Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Обоснование состава и стандартизация лекарственного препарата, содержащего кетопрофен и глюкозамина сульфат

ЛЕОНОВА ВИКТОРИЯ НОДАРЬЕВНА

ОБОСНОВАНИЕ СОСТАВА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА, СОДЕРЖАЩЕГО КЕТОПРОФЕН И ГЛКЖОЗАМИНА

СУЛЬФАТ

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЁНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

Пятигорск 2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор

Компанцева Евгения Владимировна

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук профессор

Попова Ольга Ивановна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Росздрава»

Защита состоится «30г> ШЖЛ 2003 года в 900 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.069.01 при ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава» (357532, Ставропольский край, Пятигорск, пр. Калинина, 11)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава».

Автореферат разослан «30» МОЛ 200В г.

кандидат фармацевтических наук, доцент Бочкарева Инна Ивановна

у ченыи секретарь диссертационного совета

Ч Т.

Э.Ф. Степанова

Общая характеристика работы Актуальность темы. Заболевания опорно-двигательного аппарата представляют одну из важных проблем медицины. Согласно данным медицинской статистики у каждого второго жителя России уже к 20 годам появляется то или иное заболевание суставов. У лиц пожилого возраста старше 65 лет эти заболевания наблюдаются почти у 100%. Данная группа заболеваний включает около 100 нозологических форм и встречается во всех странах мира, в которых заболеваемость достигает от 20 до 45% населения (Ш.Ф. Эрдес, 2008 г).

Для лечения таких заболеваний используют различные фармакотерапевтические средства. Однако наиболее часто применяются симптоматические препараты, среди которых превалируют нестсроидные противовоспалительные средства (НГТВС). К таким лекарственным препаратам относится кетопрофен, который нашел широкое применение за рубежом в виде различных лекарственных форм. Следует отметить, что в Российской федерации лекарственные препараты кетопрофена не выпускаются и на российский фармацевтический рынок поступают из-за рубежа. •:

Анализ зарубежной и отечественной литературы показал, что при пероральном применении кетопрофена часто наблюдаются эрозивно-язвенные поражения слизистой оболочки желудка. Это является одной из причин, того что таблетки кетопрофена для перорального применения часто не рекомендуют больным с заболеваниями желудочно-кишечного тракта.

В то же время известно, что мукополисахариды и гликонротеиды эндогенного и экзогенного происхождения могут оказывать защитное действие на слизистую оболочку; желудка и двенадцатиперстной кишки (Н.В. Чичагова,. 2007 г). Исследованиями Зупанца И.А. (1991 г) и сотрудниками кафедры фармацевтической химии Пятигорской ГФА (2005 г) доказано, что глюкозамин снижает побочные действия НПВС, а также стимулирует процессы регенерации. Есть сведения об усилении фармакологической активности НПВС с помощью глюкозамина. Очевидно, что создание лекарственных средств, содержащих кетопрофен совместно с глюкозамином, позволит не только значительно снизить побочное действие

кетопрофена, но и получить лекарственное средство с более высоко противовоспалительной активностью. Поэтому обоснование состава стандартизация лекарственного препарата, содержащего кетопрофен и глюкозами! является актуальной проблемой для фармацевтической науки и практики.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилос обоснование состава и стандартизация нового отечественного таблетированног лекарственного препарата, содержащего кетопрофен и глюкозамина сульфат позволяющего повысить анальгетическую активность и снизить ульцерогенно действие кетопрофена на фоне его совместного применения с глюкозамином.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

- подтвердить специфическую активность кетопрофена с глюкозами"' сульфатом при их совместном применении;

- разработать методики качественного и количественного анализ' кетопрофена и глюкозамина, позволяющие определять их при совместном присутствии;

- разработать методики определения продуктов деструкции кетопрофена и глюкозамина при их совместном применении;

- изучить стабильность кетопрофена и глюкозамина при их совместном присутствии;

- обосновать нормы качества предлагаемого лекарственного препарата и установить сроки годности;

- определить фармакокинетические характеристики кетопрофена и глюкозамина сульфата в предлагаемом лекарственном препарате.

Научная новизна. Проведено экспериментальное изучение на лабораторных животных влияния глюкозамина сульфата на анальгетическую активность и ульцерогенное действие кетопрофена при курсовом применении в сравнении с монотерапией кетопрофена. Анализ результатов исследования позволяет утверждать, что комбинированное применение кетопрофена с глюкозамина сульфатом повышает анальгетическую активность кетопрофена в 1,5-2 раза и существенным образом ограничивает повреждение слизистой желудка, то есть

может служить эффективным средством профилактики ульцерогенеза данного НТТВС.

Обоснован выбор методик для определения кетопрофена и глюкозамина сульфата при совместном присутствии. Для подтверждения подлинности и количественного определения кетопрофена найдены оптимальные условия использования УФ-спектрофотометрического и ВЭЖХ методов. Обоснована возможность использования спирта этилового 95% вместо токсичного растворителя спирта метилового для спектрофотометрического определения кетопрофена в предлагаемом лекарственном препарате.

Показана возможность определения продуктов деструкции кетопрофена в присутствии глюкозамина сульфата с помощью метода ВЭЖХ.

Обоснованы оптимальные условия ВЭЖХ определения примеси в глюкозамине (5-гидроксиметилфурфурола) в присутствии кетопрофена.

В результате проведенных фармакокинетических исследований показано, что максимальная концентрация кетопрофена в плазме крови собак наблюдается через 2 часа, глюкозамина сульфата - через 4 часа после однократного перорального применения лекарственного препарата.

Практическая значимость результатов исследования. В результате проведенных фармакологических исследований предложен состав нового лекарственного препарата болеутоляющего действия - Таблетки кетопрофена по 0,05 г с глюкозамина сульфатом по 0,4 г и таблетки «Флексипрофен» для ветеринарии, содержащие кетопрофена 0,02 г, глюкозамина сульфата 0,4 г. На основании этих исследований на кафедре технологии лекарств Пятигорской ГФА предложена технология таблеток, содержащих кетопрофен 0,05 (0,02) г, глюкозамина сульфат 0,4 г и вспомогательные вещества: коллидон 25 - 0,005г; тальк 0,0075 г; кальция стеарат 0,0025 г.

Предложены способы идентификации и количественного определения кетопрофена и глюкозамина сульфата химическими и физико-химическими методами. Проведена валидационная оценка методик анализа, с помощью которой подтверждена правильность их выбора.

На основании разработанных методик были установлены нормы качесл исследуемого лекарственного препарата и определена его стабильность в пронес хранения методом ускоренного старения. Срок годности составил 3 го; Полученные результаты исследований легли в основу разработки ФСП «Таблет кетопрофена с глюкозамина сульфатом» и НД на лекарственный препа «Флексипрофен» для использования в ветеринарной практике.

Внедрение результатов исследования в практику. Разработаны прое ФСП «Таблетки кетопрофена с глюкозамина сульфатом» и проект НД лекарственный препарат «Флексипрофен», который совместно с ООО «ВИК Здоровье животных» направлен для регистрации в Федеральную службу по надзо в сфере здравоохранения и социального развития.

Материалы проекта ФСП «Таблетки кетопрофена по 0,05 г с глюкозами сульфатом по 0,4 г» использованы в учебном процессе кафедры фармацевтическ химии ПятГФА (акт внедрения от 08.05.09 г).

Апробация и публикация результатов исследования. Основные результат диссертационной работы были доложены и обсуждались на ежегодных научн конференциях Пятигорской государственной фармацевтической академии в 200 2009 гг.

По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе две работы журналах, рекомендуемых ВАК.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтическг наук. Работа выполнена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО «Пятигорск ГФА Росздрава», номер государственной регистрации 01200101061.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 1 страницах машинописного текста, содержит 32 таблицы и 26 рисунков, состоит I «Введения», «Обзора литературы», 4 глав экспериментальных исследований, обпц выводов, списка литературы, включающего 142 источника, из них 42 I иностранных языках.

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Сочетание кетопрофена с глюкозамина сульфатом повыша

анальгетическую активность и значительно снижает ульцерогенное действие кетопрофена.

2. Метод УФ-спектрофотометрии позволяет проводить идентификацию и количественное определение кетопрофена в присутствии глюкозамина сульфата в исследуемых лекарственных препаратах с относительной ошибкой ±1,17%.

3. Разработанные условия анализа методом ВЭЖХ можно использовать для качественного и количественного определения кетопрофена в присутствии глюкозамина сульфата.

4. Метод Эльсона - Моргана позволяет идентифицировать и количественно определять глюкозамина сульфат в присутствии кетопрофена.

5. Разработанные методики определения посторонних примесей кетопрофена и глюкозамина сульфата позволили установить срок годности предложенного лекарственного средства - 3 года.

5. Максимальная концентрация кетопрофена в плазме крови обнаруживается через 2 ч, глюкозамина сульфата - через 4 ч после однократного пероралыюго введения исследуемого лекарственного препарата.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Фармакологические исследования кетопрофена в сочетании с глюкозамина

сульфатом

На первоначальном этапе необходимо было подтвердить увеличение специфической активности кетопрофена и уменьшение его ульцерогенности в сочетании с глюкозамина сульфатом. Исследования проводились в Пятигорской ГФА на кафедре фармакологии при консультации профессора, доктора биологических наук В.Е. Погорелого, совместно с канд. фармацевт, наук Л.М. Макаровой.

Экспериментально установлено (таблица 1), что курсовое введение кетопрофена в дозах 16 и 24 мг/кг и сочетание кетопрофена с глюкозамина сульфатом в дозе 125 мг/кг оказывает стабильный анальгетический эффект в течение 14 дней при моделировании «уксусных корчей». На других моделях альгезии — термической и электрической анальгетический эффект кетопрофена был идентичным в течение всего времени наблюдения и превышал его по сравнению с

монотерапией кетопрофеном.

Таблица 1 - Анальгезирующее действие комбинаций при введении уксусной

кислоты (количество корчей за 15 мин)

Группы животных, получавших Дни исследования

3 7 10 14

Кетопрофен 16 мг/кг 12,2±2,0* 11,3±1,6* 13,6±1,3* 15,1±1,9*

Кетопрофен 24 мг/кг 11,2±1,1* 12,0±1,3* 13,6±1,4* 14,5±2,2*

Кетопрофен 32 мг/кг 6,9±1,1* 7,6±1,3* 14,6±2,4* 16,1±2,2*

Кетопрофен (16 мг/кг) + ГА 5,4±1,1*х 4,9±1,9*х 7,3±1,3*х 7,6±1,6*х

Кетопрофен (24 мг/кг) + ГА 5,1±1,1*х 6,0±1,2*х 7,0±1,0*х о,3±1,1*Х

Кетопрофен (32 мг/кг) + ГА 4,9±0,9* 5,1±0,9* 5,9±0,8*х 6,0±0,9*х

Контрольные животные 45,7±2,9 48,2±2,6 42,!±2,3 41,6±2,4

Примечание: Здесь и в таблице 2 обозначены статистически достоверные различия (Р<0,05) относительно: * - контрольной группы животных; х — животных, получающих монотерапию кетопрофена в соответствующей дозе. ГА - глюкозамина сульфат.

При этом анальгетический эффект комбинации кетопрофен с глюкозамина сульфатом превышал почти в 2 раза эффект монотерапии кетопрофеном.

Учитывая, что среди осложнений, обусловленных приемом ЫПВС, основное место занимают зрозквнс-язвенные поражения слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки, следующим этапом исследований явилось изучение влияния на ульцерогенез комбинаций «кетопрофен+глюкозамина сульфат», содержащих кетопрофен в дозах 16 и 32 мг/кг.

Из данных таблицы 2 следует, что совместное применение кетопрофена (16 мг/кг) с глюкозамином способствовало статистически достоверному уменьшению общего количества язв относительно животных, леченых лишь одним НПВС в данной дозе. Особо следует отметить существенное снижение на фоне глюкозамина сульфата не только общего количества язв на одно животное, но и уменьшение площади язвенного дефекта (см2) и индекса безопасности.

Таким образом, совместное применение кетопрофена с глюкозамином существенным образом ограничивает ульцерогенез, характерный для данного НПВС. Так как большинством фирм-производителей предлагаются таблетки и капсулы кетопрофена по 50 мг, а глюкозамина сульфата - по 400-600 мг, то дозировка лекарственных веществ в Пересчете на одну таблетку составила:

кетопрофена 0,05 г, глюкозамина 0,4 г. В связи с тем, что фирма ООО «ВИК -Здоровье животных» проявила интерес к проведенным фармакологическим исследованиям, нами для ветеринарных целей предлагаются по согласованию с данной фирмой дозировки кетопрофена 0,02 г и глюкозамина сульфата 0,4 г в пересчете на одну таблетку.

Таблица 2 - Результаты исследования гастротоксичности

Группа животных, Количест Отек, Площадь Язвенный Индекс

получавших во язв на крысу % язвы, см2 индекс «безопасное та»

Кетопрофен 16 мг/кг 6,1±1,2* 75 0,26±0,03* 19 2,6±0,15*

Кетопрофен 32 мг/кг 8,2±1,1* 90 0,29±0,02* 20 3,1+0,16*

Кетопрофен (16 ««г/к-гЛ -1- г 4 ■ 2,2±0,9*х 50 0,11±0,03*х 7 1,8±0,14*х

Кетопрофен (32 мг/кг) + ГА 2,9±1,0*х 60 0,13±0,02*х 9 1,9+0,21*

Интактные 0 0 0 0 0

В Пятигорской ГФА на кафедре технологии лекарств доцентом А.М.

Шевченко совместно с канд. фармацевт, наук Д.В. Компанцевым был разработан следующий состав (в пересчете на одну таблетку): глюкозамина сульфата 0,4 г, кетопрофена 0,02 г (0,05 г), коллидона 25 - 0,005 г, талька 0,0075 г, кальция стеарата 0,0025 г. Средняя масса таблетки 0,435 г; 0,465 г. В связи с этим дальнейшие исследования были направлены на разработку методик анализа кетопрофена и глюкозамина сульфата при совместном присутствии, позволяющие достоверно оценивать их качество.

Оценка качества разработанных таблеток проводилась нами по показателям, рекомендованным ГФ XI, вып. 2, с. 154. Полученные результаты свидетельствуют, что исследуемые таблетки по прочности на истирание, распадаемости, отклонению от средней массы, содержанию талька соответствуют требованиям ГФ XI изд.

Качественный и количественный анализ кетопрофена и глюкозамина сульфата при совместном использовании

В связи с тем, что растворы глюкозамина сульфата не имеют полосу

поглощения в УФ-области спектра- от 230 до 300 нм, для идентификации кетопрофена в таблетках использовали метод УФ-спектрофотометрии. Спектр спиртового извлечения из растертых таблеток должен совпадать со спектром

поглощения 0,0006% раствора СО кетопрофена в спирте этиловом 95% (Ят„г=255 нм).

Для определения количественного содержания кетопрофена в таблетках использовали также метод УФ-спектрофотометрии (метод 1) и высокоэффективную жидкостную хроматографию с УФ-детектированием (ВЭЖХ) (метод 2), описанные в нормативных документах на лекарственные препараты кетонала (раствор для инъекций 100 мг/2 мл НД 42-11315-00 и крем 50 мг/г НД 42-11519-01).

Анализ методом обращенно-фазовой ВЭЖХ проводили в условиях, приведенных в таблице 3.

Таблица 3 - Условия проведения метода ВЭЖХ_

Программное обеспечение МультиХром для Windows

Колонка Luna Cis (150 х 4,6 мм)

Размер частиц сорбента 5 мкм

Длина волны 255 нм

Элюент Ацетонитрил : вода (4 : 6)

Скорость потока элюента 1,0 мкл / мин

Объем вводимой пробы 20 мкл

Режим Изократическое злюированне

Марка прибора «Стайер» фирмы Аквилон

Хроматограмма раствора кетопрофена, полученная в вышеизложенных условиях, представлена на рисунке 1.

Важнейшим критерием оценки любой аналитической методики служит доказательство ее валидности, включающей взаимосвязанную систему характеристик - специфичность, линейность, правильность и воспроизводимость (ГФ XII, 2008 г).

1.1 V |

5о о- 5

8

400-| л

Рисунок 1 - Хроматограмма 0,02% раствора кетопрофена

В ходе проведения эксперимента было установлено, что входящие в пропись компоненты не мешают количественному определению кетопрофена при совместном присутствии, то есть обе методики специфичны.

Из данных таблицы 4 следует, что обе методики правильны, так как не отягощены систематической ошибкой, < < г(Р, Хроматографическая система пригодна при условии эффективности хроматографической колонки по пику кетопрофена не менее 4000 теоретических тарелок, коэффициент асимметрии пиков не более 1. Методика ВЭЖХ характеризуется хорошей воспроизводимостью - ЛБО площади пика не более 2,6%.

Таблица 4 - Валидационная оценка методик количественного анализа

кетопрофена (Р=99%, ЦР, /9=3.50. Г /¡-9)

Валидационная характеристика УФ-спектрофотометрия ВЭЖХ

Специфичность специфичен специфичен

Правильность, (выч 1,39 2,14

Область линейной от 0,001 до 0,011 мг/мл от 0,002 до 0,018 мг/мл

зависимости

Уравнение регрессии, г ___л АТЛГ.. Л ЛА ,41 0,997 ___ол ,-" Л ^УЛ/- / А—¿,¿01/0 0,999

Воспроизводимость,

х ± Дх (%) 99,32±1,16 98,95+1,16

е 1,17% 1,17%

Рвыч 1,00

Пригодность системы ВЭЖХ, Т 4735; 0,85

/ИЮ 2,6%

Таким образом, предложенные методики количественного определения

кетопрофена отвечают требованиям по валидации, удобны, просты в исполнении и могут применяться для количественного определения кетопрофена в лекарственном препарате в присутствии глюкозамина сульфата и вспомогательных веществ.

Для идентификации глюкозамина сульфата использовали реакцию ацетилирования ацетилацетоном с последующей конденсацией с п-диметиламинобензальдегидом (реакция Эльсона - Моргана).

Кроме того, для идентификации глюкозамина сульфата и кетопрофена был использован метод хроматографии в тонком слое сорбента. Для выбора

оптимальной системы были использованы смеси растворителей, которые описаны для обнаружения кетопрофена и глюкозамина (таблица 5).

Таблица 5 - Результаты хроматографического исследования таблеток

кетопрофена с глюкозамина сульфатом

№ Система растворителей Извлечение из таблеточной массы СО кетопрофена СО глюкозамина сульфата

1 толуол- изопропанол -муравьиная кислота (70: 30: 1) Яг=0,74 11^0,74 -

2 спирт н-бутиловый - уксусная кислота - вода (5:2: 1) 11^0,88 11{=0,53 ЯрО,85 Яг=0,53

3 спирт этиловый 95% концентрированный раствор аммиака (8: 2) Я[=0,9 11г=0,49 11г0,91 Яг=0,49

4 спирт н-бутиловый - вода -спирт этиловый 95% - кислота уксусная концентрированная (3,4: 2,5: 2,0: 0,5) 111=0,82 1^0,56 Кг0,79 0,56

Кетопрофен идентифицировали по появлению пятен на хроматограмме в УФ-

свете (при 254 нм), а глюкозамин после обработки пластинки 0,5% раствором нингидрина в спирте этиловом 95%.

Из данных таблицы 5 следует, что оптимальными являются системы 2, 3, 4, при использовании которых наблюдались контрастные пятна, достаточно отдаленные друг от друга. В качестве оптимальной нами предлагается наиболее простая, доступная и менее токсичная система 3, степень разделения компонентов в которой находится в удовлетворительных пределах 0,538-0,544.

Для выбора методики количественного определения глюкозамина сульфата использовали две спектрофотометрические методики: 1 - основанная на реакции Эльсона- Моргана и 2 - на реакции с нингидрином.

Валидационная оценка предложенных методик количественного анализа глюкозамина сульфата проводилась на модельных смесях. Установлена специфичность методик, линейная зависимость аналитических сигналов, их правильность и воспроизводимость (таблица 6).

Таблица 6 - Валидационная оценка методик количественного анализа глюкозамина сульфата (Р=99%, ЦР, /)=3,50, Г(Р, А/^та^б,03, п=9)__

Валидационная характеристика Метод Эльсона-Моргана Метод по реакции с нингидрином

Специфичность специфичен специфичен

Правильность, гвыч 1,32 4,40

Область линейной от 0,1 до 0,6 мг в пробе от 0,4 до 1,2 мг в пробе

зависимости

Уравнение регрессии, г у=1,4304х+0,0636 0,999 у=0,5680х+0,0720 0,997

Воспроизводимость, х ± Ах 99,33±1,20 98,14±1,00

е 1,21% 1,02%

£выч 1,44

Систематическая -1,86

ишо^пи) V

Данные таблицы 6 свидетельствуют, что методика, основанная на реакции с нингидрином, имеет систематическую ошибку (5= -1,86) и более трудоемка. Поэтому для дальнейших исследований нами была использована простая в исполнении реакция Эльсопа-Моргана.

Изучение стабильности и установление сроков годности Одним из показателей качества ЛС является определение посторонних примесей. На первом этапе исследований необходимо было определить, какое из входящих в состав таблеток лекарственных веществ (кетопрофен или глюкозамина сульфат) первым подвергается деструкции.

Так как при термостатировании субстанций глюкозамина и кетопрофена (60°С), в течение времени эквивалентного 5 годам естественного хранения, продукты деструкции не обнаруживались, для дальнейших исследований использовали соответствующие растворы действующих веществ в спирте этиловом 50%. При этом оказалось, что в растворе глюкозамина сульфата при термостатировании были обнаружены продукты деструкции, в то время как растворы кетопрофена оставались стабильными. Таким образом, можно сделать вывод, что кетопрофен в растворе стабильнее глюкозамина сульфата. Поэтому, при определении стабильности исследуемого лекарственного препарата, первоначально была изучена возможность определения примесей глюкозамина сульфата (5-

гидроксиметилфурфурола) в присутствии кетопрофена.

5-Гидроксиметилфурфурол (5-ГМФ) имеет максимум поглощения при длине волны 280 нм, входящий в состав таблеток кетопрофен имеет максимум поглощения при 255 нм, что не позволяет использовать метод прямой УФ-спектрофотометрии для определения посторонних примесей глюкозамина.

В связи с этим необходимо было изучить возможность применения метода ВЭЖХ для разделения кетопрофена и примесей глюкозамина сульфата.

Для получения оптимального времени выхода и симметричного пика 5-ГМФ использовали градиентное элюирование с подвижной фазой вода - ацетонитрил.

Подбор концентрации ацетонитрила проводили таким образом, чтобы после выхода продуктов деструкции глюкозамина можно оыло обнаружить кетопрофен и его возможные примеси (рисунок 2).

Для детектирования пиков использовали длину волны 280 нм. В качестве подвижной фазы использовали вначале воду, потом вводили ацетонитрил и доводили его концентрацию до 20% за 10 мин, при этом элюировались все продукты деструкции глюкозамина сульфата. Затем, чтобы обнаружить кетопрофен и возможные его продукты деструкции, в течение 5 мин производили изменение концентрации ацетонитрила от 20 до 60% и далее эту концентрацию не изменяли.

а б

Рисунок 2 - Хроматограммы 0,4% раствора глюкозамина сульфата (а) и 0,02% раствора кетопрофена (б), подвергшихся термодеструкции

В разработанных оптимальных условиях количественное содержание суммы 5-ГМФ и родственных ему соединений определяли в растворе модельной смеси глюкозамина сульфата и кетопрофена, подвергнутом термической деструкции (таблица 7).

Таблица 7 - Результаты определения суммы 5-гидроксиметилфурфурола и

18х, тУ*сек тУ*сек Х,% Метрологические характеристики

308,37 0,04002

347,49 0,04510 Х=0,0411%

311,70 309,60 306,94 385,24 0,04046 0,04018 0,03984 8=0,0020 Б х =0,0008 Д Х=0,0021

->1 J,J\} б=±5,1 1%

Таким образом, в условиях разработанной методики возможно определение суммы 5-ГМФ и родственных ему соединений с относительной ошибкой ±5%.

Согласно НД 42-11519-01 в кетопрофене определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии родственные вещества и продукты деструкции, содержание которых допустимо не более 2,5%.

Ввиду отсутствия стандартных образцов веществ-свидетелей родственных соединений и продуктов деструкции для определения посторонних примесей в кетопрофене при его хранении, необходимо было изучить, в результате каких агрессивных факторов образуются примеси в кетопрофене, а также разработать методику их определения в присутствии глюкозамина сульфата.

Согласно работе Эпштейна Н.А. «Оценка пригодности (валидация) ВЭЖХ методик в фармацевтическом анализе (обзор)» (2004 г) возможность образования продуктов деструкции изучали: а) путем термического воздействия; б) действия 0,1 М раствора кислоты хлороводородной; в) хранения раствора кетопрофена в присутствии 3% раствора пероксида водорода. Все растворы выдерживали при температуре 60°С. Длительность разрушающего воздействия подбирали, учитывая, что продукты химической модификации должны быть отчетливо видны на хроматограмме и достаточно хорошо отделяться от пика основного вещества.

Полученные растворы анализировали методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в

разработанных ранее условия градиентного элюирования для обнаружения примеси 5-гидроксиметилфурфурола в глюкозамине, но при длине волны 255 нм, при которой на хроматограмме наблюдались наиболее интенсивные пики.

В результате проведенных исследований обнаружено (таблица 8), что больше всего примесей образуется в кетопрофене в присутствии пероксида водорода. В результате кислотного гидролиза содержание единичной примеси достигает 53%, что свидетельствует о значительном разрушении кетопрофена в кислой среде за одно и то же время наблюдения, по сравнению с другими агрессивными средами.

Таблица 8 - Результаты ВЗЖХ анализа продуктов химической модификации кетопрофена_

_ Фактор воздействия _

Нагревание при Нагревание при

Нагревание при температуре 60 С в температуре 60 С в

температуре 60 С присутствии пероксида присутствии кислоты

водорода хлороводородной

Время уд., мин Б, % Время уд., мин Время уд., мин

!7Л1 17,08 2,37 18 "М • \srww

19,21 0,61 17,26 1,85 19,26 6,52

20,01 0,83 18,34 3,78 20,07 8,4

21,94 0,6 19,25 4,82 21,37 0,8

25,31 0,7 19,65 0,54 25,85 53,13

25,81 1,49 20,05 9,75

28,79 0,51 22,85 0.64

24,51 0,55

25.77 4.50

28,86 3,61

Приведенные результаты показывают, что продукты деструкции, имеющие

время удерживания 19,2; 20,1 и 25,8 мин, образуются во всех трех случаях (таблица 8).

Для подтверждения возможности использования выбранных условий для определения предельных норм содержания примесей готовили 0,02% раствор кетопрофена в спирте этиловом 50% и подвергали термическому разложению (60° С) без добавления агрессивных сред до тех пор, пока на хроматограмме не обнаруживались дополнительные пики, сумма площадей которых не превышала 2.5% (ЪиСУНОК 31. Пои этом возможные ппимеси глюкочяминя не мпшягти определению, т.к. их время выхода находится в пределах от 1,5 до 10 мин.

250 0"

2000"

1500

1000-

12* 6 678 « '2Ш 15 16" 1«

Л «I III I

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 ин Рисунок 3 - Хроматограмма 0,02% раствора кетопрофена после термодеструкции

В результате оказалось, что разработанная методика чувствительна, так как она позволяет обнаруживать максимально допустимое суммарное содержание посторонних примесей в 0,02% спиртовом растворе кетопрофена, равное 2,5%.

С помощью разработанных методик были проанализированы таблетки кетопрофена с глюкозамина сульфатом, хранившиеся при 60°С в течение срока эквивалентного 5 годам хранения в естественных условиях и в течение 3 лет в естественных условиях. При этом посторонние примеси как кетопрофена, так и глюкозамина сульфата в лекарственном препарате не обнаружены.

В результате исследований по изучению стабильности глюкозамина сульфата и кетопрофена показано, что предлагаемые методики позволяют определять как примеси кетопрофена, так и глюкозамина. Однако, ввиду того, что примеси в глюкозамина сульфате образуются раньше чем в кетопрофене, для стандартизации таблеток по показателю «посторонние примеси» достаточно определять 5-ГМФ и родственные ему соединения.

Проведенные исследования позволили предложить следующие нормы качества таблеток кетопрофена с глюкозамина сульфатом (таблица 9).

Разработанные нормы качества включены в проект ФСП на таблетки кетопрофена по 0,05 г с глюкозамина сульфатом по 0,4 г и в ТУ на таблетки

«Флексипрофен», переданные на рассмотрение фирме ООО «ВИК - Здоровье животных».

Таблица 9 - Нормы качества таблеток кетопрофена с глюкозамина сульфатом

Показатели качества Методы и нормы качества

Описание Таблетки плоские с фаской и риской белого или слегка желтоватого цвета, допускается небольшая мраморность поверхности

Распадаемость Не более 15 мин

Подлинность 1. Кетопрофена 2. Глюкозамина сульфата Спектр извлечения из таблеток в области 220-350 нм должен иметь один максимум поглощения при 255±2 нм, совпадающий с максимумом раствора СО кетопрофена В УФ-свете (254 нм) соответствие положения пятен па лритаил уаммал иръиа^яиа п лыии^ипрьла Основание глюкозамина - реакция Эльсона-Моргана (розовое окрашивание) Сульфат-ион - с раствором бария хлорида (белый осадок) При проявлении 0,5% раствором нингидрина соответствие положения пятен на хроматограммах препарата и СО глюкозамина сульфата

Средняя масса таблеток и отклонения от средней массы 0,435±0,022 г; 0,465±0,023 г. Отклонение от средней массы не более ±5%.

Количественное определение: Кетопрофена Глюкозамина сульфата 0,02±0,0015 г; 0,05±0,0038 г (ВЭЖХ) 0,4±0,02 г (спектрофотометрия)

Однородность дозирования Содержание кетопрофена в одной таблетке должно отклоняться не более чем на ±15% от среднего содержания (ВЭЖХ)

Посторонние примеси глюкозамина сульфата Содержание 5-ГМФ и родственных ему соединений не должно превышать 0,05% в пересчете на субстанцию глюкозамина сульфата (ВЭЖХ)

Срок годности 3 года

Изучение фармакокинетических характеристик лекарственного препарата

Заключительным этапом исследований явилось изучение возможности определения содержания кетопрофена и глюкозамина сульфата в крови животных. Определение кетопрофена в образцах плазмы крови проводили методом ВЭЖХ в градиентном режиме: элюент - 2% муравьиная кислота, ацетонитрил (от 30% до

70% за 15 мин); колонка - РгопЮЗК 120 - 5 С Ар, 2,0 х 75 мм, зернистость - 5,0 мкм; длина волны - 254 нм; скорость потока - 100 мкл / мин; давление - 50,0; объем инжекции - 10,0 мкл. Для сравнительной оценки результатов определения кетопрофена в плазме использовали две методики: 1 - описанная для 1% раствора кетопрофена для инъекций; 2 - предложенная нами методика, заключающаяся в осаждении белков плазмы крови ацетонитрилом (таблица 10).

Сравнительный анализ двух методик показал, что кетопрофен хорошо отделяется от компонентов плазмы. Время выхода пика кетопрофена для обеих методик составило 9-11 мин.

Условия Методика 1 Методика 2

Взято на анализ 0,2 мл 0,4 мл

Растворитель 8,5 М уксусная кислота, хлороформ, спирт этиловый 95% Ацетонитрил

Прочие условия ГЭкетпякпия . —ь------,—, центрифугирование, испарение органического слоя Г Т^итпиг^гиппоаиг**» ----r^•^rJ ' "Г""""""

Время анализа 60 мин 30 мин

Как показывают проведенные исследования методика 1 более трудоемка, требует стадии экстракции и испарения органического растворителя (хлороформа) (таблица 10). Кроме того, относительная ошибка предлагаемой нами методики 2 меньше, чем методики 1 (таблица 11).

По предлагаемой методике было проведено определение кетопрофена в плазме крови животных. Для определения глюкозамина в крови использовали общепринятый метод Эльсона-Моргана.

Для изучения фармакокинетических характеристик ингредиентов разработанных таблеток эксперимент проводили на собаках. Животным перорально вместе с кормом вводили таблетки в дозе 3 мг/кг кетопрофена и 133 мг/кг глюкозамина сульфата. Пробы крови в количестве 4 мл отбирались у собак из бедренной вены через 0,5; 1; 2; 3; 4; 5 и 6 часов. К полученной после центрифугирования плазме крови для разрушения и осаждения белков прибавляли двойной объем ацетонитрила, тщательно перемешивали, центрифугировали и

фильтровали. Фильтрат вводили , в хроматограф и анализировали'в описанных вы условиях.

Таблица 11 - Результаты определения кетопрофена в плазме крови животн (опыт in vivo)____

Методика Площадь пика кетопрофена, А1Рмкл Найдено, мкг/мл Метрологические характеристики

10,338 12,42 Х=11,79 S=0,68149 S х = 0,27822 А х = 0,72 о ±6,07%

9,098 10,93

1 10,055 12,08

9,078 10,91

10,198 12,25

10,098 12,13

10,299 12,52 Х=13,05 S=0,60549 S х = 0,24719 Д х = 0,64 8 = ±4,87%

11 14 0 1 1,1 -то 14 «

2 10,244 12,45

11,203 13,62

11,216 13,63

10,300 12,52

По полученным данным были построены фармакококинетические крив кетопрофена и глюкозамина сульфата в плазме крови (рисунок 4).

Дчя изучения биодоступности таблеток кетопрофена с глюкозам сульфатом были рассчитаны следующие показатели: площадь под кри «концентрация - время» (AUC), общий клиренс (С1), константа элиминации ( кажущийся объём распределения (Vj) и среднее время удерживания (MRT) (табл 12).

Таблица 12 - Параметры кинетики кетопрофена и глюкозамина сульфат плазме крови после пероральяого введения лекарственного препарата

Параметры Кетопрофен Глюкозамина сульфат

Тпих (время достижения максимальной концентрации), ч 2,0 4,0

Ст„, мкг/мл 1,701 26,134

Vd (кажущийся объём распределения), л/кг 1,309 2,625

Iv/ (константа элиминации), час'1 0,479 0,446

С1 (общий клиренс), л/час/кг 0,612 1,171

MRT (среднее время удерживания), час 2,93 4,92

AUC(M, (площадь под фармакокинетической кривой), (мкг/мл)*час 5,48 113,89

Время, ч

б

Рисунок 4 - Фармакокннетические кривые кетопрофена (а) и глюкозамина

сульфата (б)

Как следует из представленных данных, концентрация кетопрофена достигает максимума через 2 ч, а глюкозамина сульфата - через 4 часа, что хорошо согласуется с данными литературы.

Обшис выводы

1. Проведенные фармакологические исследования подтвердили данные литературы и показали, что сочетание кетопрофена с глюкозамина сульфатом в предложенном лекарственном препарате проявляет ,, более высокую анальгетическую активность и снижает ульцерогенное действие кетопрофена по сравнению с его монотерапией.

2. Разработаны методики идентификации кетопрофена и глюкозамина сульфата в лекарственном препарате методами УФ-спектрофотометрии, и ТСХ. Для

количественного определения кетопрофена обосновано использование метода ВЭЖХ. В результате валидации установлено, что методика специфична, чувствительна, относительная ошибка определения не превышает ±1,17%.

3. Для количественного определения глюкозамина сульфата в лекарственном препарате предложен метод УФ-спектрофотометрии на основе реакции Эльсона-Моргана. Доказано, что методика валидна, относительная ошибка определения не превышает ±1,21%.

4. Изучено влияние температуры и агрессивных сред (0,1 М раствора кислоты хлороводородной, 3% раствора пероксида водорода) на возможность образования продуктов деструкции кетопрофена. Разработанная ВЭЖХ методика определения примесей кетопрофена чувствительна и позволяет обизру^й*п -т^ максимально допустимое суммарное содержание посторонних примесей равное 2,5%.

5. Обосновано использование хроматографической методики (ВЭЖХ) определения в присутствии кетопрофена продуктов деструкции глюкозамина сульфата (5-гидроксиметилфурфурола), установлено, что относительная ошибка определения не превышает ±5,11%. , ; :

6. Разработаны нормы качества таблеток кетопрофена.; с глюкозамина сульфатом. Установлено «методом ускоренного старения» и, хранения в естественных условиях, что срок годности лекарственного препарата составляет 3 года.

7. Для определения кетопрофена в биологических жидкостях использована методика, основанная на осаждении белков плазмы крови ацетонитрилом. В опытах на собаках показано, что концентрация кетопрофена в плазме крови животных достигает максимума через 2 ч, а глюкозамина сульфата - через 4 часа после однократного перорального приема лекарственного препарата.

Список публикаций по теме диссертации

1. Валидационная оценка методик количественного определения глюкозамина сульфата // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2006. - Вып. 61. - С. 240 - 241 (Соавт. А.Э. Дерхо, Д.В. Компанцев, О.Г. Струсовская).;; , .

2. Стандартизация таблеток на основе кетопрофена и глюкозамина,сульфата // Аграрная наука. - 2006. - №11. - С. 29- 32 (Соавт. Д.В. Компанцев, Е.В.

Компанцева, Б.В. Виолин, И.Н. Шаймухаметов).

3. Влияние глюкозамина сульфата на анальгетический и ульцерогенный эффекты кетопрофена // Экспериментальная и клиническая фармакология. -2007. - Т. 70, №3. - С. 53 - 55 (Соавт. Б.В. Виолин, Д.В. Компанцев, В.Е. Погорелый, JI.M. Макарова, Е.В. Компанцева).

4. Определение 5-гидроксиметилфурфурола и родственных ему соединений в таблетках, содержащих кетопрофен и глюкозамина сульфат // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. -Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2007. - Вып. 62. - С. 323 - 325 (Соавт. С.П. Сенченко, Е.В. Компанцева, Д.В. Компанцев).

5. Разработка методик контроля качества лекарственного препарата, содержащего кетопрофен и глюкозамина сульфат // От производителя до аптеки и потребителя: тез. докл. аптечного форума. - М., 2007. - С.82 - 83 (Соавт. Д.В. Компанцев).

6. Разработка технологии и исследование лекарственного препарата, содержащего кетопрофен и глюкозамин // От производителя до аптеки и потребителя: тез. докл. аптечного форума. - М., 2007,- С. 83 - 84 (Соавт. А.М. Шевченко, Д.В. Компанцев).

7. Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии для количественного определения кетопрофена в ветеринарном препарате // Аптека 2007: тез. докл. медико-фармац. конгресса 23 - 26 октября 2007 г. - М., 2007. - С. 140 - 141 (Соавт. Д.В. Компанцев, .П. Сенченко, Е.В. Компанцева).

8. Определение кетопрофена в ветеринарном препарате методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Аграрная наука. - 2007. -№11.- С.24 -26 (Соавт. Е.В. Компанцева, С.П. Сенченко, Д.В. Компанцев).

9. Определение посторонних примесей кетопрофена методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2008. - Вып. 63. - С.297 - 299.

Ю.Сравнительная оценка методик определения кетопрофена в плазме крови // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2009. - Вып. 64. - С.297 - 299.

ЛЕОНОВА ВИКТОРИЯ НОДАРЬЕВНА

ОБОСНОВАНИЕ СОСТАВА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА, СОДЕРЖАЩЕГО КЕТОПРОФЕН И ГЛЮКОЗАМИНА

СУЛЬФАТ

15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЁНОЙ СТЕПЕНИ

г г л тттттгп 1 'ч - 1 д * А ттг>пт»гтппггтпг Т I * 1 ттг

Г^ЛПДПДА 1 /V ФЛГ 1У1/\Цп,П 1 ПД У к

Подписано к печати5$€^009 г. Формат бумаги 60x84 1/16 Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ.л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №6?0

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (357532, г. Пятигорск, пр. Калинина. 11)

Актуальность темы. Заболевания опорно-двигательного аппарата представляют одну из важных проблем медицины. Согласно данным медицинской статистики у каждого второго жителя России уже к 20 годам появляется то или иное заболевание суставов. У лиц пожилого возраста старше-65 лет эти заболевания наблюдаются почти у 100%. Данная группа заболеваний включает около 100 нозологических форм и встречается во всех странах мира, в которых заболеваемость достигает от 20 до 45% населения (Ш.Ф. Эрдес, 2008 г).

Для лечения таких заболеваний используют различные фармакотерапевтические средства. Однако наиболее часто применяются симптоматические препараты, среди которых превалируют нестероидные противовоспалительные средства (НПВС). К таким лекарственным препаратам относится кетопрофен, который нашел широкое применение за рубежом в виде различных лекарственных форм. Следует отметить, что в Российской федерации лекарственные препараты кетопрофена не выпускаются и на российский фармацевтический рынок поступают из-за рубежа.

Анализ зарубежной и отечественной литературы показал, что при пероральном применении кетопрофена часто наблюдаются эрозивно-язвенные поражения слизистой оболочки желудка. Это является одной из причин, того что таблетки кетопрофена для перорального применения часто не рекомендуют больным с заболеваниями желудочно-кишечного тракта.

В то же время известно, что мукополисахариды и гликопротеиды эндогенного и экзогенного происхождения могут оказывать защитное действие на слизистую оболочку желудка и двенадцатиперстной кишки (Н.В. Чичасова, 2007 г). Исследованиями Зупанца И.А. (1991 г) и сотрудниками кафедры фармацевтической химии Пятигорской ГФА (2005 г) доказано, что глюкозамин снижает побочные действия НПВС, а также стимулирует процессы регенерации. Есть сведения об усилении фармакологической активности НПВС с помощью глюкозамина. Очевидно, что создание лекарственных средств, содержащих кетопрофен совместно с глюкозамином, позволит не только значительно снизить побочное действие кетопрофена, но и получить лекарственное средство с более высокой противовоспалительной активностью. Поэтому обоснование состава и стандартизация^лекарственного препарата, содержащего кетопрофен и глюкозамин, является актуальной проблемой для фармацевтической науки и практики.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилось обоснование состава и стандартизация нового отечественного таблетированного лекарственного препарата, содержащего кетопрофен и глюкозамина сульфат, позволяющего повысить анальгетическую активность и снизить ульцерогенное действие кетопрофена на фоне его совместного применения с глюкозамином.

Для достижения поставленной! цели необходимо решить следующие задачи:

- подтвердить специфическую активность кетопрофена с глюкозамина сульфатом при их совместном применении;

- разработать методики качественного и количественного анализа кетопрофена и глюкозамина, позволяющие определять их при совместном присутствии;

- разработать методики определения продуктов деструкции кетопрофена и глюкозамина при их совместном применении;

- изучить стабильность кетопрофена и глюкозамина при их совместном присутствии;

- обосновать нормы качества предлагаемого лекарственного препарата и установить сроки годности;

- определить фармакокинетические характеристики кетопрофена и глюкозамина сульфата в предлагаемом лекарственном препарате.

Научная новизна. Проведено экспериментальное изучение на лабораторных животных влияния глюкозамина сульфата на анальгетическую активность и ульцерогенное действие кетопрофена при курсовом применении в сравнении с монотерапией кетопрофена. Анализ результатов исследования позволяет утверждать, что комбинированное применение кетопрофена с глюкозамина сульфатом повышает анальгетическую активность кетопрофена в 1,5-2 раза и существенным образом ограничивает повреждение слизистой желудка, то есть может служить эффективным средством профилактики ульцерогенеза данного ыпвс.

Обоснован выбор методик для определения кетопрофена и глюкозамина сульфата при совместном присутствии. Для подтверждения подлинности и; количественного определения кетопрофена найдены оптимальные условия использования УФ-спектрофотометрического и ВЭЖХ методов. Обоснована возможность использования спирта этилового 95% вместо токсичного растворителя спирта метилового для спектрофотометрического определения кетопрофена в предлагаемом лекарственном препарате.

Показана возможность определения продуктов деструкции кетопрофена в присутствии глюкозамина сульфата с помощью метода ВЭЖХ.

Обоснованы оптимальные условия ВЭЖХ. определения примеси' в глюкозамине (5-гидроксиметил фурфурол а) в.присутствии кетопрофена.

В результате проведенных фармакокинетических исследований показано, что максимальная'-концентрация кетопрофена в плазме крови собак-наблюдается через 2 часа, глюкозамина» сульфата - через 4 часа после однократного перорального применения лекарственного препарата.

Практическая; значимость» результатов исследования. В- результате проведенных фармакологических исследований предложен состав нового лекарственного препарата болеутоляющего действия - Таблетки, кетопрофена по 0,05 г с глюкозамина сульфатом по 0,4 г и таблетки «Флексипрофен» для ветеринарии, содержащие кетопрофена 0,02 г, глюкозамина сульфата 0,4 г. На основании этих исследований на кафедре технологии лекарств Пятигорской ГФА предложена технология таблеток, содержащих кетопрофен 0,05 (0,02) г, глюкозамина сульфат 0;4 г и вспомогательные вещества: коллидон 25 - 0,005г; тальк 0;0075 г; кальция стеарат 0,0025 г.

Предложены способы идентификации и количественного определения кетопрофена и глюкозамина сульфата химическими и физико-химическими методами. Проведена валидационная оценка методик анализа, с помощью которой подтверждена правильность их выбора.

На основании разработанных методик были установлены нормы качества исследуемого лекарственного препарата и определена его. стабильность в> процессе хранения методом ускоренного старения. Срок годности составил 3 года. Полученные результаты исследований легли в основу разработки ФСП «Таблетки кетопрофена с глюкозамина сульфатом» и НД на лекарственный препарат «Флексипрофен» для использования в ветеринарной практике.

Внедрение результатов исследования в практику. Разработаны проект ФСП «Таблетки кетопрофена с глюкозамина сульфатом» и проект НД на лекарственный препарат «Флексипрофен», который совместно с; ООО «ВИК — Здоровье животных» направлен для регистрации в, Федеральную? службу по: надзору в: сфере здравоохранения и социального развития.

Материалы, проекта ФСП «Таблетки кетопрофена по 0,05 г с глюкозамина сульфатом по 0,4 г»■ использованы в учебном процессе кафедры фармацевтической® химии ПятГФА (акт внедрения от 08.05.09 г). .

Связь задач исследования; с проблемным планом фармацевтических наук; Работа выполнена в соответствии с планом: НИР4 FOY ВПО «Пятигорская? ГФА Росздрава», номер государственной регистрации 01200101061.

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Сочетание кетопрофена: с. глюкозамина сульфатом: повышает анальгетическую активность и значительно снижает ульцерогенное действие кетопрофена.

2. Метод УФ-спектрофотометрии позволяет проводить идентификацию и: количественное определение кетопрофена в присутствии глюкозамина: сульфата в исследуемых лекарственных препаратах с относительной ошибкой ±1,17%.

3: Разработанные условия- анализа методом ВЭЖХ можно использовать для качественного и количественного определениям кетопрофена в. присутствии глюкозамина сульфата.

4. Метод Эльсона - Моргана позволяет идентифицировать и количественно определять глюкозамина сульфат в присутствии кетопрофена.

5. Разработанные методики определения посторонних примесей кетопрофена и глкжозамина сульфата позволили установить срок годности предложенного лекарственного средства - 3 года.

5. Максимальная концентрация кетопрофена в плазме крови обнаруживается через 2 ч, глюкозамина сульфата — через 4 ч после однократного перорального введения исследуемого лекарственного препарата.

Апробация и публикация результатов исследования. Основные результаты диссертационной работы были доложены и обсуждались на ежегодных научных конференциях Пятигорской государственной фармацевтической академии в 20062009 гг.

По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе две работы в журналах, рекомендуемых ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 140 страницах машинописного текста, содержит 32 таблицы и 26 рисунков, состоит из «Введения», «Обзора литературы», 4 глав экспериментальных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 142 источника, из них 42 на иностранных языках.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведенные фармакологические исследования подтвердили данные литературы и показали, что сочетание кетопрофена с глюкозамина сульфатом в предложенном лекарственном препарате проявляет более высокую анальгетическую активность и снижает ульцерогенное действие кетопрофена по сравнению с его монотерапией.

2. Разработаны методики идентификации кетопрофена и глюкозамина сульфата в лекарственном препарате методами УФ-спектрофотометрии и ТСХ. Для количественного определения кетопрофена обосновано использование метода ВЭЖХ. В результате валидации установлено, что методика специфична, чувствительна, относительная ошибка определения не превышает ±1,17%.

3. Для количественного определения* глюкозамина сульфата вг лекарственном препарате предложен метод УФ-спектрофотометрии на основе реакции Эльсона-Моргана. Доказано, что методика валидна, относительная< ошибка определения не превышает ±1,21%.

4. Изучено влияние температуры и агрессивных сред (ОД М? раствора кислоты хлороводородной, 3% раствора' пероксида' водорода)- на возможность образования продуктов деструкции кетопрофена. Разработанная ВЭЖХ методика определения примесей кетопрофена чувствительна и позволяет обнаруживать максимально допустимое суммарное содержание посторонних примесей равное 2,5%.

51 Обосновано использование хроматографической методики (ВЭЖХ) определения в присутствии кетопрофена продуктов деструкции глюкозамина сульфата (5-гидроксиметилфурфурола), установлено, что относительная ошибка определения не превышает ±5,11%.

6. Разработаны нормы качества таблеток кетопрофена с глюкозамина сульфатом. Установлено «методом ускоренного старения» и хранения в естественных условиях, что срок годности лекарственного препарата составляет 3 года.

7. Для определения кетопрофена в биологических жидкостях использована методика, основанная на осаждении белков плазмы крови ацетонитрилом. В опытах на собаках показано, что концентрация кетопрофена в плазме крови животных достигает максимума через 2 ч, а глюкозамина сульфата — через 4 часа после однократного перорального приема лекарственного препарата.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ

Анализ литературных данных показал, что в настоящее время для лечения OA используют НПВС и препараты' структурно-модифицирующего действия. Среди широкого ассортимента НПВС большой интерес для медицины представляет кетопрофен, обладающий высокой анальгетической активностью, жаропонижающим и противовоспалительным действием. Однако, как и все НПВС, данное лекарственное вещество обладает рядом нежелательных побочных эффектов (ульцерогенез, агрегация тробоцитов и т.д.). Определенный интерес представляют проведенные американскими учеными фармакологические исследования комбинаций глюкозамина с кетопрофеном в определенных дозировках, нами не встречено подобное сочетание в отечественных композициях. Имеются экспериментальные данные о том, что глюкозамина- сульфат потенцирует действие многих НПВС, а- также обладает гастропротекторным действием. На основании этого, можно предположить, что совместное применение с кетопрофеном аминосахара глюкозамина позволит повысить безопасность курсового применения* кетопрофена.

Для анализа кетопрофена, глюкозамина сульфата и их продуктов деструкции используются химические и физико-химические методы; которые можно использовать для разработки методик стандартизации таблеток кетопрофена с глюкозамина сульфатом. Кроме того, в литературе отсутствуют данные по анализу лекарственных веществ при их совместном присутствии.

ГЛАВА 2 ОБОСНОВАНИЕ СОСТАВА ТАБЛЕТОК КЕТОПРОФЕНА С ГЛЮКОЗАМИНА СУЛЬФАТОМ И ОЦЕНКА ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА 2.1S Фармакологическоеобоснование состава

Исследования проведены в ПятГФА. на кафедре фармакологии и фармакотерапии при консультации проф., д. биол. наук В.Е. Погорелого и совместно с канд. фармацевт, наук Л.М. Макаровой на мелких лабораторных животных — крысах-самцах, линии «Вистар» (m=180—i200 г), прошедших карантин 14 дней. Методом случайной выборки формировали группы лабораторных животных: 1 группа - контрольные животные; 2 группа — животные, которым;; вводили кетопрофен; 3 группа - животные, которым вводили кетопрофен и глюкозамин. В каждой группе находилось по 10 животных.

Кетопрофен изучали в дозах 16, 24 и 32 мг/кг, а изучаемая доза глюкозамина сульфата (ГА) составляла: 125 мг/кг. Вышеперечисленные: дозы определены расчетным путем с учетом литературных данных об эффективных терапевтических, дозах объектов исследования и коэффициента пересчета дозы с человека на крысу |}121]:, Объекты исследованияшводили в фиксированное, время; суток. В!контрольных; опытах животным вводили физиологический раствор, объем, которого был эквивалентным количеству, вводимому в опытных группах. Учитывая, что объекты исследования: в дальнейшем будут использоваться перорально, в эксперименте был выбран данный путь введения.

В течение 10 часов животных перед введением объектов исследования содержали на голоде, но не . ограничивали потребление воды. По истечении-указанного времени крысам внутрижелудочно вводили объекты исследования из расчета 0,8 мл на 100 г массы тела животного. ГА животным вводили перорально одновременно с введением: кетопрофена. Учитывая, что кетопрофен плохо растворим в воде и является крупнодисперсным порошком, что делало невозможным его введение через зонд, объекты исследования вводили путем добавления в водный раствор 0,2 мл твина-80.

Изучение анальгетического действия объектов исследования проводили на различных видах болевого раздражения — химическом, механическом, термическом. Анальгетическое действие при химической альгезии изучали на модели «уксусных корчей», которые вызывали однократным внутрибрюшинным введением 1 мл 1% уксусной кислоты и подсчитывали в течение 15 минут количество «корчей» для» каждого животного. За 30 мин до введения уксусной кислоты, животным вводили объекты исследования [121, 122, 123]. Оценку анальгезии проводили по уменьшению числа болевых реакций — «корчей». При термическом раздражении анальгетические свойства объектов исследования изучали путем определения порога болевой чувствительности (ПБЧ) по методике «горячая пластинка» [122, 123]. Регистрацию» времени наступления поведенческих реакций проводили спустя 30 мин после введения объектов исследования. При оценке влияния объектов исследования на болевую реакцию, вызванную электрическим током, использовали метод электрическое раздражение кожи хвоста крысы и определяли порог ноцицептивной реакции (мВ) по писку («вокализации») животного [122, 123]. 1

Учет эффективности гастропротекторного действия препарата производили, спустя 14 дней после первого введения объектов исследования. Для этого животных умерщвляли под эфирным наркозом. Желудок извлекали, разрезали по большой кривизне и изучали выраженность ульцерогенного повреждения. Оценку ульцерогенного действия кетопрофена проводили по бальной шкале [122, 123]. В процессе наблюдения за животными оценивали также их общее состояние (поведенческие, нервно-мышечные и вегетативные реакции). Кроме того, вычисляли язвенный индекс (условные единицы). Для этого определяли процент животных, у которых образовывались язвы, тяжесть язв оценивали по балльной системе, вычисляли число язв на одну крысу, а затем проводили сложение полученных показателей [122, 123]. Язвенный индекс (см) вычисляли путем определения площади язвенного дефекта (см ) [122, 123].

Для обработки результатов экспериментов использовали статистические методы с нахождением средней арифметической (М), средней ошибки средней арифметической (ш) и вероятности ошибки по таблицам Стьюдента. Достоверность различий двух совокупностей оценивали по критерию t [124].

Результаты изучения анальгетического действия кетопрофена и его комбинаций с глюкозамина сульфатом при химической альгезии представлены в таблице 1.