Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фармакогностическое изучение и стандартизация травы Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge, произрастающего в Бурятии

На правах рукописи

ТАНГАНОВА Елена Алексеевна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ТРАВЫ ASTRAGALUSMEMBRANACEUS (Fisch.) Bunge, ПРОИЗРАСТАЮЩЕГО В БУРЯТИИ

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Улан-Удэ - 2007

003066768

Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения Российской академии наук

Научный руководитель доктор фармацевтических наук,

Николаева Галина Григорьевна

Официальные оппоненты

доктор фармацевтических наук, профессор

Даргаева Тамара Дарижаповна

кандидат фармацевтических наук Югдурова Елизавета Долгоровна

Ведущая организация ГОУ ВПО Иркутский государственный

медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита состоится « á>> г в часов на заседании

диссертационного совета К 003 fe 8 01 при Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу 670047, г Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН

Автореферат разослан » г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук УЯи^К В.Б. Хобракова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Изменившийся экологический фон оказывает влияние и на общую структуру заболеваемости, все больше удельный вес приобретают так называемые болезни цивилизации сердечно-сосудистые, нервно-психические, аллергические, онкологические и другие, которые часто осложняются формирЬванием вторичного иммунодефицита, вызываемого неблагоприятным воздействием на организм различных факторов - химических, экологических, медикаментозных, стресса и др В связи с этим возникает необходимость поиска средств, способных неспецифически стимулировать иммунную систему с целью повышения резистентности организма к любым патогенам Этим требованиям в определенной мере соответствуют иммуномодуляторы растительного происхождения Лекарственные средства растительного происхождения находят широкое применение в медицине Возрастающая популярность и эффективность во многом, объясняется содержанием в них биологически активных веществ, которые воздействуют на организм человека комплексно, легко включаются в обменные процессы и практически не проявляют побочных реакций при длительном применении

Одним из возможных подходов создавшейся проблемы является поиск и фармакогностическое изучение новых лекарственных растений для расширения ассортимента иммуномодулирующих лекарственных растительных средств

С потерей традиционных мест заготовки и культивирования лекарственных растений в Европейской части страны вызывает необходимость перенесения заготовок в Сибирь и на Дальний Восток, в частности, Бурятия обладает значительными потенциальными запасами дикорастущих лекарственных растений, которые изучены недостаточно

Богатейший опыт использования растений в народной и традиционной медицине является надежным ориентиром для выбора новых перспективных видов лекарственного сырья Большой интерес представляет изучение средств тибетской медицины, которая имеет огромный опыт по использованию лекарственных растений в лечебной практике К числу лекарственных растений, широко применяемых в тибетской медицине, относятся астрагалы, рекомендуемые для общего укрепления организма, выведения токсинов, заживления поврежденных тканей Астрагал был отнесен к потенциально тонизирующим средствам, условно составляющим «элиту» традиционных медицин Монголии, Китая, Кореи и Японии Широкое применение находит он и в медицине Западной Сибири, Забайкалья, Дальнего Востока как стимулятор иммунной системы.

\

Таким образом, поиск сырьевых источников, создающих реальные предпосылки для получения фитопрепаратов, является актуальной проблемой фармацевтической науки, направленной на реализацию социального заказа здравоохранения

На основании вышеизложенного, наиболее перспективным для дальнейшего изучения оказался астрагал перепончатый - Astragalus membranaceus (Fisch ) Bunge

Цель и задачи исследования. Целью настоящих исследований явилось фармакогностическое изучение и стандартизация надземной части (травы) астрагала перепончатого, произрастающего в Бурятии

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи'

- провести морфолого-анатомическое изучение надземных органов астрагала перепончатого и установить диагностические признаки,

- определить качественный состав и количественное содержание биологически активных веществ (БАВ) в надземной части астрагала перепончатого,

- изучить динамику накопления действующих веществ по органам и фазам развития растения для обоснования выбора рационального сырья и сроков заготовки,

- определить ресурсно-сырьевой потенциал астрагала перепончатого, дать краткую ресурсную характеристику,

- провести стандартизацию сырья и разработать нормативную документацию на лекарственное сырье - «Трава астрагала перепончатого»

Научная новизна. Методами морфолого-анатомического изучения травы астрагала перепончатого установлены диагностические признаки и числовые показатели для определения подлинности лекарственного растительного сырья

Избирательной экстракцией, в сочетании с методами бумажной, тонкослойной хроматографии, ВЭЖХ, методом хроматомасс-спектрометрии определены рутин, гиперозид, кверцетин, кофейная, феруловая, n-оксибензойная, аскорбиновая, яблочная и гексадекановая кислоты, непредельные алканы (1-октадецин, 1-доказен, гептакозан, гексакозанол), фитол, сквален, амирин, идентифицированы 25 свободных и 16 связанных аминокислот, среди которых обнаружено 9 незаменимых аминокислот, качественно и количественно определены 14 макро- и микроэлементов в траве астрагала Определено количественное содержание в траве астрагала дубильных веществ, флавоноидов, полисахаридов, аминокислот, аскорбиновой и органических кислот

С использованием полученных данных химического состава БАВ, динамики их накопления по органам и фазам развития растения, стабильности в процессе хранения, разработана методика стандартизации сырья, которая заключается в количественном определении суммарного содержания флавоноидов в траве астрагала перепончатого в пересчете на рутин-стандарт методом дифференциальной спектрофотометрии

Определены показатели сырьевой продуктивности и запасы сырья астрагала перепончатого

Практическая значимость работы. На основании результатов исследований разработаны показатели подлинности и доброкачественности сырья и составлен проект ФСП на сырье - «Трава астрагала перепончатого», «Инструкция по сбору и сушке травы астрагала перепончатого»

Методика качественных реакций, ТСХ-анализа и методика количественного определения травы астрагала перепончатого апробированы и внедрены в учебный процесс кафедры ботаники ГОУ Бурятский государственный университет (акт внедрения от 17 10 06 г )

Лекарственное сырье «Трава астрагала перепончатого» внедрено в производство ГУЗ «Центр Восточной медицины» (акт внедрения от 10 07 07)

Водные извлечения («отвар») травы астрагала перепончатого обладают иммуномодулирующим действием (заключение лаборатории экспериментальной фармакологии ИОЭБ СО РАН от 20 06 04 г)

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены на 4-й Международной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2003); юбилейной научно-практической конференции «Фармацевтической службе республики Бурятия - 80 лет» (Улан-Удэ, 2004), четвертой региональной межвузовской конференции «Медицина завтрашнего дня» (Чита, 2005), VII Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов, докторантов и молодых ученых «Наука XXI веку» (Майкоп, 2005), научно-практической конференции, посвященной 75-летию со дня рождения доктора медицинских наук Базарона Э Г. (Улан-Удэ, 2006)

По материалам диссертационной работы опубликовано 12 научных работ, 1 статья в периодическом издании, рекомендованном ВАК МО и науки РФ

Связь задач исследования с проблемным планом Научного совета по фармакологии и фармации. Настоящая работа выполнена в соответствии с программой и планом научно-исследовательских работ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН по теме'

№146 «Разработка лекарственных и профилактических препаратов для медицины Фундаментальные основы и реализация» на 2003 - 2006 гг, утвержденной президиумом СО РАН На защиту выносятся:

- результаты фармакогностического изучения астрагала перепончатого, произрастающего в Бурятии,

- результаты исследований по стандартизации сырья - травы астрагала перепончатого,

- обоснование возможности использования надземной части астрагала перепончатого, произрастающего в Бурятии, в качестве лекарственного растительного сырья

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 120 страницах машинописного текста состоит из введения, обзора литературы, 3 глав экспериментальной части, общих выводов, списка литературы и приложения Работа иллюстрирована 31 таблицами, 33 рисунками. Библиографический указатель включает 228 литературных источников, в том числе 51 на иностранных языках

В обзоре литературы (1глава) приведена краткая ботаническая характеристика астрагалов секции Сепапйтгиш, сведения о биологически активных веществах астрагалов и их применении в народной, традиционной и научной медицине

Во второй главе приведены данные по изучению анатомического строения травы астрагала перепончатого и установлению диагностических признаков, результаты фитохимического изучения с использованием методов БХ, ТСХ, ВЭЖХ и хроматомасс-спектрометрии Третья глава посвящена разработке показателей контроля качества, характеристике водного извлечения из лекарственного сырья и разработке методики стандартизации травы астрагала перепончатого,

В четвертой главе представлены результаты по определению динамики содержания флавоноидов по органам и фазам развития растения для обоснования выбора вида сырья и сроков заготовки Отражены результаты ресурсоведческих исследований

Приложение включает материалы нормативной документации, заключение о фармакологической активности травы астрагала перепончатого, акты внедрения

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. В качестве объекта исследования служила надземная часть астрагала перепончатого, образцы которой заготовлены в 2003-2006 гг Сбор сырья и полевые исследования проводились на территории Бурятии в шести районах республики -Прибайкальском, Хоринском, Еравнинском, Селенгинском, Заиграевском

и пригородной зоне г Улан-Удэ («Верхняя Березовка») в разные периоды вегетации

В работе использованы реактивы, растворители, и стандарты, отвечающие требованиям соответствующей нормативной документации

Исследования качественного состава астрагала перепончатого проводили методами одномерной и двумерной хроматографии на бумаге (БХ), марки Filtrak FN-12,16 (ГДР), тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках «Silufol» UV 254 (ЧССР), «Sorbfil» ПТСХ П-А-УФ-254

Спиртовый экстракт, этилацетатную и бутанольную фракции анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на жидкостном хроматографе «Милихром А-02» (ЗАО «ЭкоНова» Новосибирск, Россия) с колонкой (2 х 75 мм), упакованной сорбентом «Silasorb SPH», 5 мкм, с эффективностью 4000 тт по пику хризена (к' = 10) с компьютерной обработкой данных

Анализ гексанового извлечения травы астрагала проводили на хроматомасс-спектрометре «Agilent GC 6890, MSD 5973» (США) Колонка DB 5 ms, 30 м, внутренний диаметр - 0,25 мм, градиент температуры колонки при разделении от 50 до 300 °С при скорости нагрева 10 град/мин, далее 25 мин при 310 °С, температура инжектора 290 °С, квадруполя 150 °С Объем вводимого в колонку образца 1 мкл с разделением потока 1 2 Пики детектировали в режиме полного сканирования масс-спектров, идентификацию пиков проводили по базе данных «NIST/MS», включающей 150000 масс-спектров

Аминокислоты определяли на автоматическом аминокислотном анализаторе марки ААА-339 (Чехия) по общепринятым методикам Обсчет и идентификацию хроматограмм проводили на бортовом компьютере, которым снабжен анализатор Содержание каждой идентифицированной аминокислоты определяли в наномолях в 1 мг навески, а затем проводили перерасчет количественного содержания аминокислот в мг % к абсолютно сухому веществу

Элементный состав сырья определяли на атомно-абсорбционном спектрофотометре «SOLAAR М 6» (США) при спектральном диапазоне 180-900 нм по стандартным аналитическим программам этой фирмы ,

Спектрофотометрическое определение биологически активных веществ проводили на спектрофотометре марки СЕ 1021 (США) в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм

Анатомическое исследование астрагала перепончатого проводили по общепринятым методикам с использованием микроскопа АУ-12, JIomo TT 3525 Микрофотографии делали с помощью цифрового фотоаппарата марки Olympus ц digital-800

Работа по изучению эколого-биологических особенностей и определению запасов сырья проводилась в 6 ценопопуляциях астрагала перепончатого. Оценка ресурсов сырья проводилась согласно общепринятой методике определения запасов лекарственных растений (Методика ..1986). Определение урожайности осуществляли на учётных площадках, Которые закладывали на трансекте через 15 м

Фармакогностическое изучение надземной части астрагала перепончатого При изучении анатомического строения надземных органов растения определены анатомо-диагностические признаки травы астрагала перепончатого- извилистость стенок клеток эпидермиса, наличие друз кристаллов в эпидермисе листа, устьиц аномоцитного типа, расположение под эпидермисом пластинчатой колленхимы в листе (в выступах крупных жилок) и в стебле, дорсовентральное строение мезофилла, симметричное пучковое строение черешка, строение мезофилла, состоящего из однородных паренхимных клеток и воздухоносных полостей, закрытые сосудистые пучки со спиральными трахеидами, пучковое строение стебля, наличие воздушной полости внутри стебля, извилистость стенок клеток эпидермиса лепестка; наличие простых одноклеточных волосков у чашелистика; гладкая почти круглая пыльца (рис 1)

Фитохимическое изучение Химический анализ травы, проведенный с помощью общеизвестных качественных реакций на отдельные группы БАВ, позволил сделать предварительное заключение о наличии основных классов природных соединений флавоноиды, дубильные вещества, кумарины, сапонины, аминокислоты, полисахариды, алкалоиды

Методом ВЭЖХ подтверждено наличие веществ рутина, гиперозида, (рис 2, 3, табл 1,2)

Таблица 1

Время удерживания и спектральные отношения определяемых соединений

Образец Соединение мин ззо/8 з5о

стан дарт образец стан дарт образец

спиртовый экстракт рутин 10,25 10,30±0,10 0,74 0,78±0,04

этилацетатн ая фракция рутин 10,25 10,31±0,10 0,74 0,78±0,04

бутанольна я фракция гиперозид 9,99 9,93±0,10 0,79 0,76±0,04

рутин 10,25 10,24±0,10 0,74 0,78±0,04

Рис. I. Анатомо-днагностические признаки травы астрагала перепончатого

а - эпидермис верхней стороны листа: I - клетки эпидермиса; 2 - устьица; 6- поперечны й срез л иста в районе жилки: 1 - столбчатая колленхима;

2 - флоэма; 3 - эпидермис; 4 - паренхима; 5 - губчатая хлоренхима; 6 -ксилема; 7 — устьице; 8 - пластинчатая хлоренхима; в - продольный срез стебля; г - поперечный срез черешка;) - паренхимная клетка; 2 - ксилема;

3 - колленхима; 4 - склеренхима; 5 - флоэма; 6 - клетки прокамбия; д -поперечный срез стебля.

Время, мин

Рис 2. Хроматограмма спиртового (60%) извлечения травы астрагала 2 - рутин

Время, мин

Рис. 3 Хроматограмма бутанольной фракции 1 - гиперозид, 2 - рутин

Таблица 2

Содержание флавоноидов в траве астрагала перепончатого

Образец Соединение Концентрация

спиртовый экстракт рутин 51±3 мкг/мл 0,1% (в сырье)

этилацетатная фракция рутин 0,7%

бутанольная фракция гиперозид 0,1%

рутин 1,8%

Фенолокислоты представлены четырьмя веществами на двумерной бумажной хроматограмме, три из них идентифицированы методом ВЭЖХ кофейная, п-оксибензойная, феруловая (рис 4, табл 3)

Таблица 3

Идентификация и содержание фенолкарбоновых кислот в этилацетатной фракции экстракта

Кислота мин И Содержание,

стандарт аналит стандарт аналит мг/г

протокатеховая 2,00 2,00±0,02 0,49* 0,24±0,01 <2

п-оксибензойная 3,43 3,40±0,03 1,09* 1,14±0,06 0,57±0,06

кофейная 4,60 4,65±0,05 0,55* 0,58±0,03 0,36±0,04

феруловая 7,44 7,40±0,07 1,55** 1,46±0,09 0,50±0,05

Примечания *к=8254нм/82юнм, **Я=8з]4„м/8210нм

>чроматогр(V»этилацетатной сфр^кции экстракта < р & ГГч-1 © нт)

1 - протокатеховая 2. - п-оксибензойная 3 - хпорогеновая •А - п-кумароеает 5 - ко е> й! н а © - сф еруловая

Рис 4

Анализ гексанового извлечения из травы астрагала был проведен методом хроматомасс-спектрометрии (рис 5)

Были идентифицированы п-алканы - пик 6 (гептакозан), непредельные алканы - пик 2 ()-октадецин), пик 9 (1-доказен), алифиатические спирты - пик 1 (фитол), пик 4 (9, 12, 15-октадекантриен-1-ол), пик 8 (гексакозан-1-ол), органические кислоты пик - 2 ( гексадекановая кислота), метиловый эфир органической кислоты - пик 5

(9, 12, 15-октадекановой кислоты), ациклические изопреноиды - пик 7 (сквален), стерины пики 9-13

П А

Ir.ítnowr Seapl* Инея К.1гс f«ín Vül

j 1S*"«f

I

I

tí»«? »¿«в*

ueíor

гцчгт

«wew

С \SS1K48V\ vc*W*0(J 20 "

ií S«j> 25Ü1 ib i. tf.ítíUSír

Э»5р1ч t 2 *?S4l '

M£l ¿q VcMChOd СБ Ы

XpoMítorpanNU гексаиоюй штяжхй kj деяршпР 'Астрагала» л

I -фитол

2-¿читает) ft»

3 - п-гассадсканооаа кяысгсц

4 9 12,15чжшвИ11»««-1-ол

и„ .,„ , 5-мгаиоаьй->фнр9 ¡2. }$-омехлрвгплоойЕгся(мг( "»«VVÍ» б-Г«ШйММ(

7-сгаыкя,

5 - i-mxsrosBHOfl 9-1 дйокк Ю-ШПоктврсот,

II 12-страды-13 ширин

JU_-jÍA-J.

11» «со KJ» 6ЭД 1^.60 "Да «« »J» а -*" ям Г woi .щюnojgj» з^с

Рис 5 Хроматограмма гексанового извлечения

При анализе аминокислотного состава травы астрагала (табл 4) выявлено наличие большого набора свободных и связанных аминокислот, идентифицировано около 25 аминокислот, в том числе 9 незаменимых аминокислот В траве астрагала преобладают аспараги новая и глутаминовая кислоты, аспаргин и гистидин

Таблица 4

Свободные аминокислоты травы астрагала перепончатого

№ Аминокислота нМ/мг № Аминокислота нМ/мг

1 2 3 1 2 3

1 Треонин * 10,24 12 Метионин * 5,04

2 Серии 13,81 13 Изолейцин * 13,02

3 Аспаргин 442,71 14 Лейцин * 13,08

4 Глютаминовая к-та 65,92 15 Фенилаланин * 19,05

5 Глютамин 57,50 16 у-аминомаслянная 30,57

6 Пролин 31,92 17 ЭтаНоламин 5,55

7 Глицин 14,80 18 Орнитин 9,15

8 Алании 35,70 19 Лизин * 6,66

Продолжение таблицы 4

9 Цитруллин 1,20 20 Гистидин * 1,06

10 а-аминомаслянная 48,08 21 Аргинин * 15,43

11 Валин * 4,34 22 Фосфоэтаноламин 22,38

24 1 -метилгистидин 18,83 23 Аспарагиновая к-та 5,38

25 * 3-метилгистидин 9,99

* - незаменимые аминокислоты

Для более полной характеристики химического состава был изучен минеральный комплекс травы (табл 5)

Таблица 5

Элементный состав травы астрагала перепончатого

Элемент Содержание, % (х10'6) Элемент Содержание, % (х10"6)

№ 45000 Мп 2160

К 2343750 Ре 15873

Са 1744225 Со 104

Си 606 Сг 94

Хп 3018 № 488

Сй 1753 550150

РЬ 89 817

Из данных таблицы можно заключить, что трава астрагала накапливает элементы в разных количествах и соотношениях, отличается содержанием следующих элементов, которые можно разделить на важнейшие- Иа, К, Са, Си, 2п, Мп, Бе, Со, Сг, М§, условно важнейшие N1,

Б1, са

Для некоторых групп БАВ, обнаруженных в траве астрагала, было проведено определение их количественного содержания Результаты анализов представлены в таблице 6

Разработка показателей качества и стандартизация травы астрагала перепончатого Дня стандартизации травы, общей фармакопейной статьей предусмотрен раздел «Числовые показатели» Анализ товароведческих показателей проводили для сырья, собранного в рекомендуемые сроки заготовки Анализ проведен на 3 сериях сырья по методикам ГФ XI Результаты установления норм числовых показателей травы представлены в таблице 7

Таблица 6

Определение содержания БАВ в траве астрагала перепончатого

Показатель качества (X), % f X S Р,% t(P,f) Дх Е,%

Содержание суммы флавоноидов 1,23, 1,23, 1,19;1,25, 1,20 4 1,22 0,0221 95 2,78 0,0614 5,03

Содержание дуби-льых веществ 1,72, 1,8,1,84; 1,76, 1,79, 4 1,78 0,0263 95 2,78 0,0732 4,11

Содержание суммы аминокислот 9,33, 9,30, 9,17,9,26,9,29 4 9,27 0,1054 95 2,78 0,2929 3,16

Содержание аскорбиновой кислоты 1,79, 1,75, 1,76; 1,80,1,83 4 1,78 0,0182 95 2,78 0,0506 2,84

Свободных органических кислот 9,54, 9,86, 10,10,9,70, 9,83 4 9,81 0,0546 95 2,78 0 1519 1,55

Содержание восстанавливающих моносахаров 0,68, 0,79, 0,66,0,75, 0,77 4 0,73 0,0084 95 2,78 0,0234 3,21

Определены числовые показатели экстрактивных веществ, извлекаемых водой, не менее 35 % (36,85±1,66), влажность - не более 10 % (7,47±0,26), золы общей не более 8 % (7,25±0,44), золы нерастворимой в 10 % НС1 - не более 2 % (1,67±0,14), органической примеси-не более 1,5 % (1,40±0,11), минеральной примеси- не более 0,5 % (0,45±0,04), пожелтевших и побуревших примесей не более 2 % (1,74±0,05) Установленные числовые показатели легли в основу проекта Фармакопейной статьи предприятия на траву астрагала перепончатого

Таблица 7

Результаты определения числовых показателей в сырье «Трава астрагала перепончатого» [0 = 3 мм, п = 3, Р = 95 %, КР,1) = 4,30]

Влажность, % X Б Ах Е, %

х = 7,39,7,60, 7,41 7,47 0,0608 0,2614 3,50

Содержание золы общей, % X 8 Ах Е, %

х =7,38,7,12, 7,25 7,25 0,1040 0,4473 6,17

Золы нерастворимой в 10 % р-ре НС1, % X э Ах Е, %

х = 1,74, 1,66; 1,60 1,67 0,0338 0,1455 8,73

Органическая примесь, % X 8 Ах Е,%

х= 1,47,1,32, 1,41 1,40 0,0278 0,1198 8,56

Минеральная примесь, % X 8 Ах Е,%

х= 0,49, 0,44, 0,43 0,45 0,0115 0,0497 11,05

Пожелтевшие и побуревшие части растения, % х- 1,61;1,89, 1,73 X 1,74 в 0,0121 Ах 0,0518 Е, % 2,98

Экстрактивные вещества, извлекаемые водой, % х = 38,94, 35,17,36,45 X 36,85 Б 0,3882 Ах 1,66 Е,% 4,53

Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в траве астрагала перепончатого спектрофотометрическим методом

Один из критериев доброкачественности сырья является стандартизация травы астрагала перепончатого по доминирующим флавоноидам Предварительный хроматографический анализ водно-спиртовых извлечений из надземной части астрагала перепончатого показал, что в них содержатся флавоноиды (рутин, гиперозид, кверцетин). В основу методики положен спектрофотомртрический метод после реакции комплексообразования суммы флавоноидов со спиртовым раствором алюминия хлорида, при этом наблюдается батохромный сдвиг I полосы поглощения флавоноидов до 413 нм Применение

дифференциальной спектрофотометр ни позволяет исключить влияние сопутствующих веществ.

В качестве стандартного образца взят рутин, дифференциальный спектр поглощения которого с алюминия хлоридом находится в одной области с дифференциальным спектром поглощения флавоноидов астрагала (рис. 6).

АЬэргЬалсе

: /

300 400 600 600 700 800 £Й0 Wavelength

Рис. 6. Дифференциальные спектры поглощения спиртового извлечения (60 %) астрагала перепончатого и ГСО рутина

Были подобраны оптимальные условия извлечения суммы флавоноидов из травы астрагала перепончатого: экстрагент-спирт 60 %, гидромодуль 1:50, степень измельчения-1 мм, при нагревании до 60 0 в течение I часа. Для воспроизводимости методики было проведено определение суммы флавоноидов в одной серии сырья в семи независимых повторностях. Метрологические характеристики методики представлены в таблице 8.

Таблица 8

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в траве астрагала перепончатого

f X S2 S | Р t(P,f) Дх Ш %

6 2,57 0,00268 0,05180 95 2,45 0,12690 ■1 4,95

Относительная ошибка единичного определения с 95 % доверительной вероятностью составляет не более ± 5 %. Отсутствие систематической ошибки доказано опытами с добавками ГСО рутина в навеску сырья,

С целью установления нормы содержания суммы флавоноидов в сырье проведен количественный анализ по разработанной методике шести

партий сырья из разных районов республики Установлено, что содержание суммы флавоноидов в сырье должно быть не менее 1 %

Было проведено изучение водных извлечений («настой», «отвар») в зависимости от технологии приготовления, коэффициента водопоглощения (К/в) сырья, степени измельчения и соотношения «сырье-экстрагент» (табл 9, 10, 11, 12)

Таблица 9

Влияние измельченности сырья на выход суммы экстрактивных веществ*

Содержание в сырье Диаметр частиц сырья, мм

Сумма экстрактивных веществ, % * по ГФ X изд 1 2 3

16,76 36,54 26,66 24,40

- среднее значение из трех определений

Таблица 10

Выход суммы экстрактивных веществ в зависимости от соотношения сырье-экстрагент*

Содержание в сырье Соотношение сырье-экстрагент

Сумма экстрактивных веществ, % * 1 10 1 15 1 20 1-25

смачивается 31,54 38,90 28,83

- среднее значение из трех определений

Таблица 11

Влияние режима настаивания водных извлечений

Содержание в сырье Режим настаивания по методике ГФ X1

Сумма экстрактивных веществ, % Настой (1 20) Отвар (1 20)

29,56 34,16

- среднее значение из трех определений

Таблица 12

Определение коэффициента водопоглощения травы А перепончатого [п=3, Р=95 %, t (Р,0=4,30]

К/в S Дх Е,%

6,3 0,0542 0,2331 3,7

Наиболее оптимальными условиями получения извлечения из травы астрагала перепончатого является фармакопейный способ изготовления отвара с учетом коэффициента водопоглощения 1 6, степени измельчения сырья - 1 мм, гидромодуля 1.20

Ресурсная характеристика астрагала перепончатого Динамика содержания флавоноидов в надземной части астрагала перепончатого

Астрагал перепончатый вегетирует на протяжении всего вегетационного периода с мая и до осенних заморозков По нашим наблюдениям начало вегетации у астрагалов наступает в начале третьей декады мая. В конце второй декады июня начинается цветение, которое продолжается до конца июля. Фаза плодоношения начинается со второй декады июля и продолжается до сентября месяца

Таблица 13

Динамика накопления флавоноидов в надземных органах астрагала перепончатого по фазам вегетации (2003-2004 гг )

Фазы Органы Место сбора образца

вегетации растения Содержание флавоноидов

на абсолютно сухое растение, %

Несте- Тальцы Зун- Верхняя

рево Сутой Березовка

Вегетатив Стебли 0,70 0,53 0,69 0,41

ная Листья 1,15 1,07 1,26 1,12

(начало)

Бутониза Стебли 1,15 0,66 0,89 0,73

ция, Листья 3,71 2,87 2,76 3,14

начало Цветки 1,38 1,12 1,04 1,79

цветения

Массовое Стебли 1,02 1,20 0,70 0,91

цветение Листья 3,32 4,83 2,59 3,27

цветки 1,87 1,95 1,53 2,05

Плодоно Стебли 0,48 0,71 0,41 0,56

шение Листья 1,54 2,83 2,10 2,82

цветки 0,23 0,46 0,33 0,73

Из данных, приведенных в таблице следует, что содержание флавоноидов в различных органах колеблется в листьях от 1,07 до 4,83 %, в стеблях и цветках содержится 0,41 - 1,20 % и 1,04 - 2,05 % соответственно, в бобах от 0,23 до 0,73 % Самое высокое содержание флавоноидов обнаружено в листьях и цветках Флавоноиды содержатся во всех органах астрагала перепончатого

В качестве лекарственного сырья рекомендуем всю надземную часть астрагала перепончатого Содержание флавоноидов больше в фазах бутонизации и массового цветения

Оптимальным сроком сбора сырья следует считать срок с середины июня до конца июля, так как в этот период растение содержит максимальное количество действующих веществ

Соотношение массы стеблей, листьев и цветков представлено в таблице 14

Таблица 14

Соотношение разных органов в сырье астрагала перепончатого

Проба фаза вегетации Дата Часть Содержание

сырья, 100 г сбора растения частей

растения в

сырье, %

Проба 1 Бутонизация, Июнь стебли 48,35

начало цветения 2003 г листья 45,31

цветки 5,34

Проба 2 Массовое Июль стебли 38,54

цветение 2003 г листья 35,50

цветки 17,64

бобы 7,46

Проба 3 Плодоношение Август стебли 45,75

2003 г листья 31,16

бобы 22,27

Из данных таблицы видно, что основную массу сырья составляют стебли от 38,54 до - 48,54 % от общей массы сухого сырья, листья от 31,16 до 45,31 %, а цветки - 5,34- 17,64 % и бобы -7,46 - 22,27 %

В рекомендуемые нами сроки заготовки соотношение листьев 45,31 %, стеблей 48,54 %, цветков 17,64 % и бобов 7,46 %

При анализе внешних признаков измельченного сырья в виде смеси кусочков стеблей, листьев, цветков и бобов, проходящих через сито с отверстиями диаметром 3 мм, установлено, что цвет сырья зеленовато-желтый, темно-зеленый с вкраплениям коричневато-фиолетового Запах слабый Вкус горьковатый

Установлено, что в шести районах республики Бурятии биологического запаса сырья для региона достаточно для того, чтобы один раз в три года проводить заготовку сырья астрагала перепончатого (табл 15)

Таблица 15

Запасы травы астрагала перепончатого в районах республики Бурятии

Место нахождения Площа Биологи- Эксплуа- Объем

дь ческий тацион- возможных

заросли запас сырья ный запас ежегодных

га (сухой вес), т сырья, т заготовок т

Зун-Сутой 14,13 0,763 0,692 0,138

Верхняя Березовка 8,69 0,518 0,511 0,102

Тальцы 11,21 0,353 0,151 0,03

Нестерово 5,18 0,513 0,335 0,067

Анинск 15,91 1,313 0,708 0,142

Алтан 35,61 1,843 1,307 0,261

При рассмотрении показателей популяций астрагала перепончатого выявлен оптимум популяций «Зун-Сутой», «Верхняя Березовка», «Анинск» и «Алтан»

Выводы

1 На основании морфолого-анатомического изучения листьев и их черешков, цветков и стеблей выявлены микроскопические признаки (характер клеток эпидермиса, расположение устьиц, наличие простых одноклеточных и двуклеточных волосков)

Определены анатомо-диагностические признаки астрагала перепончатого, извилистостенность клеток эпидермиса листа, наличие многочисленных устьиц аномоцитного типа на верхнем эпидермисе листа и редких-на нижнем, дорсовентральное строение мезофилла листа (2 ряда палисадной паренхимы и 2-3 ряда губчатой), расположение под эпидермисом пластинчатой колленхимы в листе (в выступах крупных жилок) и в стебле, пучковое строение стебля, где сосудьг расположены в виде трехрядных радиальных тяжей, симметричное пучковое строение черешка, извилистость стенок клеток эпидермиса цветка, наличие простых одноклеточных волосков у чашелистика, мезофилл, состоящий из однородных паренхим ных клеток и воздухоносных полостей, закрытые сосудистые пучки со спиральными трахеидами, гладкая овальная, почти круглая, пыльца

2. В надземной частй астрагала перепончатого с использованием химических реакций и методов одномерной и двумерной хроматографии, ТСХ, ВЭЖХ и хроматомасс-спектрометрии установлено наличие флавоноидов, дубильных веществ, фенолкарбоновых кислот, кумаринов,

сапонинов, аминокислот, полисахаридов, алкалоидов, идентифицированы гиперозид, рутин, кверцетин, кофейная, n-оксибензойная, феруловая кислоты

Установлено, что основными биологически активными веществами травы астрагала перепончатого являются флавоноиды (1,22±0,06 %), дубильные вещества (1,78±0,07 %), восстанавливающие моносахара (0,73±0,02 %), водорастворимые полисахариды до (5,10 %), пектиновые вещества до (4,56 %), органические кислоты (9,81±0,15 %), аскорбиновая кислота (1,78±0,05 %) Содержит богатый набор аминокислот, в том числе незаменимых, а также макро- и микроэлементы

3. Изучена динамика накопления флавоноидов по органам растения и фазам вегетации и установлены оптимальные сроки заготовки сырья в фазу бутонизации - массового цветения ( середина июня- конец июля)

Установлено, что в качестве лекарственного растительного сырья целесообразно использовать надземные части растения ввиду стабильности высокого содержания в них суммы флавоноидов и основной массы растения (листьев 45,31 %, стеблей 48,54 %, цветков 17,64 % и бобов 7, 46 %)

4 Определены числовые показатели экстрактивных веществ, извлекаемых водой, не менее 35 % (36,85±1,66), влажность - не более 10 % (7,47±0,26), золы общей не более 8 % (7,25±0,44), золы нерастворимой в 10 % HCI - не более 2 % (1,67±0,14), органической примеси - не более 1,5 % (1,40±0,11), минеральной примеси - не более 0,5 % (0,45±0,04), пожелтевших и побуревших примесей не более 2 % (1,74±0,05) Установленные числовые показатели легли в основу проекта Фармакопейной статьи предприятия на траву астрагала перепончатого

5 Разработана методика стандартизации травы астрагала перепончатого методом дифференциальной спектрофотометрии Относительная ошибка определения количественного содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин не превышает ±5%

6 На основании проведенных исследований по стандартизации разработан проект ФСП на траву астра i ала перепончатого

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Танганова Е А , Асеева Т А Анатомическое строение листа и корня Astragalus membranaceus Bunge //Актуальные проблемы современной науки Фармация - Самара, 2003 - С 34-36

2. Шурыгин А Я, Асеева Т А , Игнатова Е А, Танганова Е А Влияние экстрактов корней астрагала монгольского и перепончатого на перекисное окисление липидов //Биологически активные добавки в профилактической и клинической медицине - Улан-Удэ, 2003- С 115116

3 Танганова Е А , Нагаслаева JIА Забайкальские астрагалы - сырье, перспективное для разработки биологически активной добавки к пище //Вестник Бурятского государственного университета Серия 11 Медицина - Вып. 4.- Улан-Удэ, 2003.- С 3-8.

4 Танганова ЕА, Асеева ТА Перспективы разработки новых лекарственных препаратов на основе забайкальских видов рода Astragalus L //Материалы научно-практической конференции, посвященной 70-летию службы контроля качества лекарственных средств в Бурятии-Улан-Удэ, 2003 - С 81-82

5 Танганова Е А, Нагаслаева Л А Динамика содержания флавоноидов в надземной части астрагала перепончатого //Фармацевтической службе республики Бурятия - 80 лет Материалы юбилейной научно-практической конференции - Улан-Удэ, 2004 - С 102104.

6 Танганова Е А Астрагалы секции Cenantrum флоры Бурятии //Проблемы сохранения разнообразия растительного покрова Внутренней Азии, Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием - Улан-Удэ, 2004 - С 188-189

7 Танганова Е А, Нагаслаева Л А Сравнительная характеристика морфологических признаков астрагала перепончатого, астрагала сходного и астрагала монгольского как источники получения биологически активных веществ //Медицина завтрашнего дня Материалы четвертой региональной межвузовской конференции - Чита, 2005 - С 162

8 Танганова ЕА Перспективы дальнейшего изучения астрагалов флоры Бурятии и Монголии //Monos - 15 Integrated system of traditional and üiodeni medicines - Улан-Батор, 2005 - С 66

9 Танганова E A, Ширеторова В Г. Элементный состав Astragalus membranaceus Bunge, произрастающего в Бурятии //VII Всероссийская научно-практическая конференция студентов, аспирантов, докторантов и молодых ученых Наука XXI веку - Майкоп, 2005 - С 125-126

10 Tanganova Е А, Nagaslaeva О V Phytochemical studying Astragalus membranaceus Bunge - Mongolia, Ulaanbaatar, 2006 - P 120

11 Танганова E A , Нагаслаева Л А Спектрофотометрическое определение содержания флавоноидов астрагала перепончатого //ВСГТУ. Сборник научных трудов Серия Химия и биологически активные природные соединения - Улан-Удэ, 2006 - Вып 10 - С 43-49

12 Танганова Е А Применение астрагалов в тибетской медицине // Научно-практическая конференция, посвященная 75-летию со дня рождения доктора медицинских наук Базарона Э Г - Улан-Удэ, 2006 - С 25-26

Подписано в печать 26 09 07 г Формат 60x84 1/ 16 Бумага офсетная Объем 1 3 печ л Тираж 100 Заказ № 53

Отпечатано в типографии Изд-ва БНЦ СО РАН 670047 г Улан-Удэ, ул Сахьяновои, 6

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. В результате антропо-экологических стрессорных воздействий у современного человека возникают различные психосоматические патологические состояния. Все больше удельный вес приобретают так называемые болезни цивилизации: сердечно-сосудистые, нервно-психические, аллергические, онкологические и другие, которые часто осложняются формированием вторичного иммунодефицита [86]. В связи с этим возникает необходимость поиска средств, способных неспецифически стимулировать иммунную систему с целью повышения резистентности организма к любым патогенным факторам. Этим требованиям в определенной мере соответствуют иммуномодуляторы растительного происхождения [20].

Лекарственные средства растительного происхождения находят широкое применение в медицине. Возрастающая популярность и эффективность во многом объясняется содержанием в них биологически активных веществ, которые воздействуют на организм человека комплексно, легко включаются в обменные процессы и практически не проявляют негативных побочных реакций при длительном применении.

Одним из возможных подходов для решения создавшейся проблемы является поиск и фармакогностическое изучение новых лекарственных растений для расширения ассортимента иммуномодулирующих лекарственных растительных средств.

С потерей традиционных мест заготовки и культивирования лекарственных растений в Европейской части страны возникает необходимость перенесения заготовок в Сибирь и на Дальний Восток, в частности, Бурятия обладает значительными потенциальными запасами дикорастущих лекарственных растений, которые изучены недостаточно [89, 110, 166].

Богатейший опыт использования растений в народной и традиционной медицине является надежным ориентиром для выбора новых перспективных видов^лекарственного сырья. Большой интерес представляет изучение средств тибетской медицины, которая имеет огромный опыт по использованию лекарственных растений в лечебной практике. К числу лекарственных растений, широко применяемых в тибетской медицине, относятся астрагалы, рекомендуемые для общего укрепления организма, выведения токсинов, заживления поврежденных тканей. Астрагал условно составляет «элиту» традиционных медицин Монголии, Китая, Кореи и Японии. Широкое применение находит он и в медицине Западной Сибири, Забайкалья, Дальнего Востока как стимулятор иммунной системы [14, 73, 147].

Таким образом, поиск сырьевых источников, создающих реальные предпосылки для получения фитопрепаратов, является актуальной проблемой, направленной на реализацию социального заказа здравоохранения.

На основании вышеизложенного, большой интерес для изучения представляет астрагал перепончатый - Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge.

ЦЕЛЬЮ НАСТОЯЩИХ ИССЛЕДОВАНИЙ явилось обоснование возможности использования надземной части астрагала перепончатого, произрастающего в Бурятии, в качестве лекарственного растительного сырья.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести морфолого-анатомическое изучение надземных органов астрагала перепончатого и установить диагностические признаки;

- определить качественный состав и количественное содержание биологически активных веществ (БАВ) в надземной части астрагала перепончатого;

- изучить динамику накопления действующих веществ по органам и фазам развития растения для обоснования выбора вида сырья и сроков заготовки сырья;

- определить"^ес5фсно-сырьевой потенциал астрагала перепончатого, дать краткую ресурсную характеристику;

- провести стандартизацию сырья и разработать нормативную документацию на лекарственное сырье - «Трава астрагала перепончатого».

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Методами морфолого-анатомического изучения травы астрагала перепончатого установлены диагностические признаки числовые показатели для определения подлинности лекарственного растительного сырья.

Избирательной экстракцией, в сочетании с методами бумажной, тонкослойной хроматографии, ВЭЖХ, методом хроматомасс-спектрометрии определены: рутин, гиперозид, кверцетин, кофейная, феруловая, п-оксибензойная, аскорбиновая, яблочная и гексадекановая кислоты, непредельные алканы (1-октадецин, 1-доказен, гептакозан, гексакозанол), фитол, сквален, амирин; идентифицированы 25 свободных и 16 связанных аминокислот, среди которых обнаружено 9 незаменимых аминокислот; качественно и количественно определены 14 макро- и микроэлементов в траве астрагала. Определено количественное содержание в траве астрагала дубильных веществ, флавоноидов, полисахаридов, аминокислот, аскорбиновой и органических кислот.

С использованием полученных данных химического состава БАВ, динамики их накопления по органам и фазам развития растения, стабильности в процессе хранения, разработана методика стандартизации сырья, которая заключается в количественном определении суммарного содержания флавоноидов в траве астрагала перепончатого в пересчете на рутин-стандарт методом дифференциальной спектрофотометрии.

Определены показатели сырьевой продуктивности и запасы сырья астрагала перепончатого.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. На основании результатов исследований разработаны показатели подлинности и доброкачественности сырья и составлен проект ФСП на сырье — «Трава астрагалаГперепончатого», разработана «Инструкция по сбору и сушке травы астрагала перепончатого».

Методика качественных реакций, ТСХ-анализа и методика количественного определения травы астрагала перепончатого апробированы и внедрены в учебный процесс кафедры ботаники ГОУ ВПО Бурятский государственный университет (акт внедрения от 17.10.06 г.).

Нормативная документация «Трава астрагала перепончатого» внедрена в производство ГУЗ «Центр Восточной медицины» (акт внедрения от 10.07.07 г.).

Водные извлечения («отвар») травы астрагала перепончатого обладают иммуномодулирующим действием (Заключение лаборатории экспериментальной фармакологии ИОЭБ СО РАН от 20.06.04 г.).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ и ПУБЛИКАЦИИ. Основные положения диссертационной работы доложены на: 4-й Международной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2003); юбилейной научно-практической конференции «Фармацевтической службе республики Бурятия - 80 лет» (Улан-Удэ, 2004); четвертой региональной межвузовской конференции «Медицина завтрашнего дня» (Чита, 2005); VII Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов, докторантов и молодых ученых «Наука XXI веку» (Майкоп, 2005); научно-практической конференции, посвященной 75-летию со дня рождения доктора медицинских наук Базарона Э.Г. (Улан-Удэ, 2006).

По материалам диссертационной работы опубликовано 12 научных работ, 1 статья в периодическом издании, рекомендованная ВАК МО и науки РФ.

СВЯЗЬ ЗАДАЧ ИССЛЕДОВАНИЯ С ПРОБЛЕМНЫМ ПЛАНОМ НАУЧНОГО СОВЕТА ПО ФАРМАКОЛОГИИ И ФАРМАЦИИ. Настоящая работа выполнена в соответствии с программой и планом научноисследовательских работ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН по теме № 146 «Разработка лекарственных и профилактических препаратов для медицины. Фундаментальные основы и реализация» на 20032006 гг, утвержденной президиумом СО РАН.

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ:

- результаты фармакогностического изучения астрагала перепончатого, произрастающего в Бурятии;

- результаты исследований по стандартизации сырья - травы астрагала перепончатого;

- обоснование возможности использования травы астрагала перепончатого, произрастающего в Бурятии, в качестве лекарственного растительного сырья.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. На основании морфолого-анатомического изучения астрагала перепончатого выявлены диагностические признаки его сырья (травы). Основными анатомо-диагоностическими признаками астрагала перепончатого являются: извилистостенность клеток эпидермиса листа, наличие многочисленных устьиц анамоцитного типа на верхнем эпидермисе листа и редких - на нижнем, дорсовентральное строение мезофилла листа; пучковое строение стебля, где сосуды расположены в виде трехрядных радиальных тяжей; симметричное пучковое строение черешка; извилистость стенок клеток эпидермиса цветка; наличие простых одноклеточных волосков у чашелистика; мезофилл, состоящий их однородных паренхимных клеток и воздухоносных полостей; закрытые сосудистые пучки со спиральными трахеидами.

2. В надземной части астрагала перепончатого с использованием химических реакций и методов одномерной и двумерной хроматографии, ТСХ, ВЖХ и хроматомасс-спектрометрии установлено наличие флавоноидов, дубильных веществ, фенолкарбоновых кислот, кумаринов, сапонинов, аминокислот, полисахаридов, алкалоидов; идентифицированы: гиперозид, рутин, кверцетин, кофейная, п-оксибензойная, феруловая кислоты.

Определено, что основными биологически активными веществами травы астрагала перепончатого являются флавоноиды, дубильные вещества, органические кислоты (9,81±0,15%); аскорбиновая кислота (1,78±0,05%). Астрагал перепончатый содержит богатый набор аминокислот, в том числе незаменимых, а также макро- и микроэлементы.

3. Изучена динамика накопления флавоноидов по органам и фазам развития растения и установлены оптимальные сроки заготовки сырья — фаза бутанизации — массового цветения. Установлено, что в качестве лекарственного растительного сырья целесообразно использовать облиственные верхушки растения.

4. Определены показатели сырьевой продуктивности и запасы сырья астрагала перепончатого, произрастающего в Бурятии.

5. С использованием полученных данных морфологического, физико-химического, фитохимического, ресурсоведческого исследований проведена стандартизация сырья астрагала перепончатого.

6. Определены числовые показатели доброкачественности сырья, которые легли в основу проекта Фармакопейной статьи предприятия (ФСП) на траву астрагала перепончатого.

Заключение.

Из обзора древних медицинских трактатов следует, что А. перепончатый является одним из источников тибетского растительного сырья «срад ма».

Учитывая факты применения астрагала перепончатого во многовековой народной медицине, а также использования в научной медицине, целесообразно изучение состава биологически активных веществ и ресурсной базы астрагала перепончатого, произрастающего в Бурятии.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. В качестве объекта для исследования использовались образцы надземной части астрагала перепончатого: листья, стебли, цветки, заготовленные в 2003-2006 гг. в Селенгинском, Заиграевском, Хоринском, Еравнинском, Прибайкальском районах Республики Бурятия и пригородной зоне г. Улан-Удэ («Верхняя Березовка») по фазам развития растения: начало вегетации; бутонизация и начало цветения; массовое цветение; плодоношение.

В работе использованы реактивы, растворители, стандарты, отвечающие требованиям соответствующей нормативной документации.

Исследования качественного состава А. перепончатого проводили методами одномерной и двумерной хроматографии на бумаге (БХ), марки Filtrak FN-12,16 (ГДР), тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках «Silufol» UV 254 (ЧССР), «Sorbfil» ПТСХ П-А-УФ-254.

Системы растворителей: 1. 15 % раствор кислоты уксусной; 2. н-бутанол-уксусная кислота-вода (БУВ) (4:1:2); 3. хлороформ-этилацетат-муравьиная кислота (5:4:1); 4. спирт этиловый- раствор аммиака (4:1); этилацетат- уксусная кислота (8:2); 5. н-бутанол- муравьиная кислота-вода (18:2:9); 6. этилацетат-муравьиная кислота-вода (10:2:3); 7. гексан-ацетон (7:3); 8. гексан-этилацетат (8:2); 9. хлороформ-спирт этиловый (19:1).

Хроматографирование выполняли в определенной системе растворителей при комнатной температуре в герметически закрытых стеклянных камерах. Соотношение растворителей брали в объемных частях. Все величины Rf обнаруженных соединений являются средними из 5 измерений.

Элементный состав травы определяли на атомно-абсорбционном спектрофотометре «SOLAAR М 6» (США) при спектральном диапазоне 180-900 нм по стандартным аналитическим программам этой фирмы.

Спиртовый экстракт, этилацетатную и бутанольную фракции анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на жидкостном хроматографе «Милихром А-02» (ЗАО «ЭкоНова» Новосибирск, Россия) с колонкой (2 х 75 мм), упакованной сорбентом «Silasorb SPH», 5 мкм, с эффективностью 4000 т.т. по пику хризена (к1 = 10) с компьютерной обработкой данных.

Анализ гексанового извлечения травы астрагала проводили на хроматомасс-спектрометре «Agilent GC 6890, MSD 5973» (США). Колонка DB 5 ms, 30 м; внутренний диаметр - 0,25 мм; градиент температуры колонки при разделении от 50 до 300 °С при скорости нагрева 10 град/мин, далее 25 мин при 310 °С, температура инжектора 290°С, квадруполя 150 °С. Объем вводимого в колонку образца 1 мкл с разделением потока 1:2. Пики детектировали в режиме полного сканирования масс-спектров, идентификацию пиков проводили по базе данных «NIST/MS», включающей 150000 масс-спектров.

Аминокислоты определяли на автоматическом аминокислотном анализаторе марки ААА-339 (Чехия) по общепринятым методикам. Обсчет и идентификацию хроматограмм проводили на бортовом компьютере, которым снабжен анализатор. Содержание каждой идентифицированной аминокислоты определяли в наномолях в 1 мг навески, а затем проводили перерасчет количественного содержания аминокислот в мг % к абсолютно сухому веществу.

Электронные спектры исследуемых соединений и стандартов-веществ в УФ- и видимой областях записывали на спектрофотометре УФ-видимого диапозона (UVmini-1240, Kyoto Japan), используя следующие растворители: спирт 96 %, 60 %. Спектрофотометрическое определение биологически активных веществ проводили на спектрофотометре марки СЕ 1021 (США) в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм.

Анатомическое исследование астрагала перепончатого проводили по общепринятым методикам с использованием микроскопа «Биолам Р». Выявленные особенности анатомического строения органов растений зарисовывали на рисовальном аппарате РА-4 с обозначением результатов измерений деталей по окулярному микрометру АМ-9-2. Микрофотографии делали с помощью цифрового фотоаппарата OLYMPUS \л digital 800.

Ресурсоведческие исследования по определению запасов сырья проводили в 6 ценопопуляциях А. перепончатого в разных точках ареала, различающихся по эколого-фитоценотическим условиям. Оценка ресурсов сырья проводилась согласно общепринятой методике определения запасов лекарственных растений [114]. Определение урожайности (плотности запаса сырья) осуществляли на учётных площадках, которые закладывали на трансекте через 15 м. Сырьевая фитомасса собиралась в виде верхушечных побегов А. перепончатого на уровне 10 - 15 см над поверхностью земли. Ювенильные и повреждённые растения сбору не подлежали.

Статистическая обработка результатов анализа

Точность метода устанавливается из п повторных анализов одного и того же однородного материала, где: п - число измерений;

X;- данные отдельных определений; Xj

X; =------среднее значение из п определений; п f = п - 1 - число степеней свободы; х;-х)2

S2 - дисперсия, S2 =---------; f

Xi - X)2 s = V s = V------- .средняя квадратичная ошибка отдельного f определения (выборочное стандартное отклонение); S

Sx =----- - средняя квадратичная ошибка среднего арифметического

V п или стандартное отклонение среднего результата;

Р, % - коэффициент надежности (доверительная вероятность); t (P,f) - критерий Стьюдента, зависящий от надежности и числа определений;

Дх = ± t(P,f) • S - абсолютная ошибка результата отдельного определения;

Дх = ± t(P,f) • Sx - абсолютная ошибка среднего арифметического; Дх

Е = ±-------■ 100 % - относительная ошибка результата отдельного х определения

Фармакологический скрининг, специфическая активность лекарственного средства определялась на соответствующих моделях патологических состояний в лаборатории экспериментальной фармакологии ИОЭБ СО РАН.

ГЛАВА 2. ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ АСТРАГАЛА ПЕРЕПОНЧАТОГО 2.1. Морфологические признаки растения

Для морфолого-анатомических исследований были заготовлены облиственные верхушечные побеги А. перепончатого длиной 15-25 см. При этом способе заготовки остается неповрежденным основание главных плагиотропных скелетных осей, а заготавливаются в основном более поздние побеги формирования, что способствует восстановлению естественных зарослей [11].

По жизненной форме, А. перепончатый относится к длинностержневым многоглавым травянистым поликарпикам, с монокарпическими побегами удлиненного типа; гемикриптофит. Относится к типу безрозеточных астрагалов (Рис. 1, А).

Для описания морфологического строения с целью выявления основных диагностических признаков сырья за образец взята особь А. перепончатого среднего генеративного возрастного состояния - (g2) (Рис. 1, Б).

Стебель 59-60 см длиной, слабо ветвящийся, в средней и нижней части покрыт редкими светлыми, почти прямо отстоящими волосками, ребристый, полый, толщиной около 4 мм, у основания лиловый. Листья непарноперистые, листочки в числе 9-12 пар, 10-17 мм длиной, 3-7 мм шириной, эллиптические или продолговато-яйцевидные, тупые, снизу с одиночными волосками по краям и вдоль средней жилки. Цветоносы немного длиннее листьев, белоприжатоволосистые, с примесью темных волосков. Цветки желтые, поникающие, по 5-7 собраны в рыхлые соцветия.

Цветок - полный, обоеполый, зигоморфный, циклический, пентамерный, 15-18 мм длиной. Цветоножки тонкие, длиной до 5 мм, изогнутые, отклоненные, в период плодоношения достигают 20-25 мм. Прицветники линейные, равны или короче цветоножек. Чашечка 5-7 мм

Рис. I.

А - Астрагал перепончатый в естественных условиях {внешний вид) Б - Астрагал перепончатый среднего генеративного возрастного состояния длиной, около 4 мм шириной, пятичленная, лопастная, сильно скошенная, по всей поверхности, особенно на зубцах (зубцы примерно 1/10 дл. трубки), покрыта беловатыми короткими, 0,08±0,02 мм, волосками, с одной стороны мешковидно расширенная, нижний зубец чашечки несколько ассиметричен; чашелистики до 2-3 мм дл., зубчатые. Гипантий чашевидный, венчик мотыльковый, раздельнолепестной, до 1,5 см длиной, желтый; внутренние лепестки хорошо дифферренцированы на пластинку и ноготок. Флаг обратнояйцевидный, немного длиннее крыльев, слегка выемчатый, 14-15 мм длиной. Крылья поперечно-морщинистые, почти равны лодочке. Лодочка со сливающимися лепестками. Андроцей состоит из 14 тычинок: 13 сросшихся и одной свободной. Пестик с одним плодолистиком.

Бобы на длинной ножке, 23 - 24 мм длиной, полуовальные, поникающие, с боков почти плоскосжатые, тонкоперепончатые, неравнобокие, одногнездные, встречаются редкие одиночные волоски.

Корневая система представлена главным и придаточными корнями.

К качественным критериям А. перепончатого можно отнести строение цветков и листьев, к количественным - число листьев и число цветков.

На территории Бурятии встречается, близкий А. перепончатому, вид -А. сходный. Для внешнего описания сырья с целью установления диагностических морфологических признаков мы приводим сравнительную морфологическую характеристику А. сходного и А. перепончатого (табл. 4).

По внешним признакам А. сходный и А. перепончатый мало отличаются друг от друга. Изучение морфологии растений всех популяций дало возможность выявить незначительные отличия этих видов во внешнем строении. В основном они отличаются по форме чашечки и типу её опушения. У А. сходного чашечка почти трубчато-колокольчатая, а у А. перепончатого — широко-колокольчатая. Зубцы чашечки А. перепончатого у основания шире, чем у А. сходного.