Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Фармакотерапевтическая эффективность экстракта из корней Astragalus membranaceus (Fischer) Bunge при стресс-индуцированных состояниях

На правах рукописи

БАТОЦЫРЕНОВА ЭЛЬВИРА ТОКТОХОЕВНА

ФАРМАКОТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЭКСТРАКТА ИЗ КОРНЕЙ ASTRAGALUS MEMBRANA СЕ US (FISCHER) BUNGE ПРИ СТРЕСС-ИНДУЦИРОВАННЫХ СОСТОЯНИЯХ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

7 НОЯ 2013

Улан-Удэ-2013

005537163

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Институт общей и экспериментальной биологии» Сибирского отделения Российской академии наук

Научный руководитель:

Шантанова Лариса Николаевна - доктор биологических наук, профессор Официальные оппоненты:

Маланов Ким Жапович - доктор медицинских наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Бурятский государственный университет» Министерства образования и науки РФ / кафедра фармакологии, клинической фармакологии и фитотерапии, и.о. профессора

Бартанова Елена Алексеевна - кандидат медицинских наук, Государственное автономное учреждение здравоохранения «Республиканская клиническая больница восстановительного лечения «Центр восточной медицины» / приемно-диагностическое отделение, заведующий

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Читинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения РФ

Защита состоится «28» ноября 2013 г. в 13 — часов на заседании диссертационного совета ДМ 003.028.02 при Институте общей и экспериментальной биологии Сибирского Отделения РАН по адресу: 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН.

Автореферат разослан «28» октября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент

В.Б. Хобракова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние десятилетия, в результате воздействия стрессорных факторов, отмечается срыв генетически детерминированных защитных механизмов организма с развитием т.н. «болезней цивилизации» (Каминский, Косенко, 2004; Резников, Комиссаренко, 2007; Freeman et al., 2002; Weisberg, 2009). Стресс является фактором риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, депрессивных и невротических расстройств, нарушений системы иммунитета и других патологических состояний (Погосова, 2002; Медик, 2003; Оганов, Масленникова, 2009; Бойцов и соавт., 2010). Так, частота стресс-индуцированных сердечно-сосудистых заболеваний составляет до 20% в общей медицинской практике (Росстат.., 2010; Ромасенко и соавт., 2012).

Учитывая сложный патогенез дезадаптивных состояний, для их коррекции используют целый арсенал препаратов, относящихся к различным фармакологическим классам, многие из которых при длительном применении вызывают ряд негативных побочных эффектов (Шабанов, 2003; Забродин, 2005; Яременко, 2008; Горчакова и соавт., 2010). В этой связи предпочтительным является использование средств растительного происхождения, представляющих собой комплексы биологически активных веществ, близких по своей природе эндогенным биорегуляторным соединениям (Юдинцева, 2003; Шилова, 2007; Арушанян, 2008; Николаев, 2012). Кроме того, к преимуществам растительных средств относятся широкий спектр фармакологической активности, отсутствие токсичности и риска развития неблагоприятных побочных реакций при их длительном приеме (Кукес, 2004; Пальцев, 2008; Краснов и соавт., 2009; Шилова, Суслов, 2009). Вместе с этим, перечень разрешенных адаптогенных препаратов весьма ограничен и включает ряд растительных средств, таких как препараты женьшеня, элеутерококка, родиолы розовой и некоторых других, сырьевые ресурсы которых к настоящему времени истощены (Сур, 2001; Лесиовская, Коноплева, 2002; Молоковский, 2004). В этой связи актуальной задачей является поиск новых эффективных адаптогенных средств растительного происхождения.

Одним из перспективных растений является астрагал перепончатый (Astragalus membranaceus (Fischer) Bunge), широко применяемый в традиционной медицине (тибетской, китайской, монгольской) в качестве тонизирующего средства (Шретер и соавт., 2004; Асеева и соавт., 2008; Zhao et al., 2010; Liu et al., 2011). Наличие широкого спектра ценных фармакологических свойств, разнообразие биологически активных веществ, а также достаточная сырьевая база аргументировали целесообразность

исследования данного растения с последующей разработкой на его основе нового адаптогенного средства. В Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН был разработан способ получения сухого экстракта из корней астрагала перепончатого (СЭАП), представляющего собой сумму экстрактивных веществ, представленных различными классами химических соединений. Действующими веществами экстракта являются тритерпеновые гликозиды, флавоноиды, органические кислоты.

Целью настоящего исследования явилось определение спектра адаптогенной активности и фармакотерапевтической эффективности сухого экстракта астрагала перепончатого при экспериментальных стресс-индуцированных повреждениях.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие

задачи:

- выявить стресс-протективное действие сухого экстракта астрагала перепончатого при иммобилизационном и психо-эмоциональном стрессе;

- определить влияние испытуемого фитоэкстракта на устойчивость организма к действию интенсивных физических нагрузок;

- изучить влияние сухого экстракта астрагала перепончатого на функциональное состояние центральной нервной системы;

- оценить фармакотерапевтическую эффективность испытуемого фитоэкстракта при иммуносупрессивном состоянии;

- определить особенности механизма адаптогенного действия сухого экстракта астрагала перепончатого.

Научная новизна. Работа представляет собой исследование фармакологической активности и определение фармакотерапевтической эффективности сухого экстракта астрагала перепончатого при стресс-индуцированных состояниях. Установлено, что испытуемое средство в экспериментально-терапевтических дозах повышает неспецифическую сопротивляемость организма к экстремальным факторам различной этиологии: иммобилизационному и психо-эмоциональному стрессу, интенсивным физическим нагрузкам, гиперкапнической, гемической и тканевой гипоксии. Курсовое введение животным СЭАП на фоне иммобилизационного и эмоционального стресса уменьшает выраженность всего комплекса проявлений стресс-реакции, что обусловлено снижением уровня гормонов симпатоадреналовой и гипоталамо-гипофизарно-адреналовой систем, а также оказывает ингибирующее влияние на процессы свободнорадикального окисления биомакромолекул и повышает активность эндогенной антиоксидантной система»!. Показано, что СЭАП обладает актопротекторной активностью, повышая физическую выносливость

животных, что связано с увеличением скорости ресинтеза АТФ, накоплением углеводных запасов клеток, снижением выраженности метаболического ацидоза. Указанное средство повышает ориентировочно-исследовательскую активность животных, оказывает анксиолитическое и ноотропное действие. Психотропные эффекты СЭАП обусловлены активацией ГАМК-ергической системы. Установлено, что испытуемое фитосредство обладает выраженными иммуномодулирующими свойствами, повышая активность гуморального, клеточного и макрофагального звеньев иммунного ответа при экспериментальном иммуносупрессивном состоянии. В основе адаптогеиного действия СЭАП также лежит ингибирование свободнорадикального окисления (СРО) биомакромолекул, что обусловлено наличием соединений фенольной природы, тритерпеновых гликозидов, органических кислот, аминокислот и др.

Практическая значимость. Установленные адаптогенные свойства СЭАП аргументируют целесообразность его применения в качестве средства, повышающего неспецифическую сопротивляемость организма. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре фармакологии, клинической фармакологии и фитотерапии медицинского факультета ФГБОУ ВПО «Бурятский государственный университет» (акт внедрения от 12.06.2013 г.).

Основные положения, выносимые на защиту: -сухой экстракт астрагала перепончатого в экспериментально-терапевтической дозе оказывает выраженное адаптогенное действие, повышая неспецифическую резистентность организма к действию стрессор пых факторов различной природы: иммобилизационному и эмоциональному стрессу, интенсивным физическим нагрузкам;

-сухой экстракт астрагала перепончатого повышает ориентировочно-исследовательские реакции, проявляет анксиолитические, ноотропные и антигипоксические свойства;

-сухой экстракт астрагала перепончатого обладает иммуномодулирующим действием при иммуносупрессивном состоянии;

-в основе механизма действия сухого экстракта астрагала перепончатого лежат его способности активировать ГАМК-ергическую тормозную систему, ингибировать процессы СРО биомакромолекул, стабилизировать мембранные структуры клеток, а также повышать энергетический потенциал организма при стресс-индуцированных состояниях.

Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: III Международной научно-

практической интернет - конференции «Состояние здоровья: медицинские, социальные и психолого-педагогические аспекты» (Чита, 2011); П1 Международной научно-практической конференции «Экология, здоровье, спорт» (Чита, 2011); XII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2011); VI International Scientific conference «Traditional medicine: ways of integration with modern health care» (Ulan-Ude, 2013).

Работа выполнена в Отделе биологически активных веществ ИОЭБ СО РАН в соответствии с проектом № 146 «Разработка лекарственных и профилактических препаратов для медицины. Фундаментальные основы и реализация», утвержденным Президиумом СО РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, из которых 6 статей - в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 137 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав с изложением результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя, включающего 280 источников: 115 отечественных и 165 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 29 таблицами и 11 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве объекта исследования использовали сухой экстракт астрагала перепончатого (СЭАП), полученный из корней Astragalus membranaceus (Fischer) Bunge путем двукратной экстракции 60% этанолом с ультразвуковой обработкой, последующим концентрированием и вакуумной сушкой. Полученный экстракт является суммой экстрактивных веществ, представленных, преимущественно, тритерпеновыми гликозидами, флавоноидами и органическими кислотами.

Водный раствор СЭАП вводили животным интрагастрально в дозах 50, 100 и 150 мг/кг за 30 мин до кормления однократно или многократно в зависимости от условий эксперимента. В качестве препарата сравнения использовали деалкоголизированный жидкий экстракт элеутерококка в объеме 5,0 мл/кг (Дардымов, 1976).

Эксперименты выполнены на белых крысах линии Wistar массой 160— 220 г и мышах линии СВА, Fi (СВАхС57В1/6) массой 20-22 г обоего пола. Животные находились в стандартных условиях содержания в виварии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН на обычном

рационе (Приказ МЗ СССР № 1179 от 10.10.83 г.). Эксперименты осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г.) и «Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей». Эвтаназию животных осуществляли методом мгновенной декапитации под легким эфирным наркозом.

В работе были использованы модельные системы: 1% суспензия эритроцитов донорской крови (Дубинина и соавт., 1983), суспензия липосом яичного желтка (Клебанов и соавт, 1988), а также системы, содержащие в качестве субстратов окисления стандартные химические соединения.

Острую токсичность испытуемого средства определяли с использованием метода Кербера (Руководство.., 2000).

Исследование спектра адаптогенной активности включало определение влияния СЭАП на устойчивость к иммобилизационному и эмоциональному стрессу, интенсивной физической нагрузке. Модель иммобилизационного стресса воспроизводили путем фиксации животных на спине в течение 18 часов (Амосова и соавт., 1998; Воронина, Середенин, 2005). Модель эмоционального стресса воспроизводили в стеклянном бассейне при температуре воды - 25°С. Животных помещали в пластиковые пеналы (длина - 16,5 см, внутренний диаметр - 5,5 см) и погружали в воду по мечевидный отросток на 4 часа (Overmier et al., 1986).

Для оценки антистрессорной активности определяли выраженность триады Селье: гипертрофию надпочечников, инволюцию иммунокомпетентных органов и наличие деструктивных изменений в слизистой оболочке желудка с подсчетом «индекса Паулса» (ИП) (Амосова и соавт., 1998). Содержание адренокортикотропного гормона (АКТГ) в плазме крови, альдостерона и кортизола в сыворотке крови определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа на анализаторе "DSX" (США) с применением наборов: «Стероид ИФА-кортизол-01», «Aldosterone ELISA», «DRG АСТН ELISA». Концентрацию адреналина, норадреналина и дофамина в плазме крови и гомогенате мозга проводили с помощью фотометра «STAT FAX-2100» (США) с использованием иммуноферментного набора «Tri Cat ELISA» (IBL, RE 59395 «Tri Cat ELISA»).

Влияние СЭАП на интенсивную физическую нагрузку определяли путем плавания животных в стеклянном бассейне с грузом массой 5% от массы тела (Воронина, Островская, 2005) с последующим определением биохимических показателей. Для оценки влияния СЭАП на энергетические

процессы в гомогенате бедренных мышц определяли содержание аденозинтрифосфата (АТФ), молочной (МК) и пировиноградной кислот (ПВК) (Методы.., 1982). В гомогенате печени определяли содержание гликогена (Практикум.., 1989). Содержание глюкозы, триацилглицеридов (ТАГ), холестерина, липопротеидов высокой плотности (ЛПВП), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и креатинфосфокиназы (КФК) определяли в сыворотке крови с помощью автоматического биохимического анализатора «Rx Imola» (Великобритания).

Для оценки антигипоксической активности модель гемической гипоксии воспроизводили путем однократного внутрибрюшинного введения раствора натрия нитрата в дозе 70 мг/кг; гистотоксическую гипоксию вызывали однократным внутрибрюшинным введением натрия нитропруссида в дозе 20 мг/кг; гиперкапническую гипоксию у животных воспроизводили с использованием герметично закрытой камеры объемом 1000 см3 (Воронина, Островская, 2005).

Иммунодепрессивное состояние у животных моделировали путем внутрижелудочного введения азатиоприна в дозе 50 мг/кг в течение 5 дней (Лазарева, Алехин, 1985). Действие СЭАП на состояние клеточного звена иммунного ответа оценивали в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) (Руководство.., 2005), гуморального звена - по количеству антителообразующих клеток (АОК), определяемых методом локального гемолиза по Cunningham (Cunningham, 1965), макрофагального звена - в реакции фагоцитоза перитонеальных макрофагов в отношении частиц коллоидной туши (Руководство.., 2005).

Оценку психотропного действия СЭАП проводили с использованием методов «открытое поле» (ОП), «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ), «светлая - темная камера» (Воронина, Островская, 2005). Влияние СЭАП на состояние ГАМК - ергической системы и анксиолитическое действие СЭАП исследовали методом конфликтной ситуации по Vogel (Воронина, Середенин, 2005). С целью блокады ГАМКа- рецептора использовали бикукулин (1,0 мг/кг внутрибрюшинно), а для блокады хлорного канала - пикротоксин (1,0 мг/кг внутрибрюшинно) (Воронина, 2005). Ноотропное действие СЭАП определяли в тесте условной реакции пассивного избегания (УРПИ).

Определение мембраностабилизирующей активности СЭАП оценивали по степени переписного и осмотического гемолиза эритроцитов донорской крови (Ковалев и соавт., 1986).

Интенсивность процессов СРО биомакромолекул определяли по содержанию малонового ди альдегида (МДА) в гомогенате печени

(Современные.., 1977) и сыворотке крови (Темирбулатов, Селезнев, 1981). О состоянии антиоксидантной системы судили по активности супероксиддисмутазы (СОД) в крови (Дубинина и соавт., 1983), катал азы - в сыворотке (Королюк и соавт., 1988), по содержанию восстановленного глутатиона (ВГ) в цельной крови (Anderson et al.,1977).

Определение влияния СЭАП на скорость генерации супероксидного анион-радикала (02 ") осуществляли по методу Chen (Chen et al., 2003). Антирадикальную активность по отношению к оксиду азота (КО)-определяли по методу Govindarajan (Govindarajan et al., 2003), по отношению к 2.2-дифенил-1-пикрилгидразилу (ДФПГ) определяли по методу Seyoum (Seyoum et al., 2006). Хелатирующие свойства испытуемого средства определяли фенантролиновым методом (Олейников и соавт., 2008). Динамику накопления активных продуктов тиобарбитуровой кислоты (ТБК) оценивали в суспензии липосом яичного желтка (Клебанов и соавт., 1988).

Для определения выраженности морфологических изменений головной мозг крыс помещали в 10% раствор нейтрального формалина с последующим обезвоживанием и заливкой в парафин. Фронтальные срезы коры больших полушарий головного мозга (г/м) и гиппокампа толщиной 4-5 мкм окрашивали крезил-виолетом по Нисслю (Саркисов, Перов, 1996). Морфометрические исследования проводили с использованием светового микроскопа «Motic 2000».

Результаты исследований статистически обработаны общепринятыми методами для малой выборки с применением U-критерия Манна-Уитни (Сергиенко, Бондарева, 2001). Различия считали значимыми при Р < 0,05. Данные по исследованию антиоксидантной и антирадикальной активности подвергали корреляционному анализу с применением пакета программы Advanced Grapher ver. 2.11 (Alentum Software Inc.).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Определение острой токсичности СЭАП показало, что его внутрижелудочное введение крысам в максимально возможной дозе, составляющей 6000 мг/кг, не сопровождалось гибелью животных. На фоне введения животным больших доз указанного средства (4000-6000 мг/кг) наблюдали в первые часы повышение двигательной активности, усиленную реакцию на раздражители, отказ от корма. Эти явления через 3—4 часа сменялись на апатию, замедление движений, сонливость. Спустя 8-10 часов животные опытных групп, которым вводили СЭАП, уже не отличались по внешнему виду, поведению от крыс в контроле. Эти данные позволяют отнести испытуемое средство к группе практически безвредных веществ по

классификации К.К. Сидорова (Требования.., 1973) и H.Hodge, R. Sterner (1975).

При исследовании «доза—эффект» наблюдали сопоставимую активность экстракта в дозах 50-150 мг/кг. В связи с этим все последующие эксперименты выполнены с использованием дозы 50 мг/кг. Исследование спектра адаптогенной активности СЭАП показало, что его курсовое введение крысам в дозе 50,0 мг/кг на фоне 18—часовой иммобилизации оказывает выраженное стресс-протективное действие, уменьшая проявления «триады Селье»: гипертрофии надпочечников, инволюции иммунокомпетентных органов (тимуса и селезенки), развития деструкций в слизистой оболочке желудка (табл. 1). Так, испытуемое средство ограничивало повреждения слизистой оболочки желудка белых крыс: число язв у крыс опытной группы 1 было на 85% меньше, чем в контроле' и сопровождалось снижением индекса Паулса более чем в 6 раз.

Таблица 1 - Влияние СЭАП на выраженность стрессорных изменений органов, показатели СРО биомакромолекул и антиоксидантной системы у белых крыс при 18—часовом иммобилизационном стрессе

Показатели Группы животных

Интактная, п = 6 Контрольная (стресс+ Н20), п = 6 Опытная 1 (стресс+ СЭАП), п = 6 Опытная 2 (стресс + элеутерококк), п = 6

Тимус, мг/100 г 122,3±2,90 61,8 ±0,71 87,8 ±1,20* 108,2±1,90*

Селезенка, мг/100 г 521,0±16,41 255,3±9,02 310,0±5,18* 308,3±3,08*

Надпочечники, мг/100 г 27,6±2,01 36,6±1,40 27,5±0,08* 27,6 ±1,21'

ИП для язв желудка 0 0,4 0,06* 0

ТБК—продукты, мкмоль/г ткани 10,7±1,60 16,4 ±1,81 11,4±0,11* 11,5 ±0,40*

сод, ед.активности 13,1 ±1,31 2,0 ±0,03 6,9 ± 0,50' 6,6 ±0,04*

Каталаза, мкат/л 13,5±0,07 10,4 ±1,10 13,2 ±0,08* 13,6±1,10*

ВГ, мкмоль/мл 707,ОН),01 591,0±0,02 781,0±0,07* 715,0±0,01*

Примечание: здесь и далее п - количество животных в группе; * — значения, достоверно отличающиеся от данных контрольной группы при Р < 0,05.

Наряду с этим, у крыс, получавших испытуемое средство, наблюдалось уменьшение массы надпочечников на 24%, увеличение массы тимуса и селезенки, соответственно, на 42 и 21% в сравнении с показателями у животных контрольной группы.

Курсовое введение животным СЭАП на фоне иммобилизационного стресса оказывает ингибирующее влияние на процессы СРО биомакромолекул и активирует эндогенную антиоксидантную систему организма, о чем свидетельствует снижение концентрации ТБК-активных продуктов в гомогенате печени на 30%, повышение содержания восстановленного глутатиона в крови на 32%, а также повышение активности каталазы и супероксиддисмутазы на 27% и в 2,5 раза, соответственно, по сравнению с аналогичными показателями у животных контрольной группы. При этом антиоксидантная активность испытуемого средства была аналогичной таковой у препарата сравнения — экстракта элеутерококка.

Показано, что введение крысам СЭАП предупреждало развитие стрессорных повреждений головного мозга, уменьшая долю регрессивных форм нейронов. Так, в группе крыс, получавших СЭАП, количество нормохромных нейронов в коре больших полушарий (III—V слои) было в среднем в 2 раза больше, а число гиперхромных сморщенных нейронов и нейронов с признаками дистрофии снижалось на 63 и 12%, соответственно, по сравнению с показателями контрольной группы. В гиппокампе количество нормальных нейронов возрастало на 71%, а гиперхромных сморщенных и дистрофических нейронов уменьшалось — на 78 и 47%, соответственно, по сравнению с показателями контрольной группы.

Курсовое введение животным СЭАП в дозе 50,0 мг/кг оказывало антистрессорное действие на фоне 4—часового эмоционального стресса (табл. 2).

Как следует из данных таблицы, введение животным испытуемого средства на фоне эмоционального стресса в значительной степени ограничивает активацию центральных стресс-реал изующих систем: симпатоадреналовой (САС) и гипоталамо-гипофизарно-адреналовой (ГТАС). Так, у животных опытной группы отмечалось существенное ограничение активности САС, о чем свидетельствует достоверное снижение содержания катехоламинов в плазме крови и гомогенате головного мозга: адреналина и норадреналина на 16 и 56% и на 15 и 20%, соответственно, по сравнению с аналогичными данными крыс контрольной группы.

Кроме этого, отмечалось изменение соотношений групп катехоламинов: адреналина к норадреналину (А/Н) и дофамина к сумме

норадреналина и адреналина Д/(А+Н): в большей степени увеличение указанных соотношений было выражено в тканях головного мозга.

Таблица 2 - Влияние СЭАП на содержание гормонов стресса, интенсивность СРО биомакромолекул, состояние антиоксидантной системы при эмоциональном стрессе у крыс

Показатели Группы животных

Интакгная, п = 6 Контрольная (стресс+ Н20), п = 6 Опытная 1 (стресс+ СЭАП), п = 6 Опытная 2 (стресс + элеугерокок К), п = 6

АКТГ, пг/мл (плазма) 9,2±0,19 17,5±0,32 9,73±0,51* -

Кортизол, нмоль/л (сыворотка) 24,6±0,52 54,9±1,37 32,6±0,93* -

Альдостерон, пг/мл (сыворотка) 910,3±4,93 1105,2±29,16 703,6±4,96* -

Адреналин, нмоль/л, (плазма) 4,4±0,09 33,8±0,09 28,2±0,04* 28,6±0,04*

Адреналин, нмоль/л (гомогенат г/м) 5,8±0,02 18,6±0,03 8,1±0,01* 6,4±0,03*

Норадреналин, нмоль/л (плазма) 70,6±0,10 135,0±0,01 114,6±0,10* 107,8±0,07*

Норадреналин, нмоль/л, (гомогенат головного мозга) 31,9±0,02 50,8±0,03 40,7 ±0,03* 36,0±0,04*

Дофамин, нмоль/л (плазма) 31,4±0,04 52,1±0,03 51,0±0,05* 49,4±0,03*

Дофамин, нмоль/л (гомогенат головного мозга) 9,5±0,50 16,3±0,02 13,5±0,04* 10,9±0,03*

ТБК-продукты, нмоль/мл (сыворотка) 6,8±0,62 17,0±1,41 8,4±0,55* 7,5 ±0,12*

Катал аз а, мкат/л (сыворотка) 11,1±1,02 7,6±0,52 10,2±1,01* 10,7±0,87*

ВГ, ммоль/л (сыворотка) 9,0±0,09 2,9±0,05 6,5±0,11* 8,4 ±0,04*

Полученные данные свидетельствуют, что стресс-протективное влияние СЭАП в большей степени обусловлено центральными регуляторными механизмами.

Вместе с тем, курсовое введение испытуемого средства сопровождается снижением активности ГГАС, о чем свидетельствует уменьшение концентрации АКТГ и кортизола в среднем на 45% по сравнению с данными животных контрольной группы. Кроме того, в крови животных опытной группы отмечается снижение уровня альдостерона на 36% по сравнению с контролем, что указывает на ограничение активности ренин-ангиотензин-альдостероновой системы под влиянием испытуемого средства. При исследовании -влияния СЭАП на интенсивность СРО биомакромолекул при эмоциональном стрессе установлено, что под его влиянием концентрация МДА в сыворотке крови снижается более чем в 2 раза, содержание восстановленного глутатиона повышается в 2,2 раза, а активность каталазы увеличивается на 34% по сравнению с аналогичными показателями крыс контрольной группы. При этом, стресс-протективная и антиоксидантная активность испытуемого средства была сопоставима с таковой у препарата сравнения — экстракта элеутерококка.

В таблице 3 представлены результаты изучения актопротекторной активности СЭАП. Как следует из представленной таблицы, курсовое введение животным СЭАП в дозе 50 мг/кг сопровождается повышением физической выносливости животных, увеличением продолжительности плавания на 30% по сравнению с данными у крыс контрольной группы. Показано, что повышение физической работоспособности животных под влиянием СЭАП обусловлено активацией энергетического обмена: содержание АТФ в скелетных мышцах крыс опытной группы было выше в 1,5 раза по сравнению с данными животных контрольной группы. Наряду с этим, под влиянием испытуемого средства отмечалось увеличение углеводных запасов: содержание глюкозы в сыворотке крови увеличилось на 15%, концентрация гликогена в печени животных — на 62% по сравнению с аналогичными данными у крыс контрольной группы. При этом препарат сравнения экстракт элеутерококка проявлял несколько более выраженную актопротекторную активность. На этом фоне отмечалось снижение концентрации молочной и пировиноградной кислот на 32 и 50%; соответственно, по сравнению с контролем, снижение активности ферментов ЛДГ и КФК в сыворотке крови на 40 и 15%, соответственно, по сравнению с аналогичными данными животных контрольной группы. Полученные данные свидетельствуют об уменьшении выраженности метаболического

ацидоза, являющегося главным фактором, ограничивающим работоспособность.

Таблица 3 - Влияние СЭАП на общую физическую работоспособность и биохимические показатели белых крыс на фоне интенсивной физической нагрузки

Показатели Группы животных

Интактная, (п = 6) Контрольная (плавание+ Н20), (п = 6) Опытная 1 (плавание+ СЭАП), (п = 6) Опытная 2 (плавание+ элеутерококк), (п = 6)

Продолжительность плавания, мин 2,7 ±0,25 3,63 ± 0,24* 7,8 ± 0,32*

Глюкоза, ммоль/л (сыворотка) 13,-1 г 0,72 8,6 ±0,81 9,9 ±0,04 11,2 ±0,66*

Гликоген, г% (печень) 12,6 ±0,33 4,2 ±0,27 6,8 ± 0,28* 11,2 ±0,38*

АТФ мкмоль/гр (мышцы бедра) 2,8 ±0,18 0,7 ±0,03 1,2 ±0,08* 2,0 ±0,06*

МК, мкмоль/гр (мышцы бедра) И 4,3 ±9,25 183,7 ±17,07 126,0 ±12,19* 124,0 ±8,58*

ПВК, мкмоль/гр (мышцы бедра) ОД ±0,03 0,2 ± 0,02 0,1 ±0,01* 0,1 ±0,07

ЛДГ, ед/л (сыворотка) 701,2±32,60 984,6±82,9 596,0±53,1* 716,0 ±79,80*

КФК, ед/л (сыворотка) 1246,4±32,10 2135,5±30,5 19И,0±58,7 1393,4±25,01

МДА, нмоль/мл (сыворотка) 3,8 ±0,31* 6,3 ± 0,32 5,2 ±0,35* 4,0 ±0,32*

Каталаза, мкат/л (сыворотка) 16,8 ±0,35* 13,7 ±0,33 15,3 ± 0,34* 15,2 ±0,39*

В/глугатион, ммоль/л (цельная кровь) 10,4 ±0,22* 6,4 ± 0,57 8,1 ±0,18* 9,0 ±0,15*

Курсовое введение животным СЭАП на фоне интенсивной физической нагрузки оказывало выраженное антиоксидантное действие, о чем свидетельствует уменьшение концентрации МДА на 18%, повышение

активности каталазы в сыворотке крови на 12%, содержания ВГ в крови - на 25% по сравнению с аналогичными данными крыс контрольной группы. При этом антиоксидантная активность СЭАП была сопоставима с таковой у препарата сравнения.

Установлено, что СЭАП при введении крысам в дозе 50 мг/кг оказывает выраженное психотропное действие, активируя ориентировочно-исследовательское поведение животных (табл. 4). Как следует из данных, приведенных в указанной таблице, под влиянием испытуемого фитосредства показатели горизонтальной и . вертикальной двигательной активности возрастали почти в три раза, норкового рефлекса - в пять раз, количество выходов животных в центральную зону камеры - в три раза по сравнению с аналогичными показателями крыс контрольной группы.

Таблица 4 - Влияние СЭАП на поведенческую активность белых крыс

Показатели Группы животных

Контрольная, п=10 Опытная 1 (СЭАП), п=10 Опытная 2 (элеутерококк), п=10

Горизонтальная активность 12,7 ±4,05 42,2 ±7,63* 34,0 ±4,15*

Вертикальная активность 5,7 ±2,17 12,5 ±2,03* 9,5 ±0,75*

Норковый рефлекс 0,4 ±0,16 2,2 ± 0,52* 1,6 ±0,08*

Выходы в центральную зону 1,4 ±0,52 4,8 ±1,19* 3,7 ±0,31* '

Количество заходов в открытый рукав 1,0 ±0,13 1,8 ±0,26

Время пребывания в открытом рукаве, мин 16,3 ±4,89 34,5 ± 3,24* -

Количество переходов между камерами 1,7 ±0,25 2,5 ± 0,32 -

Время пребывания в светлом отсеке, с 30,1 ±6,54 65,5 ± 9,38* -

% животных с выработанным рефлексом на 7сугки 20 80 -

Показано также, что курсовое введение СЭАП сопровождалось увеличением времени пребывания животных в открытых рукавах ПКЛ в 1,8 и 2,1 раза, соответственно. Количество переходов и время пребывания в светлом отсеке «светлой - темной» камеры также увеличилось в 1,5 и 2,2 раза, соответственно. Полученные данные свидетельствуют о повышении

ориентировочно-исследовательской активности, снижении уровня тревожности, ускорении периода адаптации животных к новым незнакомым условиям. Установлено также, что СЭАП обладает ноотропными свойствами, стимулируя когнитивные функции животных. Так, на фоне его курсового введения животным наблюдали 100% выработку условного рефлекса и сохранность памятного следа в отдаленные сроки: на 7 сутки наблюдения в тесте УРПИ данный рефлекс достоверно наблюдался у 80% животных, что превышало в 4 раза показатели контрольной группы.

Исследования влияния испытуемого средства на ГАМК-ергическую систему показали, что его курсовое введение животным в дозе 50 мг/кг на фоне блокатора хлорного канала - пикротоксина и блокатора ГАМКд-рецептора — бикукулина достоверно увеличивают количество наказуемых взятий воды на 71 и 39%, соответственно, и свидетельствуют, что механизмы аксиолитического действия испытуемого фитоэкстракта связаны с активацией тормозной ГАМК-ергической системы.

В серии последующих опытов установлено, что испытуемое средство обладает выраженной антигипоксической активностью при кислородцефицитных состояниях различного генеза. Так, введение крысам СЭАП в дозе 50 мг/кг при гемической гипоксии сопровождалось 100% выживаемостью животных при 50% гибели в контроле. При гистотоксической гипоксии и нормобарической гипоксии с гиперкапнией у крыс, получавших СЭАП, длительность резервного времени жизни увеличивалась на 34 и 87%, соответственно, по сравнению с аналогичными данными крыс контрольной группы.

В таблице 5 представлены данные изучения влияния СЭАП на показатели иммунной системы при иммуносупрессивном состоянии, индуцированном введением мышам цитостатика азатиоприна. Как следует из данных, представленных в таблице 5, курсовое 14-дневное введение мышам СЭАП в дозе 50 мг/кг оказывает выраженное иммуностимулирующее влияние, о чем свидетельствует увеличение массы селезенки мышей в среднем на 22%, повышение индекса реакции ГЗТ- в 1,4 раза, количества АОК как в абсолютных значениях, так и при расчете на 106 спленоцитов в 2,1 и 1,8 раза, соответственно, а также отмечено повышение фагоцитарного индекса в 2,6 раза по сравнению с аналогичными показателями у мышей контрольной группы.

Таблица 5 - Влияние СЭАП на выраженность реакций гиперчувствительности замедленного типа, антителообразования и фагоцитоза на фоне азатиоприновой иммуносупрессии у мышей линии Р1(СВАхС57В1/6)

Показатели Группы животных

Интактная, (п=10) Контрольная (азатиоприн), (п=10) Опытная (азатиоприн+СЭАП), (п=10)

Относительная масса селезенки, % 0,5 ± 0,03 0,4 ±0,04 0,5 ± 0,02*

Индекс реакции ГЗТ, % 34,2 ± 1,01 19,2 ±1,76 26,7±2,08*

Количество АОК на селезенку 523331±3416 28982 ±2329 60844±3610* .

Количество АОК на 10бспленоцитов 316,2 ± 16,60 198,4 ±13,6 348,7 ±27,80*

Фагоцитарный индекс, оггг.пл (усл.ед.) 0,03±0,002 0,01 ± 0,0009 0,03 ±0,003*

С целью уточнения механизма действия указанного средства проведены дополнительные исследования. Показано, что механизмы адаптогенного действия СЭАП обусловлены стабилизацией мембранных структур клеток. Так, при использовании суспензии эритроцитов добавление испытуемого средства в дозах, эквивалентных экспериментально-терапевтическим, оказывало выраженное мембраностабилизирующее действие, уменьшая степень гемолиза эритроцитов при перекисном гемолизе — на 96%, при осмотическом — на 95% по сравнению с аналогичными данными контрольной группы.

При применении методов in vitro (табл. 6) выявлено, что мембраностабилизирующая активность СЭАП связана с прямым антирадикальным и опосредованным — хелатирующим действием веществ фенольной природы, входящих в его состав.

Наличие выраженной антирадикальной активности исследуемого средства было установлено по отношению к DPPH-радикалам, супероксидным анион-радикалам, радикалам NO. Показано, что индекс половинного ингибирования (Ю50) в отношении DPPH-радикалов составил 60,0 мкг/мл, что сопоставимо с таковым у препарата сравнения ионола; в отношении NO-радикалов - 242,4 мкг/мл, что превосходит таковую у препарата сравнения аскорбиновой кислоты (1С50 1140,0 мкг/мл); к

супероксидным анион-радикалам - 500,0 мкг/мл, при 1С50 101,0 мкг/мл для аскорбиновой кислоты.

Наряду с этим, показано, что СЭАП снижает скорость накопления ТБК— активных продуктов в модельной системе: индекс его антиокислительной активности составил 494,2 мкг/мл при 1С50 у аскорбиновой кислоты - 50,8 мкг/мл. Установлено также, что СЭАП обладает Ре2+-хелатирующей активностью: 1С50 - 4,9 мг/мл, для препарата сравнения (аскорбиновой кислоты) данный показатель составил 0,15 мг/мл.

Таблица 6 - Антиоксидантная активность СЭАП, 1С50

Объект БРРН, (мкг/мл) ТБК, (мкг/мл) Ре2+, (мг/мл) о2-, (мкг/мл) N0, (мкг/мл)

СЭАП 60,0 ± 1,43 494,2 ± 7,2 4,9 ± 0,12 500,0 ±7,15 242,4 ±5,04

АКа 4,8 ±0,15 50,8 ± 1,15 0,2 ± 0,01 101,0 ±3,21 1140,0± 34,21

Ионол1 45,1 ± 1,37 - - - -

Примечания: ЭРРН - антирадикальная активность в отношении ДФПГ", ТБК-антиоксидантная активность в отношении накопления ТБК-активных продуктов; Ре - Ре2+ хелатирующая активность; 02'~- связывание супероксид-анион радикала; N0 -связывание молекул оксида азота; АКа - вещество сравнения (аскорбиновая кислота).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что СЭАП обладает широким спектром адаптогенной активности, повышая неспецифическую резистентность организма лабораторных животных к действию экстремальных факторов различной природы. Так, его введение лабораторным животным в экспериментально-терапевтической дозе 50,0 мг/кг повышает устойчивость организма к действию иммобилизационного, эмоционального стресса, интенсивных физических нагрузок, гемической, тканевой и гиперкапнической гипоксии, иммуносупрессии.

В основе адаптационной перестройки организма, развивающейся под влиянием СЭАП, лежит ряд функциональных и метаболических изменений на различных уровнях биологической организации. Центральные механизмы адаптогеиного действия СЭАП связаны с активацией тормозных систем ЦНС, в частности, ГАМК-ергической системы, что снижает гиперактивацию стресс—реализующих систем, тем самым, ограничивается развитие

негативных последствий стресс-реакции (Воронина, Середенин, 2002; Александровский и соавт., 2005; Бурчинский, 2007; N11«, 2000; Ищи ег а1., 2002). ГАМК способствует снижению потребления 02, температуры тела и катаболизма со снижением активности центров головного мозга, увеличивая устойчивость организма ко многим экстремальным факторам (Кулинский, Колесниченко, 2005). Подтверждением данного механизма стресс-протективного действия СЭАП служат полученные нами данные об уменьшении выраженности «триады Селье», повышении устойчивости нейронов головного мозга, а также снижении активности центральных стресс-реал из ующих систем; симпатоадреналовой и гипоталамо-гипофизарно-адреналовой.

Установлено, что периферические адаптогенные эффекты испытуемого фитосредства связаны с оптимизацией энергетического баланса организма, в частности, с ускорением ресинтеза макроэргических соединений в работающих тканях, увеличением углеводных запасов, повышением уровня кислородной обеспеченности клеток, что свидетельствует о преобладании аэробных механизмов энергообеспечения жизнедеятельности, т.е. активации процессов окислительного фосфорилирования. В частности, данный механизм был установлен при исследовании актопротекторной активности СЭАП: его курсовое введение сопровождалось повышением концентрации АТФ, уменьшением выраженности метаболического ацидоза, являющегося, как известно, основным лимитирующим фактором работоспособности и развития тканевой гипоксии (Зайчик, Чурилов, 2007; Тимошенко, Горохов, 2007). Наряду с этим, на фоне введения испытуемого средства отмечено снижение активности КФК, ЛДГ — внутриклеточных ферментов, уровень которых повышается при интенсивной физической нагрузке, вследствие деструкции миоцитов (Никулин, Родионова, 2010). Важное значение при реализации адаптогенных свойств СЭАП имеет выявленный антигипоксический эффект, обнаруженный при кислороддефицитных состояниях различного генеза: гемической, гистотоксической и гиперкапнической гипоксии, поддерживающий на более высоком уровне кислородное обеспечение тканей организма в экстремальных ситуациях.

СЭАП существенно ускоряет период адаптации животных, помещенных в новые незнакомые условия, снижая уровень эмоциональности и тревожности, а также стимулирует познавательную активность животных. Выраженное ноотропное действие СЭАП и сохранение памятного следа в отдаленные сроки наблюдения обусловлено активацией гигагакампа, поскольку известна его ведущая роль в механизмах памяти, высших

когнитивных функций и тревожных состояний (Судаков, Умрюхин, 2010; Умрюхин, 2013; Myers, Davis, 2002; Ji, Maren, 2007).

Показано также, что СЭАП способен ослаблять супрессивное действие токсических лекарственных средств таких как азатиоприн на показатели клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа, не изменяя показатели ингактных животных, что присуще лишь истинным йммуномодуляторам, обладающим активностью только в условиях повреждения иммунитета (Лазарева и соавт, 2005; Хобракова, Николаев, 2009; Wang et al., 2009; Zhao et al., 2010).

Установлено, что одним из важных молекулярно-клеточных механизмов адаптогенного действия СЭАП является наличие выраженной антиоксидантной активности, обусловленной ингибированием процессов СРО, о чем свидетельствуют полученные данные о снижении содержания продуктов пероксидации липидов в тканях и повышении активности ферментов антиоксидантной защиты организма, что сопровождается повышением резистентности мембранных структур клеток при экстремальных воздействиях. Установлено, что ингибирование процессов СРО под влиянием испытуемого фитосредства обусловлено антиоксидантным действием флавоноидов и тритерпеновых гликозидов, что подтверждается данными литературы (Yin et al., 2010; Peng et al., 2011; Zhong et al., 2012). В результате совокупного действия биологически активных веществ СЭАП, обладающих прямым и опосредованным антиоксидантным действием, поддерживается структурная и функциональная целостность биологических мембран при стресс— индуцированных патологических состояниях.

Заключение

Растительное средство СЭАП в экспериментально-терапевтической дозе 50 мг/кг повышает сопротивляемость организма лабораторных животных к действию стрессорных факторов: иммобилизационному и эмоциональному стрессу, интенсивным физическим нагрузкам, гипоксическим состояниям, иммуносупрессии с формированием неспецифически повышенной резистентности организма, обусловленной оптимизацией баланса центральных стресс-реал изующих и стресс— лимитирующих систем. Эффективность испытуемого средства, по ряду параметров, превосходит таковую у препарата сравнения - экстракта элеутерококка колючего.

Курсовое введение животным СЭАП ограничивает развитие патологических .изменений во внутренних органах и тканях животных при

иммобилизационном и эмоциональном стрессе, что связано с активацией тормозной ГАМК-ергической системы, ограничивающей гиперакгивацию стресс-реализующих систем, тем самым, предотвращая развитие негативных последствий стрессорной реакции.

Исследование актопротекторной активности данного средства на фоне интенсивных физических нагрузок показало, что его курсовое введение крысам сопровождается повышением выносливости животных. Механизм его актопротекторного действия связан с оптимизацией энергетического статуса организма, снижением выраженности метаболического ацидоза при ингибировании свободнорадикального окисления биомакромолекул.

Введение животным СЭАП на фоне иммунодепрессивного состояния оказывает выраженное иммуномодулирующее действие, стимулируя клеточное, гуморальное и макрофагальное звенья иммунного ответа организма.

Широкий спектр адаптогенной активности СЭАП связан с формированием под его влиянием неспецифически повышенной резистентности, обусловленной ограничением окислительного стресса, ведущего к деструкции клеточных мембран.

Выводы

1. Сухой экстракт астрагала перепончатого оказывает выраженное стресс-протективное действие при иммобилизационном и эмоциональном стрессе:

2. Испытуемый фитоэкстракт повышает устойчивость организма к действию интенсивных физических нагрузок;

3. Сухой экстракт астрагала перепончатого повышает ориентировочно-исследовательскую активность, снижает уровень тревожности и эмоциональности, стимулирует когнитивные функции ЦНС;

4. Сухой экстракт астрагала перепончатого повышает устойчивость животных к гипоксиям различного генеза, оказывает иммуномодулирующее действие при азатиоприновой иммуносупрессии;

5. Важными в механизме адаптогенного действия сухого экстракта астрагала перепончатого являются его способности ограничивать гиперактивацию стресс-реализующих систем на фоне ингибирования СРО биомакромолекул и стабилизации мембранных структур клеток, повышать энергетический потенциал клеток за счет содержания тритерпеновых гликозидов, флавоноидов, органических кислот и других биологически активных веществ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Батоцыренова, Э.Т. Астрагал перепончатый как перспективное растительное сырье для создания новых лекарственных средств / Э.Т. Батоцыренова, JI.H. Шантанова // Материалы III Международной научно-практической конференции «Состояние здоровья: медицинские, социальные и психолого-педагогические аспекты». - Чита,

2011.-С. 8-10.

2. Батоцыренова, Э.Т. Оценка антирадикальной активности сухого экстракта астрагала перепончатого / Э.Т. Батоцыренова, JI.H. Шантанова // Материалы III Международной научно-практической конференции «Экология, здоровье, спорт». - Чита, 2011. - С. 102-103.

3. Batotsyrenova, Е.Т. The influence of the dry extract derived from Astragalus membranaceus Bunge on the behavioral characteristics in rats / E.T. Batotsyrenova, M.V. Baldandorzhieva, S.M. Gulyaev // Мэс Засал. - 2011. -№ 13.-P. 141-142.

4. Батоцыренова, Э.Т. Психотропный и антигипоксический эффекты астрагала перепончатого / Э.Т. Батоцыренова, Л.Н. Шантанова, С.М. Гуляев // Здоровье и образование в XXI веке. - 2011. - Т. 13, № 1. - С. 109-110.

5. Хобракова, В.Б. Сухой экстракт астрагала перепончатого -перспективное иммуномодулирующее средство / В.Б. Хобракова, Э.Т. Батоцыренова, Д.Н. Олейников // Российский аллергологический журнал. -

2012. — № 1. — Вып. 1. —С. 334—336.

6. Торопова, A.A. Антиоксидантная активность сухого экстракта подземных органов Astragalus membranacem и его фракций / A.A. Торопова, Э.Т. Батоцыренова, Д.Н. Олейников, Л.М. Танхаева, Л.Н. Шантанова, С.М. Николаев // Сибирский медицинский журнал. - 2012. - № 7. - С. 107-109.

7. Батоцыренова, Э.Т. Антигипоксические свойства сухого экстракта астрагала перепончатого / Э.Т. Батоцыренова, Л.Н. Шантанова, О.Д.-Д. Цыренжапова II Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2012.-№ 4 (86). - С. 178-180.

8. Батоцыренова, Э.Т. Антистрессорное действие сухого экстракта астрагала перепончатого / Э.Т. Батоцыренова, Л.Н. Шантанова, A.A. Торопова, О.Д.-Д. Цыренжапова, Э.А. Алексеева // Вестник Бурятского государственного университета. — 2012, — Спецвыпуск С. — С. 55—58.

9. Хобракова, В.Б. Коррекция экспериментального вторичного иммунодефицита растительным средством / В.Б. Хобракова, Э.Т.

Батоцыренова, О.Д-Д. Цыренжапова // Вестник Бурятского государственного университета. - 2012. - Спецвыпуск С. — С. 173 — 175.

10. Батоцыренова, Э.Т. Мембраностабилизирующая и антиоксидантная активность сухого экстракта Astragalus membranaceus /Э.Т. Батоцыренова, А.А. Торопова, Л.Н. Шантанова, Э.А. Алексеева // Вестник Бурятского государственного университета. — 2012. -№ 12. - С. 15-18.

11. Batotsyrenova, Е.Т. The influence of the extract of Astragalus membranaceus on the state of GABA - ergic system / E.T. Batotsyrenova, Y.G. Rasuvaeva, L.N. Shantanova // Proceedings of the VI international scientific conference «Traditional medicine: ways of integration with modern health care». -Ulan-Ude, 2013.-P. 65.

12. Batotsyrenova, E.T. The influence of the extract of Astragalus membranaceus on the brain structure / E.T. Batotsyrenova, S.M. Gulyaev, L.N. Shantanova // Proceedings of the VI international scientific conference «Traditional medicine: ways of integration with modern health care». — Ulan — Ude, 2013. - P. 66.

Подписано в печать 25.10.2013 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Объем 1,4 печ. л. Тираж 100. Заказ № 43.

Отпечатано в типографии Изд-ва БНЦ СО РАН 670047 г. Улан-Удэ ул. Сахьяновой, 6.