Автореферат и диссертация по медицине (14.01.11) на тему:Эндогенная нейропротекция при ишемических нарушениях мозгового кровообращения

На правах рукописи

ШМОНИН

Алексей Андреевич

ЭНДОГЕННАЯ НЕЙРОПРОТЕКЦИЯ ПРИ ИШЕМИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЯХ МОЗГОВОГО КРОВООБРАЩЕНИЯ (КЛННИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.01.11 Нервные болезни 14.03.03 Патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

15 шр тг

Санкт-Петербург - 2012

005014023

Работа выполнена на кафедре неврологии и нейрохирургии с клиникой и кафедре патофизиологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова» Минздравсоцразвития России.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Мельникова Елена Валентиновна доктор медицинских наук, профессор Власов Тимур Дмитриевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры нервных болезней ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургской государственной педиатрической медицинской академии» Минздравсоцразвития России

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой физиологии и патологии ГБОУ ВПО «Санкт-петербургской химико-фармацевтической академии» Минздравсоцразвития России

Чухловина Мария Лазаревна

Тюкавин Александр Иванович

Ведущая организация: Федеральное государственное военное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации.

Защита состоится 2012 года в_часов на заседании диссертационного

совета Д 208.090.06 при ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский медицинский университет им. акад. И. П. Павлова» Минздравсоцразвития России (197022, г. Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6/8).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский медицинский университет имени академика И. П. Павлова» Минздравсоцразвития России (197022, г. Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6/8).

Автореферат разослан «2.^ » февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, доцент

Юрков Игорь Викторович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Острые нарушения мозгового кровообращения являются одной из ведущих причин смерти и инвалидизации в Российской Федерации и в мире. Статистические данные позволили Всемирной Организации Здравоохранения в 2004 году объявить инсульт заболеванием, угрожающим жизни и здоровью каждого жители Земли. В России ежегодно регистрируется 450 ООО инсультов (или 2,5-3 случая на 1000 населения в год), инсульты (3,2 на 10.000 населения в год) занимают первое место (40-50%) среди всех причин инвалидности [Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2006].

Одним из направлений лечения, применяемых для уменьшения повреждения при ишемическом инсульте, и других вариантах ишемии мозга продолжает оставаться фармакологическая нейропротекция. Поэтому разработка и внедрение препаратов, способных ослаблять выраженность ишемического и реперфузионного повреждения головного мозга, остается одной из важнейших задач современной неврологии.

В то же время, в патогенезе развития ишемического повреждения мозга в последнее время выделяют механизмы активной защиты тканей от повреждения, т.е. механизмы эндогенной нейропротекции. Эндогенная нейропротекция - система кратковременных и долговременных реакций организма на внешние и внутренние стимулы, приводящих к повышению устойчивости нервной ткани к повреждению различной природы. Система направлена в первую очередь на сохранение функционирующей массы нервных и глиальных клеток, а также их пространственного расположения при повреждении мозга. Наиболее известными феноменами эндогенной нейропротекции является ишемическое пре- и посткондиционирование. Ишемическое прекондиционирование - это повышение устойчивости ткани к ишемическому и реперфузионному повреждению, возникающее после умеренных повреждающих воздействий (например, коротких эпизодов ишемии и реперфузии) [Власов Т.Д. и соавт., 2004, 2008; Цейтлин A.M. и соавт, 2010; Dirnagl U. et al., 2008]. При ишемическом посткондиционировании повышение устойчивости к реперфузионному повреждению вызывается несколькими короткими эпизодами ишемии и реперфузии в реперфузионном периоде [Zhao H. et al., 2006; Dirnagl U. et al., 2008; Wang J.Y et al., 2008]. Пре- и посткондиционирование можно рассматривать как единый защитный феномен, приложенный на различных этапах повреждения [Dirnagl U. et al., 2008; Pignataro G. et al., 2009]. Согласно некоторым данным, транзиторная ишемическая атака (ТИА) может выступать в качестве прекондиционирующего стимула перед ишемическим инсультом [Мопсауо J. et al, 2000; Sitzer M. et al. 2004; Wegener S. et al., 2004]. Однако эти сведения противоречивы, и ряд исследователей не подтверждает защитный эффект ТИА [Johnston, S.C. et al. 2004; Morte D.D. et al., 2008]. Также остается неизученным влияние ишемического прекондиционирования на коллатеральное кровообращение.

Имеются данные о том, что гипоксия и различные патологические состояния (например, сахарный диабет) могут приводить к развитию гипоксического и метаболического прекондиционирования, соответственно [Galagudza М.М. et al., 2008]. Не исключено, что клинические состояния и заболевания, сопровождающиеся гипоксией тканей (сердечная недостаточность, стенозы брахиоцефальных артерий, сахарный диабет, хроническая обструктивная болезнь легких), также могут быть одним из клинических эквивалентов прекондиционирования. А у больных, прекондиционированных в результате сопутствующих клинических состояний, снижается риск повторного инсульта, и улучшается восстановление после инсульта.

Еще одним из механизмов нейропротекции является действие эритропоэтина и других ростовых факторов. На моделях острой фокальной ишемии мозга у животных продемонстрированы нейропротекгивные свойства эритропоэтина [Захаров Ю.М., 2007; Мтпегир I. е1 а1., 2009; 1егпёа1 М. й а1 2010]. Большинство исследователей использовали раннее профилактическое введение эритропоэтина за 24 часа и более. Данных о наличии защитного эффекта эритропоэтина при введении непосредственно перед ишемией нет.

Несмотря на наметившиеся перспективы, в настоящий момент проведено недостаточно систематических исследований, которые позволили бы разработать подходы к использованию механизмов эндогенной нейропротекции в лечебной практике, дали бы возможность оценить защитный потенциал пациента для индивидуализации вторичной профилактики острых нарушений мозгового кровообращения.

Цель исследования:

изучение отдельных механизмов эндогенной нейропротекции для улучшения качества лечения ишемических нарушений мозгового кровообращения

Задачи исследования:

1. Оценить эффективность ишемического пре- и посткондиционирования на разных моделях и сроках экспериментального ишемического инсульта

2. Изучить значение коллатерального кровообращения в формировании защитного эффекта раннего ишемического прекондиционирования головного мозга

3. Исследовать влияние эритропоэтина на выраженность ишемического повреждения головного мозга у крыс

4. Выявить у пациентов с ишемией головного мозга клинические состояния и факторы, потенциально способствующие активации эндогенной нейропротекции

5. Определить роль транзиторной ишемической атаки, как возможного аналога ишемического прекондиционирования, при ее возникновении перед ишемическим инсультом

Научная новизна:

Впервые предпринята попытка оценить значение различных эндогенных механизмов защиты при ишемическом повреждении головного мозга, как частей эндогенной системы нейропротекции.

Впервые в эксперименте выявлен эффект «краевой реперфузии» при длительной окклюзии средней мозговой артерии у крысы.

Впервые на модели фокальной ишемии головного мозга показано, что раннее ишемическое прекондиционирование обладает способностью уменьшать размер зоны нарушения перфузии.

Впервые проведен комплексный сравнительный анализ эффективности трех видов эндогенной нейропротекции: эритропоэтина, ишемического пре- и посткондиционирования в эксперименте.

Впервые установлено, что эритропоэтин способен вызывать защиту мозга при введении за 30 минут до ишемии, то есть эритропоэтин активирует раннее фармакологическое прекондиционирование.

Впервые на основании метанализа был продемонстрирован защитный эффект транзиторной ишемической атаки перед инсультом как клинического эквивалента ишемического прекондиционирования мозга.

Впервые показано, что наличие в анамнезе сосудистого события (транзиторной ишемической атаки или инсульт) ассоциировано с развитием менее тяжелых форм цереброваскулярной патологии (транзиторных ишемических атак) впоследствии.

Теоретическая и практическая значимость результатов:

Проведенные исследования позволяют расширить представление о механизмах формирования ишемического повреждения, поставив в зависимость размеры очагов ишемии и степень выраженности ишемических изменений от факторов эндогенной защиты.

Теоретическое значение имеют выявленный феномен сокращения зоны ишемии или «краевой реперфузии», развивающийся при длительной окклюзии средней мозговой артерии у крыс и способность раннего ишемического прекондиционирования влиять на размер зоны нарушения перфузии.

В работе даны предпосылки для возможного практического применения таких механизмов эндогенной нейропротекции, как феномены ишемического пре- и посткондиционирования.

Полученные результаты дают теоретическое обоснование применению эритропоэтина для повышения порога ишемической толерантности в клинической практике.

Выявленная роль транзиторных ишемических атак как прекондиционирующего фактора дает основание для последующего изучения этой формы нарушений мозгового кровообращения с возможностью определения активности эндогенных защитных систем, и, в перспективе, оптимизации прогноза при ишемическом инсульте.

Основные положения, выносимые на защиту

При остром ишемическом и реперфузионном повреждении головного мозга размеры очага повреждения и способность тканей к восстановлению определяется, в том числе, активностью отдельных эндогенных факторов противоишемической защиты, проявляющихся при прекондиционировании, посткондиционировании или введении эритропоэтина до и после ишемии.

Одним из механизмов защитного эффекта раннего ишемического прекондиционирования головного мозга является улучшение коллатерального кровообращения, что проявляется более быстрым уменьшением зоны перфузионных нарушений в очаге ишемии после прекондиционирования.

Транзиторная ишемическая атака способствует активации механизмов эндогенной нейропротекции, что проявляется развитием менее тяжелых форм цереброваскулярных событий и лучшим восстановлением пациентов после инсульта, и, таким образом, транзиторная ишемическая атака может рассматриваться как клинический эквивалент ишемического прекондиционирования.

Личный вклад автора в проведенное исследование

Все разделы работы выполнены лично автором. Автор лично выполнил экспериментальную часть исследования, провёл анализ литературных данных, а также осуществил статистическую обработку результатов экспериментов. Автором самостоятельно разработаны модели экспериментального ишемического инсульта, методы оценки повреждения мозга и церебрального кровотока. Клиническая часть работы выполнена также автором. Автором самостоятельно осуществлена оценка полученных результатов, подготовлены публикации по результатам проведенных исследований.

Апробация работы

Основные положения работы доложены на LXVIII ежегодной итоговой научно-практической конференции на кафедре неврологии, посвященной 110-летию СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины - 2007»; II Российском Международном конгрессе «Цереброваскулярная патология и инсульт», Санкт-Петербург, 17-20 сентября 2007 г.; II международном молодёжном медицинском конгрессе - 2007, Санкт-Петербург; Ежегодной Санкт-Петербургской студенческой конференции «Актуальные вопросы неврологии», 8 апреля 2008 г., Санкт-Петербург; XIV Международной конференции «Актуальные проблемы патофизиологии», 15-16 апреля 2008 г., Санкт-Петербург; 11-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», 19 апреля 2008 г., Санкт-Петербург; Всероссийской научно-практической конференции «Поленовские чтения», 22-24 апреля 2009 г., Санкт-Петербург, Конференции «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов - 2009», Санкт-Петербург; I ежегодной научно-практической конференции Совета молодых ученых и специалистов Федерального центра сердца, крови и эндокринологии имени В.А. Алмазова, 19-20 ноября 2009 г., Санкт-Петербург; Всероссийской научно-практической конференции «Поленовские чтения», 6-10 апреля 2010 г., Санкт-Петербург; 19th European Stroke Conference Barcelona, Spain, 25 - 28 May 2010; Юбилейной научно-практической научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», 24 мая 2011 г., Санкт-Петербург.

Материалы диссертации были доложены на заседаниях проблемной комиссии Института экспериментальной медицины ФГУ «Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова», проблемной комиссии «Неврология, восстановительная, спортивная медицина и физиотерапия» СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.

Внедрение результатов работы

Результаты и выводы диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре неврологии и нейрохирургии с клиникой, кафедре патофизиологии с курсом клинической патофизиологии, в учебный процесс и лечебную работу клиники неврологии ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова» Минздравсоцразвития России. Также

результаты внедрены в учебный процесс и лечебную работу ФГБУ «Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова» Минздравсоцразвития.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ (7 статей, из них 4 статьи в журналах из списка ВАК).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц и 29 рисунков.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 68 отечественных и 133 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы м методы исследования

Исследование состоит из клинической и экспериментальной частей. Дизайн исследования представлен в табл. №1. Все эксперименты были одобрены этическим комитетом ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова» Минздравсоцразвития России.

В экспериментальной части исследования применяли три модели фокальной ишемии головного мозга крысы in vivo:

- перевязка левой средней мозговой артерии (СМА) и левой общей сонной артерии (ОСА) (перманентная ишемия);

- перевязка левой СМА и окклюзия обеих ОСА на 40 минут по методу Zhao Н. [Zhao Н. et al, 2006] (транзиторная ишемия);

- филаментная окклюзия левой СМА по методу Koizumi J. [Koizumi J. et al, 1986] (транзиторная ишемия).

Все операции выполняли под хлоралгидратным наркозом.

Перманентная фокальная ишемия

Перманентную фокальную ишемию головного мозга (ишемию без реперфузии) моделировали по стандартной методике, заключающейся в одномоментной перевязке левой внутренней сонной артерии (ВСА) и левой СМА [Sundt Т.М. et al, 1966, Durukan A. et al, 2007]. Кровоток не восстанавливается. Доступ к СМА осуществляли через трепанационное окно в проекции корковой ветви левой СМА.

Моделирование ишемии головного мозга по методике Zhao Н.

Для моделирования ишемии производили перевязку левой СМА и окклюзию обеих ВСА на 40 минут путем наложения клипс. Для реперфузии клипсы с обеих ВСА снимали, и кровоток восстанавливался.

Филаментная транзиторная фокальная ишемия мозга по методике Koizumi J.

Транзиторную фокальную ишемию головного мозга производили с помощью эндоваскулярной окклюзии левой СМА, которую выполняли по методике Koizumi J. в модификации Longa E.Z. и Belayev L., введением филамента (полипропиленовой нити 4-00 с окончанием, обработанным силиконом и поли-Ь-лизином), в левую наружную сонную артерию, с последующим ее проведением к устью левой СМА через ВСА. Для реперфузии нить извлекали.

Через 48 часов после моделирования ишемии изучали повреждение мозга, использовали оценку размера инфаркта мозга, неврологического дефицита по шкале Гарсия [Garcia J.H. et al, 1995] и выраженность отёка мозга.

Дизайн исследования.

Таблица 1.

Название Модель или метод исследования Объем исследования Методы оценки

Экспериментальное исследование

Защитный эффект раннего ишемического прекондиционирования при фокальной ишемии мозга различной длительности у крыс Модель фокальной транзиторной и перманентной ишемии мозга у крыс 41 крыса Размер инфаркта мозга, ультразвуковая допплерография, выраженность отека головного мозга

Роль коллатерального кровообращения в формировании защитного эффекта раннего ишемического прекондиционирования при фокальной ишемии мозга у крыс Модель фокальной транзиторной и перманентной ишемии мозга у крыс 56 крыс Ультразвуковая допплерография, зона нарушения перфузии (зона ишемического риска)

Сравнительное исследование нейропротективных эффектов эритропоэтина, пре- и посткондиционирования при фокальной ишемии мозга в эксперименте Модель фокальной транзиторной ишемии мозга у крыс 40 крыс Размер инфаркта мозга, ультразвуковая допплерография, выраженность отека головного мозга, неврологический дефицит

Оценка нейропротективного эффекта эритропоэтина при введении через 3 и 12 часов после реперфузии Модель фокальной транзиторной ишемии мозга у крыс 18 крыс Размер инфаркта мозга, ультразвуковая допплерография, выраженность отека головного мозга, неврологический дефицит

Клиническая часть исследования

Исследование клинических факторов, определяющих вариант развивающегося ишемического события - ТИА или инсульт Исследование пациентов с ТИА и ишемическим инсультом 73 человека Частота сосудистых событий, неврологический дефицит, оцененный по шкале инсульта национального института здоровья

ТИА перед инсультом - клинический эквивалент прекондиционирования? Метанализ литературы 8 615 человек Количество положительных исходов, летальность

Оценка размера инфаркта.

Оценку величины зоны инфаркта производили с помощью количественного анализа срезов мозга, гистохимически окрашенных хлоридом трифенилтетразолия. Для этого срезы головного мозга толщиной 2 мм инкубировали в 0,1% растворе трифенилтетразолия хлорида (MP Biomed., США) при t=37,0° С в течение 15 минут. Затем получали цифровые фотографии поверхности срезов. Вычисляли средний относительный показатель объема инфаркта и коэффициент асимметрии полушарий головного мозга.

Оценка магистрального кровотока.

Магистральный кровоток оценивали в левой СМА, для чего использовали метод высокочастотной ультразвуковой допплерографии при помощи прибора Минимакс-Допплер-К (Минимакс, Санкт-Петербург). В бассейне левой СМА регистрировали систолическую и диастолическую линейные скорости.

Оценка зоны нарушения перфузии.

Для оценки степени тканевой перфузии в ишемизированной области исследовали так называемую «зону ишемии». Зона ишемии (зона ишемического риска) включает в себя зоны ядра ишемии и «ишемической пенумбры». Для определения зоны нарушения перфузии использовали введение синего Эванса (Вектон, Россия) в левый желудочек сердца. Через 5 секунд животное выводили из эксперимента, и мозг извлекали для дальнейшего исследования. Синий Эванса попадает в хорошо перфузируемые участки мозга, окрашивая ткани в синий свет. Оставшиеся неокрашенными участки мозга составляли зону ишемии. Анализировали 5 срезов мозга толщиной 2 мм, произведенных во фронтальной плоскости. Вычисляли средний относительный показатель объема нарушения кровотока.

Моделирование ишемического пре- и посткондиционироваиия, введение

эритропоэтнна.

Раннее ишемическое прекондиционирование моделировали путем окклюзии обеих ОСА на 5 минут за 5 минут до ишемии. Раннее ишемическое посткондиционирование моделировали путем создания 10 эпизодов окклюзии обеих ОСА на 10 секунд с 10-секундными интервалами реперфузии в раннем реперфузионном периоде, сразу после восстановления кровотока, (по методу Zhao Н.). Эритропоэтин (Янссен-Силаг) вводили в дозе 2500 ЕД/кг и 5000 ЕД/кг внутрибрюшинно за 30 минут до ишемии или спустя 3 и 12 часов после восстановления кровотока.

Клиническое исследование В исследовании приняли участие пациенты с доказанным ишемическим инсультом (п=52), поступившие в первые 3 суток от момента появления первых симптомов, и пациенты с ТИА (п=21). Все больные с инсультами были разделены на две группы: пациенты с «хорошим» (более 40% от исходного, 5,33±3,4 балла к 14 дню, п=32) и «плохим» (менее 40% от исходного, 1,8±1,35 балла к 14 дню, п=20 по шкале инсульта национального института здоровья) восстановлением неврологического дефицита. Выделили следующие факторы для оценки влияния на развитие ТИА или инсульта, и на восстановление неврологического дефицита при инсульте: пол, возраст, наличие в анамнезе факта ишемического инсульта или ТИА, а также их количество, тяжесть неврологического дефицита в первый день (по шкале инсульта национального института здоровья). Для изучения факторов, влияющих на активацию механизмов эндогенной нейропротекции, использовали следующие показатели: гематологические (количество эритроцитов, содержание гемоглобина, цветовой показатель, гематокрит и другие), предшествующие сосудистые изменения,

выявленные при нейровизуализации, наличие атеросклеротических бляшек и стенозов, нарушения сердечного ритма, наличие сердечной недостаточности, курение, наличие сахарного диабета 2-го типа, замкнутость Виллизиева круга и другие.

Метанализ

Анализ проводился в базах данных Национальной библиотеки Санкт-Петербурга и MEDLINE. Отобрано 14 публикаций, посвященных данной теме [Altieri M. et al. 1998; Yamamoto H. et al., 1998; Moncayo J. et al., 2000; Weih M. et al., 1999; Castillo J. et al., 2003; Johnston S.C. et al., 2004; Sitzer M. et al., 2004; Wegener S. et al., 2004; Schaller В. et al., 2005; Шварцбурд Т.Я., 2005; Morte D.D. et al., 2008; Zsuga J. et al., 2008; Paul N.L.M. et al., 2010; Мельникова E.B. и соавт, 2010], из них две отечественных, а остальные выполнены зарубежными авторами. В общей сложности, были оценены данные по 13737 пациентам с инсультом без предшествующей ТИА и 1634 пациентам с ТИА и инсультом. Для проведения метанализа были отобраны статьи, выполненные с одинаковым дизайном и применением сходных статистических методов. Так стало возможным осуществить метаналитический подход в отношении двух показателей -летальности и положительных исходов. В качестве определения положительных исходов использовали оценку по шкале Ренкин 0-1 баллов и по шкале Бартел более 90 баллов через 3 месяца после инсульта. Причем наш анализ литературы не позволил выделить подгруппы ТИА по их клиническим характеристикам.

Статистическая обработка результатов Статистический анализ данных осуществляли с помощью программного пакета SPSS 12,0. Для статистической оценки двух независимых выборок использовали критерий Манна-Уитни, а для двух зависимых Вилкоксона-Манна-Уитни. Результаты представлены в виде графиков «с точками», «ящики и усы» и таблиц, а значения приведены в виде медианы и 25% и 75% процентилей в круглых скобках. В клинической части также использован многофакторный анализ и метод Хи-квадрат (критерий Пирсона). В метанализе использовано отношение шансов по методу Мантель-Ханзел (Mantel Hanzel test).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

При 30-ти минутной эндоваскулярной окклюзии левой СМА и 48- часовой реперфузии развивался инфаркт мозга, расположенный в подкорковых ядрах левого полушария большого мозга (рис. 1а). Увеличение продолжительности фокальной ишемии в бассейне СМА до 60 минут приводило к расширению зоны пораженной ткани головного мозга с ее распространением в направлении от подкорковых структур к коре. Ишемическое прекондиционирование уменьшало размер зоны инфаркта в подкорковых ядрах при продолжительности повреждающей ишемии 30 минут (группа №2 по сравнению с группой №1, р=0.008). При оценке размера инфаркта в целом мозге (кора + подкорковые структуры) при 60-ти минутной ишемии (группа №3) наблюдалась тенденция к сохранению защитного эффекта ишемического прекондиционирования (группа №4), хотя разница не была достоверной р=0,19. Однако при более детальном анализе срезов (рис. 16) было отмечено, что ишемическое прекондиционирование при 60-ти минутной ишемии уменьшало размер инфаркта подкорковых структур (группа №4 по сравнению с группой №3, р=0,016), но не влияло на степень повреждения коры (р=0,73, рис 16). Таким образом, раннее ишемическое прекондиционирование эффективно уменьшает повреждение мозга у крыс при фокальной ишемии мозга длительностью 30 или 60 минут, а также при 48-часовой ишемии, что проявляется уменьшением размера инфаркта и выраженности

отёка мозга. Это отличает эффекты ранней эндогенной цитопротекции в головном мозге от таковой в миокарде. Для объяснения полученных результатов мы провели исследование влияния прекондиционирования на магистральный кровоток и размер зоны нарушения перфузии в головном мозге. Была высказана гипотеза, что раннее ишемическое прекондиционирование способно повлиять на церебральный кровоток в головном мозге.

40-

%

30-

20-

10-

p«O.OUS

X

р=0.00005

Группа Xsl Группа Ml Группа J63 Группа Л»4 30 мин. ИПК и 30 миы. Ь0 минут ИПК 60 мкиуг ОЛСМА ОЛСМА ОЛСМА ОЛСМА

Группа Л г 5 Группа №6 передо жа ИПК и ЛСМа перевязка ЛСМА

Рис. 1а. Влияние прекондиционирования на размер зоны инфаркта (по площади повреждения большого мозга) при транзиторной и перманентной ишемии вследствие эндоваскулярной окклюзии или перевязки левой СМА соответственно. Обозначения: ОЛСМА - окклюзия левой СМА, ИПК - ишемическое прекондиционирование.

Рис.1б. Влияние прекондиционирования на размер зоны инфаркта (по площади повреждения подкорковых ядер) при транзиторной 60-ти минутной ишемии вследствие эндоваскулярной окклюзии левой СМА. Обозначения: см. Рис 1а.

Исследование зоны нарушения перфузии ткани мозга (рис. 2а) показало, что происходит достоверное уменьшение зоны нарушения перфузии через 30 минут после окклюзии СМА - эффект «краевой реперфузии» (группа 3 по сравнению с группой 1, р<0,01). Ишемическое прекондиционирование не изменяло ее размер, выявленный через 5 минут после эндоваскулярной окклюзии левой СМА (группа №2 по сравнению с группой №1, р=0,69), но при введении синего Эванса через 30 минут после начала ишемии у крыс с предшествующим ишемическим прекондиционированием отмечалось уменьшение зоны ишемии в области подкорковых ядер (рис 26, группа №4 по сравнению с группой №3, р=0,032). Исследование зоны ишемии на модели перевязки левой СМА показало (рис. 2а) аналогичную зависимость: не отмечалось уменьшения размера зоны ишемии при введении синего Эванса через 5 минут после перевязки левой СМА в группе ишемического прекондиционирования (группа №6 по сравнению с группой №5, р=0,99), в то время как через 40 минут после начала ишемии отмечено уменьшение зоны ишемии в группе прекондиционирования (группа №¡8 по сравнению с группой №7, р=0,018). Таким образом, эффективность раннего ишемического прекондиционирования отчасти связана с изменением зоны нарушения перфузии (зоны ядра ишемии и «ишемической пенумбры») через 30 минут после окклюзии артерии за счёт более раннего открытия коллатерального кровообращения других бассейнов, по-видимому, через лептоменигиальные анастомозы. Таким образом, можно сделать заключение, что наравне с известными цитопротективными механизмами, раннее ишемическое прекондиционирование способно улучшать регионарный кровоток в головном мозге через 30-40 минут после начала ишемии, что приводит к уменьшению размера зоны ишемии. р<0.01

40-

%

30-

20-

Группа Группа.Группа Л*3 Гр\ш«А>4 ОЛСМА ИПКи ЗОмшч ИПК.Шчипм ОЛСМА ОЛСМА ОЯСМЛ

р—0.018

X

I

~т

Группа№5 Группа Группа №¡7 Группа .48

переписка ИПК н персвткн ИПК я

ДСМА перевязка ЛСМА персапка

ЛСМА ''О мя". ЛСМА 40 мин.

Рис.2а. Влияние прекондиционирования на размер зоны ишемии по отношению к площади большого мозга при исследовании на модели эндоваскулярной окклюзии левой СМА и на модели перевязки левой ОСА и корковой ветви левой СМА. Обозначения: ОЛСМА - окклюзия левой СМА, ИПК - ишемическое прекондиционирование.

Грушм ЛИ Групп* ЛМ ЗОмииуг WIK и ДО минус

олсмл адсмл

Рис. 26. Влияние прекондиционирования на размер зоны ишемии по отношению к площади подкорковых ядер поврежденного полушария через 30 минут после начала ишемии при исследовании на модели эндоваскулярной окклюзии левой СМА в группах № 3 и 4. Обозначения: см. Рис 2а.

В табл. 2 представлены данные статистической обработки (уровень значимости) по исследованию влияния раннего ишемического пре- и посткондиционирования, введения эритропоэтина за 30 минут до ишемии на размер инфаркта, кровоток в СМА на 20 минуте реперфузии, неврологический дефицит и выраженность отека головного мозга. Статистически значимые показатели выделены жирным шрифтом (значимым считалось р<0,05). Серии экспериментов расположены соответственно степени выявленного защитного эффекта.

Нами продемонстрирован комплексный нейропротективный эффект раннего пре- и посткондиционирования и раннего введения эритропоэтина при фокальной транзиторной ишемии головного мозга. При сопоставлении различных методов эндогенной нейропротекции, эритропоэтин продемонстрировал наилучший защитный эффект. Учитывая, что эритропоэтин является разрешенным препаратом, и его введение не связано с техническими сложностями, этическими проблемами, его использование для эндогенной нейропротекции при ишемическом инсульте и защиты от ятрогенной ишемии при операциях на сосудах мозга может быть рассмотрено как наиболее перспективное [Ehrenreich Н. 2002, Ahmet Höke 2006, Mirmerup J., 2009].

Таблица 2.

Сводная таблица исследования уровня значимости влияния раннего ишемического пре- и посткондиционирования, введения эритропоэтина за 30 минут до ишемии на размер инфаркта, кровоток в СМА на 20 минуте реперфузии, неврологический

Группа Размер инфаркта Кровоток на 20-й минуте реперфузии Неврологический дефицит Выраженность отёка мозга

ЭПО 5,0 0,003 0,010 0,010 0,016

ПреКон 1 0,020 0,006 0,027 0,337

ЭПО 2,5 0,024 0,006 0,097 0,055

ПостКон 0,017 0,100 0,096 0,018

ПреКон 2 0,465 0,028 0,091 0,018

В табл. 2 представлены уровни значимости по сравнению с контролем во всех группах (Критерий Манна-Уитни, значимым считалось р<0,05). Обозначения: ЭПО 2,5 - эритропоэтин в дозе 2500 Ед/кг, ЭПО 5,0 - эритропоэтин в дозе 5000 Ед/кг, ПреКон 1 - однократное ишемическое прекондиционирование (5 минут ишемии 5 минут реперфузии), ПреКон 2 - двукратное ишемическое прекондиционирование (два эпизода 5 минут ишемии 5 минут реперфузии), ПостКон - ишемическое посткондиционирование.

В клинических условиях применение профилактических методик нейропротекции ограничено, так как большинство больных поступает спустя несколько часов после появления симптомов инсульта. Согласно нашим данным, эритропоэтин в дозе 5000 Ед/кг продемонстрировал наилучший защитный эффект при профилактическом использовании. Исследована эффективность защитного эффекта эритропоэтина при введении спустя 3 и 12 часов после восстановления кровотока в эксперименте. Влияние введения эритропоэтина через 3 и 12 часов на размер инфаркта показано на рисунке 3. Размер ишемического повреждения мозга составил в контрольной группе 12,65 (10,6; 15,21) %; в группе 2 - эритропоэтин через 3 часа -3,97 (3,18; 4,69) %, что было достоверно меньше, чем в контроле (р=0,0007); в группе 3 - эритропоэтин через 12 часов - 3,58 (3,39; 3,71) %, р=0,0016 в сравнении с контролем. Различий между группами эритропоэтина через 3 и 12 часов по размеру инфаркта получено не было (р=0,5368).

Рис.3. Размер инфаркта мозга при введении эритропоэтина 5000 Ед/кг через 3 и 12 часов после восстановления кровотока Обозначения: ЭПО - эритропоэтин.

Таким образом, не только раннее ишемическое прекондиционирование обладает защитным эффектом, но и раннее ишемическое посткондиционирование и эритропоэтин в дозах 2500 и 5000 Ед/кг, введенный за 30 минут до 40-минутной окклюзии СМА уменьшают ишемическое повреждение мозга. Наибольшее защитное действие оказывает введение эритропоэтина в дозе 5000 Ед/кг. Ишемическое повреждение мозга уменьшается также в случае введение эритропоэтина в дозе 5000 Ед/кг через 3 и 12 часов после 30 минутной окклюзии СМА.

23 22 21 20 19 18

р=0,0007 р=0,0016

з 2 1

О'

Контроль ЭПО Зч ЭПО 12ч

Клиническое исследование

В группе ТИА частота предшествующих сосудистых событий (ТИА и инсультов в анамнезе) была выше, чем у пациентов с инсультами (59,1% уэ 17,3% соответственно, р=0,001). Причем количество предшествующих эпизодов было также больше в группе ТИА (Рисунок 4). Таким образом, наличие в анамнезе цереброваскулярного эпизода (ТИА или инсульта) может быть признаком «подготовленности» ткани головного мозга к последующему ишемическому повреждению. Данная «находка» может быть расценена как клинический эквивалент ишемического прекондиционирования мозга.

Количество пациентов

ОНМК 3 2 1 0 1 2 3 4 10 ТИА

Количество предшествующих цереброваскулярных эпизодов

Рис.4. Влияние наличия и количества предшествующих ишемических событий на тип последующего события. Обозначения: ОНМК - острые нарушения мозгового кровообращения.

Согласно данным нашего исследования, не показано влияния предшествующего поражения мозга (выявленного при нейровизуализации), атеросклероза брахиоцефальных артерий, нарушений сердечного ритма, сердечной недостаточности, курения, сахарного диабета 2-го типа, замкнутости Виллизиева круга на динамику восстановления неврологического дефицита или тяжести цереброваскулярного события (ТИА или инсульта). Нами не подтвердился возможный нейропротективный эффект этих факторов.

Метанализ

Для оценки влияния предшествующих ТИА на число положительных исходов после инсульта было выбрано 6 из 14 статей (таблица 3). В группу «инсульты без ТИА» было включено 7912 пациентов, а в группу «инсульты с предшествующими ТИА» - 703 пациента. Согласно данным статистического метанализа выявлено, что наличие ТИА перед инсультом приводило к достоверному (р=0,0002) увеличению положительных исходов по сравнению с группой без ТИА (табл. 3) ОЯ 1.38 [1.16, 1.63].

Таблица 3.

Влияние ТИА перед инсультом на число положительных исходов (метод Мантель-Ханзеля - Mantel Hanzel test)._

ТИА+инсульт Инсульт

Risk Ratio

Study or Subgroup Events Total Events Total Weight M-H, Random, 95% CI

Risk Ratio M-H, Random, 95% CI

Arbiox, 2004 36 166 165 1103 13.4% 1.45 [1.05, 2.00)

Castillo. 2003; 23 27 48 107 16.0% 1.90 [1.46, 2.47]

Moncayo. 2000; 105 140 1398 2086 24.0% 1.12 [1.01, 1.24]

Moncayo. 2000; 170 293 1398 2086 0.0% 0.87 [0.78, 0.96]

Schailer B.. 2005; 8 11 46 70 10.6% 1.11 [0.74, 1.65]

Sizer M.. 2004; 153 332 1567 4465 23.0% 1.31 [1.16,1.48]

WeihM.. 1999; 20 27 36 81 13.0% 1.67 [1.20, 2.32]

Total (95% CI) I 783 7912 J 100.0% 1.38 [1.16,1.63]

Total events 345 3260

Heterogeneity: Tau2 = 0.03; Chi2 = 18.42. dT = 5(P: = 0.002); I2 = 74%

Test for overall effect: Z = 3.72 (P_ ¿00002^1 (

Инсульт

1 10 100 ТИА + Инсульт

Для оценки влияния предшествующих ТИА на летальность после инсульта было выбрано 2 статьи. В группу «инсульты без ТИА» было включено 3108 пациентов, а в группу «инсульты с предшествующими ТИА» - 361 пациента. По результатам анализа выявлено, что наличие ТИА перед инсультом не приводило к достоверному (р=0.30) снижению летальности после инсульта по сравнению с группой без ТИА (таблица 4) OR 0.74 [0.42, 1.31].

Таблица 4.

Влияние ТИА перед инсультом на внутригоспитальную летальность (метод Мантель-Ханзеля - Mantel Hanzel test).

ТИА+инсульт инсульт Odds Ratio Odds Ratio

Study or Subgroup Events Total Events Total Weight M-H, Random, 95% CI M-H, Random, 95% CI

Arbiox, 2004 32 166 219 1103 54.7% 0.96 [0.64,1.461 If"

Zsuga 2008 15 195 268 2005 45.3% 0.54 [0.31,0.93] "B"

Total (95% CI) 1361 3108 [ 100.0%

Total events 47 487

Heterogeneity: Tau2 = 0.11; Chi2 = 2.80, df = 1 (P = 0.09); I2 = 64% Test for overall effect: 2 = 1.03fcp - 0 30j

По остальным конечным точкам нашего исследования, указанным выше, были выявлены значимые расхождения в методах оценки и интерпретации клинических характеристик, что не позволило применить статистический анализ.

Таким образом, ТИА перед ишемическим инсультом является клиническим эквивалентом ишемического прекондиционирования, что проявляется увеличением числа положительных исходов.

Наличие защитного эффекта ТИА перед инсультом доказывает существование феномена ишемического прекондиционирования мозга применительно к человеку. Причем, выраженность защитного эффекта прекондиционирования, выявленного по результатам нашего исследования, позволяет рассуждать о возможном преимуществе эндогенной нейропротекции перед фармакологической, поскольку ни один из современных нейропротективных препаратов не доказал своей эффективности при

0.74 [0.42,1.31)

I-1--1-1

0.01 0.1 1 10 100 ТИА+инсульт Инсульт

ишемическом инсульте [рекомендации ASA 2011 и ESO 2008]. Основываясь на результатах данной работы, создание методов и средств нейропротекции, основанных на феномене прекондиционирования и стимуляции эндогенной нейропротекции, может быть весьма перспективным.

ВЫВОДЫ

1. Раннее ишемическое прекондиционирование обладает защитным эффектом при транзиторной фокальной ишемии мозга длительностью 30 или 60 минут у крыс, а также при 48-часовой перманентной ишемии, что проявляется уменьшением размера повреждения и выраженности отёка мозга.

2. При окклюзии средней мозговой артерии возникает зона нарушения перфузии, которая через 30 минут уменьшается за счет увеличения коллатерального кровообращения; в случае применения раннего ишемического прекондиционирования, уменьшение зоны нарушения перфузии более выражено, что позволяет рассматривать коллатеральное кровообращение как один из механизмов защитного эффекта ишемического прекондиционирования.

3. Ишемическое посткондиционирование по протоколу: десять эпизодов 10-секундной ишемии, перемежающиеся 10-секундной реперфузией, начатое на 10 секунде после 40-минутной транзиторной фокальной ишемии головного мозга крысы, уменьшает неврологический дефицит и размер ишемического повреждения головного мозга, что свидетельствует о его нейропротективном действии.

4. Введение эритропоэтина в дозах 2500 и 5000 Ед/кг за 30 минут до 40-минутной окклюзии средней мозговой артерии у крыс уменьшает ишемическое повреждение мозга, наибольшим защитным эффектом обладает введение эритропоэтина в дозе 5000 Ед/кг. Реперфузионное повреждение мозга уменьшается в случае введение эритропоэтина в дозе 5000 Ед/кг через 3 и 12 часов после 30 минутной окклюзии средней мозговой артерии;

5. Наличие у пациентов в анамнезе предшествующих инсультов или транзиторных ишемических атак ассоциировано с развитием менее тяжелых форм цереброваскулярных событий - транзиторных ишемических атак.

6. Сопутствующие заболевания - сахарный диабет, сердечная недостаточность и атеросклеротическое поражение брахиоцефальных артерий, - не приводят к активации механизмов эндогенной нейропротекции и не ассоциированы с ускорением восстановления неврологического дефицита.

7. По данным метанализа, транзиторная ишемическая атака перед ишемическим инсультом является клиническим эквивалентом ишемического прекондиционирования, что проявляется увеличением числа положительных исходов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

В проведенном исследовании имеется теоретическое обоснование для возможного практического использования механизмов эндогенной нейропротекции: ишемического пре- и посткондиционирования.

Полученные результаты делают перспективным применение эритропоэтина в клинической практике для повышения устойчивости головного мозга к ишемии.

Выявленная роль транзиторных ишемических атак как прекондиционирующего фактора дает основание для оптимизации прогноза при ишемическом инсульте.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи:

1. Шмонии, A.A., Защитный эффект ишемического прекондиционирования при фокальной ишемии головного мозга крысы различной продолжительности/ Т.Д. Власов, А.Е. Байса, A.A. Шмонин, В.Н. Вавилов, Е.В. Мельникова// Клиническая патофизиология. - 2008. - №1. - С. 54-57.

2. Шмонин, A.A. Многофакторная нейропротекция при ишемическом инсульте (клинико-экспериментальное исследование)/ A.A. Скоромец, Е.В. Мельникова, И.В. Чурилова, A.A. Шмонин// Врач. - 2009. - №2. - С. 26-29. (журнал из списка ВАК)

3. Шмонин, A.A. Ишемический инсульт или транзиторная ишемическая атака: какие факторы могут определять вариант сосудистого события?/ Е.В.Мельникова, A.A. Шмонин, Л.Н.Стукова, Е.А.Бондарева, Д.В. Клишина// Сб. научных трудов "Трансляционная медицина" (под ред. член-корр. РАМН, проф. Е. В. Шляхто). -СПб,2010.-С. 273-279.

4. Шмонин, A.A. Эндогенная нейропротекция при ишемии мозга: эритропоэтин, пре-и посткондиционирование/ A.A. Шмонин, И.Ю. Панов, A.B. Симаненкова, М.С. Просвирнина, С.С. Чеканов, Е.В. Мельникова, Т.Д. Власов// Анналы клинической и экспериментальной неврологии. - 2010. - Том 4. - №3. - С. 29-35. (журнал из списка ВАК)

5. Шмонин, A.A. Экспериментальное исследование нейропротективных свойств альфа-липоевой кислоты и супероксиддисмутазы при ишемии мозга у крыс/ A.A. Шмонин, Е.В. Мельникова, И.В. Чурилова, Т.Д. Власов// Российский физиологический журнал им. Сеченова. - 2011. - Том 97. - №1. - С. 65-71. (журнал из списка ВАК)

6. Шмонин, A.A., Эндогенная защита при ишемическом повреждении мозга/ A.A. Шмонин, Е.В. Мельникова, Т.Д. Власов// Медлайн-экспресс. - 2011. - №1 (207). -С.46-51.

7. Шмонин, A.A. Защитные эффекты раннего ишемического прекондиционирования при фокальной ишемии мозга у крыс: роль коллатерального кровообращения/ A.A. Шмонин, А.Е. Байса, Е.В. Мельникова, В.Н. Вавилов, Т.Д. Власов// Российский физиологический журнал им. Сеченова. - 2011. - Том 97. - № 2. -С. 203-213. (журнал из списка ВАК)

Тезисы:

1. Шмонин, A.A. Эффективность нейропротекции при ишемическом инсульте в зависимости от индивидуальных характеристик пациентов / A.A. Шмонин// «II международный молодёжный медицинский конгресс - 2007»: Сборник. - СПб.: Изд-во BMA, 2007. - С. 65-66.

2. Шмонин, A.A. Роль коллатерального кровообращения в формировании защитного эффекта раннего ишемического прекондиционирования при фокальной ишемии мозга у крыс / A.A. Шмонин, А.Е. Байса// Всероссийская научно-практическая конференция «Поленовские чтения», 22-24 апреля 2009 г.: Тезисы. - СПб., 2009. -С. 247.

3. Shmonin, A.A. Role of Collateral Circulation in Protective Effect of Early Ischemic Preconditioning During Focal Transient and Permanent Brain Ischemia in Rats / E.V. Melnikova, A.A. Shmonin, A.E. Baysa, V.N. Vavilov, T.D. Vlasov// Cerebrovascular Diseases. - Abstracts 18th European Stroke Conference. - 27 May 2009. - P. 111.

4. Shmonin, A.A. Neuroprotective effects of lipoic acid and superoxide dismutase in the rat model of cerebral ischemia / E.V. Melnikova, A.A. Shmonin, N.M. Paramonova, I.V. Churilova, T.D. Vlasov, E.V. Protsenko, D.V. Gerasimenko// Cerebrovascular Diseases. - Abstracts 18th European Stroke Conference. - 27 May 2009. - P. 115.

5. Шмонин, A.A. Исследование факторов, влияющих на клиническое проявление и восстановление неврологических функций у пациентов с инсультами и транзиторными ишемическими атаками /Е.А. Бондарева, Д.В. Клишина, JI.H. Стукова, A.A. Шмонин// 13-я Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей «Человек и его здоровье: Фундаментальная и клиническая медицина»: Сборник тезисов. - СПб., 2010. - С. 29-30.

6. Шмонин, A.A. Методы защиты мозга при операциях на артериях головы и шеи: пре- и посткондиционирование, эритропоэтин/ A.A. Шмонин, И.Ю. Панов, A.B. Симаненкова, М.С. Просвирнина, С.С. Чеканов, Е.В. Мельникова, Т.Д. Власов// IX всероссийская научно-практическая конференция «Поленовские чтения», 6-10 апреля 2010: Материалы. - СПб.: Изд-во «Человек и его здоровье», 2010. - С. 389.

7. Shmonin, A.A. Endogenous Neuroprotection during Focal Brain Ischemia in Rats: Erythropoietin, Ischemic Pre- and Postconditioning/ E.V. Melnikova, A.A. Shmonin, I.Y. Panov, A.V. Simanenkova, M.S. Prosvirnina, S.S. Chekanov, T.D. Vlasov// Cerebrovascular Diseases. - Abstracts 19th European Stroke Conference. - May 2010. -Vol. 29 (suppl 2). - P. 893.

8. Шмонин, A.A. Клинико-экспериментальное исследование эндогенной нейропротекции при ишемии мозга: эритропоэтин, пре- и посткондиционирование/ A.A. Шмонин// «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», 24 мая 2011: Сборник тезисов. - СПб.: Изд-во СПбМАПО, 2011.-С. 150-151.

9. Shmonin, A.A. Protective effect of erythropoietin in early and delayed postischemic period in rat model of focal cerebral ischemia/ M.S. Prosvirnina, T.D. Vlasov, A.A. Shmonin, E.V. Melnikova// Cerebrovascular Diseases: Abstracts 20th European Stroke Conference. - May 2011. - 31 (suppl 2). - P. 138.

Список основных обозначений и сокращений

ВСА - внутренняя сонная артерия

СМА - средняя мозговая артерия

ТИА - транзиторная ишемическая атака

Подписано в печать 17.02.2012г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,1. Тираж 100 экз. Заказ №2515.

Отпечатано в ООО «Издательство "ЛЕМА"» 199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д. 24 тел.: 323-30-50, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@mail.ru http://www.lemaprint.ru