Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Разработка и стандартизация нейропротективных средств растительного происхождения

На правах рукописи

005005479

СЕРЕБРЯНСКАЯ ТАТЬЯНА СТЕПАНОВНА

РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ НЕЙРОПРОТЕКТИВНЫХ СРЕДСТВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

' 8 ДЕК 2011

Улан-Удэ -2011

005005479

Диссертационная работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН.

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор

Николаева Галина Григорьевна

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук,

профессор

Маняк Виктор Андреевич

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский

институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР)РАСХН

Защита состоится « 22 » декабря 2011 г. в 1800 часов на заседании Диссертационного совета ДМ 003.028.02 при Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу: 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой 6.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН.

Автореферат разослан « 22 » ноября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат фармацевтических наук Гармаева Елена Анатольевна

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Охрана и укрепление здоровья людей является одной из актуальных медико-социальных задач современного общества. Значительная распространенность ишемических повреждений головного мозга является одной из актуальных проблем медицинской и фармацевтической наук. Это обусловлено резким увеличением заболеваемости атеросклерозом, артериальной гипертонией и связанных с ними сосудистыми заболеваниями головного мозга. В России цереброваскулярные заболевания (ЦВЗ) занимают второе место среди причин смертности, а как причина стойкой инвалидизации - первое место. Частота начальных форм хронической недостаточности мозгового кровообращения (НФХНМК) по данным НИИ неврологии РАМН (1998) достигает 70 % среди всех ЦВЗ, являющихся, при этом, основным фактором риска развития инсультов (Намса-раева Г.Т., Николаев С.М., 2003; Евзельман М.А., Байраков В.И., Герасимов A.B., 2006).

Несмотря на обширный арсенал современных лекарственных средств, применяемых для профилактики и лечения ЦВЗ, потребность в эффективных и безопасных средствах остается по-прежнему высокой. Среди широкого спектра лекарственных средств, применяемых в медицинской практике, особое место занимают препараты на основе лекарственного растительного сырья (Намсараева Г.Т., Николаев С.М., 2003; Очиров О.И., Жи-гаев Г.Ф., Кривигина Е.В., Лудупова Е.Ю., 2009). Препараты растительного происхождения являются перспективными для фармакологической коррекции нарушений, возникающих при недостаточности кровоснабжения мозга, так как обладают высокой эффективностью и предельно низкой токсичностью, а также многообразием фармакологических свойств, что обеспечивает комплексное воздействие на организм больного. Необходимо подчеркнуть, что в отличие от синтетических средств, фитопрепараты представляют собой комплекс нативных, сбалансированных, имеющих сродство к организму человека биологически активных веществ (БАВ) и, как следствие, их действие оказывается более мягким, всесторонним; при их применении практически отсутствуют побочные эффекты. Помимо терапевтического эффекта основных действующих компонентов, лекарственные средства (JIC) растительного происхождения несут в себе комплекс витаминов, макро- и микроэлементов, которые крайне необходимы организму. Для растительных препаратов характерно комплексное влияние на периферические и центральные механизмы адаптации функций организма. В настоящее время фитофармакотерапия занимает особое место в профилактике и лечении многих хронических и длительно протекающих заболеваний, в частности нарушений кровообращения в центральной нервной системе.

Среди многокомпонентных лекарственных средств природного происхождения наиболее востребованными и доступными для населения России остаются сборы и экстракционные препараты. Исследования последних лет показали, что целебные свойства лекарственных растений зависят от гармоничного взаимодействия всех активных веществ, которые обладают в своей совокупности более широким действием, чем в отдельности. В связи с этим весьма перспективными являются исследования по переводу сборов и отдельных растений, используемых в виде настоев и отваров, в суммарные препараты - экстракты, которые выгодно отличаются рациональностью использования и постоянством состава биологически активных веществ, а также возможностью их стандартизации.

В последние десятилетия для профилактики ЦВЗ применяются биологически активные добавки к пище. Эффективные биодобавки снижают риск развития большинства «возрастных» болезней, обусловленных недостаточностью кровообращения в жизненно важных органах (мозг, сердце и другие). В этой связи, актуальным представляется исследование, направленное на разработку нейропротективных средств в форме сбора, сухого экстракта и фиточая.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка и стандартизация нейропротективных средств и биологически активной добавки к пище растительного происхождения.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

>обосновать состав и соотношение компонентов растительной композиции для разработки сбора нейропротективного;

> провести фармакогностическое изучение сбора: разработать критерии подлинности и показатели доброкачественности, определить содержание биологически активных веществ;

> изучить влияние основных факторов экстракции на выход биологически активных веществ из сбора для разработки схемы получения экстракта сухого и фиточая;

> определить качественное и количественное содержание основных биологически активных веществ в экстракте сухом;

> разработать и валидировать методики стандартизации указанных средств по сумме флавоноидов и аминокислот;

>разработать проекты нормативной документации: ФСП на сбор нейро-протективный, экстракт сухой и ТУ на БАД к пище. Научная новизна. Обоснован и разработан состав и соотношение компонентов сбора, рекомендованного в качестве нейропротективного средства.

Проведен товароведческий анализ сбора. Макро- и микроскопическими методами определены диагностически значимые признаки сбора и фиточая. Установлены критерии подлинности и числовые показатели, внесенные в нормативные документы. С учетом вклада каждого компонента сбора разработаны методики качественного и количественного анализа, подтверждающие наличие основных групп веществ, характерных для каждого вида сырья.

Определены условия для экстракции сбора, обеспечивающие максимальный выход суммы экстрактивных и действующих веществ, что положено в основу технологической схемы получения экстракта сухого, условно названного «Полинейротон», со стабильными показателями качества.

Методами БХ, ТСХ, ВЭЖХ, ГХМС установлено наличие основных групп биологически активных веществ: флавоноидов, аминокислот, аскорбиновой кислоты, органических и фенолкарбоновых кислот, каротинои-дов, полисахаридов, глицирризиновой кислоты, дубильных веществ, а также обнаружено 17 макро- и микроэлементов в сборе и экстракте сухом; установлены показатели качества, которые включены в проекты ФСП.

Разработаны и валидированы методики количественной оценки БАВ -суммы флавоноидов в пересчете на рутин, свободных аминокислот в пересчете на глютаминовую кислоту, позволяющие проводить стандартизацию от сбора к экстракту методом спектрофотометрии.

Разработаны проекты нормативной документации: ФСП, ТУ и рецептура, лабораторные регламенты, ТИ.

Практическая значимость работы. На основании данных макро- и микроскопического, товароведческого и фитохимического изучения разработаны проекты Фармакопейных статей предприятия (ФСП) на сбор нейропротективный, экстракт «Полинейротон» сухой; Технические условия (ТУ) на БАД к пище Фиточай «Полинейротон», фильтр-пакеты (ТУ 9370-016-03533369-11), Рецептура и Технологическая инструкция (ТИ) на производство БАД к пище Фиточай «Полинейротон», фильтр-пакеты. Разработан состав и способ получения сбора (Лабораторный регламент на производство сбора нейропротективного. JIP № 005-03533369-11); способ получения и технологическая схема производства экстракта «Полинейротон» сухого (Лабораторный регламент на производство экстракта «Полинейротон» сухого. ЛР 64- № 01 l-03533369-i 1). Результаты исследований внедрены в учебный процесс на кафедре «Технология продуктов из растительного сырья» ВСГУТУ (акт внедрения от 15.09.2011г.).

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертации представлены: на Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые Сибири» (Улан-Удэ, 2008), Ш Международной научной конференции «Традиционная медицина: современная ситуация и перепек-

тивы развития» (Улан-Удэ, 2008), IV Международном симпозиуме традиционной медицины и инновационных лекарственных средств (Улан-Батор, 2009).

По материалам диссертационной работы опубликовано 7 научных работ, из них 3 - в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ.

Связь задач исследования с проблемным планом научного совета по фармакологии и фармации. Настоящая работа выполнена в лаборатории химико-фармацевтических исследований в соответствии с программой и планом научно-исследовательских работ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН по теме № 146 «Разработка лекарственных и профилактических препаратов для медицины. Фундаментальные основы и реализация», утвержденной президиумом СО РАН.

На защиту выносятся: >обоснование выбора состава и соотношения компонентов сбора;

> результаты разработки способа получения сбора, экстракта сухого и фиточая;

>результаты фармакогностического и фитохимического изучения сбора и экстракта сухого;

> результаты исследований по стандартизации сбора и экстракта сухого.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 192 страницах машинописного текста: состоит из введения, обзора литературы (глава 1), собственных исследований (3 глав), общих выводов, списка литературы, который включает 170 источников, из них 35 на иностранных языках, и приложения. Работа иллюстрирована 49 таблицами и 34 рисунками и схемами. В приложении представлены материалы по внедрению: нормативные документы на сбор нейропротективный и экстракт «Полинейротон» сухой; БАД к пище Фиточай «Полинейротон», фильтр-пакеты; заключение о фармакологической активности средства.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе изложены краткие сведения о нарушениях мозгового кровообращения, применении нейропротективных средств синтетического и растительного происхождения, приведены общие сведения о растениях, входящих в состав сбора, дана краткая характеристика сборов, сухих экстрактов и биологически активных добавок к пище.

В пояснении к эксперименту приведены сведения об объектах исследований, приводится аргументация об используемых методах и приборах, а также другие данные методического характера, используемые в работе.

Во второй главе обоснован состав сбора и установлено соотношение его компонентов, разработан способ получения сбора и фиточая.

В третьей главе приведены экспериментальные данные фармакогно-стического изучения сбора и результаты разработки методики стандартизации по сумме флавоноидов и аминокислот.

Глава четвертая включает исследования по разработке способа получения экстракта «Полинегфотон» сухого, изложены результаты его стандартизации по сумме флавоноидов и аминокислот, приведены показатели качества.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследований

Объектом исследования являлось лекарственное растительное сырье, отвечающее требованиям нормативной документации:

> трава астрагала перепончатого (Herba Astragalus membranaceus (Fisch, ex Link) Bunge) - ТУ 9370-003-0353369-08;

>плоды боярышника (Fructus Crataegi) - ГФ XI, вып. 2, ст. 32; >щетки ноготков (Flores Calendulae) - ГФ XI, вып. 2, ст. 5;

> плоды облепихи крушиновидной (Fructus Hippophaë rhamnoides) - ВФС 42-1741-87; ТУ 64-4-87-89;

> корни солодки (к. солодки уральской) (Radices Glycyrrhizae, г. G. uralensis) - ГФ X, ст. 573; ФСП 42-0273-1781-01 и 0296-2339-02;

> трава солянки холмовой (Herba Salsolae collina) - ТУ 9379-00451522555-05;

>побеги черники обыкновенной (Cormus Vaccinium myrtilli) - ФС 42-294893;

> плоды шиповника (Fructus Rozae) - ГФ XI, вып.2, ст. 38;

> корни шлемника байкальского (Radices Scutellariae baicalensis) - ФС 42453-72,

Изучение внешних признаков сбора проводили в соответствии с требованиями ГФ XI изд., вып.1, С.266-267. Микроскопическое изучение сбора, фиточая и его компонентов проводили по методике, описанной в ГФ XI изд., вып.1, С.277. Исследование и фотосъемку проводили на микроскопе MICROS Serial № 008722 MC 300Х (Austria) с окуляром ><10 и объективами х4, хЮ. Сгущение полученных извлечений на стадии экспериментальных исследований проводили на вакуум-выпарном ротационном испарителе марки ИРМ-1. Исследование качественного состава изучаемых объектов проводили с помощью качественных реакций и методом одномерной и двумерной хроматографии на бумаге марки «Filtrak» FN-11 (Германия), методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Silufol» марки «UV254» (Чехия) размером 15x15 см в следующих системах растворителей:

I. н-бутанол - кислота уксусная ледяная - вода (БУВ) (4:1:2); 2. 15 % раствор кислоты уксусной; 3. хлороформ - этилацетат - кислота муравьиная (5:4:1); 4. этилацетат - кислота уксусная (8:2); 5. н-бутанол - кислота муравьиная - вода (18:2:9); 6. этилацетат - кислота муравьиная - вода (10:2:3); 7. гексан - ацетон (7:3); 8. гексан - этилацетат (8:2); 9. хлороформ - спирт этиловый (19:1); 10. пиридин - уксусный ангидрид - вода (6:4:2),

II. изопропанол - муравьиная кислота - вода. Растворители для хроматографии и реактивы для получения производных использовали марки ХЧ и ЧДА. Соотношение растворителей учитывали в объемных частях. Определение фенольных соединений экстракта «Полинейротон» сухого проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы GILSTON модель 305 (ФРАНЦИЯ), с инжектором ручным модель RHEODYNE 7125 (США) с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы Мультихром для «Windows». В качестве неподвижной фазы была использована металлическая колонка размером 4,6x250 мм Кромасил Cl 8, размер частиц 5 микрон. В качестве подвижной фазы была использована смесь метанол - вода - кислота фосфорная концентрированная в соотношении 400:600:5. Анализ проводили при комнатной температуре. Скорость подачи элюента составляла 0,8 мл/мин. Продолжительность анализа составляла 120 мин. Детектирование проводилось с помощью УФ-детектора GILSTON UV/VIS, модель 151, при длине волны 254 нм. Определение аминокислотного состава сбора и экстракта сухого проводили на аминокислотном анализаторе марки ААА-339 (Чехия). Содержание аминокислот определяли в нмоль/г, затем производили перерасчет количественного содержания аминокислот в мг/г к абсолютно сухому сырью. Определение элементного состава экстракта сухого проводили на спектрографе ДФС-8 с плоскостной дифракционной решеткой методом эмиссионного спектрального анализа. Определение состава жирных кислот проводили методом газо-хромато-масс-спектрометрии (ГХМС) на газовом хроматографе Hewlett-Packard 6890 с квадрупольным масс-спектрометрическим детектором HP 5973. Кварцевая колонка CP-Wax (неполярная фаза - полиэтиленгликоль) с внутренним диаметром 0,20 мм. В качестве подвижной фазы использовали гелий марки «А». Качественный анализ основан на сравнении времен удерживания полных масс-спектров соответствующих чистых компонентов, представленных в машинном каталоге стандартных смесей GLC-68D (Nu-Chek-Prep; Elysian, Minnesota, USA). Определение состава эфирного масла проводили методом газо-хромато-масс-спектрометрии на газовом хроматографе Hewlett-Packard 6890 с масс-селективным детектором.

При разработке методик качественного и количественного определения использованы хроматографически чистые вещества и стандарты: та-

НИН, кислоты галловая (Fluka, кат. № 48630), хлорогеновая, кофейная (Sigma, кат. № 0625), цикориевая и феруловая, ГСО рутина (ФС 42-250887), байкалин, лютеолин-7-глюкозид, ГСО гиперозида (ФС 42-0106-03), ГСО лютеолина (ФС 42-2970-93), витексин, байкалеин, кемпферол, ГСО кверцетина (ФС 42-1290-79), дигидрокверцетин, кемпферол, апигенин, нарингенин; глицин, серии, лейцин, аспагиновая кислота, аспарагин, треонин, глютамин, глютаминовая кислота; кислоты яблочная (ТУ 6-09-405875), янтарная и лимонная (ГОСТ 3652-69); ß-каротин (ТУ 65-5139-86); глюкоза (ФС 42-2419-86); аскорбиновая кислота (ГОСТ 7047-55).

Электронные спектры исследуемых соединений и стандартных веществ в видимой и УФ-областях записывали на спектрофотометре УФ-видимого диапазона (UVmini-1240, Kyoto Japan), используя растворители: спирт этиловый 60%, 40%, 30%, воду очищенную. Спектрофотометриче-ское определение биологически активных веществ проводили с помощью спектрофотометра CECIL СЕ 1021 и CECIL СЕ 2011 (США) в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм.

Статистическая обработка результатов - в соответствии с ГФ XI изд., вып. 1, С. 199-207

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Разработка способа получения сбора иейропротективного и биологически активной добавки к пище в форме фиточая

Обоснование подбора композиции сбора

Состав сбора разработан на основе сведений о применении растений в народной, традиционной и научной медицине с учетом их фармакологических свойств, химического состава, официнальности и состояния сырьевой базы каждого из компонентов. Использовалось высушенное сырье урожая 2007-2010 гг. По числовым показателям образцы сырья соответствовали

нд.

С целью выбора оптимального соотношения компонентов, входящих в сбор, были изучены 4 варианта сбора (табл. 1).

Фармакологический скрининг показал, что сбор III варианта по своей активности превосходит другие сборы (I, II, IV варианты). Для дальнейшего исследования выбран вариант III - сбора, следующего состава: корни шлемника байкальского - 20 г, плоды шиповника собачьего - 15 г, трава астрагала перепончатого - 10 г, плоды боярышника кроваво-красного - 10 г, цветки ноготков лекарственных - 10 г, корни солодки голой или уральской - 10 г, трава солянки холмовой - 10 г, побеги черники обыкновенной -Юг, плоды облепихи крушиновидной - 5 г.

Таблица 1

Варианты сбора

Наименование лекарственного Соотношение компонентов сбора, г

растительного сырья г I II III IV

вариант вариант вариант вариант

Корни шлемника байкальского 18,0 15,0 20,0 12.0

Плоды боярышника кроваво-красного 12,0 15,0 10,0 5.0

Цветки ноготков лекарственных 12.0 8.0 10,0 15.0

Плоды облепихи крушиновидной 12,0 15.0 5,0 10,0

Корни солодки голой или уральской 7.0 15,0 10,0 5.0

Трава солянки холмовой 8,0 12.0 10,0 15.0

Побеги черники обыкновенной 12,0 5.0 10,0 15,0

Плоды шиповника собачьего 12,0 9.0 15.0 8.0

Трава астрагала перепончатого 7,0 6,0 10.0 15,0

Разработана технологическая схема получения сбора, которая включает следующие стадии технологического процесса:

ВР 1 Вспомогательные работы;

ТП 1 Измельчение и просеивание растительного сырья;

ТП 2 Получение готового продукта;

УМО 1 Фасовка и упаковка готового продукта.

Согласно технологической схеме производства наработано 5 серий. Проведено изучение основных факторов, определяющих полноту экстракции сбора; установлено: соотношение сырье - экстрагент (1:20), коэффициент водопоглощения 1:4, режим настаивания водных извлечений сбора-отвар.

Получение биологически активной добавки к пище Фиточай «Полинейротон», фильр-пакеты Фильтр-пакеты представляют собой дозированную форму и имеют ряд преимуществ: точность дозирования, удобство в использовании, портативность при транспортировке и хранении. Использование фильтр-пакетов позволяет избежать стадии фильтрации в процессе изготовления и использовать всегда свежеприготовленный настой. В связи с тем, что БАД к пище Фиточай «Полинейротон», фильтр-пакеты получают на основе сбора ней-ропротективного, фиточай оценивают по тем же показателям, что и сбор. Кроме того, изучены факторы, влияющие на качество фиточая. Установлено: степень измельчения фиточая - 1 мм, количество (масса) фиточая в одном фильтр-пакете - 1,5 г, объем воды для экстракции - 150 мл, время экстракции - 15 минут, технология изготовления фиточая - по «Инструкция по применению БАД к пище Фиточай «Полинейротон», фильтр-пакеты по 1,5 г. ТУ 9370-016 -03533369-11».

Критериями подлинности фиточая являются значимые анатомо-диагностические признаки (фото 1, 2). Стандартизацию фиточая проводят

по сумме флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-глюкозид и сумме аминокислот в пересчете на глютаминовую кислоту.

Фармакогностическое изучение сбора нейропротективного Для определения критериев подлинности сбора изучены методами макро- и микроскопии внешние и анатомо-диагностические признаки. Установлено, что сбор представляет собой смесь девяти видов сырья, состоящую из неоднородных частиц зеленовато-желтого цвета с оранжевыми, серовато-коричневыми, бордово-красными включениями, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 5 мм. Запах ароматный. Вкус водного извлечения сладковато-горький.

При микроскопическом изучении сбора были выявлены диагностически значимые признаки отдельных растительных компонентов. Исследуемый сбор включает сырье различных морфологических групп:

> корни (шлемника, солодки);

>листья (трава астрагала и солянки, побеги черники);

> цветки (цветки ноготков);

> плоды (шиповника, боярышника, облепихи).

Фото 1. Фиточай «Полинейротон». Степень измельчения 1 мм. Фрагменты листьев черники обыкновенной, цветков ноготков, шлемника байкальского, корней солодки уральской. Увел. ><40

Фото 2. Фиточай «Полинейротон». Степень измельчения ! мм. Фрагменты плодов облепихи крушиновидной и шиповника собачьего, корней шлемника байкальского, цветков ноготков, стеблей черники обыкновенной, травы солянки холмовой. Увел. *40

Диагностические признаки всех компонентов визуализировались в совокупности и соответствовали своему описанию в нормативных документах для каждого вида сырья.

В морфологической группе «корни» наблюдали частицы от светло-желтого до коричневого цвета. Наличие групп склеренхимных волокон с остатками кристаллоносной обкладки, обрывков широких сосудов ксилемы с окаймленными порами, крахмальных зерен позволило идентифици-

ровать корни солодки. Наличие групп склереид, обрывков сосудов, клеток паренхимы и крахмальных зерен - корни шлемника байкальского.

В морфологической группе «листья» наблюдали частицы от сероватого до темно-зеленого цвета. Опушенность и наличие железок позволили достоверно определить траву астрагала перепончатого и побеги черники, которые различаются по форме и размерам волосков и железок. Для листьев астрагала перепончатого характерны простые одно- и двуклеточные волоски на нижнем эпидермисе, расположение под эпидермисом пластинчатой колленхимы в листе (в выступах крупных жилок). Для листьев черники обыкновенной - булавовидные железки с многоклеточной двурядной ножкой и овальной многоклеточной головкой, кристаллоносные обкладки вдоль жилок с нижней стороны листа, а с верхней стороны - одноклеточные толстостенные волоски с грубой бородавчатой поверхностью. По отсутствию волосков и наличию включений определили листья солянки холмовой.

В морфологической группе «цветки» при рассмотрении препарата язычковых цветков ноготков с поверхности видны удлиненные клетки эпидермиса с оранжевыми округлыми хромопластами. На зубчиках эпидермис с сосочками, иногда с устьицами. Трубка венчика густо опушена простыми и железистыми одно- и двурядными волосками.

В морфологической группе «плоды» встречали частицы от оранжевого до темно-бордового цвета. По 6-угольным клеткам эпидермиса с редкими одноклеточными толстостенными волосками, клеткам мякоти с включениями оранжево-красного и буровато-желтого цвета (каротиноиды), мелким друзам и призматическим кристаллам, каменистым клеткам определили плоды боярышника. Плоды облепихи определили по многоугольным клеткам с прямыми стенками и неравномерно утолщенными оболочками, чешуевидным (щитовидным) волоскам наружного эпидермиса. Плоды шиповника - по многоугольным прямостенным клеткам эпидермиса с неравномерно утолщенными клеточными стенками, тонкостенным клеткам мякоти с оранжево-красными глыбками хромопластов и многочисленными друзами кальция оксалата, каменистым клеткам с сильно утолщенными пористыми стенками, тонко- и толстостенным волоскам.

Микроскопический анализ позволил разделить компоненты сбора по частоте встречаемости их диагностических признаков в микропрепаратах на 3 группы. Наиболее часто встречающимися видами сырья являлись: листья астрагала, солянки, черники и обрывки их стеблей - в 89 % случаев; корни шлемника и солодки, плоды шиповника и боярышника - в 75 %; плоды облепихи и цветки ноготков - редко встречающиеся (фото 3,4).

Фото 3. Сбор нейропротективный. Степень измельчения по ГФ X. Фрагменты цветков ноготков, плодов шиповника, побегов черники, корней шлемника и солодки, травы солянки. Увел. *40

Фото 4. Сбор нейропротективный. Степень измельчения по ГФ X. Фрагменты плодов шиповника, облепихи и боярышника, корней шлемника, травы солянки и астрагала. Увел. х40

Для стандартизации сбора проведен товароведческий анализ на трех сериях сбора. Установлены нормы по числовым показателям: содержание экстрактивных веществ, извлекаемых водой, не менее 28 %; влажность не более 12 %; золы общей не более 9 %; золы, не растворимой в 10 %раство-ре хлористоводородной кислоты, не более 3 %; органической примеси не более 2 %; минеральной примеси не более 1 %; суммы флавоноидов в пересчете на рутин - не менее 1 %; суммы свободных аминокислот в пересчете на глютаминовую кислоту - не менее 3 %. Зараженность амбарными вредителями, плесень, затхлость, посторонние запахи и привкусы не допускаются.

Таким образом, проведенные исследования подтвердили подлинность сбора по входящим в его состав компонентам. Полученные в ходе работы результаты включены в соответствующие разделы нормативных документов.

Химический анализ сбора, проведенный с помощью качественных реакций с водным и спирто-водными извлечениями, позволил сделать предварительное заключение о наличии основных классов природных соединений: флавоноиды, аминокислоты, аскорбиновая кислота, дубильные вещества, каротиноиды, кумарины, органические кислоты, сапонины, водорастворимые полисахариды, восстанавливающие сахара..

Было проведено изучение БАВ сбора методом БХ и ТСХ в нескольких системах растворителей и со стандартными образцами; при этом идентифицировали: рутин ~ 0,45), кверцетин (ЯГ - 0.7), лютеолин (ИГ ~ 0,8). Также были обнаружены фенолкарбоновые кислоты (галловая, кофейная), аминокислоты (аспарагиновая и глютаминовая кислоты, аспарагин, глю-

тамин, глицин, треонин, серин, лейцин), глюкоза, органические кислоты (лимонная, яблочная).

Определение аминокислот проводили на аминокислотном анализаторе марки ААА-339 (Чехия). На основании данных анализа обнаружен большой набор свободных и связанных аминокислот (табл. 2, 3); было идентифицировано 24 свободных и 17 связанных аминокислот, среди которых 9 незаменимых*.

Таблица 2

Свободные аминокислоты сбора_

Аминокислота мг/г Аминокислота мг/г Аминокислота мг/г

аланин 0,010179 глицин 0,120433 серин 0,006846

а-аминомасляная 0,224449 глютамин 0,457765 таурии 0,118946

у-аминомасляная 0,319271 глютаминовая 1,047312 тирозин 0,055753

аргинин* 1,013431 изолейцин* 0,074958 треонин* 0,019262

аспарагин 0,560968 лейцин* 0,033675 фенилапанин* 0,103524

аспарагиновая 0,028156 лизин* 0,088235 цистеин 0,028801

валин* 0,109781 метионин* 0,095903 цистин 0,136534

гистидин* 0,205857 орнитин 0,011241 этаноламин 0,005609

Таблица 3

Связанные аминокислоты сбора_

Аминокислота мг/г Аминокислота мг/г Аминокислота мг/г

аланин 0,009516 глицин 0,001519 пролин 0,003983

а-аминомасляная 0,002804 глютаминовая 0,042983 серин 0,009536

аргинин* 0,008053 изолейцин* 0,001712 тирозин 0,026757

аспарагиновая 0,024246 лейцин* 0,007742 треонин* 0,008173

валин* 0,00805 лизин* 0,010915 фенилаланин* 0,005487

гистидин* 0,007185 метионин* 0,013313

Установлено, что среди свободных аминокислот сбора наибольшее количество составляют глютаминовая кислота, аргинин*, аспарагин, глюта-мин; среди связанных - аспарагиновая и глютаминовая кислоты, тирозин.

Определение компонентов эфирного масла проводили перегонкой с водяным паром, его компоненты идентифицировали методом ГХМС (табл. 4). Выход эфирного масла на воздушно-сухую массу сырья составляет менее 0,1 мл с 40 г.

Таблица 4

Компоненты эфирного масла сбора •

Соединение % Соединение % Сорединение %

гераниол 7,255 а-зингибирен 24,028 кубебан-11-ол 2,6

(+) 4-карен 3,473 циклогескен 9,881 а-кадинол 8,737

аг-куркумен 13,109 Р-сесквифелланд-рен 18,799 мууролол. Т-(а-мууролол) 5.726

Установлено, что эфирное масло сбора содержит 9 компонентов, из которых наибольшее количество составляют а-зингибирен и Р-сесквифелландрен.

Определение жирного масла проводили методом ГХМС. В результате проведенного эксперимента было идентифицировано 8 жирных кислот

(табл. 5).

Таблица 5

_Жирные кислоты сбора___

Кислота % Кислота % Кислота %

пальмитиновая (16:0) 25.946 олеиновая (18:1п7) 10,232 линоленовая (18:ЗпЗ) 8,771

пальмитолеино-вая (16:1п9) 17,311 олеиновая (18:1 п9) 5,004 арахиновая (20:0) 1.124

стеариновая (18:0) 2,917 линолевая (18:2п6) 25,768

Установлено, что сумма насыщенных жирных кислот жирного масла сбора составляет 32,316%, сумма мононенасыщенных жирных кислот -32,547%, сумма полиненасыщенных жирных кислот - 34,539%.

Определение элементного состава проводили методом эмиссионного спектрального анализа, подготовку пробы проводили методом сухого сжигания. В результате было идентифицировано 17 макро- и микроэлементов (табл. 6). Содержание золы в сборе составило 9,01 %.

Установлено, что среди микроэлементов сбора наибольшее содержание составляют: Мп, Ре, Бг, Ва. Тяжелые металлы не превышают допустимых значений.

Таблица 6

Элементный состав сбора

Элемент % Элемент % Элемент % Элемент %

10 Мп 3 Мо 0,0001 Ва 0,08

Са 10 Сг 0,003 Си 0,015 и 0,003

мг >10 Со 0,001 РЬ 0,001

А1 0,4 № 0,001 Ъа 0,015

Ре 0,8 V 0.006 Бг 0,08

Установлено количественное содержание основных БАВ в сборе. Для проверки воспроизводимости методик проведено 5 определений содержа-

ния действующих веществ в одной серии сбора (табл. 7).

Таблица 7

Метрологические характеристики методик содержания основных БАВ сбора

БАВ Г X Б2 Б Р, % ЦР,0 Дх Е, %

аскорбиновая кислота 4 1,92 0,000552 0,0235 95 2.78 0,0653 3,4

глицирризиновая кислота 4 0,95 0,000092 0.0096 95 2.78 0.0266 2,8

орагнические кислоты 4 2,97 0,001096 0.0331 95 2.78 0.0921 3.1

каротиноиды 4 1.3 0.000137 0,0117 95 2.78 0.0325 2.5

дубильные вещества 4 1.38 0.00032 0.0179 95 2.78 0.0497 3.6

полисахариды 4 4,01 0.001197 0.0346 95 2.78 0.0962 2.4

Относительная ошибка единичного определения разработанных методик с 95 % вероятностью не превышает ±4 %.

Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин методом УФ-спектрофотометрии Учитывая данные о широком спектре фармакологического действия флавоноидов и аминокислот, а также сведения о наличии этих веществ в компонентах сбора, стандартизацию сбора проводили по сумме флавоноидов в пересчете на рутин-стандарт и по сумме аминокислот в пересчете на стандарт глютаминовой кислоты.

В основу разработанной методики положен метод дифференциальной спектрофотометрии после реакции комплексообразования со спиртовым раствором алюминия хлорида (рис. 1). Установлены условия проведения реакции комплексо-образования: количество извлечения, взятого для определения - 2 мл; концентрация раствора алюминия хлорида - 2 %; его количество, взятое для определения - 2 мл, время - 35-40 минут. Изучение зависимости оптической плотности от концентрации раствора показало, что поглощение света раствором рутина и спиртового извлечения из сбора подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бэра.

Выбор рутина в качестве стандарта основан на общем спектре извлечения сбора, имеющим максимум поглощения при Х=408±2 нм, что соответствует максимуму поглощения комплекса рутин - алюминия хлорид (рис.1).

сбора (2) с алюминия хлоридом При разработке методики учитывались оптимальные условия экстракции; установлено, что максимальное извлечение суммы флавоноидов достигается при экстракции сбора спиртом 70 %, при степени измельчения 1 мм, при соотношении сырья и экстрагента 1:100, в течение 1 часа.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье должно быть не менее 1,0 %. Для проверки воспроизводимости методики проводили определение в 5 независимых повторностях. От-

носительная ошибка методики единичного определения не превышает ±3,65 % (табл. 8).

Разработанная методика валидирована, с помощью современных методов доказана ее правильность, достоверность и воспроизводимость.

Таблица 8

Метрологические характеристики методики количественного

определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в сборе

г X 52 Б Р, % «Р,0 Дх Е.%

4 1,18 0,00024 0,0155 95 2,78 0,0431 3.65

Разработка методики количественного определения свободных аминокис-

лот спектрофотометрическим методом

В основу разработанной методики определения суммы аминокислот положена реакция взаимодействия с нингидрином. Выбор глютаминовой кислоты в качестве стандарта обусловлен данными ТСХ.

Оптимальными условиями проведения количественного определения аминокислот являлись: тип экстрагента - вода горячая; соотношение сбора и экстрагента - 1:100; время экстракции - 1 ч; количество извлечения, взятого для определения - 5 мл; концентрация раствора нингидрина - 0,1 %; его количество, взятое для определения - 5 мл; время проведения реакции комплексообразования - 25-30 минут. Изучение зависимости оптической плотности от концентрации раствора, показало, что поглощение света раствором рутина и спиртового извлечения из сбора подчиняется закону Бу-

Содержание суммы аминокислот в пересчете на глютаминовую кислоту и абсолютно сухое сырье должно быть не менее 2,0 %.

Для проверки воспроизводимости методики проводили определение в 5 независимых повторностях. Относительная ошибка методики количественного определения суммы аминокислот в пересчете на глютаминовую кислоту с 95 % вероятностью составляет ±2,33 % (табл. 9).

Таблица 9

Метрологические характеристики методики количественного определения

суммы аминокислот в пересчете на глютаминовую кислоту в сборе

{ X Р.% КР-0 Дх Е.%

4 2.36 0.00039 0,01975 95 2.78 0.0549 2,33

Разработанная методика валидирована, с помощью современных методов доказана ее правильность, достоверность и воспроизводимость.

Получение экстракта «Полинейротон» сухого на основе сбора и его

стандартизация Разработка технологической схемы получения экстракта сухого Сухие экстракты являются одним из наиболее рациональных способов переработки ЛРС, обеспечивающих максимальное извлечение действующих веществ и возможность создания стандартизованного фитопрепарата. Следующим этапом нашей работы являлась разработка способа получения сухого экстракта как субстанции для создания готовых лекарственных форм. В результате изучения факторов, влияющих на процесс экстрагирования, предложена ресурсосберегающая технология, обеспечивающая максимальный выход БАВ из лекарственного сырья. Оптимальной является последовательная экстракция сбора спиртом этиловым 70 % и 40 % двукратно, и водой очищенной однократно по 1 ч соответственно, обеспечивая полное истощение сырья. На основании рационального режима экстрагирования разработана технологическая схема (рис. 3), ставшая основой лабораторного регламента на производство экстракта «Полинейротон» сухого.

Экстракт сухой, полученный из сбора, представляет собой аморфный порошок от светло-коричневого до коричневого цвета, слегка гигроскопичный. Хорошо растворим в горячей воде, спирте 50-70 %. По разработанной схеме получено пять серий экстракта, заложенных на хранение. Срок хранения установлен в естественных условиях и составляет - не менее 2 лет. Разработанные показатели качества включены в нормативные документы: проект Фармакопейной статьи предприятия, Лабораторный регламент на способ получения экстракта сухого (ЛР 64- № 011-0353336911).

Фитохимическое изучение экстракта сухого При фитохимическом исследовании экстракта сухого было установлено наличие основных групп биологически активных веществ, содержащихся в исходном сборе: фенольные соединения, аминокислоты, аскорбиновую и органические кислоты, сапонины, дубильные вещества, кума-рины, восстанавливающие сахара.

Все методики качественного обнаружения идентичны использованным методикам для изучения качественного состава сбора. Идентификация

Рис. 3. - Технологическая схема производства

обнаруженных соединений подтверждена инструментальными методами исследований.

Определение аминокислот проводили на аминокислотном анализаторе марки ААА-339 (Чехия). В результате проведенного эксперимента было идентифицировано 19 свободных аминокислот (9 незаменимых*) и 20 связанных аминокислот (табл. 10, 11).

Таблица 10

Свободные аминокислоты экстракта____

Аминокислота мг/г Аминокислота мг/г Аминокислота мг/г

аланин 0,511629 гистидлин* 0,62356 серин 0,28377

у-аминомасляная 0,233112 глютаминовая 0,895135 тирозин 0.087229

аргинин* 0,107968 лейцин* 4.740365 фенилаланин* 0,087623

аспарагиновая 0,179173 лизин* 0,036975 цистин 0.811013

валин* 0,128279 метионин* 0.161868 этаноламин 0.033726

глицин 0.41305 орнитин 0.006386

Установлено, что среди свободных аминокислот экстракта наибольшее количество составляют лейцин*, кислота глютаминовая, цистин, гисти-

дин*.

Таблица 11

_ Связанные аминокислоты экстракта_

Аминокислота мг/г Аминокислота мг/г Аминокислота мг/г

аланин 0,053588 глютаминовая 0,582667 таурин 0.085559

у-аминомасляная 0,050769 изолейцин* 0,048834 тирозин 0.032723

аргинин* 0,120972 лейцин* 0,059806 треонин* 0,044943

аспарагиновая 0,673423 лизин* 0,046358 фенилаланин* 0,04262

валин* 0,064367 метионин* 0,032719 этаноламин 0,0529

глицин 0,066194 пролин 0,484632 фосфоэтаноламин 0,117393

ги стадии* 0,046578 серин 0,076559

Установлено, что среди связанных аминокислот экстракта наибольшее количество составляют: аспарагиновая кислота, глютаминовая кислота, пролин.

Определение фенольных соединений проводили методом ВЭЖХ. В результате эксперимента обнаружено 33 соединения, идентифицировано 20

Установлено, что среди фенольных соединений экстракта наибольшее количество составляют: танин, галловая кислота, кумарин, хлорогеновая кислота, гиперозид, рутин.

Определение элементного состава проводили методом эмиссионного спектрального анализа, подготовку пробы - методом сухого сжигания. В результате проведенного эксперимента было идентифицировано 17 макро-и микроэлементов (табл. 13). Содержание золы в экстракте составило 27,25 %.

Таблица 12

Фенольные соединения экстракта

Соединение % Соединение % Соединение %

танин 11.94 рутин 3.19 глицирризиновая к-та 1.17

галловая к-та 14,72 байкалин 2.28 байкалеин 1.29

хлорогеновая к-та 4,07 лютеолин-7-глюкозид 1.33 кверцетин 1.29

кофейная к-та 1.71 гиперозид 5.2 дигидрокверцетин 2.2

цикориевая к-та 1.05 лютеолин 0.61 кумарин 17.17

феруловая к-та 1,89 витексин 1,19 кемпферол 0.55

апигенин 3,99 нарингенин 5.2

Таблица 13

Элементный состав экстракта

Элемент % Элемент % Элемент % Элемент %

51 J 3 Мп 0,6 Мо 0.0001 Ва 0,05

Са 3 Сг 0,004 Си 0.008 и <0,003

м§ 10 Со 0,001 РЬ 0,0001

А1 0,1 № 0,0006 гп 0,006

Ре 0,2 V 0,005 Бг <0,08

Установлено, что среди микроэлементов экстракта наибольшее содержание составляют: Мп, Бг, Ва, Ре. Тяжелые металлы не превышают допустимых значений.

Установлено количественное содержание основных БАВ в экстракте сухом. Для проверки воспроизводимости методик проведено 5 определений содержания действующих веществ в одной серии экстракта (табл. 14).

Таблица 14

Метрологические характеристики методик содержания основных БАВ

экстракта сухого

БАВ С X 5 Р, % Дх Е, %

аскорбиновая кислота 4 4,32 0,002061 0,0451 95 2,78 0,1253 2,9

глицирризиновая кислота 4 3,25 0,000858 0,0293 95 2,78 0,0813 2.5

орагнические кислоты 4 8,3 0,006989 0,0836 95 2,78 0,2324 2.8

каротиноиды 4 3,25 0,000605 0,0246 95 2,78 0,0683 2.1

дубильные вещества 4 3.21 0,000973 0,0312 95 2.78 0,0867 2.7

полисахариды 4 9,23 0,005344 0,0731 95 2,78 0.2031 2.2

Относительная ошибка единичного определения разработанных методик с 95 % вероятностью не превышает ±3 %.

Разработка методик стандартизации нейропротективного средства -

экстракта «Полинейротон» сухого Для количественной оценки содержания БАВ в экстракте сухом предложена методика количественного определения по содержанию суммы флавоноидов и суммы аминокислот методом спектрофотометрии, при этом

учтена разработка методики для сбора. Максимумы поглощения рутина-стандарта и раствора экстракта находятся в одной области 408±2 нм.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин должно быть не менее 4,0 %. Для проверки воспроизводимости методики проведено 5 определений содержания суммы флавоноидов в одной серии экстракта (табл.15).

Таблица 15

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в экстракте сухом

4.38

0,00185

0,0430

Р, % 95

t(P.f) 2.78

Дх 0.1196

Е, % 2.73 ~

Как видно из данных таблицы, относительная ошибка единичного определения с 95% вероятностью составляет ±2,73 % для экстракта, что свидетельствует о воспроизводимости методики. Отсутствие систематической ошибки методики доказано при помощи опытов с добавками ГСО рутина в навеску сырья.

Определение содержания аминокислот в пересчете на глютаминовую кислоту проводили спектрофотометрическим методом. Максимумы поглощения стандарта глютаминовой кислоты и раствора экстракта находятся в одной области 566±2 нм.

Содержание суммы аминокислот в пересчете на глютаминовую кислоту и абсолютно сухое сырье должно быть не менее 3,0 %. Для проверки воспроизводимости методики проведено 5 определений содержания суммы аминокислот в одной серии экстракта (табл. 16).

Таблица 16

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы аминокислот в пересчете на глютаминовую кислоту в экстракте

f X S Р.% t(P.f) Дх Е.%

4 3,45 0,000605 0,0246 95 2,78 0,0683 1,98

Как видно из данных таблицы, относительная ошибка единичного определения с 95% вероятностью составляет ±1,98 % для экстракта, что свидетельствует о воспроизводимости методики. Отсутствие систематической ошибки методики доказано при помощи опытов с добавками PCO глютаминовой кислоты в навеску сырья.

Разработанные методики вапидированы, с помощью современных методов доказаны их правильность, достоверность и воспроизводимость.

Разработаны показатели качества для экстракта сухого: описание внешнего вида, подлинность, потеря в массе при высушивании, количественное содержание действующих веществ включены в проект ФСП.

Проведены исследования по установлению срока годности сухого экстракта. При хранении в естественных условиях (температура 18-20 °С), пока-

затели качества определяют через каждые 6 месяцев. На основании полученных данных установлен предварительный срок - 2 года.

ВЫВОДЫ

1. На основании данных литературы о химическом составе растений, применении их в научной и традиционной медицине, состоянии сырьевой базы и результатов фармакологического скрининга была разработана растительная композиция, являющаяся основой для получения нейропротективных средств в форме сбора, сухого экстракта и фиточая.

2. Макро- и микроскопическими методами анализа установлены диагностически значимые признаки сбора, фиточая и его компонентов. Установлены числовые показатели. Исследован химический состав сбора и экстракта сухого методами хроматографии, ВЭЖХ, ГХМС, при этом идентифицированы: фла-воноиды (апигенин, рутин, байкапин, байкалеин, лютеолин-7-глюкозид, гипе-розид, лютеолин, витексин, нарингенин, кверцетин, дигидрокверцетин, кемп-ферол), фенолкарбоновые кислоты (галловая, хлорогеновая, кофейная, цико-риевая, феруловая), танин, глицирризиновая кислота, кумарин; свободные и связанные аминокислоты; компоненты эфирного масла; жирные кислоты.

3. Установлены оптимальные условия экстракции получения сухого экстракта: экстрагент - спирт 70 % и 40 %, вода горячая; степень измельчения для каждого вида сырья в зависимости от морфологического строения (корни шлемника и солодки, побеги черники - 3 мм, плоды шиповника, боярышника и облепихи - 0,5-1 мм, трава астрагала перепончатого, солянки холмовой, цветки ноготков - 5 мм), соотношение сырье - экстрагент 1:(10-12) с учетом коэффициента водопоглощения, время экстракции - по 1ч. Определены показатели качества и срок годности экстракта сухого - 2 года.

4. Разработаны и валидированы методики стандартизации нейропротективных средств по флавоноидам и аминокислотам методом спектрофотомет-рии. Относительная ошибка определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин и суммы аминокислот в перечете на глютаминовую кислоту составляет ± 3,65 % и ± 2,33 % соответственно в сборе, ± 2,73 % и ± 1,98 % соответственно в сухом экстракте.

5. Разработаны нормативные документы: проекты ФСП на сбор и экстракт сухой, ТУ и ТИ на производство БАД к пище Фиточай «Полинейротон», фильтр-пакеты, Рецептура, Лабораторный регламент (ЛР) на производство сбора и экстракта сухого.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Serebryanskaya T.S. Development of the composition of herbs for creation of the medical product having neuromodulating action / T.S. Serebryanskaya, G.G. Ni-kolaeva, M.Yu. Tulonov // Materials of the III International scientific conference «Traditional medicine: a current situation and perspectives of development». -Ulan-Ude, 2008. - P. 64.

2.Серебрянская Т.С. Обоснование выбора компонентов композиции лекарственных растений для создания лекарственного средства, обладающего ней-ромодулируюшим действием / Т.С. Серебрянская, Г.Г. Николаева // Материалы Всероссийской молодежной научно-технической конференции «Молодые ученые Сибири». - Улан-Удэ, 2008. - С. 176-180.

3.Serebryanskaya T.S. Componental structure of a composition neyroprotective action. Development and a substantiation / T.S. Serebryanskaya, G.G. Nikolaeva // Erdos forum on Development of International Traditional Medicine. The 4th International Symposium on Traditional Medicine and Innovative Drugs. - Erdos, 2009.-P. 26.

4. Серебрянская Т.С. Определение состава фенольных соединений полиэкстракта сухого методом ВЭЖХ / Т.С. Серебрянская, Г.Г. Николаева // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2009. - № 3. - С. 225-227.

5. Серебрянская Т.С. Анализ свободных аминокислот водного извлечения композиции лекарственных растений, обладающей нейропротекторным действием / Т.С. Серебрянская, Г.Г. Николаева // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. -2010-№2.-С. 213-215.

6. Серебрянская Т.С. Сравнительный анализ свободных аминокислот сбора лекарственных растений и его полиэкстракта сухого, обладающих нейропротекторным действием / Т.С. Серебрянская, Г.Г. Николаева, М.Ю. Туло-нов, С.М. Гуляев // Вестник БГУ. -2010. -№ 12. - С. 88-91.

7.Серебрянская Т.С. Действие сухого полиэкстракта при ишемии головного мозга у крыс / С.М. Николаев, С.М. Гуляев, М.Ю. Тулонов, Т.С. Серебрянская // Вестник БГУ. - 2010. - № 12. - С. 26-29.

Подписано в печать22.П.20II. Формат60x84 1/16. Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,4. Уч.-изд. л. 1,3. Тираж 100. Заказ № 69. Отпечатано в типографии Изд-ва БНЦ СО РАН 670047 г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6.

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Охрана и укрепление здоровья людей является одной из актуальных медико-социальных задач современного общества. Значительная распространенность ишемических повреждений головного мозга, является одной из актуальных проблем медицинской и фармацевтической наук. Это обусловлено резким увеличением заболеваемости атеросклерозом, артериальной гипертонией и связанных с ними сосудистыми заболеваниями головного мозга. В России цереброваскулярные заболевания занимают второе место среди причин смертности, а как причина стойкой инвалидизации -первое место [62, 111, 124]. Частота начальных форм хронической недостаточности мозгового кровообращения по данным НИИ неврологии РАМН [58, 74] достигает 70 % среди всех цереброваскулярных заболеваний являющихся, при этом, основным фактором риска развития инсультов [32, 65, 74].

Несмотря на обширный арсенал современных лекарственных средств, применяемых для профилактики и лечения цереброваскулярных заболеваний, потребность в эффективных и безопасных средствах остается по-прежнему высокой. Среди широкого спектра лекарственных средств, применяемых в медицинской практике, особое место занимают препараты на основе лекарственного растительного сырья. Препараты растительного происхождения являются перспективными для фармакологической коррекции нарушений, возникающих при недостаточности кровоснабжения мозга, так как обладают высокой эффективностью и предельно низкой токсичностью, а также многообразием фармакологических свойств, что обеспечивает комплексное воздействие на организм больного. В частности, при лечении начальных форм хронической недостаточности мозгового кровообращения предусматривается назначение фитопрепаратов, совмещающих не только гиполипидемический, ноотропный, антиоксидантный и антигипоксический эффекты, а также обладающих иммуномодулирующим, противовоспалительным, адаптогенным, седативным, спазмолитическим, мембраностабилизирующим, антимикробным действием, что позволяет воздействовать на все звенья патогенеза данного заболевания, оказывать регулирующее влияние на метаболические процессы в мозге и организме. Необходимо подчеркнуть, что в отличие от синтетических средств, фитопрепараты представляют собой комплекс нативных, сбалансированных, имеющих сродство к организму человека биологически активных веществ (БАВ) и, как следствие, их действие оказывается более мягким, всесторонним; при их применении практически отсутствуют побочные эффекты. Помимо терапевтического эффекта основных действующих компонентов, лекарственные средства растительного происхождения несут в себе комплекс витаминов, макро- и микроэлементов, которые крайне необходимы организму. Для растительных препаратов характерно комплексное влияние на периферические и центральные механизмы адаптации функций организма. В настоящее время фитофармакотерапия занимает особое место в профилактике и лечении многих хронических и длительно протекающих заболеваний, в частности нарушений кровообращения в центральной нервной системе.

Среди многокомпонентных лекарственных средств природного происхождения наиболее востребованными и доступными для населения России остаются сборы и экстракционные препараты. Исследования последних лет показали, что целебные свойства лекарственных растений зависят от гармоничного взаимодействия всех активных веществ, которые обладают в своей совокупности более широким действием, чем в отдельности. Перспективными являются исследования по переводу сборов и отдельных растений, используемых в виде настоев и отваров, в суммарные препараты -экстракты, которые выгодно отличаются рациональностью использования и постоянством состава биологически активных веществ, а также возможностью их стандартизации. В последние десятилетия для профилактики цереброваскулярных заболеваний широко применяются биологически активные добавки к пище. Эффективные и качественные биодобавки снижают риск развития большинства «возрастных» болезней, обусловленных недостаточностью кровообращения в жизненно важных органах (мозге, сердце и других).

В этой связи, актуальным представляется исследование, направленное на разработку экстрактов сухих, полученных на основе сборов, а также биологически активных добавок (БАД) к пище в форме фиточаев. Исходя из вышеизложенного, научные исследования, направленные на разработку и стандартизацию лекарственных средств и БАД к пище, предназначенных для коррекции обменных процессов в головном мозге и улучшения общего функционального состояния пациентов, являются актуальными, своевременными, имеющими как теоретическое, так и важное практическое значение для клинической практики и фармации.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящего исследования является разработка и стандартизация нейропротективных средств и биологически активной добавки к пище растительного происхождения.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи: теоретически и экспериментально обосновать состав и соотношение компонентов растительной композиции для разработки сбора нейропротективного; провести фармакогностическое изучение сбора: разработать критерии подлинности и показатели доброкачественности, определить содержание биологически активных веществ; изучить влияние основных факторов экстракции на выход биологически активных веществ из сбора для разработки способа получения экстракта сухого и фиточая; провести фитохимическое изучение экстракта сухого; разработать и валидировать методики стандартизации указанных средств по сумме флавоноидов и аминокислот;

- разработать проекты нормативной документации: ФСП на сбор нейропротективный, экстракт сухой и ТУ на БАД к пище.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Обоснован и разработан состав и соотношение компонентов сбора, включающий девять видов лекарственных растений, и рекомендованный в качестве нейропротективного средства.

Проведен товароведческий анализ сбора. Макро- и микроскопическими методами исследований установлены диагностически значимые признаки сбора и фиточая; установлены критерии подлинности и числовые показатели, внесенные в нормативные документы. С учетом вклада каждого компонента сбора разработаны методики качественного и количественного определения, подтверждающие наличие основных групп веществ, характерных для каждого вида сырья.

Определены условия экстрагирования сбора, обеспечивающие максимальный выход суммы экстрактивных и действующих веществ, которые положены в основу разработки способа получения экстракта сухого (условно названного «Полинейротон») со стабильными показателями качества.

Методами БХ, ТСХ, ВЭЖХ, ГХМС установлено наличие основных групп биологически активных веществ: флавоноидов, аминокислот, аскорбиновой кислоты, органических и фенолкарбоновых кислот, каротиноидов, полисахаридов, глицирризиновой кислоты, дубильных веществ, а также обнаружено 17 макро- и микроэлементов в сборе и экстракте сухом; определены компоненты эфирного (9) и жирного (8) масла сбора; установлены показатели качества, которые включены в проекты ФСП.

Разработаны и валидированы методики количественной оценки БАВ -суммы флавоноидов в пересчете на рутин, суммы свободных аминокислот в пересчете на глутаминовую кислоту, позволяющие проводить стандартизацию от сбора к экстракту методом спектрофотометрии.

Составлены нормативные документы: ФСП, ТУ, Рецептура, лабораторные регламенты, технологическая инструкция.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. На основании результатов макро- и микроскопического, товароведческого и фитохимического изучения разработаны: проекты Фармакопейных статей предприятия (ФСП) на сбор нейропротективный, экстракт сухой «Полинеротон»; технические условия (ТУ) на БАД к пище Фиточай «Полинейротон», фильтр-пакеты (ТУ 9370-01603533369-11), Рецептура, а также Технологическая инструкция (ТИ) на производство БАД к пище Фиточай «Полинейротон», фильтр-пакеты; состав и способ получения сбора (Лабораторный регламент на производство сбора нейропротективного. ЛР 64- № 005-03533369-11); способ получения и технологическая схема производства экстракта сухого «Полинейротон» (Лабораторный регламент на производство экстракта сухого «Полинейротон». ЛР 64- № 011-03533369-11); проект Инструкции по применению БАД к пище Фиточай «Полинейротон», фильтр-пакеты. Результаты исследований внедрены в учебный процесс кафедры «Технология продуктов из растительного сырья» ВСГУТУ (акт внедрения от 15.09.2011 г.). Проекты нормативных документов утверждены Ученым советом ИОЭБ СО РАН, протокол № 10 от 09.09.2011 г.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ. Основные положения диссертации представлены на: Всероссийской научно-технической конференции «Молодые ученые Сибири» (Улан-Удэ, 2008); the III International scientific conference «Traditional medicine: a current Situation and perspectives of development» (Ulan-Ude, 2008); the 4th International Symposium on Traditional Medicine and Innovative Drugs (Erdos, 2009). По материалам диссертационной работы опубликовано 7 научных работ, из них 3 - в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ.

СВЯЗЬ ЗАДАЧ ИССЛЕДОВАНИЯ С ПРОБЛЕМНЫМ ПЛАНОМ НАУЧНОГО СОВЕТА ПО ФАРМАКОЛОГИИ И ФАРМАЦИИИ. Настоящая работа выполнена в лаборатории химико-фармацевтических исследований в соответствии с программой и планом научно-исследовательских работ

Института общей и экспериментальной биологии СО РАН по теме № 146 «Разработка лекарственных и профилактических препаратов для медицины. Фундаментальные основы и реализация», утвержденной президиумом СО РАН.

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ:

- данные по обоснованию и разработке состава и соотношения компонентов сбора; результаты разработки способа получения сбора, экстракта сухого и фиточая;

- результаты фармакогностического и фитохимического изучения сбора и экстракта сухого; результаты исследований по стандартизации сбора и экстракта сухого.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. На основании данных литературы о химическом составе растений, применении их в научной и традиционной медицине, состоянии сырьевой базы, результатов фармакологического скрининга и фитохимического изучения обоснован состав и соотношение компонентов растительной композиции являющейся основой для получения нейропротективных средств в форме сбора, сухого экстракта и фиточая.

2. Макро- и микроскопическими методами исследования установлены диагностически значимые признаки сбора, фиточая и его компонентов. Установлены числовые показатели. Исследован состав сбора и экстракта сухого методами хроматографии (БХ, ТСХ, ВЭЖХ), ГХМС, при этом идентифицированы: флавоноиды (апигенин, рутин, байкалин, байкалеин, лютеолин-7-глюкозид, гиперозид, лютеолин, витексин, нарингенин, кверцетин, дигидрокверцетин, кемпферол), фенолкарбоновые кислоты (галловая, хлорогеновая, кофейная, цикориевая, феруловая), танин, глицирризиновая кислота, кумарин; свободные и связанные аминокислоты; компоненты эфирного масла; жирные кислоты.

3. Определено влияние основных факторов экстракции на выход биологически активных веществ; установлены оптимальные условия экстракции: экстрагент - спирт 70 %, 40 % и вода горячая; соотношение сырье - экстрагент 1:10(12) с учетом коэффициента водопоглощения 1:3, время экстракции — по 1 часу. Разработан способ получения экстракта сухого на основе сбора нейропротективного.

4. Разработаны и валидированы методики стандартизации нейропротективных средств по флавоноидам и аминокислотам методом спектрофотометрии. Относительная ошибка определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин и суммы аминокислот в перечете на глутаминовую кислоту составляет ± 3,65 % и ± 2,33 % соответственно в сборе, ± 2,73 % и ± 1,98 % соответственно в сухом экстракте. Определены показатели качества и срок годности экстракта сухого — 2 года.

5. Разработаны нормативные документы: проекты ФСП на сбор и экстракт сухой, ТУ и ТИ на производство БАД к пище Фиточай «Полинейротон», фильтр-пакеты, Рецептура, Лабораторный регламент на производство сбора и экстракта сухого.

Заключение

Цереброваскулярные заболевания относятся к одним из самых распространенных заболеваний во всем мире, занимая 2-3 место в ряду главных причин смертности и является ведущей причиной инвалидизации населения в экономически развитых странах. В последние десятилетия во всем мире наблюдается «старение» населения и эта тенденция будет превалировать в ближайшее время [32, 62, 65, 74, 76, 102, 111, 174]. Известно, что у пожилых людей значительно снижена активность иммунной системы, замедлены реакции и адаптация, наблюдаются нарушения в сердечно-сосудистой деятельности, дыхательной, желудочно-кишечной, мочеполовой системе. Из-за ослабления всех функций в организме пожилых людей терапия заболеваний весьма затруднена. Это связано с тем, что у гериатрических пациентов, как правило, наблюдается полиморбидность (множественность заболеваний),: замедляется всасываемость, распределение, экскреция принимаемых лекарственных средств, часто возникают побочные эффекты, из-за большой продолжительности приема лекарственных средств к ним возникает привыкание [74, 99, 100, 137].

Особую роль в лечении различных заболеваний имеют препараты из лекарственного растительного сырья, они практически не оказывают побочного действия на организм пациентов и имеют сродство к нему. Данные препараты оказывают мягкое, положительное воздействие на организм [62, 73, 74, 80, 88, 89, 123]. Комплексные фитопрепараты используют в практике, в основном в политерапии, для вспомогательного эффекта и в целях профилактики заболеваний. Препараты растительного происхождения являются перспективными для фармакологической коррекции нарушений, возникающих при недостаточности кровоснабжения мозга, так как обладают высокой эффективностью и предельно низкой токсичностью, а также многообразием фармакологических свойств, что обеспечивает комплексное воздействие на организм больного.

Таким образом, препараты на основе лекарственного растительного сырья, перспективны и актуальны в вопросах, касающихся терапии и профилактики различных заболеваний. Их разработка и исследование является одним из важнейших вопросов медицины. Большой интерес представляет поиск лекарственных растительных средств, обладающих нейропротективной активностью, необходимых в медицинской практике для лечения и профилактики нарушений кровообращения головного мозга. С расширением ассортимента лекарственных средств является актуальной разработка и стандартизация экстрактов сухих из лекарственного растительного сырья (сборов). Разработка лекарственных средств - основной ключевой момент, основой действия которой является разработка технологической схемы производства, установление показателей качества (разработка методик качественного и количественного определения основных биологически активных веществ) и экспериментальных фармакологических исследований. В последние десятилетия для профилактики, в том числе, цереброваскулярных заболеваний применяются биологически активные добавки к пище.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования являлось лекарственное растительное сырье, отвечающее требованиям нормативной документации:

- корни шлемника байкальского {Radices Scutellariae baicalensis) — ФС 42-453-72;

- плоды шиповника (Fructus Rozae) - ГФ XI, вып.2, ст. 38;

- трава астрагала перепончатого (Herba Astragali membranaceus) - ТУ 9370-003-03533369-08;

- плоды боярышника {Fructus Crataegi) - ГФ XI, вып. 2, ст. 32;

- цветки ноготков {Flores Calendulae) - ГФ XI, вып. 2, ст. 5;

- корни солодки голой (к. солодки уральской) {Radices Glycyrrhizae, г. G. uralensis) - ГФ X, ст. 573; ФСП 42-0273-1781-01 и 0296-2339-02;

- трава солянки холмовой {Herba Salsolae collina) - ТУ 9379-00451522555-05;

- побеги черники обыкновенной {Cormus Vaccinium myrtilli) — ФС 422948-93;

- плоды облепихи крушиновидной {Fructus Hippophae rhamnoides) -ВФС 42-1741-87; ТУ 64-4-87-89.

В исследованиях использовали различные варианты сбора, сухие экстракты и БАД к пище - фиточай, полученные из сбора. Отбор средней и аналитических проб, измельчение сырья - согласно ГФ XI, вып. 1, стр. 273.

Изучение внешних признаков сбора проводили - оп ГФ XI, вып. 1, стр.266. Микроскопическое изучение сбора, фиточая и его компонентов проводили по ГФ XI, вып. 1, стр. 277. Исследование и фотосъемку проводили на микроскопе MICROS Serial № 008722 МС 300Х (Austria) с окуляром хЮ и объективами М, хЮ.

Сгущение полученных извлечений проводили на вакуум-выпарном ротационном испарителе марки ИРМ-1.

Исследование качественного состава объектов проводили качественными реакциями, и методом одномерной и двумерной хроматографии на бумаге марки «Filtrak» FN-11 (Германия), а также тонкослойной хроматографией на пластинках «Silufol» марки «UV254» (Чехия) размером 15x15 см в следующих системах растворителей:

I 15 % раствор кислоты уксусной;

II н-бутанол - кислота уксусная ледяная - вода (БУВ) (4:1:2);

III этилацетат - кислота уксусная (4:1);

IV гексан - ацетон (7:3);

V гексан - этилацетат (4:1);

VI хлороформ - спирт этиловый (19:1);

VII пиридин - уксусный ангидрид - вода (3:2:1).

Растворители для хроматографии и реактивы для получения производных использовали марки ХЧ и ЧДА. Соотношение растворителей учитывали в объемных частях.

ВЭЖХ проведено на хроматографе «Gilston» модель 305 (Франция); инжектор ручной - модель Rheodyne 7125 USA, с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы Мультихром для Windows. Неподвижная фаза - металлическая колонка размером 4,6x250 мм Кромасил С18 с размером частиц сорбента 5 микрон. Подвижная фаза - смесь метанол - вода - фосфорная кислота концентрированная (400:600:5). Скорость подачи элюента- 0,8 мл/мин. Продолжительность анализа составляла 120 мин. Детектор - УФ - при длине волны 254 нм; объем вводимой пробы - 20 мкл.

Определение аминокислотного состава сбора и экстракта сухого проводили на аминокислотном анализаторе марки ААА-339 (Чехия). Содержание аминокислот определяли в нмоль/г, затем производили перерасчет количественного содержания аминокислот в мг/г к абсолютно сухому сырью.

Определение элементного состава экстракта сухого проводили на спектрографе ДФС-8 с плоскостной дифракционной решеткой методом эмиссионного спектрального анализа.

Определение состава жирных кислот проводили методом газо-хромато-масс-спектрометрии (ГХМС) на газовом хроматографе Hewlett-Packard 6890 с квадрупольным масс-спектрометрическим детектором HP 5973. Кварцевая колонка CP-Wax (неполярная фаза - полиэтиленгликоль) с внутренним диаметром 0,20 мм. В качестве подвижной фазы использовали гелий марки «А». Качественный анализ основан на сравнении времен удерживания полных масс-спектров соответствующих чистых компонентов, представленных в машинном каталоге стандартных смесей GLC-68D (Nu-Chek-Prep; Elysian, Minnesota, USA).

Определение эфирного масла проводили перегонкой с водяным паром, его компоненты идентифицировали методом газо-хромато-масс-спектрометрии (ГХМС) на газовом хроматографе Hewlett-Packard 6890 с масс-селективным детектором.

При разработке методик качественного и количественного определения использованы хроматографически чистые вещества и стандарты: ГСО рутина (ФС 42-2508-87), ГСО гиперозида (ФС 42-0106-03), ГСО кверцетина (ФС 421290-79), ГСО лютеолина (ФС 42-2970-93), ГСО лютеолина-7-гликозида (ФС 42-3130-95); мирицетина (чистое вещество), кислота галловая (Fluka, кат. № 48630), кислота кофейная (Sigma, кат. № 0625), кислота аскорбиновая (ГОСТ 7047-55), кислота яблочная (ТУ 6-09-4058-75), кислота лимонная (ГОСТ 365269), ß-каротин (ТУ 65-5139-86), глюкоза (ФС 42-2419-86).

Растворы стандартных веществ в видимой и УФ-областях записывали на спектрофотометре УФ-видимого диапазона (UVmini-1240, Kyoto Japan), используя растворители: спирт этиловый 95 %, 70 %, 40 %, 30 %.

Спектрофотометрическое определение биологически активных веществ проводили с помощью спектрофотометра CECIL СЕ 1021 и CECIL СЕ 2011 (США) в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм.

Валидация проведена в соответствии с руководством [74]. Разработанные методики отвечают требованиям специфичности, точности, прецизионности.

1. Специфичность - способность однозначно оценивать анализируемое вещество в присутствии других компонентов, которые могут присутствовать в образце. Это могут быть примеси, продукты разложения, вспомогательные вещества и так далее. Недостаток специфичности испытания может быть компенсирован другими дополнительными испытаниями. Специфичность для различных типов испытаний означает следующее:

Идентификация: доказательство того, что идентифицировано именно анализируемое вещество.

Испытания на примеси: доказательство того, что каждое испытание на примеси позволяет однозначно характеризовать содержание примесей в образце (например, «Сопутствующие примеси», «Тяжелые металлы», «Содержание остаточных количеств органических растворителей» и другие).

Количественное определение (содержание или активность): доказательство того, что методика позволяет точно и правильно установить содержание или активность именно анализируемого вещества в образце.

2. Правильность или точность характеризует степень соответствия между известным истинным значением или справочной величиной и значением, полученным по данной методике.

3. Прецизионность аналитической методики выражает степень близости (или степень разброса) результатов для серии измерений, выполненных по данной методике на различных пробах одного и того же однородного образца. Прецизионность может рассматриваться на трех уровнях: сходимость, внутрилабораторная прецизионность и воспроизводимость.

4. Сходимость характеризует прецизионность методики при ее выполнении в одних и тех же условиях (в частности, одним и тем же аналитиком или группой аналитиков) в течение небольшого промежутка времени.

Статистическая обработка результатов в соответствии с ГФ XI изд., вып.1, стр.199. Точность метода устанавливается из п повторных исследований одного и того же материала, где: п Хі

ЛЛ п = п-1

52 = г -V хі — х \ /

5 = Р

Кл/) = ±—•100% х

- число измерении;

- данные отдельных определений;

- среднее значение из и определений;

- число степеней свободы;

- дисперсия;

- средняя квадратичная ошибка отдельного определения (выборочное стандартное отклонение);

- коэффициент надежности (доверительная вероятность), %;

- критерий Стьюдента, зависящий от надежности и числа определений;

- абсолютная ошибка результата отдельного определения;

- относительная ошибка результата отдельного (единичного) определения.

ГЛАВА 2. РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ СБОРА НЕЙРОПРОТЕКТИВНОГО

2.1. Обоснование подбора композиции сбора

В настоящее время существуют различные подходы к составлению комплексных растительных средств. Один из них предполагает взаимное усиление позитивных свойств используемых сочетаний, другой основан на подборе компонентов, исходя из данных об их химическом составе, фармакологической активности, применении в народной, традиционной и научной медицине [7, 40, 52, 57, 63, 70, 79, 147, 152]. Также учитываются национальные особенности составления прописей, традиционная сочетаемость (частота совместной встречаемости в прописях традиционной медицины), состояние сырьевой базы и принципы адекватной мобилизации адаптационных механизмов при воздействии на организм повреждающих факторов.

Оптимальным следует считать подбор ингредиентов, действие которых направлено на устранение причин заболевания, уменьшение патогенетических изменений, усиление защитных и компенсаторно-приспособительных механизмов организма. Доказано, что комплексные растительные средства имеют более широкий спектр терапевтического действия, чем отдельные его компоненты [7, 40]. При этом должны соблюдаться принципы составления многокомпонентных лекарственных средств: безопасность, обеспечивающая возможность длительного применения с минимальными побочными эффектами; эффективность, обеспечивающаяся рациональным сочетанием компонентов с учетом потенцирования их действия друг другом; нормализация нарушенных звеньев метаболизма; стандартное качество и стабильность при хранении; рациональная лекарственная форма.

Учитывая, что одними из основных причин инсульта являются гипертония, гиперхолестеринемия, атеросклероз, сердечно-сосудистые заболевания и сахарный диабет, были подобраны лекарственные растения, влияющие на причины возникновения этих заболеваний. Сбор в свой состав включает компоненты, подобранные по принципу сочетанного разностороннего действия на организм, среди которых растения, обладающие спазмолитической, гипотензивной, ноотропной активностью, растения, влияющие на состав крови, витаминоносные растения и растения, обладающие широким спектром фармакологического действия. Доля каждого вида сырья и рациональность их сочетания определялись с учетом механизма развития нарушений мозгового кровообращения, официнальности и состояния сырьевой базы.

Все лекарственные растения, включенные в растительную композицию, способны возместить недостаточность витаминов и микроэлементов, которые в сочетании с флавоноидами, полисахаридами и другими биологически активными веществами формируют механизм синергетического действия антиоксидантов, осуществляющих защиту липидов и мембранных белков клеток от перекисного окисления, способствуют укреплению стенок капилляров и сосудов, выводят излишки холестерина из состава крови, усиливают и потенцируют действие сопутствующих компонентов. Наличие в растениях заменимых и незаменимых аминокислот способствует восстановлению структуры клеток, усилению регенеративных процессов, уменьшению дистрофических проявлений [2, 3, 15, 18, 26, 29, 44, 46, 58, 107, 116, 123, 128, 129, 130, 134, 135, 144, 145, 154]. Использование комплекса биологически активных веществ в таком сочетании в сборе необходимо для обеспечения адекватной фармакологической коррекции нарушений кровообращения головного мозга.

Нами подобрана исходная растительная композиция (сбор), состоящая из девяти видов лекарственных растений: шлемника байкальского, шиповника собачьего, астрагала перепончатого, боярышника кроваво-красного, ноготков лекарственных, солодки голой (или уральской), солянки холмовой, черники обыкновенной, облепихи крушиновидной.

Выбор оптимального варианта и соотношения компонентов сбора С целью выбора оптимальной комбинации растительного сырья, входящего в сбор, были изучены 4 варианта сбора (табл. 2).

Содержание экстрактивных веществ определяли по методике ГФ XI, вып. 1, стр. 295. Количественное определение суммы флавоноидов в пересчете на рутин, суммы свободных аминокислот в пересчете на глутаминовую кислоту проводили по разработанным нами методикам. Экстракцию каждого варианта сбора проводили по следующей методике: сырье измельчают (согласно ГФ X изд., ст. 349), помещают в конические колбы, заливают горячей водой при соотношении 1:10 и настаивают на водяной бане при помешивании 3 раза по 30 минут, фильтруют. Объединенные извлечения каждого варианта сбора упаривают под вакуумом, остаток сушат в вакуум-сушильном шкафу. Полученный концентрат растирают в порошок и анализируют на содержание флавоноидов и аминокислот (табл. 3).