происходящим в каудальной области мигрирующего по субстрату фагоцита. В рамках решения этой задачи мы изучит! изменения ряда морфофункциональных характеристик нейтрофилов и свойств покрытой ^С поверхности после длительного взаимного контакта. Молекулярной основой десорбции нейтрофилов с рецегггорзависимой поверхности могло служить (1) простое рассоединение рецептора адгезии с лигандом, (2) шеддинг рецептора или части рецептора в зоне контакта и (3) оставление лиганда или части лиганда в соединении с рецептором при разрушении связи с субстратом. Для проверки этих альтернатив мы выполнили оценку количества РсуИ. на поверхности нейтрофилов после десорбции с ^О-планшета. Нейтрофилы, десорбировавшиеся к 420Й минуте демонстрировали снижение мембранной экспрессии FcyR.II (МР1=118±27 имп/ПМЛ) и РсуМН (МР1=122±29 имп/ПМЛ) по сравнению с контролем - нейтрофилами, инкубированными 420 мин на НЗА-планшете (МР1=243±32 имп/ПМЛ и 169±29 имп/ПМЛ, соответственно). В то же время, экспрессия РсуШ не претерпевала изменений (МР1 на 420 мин 43±17 имп/ПМЛ и

34±7 имп/ПМЛ в опыте и контроле, соответственно). Эти результаты согласуются с данными о том, что в формировании адгезивного контакт с поверхностью, покрытой агрегированным IgG, принимают участие только FcyRII и FcyRIII, но не Fc/RI (de Haas М. et al., 1995). Потеря мембранных FcyRII и FcyRIII нейтрофилами после их десорбции с IgG-плашпета происходит, очевидно, вследствие шеддинга (сбрасывания) этих рецепторов; однако, остается неясной локализация шеддинга - в зоне контакта клетки с субстратом или со свободной поверхности нейтрофилов (разрешение этого вопроса изложено ниже).

Сохранение десорбировавшимися нейтрофилами интегральности цитоплазм этической мембраны к столь позднему для этого типа клеток сроку (420 мин) в сочетании с утратой адгезивных свойств могло свидетельствовать об их апопгозе, поскольку оба эти признака проявляются у апоптозных ПМЛ (Savill J.C. et al., 1989; Dransfeld I., Stocks S.C., Haslett С. ,1995). Исходя из этих соображений, мы выполнили цитологическую оценку десорбировавшихся к 420й мин с поверхности IgG-планшета нейтрофилов. Доля апоптозных клеток в этой популяции - 31.00±5.61% -достоверно превышала показатели в контроле (нейтрофилы, инкубированные в силиконированной посуде), составлявшие 17.64±3.65%. Таким образом, адгезия на IgG-покрытой поверхности индуцировала апоптоз нейтрофилов. Можно предположить, что апоптозные ПМЛ утрачивали способность к прикреплению к IgG-покрытой поверхности, как это было продемонстрировано в отношении Е-селектина и фибриногена (Dransfeld I., Stocks S.C., Haslett С., 1995).

Так как данные по измерению количества мембранных FcyR на ПМЛ после десорбции с IgG-планшета выявили селективное снижение числа FcyRII и III (см. раздел II.2.1), это могло говорить о том, что некоторое количество FcyR (или их фрагментов) находится на поверхности субстрата - либо в результате оставления в зоне контакта при десорбции нейтрофилов, либо вследствие связывания с поверхностно-ассоциированным IgG после шеддинга в среду инкубации. В любом случае, гипотеза предсказывала снижение адгезивной

емкости ^О-поверхности в отношении свежей порции ПМЛ. Эксперхмент по проверке этого предположения подтвердил его справедливость: было отмечено резкое снижение сорбционной емкости ]^0-сефарозы в отношении свежей порции нейтрофилов после длительного предварительного контакта этой порции сефарозы с другими нейтрофилами. Аналогичный результат был достигнут' в пробах с СЗЬ-сефадексом, но не ОЕАЕ-сефадексом: последний не демонстрировал какого-либо изменения сор бидонных свойств. Таким образом, экспериментальные дагаше свидетельствовали о модификации нейтрофилами поверхности использованных нами рецепторзависимых субстратов (1цС-сефарозы и СЗЬ-сефадекса), приводящей к снижению сорбционной емкости последних.

Нами была предпринята попытка более детально охарактеризовать механизм модификации адгезивной поверхности. Прежде всего, мы установили степень локальности процесса, т.е. выяснили, происходила ли данная модификация только в зоне контакта клетки в субстратом, или на всей свободной площади поверхности, вследствие воздействия выделяемых нейтрофилами продуктов. Обработка ^С-сефарозы и СЗЬ-сефадекса (даже многократная) инкубационной средой, полученной после длительной инкубации нейтрофилов с другой порцией ^О-сефарозы, не привела к снижению показателей адгезии ПМЛ на данных сорбентах, что свидетельствовало в пользу первого объяснения.

Исходя из сделанного нами предположения о возможном оставлении нейтрофилами при десорбции мембранного материала на поверхности сорбента, приводящем к снижению адгезивных свойств последнего, мы попробовали непосредственно определить эти гипотетические мембранные компоненты на поверхности ^О-планшета и выяснить их природу. Проверка дала положительные результаты: меченые I125 нейгрофилы после десорбции с ^С-планшета оставляли на его поверхности значительное количество радиоактивного материала (0.08-0.1% от общей активности адгезировавшихся к 30-й мин клеток), которое

существенно превышало таковое для покрытой НБА поверхности (Таблица 1)._

420 мин, неадгезировавшиеся ПМЛ удалены на ЗОЙ мин

^О-планшет ША-планшет

имп/мин х 1000, М±т 730.5±71.9* 135.4±44.7

Таблица 1. Активность адгезивных поверхностей после контакта с мечеными I125 нейтрофилами. Поверхностные компоненты нейгрофильной мембраны были помечены I125, затем клетки инкубировали в лунках 1^0- или НБА-планшета 420 мин (2х10б ПМЛ/мл, 0.2мл в лунку), лунки отмывали и измеряли поверхностно-связанную радиоактивность лунок. Неадгезировавшиеся к 30 мин ПМЛ были удалены. Результаты суммированы по 6 экспериментам. Звездочки (*) отмечают значимую разницу от ША-планшета.

Поскольку использованный нами метод суправитальной инкорпорации I125 в мембрану клеток позволял метить не только белки, но и липиды, для подтверждения (или опровержения) белковой природы обнаруженных радиоактивных субстанций материал, собранный с поверхности лунки 1§С-планшета после десорбции нейгрофилов, был подвергнут БОБ-РАОЕ с последующей авторадиографией. Полученные

электр офореграммы подтвердили наличие белковых компонентов в образце.

Паттерн распределения полос протеинов, оставленных нейтрофилами в ассоциации с ^С-поверхностью, не повторял таковой для лизата ПМЛ: две наиболее интенсивные и четко выраженные полосы наблюдались вблизи 28кОа и 15 кОа зон, в то время как лизат нейгрофилов демонстрировал большее число полос с наиболее массивной в районе68 кБа. Это говорило о накоплении селективных мембранных белков на поверхности ^О-планшета после десорбции нейгрофилов. Спектр белков, связанных с поверхностыо, отличался также от набора протеинов, оставленных на поверхности ША-планшета: в последнем

случае не только не наблюдалось выраженных полос в диапазоне определяемых молекулярных масс, но и "фоновая" затемненность образца (в случае уравнивания образцов с ША-и ^С-планшетов по величине радиоактивности) была ниже, что свидетельствовало о присутствии большего числа низкомолекулярных продуктов с Мг<15кБа .Такое несовпадение профилей оставленных нейгрофилами на НБА- и Гдв-поверхностях протеинов свидетельствовало о специфичности процессов шеддинга мембранных белков, определяемой природой лигандов субстрата. Природа оставленных на ^О-планшете белков остается неясной; можно, однако, предположить, что они являются компонентами FcyR.II и/или III. Возможность аккумуляции на поверхности целых рецепторов (или их цепей) исключена, поскольку молекулярная масса наиболее стабильно воспроизводимой при авторадиографии полосы (между 18 и 28 кТ)а) слишком низка по сравнению с цепями, входящими в состав FcyR.II и III.

Последним вопросом, интересовавшим нас в отношении адгезированных на и СЗЬ-поверхностях

нейтрофилов, было изменение реактивности этих клеток в ответ на гомологичные (т.е. действующие через те же рецепторы, что и лиганды субстрата) стимулы. Этот вопрос является практически неизученным, несмотря на то, что подобная ситуация может часто иметь место при иммунокомплексном воспалении. Для сравнения мы также использовали рецепторзависимую гегерологичную (т.е. опосредованную другими, нежели молекулы прикрепления к данному субстрату, рецепторами) и неспецифическую (форболмиристатацетатом) стимуляцию. В дополнение к ^О-сефарозе и СЗЬ-сефадексу в этой серии экспериментов мы исследовали Суг-З и ОЕАЕ-сефадекс. В качестве индикатора реактивности нейтрофилов применялась люминол-зависимая и люцигнин-зависимая хемилюминесценция. Позитивным контролем служили ПМЛ во взвеси. Нейтрофилы, адгезированные на ^С-сефарозе и СЗЬ-сефадексе, демонстрировали резкое угнетение ЛЗХЛ в ответ на БТг и lgG при сохранненной реакции на неспецифическую

стимуляцию PMA. (Рис. 2)

Рис.2. Характеристика ЛЗХЛ-ответа нейгрофилов, адгезированных к различньш поверхностям. Нейтрофилы инкубировали 30 мин с указанными сорбентами (или во взвеси - кошроль), отмывали несвязавшиеся клетки и стимулировали стандартное количество адгезированных клеток (500х103) приведенными в легенде стимуляторами. Отмечали интенсивность максимальной ЛЗХЛ относительно контроля -суспензии клеток.

Напротив, клетки, закрепленные на DEAE-сефадексе, обладали резко сниженным ответом на все стимулы. Нейтрофилы, находящиеся в контакте с Cyt-З, занимали промежуточное положение: их отвечаемостъ на рецепторзависимые стимулы была полностью подавлена, в то время как реакция на РМА оставалась частично сохраненной. Подавление ЛЗХЛ адгезированных клеток в ответ на рецепторзависимые стимулы (а для DEAE-сефадекса и Cyt-З и на рецепторнезависимьш агент) могло иметь двоякое толкование. Поскольку люминол в основном регистрирует хемилюминесценцию в системе ШОг-миелопероксидаза-НОО (McPhail L.C., Snyderman R., 1984), полученный результат

указьшал либо на дефицит формирования субстрата миелопероксидазных реакций - супер оксид-аниона, либо на дефекты миелопероксидазной системы и/или сопряжения миелопероксидазной системы с супероксид-анионом. Прояснить ситуацию были призваны эксперименты по измерению ЛюцЗХЛ, т.к. лгоцигенин обладает высокой избирательностью в отношении супероксид-аниона, слабо реагируя на Н2О2 и систему НгОг-миелопероксидаза-НОСг-(СуИепЬаттагН., 1987).

Паттерн ЛюцЗХЛ-ответа адгезированных

нейтрофилов напоминал таковой для ЛЗХЛ: относительные величины ЛюцЗХЛ при стимуляции рецегггорзависимыми агентами бьши существенно ниже, чем в контроле, для всех сорбентов (Рис.3).

120

Р суспензия Ь>0-сефароза СЗЬ-сефадекс СуЮйехЗ ВЕАЕ-

клеток сефадекс

Рис.3. Характеристика ЛюцЗХЛ-ответа нейтрофилов, адгезированных к различным поверхностям. Нейтрофилы инкубировали 30 мин с указанными сорбентами (или во взвеси - контроль), отмывали несвязавшиеся клетки и стимулировали

стандартное количество адгезироваиных клеток (500x101) приведенными в легенде стимуляторами. Отмечали интенсивность максимальной ЛюцЗХЛ относительно контроля - суспензии клеток.

Однако, имелись и некоторые отличия. Во-первых, реакция на РМА в случае IgG-сефарозы и СЗЬ-сефадекса также была значительно подавлена. Во-вторых, величины ответа прикрепленных к IgG-сефарозе и СЗЬ-сефадексу нейгрофилов на рецепгорзависимые стимулы были значимо выше, чем при использовании люминола. Одинаковая степень угнетения ЛЗХЛ и ЛюцЗХЛ нейгрофилов, адгезироваиных к Cyt-З и DEAE-сефадексу, в ответ на все типы стимуляторов говорила о том, что в этих условиях подавление ЛЗХЛ-ответа ПМЛ могло происходить всецело за счет угнетения образования супероксид-аниона. Однако, подавление активности этих двух систем (супероксид-генерирующей и НгОг-миелопероксидаза-НОСг-) при адгезии ПМЛ происходит не обязательно в равной степени, что следует из описанной выше второго отличия ЛюцЗХЛ-ответа от ЛЗХЛ-ответа. Более того, активность системы ШОг-миелопероксидаза-НОО адгезироваиных нейгрофилов иногда изменяется в противоположном супер оксидной системе направлении (повышается), как видно при сравнении относительных величин интенсивности ЛЗХЛ-и ЛюцЗХЛ-ответов прикрепившихся к СЗЬ-сефадексу ПМЛ.

ВЫВОДЫ

1. Нейтрофилы человека не демонстрируют гетерогенность в реакциях IgG-опосредованной адгезии.

2. Не прикрепившиеся ко времени наступления пика алгезии нейтрофилы способствуют пролонгированию адгезии популяции ПМЛ к IgG-покрыгой поверхности.

3. Уменьшение с течением времени количества ПМЛ, ассоциированных с IgG-покрыгой поверхностью, практически целиком обусловлено десорбцией клеток, сохраняющих интегральность щггоплазматической мембраны.

4. Постдесорбционные изменения ПМЛ в случае адгезии на IgG-покрытой поверхности заключаются в индукции апогтгоза в значительной части клеточной популяции (около 30%) и снижении мембранной экспрессии

задействованных в адгезии рецепторов - FcyRII и FcyRIII - без изменения количества FcyRI.

5. Адгезия нейгрофилов на IgG-поверхности с последующей десорбцией приводит к снижению ее адгезивной емкости за счет оставления клетками селективных мембранных белков.

6. Нейтрофилы, десорбировавшиеся естественным образом с IgG-поверхности, оставляют на субстрате мембранные белки (или их компоненты) с молекулярной массой около 15 и 28 kDa. Последние, вероятно, являются фрагментами Fcy рецепторов II и/или III типов.

7. Реактивность нейгрофилов (по данным ЛЗХЛ и ЛюцЗХЛ), закрепленных на рецепторзависимых (IgG-сефароза, СЗЬ-сефадекс, Cyt-З) или рецепторнезависимом (DEAE-сефадекс) сорбентах, к рецепторзависимым (действующим через FcR или CR3) или неспецифическим (РМА) стимулам снижается во всех случаях, за исключением ЛЗХЛ-ответа нейгрофилов, прикрепленных к IgG-сефарозе и СЗЬ сефадексу, на РМА.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чеботарь И.В., Маянский А.Н., Соловьев К.Ю., Челышев

И.В. (1992) Влияние конканавалина А на различные типы адгезии нейгрофилов человека. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины CXIV(7), 66-68.

2. Маянский А.Н., Челышев И.В., Чеботарь И.В. (1993) Кондиционирование IgG- и СЗЬ-зависимых реакций нейгрофилов в условиях специфической и неспецифической адгезии. Иммунология №1, 23-25.

3. Челышев И.В., Маянский А.Н. (1993) Изменение адгезивной способности субстратов в процессе IgG- и СЗЬ-зависимой адгезии полиморфноядерных лейкоцитов. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины CXV(6), 641-642.

4. Доценко В.Л., Нешкова Е.А., Чеботарь И.В., Челышев

И.В., Маянский А.Н., Яровая Г.А. (1994) Секретирование сериновой связанной с мембраной протеиназы по-лиморфноядерными лейкоцитами в условиях адгезии на

различных типах рецепторзависимых и рецепгорнезависимых сорбентов. Вопросы Медицинской Химии 40(3), 11-15.

5. Челышев И.В., Маянский А.Н., Чеботарь И.В. Особенности реактивности нейтрофилов человека в условиях адгезивного процесса. // Факторы гуморального и клеточного иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях. Тезисы XI научной конференции. Челябинск, 1992. - с. 111-112.

6. Чеботарь И.В., Заславская М.И., Соловьев К.Ю., Челышев И.В. Лектинзависимое кондиционирование в системе IgG-опосредованных реакций нейтрофила. // Тезисы I съезда иммунологов России. Новосибирск, 1992. - с.526.

7. Dotsenko V., Neshkova Н., Chebotar I., Chelyshev I., Mayansky A., Yarovaya G. Adhesion-dependent secretion of the membrane serine proteinase by human polymorphonuclear leukocytes. Abstracts. Kinin. Brazil, 1993, P37, 3.10.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ЛДГ - лактатдегадрогеназа ЛЗХЛ - люминол-зависисая ХЛ ЛюцЗХЛ - люцигенин-зависимая ХЛ ПМЛ - полиморфноядерный лейкоцит(ы) ХЛ - хемшпоминесценция

C3b(i) - C3b-complement factor (inactivated), СЗЬ-фактор

комплемента (инакгивированный) СЗЬ-сефадекс - C3b-conjugated sephadex, сефадекс,

конъюгированный с СЗЬ-фактором комплемента Cyt-3 - cytodex-З, цигодекс-3 DEAE-сефадекс - диэтиламиноэтил-сефадекс FACS - fluorescence-activated cell sorter(ing), проточный

цитофлюориметр(ия) FcyR - fragment crystallizable gamma receptor, рецептор к Fc

фрагментам у-цепей IgG HSA - human serum albumin, альбумин сыворотки крови человека

IgG - immunoglobulin G, иммуноглобулин G

IgG-сефароза - сефароза, конъюшрованная с IgG

MFI - mean fluorescence intensity, средняя интенсивность

флюоресценции