Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Значение перекисного окисления липидов в формировании дисфункций нейтрофилов

Р Г Б ОД

1 7 ОКТ 1396

На правах рукописи

Милютин Максим Викторович

ЗНАЧЕНИЕ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В ФОРМИРОВАНИИ ДИСФУНКЦИЙ НЕЙТРОФИЛОВ.

14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Пермь -1996

Работа выполнена в Кировском государственном медицинском институте на кафедре патологической физиологии.

Научный руководитель - доктор медицинских наук В.Ф.Кузнецов.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Б.Я.Сыропятов кандидат медицинских наук, доцент Е.И.Самоделкин

Ведущая организация - НИИ экспериментальной медицины РАМН

(Санкт-Петербург)

Защита состоится ".......".................... 1996 г. в......часов на заседании

Диссертационного совета К.084.09.01 при Пермской государственной медицинской академии по адресу: 614600, г. Пермь, ул. Куйбышева, д. 39.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета, доцент

Р.С.Кузяев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

In vivo фагоцитарный процесс формируется при адгезии нейтро-филов на поверхности тканей. Для обозначения представленного варианта фагоцитоза используют термин "поверхностный" фагоцитоз (Адо А.Д., 1963; Klebanoff S.J., Clark R.A., 1978). Эритроциты являются универсальным объектом для исследования процесса взаимодействия инфекционных агентов с тканями организма (Neter Е., Zalewski N.J., Zak D.A., 1953), поэтому их используют в качестве подложки при изучении "поверхностного" фагоцитоза (Кузнецов В.Ф., 1995; Кузнецов В.Ф., Давидов М.И., Обернебесова Т.П., 1995), а данную модель рассматривают как метод исследования in vitro процесса взаимодействия нейтрофилов и чувствительных к ним тканей с микробными агентами (Кузнецов В.Ф., 1995).

Достаточно полно изучены закономерности регуляции фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН) в условиях нормы и при патологии. В этой связи большое внимание уделяется интерлейкинам, цитокинам, белкам "острой фазы", молекулам адгезии (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989; Долгушин И.И. и соавт., 1992), эритроцитам (Nelson R.A., 1953; Кузнецов В.Ф., 1995). Имеются сведения о влиянии антиоксидантов на фагоцитоз (Boxer L.A., 1990; Schmidt Von К. et al., 1991; Droge W. et al., 1992; и др.), что свидетельствует о воздействии продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) на фагоцитарный процесс. Однако не изучены физиологические закономерности фагоцитоза на поверхности аутологичных эритроцитов в системе корреляционных взаимосвязей с продуктами ПОЛ в крови.

Недостаточность фагоцитоза имеет место при многих заболеваниях человека и животных (Klebanoff S.J., Clark R.A., 1978; Йегер Л., 1990; Дзержинская И.И., Хамаганова Е.Г., 1992; Калугина Г.В., Клушан-цева М.С., Шехаб Л.Ф., 1993; и др.). Поэтому иммунодефицитные состояния, характеризующиеся снижением фагоцитоза, являются актуальной проблемой медицины. Однако в литературе мало представлены сведения об универсальных патогенетических путях этой патологии. В этой связи привлекает внимание такой универсальный механизм повреждения как процесс перекисного окисления липидов, но его значение как фактора патогенеза недостаточности "поверхностного" фагоцитоза не изучено.

Вышесказанное определило актуальность цели и задач настоящего исследования.

Цель исследования. Изучить закономерности фагоцитарного процесса на поверхности аутологичных эритроцитов в условиях влияния продуктов ПОЛ в норме, а также при экспериментальной патологии.

Задачи исследования.

1. На модели фагоцитоза in vitro, в котором воспроизводится процесс инфицирования в тканях, изучить корреляционные связи фагоцитарных показателей и уровней продуктов ПОЛ в зависимости от пола обследованных, вида объектов фагоцитоза и величины поглотительной активности нейтрофилов.

2. Разработать экспериментальную модель недостаточности фагоцитоза in vivo, формирующегося на поверхности аутологичных эритроцитов, при активации процессов ПОЛ.

3. Изучить функциональный популяционный состав нейтрофи-лов и их бактерицидную активность при экспериментальной недостаточности "поверхностного" фагоцитоза.

4. Изучить активность сурфактанта, отражающего состояние легочной ткани, при воспалительных процессах в легких, являющихся следствием недостаточности фагоцитарного процесса.

Научная новизна.

Впервые изучен фагоцитоз на поверхности седиментированных клеток крови (динамика и популяционный состав фагоцитирующих нейтрофилов) в зависимости количества продуктов ПОЛ в цельной крови у мужчин и женщин, уровня поглотительной активности нейтрофилов, при применении объектов фагоцитоза различной антигенной специфичности.

В оригинальной экспериментальной модели недостаточности фагоцитоза (снижение поглотительной и бактерицидной активности нейтрофилов) у свиней впервые изучены изменения популяционного состава нейтрофилов, участвующих в фагоцитарном процессе на поверхности седиментированных эритроцитов, проявляющиеся в количественном сужении в 2 раза размеров популяций микрофагов, которые реально принимают участие в фагоцитозе, то есть малоактивных и высокоактивных нейтрофилов. Удельная поглотительная активность нейтрофилов с высоким поглотительным потенциалом не изменялась. Введение в корм антиоксидантов отменяло представленные сдвиги и снижало заболеваемость пневмониями с 75 до 3 %, т.е в 25 раз.

При экспериментальной недостаточности "поверхностного" фагоцитоза у свиней впервые установлено снижение активности сурфактанта под влиянием ПОЛ, что может являться фактором патогенеза пневмоний, характерных для этого иммунодефицитного состояния.

Практическая ценность.

Приведенные в работе материалы, описывающие соотношение фагоцитарных показателей и уровней продуктов перекисного окисления липидов в крови у людей разного пола, позволяют более корректно осуществлять отбор здоровых людей в контрольных исследованиях.

Представления о взаимоотношениях фагоцитоза и интенсивности ПОЛ в норме и при экспериментальной патологии позволяют уточнить механизмы формирования недостаточности фагоцитарного процесса, являющегося универсальным фактором патогенеза при заболеваниях человека и животных. Эти материалы необходимо учитывать при осуществлении иммунокоррекции.

При осуществлении профилактики недостаточности фагоцитарного процесса у свиней совхоза "Заречье" оценен предотвращенный экономический ущерб.

Результаты работы можно использовать в учебном процессе, в научно-исследовательских учреждениях иммунологического, терапевтического и ветеринарного профиля.

Положения, выносимые на защиту.

1. У мужчин и женщин, имеющих различные уровни продуктов ПОЛ в крови, наблюдаются различия уровней "поверхностного" фагоцитоза в отношении шигелл Зонне. Это проявляется в более высоких показателях ФАН у женщин. При использовании объектов фагоцитоза (ОФ) шигелл Флексиера различий среди фагоцитирующих популяций нейтрофилов у мужчин и женщин не наблюдается. Фагоцитоз кишечных иерсиний характеризуется более высоким содержанием нефагоцитирующих нейтрофилов у лиц мужского пола.

2. У мужчин и женщин наблюдается различный - в зависимости от интенсивности захвата ОФ - характер влияния продуктов ПОЛ на фагоцитоз. У мужчин отмечается универсальная позитивная корреляция уровней продуктов ПОЛ и фагоцитарных показателей. У женщин продукты ПОЛ позитивно коррелируют со слабо выраженным фагоцитозом и негативно - с "интенсивным. "

3. Динамика фагоцитарного процесса при использовании

различных ОФ отличается у мужчин и женщин. Нейтрофилы женщин уже к 10 минуте фагоцитоза шигелл Зонне достигают максимума поглотительной активности, в то время как у мужчин ФАН продолжает нарастать до 20 минуты. При применении шигелл Флекснера и кишечных иерсиний рост фагоцитоза у мужчин идет за счет увеличения удельной поглотительной активности высокоактивных нейтро-филов, а у женщин также и- за счет расширения количественных рамок фагоцитирующих популяций нейтрофилов.

4. При экспериментальной недостаточности фагоцитоза у свиней, характеризующейся снижением поглотительной и бактерицидной активности нейтрофилов, количественные рамки фагоцитирующих популяций нейтрофилов сужаются в 2 раза, но при этом удельная поглотительная активность высокоактивных нейтрофилов не изменяется. Введение антиоксидантов отменяет данные сдвиги.

5. При патологической активации ПОЛ in vivo снижается активность сурфактанта, что является фактором патогенеза пневмонии.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены на заседаниях кафедры патологической физиологии Кировского государственного медицинского института, на проблемной комиссии № 1 "Морфология и морфогенез, нормальная и патологическая физиология" Кировского государственного медицинского института, на заседании Кировского городского общества физиологов при РАН. Результаты работы доложены и опубликованы на итоговых конференциях Кировского НИИ гематологии и переливания крови, Кировского Государственного педагогического университета, 1-й научной конференции "Актуальные вопросы медицины труда и промышленной экологии", научной конференции, посвященной 50-летию Победы в Великой Отечественной войне "Достижения медбиофизики и клинической биохимии - в практику здравоохранения".

Основные положения работы освещены в 8 научных публикациях.

Внедрение работы.

Полученные результаты использованы в учебном процессе ряда кафедр (медбиофизики, микробиологии) Кировского государственного медицинского института; в работе Регионального центра по лечению гемофилии при Кировском НИИ гематологии и переливания крови; в исследованиях Кировского НИИ охотоведения и звероводства им,

проф. Житкова; в ветеринарной работе свиноводческого хозяйства "Заречье".

Объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных экспериментальных исследований, изложенных в 2 главах, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 138 страницах и включает 16 таблиц и 12 рисунков. Библиографический указатель имеет ссылки на работы отечественных (75) и иностранных (56) авторов.

Настоящая работа является составной частью комплексного изучения фагоцитарной активности нейтрофилов на поверхности аутоло-гичных клеток крови в норме и в условиях патологии (научный руководитель - д.м.н. Кузнецов В.Ф.), осуществляемого на кафедре патологической физиологии (зав. - д.м.н. Кузнецов В.Ф.) Кировского государственного медицинского института (ректор - заслуженный деятель науки РФ, Лауреат Государственной премии, профессор Журавлев В.А.).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Фагоцитарную активность нейтрофилов оценивали на модели in vitro для исследования фагоцитоза к микробным агентам на поверхности аутологичных клеток крови. Изучение проводили по методу, описанному в заявке на изобретение № 5033772/14(008501) (Кузнецов В.Ф., Обернебесова Т.П. "Способ исследования фагоцитоза в цельной крови", положительное решение от 21.12.1994 года) и в патенте РФ на изобретение № 2038820 (Кузнецов В.Ф. "Способ определения неспецифической резистентности организма у свиней"). В качестве объектов фагоцитоза использовали антигенные эритро-цитарные диагностикумы (ЭД) для реакции непрямой гемагглюти-нации (РНГА) из шигелл Зонне, Флекснера и кишечных иерсиний (СПбНИИВС). Определяли следующие показатели ФАН: процент фагоцитоза (%Ф), фагоцитарное число (ФЧ), фагоцитарный индекс (ФИ), объемный фагоцитоз (Об.Ф). Для оценки популяционного состава нейтрофилов определяли процент неактивных (нулевых) нейтрофилов (поглотивших 0 объектов; %0-нф), процент малоактивных нейтрофилов (поглотивших один ОФ; %ма-нф), процент активных нейтрофилов (поглотивших 2 и более ОФ; %а-нф), фагоцитарный индекс активных нейтрофилов (ФИ а-нф), индекс активности фагоцитоза (ИАФ) (Каплин В.Н. с соавт., 1993).

Для оценки кислородзависимых механизмов бактерицидной активности нейтрофилов использовали спектрофотометрический вариант НСТ-теста (Okamura et al.,1976; Гордиенко С.М., 1983).

Исследование уровней продуктов перекисного окисления липи-дов в цельной крови в гептан-изопропанольных экстрактах проводили по Волчегорскому И.А. и соавт. (1989).

Определение сурфактанта у свиней производилось по Pattle RJE. (1958). В качестве исследуемого материала брались кусочки легких свежезабитых свиней. По изменению диаметра пузырьков вычисляли коэффициент стабильности (Stability ratio, S.r), величина которого прямо коррелирует с количеством и активностью сурфактанта. Оценка состояния сурфактанта у каждого животного проводилась в обоих легких, кроме того, подсчитывался средний S.r.

Экспериментальную модель недостаточности фагоцитоза у свиней ставили по оригинальной методике (Кузнецов В.Ф., Милютин М.В. с соавт., 1992).

Фагоцитоз на поверхности аутологичных эритроцитов в отношении ОФ шигелл Зонне, Флекснера и кишечных иерсиний, а также уровень продуктов перекисного окисления липидов в цельной крови изучен у 21 человека. В эту группу вошли практически здоровые люди с нормальными показателями общих анализов крови и мочи, а также иммунограммы. Иммунограмма определялась в лаборатории д.м.н. Г.А.Зайцевой (Кировский НИИ гематологии и переливания крови).

При изучении вторично формирующейся недостаточности фагоцитоза у свиней совхоза "Заречье" была обследована кровь 71 животного. Осуществлена профилактика недостаточности фагоцитарного процесса путем назначения в корм антиоксиданта дилудина (726 животных), у 43 свиней оценивали активность сурфактанта.

Статистические методы.

Использовали t-критерий Стьюдента, критерии непараметрической статистики (Вилкоксона и Вилкоксона-Манна-Уитни), а также методы корреляционного и регрессионного анализа (Плохинский Н.А., 1970; Гублер Е.В., 1978). Для расчета большинства статистических показателей использовали пакет прикладных программ для персонального компьютера МОД-81М (Венгрия) (разработаны и любезно предоставлены Ю.И.Шиловым и Н.А.Шиловой), а также коммерческий пакет DIASTA на ПК IBM АТ/386.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Физиологические закономерности влияния, продуктов ПОЛ на фагоцитоз к ОФ различной специфичности.

Особенности фагоцитарного процесса у мужчин и женщин.

Ранее (Кузнецов В.Ф., Обернебесова Т.П., 1994) был установлен более высокий уровень поверхностного фагоцитоза к шигеллам Зонне у женщин по сравнению с мужчинами. В настоящей работе изучен популяционный состав нейтрофилов у мужчин и женщин при использовании ОФ различной антигенной специфичности.

В случае применения ОФ шигелл Зонне у мужчин на 10 минуте фагоцитоза достоверно выше был показатель %0-нф, отражающий неактивную популяцию микрофагов. В то же время у женщин достоверно более высокими оказались показатели, характеризующие популяции нейтрофилов, вовлеченные в фагоцитоз (%ма-нф, %а-нф, ФИ а-нф, ИАФ). На 20 минуте приведенные показатели не различаются. По сравнению с 10 минутой достоверный рост активности нейтрофилов на 20 минуте наблюдался только у мужчин.

При использовании ОФ шигелл Флекснера наблюдался в целом более высокий уровень фагоцитарной активности нейтрофилов, чем при использовании ОФ шигелл Зонне. Но в то же время не зафиксировано различий в уровне фагоцитоза у мужчин и женщин.

Фагоцитоз иерсиний оказался достоверно выше уровня фагоцитоза шигелл Зонне и достоверно ниже уровня фагоцитоза шигелл Флекснера. При анализе различий по половому признаку на 5 минуте процесса достоверных различий не обнаружено. На 10 минуте у мужчин оказался достоверно более высоким показатель %0-нф, но среди популяций нейтрофилов, реально проучаствовавших в фагоцитозе (ма-нф и а-нф), достоверных различий у мужчин и женщин не найдено.

Таким образом, различия фагоцитоза у мужчин и женщин отмечаются при использовании ОФ шигелл Зонне, в отношении которых установлены наименьшие уровни поглотительной активности. При использовании ОФ иерсиний, величины фагоцитоза которых занимали среднюю позицию, показатели ФАН в меньшей степени зависели от пола. В этом случае различия заключались только в количестве нулевых нейтрофилов, которых было больше у мужчин. При использовании ОФ шигелл Флекснера, поглотительная активность по отношению к которым оказалась самой высокой, влияния полового признака не установлено.

У мужчин и женщин найдены также различия в динамике фагоцитоза к ОФ различной антигенной специфичности.

Так, при использовании ОФ шигелл Зонне (рис. 1) на 20 минуте,

16 14 12 10 8 6 4 2 0

Рис. 1. Динамика фагоцитоза у мужчин и женщин при использовании ОФ шигелл Зонне.

к

ж

щ

Ш

Г?

щ г4- щ

10' 20' 10'20' 10'20' 10'20' 10'20' 10'20' 10'20' 10'20' 10'20' 10'20' с?9с??с?9с??а,9

% 0-нф-Ю1 •/. ма-нф % а-нф ФИ а-нф ИАФ-10

по сравнению с 10 минутой, достоверный рост активности нейтрофилов наблюдался только у мужчин. Отсюда можно заключить, что в отношении шигелл Зонне нейтрофилы мужчин и женщин обладают разной реактивностью, хотя со временем в одинаковой мере реализуют свой поглотительный потенциал.

При использовании ОФ шигелл Флекснера (рис. 2) у мужчин к 10 минуте фагоцитарного процесса возрастают, в сравнении с 5 минутой, показатели ФИ а-нф и ИАФ. В то же время не различаются на 5 и 10 минутах фагоцитоза показатели %0-нф, %ма-нф, %а-нф. Это означает, что у мужчин количественный состав различных популяций нейтрофилов в динамике фагоцитарного процесса изменений практически не претерпевает, а нарастание активности фагоцитоза происходит за счет более полной реализации поглотительного потен-циала активных нейтрофилов. Поэтому можно говорить об "интенсивном" нарастании у мужчин фагоцитоза к ОФ шигелл Флекснера. У женщин к 10 минуте, в сравнении с 5 минутой, выросли показатели %а-нф,

ФИ а-нф и ИАФ. Не изменились показатели %0-нф и %ма-нф. Из этого следует, что рост фагоцитоза у женщин произошел не только

У.О-нф-Ю' '/• ма-нф % а-нф-10-' ФИ а-нф ИАФ-10

Рис.2. Динамика фагоцитоза у мужчин и женщин при использовании ОФ шигелл Флекснера.

из-за более полной реализации поглотительного потенциала активных нейтрофилов (интенсивно), но и за счет количественного расширения рамок этой популяции (экстенсивно). Источником же пополнения популяции активных нейтрофилов могут быть микрофаги двух других популяций (нулевые и малоактивные).

Динамика фагоцитарного процесса оказалась различной у мужчин и женщин также и при использовании в качестве ОФ кишечных иерсиний (рис. 3). У мужчин к 10 минуте фагоцитоза, в сравнении с 5 минутой, достоверно вырос ИАФ. У женщин к 10 минуте достоверно возросли показатели %а-нф, ФИ а-нф и ИАФ, и в то же время достоверно снизился показатель %0-нф. Таким образом, у женщин нарастание фагоцитоза произошло как за счет количественного увеличения популяции активных нейтрофилов (экстенсивно), так и за счет более полной реализации активными нейтрофилами своего поглотительного потенциала (интенсивно). Аналогичная динамика фагоцитарного процесса, как уже отмечалось выше, имела место при фагоцитозе шигелл Флекснера, и похожая - при фагоцитозе шигелл Зоине.

% 0-нф-Ю' •/. ма-нф % а-нф ФИа-нф ИАФ-10

Рис.3. Динамика фагоцитоза у мужчин и женщин при использовании ОФ кишечных иерсиний.

Приведенные материалы свидетельствуют о том, что половые различия фагоцитоза можно выявить не только при анализе абсолютных параметров, но и при исследовании их динамики.

Корреляционые взаимосвязи уровней продуктов ПОЛ в цельной крови и фагоцитарной активности нейтрофилов у мужчин и женщин.

Установлены половые различия в количестве продуктов ПОЛ в гептан-изопропанольных экстрактах цельной крови. Так, у женщин выявлено более высокое количество диеновых конъюгатов (экстинция при длине волны 232 нм), кетодиенов и сопряженных триенов (278 нм). Кроме того, у женщин оказались достоверно выше индексы экстинций 232/220 и 278/220.

Различия в уровнях продуктов ПОЛ у мужчин и женщин предполагают и различное их влияние на фагоцитоз. Материалы этих исследований приведены ниже.

Ранее нами (Кузнецов В.Ф., Милютин М.В., Перера Л.Л., 1995) были описаны особенности корреляционных взаимосвязей показателей физико-химического гомеостаза (в частности, продуктов ПОЛ в цель-

ной крови) и фагоцитоза на поверхности.аутологичных клеток крови. В представленной же работе исследованы закономерности влияния продуктов ПОЛ на поверхностный фагоцитоз у лиц различного пола. Для этого изучены корреляционные взаимосвязи (линейная корреляция и линейная регрессия) показателей ПОЛ и ФАН при использовании ОФ различной антигенной специфичности у мужчин и женщин (см. таблицу).

Таблица.

Корреляционные взаимосвязи уровней продуктов ПОЛ и показателей ФАН к различным объектам фагоцитоза у мужчин и женщин.

ВИД ОБЪЕКТОВ ФАГОЦИТОЗА

Шигелла Зонне Кишечная иерсиния Шигелла Флекснера

МУЖЧИНЫ + + +

ЖЕНЩИНЫ + - -

В случае применения ОФ шигелл Зонне на 10 минуте фагоцитарного процесса у мужчин выявлена положительная корреляционная взаимосвязь между ФИ а-нф и активностью продуктов ПОЛ при всех экстинциях, а также между ФИ а-нф и индексами экстинций 232/220 и 278/220. Таким образом, что у мужчин при использовании ОФ шигелл Зонне процессы перекисного окисления липидов оказывают, вероятно, стимулирующее влияние на популяцию активных нейтрофилов, увеличивая их поглотительную активность.

У женщин на этой же минуте выявлена положительная корреляция между %а-нф и количеством диеновых конъюгатов (экстинция при длине волны 232 нм) и между %а-нф и уровнем кетодиенов и сопряженных триенов (278 нм), а также между ИАФ и активностью продуктов ПОЛ в цельной крови. Таким образом, у женщин при использовании ОФ шигелл Зонне продукты ПОЛ стимулируют фагоцитарную активность посредством расширения количественных рамок популяции активных нейтрофилов (а-нф) за счет других популяций (ма-нф, 0-нф).

Приведенные материалы свидетельствуют об активирующем влиянии продуктов ПОЛ у мужчин и женщин на поглощение ОФ шигелл Зонне в начальный период фагоцитарного процесса.

На 20 минуте достоверных корреляционных взаимосвязей между показателями ФАН и ПОЛ не выявлено ни у женщин, ни у мужчин. Вероятно, при достаточно высоком уровне поглотительной активности стимулирующее влияние ПОЛ на фагоцитарный процесс перестает сказываться.

Изучены также корреляционные взаимосвязи показателей ПОЛ и ФАН с шигеллами Флекснера у мужчин и женщин.

На 5 минуте фагоцитоза у мужчин выявлена негативная корреляция показателя ма-нф с уровнем ненасыщенных фосфоли-пидов (экстинция на волне длиной 220 нм). У женщин обнаружены негативная корреляция показателя %а-нф со всеми показателями ПОЛ и негативная корреляция ИАФ с количеством всех исследованных продуктов ПОЛ и с индексом экстинций 278/220. На 10 минуте фагоцитоза достоверных корреляционных взаимоотношений между показателями ФАН и ПОЛ у женщин не найдено. У мужчин выявлена положительные корреляции между показателем ФИ а-нф и уровнем кетодиенов и сопряженных триенов (экстинция на волне 278 нм), а также между ФИ а-нф и индексом экстинций 278/220.

Материалы исследования корреляционных закономерностей, полученные при использовании в качестве ОФ шигелл Флекснера, свидетельствуют о наличии у мужчин позитивных взаимосвязей уровней ПОЛ и функциональной активности популяции нейтрофилов с высокой поглотительной способностью (а-нф). У женщин отмечают обратные закономерности.

При анализе корреляционных взаимоотношений между показателями ФАН в отношении иерсиний и показателями ПОЛ на 5 минуте фагоцитарного процесса у мужчин достоверных корреляций не обнаружено. У женщин на 5 минуте отмечается достоверная позитивная корреляция показателя %0-нф с количеством всех исследованных продуктов ПОЛ. Имеются также негативные корреляции показателя %ма-нф с уровнями ненасыщенных фосфолипидов (экстинция на волне 220 нм) и диеновых конъюгатов (232 нм) и, кроме того, негативные корреляции показателя %а-нф с количеством диеновых конъюгатов (232 нм), кетодиенов и сопряженных триенов (278 нм) и с индексами экстинций 232/220 и 278/220. Далее выявлены негативные корреляции показателя ФИ а-нф с индексом экстинций 232/220 и ИАФ с индексами экстинций 232/220 и 278/220. В целом эти результаты свидетельствуют о тормозящем влиянии продуктов ПОЛ на фагоцитарный процесс у женщин в отношении кишечных иерсиний, что совпадает с материалами, полученными при использовании ОФ. шигелл Флекснера.

На 10 минуте фагоцитоза Iersinia enterocolitica у мужчин обнаружены негативные корреляции %0-нф с количеством кетодиенов и сопряженных триенов (278 нм) и с индексом экстинций 278/220. Помимо этого найдена негативная корреляция %ма-нф с индексом экстинций 232/220. Установлены также позитивные корреляционные связи %а-нф с количеством диеновых конъюгатов (232 нм), кетодиенов и сопряженных триенов (278 нм), а также с индексами экстинций 232/220 и 278/220. ФИ а-нф позитивно коррелирует с количеством диеновых конъюгатов (232 нм), кетодиенов и сопряженных триенов (278 нм) и с индексами экстинций 232/220 и 278/220.

У женщин на 10 минуте обнаружена позитивная корреляционная взаимосвязь показателя %0-нф с количеством кетодиенов и сопряженных триенов (278 нм) и с индексами экстинций 232/220 и 278/220; достоверная негативная корреляция показателя а-нф с индексом экстинций 278/220; достоверная негативная корреляция показателя ФИ а-нф с индексом экстинций 232/220.

Таким образом, можно сделать заключение о том, что в зависимости от величины фагоцитарных показателей, у женщин имеются различия во влиянии ПОЛ на фагоцитарную активность нейтрофилов. При использовании ОФ, которые интенсивно поглощаются нейтрофилами, влияние негативное, а при использовании ОФ, которые фагоцитируются слабо - влияние позитивное. У мужчин же без зависимости от величины фагоцитарных показателей имеют место позитивные корреляционные взаимосвязи с показателями ФАН. Представленные материалы свидетельствуют о регуляторном влиянии продуктов ПОЛ на ФАН у практически здоровых людей.

Влияние перекисного окисления липидов и антиоксидантов

на уровень фагоцитарной активности нейтрофилов в эксперименте in vivo.

В нашей публикации (Кузнецов В.Ф., Милютин М.В., Захаров В.Н. и др., 1992) впервые показана возможность экспериментального моделирования недостаточности фагоцитоза, формирующегося на поверхности аутологичных клеток крови, при активизации ПОЛ в целом организме. Также впервые приведена вероятность патогенетической профилактики этого нарушения.

Депрессия фагоцитоза, формирующегося на поверхности аутологичных клеток крови, получена экспериментально при введении в корм животных пищеотходов многодневного сбора.

В представленной экспериментальной модели изучены измене-

ния популяционного состава нейтрофилов, участвующих в фагоцитарном процессе (рис.4). Установлено, что на 10 минуте фагоцитоза

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

123 123 123 123 123

% 0-нф-Ю1 •/•ма-нф V. а-нф-10' ФИ а-Нф ИАФ-10

Рис.4. Показатели фагоцитарной активности нейтрофилов различных популяций у свиней контрольной группы (1), при употреблении пищеотходов многодневного сбора (2) и при назначении антиоксиданта дилудина (3).

Время контакта крови с ОФ шигелл Зонне — 10 минут.

1

"■гг- Щ Р •Ь % > 1 Й: $ Ш: г:;.

ш 1 ■■■ 1? + Й Я' и ■'А* щ э 1 ■ь

-1 § » щ

»1 |й а А ?

Ф щ шад й

происходит количественное сужение размеров тех популяций нейтрофилов, что реально приняли участие в поглощении ОФ (ма-нф и а-нф). В то же время показатель ФИ а-нф практически не изменился, что свидетельствует о сохранении нейтрофилами своего поглотительного потенциала, реализация которого лишь оттягивается во времени. В пользу этого говорит и тот факт, что при достаточно длительной экспозиции крови и ОФ (20 минут) показатели ФАН различных популяций не уступают контрольным. Наряду с нарушением поглотительной активности у нейтрофилов отмечается снижение стимулированных под влиянием опсонизированного зимозана кис-лородзависимых механизмов бактерицидности.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что введение в корм животных пищеотходов многодневного сбора можно рассматривать как экспериментальную модель дисфункции

фагоцитарного процесса, формирующегося на поверхности аутологич-ных клеток крови. Особенностью этой модели является то, что снижение поглотительной активности нейтрофилов связано с повышением их инертности, что оттягивает во времени реализацию их поглотительного потенциала. Инертность поглотительного потенциала нейтрофилов сочетается с дефектностью их бактерицидности, а также (Кузнецов В.Ф., 1995) с нарушением их адгезионной активности.

При использовании этой экспериментальной модели совершена попытка патогенетической профилактики недостаточности фагоцитоза с помощью антиоксиданта дилудина. Добавление в корм дилудина полностью нивелирует угнетающее действие на фагоцитоз пище-отходов многодневного сбора (рис.4). Как известно, пищеотходы многодневного сбора содержат перекиси липидов (Богуш A.A., 1987), а дилу-дин является антиоксидантом (Двинская JI.M., Шубин A.A., 1986; Пантюшенко В.Т., Новиков В.Э., Журавлев А.И., 1988). В связи с этим возможно предположить, что угнетающее действие на фагоцитоз в данной экспериментальной модели оказывают продукты ПОЛ, а добавление антиоксидантов (в данном случае - дилудина) нейтрализует эти влияния. О профилактическом эффекте антиоксидантов свидетельствует и тот факт, что заболеваемость пневмониями при добавлении в корм дилудина снизилась с 75 до 3 %, т.е. в 25 раз.

Приведенные материалы позволили сформулировать представления о генезе формирования дефектности фагоцитарного процесса при введении в корм пищеотходов многодневного сбора. Главным звеном патогенеза является активация перекисного окисления липидов. Как известно, пищеотходы многодневного сбора содержат гидроперекиси липидов, образующиеся из пищевых жиров в процессе хранения. Данные вещества под влиянием металлов с переменной валентностью способны превращаться в свободные радикалы, инициируя процессы ПОЛ. Кроме того, пищеотходы многодневного сбора содержат продукты брожения и гниения остатков пищи, оказывающие повреждающее действие на клетки эпителия желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Это приводит к нарушению барьерной функции эпителия ЖКТ и всасыванию токсического содержимого кишечника в кровь, что также может активировать процессы перекисного окисления липидов (Богуш A.A., 1987). И, наконец инициаторами ПОЛ являются чужеродные субстанции, присутствующие в пищевых продуктах чаще растительного происхождения - нитриты, нитраты и ядохимикаты (Терехина H.A., Петрович Ю.А., 1992). Последний механизм инициации ПОЛ весьма актуален и для человека, так как

содержание указанных веществ в потребляемых населением продуктах (фрукты, овощи, хлеб, мясо и др.) часто превышает допустимые пределы.

Патологическая активация ПОЛ приводит к повреждению биологических мембран, что увеличивает их ригидность и жесткость. Это может сочетаться со снижением способности нейтрофилов воспринимать внешние стимулы, в том числе ОФ из ЭД и частиц опсонизи-рованного зимозана, что проявляется в виде снижения адгезии и уменьшении бактерицидности микрофагов. Формирующаяся вследствие этого дисфункция поглотительной активности нейтрофилов проявляется в нарушении их способности выполнять свои функции на поверхности аутологичных клеток. Это, в свою очередь, приводит к нарушению выхода микрофагов в очаг микробного воспаления, так как стадия краевого стояния и адгезии на поверхности эндотелия является важнейшим звеном эмиграции нейтрофилов в очаг воспаления. Снижение же бактерицидного потенциала создает в очаге и внутри самих нейрофилов благоприятные условия для размножения микроорганизмов. Это реализуется у свиней в виде пневмоний, которые клинически проявляются в 75 % случаев, а цитологически, как было показано нами ранее (Кузнецов В.Ф., Милютин МВ., Захаров В.Н. и др., 1992) - в 100 % случаев.

В представленной работе, наряду с приведенными выше сдвигами, выявлено снижение активности сурфактанта у свиней при употреблении пищеотходов многодневного сбора. Дефект сурфактанта, на наш взгляд, является одним из важнейших факторов патогенеза, участвующих в формировании пневмоний. По своей химической природе сурфактант, как известно (РаШе И.Е., 1958), является фосфо-липидом и легко подвергается свободнорадикальному окислению. Исходя из этого, исследование количества сурфактанта в легких следует считать дополнительным диагностическим критерием воспалительного процесса в легочной ткани. Параллельно нейтрофильному имеется, по-видимому, также снижение активности макрофагального звена антимикробной защиты легких, поскольку с уменьшением количества сурфактанта в легких уменьшается количество альвеолярных макрофагов (Чазова Н.Л., 1982).

Приведенные в этой работе материалы свидетельствуют о регу-ляторном влиянии на фагоцитоз продуктов перекисного окисления липидов в крови практически здоровых людей. В условиях патологии взаимоотношения продуктов ПОЛ и нейтрофилов изменяются. Интенсификация процесса перекисного окисления липидов, харак-

терная для патологии, приводит к комбинированному нарушению фагоцитоза и способствует формированию иммунодефицитного состояния.

ВЫВОДЫ.

1. У здоровых людей установлено модулирующее влияние продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) на фагоцитоз нейтрофилов, определяемый на поверхности аутологичных клеток крови. Это влияние зависит от пола обследованных и от интенсивности захвата объектов фагоцитоза (ОФ). У мужчин отмечается универсальная позитивная связь фагоцитарных критериев и уровней продуктов ПОЛ. У женщин корреляционные закономерности зависели от величины фагоцитарных показателей; позитивные связи установлены при использовании ОФ, которые фагоцитируются слабо, и негативные - при применении ОФ, которые захватываются интенсивно.

2. У здоровых женщин, имеющих более высокий - в сравнении с мужчинами - уровень продуктов ПОЛ в крови, показатели фагоцитоза шигелл Зонне были выше. При использовании ОФ кишечных иерсиний у мужчин выявлено больше нулевых нейтрофилов. В отношении шигелл Флекснера не обнаружено различий фагоцитоза в зависимости от пола.

3. У мужчин и женщин была различной динамика фагоцитоза в зависимости от времени экспозиции крови и ОФ. При фагоцитозе шигелл Зонне активность нейтрофилов у женщин быстрее достигает своего максимума. Количественный состав популяций нейтрофилов в динамике фагоцитоза шигелл Флекснера у мужчин не изменяется, а возрастание фагоцитоза происходит за счет более полной реализации поглотительного потенциала активных нейтрофилов; у женщин нарастание фагоцитарной активности происходит во всех популяциях нейтрофилов. При использовании в качестве ОФ кишечных иерсиний наблюдается сходная динамика.

4. На экспериментальной модели недостаточности фагоцитоза у свиней, вызываемой активацией ПОЛ, установлено замедление вовлечения в фагоцитарный процесс высоко- и малоактивных нейтрофилов в сочетании со снижением их бактерицидности. Введение в корм антиоксидантов предотвращает формирование нарушения поглотительного потенциала нейтрофилов.

5. Патологическая активация ПОЛ, лриводящая к формированию иммунодефицитного состояния, характеризуется снижением активности сурфактанта, что является фактором патогенеза пневмоний.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Экспериментальная модель недостаточности фагоцитоза у свиней. //В кн.: Обмен веществ в норме и патологии. Труды Тюменского медицинского института. -Тюмень, 1992. -С. 51. (Соавт. Кузнецов В.Ф., Захаров В.Н., Яволов С.П. и др.)

2. Влияние пищеотходов многодневного сбора на состояние сурфактанта легких у свиней. // Сборник материалов 1-й научной конференции "Актуальные вопросы медицины труда и промышленной экологии". -Киров, 1994. -С. 96. (Соавт. Кузнецов В.Ф., Савельев О.Н.)

3. Исследование фагсщитарной активности нейтрофилов в цельной крови у свиней с воспалительными заболеваниями легких. // Сборник материалов 1-й научной конференции "Актуальные вопросы медицины труда и промышленной экологии. -Киров, 1994. -С. 97-98. (Соавт. Кузнецов В.Ф., Захаров В.Н., Пекшев A.B.)

4. Поглотительная активность нейтрофилов в системе корреляционных взаимосвязей с биофизическими, гематологическими и иммунологическими показателями. // Актуальные вопросы трансфу-зиологии и клинической медицины. Материалы научно-практической конференции института по итогам работы в 1994 г. -Киров, 1995. -С. 73-74. (Соавт. Кузнецов В.Ф., Зайцева Г.А., Бяков И.С.)

5. Эритроцитарно-нейтрофильные взаимодействия с микробными агентами в цельной крови при физиологической и патологически измененной реактивности организма. // Материалы III научной конференции, посвященной 50-летию победы в Великой Отечественной войне. Труды Кировского государственного педагогического института. -Том П1 -Киров, 1995. -С. 156-157. (Соавт. Кузнецов В.Ф., Обернебесова Т.П.)

6. Половые различия физико-химической регуляции фагоцитоза на поверхности аутологичных клеток крови. // Рук. деп. в ВИНИТИ 15.02.96, № 24980. Кировский гос. мед. ин-т. -Киров, 1996. -13 с. (Соавт. Кузнецов В.Ф.)

7. Принципы биофизической регуляции фагоцитоза на поверхности аутологичных клеток крови. // Достижения медбио-физики и клинической биохимии - в практику здравоохранения. Материалы научной конференции, посвященной 50-летию Победы в Великой Отечественной войне (г.Киров, 15-16 мая 1995 г.) -Киров, 1995. -С. 23-24. (Соавт. Кузнецов В.Ф., Перера Л.Л.)

8. Патогенетическая профилактика недостаточности фагоцитоза. // Лекарственное обозрение. -1996. -№ 4. -С. 27-29 (Соавт. Кузнецов В.Ф., Черешнев В.А., Захаров В.Н., Пекшев А.]