Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Фармакологические свойства и радиобиологические эффекты линейных и циклических производных изотиомочевины - конкурентных ингибиторов синтаз оксида азота

На правах рукописи

Филимонова Марина Владимировна

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И РАДИОБИОЛОГИЧЕСКИЕ

ЭФФЕКТЫ ЛИНЕЙНЫХ И ЦИКЛИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДНЫХ ИЗОТИОМОЧЕВИНЫ - КОНКУРЕНТНЫХ ИНГИБИТОРОВ СИНТАЗ

ОКСИДА АЗОТА

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология 03.01.01 - радиобиология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

11 НОЯ 2015

Обнинск - 2015

005564417

Работа выполнена в Медицинском радиологическом научном центре им. А.Ф. Цыба -филиале Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный медицинский исследовательский центр им. П.А. Герцена» Министерства здравоохранения Российской Федерации (с 09.02.2015 организация переименована в Медицинский радиологический научный центр им. А.Ф. Цыба - филиал Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский радиологический центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации (МРНЦ им. А.Ф.Цыба-филиал ФГБУ «НМТРЦ» Минздрава России))

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Арзамасцев Евгений Вениаминович

доктор медицинских наук Жаворонков Леонид Петрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, руководитель Центра доклинических испытаний, заведующий лабораторией фармаколопни ФГБУН «Институт физиологически

активных веществ» РАН Кинзирский Александр Сергеевич

доктор медицинских наук, профессор, ректор Института ДПО «Экстремальная медицина» ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени

A.M. Никифорова» МЧС России Гребенкж Александр Николаевич

доктор биологических наук, заведующий лабораторией радиационной биофизики ФГБУ «ГНЦ РФ -Федеральный медицинский биофизический

центр им. А.И. Бурназяна» ФМБА России Осипов Андриян Николаевич

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И.Пирогова» Минздрава России

диссертационного совета Д 001.024.01 на базе ФГЪНУ «НИИ фармакологии имени В.В.Закусова» по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ученой части ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д.8 и на сайте www.academpharm.ru.

Автореферат разослан " С^С^Л^/г-^2(ц 5 года

Защита диссертации состоится

на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Вальдман Елена Артуровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Наличие оксида азота (NO) в биологических тканях было описано ещё в первой половине века. Но только спустя 150 лет, когда было установлено, что эндогенный NO является фактором релаксации сосудов (Furchgott, R.F., Zawadzki J.V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine // Nature. - 1980. - Vol.288, N.5789. - P.373-376; Palmer R.M, Ferrige A.G., Moncada S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor // Nature. - 1987. - Vol.327, N.6122. -P.524-526.), присутствует в активированных макрофагах (Stuehr D.J., Kwon N.S., Gross S.S. et al. Synthesis of nitrogen oxides from L-arginine by macrophage cytosol: requirement for inducible and constitutive components // Biochem. Biophys. Res. Common. - 1989. -Vol.161, N.2. - P.420-426.) и тканях мозга (Garthwaite J. New insight into the functioning of nitric oxide-receptive guanylyl cyclase: physiological and pharmacological implications // Mol. Cell Biochem. - 2010. - Vol.334, N.l-2. - P.221-23.), оксид азота привлёк большое внимание специалистов в различных областях биологии и медицины.

Объём научных данных о биологической роли NO, накопленный к настоящему времени, столь велик, что затруднительно осознать даже общую картину, создаваемую ими. Оксид азота участвует в регуляции тонуса сосудов и адгезии клеток крови, сократимости миокарда и скелетных мышц, тонуса бронхов и моторики ЖКТ, модулирует процессы ангиогенеза и регенерации, является медиатором многих видов чувствительности и участвует в процессах высшей нервной деятельности, регулирует митохондриальную активность и редокс-гомеостаз, является эффектором иммунных реакций (Taylor С.Т., Moncada S. Nitric oxide, cytochrome С oxidase, and the cellular response to hypoxia // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. - 2010. - Vol.30, N.4. -P.643-647; Forstermann U., Sessa W.C. Nitric oxide synthases: regulation and function // Eur. Heart J. - 2012. - Vol.33, N.7. - P.829-837; Vincent S.R. Nitric oxide neurons and neurotransmission // Prog. Neurobiol. - 2010. - Vol.90, N.2. - P.246-255; Niu X., Watts V.L., Cingolani O.H. et al. Cardioprotective effect of beta-3 adrenergic receptor agonism: role of neuronal nitric oxide synthase // J. Am. Coll. Cardiol. - 2012. - Vol.59, N.22. -P.1979-1987; Tang L., Wang H., Ziolo M.T. Targeting NOS as a therapeutic approach for heart failure // Pharmacol. Ther. - 2014. - Vol.142, N.3. - P.306-315.). Эти знания расширили представления о механизмах многих физиологических и патологических процессов, и создали основу для развития новых подходов к лечению ряда заболеваний и патологических состояний путём модификации эндогенного синтеза оксида азота.

Однако, если фармакологические средства, стимулирующие продукцию оксида азота - химические доноры NO, вошли в клиническую практику задолго до открытия биологической роли оксида азота (в частности, нитроглицерин применяется при лечении стенокардии уже около 150 лет (Brunton T.L. On the use of nitrite of amyl in angina pectoris // Lancet. - 1867. - N.2. - P.97-98.), то становление фармакологических средств, подавляющих продукцию NO - ингибиторов синтаз оксида азота (NOS), происходит только в последние десятилетия.

Данные многих исследований свидетельствуют о том, что ингибиторы NOS могут иметь практическое значение в лечении патологических состояний, протекающих с избыточной продукцией NO (сепсис, эндотоксемии, воспалительные и дегенеративные заболевания) и способны проявлять широкий спектр фармакологических свойств - оказывать вазопрессорное, кардио- и нейрозащитное,

противовоспалительное действие (Hernandez G., Bruhn A., Ince C. Microcirculation in sepsis: new persprctives // Curr. Vase. Pharmacol. - 2013. - Vol.11, N.2. - P. 161-169; Moncada S., Bolanos J.P. Nitric oxide, cell bioenergetics and neurodegeneration // J. Neurochem. - 2006. - Vol.97, N.6. - P.1676-1689; Calcerrada P., Peluffo G„ Radi R. Nitric oxide-derived oxidants with a focus on peroxynitrite: molecular targets, cellular responses and therapeutic implications // Curr. Pharm. Des. - 2011. - Vol.17, N.35. - P.3905-3932; Rochette L., Lorin J., Zeller M. et al. Nitric oxide synthase inhibition and oxidative stress in cardiovascular diseases: possible therapeutic targets? // Pharmacol. Ther. - 2013. - Vol.140, N.3. - P.239-257; Omar S.A., Webb A.G. Nitrite reduction and cardiovascular protection // J. Mol. Cell Cardiol. - 2014. - Vol.73. - P.57-69; Leiper J., Nandi M. The therapeutic potential of targeting endogenous inhibitors of nitric oxide synthesis // Nat. Rev. Drug Discov. - 2011. - Vol.10, N.4. - P.277-291.). Вместе с тем, несмотря на большие усилия, разработка NOS-ингибирующих фармакологических средств пока не получила удовлетворительного воплощения - в настоящее время известно более 600 различных соединений, способных подавлять активность NOS, но на стадию клинических испытаний смогли выйти лишь единицы из них.

Препятствия для клинического применения ингибиторов NOS связаны не только с их токсическими и фармакокинетическими свойствами. В значительной мере они обусловлены сложностью самой организации эндогенного синтеза NO. В тканях организма оксид азота продуцируется семейством изоформ NOS, которые существенно отличаются участием в различных процессах (Dudzinski D.M., Michel Т. Life history of eNOS: Partners and pathway // Cardiovasc. Res. - 2007. - Vol.75, N.2. -P.247-260; Villanueva C., Giulivi C. Subcellular and cellular locations of nitric-oxide synthase isoforms as determinants of health and disease // Free Radic. Biol. Med. - 2010. -Vol.49, N.3. - P.307-316; Ramadoss J., Pastore M.B., Magness R.R. Endothelial caveolar subcellular domain regulation of endothelial nitric oxide synthase // Clim. Exp. Pharmacol. Physiol. - 2013. - V.40, N.ll. - P.753-764.). И в этой связи практический интерес представляют, в первую очередь, соединения, избирательно ингибирующие изоформы NOS. Однако значимый уровень селективности проявляет не более 3-5% известных ингибиторов NOS.

Важным фактором также является механизм ингибирующего действия. Большинство известных ингибиторов NOS (или их метаболиты) частично или в полной мере необратимо инактивируют эти ферменты (Wolff D.J., Lubeskie А. Inactivation of nitric oxide synthase isofoms by diaminoguanidine and NG-amino-L-arginine // Arch. Biochem. Biophys. - 1996. - Vol.325, N.2. - P.227-234; Li H., Poulos T.L. Structure-function studies on nitric oxide synthases // J. Inorg. Biochem. - 2005. -Vol.99, N.l. — P.293-305; Lee K.S., Lee D.K., Jeoung D. et al. Differential effects of substrate-analogue inhibitors on nitric oxide synthase dimerization // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2012. - Vol.418, N.l. - P.49-55.). Между тем, необратимое подавление активности NOS является далеко не всегда целесообразным и безопасным. По этой причине многие известные ингибиторы NOS, в том числе и селективные, остаются удобными инструментами исследований, но возможность их клинического применения представляется сомнительной (Alderton W.K., Cooper С.Е., Knowles R.G. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition // Biochem. J. - 2001. - Vol.357, Pt.3. - P.593-615; Zhu Y., Nikolic D., Van Breemen R.B. et al. Mechanism of inactivation of inducible nitric oxide synthase by amidines. Irreversible enzyme inactivation without inactivator modification // J. Am. Chem. Soc. - 2005. - Vol.127, N.3. - P.858-868; Viteceek J., Lojek A., Valacchi G. et al. Arginin-based inhibitors of nitric oxide synthase:

therapeutic potential and challenges // Mediators Inflamm. - 2012. - Vol.2012. - Art.lD: 318087.).

При таких обстоятельствах перспективными могут оказаться селективные ингибиторы NOS с обратимым, субстрат-конкурентным действием. В связи с поиском химических соединений, обладающих такими свойствами, привлекают внимание линейные и циклические производные изотиомочевины (ИТМ), имеющие в своей молекулярной структуре тиоамидиновый фрагмент RrNH-C(SR2)=NR3, изостеричный гуанидиновой группе L-аргинина. Тиоамидиновый фрагмент, выполняя роль псевдосубстрата, может позволить таким соединениям конкурировать за активный центр NOS, что подтверждает наличие в ряду S-алкил-ИТМ чрезвычайно активных, неселективных ингибиторов NOS, являющихся в полной мере обратимыми, конкурентными ингибиторами (Garvey Е.Р., Oplinger J.A., Tanoury G.J. et al. Potent and selective inhibition of human nitric oxide synthases. Inhibition by non-amino acid isothioureas // J. Biol. Chem. - 1994. - Vol.269, N.43. - P.26669-26676; Wolff D.J., Gauld D.S., Neulander M.J. et al Inactivation of nitric oxide synthase by substituted aminoguanidines and aminoisothioureas // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 1997. - V.283, N.l. -P.265-273.).

Для поиска селективных ингибиторов NOS в этой области может представлять интерес мало изученный класс N,S-3aMeu№HHbix ИТМ - результаты единичных работ в этой области свидетельствуют, что строение N-замещающего радикала может оказывать существенное влияние на селективность соединений к изоформам NOS (Shearer B.G., Lee S., Oplinger J.A. et al. Substituted N-phenylisothioureas: potent inhibitors of human nitric oxide synthase with neuronal isoform selectivity// J. Med. Chem.

- 1997. - Vol.40, N.12. - P.1901-1905; Проскуряков С.Я., Кучеренко Н.Г., Тришкина А.И. и др. NO-ингибирующая и вазотропная активность некоторых соединений, содержащих тиоамидиновую группу // Бюлл. экспер. биол. мед. - 2002. - Т. 134, №. 10.

- С.393-396.).

Наряду с проблемами поиска приемлемых ингибиторов NOS остаются отрытыми и многие вопросы, связанные с их биологической активностью. Фармакологическим эффектом ингибиторов NOS, механизм которого на сегодня наиболее изучен, является вазопрессорное действие. Ожидается, что ингибиторы NOS могут иметь преимущества в сравнении с имеющимися вазопрессорами - большую длительность действия, отсутствие побочных эффектов, характерных для адреномиметиков, способность повышать тонус сосудов при резистентных вазоплегиях, что может позволить им занять важное место при лечении критических состояний и при оказании неотложной, экстренной помощи (Hernandez G., Bruhn A., Ince С. Microcirculation in sepsis: new persprctives // Curr. Vase. Pharmacol. - 2013. - Vol.11, N.2. - P.161-169; Cauwels A. Nitric oxide in shock // Kidney Int. - 2007. - Vol.72, N.5. -P.557-565; Andrades M.E., Morina A., Spasic S. et al. Bench-to-bedside review: sepsis -from the redox point of view // Crit. Care. - 2011. - Vol.15, N.5. - P.230-241.). Однако гемодинамические эффекты ингибиторов NOS на моделях различных состояний и в клинических наблюдениях нередко носят противоречивый характер (Gamboa А., Shibao С., Diedrich A. et al. Contribution of endothelial nitric oxide to blood pressure in humans // Hypertension. - 2007. - Vol.49, N.l. - P.170-177; Wecht, J.M., Weir J.P., Goldstein D.S., et al. Direct and reflexive effects of nitric oxide synthase inhibition on blood pressure // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. - 2008. - Vol.294, N.l. - P.H190-H197; Juffermans N.P., Vervloet M.G, Daemen-Gubbels C.R. A dose-finding study of methylene blue to inhibit nitric oxide actions in the hemodynamics of human septic shock II Nitric

Oxide. - 2010. - Vol.22, N.4. - P.275-280.). Это свидетельствует о необходимости детального изучения вазоактивных свойств ингибиторов NOS, поскольку неоднозначная трактовка и недооценка эффектов препятствуют внедрению таких средств в клиническую практику (Bailev A., Pope T.W., Moore S.A. et al The tragedy of TRIUMPH for nitric oxide synthesis inhibition in cardiogenic shock: where do we go from here? // Am. J. Cardiovasc. Drugs. - 2007. - Vol.7, N.5. - P.337-345; Viteceek J., Lojek A., Valacchi G. et al. J. Arginin-based inhibitors of nitric oxide synthase: therapeutic potential and challenges // Mediators Inflamm. - 2012. - Vol.2012. - Art.ID: 318087.).

Менее изученной остаётся противолучевая активность ингибиторов NOS, хотя их способность к радиозащитному действию была показана более 20 лет назад (Liebmann J., DeLica A.M., Ciffin D. et al. In vivo radiation protection by nitric oxide modulation // Cancer Res. - 1994. - Vol.54, N.13. - P.3365-3368.). Рост клинической потребности в эффективных противолучевых средствах в настоящее время обусловлен неуклонным расширением применения методов радиационной медицины в лечении онкологических заболеваний (Цыб А.Ф., Будагов Р.С., Замулаева И.А. и др Радиация и патология: учебное пособие / под общ. ред. А.Ф. Цыба. - М.: Высшая школа, 2005. -341 е.; Иванов В.К., Цыб А.Ф., Метлер Ф.А. Радиационные риски медицинского облучения // Радиация и риск. - 2011. - Т.20, №.2. - С. 17-29; Prasanna P.G., Stone Н.В., Wong R.S. et al. Normal tissue protection for improving radiotherapy: Where are the Gaps? // Transl. Cancer Res. - 2012. - Vol.1, N.l. - P.35-48; Maier P., Wenz F„ Herskind C. Radioprotection of normal tissue cells // Strahlenther. Oncol. - 2014. - Vol.190, N.8. -P.745-752.). На сегодняшний день известно значительное число различных соединений, обладающих противолучевым действием (Владимиров В.Г., Красильников И.И., Арапов О.В.. Радиопротекторы: Структура и функция / Киев: Наукова думка, 1989. - 258 е.; Hosseinimehr S.J. Foundation review: Trends in the development of radioprotective agents // Drugs Discov. Today. - 2007. - Vol.12, N.19/20. -P.794-805; Васин M.B. Противолучевые лекарственные средства (учебная монография) / М.: Изд-во Российской медицинской академии последипломного образования, 2010. - 180 е.; Ильин JI.A., Ушаков И.Б., Васин М.В. Противолучевые средства в системе радиационной защиты персонала и населения при радиационных авариях // Мед. радиол, радиац. безоп. - 2012. - Т.57, №.3. - С.26-31.). Однако, плохая переносимость и токсичность этих радиопротекторов в эффективных дозах затрудняют их применение в онкологической практике - по существу, единственным допущенным к клиническому применению для профилактики осложнений радио- и химиотерапии является, разработанный в США, аминотиоловый радиопротектор амифостин (Kouvaris J.R., Kouloulias V.E., Vlahos L.J. Amifostine: the first selective-target and broad-spectrum radioprotector // Oncologist. - 2007. - Vol.12, N.6. - P.738-747; Hensley M.L., Hagerty K.L., Kewalramani T. et al. American Society of Clinical Oncology 2008 clinical practice guideline update: use of chemotherapy and radiation therapy protectants // J. Clin. Oncol. - 2009. - Vol.27, N.l. - P.127-145.). В этой связи изучение механизмов противолучевого действия ингибиторов NOS и их особенностей фармакодинамического взаимодействия с радиопротекторами различных классов может явиться основой для разработки эффективных, приемлемых для лучевой терапии радиомодифицирующих средств (Bourgier С., Levy A., Vozenin М.С. et al Pharmacological strategies to spare normal tissues from radiation damage: useless or overlooked therapeutics? // Cancer Metastasis Rev. - 2012. - Vol.31, N.3-4. - P.699-712; Рождественский JI.M. Актуальные вопросы поиска и исследования противолучевых средств II Радиац. биол. Радиоэкол. - 2013. - Т.53, №.5. - С.513-520; Fahl W.E. Effect

of topical vasoconstrictor exposure upon tumorocidal radiotherapy // Int. J. Cencer. - 2014. - Vol.135, N.4.-P.981-989.).

He меньший интерес представляет также изучение антиангиогенного и противоопухолевого действия ингибиторов NOS. Клинический опыт применения ангиостатиков свидетельствует, что такие средства подавляют рост и метастазирование новообразований, повышают эффективность радио- и химиотерапии (Willett C.G., Duda D.G., di Tomaso E. et al. Complete pathological response to bevacizumab and chemoradiation in advanced rectal cancer // Nat. Clin. Pract. Oncol. - 2007. - Vol.4, N.5. - P.316-321; Schmidt В., Lee H.J., Ryeom S. Combining Bevacizumab with radiation or chemoradiation for solid tumors: A review of the scientific rationale, and clinical trials // Curr. Angiogenes. 2012. - Vol.1, N.3. - P. 169-179; Корчагина A.A., Шеин О.И., Турина В.П., Чехонин В.П. Роль рецепторов VEGFR в неопластическом ангиогенезе и перспективы терапии опухолей мозга // Вестник РАМН. - 2013. - № 11. - С.104-114.). В то же время, в клинической практике и в экспериментальных исследованиях влияние VEGF-специфических и мультикиназных ингибиторов, как правило, прогрессивно ослабевает вследствие развития резистентности опухоли к таргетным препаратам через активацию альтернативных ангиогенных путей и усиление промиграционного фенотипа некоторых неоплазий (Maity A., Bernhard E.J. Modulating tumor vasculature through signaling inhibition to improve cytotoxic therapy // Cancer Res. - 2010. - Vol.70, N 6. - P.2141-2145; Plate K.H., Scholz A., Dumont D.J. Tumor angiogenesis and anti-angiogenic therapy in malignant gliomas revisited // Acta Neuropathol. - 2012. - Vol.124, N.6. - P.763-775.).

Вместе с тем, данные о механизмах регуляции ангиогенеза позволяют рассматривать стойкое повышение синтеза NO в эндотелиоцитах и последующие NO-зависимые процессы как общие звенья в путях действия основных факторов опухолевого ангиогенеза (Isenberg J.S., Martin-Manso G., Maxhimer J.B. et al. Regulation of nitric oxide signaling by thrombospondin-1: implications for anti-angiogenic therapies II Nat. Rev. Cancer. - 2009. - Vol.9, N.3. - P.182-194; Miller T.W., Isenberg J.S., Roberts D.D. Molecular regulation of tumor angiogenesis and perfusion via redox signaling // Chem. Rev. - 2009. - Vol.109, N.7. - P.3099-3124; Cheng H„ Wang L„ Mollica M. Nitric oxide in cancer metastasis // Cancer Lett. - 2014. - Vol.352, N.l. - P.l-7.) и неспецифическое антиваскулогенное влияние на опухоль можно ожидать при подавлении синтеза оксида азота. В этой связи химические ингибиторы NOS могут стать эффективными адъювантами, способными расширить возможности существующих методов лечения злокачественных новообразований.

Сложности разработки лекарственных средств с NOS-ингибирующим действием и множественность нерешённых вопросов их фармакологии определили комплексный характер данной работы, которая предусматривала сочетание аналитических и экспериментальных исследований по поиску конкурентных ингибиторов NOS с изучением зависимости биохимической активности веществ от их химического строения и изучением особенностей их фармакологических свойств.

Цель исследования: поиск в ряду линейных и циклических N,S-'3aMeineinn,ix производных изотиомочевины эффективных конкурентных ингибиторов синтаз оксида азота, изучение особенностей их NOS-ингибирующей активности и ряда фармакологических свойств - вазопрессорного, радиомодифицирущего и противоопухолевого эффектов.

Задачи исследования:

1. Провести анализ особенностей химического строения производных ИТМ, определяющих их NOS-ингибирующие свойства. Осуществить направленный синтез ряда новых, оригинальных Ы^-замещённых изотиомочевин, потенциально способных к конкурентному ингибированию NOS.

2. Изучить in vitro способности полученных соединений к подавлению каталитической активности изоформ NOS, оценить селективность и обратимость ингибирования. Оценить показатели острой токсичности, дозовые и временные параметры NOS-ингибирующего действия in vivo. Выделить наиболее перспективные соединения для фармакологических исследований.

3. Изучить влияние отобранных соединений на гемодинамику интактных животных. Оценить их вазопрессорную активность на экспериментальных моделях различных гипотонических состояний.

4. Провести анализ взаимосвязи радиозащитной и NOS-ингибирующей активности производных ИТМ. Получить экспериментальные оценки показателей противолучевой активности изучаемых соединений по выживаемости подопытных животных и клоногенных гемопоэтических клеток при воздействии у-излучения. Изучить эффективность комбинированного действия производных ИТМ с известными радиопротекторами. Оценить их радиомодифицирующие способности на моделях лучевой терапии опухолей.

5. Изучить влияние отобранных соединений на рост и метастазирование карциномы лёгких Льюис и механизмы их противоопухолевого и антиметастатического действия. Оценить их противоопухолевую эффективность в комбинации с ангиостатическими препаратами, радио- и химиотерапией.

Научная новизна. Экспериментальным путём выявлены особенности молекулярной структуры N,S-3aMeiuëHiibix ИТМ, определяющих их способность к конкурентному ингибированию NO-синтаз. Установлено влияние N-замещающего радикала на селективность таких соединений к изоформам NOS. Впервые показано, что N-замещающие изобутаноил, циклобутанкарбонил и циклогексанкарбонил повышают селективность N,S-3aMeiuëHHbix ИТМ к ингибированию eNOS и iNOS, что позволяет рассматривать эти соединения как перспективную основу для создания NOS-ингибирующих фармакологических средств, действие которых затрагивает, в первую очередь, сосудистый гомеостаз.

Впервые показано, что изучаемые N,S-3aMeuiëHHbie ИТМ, обладающие высокой NOS-ингибирующей активностью, в низких нетоксических дозах вызывают выраженное повышение сосудистого тонуса, которое сопровождается длительным гипертензивным эффектом при различных гипотониях, в том числе, резистентных к действию существующих вазопрессорных лекарственных средств.

Впервые исследована взаимосвязь NOS-ингибирующей и противолучевой активности S- и N,S-3aMeHiëHHbix ИТМ. Установлено, что основным механизмом их противолучевого действия является индукция гипоксии. Экспериментально показано, что активные ингибиторы NOS из класса К8-замещённых ИТМ способны оказывать эффективное противолучевое действие в менее токсических дозах, чем аминотиоловые радиопротекторы. Впервые выявлено выраженное фармакодинамическое взаимодействие ингибиторов NOS с существующими противолучевыми средствами различных классов. Показана способность

исследованных N,S-3aMeiuënnbix ИТМ значительно повышать противолучевую эффективность существующих серотонин- и адренергических радиопротекторов.

Впервые экспериментально показано, что гипоксический механизм противолучевого действия исследованных Ы^-замещённых ИТМ способен обеспечивать селективную защиту немалигнизированных тканей при лучевой терапии солидных опухолей.

Подтверждены данные о способности ингибиторов NOS проявлять антиангиогенное и противоопухолевое действие. Впервые установлено, что изученные N,S-3aMeiuënnbie ИТМ тормозят рост и подавляют метастазирование экспериментальных неоплазий, вызывая нарушение опухолевой васкуляризации, подавляя пролиферацию опухолевых клеток и усиливая их апоптотическую и некротическую гибель. Впервые показана способность этих соединений существенно повышать противоопухолевую эффективность радио- и химиотерапии опухолей.

Методы синтеза исследованных ^ацил-Б-алкил-замещённых ИТМ и данные об их биохимических свойствах, вазапрессорной, противолучевой и противоопухолевой активности являются приоритетными и стали предметом 4 патентов Российской Федерации и одобренной заявки на изобретение.

Теоретическая и практическая значимость. Выявленные особенности молекулярной структуры оригинальных N,S-3aMeiuëHHbix ИТМ, определяющие их способность к ингибированию NOS, установленная зависимость селективности изученных соединений к изоформам NOS от характера N-замещающего ацильного радикала создают основу для поиска и дизайна конкурентных ингибиторов NOS в ряду линейных и гетеро- циклических соединений, содержащих тиоамидиновый фрагмент - производных ИТМ, тиазола, тиазолина, тиазина.

Проведённые исследования выявили способность ингибиторов NOS из класса Ы,8-замещённых ИТМ оказывать в нетоксических дозах выраженное сосудосуживающее действие при различных гипотониях, в том числе, резистентных к действию существующих вазопрессоров. Полученные результаты свидетельствуют, что конкурентные тиоамидиновые ингибиторы NOS могут создать новые возможности в фармакотерапии гипотонических расстройств, при оказании экстренной и неотложной помощи, и в лечении критических состояний, а также позволяют рекомендовать соединение Т-1059 для дальнейшей разработки в качестве вазопрессорного и противошокового средства.

Результаты исследований показали, что конкурентные ингибиторы NOS из класса N,S-3aMeiuëHHbix ИТМ обладают свойствами гипоксических радиопротекторов. Показатели противолучевой эффективности и радиозащитной широты этих соединений, данные о значительном повышении противолучевой эффективности при комбинированном взаимодействии с имеющимися серотонин- и адренергическими радиопротекторами, и способности к селективной защите немалигнизированных тканей свидетельствуют, что конкурентные тиоамидиновые ингибиторы NOS могут иметь важное практическое значение при разработке более безопасных противолучевых и радиомодифицирующих средств. Полученные результаты позволяют рекомендовать соединение Т-1023 для дальнейшей разработки в качестве радиопротектора экстренного действия и средства профилактики осложнений лучевой терапии.

Установлено, что изучаемые производные ИТМ при субхроническом применении подавляют рост и метастазирование злокачественных опухолей, оказывая антиангиогенное и проапоптотическое действие. Полученные данные о способности

9

этих соединений повышать эффективность радио- и химиотерапии позволяют рассматривать их как перспективную основу для разработки новых средств адъювантной терапии злокачественных новообразований.

Результаты проведённых исследований вошли в 5 патентов РФ на изобретение.

Методология и методы диссертационного исследования. Исследование носило комплексный характер, предполагающий сочетание экспериментальных исследований по поиску и дизайну эффективных ингибиторов NOS с изучением зависимости биохимической активности веществ от их молекулярной структуры, особенностей их биохимического действия и фармакологических свойств. При решении поставленных задач использован обширный арсенал методов исследований из различных областей - биохимии, клеточной биологии, морфологии, экспериментальной физиологии, радиобиологии, онкологии и фармакологии.

Исследования NOS-ингибирующей активности изучаемых соединений проведено in vitro - радиометрическим методом на изолированных изоформах NOS и методом проточной цитофлуориметрии на клеточных культурах; in vivo - методом ЭПР-спектрометрии и фотометрическим методом. Изучение токсических свойств соединений проведено по методу острой токсичности. Изучение вазоактивных свойств соединений проведено общепринятыми методами экспериментальной физиологии и фармакологии на интактных животных и экспериментальных моделях острого геморрагического шока, эндотоксического шока, гипотензии при ганглиоблокаде и модели рефрактерной вазоплегии при эндотоксемии. Изучение противолучевых свойств соединений проведено общепринятыми методами экспериментальной радиобиологии по выживаемости животных и выживаемости клоногенных гемопоэтических клеток. Для оценки способности изучаемых соединений к профилактике осложнений радиотерапии использована экспериментальная модель лучевой терапии саркомы М-1. Исследование противоопухолевой и антиметастической активности соединений проведено на карциноме лёгких Льюис с применением морфологических, иммуногиетохимических и морфометрических методов. При анализе и обобщении полученных экспериментальных данных использованы адекватные методы статистики и прикладной математики.

Положения, выносимые на защиту

1. Соединения класса ^ацил-5-алкил-замещённых изотиомочевин обладают способностью к обратимому, конкурентному ингибированию NOS, если их S-замещающий радикал представлен низшим алкилом. Строение N-ацильных заместителей в этих соединениях оказывает существенное влияние на селективность их действия к изоформам NOS.

2. Ряд оригинальных №ацил-8-алкил-замещённых изотиомочевин проявляют селективность к eNOS и iNOS, и в нетоксических дозах оказывают выраженную NOS-ингибирующую активность in vivo, что позволяет рассматривать данные соединения как перспективные для разработки на их основе новых фармакологических средств, влияющих, в первую очередь, на сосудистый гомеостаз.

3. Вазопрессорное действие исследованных производных ИТМ наблюдается на различных моделях гипотонических состояний, в том числе, резистентных к действию существующих вазопрессорных лекарственных средств, и отличается большой продолжительностью и отсутствием негативных эффектов, характерных для адреномиметиков.

4. Противолучевое действие алкил-замещённых изотиомочевин реализуется путём индукции циркуляторной гипоксии. Испытанные соединения обеспечивают эффективную радиационную защиту в менее токсических дозах, по сравнению с серосодержащими радиопротекторами, способны повышать противолучевую эффективность серотонин- и адренергических радиопротекторов, и проявляют селективную защиту немалигнизированных тканей при лучевой терапии солидных опухолей.

5. Исследованные ингибиторы NOS оказывают выраженное противоопухолевое и антиметастатическое действие, подавляя опухолевый ангиогенез и стимулируя апоптотическую и некротическую гибель опухолевых клеток и способны повышать эффективность радио- и химиотерапии новообразований.

6. Полученные данные свидетельствуют о перспективности разработки на основе наиболее активных соединений лекарственных средств принципиально нового механизма действия, способных расширить возможности фармакотерапии при лечении ряда распространённых заболеваний, при оказании экстренной, неотложной помощи и терапии критических состояний.

Степень достоверности. Достоверность экспериментальных данных обеспечивалась применением адекватных, верифицированных методов исследований и экспериментальных моделей, кондиционностью химических, биологических материалов и лабораторных животных, величиной экспериментальных выборок и воспроизведением результатов в независимых экспериментах. Анализ данных и их обобщение проведены с применением методов математической статистики и прикладной математики, соответствующих характеру данных и задачам экспериментов. Все выявленные закономерности, эффекты, обобщения и выводы подтверждались сериями независимых экспериментов и результатами статистического анализа.

Использование результатов исследований. Результаты исследований фармакологической активности соединения Т-1023 составили основу для разработки программы НИР МЗ РФ (№ гос. регистрации 01201461942) по проведению расширенного доклинического изучения Т-1023 в качестве средства лечения злокачественных новообразований, которая в настоящее время выполняется в МРНЦ им. А.Ф. Цыба.

Результаты изучения фармакологической активности соединения Т-1059 составили основу для разработки программы доклинических исследований вазопрессорного средства на основе ингибиторов NOS из класса N,S-3aMeuiëHHbix производных ИТМ. Получено положительное решение на проведение этих исследований в рамках ФЦП «Фарма-2020» (протокол № ОП-4119/19 от 09 07-2014 г).

Апробация работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на следующих научных конференциях: Национальная научно-практическая конференция с международным участием «Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека» (Смоленск, 2001); Международная научно-практическая конференция «Активные формы кислорода, оксида азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2003); VIII Международная конференция «Биоантиоксидант» (Москва, 2010); Третий съезд военных врачей медико-профилактического профиля Вооружённых сил Российской Федерации (Санкт-Петербург, 2010); Российская научная конференция с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии» (Санкт-Петербург, 2011); Вторая международная

конференция «Новые направления в химии гетероциклических соединений» (Железноводск, 2011); Всероссийская конференция «Радиохимия - наука будущего», посвященной 100-летию со дня рождения А.Н. Несмеянова (Москва, 2011); Всероссийская конференция с международным участием «Современные проблемы химической науки и образования», посвященная 75-летию со дня рождения В.В. Кормачева (Чебоксары, 2012); International conference «Radiation safety challengers in the 21th century» (Yerevan, 2012); Российская научная конференция «Острые проблемы разработки противолучевых средств: консерватизм или модернизация» (Москва, 2012); Научно-практическая конференция «Перспективные технологии медицинского обеспечения вооружённых сил Российской Федерации» (Санкт-Петербург, 2013); Third International Conference on Radioecology & Environmental Radioactivity; ICRER 2014; (Barcelona, 2014); VII съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва, 2014).

Диссертация апробирована на научной конференции Экспериментального радиологического сектора Медицинского радиологического научного центра имени А.Ф. Цыба - филиала федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный медицинский исследовательский центр имени П.А. Герцена» Министерства здравоохранения Российской Федерации 04.12.2014 г. (протокол № 279).

Публикации. Результаты диссертационного исследования опубликованы в 18 научных статьях, из них 11 - в рецензируемых изданиях перечня ВАК Минобрнауки РФ, 5 патентах РФ. Результаты доложены на научных мероприятиях, тезисы 21 доклада представлены в сборниках материалов.

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 239 страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, четырёх глав результатов исследований, заключения, выводов, рекомендаций и списка литературы. Работа содержит 45 таблиц и 33 рисунка. Список литературы содержит 569 источников, из которых 135 отечественных и 434 зарубежных изданий.

Личный вклад автора. Автору принадлежит основная роль в обосновании и выборе направлений исследований, проведении большинства экспериментов, анализе и обобщении полученных результатов, их публикации в научных изданиях, докладах и обсуждении на отечественных и международных конференциях, формулировании теоретических положений, выводов и рекомендаций. В экспериментальных работах, выполненных в соавторстве, вклад автора является определяющим, состоящим в участии на всех этапах - от постановки задач и реализации до обсуждения результатов в публикациях и докладах. Написание диссертации выполнено автором лично.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на 850 белых аутбредных мышах обоего пола, на 2230 мышах-гибридах Fi (CBAxC57BL6j) обоего пола, на 35 самках мышей C57BL6j и на 230 самцах крыс Wistar, которые были получены из питомника ФГБУН НЦБМТ ФМБА России и прошли 20-суточный карантин в виварии МРНЦ. Содержали животных в соответствии с нормами группового размещения в условиях естественного освещения с принудительной 16-кратной вентиляцией, при температуре 18-20°С и относительной влажности воздуха 40-70%. Животные имели свободный доступ к питьевой воде и

корму, и получали стандартный (ГОСТ Р50258-92) корм ПК-120-1 (ООО «Лабораторснаб», Россия). Все работы с животными выполнены на основе стандартных операционных процедур, принятых в МРНЦ, которые соответствуют правилам Европейской Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для научных целей (ETS 123, Strasbourg, 1986).

Использованные соединения и фармакологические препараты. Методы синтеза изучаемых в работе N,S-3aMeiuëHHbix ИТМ разработаны в лаборатории радиационной фармакологии МРНЦ им. А.Ф. Цыба и защищены патентами РФ (RU2338538 от 20.11.2008; RU2353614 от 27.04.2009, RU2475479 от 20.02.2013) и патентной заявкой (№082603 от 29.11.2013). Методы синтеза использованных S-[2-алкил(арил)сульфонил]-замещённых производных 8-этил(винил)-ИТМ разработаны в ФГБУН ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН (а.с. №83085 от 1.11.1974, №90803 от 6.10.1975 и №97821 от 2.8.1976). Наработка всех производных ИТМ для исследований проведена в лаборатории радиационной фармакологии МРНЦ.

При проведении исследований использовались в фармакопейных формах следующие препараты сравнения и вспомогательные средства - радиопротекторы амифостин (Medlmmun Pharma BV, Нидерланды), дифетур (НПЦ «Фармзащита» ФГУП ФМБА, Россия), цистамина дигидрохлорид (Sigma-Aldrich, Москва), серотонина адипинат (Sigma-Aldrich, Москва), мексамин (Sigma-Aldrich, Москва), индралин (Б-190; НПЦ «Фармзащита» ФГУП ФМБА, Россия), агадреномиметик фенилэфрин (мезатон, ICN Полифарм, Россия), цитостатик циклофосфамид (циклофосфан, ООО «Компания Деко», Россия), ингибитор VEGF бевацизумаб (авастин, Roche Diagnostics GmbH, Германия), ганглиоблокатор азаметония бромид (пентамин; ОАО Дальхимфарм, Россия) и тиопентал натрия (Sandoz, Австрия).

Все соединения применялись в виде асептических водных растворов, приготовленных ex tempore. Исключение составляли соединение Т-1049, суспензию которого готовили с применением Tween-80 (Sigma-Aldrich, Москва) в соотношении 1:10, и индралин, который растворяли в 1% растворе винной кислоты.

Исследование токсичности изучаемых соединений проведено на самцах F] (CBAxC57BL6j) при однократном в/б введении с использованием метода пробит-анализа по Литчфилду-Уилкоксону (Элементы количественной оценки фармакологического эффекта / M.JI. Беленький. - Л.: Гос. изд-во мед. литературы, 1963.- 146 е.).

Исследования NOS-иигибирующей активности. Скрининговая оценка ингибирующей активности изучаемых ИТМ и их селективности проведена in vitro радиометрическим методом (van Eijk Н.М., Luiking Y.C., Deutz N.E. Method using stable isotopes to measure nitric oxide synthesis in the L-arginine/NO pathway in health and disease // J. Chromatogr. В Analyt. Technol. Biomed. Life Sei. - 2007. - Vol.851, N.l-2. -P.172-185.) на рекомбинантных изоформах NOS человека (Enzo Life Sciences Inc., США) с применением набора реагентов NOS Activity Assay Kit (Cayman Chemical, США). Активность ферментов оценивали по скорости накопления [3Н]-Ь-нитруллина, которую определяли при помощи сцинтилляционного счётчика Beckman LS 6000 (Beckman Coulter, США).

Исследование обратимости NOS-ингибирующего действия изучаемых ИТМ проведено на культурах клеток меланомы В16 и клеток HeLa методом флуориметрии (Nagano T., Yoshimura Т. Bioimaging of nitric oxide // Chem. Rev. - 2002. - Vol.102, N.4. - P. 1235-1269.). Клетки, после 2 часов инкубации с изучаемыми соединениями,

отмывали в PBS и инкубировали 1 час с зондом DAF-2DA (Sigma-Aldrich, США). Активность синтеза N0 оценивали по флуоресценции DAF-2T, которую измеряли на проточном цитофлуориметре FACS Calibur (BDIS, США).

Исследования влияния изучаемых соединений in vivo на продукцию NO в биологических тканях проведены на самцах мышей F, (CBAxC57BL6j) методом ЭПР-спектрометрии с диэтилдитиокарбаматной спиновой ловушкой (Sigma-Aldrich, США) (Vanin A.F., Poltorakov А.Р. NO spin trapping in biological systems // Front Biosci. (Landmark Ed.) - 2009. - Vol.14. - P.4427-4435.). Образцы тканей печени и мозга брали на исследование через 1 час после введения изучаемых ИТМ. Спектры ЭПР регистрировали на спектрометрах ЕМХ-8 и ESP-300E (оба: Bruker, Германия). Содержание N0 оценивали по амплитуде первой компоненты триплетной структуры спектра.

Исследования влияния изучаемых соединений in vivo на содержание NOjTNOj" в биологических тканях проведено на самцах крыс Wistar фотометрическим методом с применением реагента Грисса (Promega, США) (Tsikas D. Analysis of nitrite and nitrate in biological fluids by based on the Griess reaction: appraisal of the Griess reaction in the L-arginine/nitric oxide area of research // J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sei. - 2007. - Vol.851, N.l-2. - P.51-70.). Образцы крови, тканей печени и мозжечка брали в опыт через 1 сутки после введения изучаемых ИТМ. Депротеинизацию плазмы и гомогенатов проводили сульфатом цинка, нитраты восстанавливали металлическим цинком. Оптическую плотность измеряли на фотометре КФК-3-01 (ЗОМЗ, Россия).

Исследование влияния на сердечно-сосудистую систему изучаемых соединений проведено на интактных самцах крыс Wistar и на моделях различных гипотоний. У животных под тиопенталовым наркозом с помощью полиграфа RM-6000 (Nikhon Kohden, Япония) или комплекса PowerLab 8/30 (ADInstruments, Австралия) регистрировали ЭКГ и показатели ЧСС, ЧДД, АДС и АДд в левой сонной артерии и ЦВД в яремной вене. Для воспроизведения острого геморрагического шока проводили забор крови из правой сонной артерии в течение 8-12 мин в объёме 3,0 мл на 100 г массы тела. Для создания острого эндотоксемического шока вводили ЛПС E.coli (Sigma-Aldrich, США) однократно, в/в, 18 мг/кг. Для создания гипотонии при ганглиоблокаде вводили азаметония бромид (однократно, в/б, 12 мг/кг). Дтя воспроизведения рефрактерной вазоплегии проводили двукратное в/б введение ЛПС в дозе 5 мг/кг: первое - за 18 часов до исследований, второе - в начале исследования. После развития у крыс стабильной гипотонии повторяли регистрацию показателей. Затем животным опытных групп однократно в/б вводили исследуемые соединения и продолжали мониторинг показателей в течение последующих 90-120 минут. В этих опытах в качестве препарата сравнения использован фенилэфрин (однократно, в/б, 0,5 мг/кг). В исследованиях на интактных животных, наряду с указанными показателями, каждые 30 минут измеряли измеряли МОК методом термодилюции, и в дальнейшем прово-дили расчёт общепринятых гемодинамических показателей - УПСС, УО и СИ.

Исследования радиозащитных свойств изучаемых соединений проведены на аутбредных мышах и мышах-гибридах F, (CBAxC57BL6j) обоего пола. Воздействие у-излучением б0Со на животных проводили в группах по 12-15 особей на установках «Гаммацелл-220» (Канада) с мощностью дозы 310-330 мГр/с и «Луч-2» (Россия) с мощностью дозы 75-90 мГр/с. Изучаемые ИТМ вводили в/б за 15-20 до лучевого воздействия. При сочетанном применении с другими радиопротекторами соединения

вводили раздельно с интервалом 5-10 минут. Радиозащитные эффекты оценивали по 30-суточной выживаемости животных и выживаемости клоногенных гемопоэтических клеток, которую изучали методами селезёночных эндо- и экзоколоний (Радиобиология стволовых клеток / А.Г. Коноплянников - М.: Биоинформсервис, 2009. - 171 е.). Показатели радиозащитной широты и эффективности оценивали согласно руководству для противолучевых средств (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей ред. члена-корр. РАМН, проф. Р.У.Хабриева. 2-изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. -832 е.).

Исследования радиомодифицирующего действия изучаемых ИТМ при радиотерапии проведены на самцах крыс Wistar на модели лучевой терапии перевиваемой саркомы М-1 при локальном облучении в дозах 32 и 36 Гр. Динамику опухолевого роста оценивали морфологическими методами. Тяжесть и течение острых лучевых повреждений кожи оценивали по классификации RTOG/EORTC-95 (Сох J.D., Stetz J., Pajak T.F. Toxicity criteria of the Radiation Therapy Oncology Group (RTOG) and the European Organization of Research and Treatment of Cancer (EORTC) // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. - 1995. - Vol.31, N.5. - P.1341-1346; Аклеев A.B., Радиобиологические закономерности реакции нормальных тканей при лучевой терапии опухолей // Радиац. биол. Радиоэкол. - 2014. -Т.54, №.3. -С.241-255 2014).

Исследования противоопухолевой активности изучаемых ИТМ при субхроническом введении проведено на самцах мышей F! (CBAxC57BL6j) на перевиваемой карциноме лёгких Льюис. Динамику роста и активность метастазирования карциномы оценивали морфологическими методами. Противоопухолевое и антиметастатическое действие оценивали по индексам ТРО, ИИМ и длительности задержки роста (Хабриев Р.У., 2005). Этими методами исследовалась и противоопухолевая эффективность в сочетании с бевацизумабом, циклофосфаном и лучевым воздействием. Гистологические и иммуно-гистохимические исследования влияния изучаемых ИТМ на морфологию тканей карциномы Льюис проведены по методике, изложенной в (М.В. Филимонова, В.В. Южаков, Л.И. Шевченко и др. Экспериментальное исследование противоопухолевой активности нового ингибитора синтаз оксида азота Т1023 // Молекулярная медицина. -2015.-№ 1. - С.61-64.).

Статистические методы. При первичной обработке данных проводили проверку наличия сомнительных значений с применением критериев Диксона и Ирвина. Сомнительную варианту классифицировали как грубую погрешность при р<0,05 и исключали из дальнейшего рассмотрения. Проверку различий проводили с применением непараметрических критериев: при парном сравнении использовали U-критерий Манна-Уитни и двухвыборочный критерий Колмогорова-Смирнова, а при множественном - ранговый дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса и критерии Даннета и Данна. Различия выживаемости животных оценивали по точному критерию Фишера. Во всех случаях межгрупповые различия считали достоверными при р<0,05. Корреляционный и регрессионный анализ, и статистические расчёты проведены с использованием программ Exel 2003 (Microsoft, США), Origin 7.5 (OriginLab, США) и Statistica 7.0 (StatSoft Inc., США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Обоснование химической области фармакологического скрининга

На начальном этапе поисковых работ нами было показано, что для проявления аффинности К,8-замещённых HTM к NOS важным является наличие S-алкильного заместителя. Но увеличение этого радикала выше С4.5 ослабляло ингибирующую активность таких ИТМ - оптимальными являлись низшие алкилы С2.з- Другим важным моментом являлся характер заместителей атома углерода N-радикала, контактирующего с атомом азота тиоамидиновой группы. Производные ИТМ проявляли аффинность к NOS только, если в этом месте находилась -СНГ или -СО-группа. Причём, ацильные производные, как правило, проявляли большую ингибирующую активность в сравнении с алкильными аналогами.

В этой связи, было принято целесообразным вести поиск эффективных конкурентных ингибиторов NOS в ряду ^ацил-8-алкил-замещённых ИТМ общей формулы:

? NHj где- алкильная/арильная группа С/.^;

R,—С—N— С • НХ #2 - алкильная группа С2.з,

g_p НХ— неорганическая/органическая кислота.

Структура и физико-химические свойства синтезированных ИТМ

В рамках исследований были синтезированы, идентифицированы и охарактеризованы 16 новых, не описанных ранее производных ИТМ. Большинство соединений имели в качестве S-заместителя этил или изопропил (табл. 1). N-замещающий радикал варьировал в широких пределах - от ацетила до пальмитинатоила, и был представлен как линейными, так и циклическими углеводородами.

Таблица 1 - Структура и физико-химические свойства полученных ИТМ

Код Соединение Структура Свойства

Т-974 №ацил-8-метил-ИТМ гидроиодид о s^ ^N^NHjHI MB-T - 1 ПЛ -260,1 160-162°C

Т-982 N-ацил-З-э гил-ИТМ гидробромид о s^ ^N^NIVHBr MB- T - 1 Ш1 -227,1 120-12ГС

Т-975 ^ацил-8-изопропил-ИТМ гидробромид о s^ ^N^NH.-HBr MB- T - A Ш1 -241,1 138-140°C

Т-1004 N-nponnoHwi-S-H3onponwi-ИТМ гидробромид О s-^ MB-T - 1 ПЛ -255,2 126-128°C

Т-1005 ^пропионил-8-метил-ИТМ гидроиодид о s' MB-T - 1 ПЛ 274,2 119-120°C

Т-1006 ^пропионил-8-этил-ИТМ гидробромид о s— "^^N^NHjHBr MB-T - 1 ПЛ -241,1 106-107°C

Т-1023 Т-1032 Т-1058

Т-1031

Т-1019 Т-1020 Т-1049 Т-1059 Т-1064 Т-1046

М-изобутаноил-Б-изопропил-ИТМ гидробромид

Ы-изобутаноил-8-этил-ИТМ гидробромид

N-бeнзoил-S-этил-ИTM гидробромид

Ы-бензоил-8-этил-ИТМ оксиэтилидендифосфонат

Ы-З'-фторбензоил -Б-этил-ИТМ гидробромид

Ы-циклобутаноил -Б-этил-ИТМ гидробромид

>1-циклобутаноил -Б-изоиропил-ИТМ гидробромид

Ы-циклогексаноил -Б-этил-ИТМ гидробромид

N-циклoгeкcaнoил -Б-изопропил-ИТМ гидробромид

N-пaльмитинaтoил -8- этил-ИТМ гидробромид

о в'

Л

О

^^М^МН^НВг О

о

" Лы

■СН^ОЩРЮХОНЦ, О Б"-

Л

ИН,НВг

о э'

О

А

о

сА

° X

о

л,

МН.-НВг

о я

^(СН,);^^ МН.-НВГ

мвт -

1 пл

МВТ

1 п..

МВТ -

1 ПЛ

МВТ -

1 ПЛ

мвТ -

1 ПЛ

мвт -

1 ПЛ

мвТ -

1 ПЛ

МВТ -

1 ПЛ

МВТ -

1 ПЛ

мв

269,2 129-13ГС

- 255,2

■ 68-70°С

- 289,2 195-197°С

-414,4 178-182°С

- 307,2 190-19ГС

- 267,2 120-123°С

-281,2 118-120°С

- 295,2 123-125°С

- 309,3

- 163-165°С

- 423,5

- 103-105°С

Все соединения были хорошо растворимы в воде. Исключением являлось производное Т-1046, содержащее протяжённый ^заместитель (С14), которое растворяли в присутствии Т\уееп 80 (1:10).

Токсикологическая характеристика изучаемых производных ИТМ

Результаты исследований показали, что изучаемые Ы^-замещённые ИТМ являются умеренно токсичными соединениями (табл. 2). Для мышей при в/б введении значения ЛД50 находились в пределах 380-945 мг/кг.

При этом существенной зависимости проявления токсичности в ряду исследуемых соединений от их химического строения не установлено. Наименее токсичным являлось производное Т-1046, что, вероятно, было обусловлено его низкой растворимостью.

Таблица 2 - Показатели острой токсичности изучаемых ИТМ для мышей при в/б введении (мг/кг)

Соединение ЛД10 лд16 ЛД50±т ЛД84 ЛД90

Т-974 297 337 485 ± 16 660 770

Т-975 405 520 713 ±20 925 1035

Т-982 203 338 515 ± 13 668 810

Т-1004 190 342 564 ± 23 814 1008

Т-1005 210 389 564 ± 17 743 920

Т-1006 545 590 761 ± 65 975 1035

Т-1019 475 501 615 ±40 742 797

Т-1020 622 674 812 ± 32 965 1008

Т-1023 224 268 410 ± 11 552 623

Т-1031 415 523 732 ± 50 928 1035

Т-1032 325 356 411 ±40 456 490

Т-1046 680 762 945 ± 57 1173 1277

Т-1049 618 713 760 ± 61 857 931

Т-1058 281 325 414 ± 17 488 561

Т-1059 232 274 380 ± 32 523 594

Т-1064 287 324 655 ± 16 887 953

NOS-ингибирующая активность изучаемых производных ИТМ

Исследование ингибирующей активности изучаемых производных ИТМ на изолированных изоформах NOS показало, что все соединения в той или иной мере проявляли свойства ингибиторов NOS (табл. 3). Как и ожидалось, наличие N-замещающего радикала в структуре этих ИТМ, в целом, ослабляло их аффинность к NOS по сравнению с S-этил/изопропил-ИТМ, у которых 1С50 находится в наномолярной области (Wolff D.J., Gauld D.S., Neulander M.J. et al. Inactivation of nitric oxide synthase by substituted aminoguanidines and aminoisothioureas // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 1997. - V.283, N.l. - P.265-273). Тем не менее, ряд соединений - Т-1004, Т-1020, Т-1023, Т-1032, Т-1049 и Т-1059 вполне эффективно подавляли активность eNOS и iNOS (IC50 — 1,8-10 мкМ/л), на уровне, сопоставимом с активностью таких ингибиторов NOS, как L-NAA, L-NNA, L-NAME (Lambert L.E., Whitten J.P., Baron В.М. et al. Nitric oxide synthsis in the CNS endothelium and macrophages differs in its sensitivity to inhibition by arginine analogues // Life Sci. - 1991. - Vol.48, N.l. - P.69-75; Boer R., Ulrich W.R., Klein T. et al. The inhibitory potency and selectivity of arginine substrate site nitric-oxide synthase inhibitors is solely determined by their affinity toward the different isoenzymes // Mol. Pharmacol. - 2000. - Vol.58, N.5. - P. 1026-1034.).

Вместе с тем, в этих исследованиях проявилась и «положительная» сторона влияния N-радикала. Если большая часть изучаемых ИТМ, подобно S-алкил-ИТМ, являлась неселективными ингибиторами NOS, то такие N-заместители, как изобутаноил, циклобуганоил и циклогексаноил, в большей степени ослабляли взаимодействие N,S-3aMeiueHHbix ИТМ с нейрональной NOS, в результате чего такие соединения в той или иной степени приобретали селективность к ингибированию эндотелиальной и индуцибелыюй изоформ. Так, производные Т-1020, Т-1032 и Т-

1049 проявляли умеренную селективность (в 3-5 раз) к eNOS и iNOS, а соединения Т-1023 и Т-1059 в данных исследованиях демонстрировали уже практически значимый уровень селективности - в 15-30 раз активнее подавляя eNOS и iNOS, чем nNOS.

Сопоставление 1С50 и ЛД50 изучаемых производных ИТМ показало, что наиболее активные соединения оказывают значительное ингибирующее влияние уже при концентрациях, на 2-3 порядка ниже токсических, что позволяло ожидать у этих соединений высокой физиологической активности при низких нетоксических дозах.

В опытах на изолированных NOS характер ингибирующего действия исследованных Ы.Б-замещённых ИТМ, как и у S-алкил-ИТМ, был в полной мере конкурентным и обратимым - влияние этих соединений на каталитическую активность всех изоформ полностью нивелировалось при 8-10-кратном избытке L-аргинина.

Таблица 3 - Показатели ингибирующей активности изучаемых ИТМ in vitro по отношению к изоформам NOS

Соединение 1С 50, мкМ/л / мг/кг Селективность *

nNOS ¡NOS eNOS n/i e/i

Т-974 250 / 65,0 160/41,6 190/49,4 1,6 1,2

Т-975 150/36,1 90/21,7 110/26,5 1,7 1,2

Т-982 160/36,3 90 / 20,4 120/27,3 1,8 1,3

Т-1004 15/3,8 7,5/1,9 9,5 / 2,4 2,0 1,3

Т-1005 35 / 9,6 24 / 6,6 28 / 7,7 1,5 1,2

Т-1006 20 / 4,8 13/3,1 17/4,1 1,5 1,3

Т-1019 130/39,9 75/23,0 90 / 27,6 1,7 1,2

Т-1020 35 / 9,4 8/2,1 10/2,7 4,4 1,3

Т-1023 48/12,9 3,2 / 0,9 5,0/1,3 15,0 1,6

Т-1031 120/49,7 85 / 35,2 95 / 39,4 1,4 1,1

Т-1032 20/5,1 6/1,5 9/2,3 3,3 1,5

Т-1046 23 / 9,7 18/7,6 21 / 8,9 1,3 1,2

Т-1049 28 / 7,9 5,5/1,5 8,5 / 2,4 5,1 1,5

Т-1058 40/11,6 22 / 6,4 27 / 7,8 1,8 1,2

Т-1059 60/17,7 1,8/0,5 3,3/1,0 33,3 1,8

Т-1064 35/10,8 14/4,3 18/5,6 2,5 1,3

Примечание. * - отношение соответствующих 1С50.

Чисто конкурентное ингибирование NOS изучаемыми производными ИТМ подтвердили и результаты исследований на культурах клеток меланомы В16 и клеток HeLa, различающихся спектром экспрессируемых NOS. В этих опытах было показано, что после 2-х часов инкубации клеток с различными концентрациями изучаемых ИТМ, вплоть до токсических, удаление этих веществ из культуральной среды сопровождалось быстрым и полным восстановлением продукции NO до уровня интактных клеток, не имевших контакта с этими соединениями (таблица 4).

Таблица 4 - Относительная продукция оксида азота в клетках В16 и HeLa после удаления из среды изучаемых соединений (М±ст)

Концентрация ингибитора Т-1023 Т-1059 L-NMMA

В16 HeLa В16 HeLa В16 HeLa

Контроль 100 ±9 100 ±4 100 ± 9 100 ±4 100 ±9 100 ±4

0,02 мг/мл 88 ±20 97 ± 12 105 ± 17 98 ± 14 93 ± 17 97 ± 15

0,1 мг/мл 87± 18 96 ±6 96 ±20 99 ±6 78 ± 11 1 89 ±6 1

0,2 мг/мл 91 ±7 90 ± 10 92 ±28 98± 12 82 ± 7 1 88 ± 14

Примечание. 1 - статистически значимое различие с контролем по критерию Даннета (во всех группах п = 5)

Вместе с тем, в обеих клеточных культурах после 2 часов инкубации с высокими дозами L-NMMА сохранялось достоверное снижение на 10-20% продукции NO после его удаления из среды, что согласуется с данными о смешанном влияния L-NMMA на NOS - конкурентным ингибированием и необратимой инактивацией (Alderton W.K., 2001; Lee K.S., 2012).

Таблица 5 - Влияние изучаемых ИТМ в дозе 10 мг/кг на продукцию NO в печени подопытных животных, индуцированную ЛПС (М±ст)

Группа Содержание NO, Группа Содержание NO,

отн. ед. отн. ед.

Контроль; (18) 5,3 ± 1,0 ЛПС + Т-1020; (18) 2,9 ± 0,9 12

ЛПС; (18) 14,6 ±3,2 ЛПС + Т-1023;(18) 1,4 ± 1,0 ! 2

ЛПС + Т-974; (15) 9,3 ±2,1 1 ЛПС + Т-1031; (15) 8,6 ± 2,7 1

ЛПС + Т-975; (18) 8,7 ± 2,0 1 ЛПС + Т-1032; (18) 4,3 ± 1,1 1

ЛПС + Т-982; (16) 8,9 ±2,3 1 ЛПС+Т-1046; (15) 7,4 ± 1,7 1

ЛПС + Т-1004; (15) 3,4 ±0,6 12 ЛПС + Т-1049; (18) 2,1 ±0,7 12

ЛПС + Т-1005; (15) 7,1 ± 1,6 1 ЛПС + Т-1058; (15) 7,6 ± 1,5 1

ЛПС + Т-1006; (15) 6,2 ± 1,2 1 ЛПС + Т-1059; (18) 2,4 ±0,8 12

ЛПС + Т-1019; (18) 9,1 ± 1,6 1 ЛПС + Т-1064; (18) 6,0 ± 0,9 1

Примечания. 1 и 2 - статистически значимое различие по критерию Данна, соответственно, с группой, получавшей только ЛПС, и с контрольной группой; в скобках указано число проб.

Результаты исследования влияния изучаемых ИТМ на эндогенную продукцию NO в тканях подопытных животных показали, что большая часть этих соединений проявляет in vivo высокую NOS-ингибирующую активность (табл. 5). При однократном в/б введении этих соединений в дозе 10 мг/кг (1/50-1/40 ЛД50) уже в течение первого часа наблюдалось достоверное снижение синтеза NO в печени мышей Fi (CBAxC57BL6j), получавших ЛПС (2 мг/кг) за 24 часа до исследований.

NOS-ингибирующая активность исследованных ИТМ in vivo, в целом, коррелировала с данными, полученными in vitro на изолированных ферментах (см. табл. 3). В исследовании in vivo также наиболее высокую активность проявляли производные Т-1004, Т-1020, Т-1023, Т-1032, Т-1049 и Т-1059. В данных опытах эти вещества в дозе 10 мг/кг, несмотря на длительное влияние ЛПС, снижали продукцию

NO статистически значимо ниже уровня, характерного для интактных животных, не получавших эндотоксин. Данное сходство свидетельствует, что влияние изучаемых производных ИТМ in vivo на эндогенный синтез N0 определяется, собственно, их ингибирующим действием на NOS.

Дальнейшие исследования показали, что эти соединения после в/б введения быстро всасываются и распределяются в биологических тканях, проникая, в том числе, через ГЭБ. Так, на рис. 1,а показано, что вещества Т-1023 и Т-1059 уже в течение первого часа после в/б инъекции в дозе 10 мг/кг достоверно снижают синтез NO как в печени, так и в головном мозге мышей Fi (CBAxC57BL6j). В тканях мозга, куда ЛПС не проникал при в/б введении, изучаемые ИТМ статистически значимо подавляли спонтанную продукцию NO, а в печени ингибиторы блокировали как спонтанный, так и индуцированный синтез NO.

Печень Мозг Печень Мозг Плазма

Рисунок 1 - Влияние in vivo производных Т-1023 и Т-1059 в дозе 10 мг/кг на продукцию NO (А) и содержание его стабильных метаболитов (Б) в биологических

тканях и жидкостях. Обозначения: 1 и 2 - статистически значимое различие по критерию Данна, соответственно, с контролем и группой, получавшей только ЛПС.

Изучаемые N,S-3aMeuiëHHbie ИТМ обратимо ингибируют NOS, но их активность in vivo сохраняется длительное время. Так, однократное введение Т-1023 и Т-1059 в дозе 10 мг/кг отражалось и на уровне стабильных метаболитов, аккумулирующих N0 - через сутки после их инъекции наблюдалось выраженное снижение уровня N02" /N03" в различных тканях (рис. 1,6), которое коррелировало с изменениями синтеза самого NO. Результаты прямых экспериментальных оценок продолжительности NOS-ингибирующей активности изучаемых соединений in vivo показали, что однократное введение их в дозах 10-20 мг/кг сопровождается достоверным снижением продукции NO в тканях в течение 3-4 часов (рис. 2).

20 г

I I Контроль ]ЛПС

ЛПС + Т-1023 1,5 мг/кг ЛПС + Т-1023 10 мг/кг ЛПС + Т-1023 30 мг/кг

1 час 4 часа

Время от введения ЛПС и ингибитора NOS

Рисунок 2 - Дозовая и временная зависимость влияния Т-1023 на эндогенный синтез N0 в печени подопытных животных.

В целом, полученные на этом этапе данные о токсичности и NOS-ингибирующей активности позволили рассматривать производные ИТМ Т-1004, Т-1020, Т-1023, Т-1032, Т-1049 и Т-1059 как перспективные соединения, детальное изучение физиологических и фармакологических свойств которых представляет значительный научный и практический интерес.

Исследования влияния изучаемых ИТМ на сердечно-сосудистую систему

Результаты исследований влияния изучаемых ИТМ на гемодинамику интактных крыс Wistar показали, что подобно некоторым известным ингибиторам NOS (Narayanan К., Spack L., McMillan К. et al. S-alkyl-L-thiocitrullines. Potent stereoselective inhibitors of nitric oxide synthase with strong pressor activity in vivo II J. Biol. Chem. - 1995. - Vol.270, N.19. - P.l 1103-11110; Wray G.M., 1998; Alderton W.K., 2005; Lange M., Enkhbaatar P., Nakano Y. et al. Role of nitric oxide in shock: the large animal perspective // Front Biosci. (Landmark Ed.). - 2009. - Vol.14. - P. 1979-1989.), эти соединения оказывают выраженное вазопрессорное действие, приводящее к повышению периферического сопротивления сосудов.

Как показано на рис. 3, при введении соединения Т-1059 однократно, в/б, 10 мг/кг (1/25 ЛД|6) у подопытных животных наблюдалось значительное и длительное повышение сосудистого тонуса - показатель УПСС оставался достоверно повышенным на 30-45% в течение 90 минут. При этом вначале отмечался умеренный гипертензивный эффект - показатели АД достоверно повышались на 15-20% в течение первых 10 минут. Рост АД у этих животных сопровождался рефлекторным замедлением сердечного ритма, и далее, на фоне брадикардии развивалась умеренная гипотония при повышенном УПСС. В дальнейшем все изменения самостоятельно регрессировали по мере нормализации сосудистого тонуса. Сходные, но менее длительные изменения в гемодинамике нормотензивных крыс вызывало в этой же дозе соединение Т-1023. В этом случае вазопрессорное действие ослабевало через 30-

40 минут после введения данного производного ИТМ, и к 60 минуте показатель УПСС уже соответствовал исходному.

чсс, %

120

100

Время наблюдения, минуты

Рисунок 3 - Влияние изучаемых производных ИТМ в дозе 10 мг/кг на гемодинамику интактных наркотизированных крыс Wistar. Обозначения: светлые символы -соединение Т-1023, тёмные - соединение Т-1059.

В использованных дозах изучаемых ИТМ барорефлекторная реакция, в целом, носила умеренный характер, который, скорее всего, не требует фармакологической коррекции: снижение ЧСС и АДС не превышало 10-15% и при этом не отмечалось ослабления насосной функции сердца и системного кровотока -, показатели УО и СИ сохранялись на исходном уровне.

Полученные результаты не только показали наличие выраженной вазопрессорной активности у изучаемых ИТМ, но и в определённой мере свидетельствуют об их относительной безопасности. Поскольку эти вещества являются обратимыми ингибиторами NOS, их краткосрочные эффекты, в данном случае - вазопрессорное действие и гипертензивный эффект, можно отменить введением L-аргинина или фармакологических доноров NO, например, нитроглицерина (Alaerton W.K., 2001), а выраженность рефлекторных изменений, в данном случае, - брадикардию и гипотонию, можно корректировать холинолитиками, например, п/к введением атропина (Лекарственные средства. Пособие для врачей. Справочник. 15-е изд. / под ред. М.Д. Машковского. - М.: Новая Волна, 2005. - 1164 е.).

Для исследования вазопрессорных свойств изучаемых ИТМ при гиповолемиях в работе использовали модель геморрагического шока у крыс, вызванного острой, массивной потерей крови - около 50% циркулирующей крови за 8-12 минут. В этом случае кровопотеря приводила к развитию тяжёлого шока. Как показано на рис. 4, к окончанию кровопотери у животных наблюдалась умеренная брадикардия и глубокая гипотония - АДС составляло 30%, АДц - около 20% от исходного. В'течение первого часа гипотония частично компенсировалась за счёт повышения тонуса сосудов и ЧСС - к 60-й минуте АДС составляло 55%, АДц - 44% от исходного. Но полной

компенсации не происходило, и на фоне сохраняющейся гипотонии и гипоперфузии через 40-60 минут после кровопотери у значительной части «нелеченых» крыс развивались нарушения насосной функции сердца, что, по-видимому, становилось основной причиной их гибели. Из 11 контрольных животных 5 особей (45%) погибло к 120 минуте опыта.

Т-1059

4Й

20 40 60 80 100 120

Р 1

Время наблюдения, минуты

Рисунок 4 - Влияние фенилэфрина (0,5 мг/кг в/б) (слева) и соединения Т-1059 (10 мг/кг в/б) (справа) на показатели АД и ЧСС наркотизированных крыс \Vistar при остром тяжёлом геморрагическом шоке. Обозначения: 1 - контрольные животные; 2 -подопытные животные (в группах по 9-11 особей).

Введение фенилэфрина (однократно, в/б, 0,5 мг/кг) в дозе, эквивалентной, с учётом межвидового пересчёта, максимально рекомендуемой дозе для человека при п/к и в/м введении (Машковский М.Д., 2005), сопровождалось развитием у подопытных крыс в состоянии геморрагического шока умеренного гипертензивного эффекта - показатели АД через 2-5 минут повысились на 40-70% в сравнении с контролем. Однако вазопрессорное действие фенилэфрина было непродолжительным - статистически значимый гипертензивный эффект наблюдался до 20 минуты после инъекции. Достаточно слабое и кратковременное ослабление гипотонии при воздействии фенилэфрина в этих опытах, по существу, не влияло на течение шока -из 10 животных этой группы в течение 2 часов наблюдения погибло 5 особей (50%).

Качественно иная картина течения тяжёлого геморрагического шока наблюдалась при однократном в/б введении изучаемых производных ИТМ, обладающих высокой 1*Ю8-ингибирующей активностью (Т-1020, Т-1023, Т-1049 и Т-1059), в дозе 10 мг/кг (порядка 1/25-1/70 ЛД16). Вазопрессорное действие этих соединений сопровождалось развитием выраженного и длительного гипертензивного эффекта, превосходившего эффект фенилэфрина в 1,5-2 раза по степени подъёма АД и в 5-7 раз по продолжительности. В ряду исследованных ИТМ наиболее выраженное

гипертензивное действие оказывало соединение Т-1059, обладающее высокой селективностью к eNOS и iNOS. Как показано на рис. 4, однократное введение этой ИТМ в нетоксической дозе поддерживало у крыс, потерявших 50% циркулирующей крови, показатели АД на уровне физиологической нормы в течение всего срока наблюдения.

Необходимость применения вазопрессоров при геморрагическом шоке, протекающем, по крайней мере, на ранних стадиях, при повышенном тонусе сосудов, не очевидна, поскольку избыточная централизация кровотока может отягощать течение такого состояния. Тем не менее, в этих опытах значительное и длительное ослабление тяжёлой гипотонии при воздействии изучаемых ИТМ сопровождалось достоверным снижением краткосрочной летальности - в группах, получавших ингибиторы NOS, в течение 120 минут (до окончания опыта) не погибло ни одно животное, что свидетельствует о целесообразности разработки на основе этих соединений лекарственных средств для оказания помощи при острых гипотонических расстройствах на догоспитальном этапе.

В пользу важности широкого применения таких вазопрессоров свидетельствуют результаты исследований на моделях вазодилятационных гипотоний. Как показано на рис. 5, при введении ЛПС (18 мг/кг в/в) у подопытных крыс уже через 10 минут развивался острый эндотоксемический шок. Однократное введение таким животным фенилэфрина (0,5 мг/кг в/б) было малоэффективным. Гипертензивный эффект адреномиметика был слабым и кратковременным - статистически значимое повышение АД отмечено только на 10 минуте после инъекции препарата.

АДс,

%

j Фенилэфрин

I=i=î—à—i=S=i=-i

АДд,

%

100

50

0 125

'-Î-,

чсс, %

100

100

50

Т-1059

о

125

ijjf-Ηï—ï—

20 40 60 80 о :

а 1 я 2 Время наблюдения, минуты

40

60

Рисунок 5 - Влияние фенилэфрина (0,5 мг/кг в/б) (слева) и соединения Т-1059 (10 мг/кг в/б) (справа) на показатели АД и ЧСС наркотизированных крыс \Vistar при остром эндотоксемическом шоке. Обозначения: 1 - контрольные животные; 2 -подопытные животные (в группах по 8-9 особей).

Т-1059

АДс,

%

АДд,1 %

чсс,

.•••.-...-É

.... .>..

-5—s—5—s—5—5—5

□ 1

_I_._I_._I_I_I_■ I ■_i_

0 20 40 60 80 100 Время наблюдения, минуты

Рисунок 6 - Влияние соединения Т-1059 (10 мг/кг в/б) на показатели АД и ЧСС наркотизированных крыс \Vistar при гипотонии, вызванной азаметонием (12 мг/кг в/б).

Обозначения: 1 — контрольные крысы; 2 - подопытные крысы (в группах по 7-8 особей).

В то же время, при введении соединения Т-1059 (однократно, в/б, 10 мг/кг) у таких животных наблюдался выраженный и длительный гипертензивный эффект. Вазопрессорное действие ингибитора NOS в этих опытах сопровождалось умеренной рефлекторной брадикардией, которая, скорее всего, ограничивала рост АДС. Тем не менее, в течение 90 минут наблюдения показатели АДС у этих животных находились на уровне 85-90%, а АДд - 95-100% физиологической нормы.

Длительный гипертензивный эффект Т-1059 в аналогичной дозе наблюдался и при гипотонии, вызванной ганглиоблокадой. Как показано на рис. 6, ингибитор NOS практически полностью устранял гипотензивное влияние азаметония - с 20 минуты после введения Т-1059 и до конца наблюдения показатели АДд составляли 90-95%, а АДС - 85-90% от исходного уровня до введения ганглиолитика.

Повышение тонуса сосудов при действии ингибиторов NOS развивается без участия клеточных рецепторных структур (Dudzinski D., 2007; Ramadoss J., 2013; Tang L., Wang H., Ziolo M.T. Targeting NOS as a therapeutic approach for heart failure // Pharmacol. Ther. - 2014. - Vol.142, N.3. - P.306-315.), нарушение функции которых во многом определяет патогенез гипотонии, при которых имеющиеся вазопрессоры неэффективны. Данная особенность механизма действия позволяет ожидать у ингибиторов NOS потенциальной способности к вазопрессорному действию при резистентных гипотониях. Подтверждением такой способности явились результаты исследований на модели рефрактерной вазоплегии, вызванной длительной эндотоксемией.

Как показано на рис. 7, при двукратном в/б введении ЛПС в дозе 2 мг/кг с интервалом в 18 часов у подопытных животных развивалась выраженная вазодилятационная гипотония. При этом длительная эндотоксемия значительно подавляла у этих животных реактивность сосудов к действию вазопрессоров. При введении фенилэфрина (однократно, в/б, 0,5 мг/кг) не наблюдалось сколько-нибудь значимых изменений АД в течение всего срока наблюдения, что свидетельствовало о развитии у этих животных рефрактерной вазоплегии.

АДс, %

100

"í-

50

Фенилэфрин

^i-ï-ï-i-ï-ï-i-ï-ï-i

АДд.

%

-t

50

100

50

I _I_ I _L-

T-1059

Ф

_)_ i _i_i_I_._i—

^-i-ï-ï-H'

....

50

■HHH-Í-Í4

ЧСС,

%

75

18 часов

i Нч-Ж-Н-

-н

18 часов

- Н^рИ+H+f

20 40 60 80

40 60 80

Время наблюдения, минуты

Рисунок 7 - Влияние фенилэфрина (0,5 мг/кг в/б) (слева) и соединения Т-1059 (10 мг/кг в/б) (справа) на показатели АД и ЧСС наркотизированных крыс Wistar при рефрактерной вазоплегии на фоне длительной эндотоксемии (в группах по 7-8

особей).

Но данное состояние не являлось препятствием для реализации вазопрессорного действия изучаемых ингибиторов NOS. Как показано, введение Т-1059 (однократно, в/б, 10 мг/кг) сопровождалось развитием гипертензивного эффекта сразу после инъекции препарата. Уже на 2 минуте гипертензивное действие Т-1059 полностью нивелировало гипотензивный эффект эндотоксемии. В то же время, прессорное действие Т-1059 на этой модели было непродолжительным - с 5-ой минуты тонус сосудов снижался и значимым гипертензивный эффект оставался только в течение 20 минут. Относительно низкая продолжительность вазопрессорного действия изучаемых ИТМ при данном способе введения, по-видимому, обусловлена высокой экспрессией ¡NOS и перманентным пополнением их пула на поздних стадиях эндотоксемии (Cauwels А., 2007; Pautz A., Art J., Hahn S. et al. Regulation of the expression of inducible nitric oxide synthase // Nitric Oxide. - 2010. - Vol.23, N.2. - P.75-93.). В этом случае длительный гипертензивный эффект, вероятно, можно достичь при в/м или п/к введении, либо при продолжительной инфузии таких соединений.

В целом, установленная в проведённых исследованиях способность изучаемых ИТМ в нетоксических дозах к выраженному и длительному вазопрессорному действию при различных гипотониях, в том числе, резистентных к действию имеющихся средств, и отсутствие у них побочных эффектов, характерных для адреномиметиков, свидетельствуют, что такие соединения могут стать основой для разработки новых эффективных вазопрессорных и противошоковых средств, способных создать новые возможности фармакотерапии гипотонических расстройств, особенно при оказании экстренной, неотложной помощи и лечении критических

состояний. Проведение детальных доклинических исследований наиболее эффективных ИТМ, в первую очередь, соединения Т-1059, является вполне обоснованным и целесообразным.

Исследования противолучевой активности изучаемых ИТМ

Способность некоторых S-монозамещённых ИТМ (в первую очередь - S-метил/ этил/аминоэтил-ИТМ) к противолучевому действию была показана ещё в 1960-80 годах (Жеребченко П.Г., Зильбер Ю.Д., Поспехова Г.П. и др Радиозащитный эффект солей S-алкилзамещённых производных изотиомочевины при их раздельном и комбинироваанном изучении // Радиобиология. - 1968. - Т.8, №.4. - С.582-587; Голощапова Ж.А., Тужилкова Т.Н., Мизрах Л.И. Экспериментальное обоснование использования некоторых производных изотиурония в качестве радиозащитных соединений // Радиобиология. - 1981. - Т.21, №.5. - С.521-525.). Но позднее было установлено, что эти ИТМ проявляют высокую NOS-ингибирующую активность (Garvey Е.Р., 1994; Wolff D.J., 1997). Более того, было выявлено, что многие известные радиопротекторы подавляют эндогенный синтез NO (Garvey Е.Р., 1994), а некоторые ингибиторы NOS и химические перехватчики NO обладают радиозащитным действием (Liebmann J., DeLica A.M., Ciffin D. et al. In vivo radiation protection by nitric oxide modulation // Cancer Res. - 1994. - Vol.54, N.13. - P.3365-3368; Гильяно H.A., Бондарев Г.Н., Носкин JI.A. и др. NO-зависимый путь модификации клеточной чувствительности к действию у- и нейтронного излучений // Радиац. биол. Радиоэкол. - 2004. - Т. 44, № 1. - С. 62-67; Гильяно Н.Я., Бондарев Г.Н., Коневега Л.В. и др. Модификация клеточной радиочувствительности ингибиторами NO-синтаз // Радиац. биол. Радиоэкол. - 2005. - Т.45, № 1. - С.63-67; Проскуряков С.Я., Коноплянников А.Г., Скворцов В.Г. и др Структура, активность и биологические эффекты субстрат-подобных ингибиторов NO-синтаз // Биохимия. - 2005. - Т.70, №.1. - С. 14-32; Коноплянников А.Г., Проскуряков С.Я., Коноплянникова O.A. и др Влияние некоторых ингибиторов NOS дигидротиазин-тиазолинового ряда на пострадиационное восстановление эндогенных КОЕ-С-8 у мышей // Радиац. биол. Радиоэкол. - 2007. - Т.47, № 1. - С.5-9; Sharmaa D., Sandura S.K., Rashmia R. et al. Differential activation of NF-кВ and nitric oxide in lymphocytes regulates in vitro and in vivo radiosensitivity // Mutat. Res. - 2010. - Vol.703, N.2. - P. 149-157.).

Вместе с тем, эти данные позволяли лишь предполагать о возможных механизмах повышения радиорезистентности при воздействии на обмен NO и роль NOS-ингибирующей активности в развитии противолучевого эффекта оставалась не вполне ясной. Кроме того, не был в полной мере исследован и общий вопрос о целесообразности применения ингибиторов NOS в качестве радиозащитных и радиомодифицирующих средств.

Для оценки роли ингибирования NOS при реализации радиозащитного действия производных ИТМ нами было проведено изучение NOS-ингибирующей и противолучевой активности 8-[2-алкил(арил)сульфонил]-производных 8-этил(винил)-ИТМ. Исследовано влияние этих производных ИТМ в дозах 1/3-1/2 ЛД50 на выживаемость аутбредных мыщей при воздействии у-излучения в дозе 10 Гр и активность синтеза NO в печени мышей Fi (CBAxC57BL6j).

Сопоставление полученных данных, отражающих NOS-ингибирующую и противолучевую активность, показало наличие достоверной корреляции в ряду исследованных S-замещённых ИТМ: производные ИТМ, обладающие in vivo высокой

способностью к подавлению синтеза N0, проявляли и большую противолучевую активность (Рис. 8).

Рисунок 8 - Взаимосвязь между N05-ингибирующей и противолучевой активностью в ряду исследованных 5-алкил-ИТМ. По оси ординат -30-суточная выживаемость аутбредных мышей, облучённых в дозе 10 Гр; по оси абсцисс - содержание N0 в печени мышей - Я = -0,92; р < 0,01 ■ Р1 (СВАхС57ВЦ), получавших изучаемые

соединения, в сравнении с контрольными животными; Я - коэффициент корреляции

20 40 60 80 100 Относительное содержание NO, % Спирмена

Эта взаимосвязь свидетельствовала, что в развитии противолучевого действия Б-алкил-ИТМ принципиальную роль играет подавление этими соединениями биогенного синтеза N0, и позволяла ожидать радиозащитное действие и у изучаемых Ы,8-замещённых ИТМ. Результаты предварительных исследований показали, что однократное в/б введение изучаемых Ь'^-замешёшшх ИТМ в дозах 1/4-1/2 ЛД16 за 15-20 минут до облучения достоверно повышало выживаемость подопытных животных и колониеобразующих гемопоэтических клеток при воздействии у-излучения (Рис. 9).

30

Ч 20

10

_L

1 2 3 4 5 6 Эксперимент №1

1 2 3 4 5 6 Эксперимент №2

1 2 3 4 5 Эксперимент №3

Рисунок 9 - Влияние изучаемых ИТМ на число селезёночных эндоколоний у самцов мышей Fi (CBAxC57BL6j) на 9 сутки после облучения в дозе 6 Гр. Во всех опытах / -

контроль; 2 - цистамин 225 мг/кг. Опыт№1: 3 - Т-1004 120 мг/кг; 4- Т-1006 120 мг/кг; 5 —Т-1023 120 мг/кг; б - Т-1032 150 мг/кг. Опыт №2: 3 - Т-1019 140 мг/кг; 4 -Т-1020 135 мг/кг; 5-Т-1049 220 мг/кг; 6-Т-1058 100 мг/кг. Опыт№3: З-Т-1023 130 мг/кг; 4 - Т-1059 120 мг/кг; 5- Т-1064 220 мг/кг. Символом * отмечено статистически значимое различие с контролем.

В ряду исследованных Ы,5-заме[цённых ИТМ также отмечалась связь между NOS-ингибируюшей и противолучевой активностью, аналогичная зависимости,

выявленной для S-замещённых ИТМ. Слабые ингибиторы NOS (Т-1019, Т-1058, Т-1064) проявляли умеренное, порой недостоверное радиозащитное действие. И, наоборот, активные ингибиторы NOS (соединения Т-1004, Т-1006, Т-1020, Т-1023, Т-1032, Т-1049 и Т-1059) обеспечивали противолучевую защиту, не уступая, а иногда и превосходя в эффективности действие цистамина и дифетура, которые применялись в дозах, близких к максимально переносимым (1/2 ЛД50).

Наблюдаемая связь между NOS-ингибирующей и противолучевой активностью изучаемых производных ИТМ, и наличие у них выраженных вазопрессорных свойств позволяли предположить, что основным механизмом противолучевого действия этих соединений является индукция тканевой гипоксии. Для проверки этого предположения было проведено исследование влияния изучаемых ИТМ в высоких, радиозащитных дозах (1/6-1/5 ЛД16) на гемодинамику интактных животных.

Как показано на рис. 10, при таких дозах изучаемые ИТМ вызывали изменения в гемодинамике, сходные с теми, которые наблюдались при применении этих соединений в низких дозах (см. рис. 3). Повышение УПСС в этом случае было более выраженным и продолжительным, и, как и при малых дозах, начальный гипертензивный эффект в дальнейшем на фоне брадикардии сменялся гипотонией при повышенном УПСС. Существенным отличием являлось то, что при данных дозах ИТМ вазопрессорное действие вызывало не только замедление сердечного ритма, но и сопровождалось ослаблением насосной функции сердца (УО снижался на 15-25%), и в результате отмечалось значительное и длительное ослабление системного кровотока: при воздействии Т-1059 СИ снижен на 30-35% в течение всего срока наблюдения; при воздействии Т-1023 - на 40-45% в течение 90 минут.

120

100

во

120

80

я

X

Систолическое АД, %

ЧСС, %

100

40

80

120

Диастолическое АД, %

40

200

100

120 30 60 90 120

Время наблюдения, минуты

30 60 90 120

Рисунок 10 - Влияние изучаемых производных ИТМ на гемодинамику интактных наркотизированных крыс \Vistar. Обозначения: светлые символы - соединение Т-1023 в дозе 60 мг/кг, тёмные - соединение Т-1059 в дозе 40 мг/кг.

Следовательно, полученные данные согласуются с предположением о гипоксическом механизме противолучевого действия ^8-замещённых ИТМ. Причём, обращает на себя внимание сходство изменений в гемодинамике, которые

индуцируют в радиозащитных дозах изучаемые ИТМ и ееротонин- и адренергичеекие радиопротекторы (Радиационная фармакология. / П.П. Саксонов, B.C. Шашков, П.В. Сергеев. - М.: Медицина, 1976. - 256 е.; Противолучевые лекарственные средства (учебная монография) / М.В. Васин // М.: Изд-во Российской медицинской академии последипломного образования, 2010. - 180 е.), что позволяет рассматривать ингибиторы NOS, и, в частности, изучаемые ИТМ, как один из видов вазоактивных гипоксических радиопротекторов.

Для оценки перспективности применения изучаемых N,S-3aMeiuëiiHbix ИТМ в качестве радиозащитных средств было проведено детальное исследование противолучевой активности соединения Т-1023, которое в предварительных опытах оказывало наиболее выраженное и стабильное радиозащитное действие. Исследование выживаемости клоногенных гемопоэтических клеток мышей Fi (CBAxC57BL6j) при воздействии у-излучения в дозе 5 Гр в зависимости от дозы соединения Т-1023 показало, что в отличие от аминотиоловых радиопротекторов, эффективно действующих только в субтоксических дозах (Васин М.В., 2010; Рождественский JI.M., 2013), достоверное противолучевое действие Т-1023 наблюдалось уже при дозе 1/8 ЛД16 (40 мг/кг), достигало максимума в области 1/4 ЛД16 (75 мг/кг), а при более высоких дозах Т-1023 защитный эффект оставался неизменным (Рис. 11).

Доза Т1023, мг/кг

Рисунок 11 - Зависимость выживаемости клоногенных клеток костного мозга мышей И] (СВАхС57ВЬ^), облучённых в дозе 5 Гр, от дозы Т-1023 (метод селезёночных экзоколоний). Символом * отмечено статистически значимое различие с контролем.

Аналогичная зависимость наблюдалась и по 30-суточной выживаемости мышей F, (CBAxC57BL6j) при облучении в дозе 10 Гр. В этом случае также достоверное противолучевое действие Т-1023 наблюдалось уже при дозе 1/8 ЛД16 (40 мг/кг), и радиозащитный эффект достигал максимума в области 1/4 ЛД,6 (75-85 мг/кг). Эти данные позволили рассматривать дозу Т-1023 40 мг/кг как минимальную, а 75 мг/кг как оптимальную радиозащитную дозу, и оценить терапевтическую широту Т-1023. Терапевтический индекс, рассчитанный как отношение минимальной радиозащитной дозы к ЛД10 (Хабриев Р.У., 2005), составил 5,5, а индекс радиозащитной широты, рассчитанный как ЕД50/ЛД50, составил 6,0 (4,1 ^8,8). Полученные показатели непротиворечивы и в 2-3 раза превышают соответствующие показатели серосодержащих радиопротекторов для данного вида животных.

100

10

l Jv Б

_J-1-1-1-i_ 10 _I_I_l_I_1—

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Доза, Гр

100 -ч

0,0

Рисунок 12 - Влияние Т-1023 в дозе 75 мг/кг на выживаемость клоногенных клеток

мышей F, (CBAxCS7BL6j) при воздействии у-облучения (тест селезёночных экзоколоний). А, Б — данные двух экспериментов. 1 - контрольные, 2 - подопытные животные. Кривыми показаны соответствующие log-линейные регрессии.

В качестве показателя противолучевой эффективности использован ФИД, который оценивали для оптимальной радиозащитной дозы Т-1023 (75 мг/кг). В опытах по 30-суточной выживаемости мышей Fi (CBAxC57BL6j) показатели ЛД50 у-излучения составили: для контрольных животных - 7,13 (6,62+7,64) Гр; для подопытных - 10,22 (9,61 + 10,93) Гр. Величина ФИД по отношению этих ЛД50, составила 1,44 (1,26-И,65). Несколько большие величины ФИД для этой дозы Т-1023 получены в двух опытах по выживаемости гемопоэтических клоногенных клеток (рис. 12). По данным первого опыта ФИД составил 1,81 (1,29+2,38), по данным второго - 1,56(1,21+1,94).

Полученные в этих исследованиях показатели терапевтической широты и противолучевой эффективности Т-1023 по действующим критериям отбора противолучевых средств (Хабриев Р.У., 2005; Владимиров В.Г., 1989) позволяют рассматривать это соединение в качестве перспективного объекта для создания нового радиопротектора экстренного действия.

Сложность процессов развития лучевого поражения и различие механизмов действия ряда радиопротекторов создают возможность для их комбинированного применения. Несмотря на то, что противолучевая активность некоторых ингибиторов NOS была показана более 20 лет назад, их совместное применение с другими радиопротекторами остаётся неисследованным. В этой связи было проведено сравнительное изучение влияния Т-1023 в сочетании с цистамином, серотонином, мексамином и индралином на выживаемость эндогенных клоногенных клеток костного мозга мышей F! (CBAxC57BL6j) при воздействии у-изл учения в дозе 6 Гр. Результаты исследований показали значительное фармакодинамическое взаимодействие данного ингибитора NOS с противолучевыми средствами различных классов, характер которого, судя по всему, определялся вазоактивными свойствами радиопротекторов (Рис. 13).

Цистамин

30 г

Серотонин

Цистамин: 0 150 0 150 Т-1023: 0 0 90 90

Серотонин: 0 150 0 75 150 Т-1023: О 0 75 75 40

Мексамин

Индралин

Мексамин: 0 20 О 0 20 20 Т-1023: 0 0 40 75 75 40

Индралин: 0 40 0 40 40 Т-1023: О 0 40 40 25

Рисунок 13 - Влияние Т-1023 в сочетании с некоторыми известными радиопротекторами на число селезёночных эндоколоний у мышей F] (CBAxC57BLâj) на 9 сутки после облучения в дозе 6 Гр. Символом * отмечены статистически значимые различия с группами, получавшими изучаемые соединения раздельно.

Сочетанное применение Т-1023 с цистамином, который в радиозащитных дозах вызывает резкое падение тонуса сосудов, сопровождалось достоверным снижением противолучевой эффективности. Но сочетанное применение Т-1023 с серотонин- и адренергическими радиопротекторами, обладающими вазопрессорным действием, сопровождалось выраженным увеличением радиозащитного эффекта. Причём, в этих опытах соединение Т-1023 статистически значимо повышало эффективность этих радиопротекторов даже в случае его применения в малых дозах, не проявляющих самостоятельного противолучевого действия. Полученные данные свидетельствуют, что ингибиторы NOS, и в частности, соединение Т-1023, могут являться ценными дополнительными компонентами, способными создать новые возможности в разработке более эффективных и безопасных противолучевых средств.

Исследования радиомодифицирующих свойств изучаемых ИТМ на моделях лучевой терапии опухолей

Во многих исследованиях показано, что, в связи с несовершенством сосудистой сети новообразований, в тканях солидных опухолей имеются гипоксичные области, в которых содержание кислорода значительно ниже, чем в нормальных окружающих тканях (Микрофизиология опухолей / С.П. Осинский, П. Ваумпель. - Киев: Наукова думка, 2009 - 256 е.). Это различие в оксигенации может определять как резистентность опухолей к лучевому воздействию, так и риски развития осложнений

радиотерапии. Индукция гипоксии фармакологическими средствами может в значительной мере селективно защищать нормальные ткани при лучевом воздействии (Prasanna P.G., 2012; Fahl W.E. Effect of topical vasoconstrictor exposure upon tumorocidal radiotherapy // Int. J. Cencer. - 2014. - Vol.135, N.4. - P.981-989; Nieder C., Andratschke N.H., Grosu A.L. Normal tissue studies in radiation oncology: A systematic review of highly cited articles and citation patterns // Oncol. Lett. - 2014. - Vol.8, N.3. -P.972-976.). В этой связи, способность изучаемых ИТМ создавать условия для развития гипоксии и оказывать эффективное противолучевое действие явилась основанием для изучения их радиомодифицирующих свойств на моделях лучевой терапии опухолей.

Исследования проведены на самцах крыс Wistar на моделях лучевой терапии саркомы М-1 при локальном воздействии на опухоль у-излучения в дозах 32 и 36 Гр. Животных-опухоленосителей брали в опыт на 11 сутки после перевивки саркомы. Крысам подопытных групп перед облучением вводили Т-1023 (однократно, в/б, 75 мг/кг).

Результаты исследований показали, что однократное введение Т-1023 животным-опухоленосителям не оказывало влияния на рост необлучённой саркомы (табл. 6). Независимо от применения Т-1023, рост опухоли имел экспоненциальный характер и на поздних сроках у многих животных этих групп в опухолевых узлах наблюдались некротические изменения.

Таблица 6 - Динамика роста саркомы М-1 в экспериментальных группах

Время, Средний объём опухолевого узла, отн ед. * (М±а)

сутки Контроль Т-1023 32 Гр Т-1023 + 32 Гр 36 Гр Т-1023 + 36 Гр

0 1,0±0,3 1,0±0,2 1,0±0,2 1,0±0,2 1,0±0,3 1,0±0,2

3 1,4±0,3 1,3±0,2 1,3±0,3 1,3±0,5 1,1 ±0,5 1,2±0,3

5 2,0±0,4 2,2±0,3 1,3±0,3 1,1 ±0,6 1,0±0,7 1,0±0,4

7 2,4±0,6 2,3±0,6 1,1 ±0,3 1 0,9±0,5 1 0,6±0,4 1 0,9±0,3 1

10 3,1±0,9 3,2±0,8 0,7±0,2 1 0,7±0,4 1 0,3±0,3 1 0,6±0,4 1

13 4,4±1,5 4,2±1,3 0,4±0,2 12 0,6±0,4 1 0,2±0,3 12 0,3±0,3 1 2

17 5,6±2,2 5,8±2,1 0,3±0,1 12 0,4±0,3 12 0,2±0,2 12 0,3±0,3 12

25 10,6±3,9 10,0±3,1 0,4±0,2 12 0,5±0,5 1 0,3±0,3 12 0,4±0,5 1

Примечания. * данные нормированы на начальный (11 сутки роста) средний объём в группах; - статистически значимое различие с контрольной группой; 2 - в группах, получавших облучение, статистически значимое различие с начальным значением (при t=0).

Несмотря на то, что Т-1023 было введено подопытным животным в оптимальной радиозащитной дозе, в этих исследованиях ингибитор NOS также не оказал влияния и на радиочувствительность саркомы. Как показано в табл. 6, на всех сроках не наблюдалось различий объёмов опухолевых узлов между группами, получавшими облучение в равных дозах. Независимо от применения Т-1023, у-излучение оказывало эффективное терапевтическое действие, сопровождавшееся значительным (в 3-5 раз) регрессом и длительной задержкой роста саркомы - по меньшей мере, на 17 суток. Во всех группах к 10-13 суткам после облучения у части животных наблюдался полный

регресс узла (у 40% при дозе 32 Гр, и у 50-60% при дозе 36 Гр), но на поздних сроках отмечался рецидивный рост сохранившихся опухолей.

Таблица 7 - Влияние Т-1023 на лучевые реакции кожи крыс \Vistar при воздействии у-излучения в дозе 32 Гр

Степень лучевой реакции кожи по классификации Доля животных, %

7 сутки 10 сутки 13 сутки

КТОО/ЕСЖТС-95 32 Гр Т-1023 + 32 Гр 32 Гр Т-1023 + 32 Гр 32 Гр Т-1023 + 32 Гр

0 — нет проявлений; 0 0 0 0 0 0

1 - умеренная эритема, эпиляция, сухой эпидермит; 87,5 87,5 12,5 62,5 0 62,5

2 - яркая эритема, островковый влажный 12,5 12,5 50 37,5 12,5 25

эпидермит, умеренный отек;

3 - сливной влажный эпидермит, отёк с вдавлением; 0 0 37,5 0 75 12,5

4 - язва, кровотечение, некроз; 0 0 0 0 12,5 0

Различие: недостоверное р < 0,05 р < 0,01

Рисунок 14 - Картина острых лучевых реакций кожи при облучении в дозе 32 Гр у крыс, не получавших Т-1023.

(А, Б) - 11 сутки. Внешняя поверхность - отёк кожи, сливной влажный эпидермит; внутренняя поверхность - частичная эпиляция, островковый эпидермит.

(В, Г) - 25 сутки. Стадия регенерации эксудативного эпидермита, полная эпиляция шёрстного покрова.

Если лучевые эффекты в отношении саркомы соединение Т-1023 в этих опытах не модифицировало, то его влияние на тяжесть лучевых реакций кожи было отчётливым. В группах, получавших облучение в дозе 32 Гр, начальная динамика

развития кожных лучевых реакций не различались: проявления манифестировали на 3-5 сутки и до 7-х суток оставались в пределах 1-ой степени реакции - отмечалась умеренная эритема и сухой, иногда, распространённый эпидермит (табл. 7). Но к 1013 суткам у большей части крыс, не получавших соединение Т-1023, тяжесть лучевых повреждений быстро нарастала - развивался влажный, чаще сливной эпидермит, нередко сопровождавшийся изъязвлениями и мелкими кровотечениями (рис. 14), что свидетельствовало о полном поражении и отторжении эпидермиса и частичном поражении дермы. Воспалительные процессы в этой группе протекали длительно и у значительной части животных, имевших высокую степень лучевой реакции, до конца наблюдения регенерация повреждений оставалась незавершённой.

Рисунок 15 - Картина острых лучевых реакций кожи при облучении в дозе 32 Гр у крыс, получавших Т-1023.

(А, Б) - 11 сутки. Внешняя поверхность - эритема, островковый влажный эпидермит; внутренняя поверхность -умеренная эритема.

(В, Г) - 25 сутки. Проявления лучевой реакции отсутствуют.

У крыс, которым перед облучением в дозе 32 Гр вводили соединение Т-1023, к 10-13 суткам отягощение лучевой реакции наблюдалось у небольшой части особей, и, как правило, было ограничено усилением эритемы и развитием умеренного островкового влажного эпидермита (табл. 7, рис. 15), что свидетельствовало о значительной сохранности эпидермиса. В этот период отличия тяжести лучевых повреждений кожи между группами, облучёнными в дозе 32 Гр, принимало выраженный характер и по степени лучевой реакции в классификации ЯТСЮ-95 наблюдалось статистически значимое различие. В дальнейшем у крыс, получивших Т-1023, проявления лучевой реакции быстро регрессировали и к 25-м суткам эксперимента у 75% этих животных полностью отсутствовали какие-либо изменения кожи и её придатков.

Таблица 8 - Влияние Т-1023 на лучевые реакции кожи крыс \Vistar при воздействии у-излучения в дозе 36 Гр

Степень лучевой реакции кожи по классификации Доля животных, %

7 сутки 10 сутки 13 сутки

ЯТСЮ/ЕСЖТС-95 36 Гр Т-1023 + 36 Гр 36 Гр Т-1023 + 36 Гр 36 Гр Т-1023 + 36 Гр

0 - нет проявлений; 0 0 0 0 0 0

1 — умеренная эритема, 62,5 75 12,5 62,5 0 0

эпиляция, сухой эпидермит;

2 - яркая эритема, остров- 37,5 25 50 12,5 25 75

ковый влажный эпидермит,

умеренный отек;

3 - сливной влажный эпи- 0 0 37,5 25 50 25

дермит, отёк с вдавлением;

4 - язва, кровотечение, 0 0 0 0 25 0

некроз;

Различие: недостоверное р < 0,05 р < 0,05

Рисунок 16 - Картина острых лучевых реакций кожи при облучении в дозе 36 Гр у крыс, не получавших Т-1023.

(А, Б) - 11 сутки. Внешняя поверхность - отёк кожи, сливной влажный эпидермит, формирование глубоких дефектов; внутренняя поверхность - эпиляция, влажный эпидермит.

(В, Г) - 25 сутки. Внешняя поверхность - незавершённая регенерация глубокого дефекта за счёт рубцевания. Внутренняя поверхность - стадия регенерации экссудативного эпидермита, полная эпиляция шёрстного покрова.

При воздействии у-излучением в дозе 36 Гр соединение Т-1023 также оказывало статистически значимое влияние на развитие острой лучевой реакции кожи (табл. 8). У животных, не получавших Т-1023, к 10-13 суткам в большинстве случаев на фоне выраженного отёка кожи развивался распространённый экссудативный дерматит, нередко приобретавший язвенно-некротический характер, сопровождавшийся изъязвлениями, кровоизлияниями и формированием глубоких дефектов (рис. 16), что

Ж- ЩЗШЁм Шшшк - з НВЯкЯЖ! 'V б

ц*

свидетельствовало о значительном поражении глубоких слоев дермы и подлежащих тканей. В дальнейшем, по мере ослабления воспаления, такие дефекты восстанавливались за счёт краевой эпителизации, а в некоторых случаях - за счёт кожных дериватов с формированием рубцовой ткани. К 25-м суткам эксперимента у большинства животных этой группы регенерация лучевых повреждений кожи оставалась незавершённой.

Рисунок 17 - Картина острых лучевых реакций кожи при облучении в дозе 36 Гр у крыс, получавших Т-1023. (А, Б) - 11 сутки. Внешняя поверхность - островковый влажный эпидермит; внутренняя поверхность - частичная эпиляция, сухой эпидермит. (В, Г) - 25 сутки. Внешняя поверхность - без изменений. Внутренняя поверхность - полная эпиляция шёрстного покрова.

У большинства животных, получавших Т-1023 перед облучением в дозе 36 Гр, к 10-13 суткам выраженный сухой эпидермит приобретал характер островкового экссудативного (рис. 17). Однако сливная форма развилась только у четверти этих животных и язвенно-некротических явлений при этом не наблюдалось (табл. 8). В дальнейшем, по мере ослабления воспаления, у этих крыс развивалась активная регенерация - к 25 суткам у подавляющего большинства животных этой группы сохранялись минимальные проявления лучевой реакции — сухое шелушение кожи и, в разной степени, эпиляция шёрстного покрова на внутренней поверхности облучённой конечности. Только у одной особи регенерация после сливного экссудативного дерматита оставалась незавершённой.

Таким образом, при обеих дозах у-излучения соединение Т-1023 статистически значимо ограничивало степень острых лучевых реакции кожи подопытных животных. При этом заметного влияния Т-1023 на развитие воспалительных и регенераторных процессов в этих опытах не наблюдалось - течение близких по объёму и клинической тяжести лучевых повреждений у опытных и контрольных животных было сходным. Это свидетельствует, что соединение Т-1023 ослабляло, именно, лучевую альтерацию глубоких слоев кожи и подлежащих тканей - вызывало снижение радиочувствительности нормальных тканей в поле облучения. В то же время, в этих опытах ингибитор NOS не модифицировал чувствительность саркомы к лучевому воздействию и не снижал противоопухолевую эффективность радиотерапии.

ШЁЁЯ

Полученные в этих исследованиях результаты свидетельствуют, что гипоксический механизм противолучевого действия ингибиторов NOS позволяет им оказывать селективную защиту немалигнизированных тканей при лучевой терапии солидных новообразований и в этой связи изучаемые производные ИТМ, и, в частности, соединение Т-1023, можно рассматривать как перспективную основу для разработки фармакологических средств профилактики осложнений радиотерапии.

Исследования противоопухолевой и антиметастатической активности

изучаемых ИТМ

Участие NO в сосудистой системе касается и таких долгосрочных процессов, как ангиогенез. Авторы исследований опухолевого ангиогенеза среди множества модуляторов особую роль отводят оксиду азота (Isenberg J.S., 2009; Ziehe M., Morbidelli L. Molecular regulation of tumour angiogenesis by nitric oxide // Eur. Cytokine Netw. - 2009. - Vol.20, N.4. - P.164-170; Burke A.J., Sullivan F.J., Giles F.J. et al. The yin and yang of the nitric oxide in cancer progression // Carcinogenesis. - 2013. - Vol.34, N.3. - P.503-512; Cheng H., 2014). Действие большинства ангиогенных факторов вызывает повышение экспрессии и каталитической активности eNOS в клетках эндотелия, что, в свою очередь, инициирует каскад процессов, ведущих к длительному снижению тонуса сосудов и повышению их проницаемости, миграции и пролиферации эндотелиальных клеток, и, в конечном итоге, к развитию новой сосудистой сети. В этой связи неспецифическое антиваскулогенное влияние на опухоль может оказывать подавление синтеза NO химическими ингибиторами NOS.

Эти представления, а также данные о способности изучаемых N,S-3aMeuiëHHbix ИТМ к эффективному ингибированию активности NOS явились основанием для изучения противоопухолевой и антиметастатической активности этих соединений.

Ежедневное в/б введение самцам мышей F, (CBAxCS7BL6j) соединений Т-1004, Т1023 и Т-1032 в дозе 60 мг/кг (1/6-1/5 ЛД)6) с 1 по 21-22 сутки после перевивки карциномы лёгких Льюис (КЛЛ) не вызывало каких-либо токсических и летальных эффектов. В то же время, все эти ИТМ оказывали сходное влияние на развитие КЛЛ, сопровождавшееся статистически значимым антиметастатическим и противоопухолевым эффектом. Как показано на рис. 18, при такой схеме введения противоопухолевый эффект ингибиторов NOS реализовался преимущественно на раннем этапе развития карциномы и проявлялся начальной задержкой роста опухоли: на 1,5-2 суток - при воздействии Т-1004 и Т-1032; и на 3 суток - при воздействии Т-1023. В результате этой задержки объём опухоли у животных подопытных групп оставался достоверно ниже, чем в контроле в течение всего срока наблюдения и индекс ТРО стабильно сохранялся на высоком уровне: 30-50% - для соединений Т-1004 и Т-1032; 45-70% - для соединения Т-1023. При этом ингибиторы NOS также подавляли и метастазирование карциномы - на 21-22 сутки роста опухоли число лёгочных метастазов у подопытных животных было на 35-50% меньше, чем в контроле.

Противоопухолевая активность изучаемых ИТМ наблюдалась не только на ранних стадиях опухолевого процесса. Как показано, введение Т-1023 с 7 суток роста КЛЛ, когда опухолевые узлы уже сформировались у всех животных, также сопровождалось развитием задержки роста опухоли примерно на 2 суток, и через 10 дней объём опухолей у животных опытной группы был достоверно ниже, чем в контроле (ИР снижался до 47-50%). Кроме того, воздействие Т-1023 на развившуюся карциному в данном опыте сопровождалось выраженным антиметастатическим

эффектом — на 21 сутки число лёгочных метастазов у подопытных животных было в 5 раз ниже, чем в контроле. Причём, в этом случае соединение Т-1023 не только эффективно ингибировало процессы метастазирования, но статистически значимо подавляло рост метастазов - число крупных лёгочных метастазов снизилось почти в 3 раза.

ИИМ = 45%

8 20 -

10 -

60 г

; 40

s

о 20

ИИМ = 79%

It

6 9 12 15 18 21 Время наблюдения, сутки

Крупные Малые

Все

Рисунок 18 - Влияние на рост и метастазирование карциномы лёгких Льюис соединения Т-1023 при ежедневном введении в дозе 60 мг/кг с 1 по 21 сутки (вверху) и с 7 по 21 сутки после перевивки (внизу). Обозначения: светлые символы -контроль; тёмные - подопытные животные; символом * отмечены статистически значимые различия с контролем.

Предположение об антиангиогенном механизме противоопухолевого действия изучаемых ИТМ было подтверждено при сравнительном изучении влияния на морфологию тканей КЛЛ соединения Т-1023 и VEGF-ингибитора бевацизумаба (авастин). Результаты этих исследований показали, что Т-1023, подобно бевацизумабу, вызывает при субхроническом введении выраженные нарушения перитуморальной васкуляризации опухоли (рис. 19), которые сопровождаются достоверным снижением пролиферативной активности клеток карциномы и повышением их апоптотической и некротической гибели.

Известно, что применяемые в онкологической практике ингибиторы VEGF и мультикиназные ингибиторы повышают эффективность радио- и химиотерапии (Fang Р., Hu J.H., Cheng Z.G., et al. Efficacy and safety of bevacizumab for the treatment of advanced hepatocellular carcinoma: a systematic review of phase II trials // PLoS One. -2012. - Vol.7, N.12. - doi: 10.1371/journal.pone.0049717; Lein S., Lowman H.B. Therapeutic anti-VEFG antibodies // Handb. Exp. Pharmacol. - 2008. - N. 181. - P. 131-150; Schmidt В., 2012; Abdel-Rahman O., 2014). Изучаемые производные ИТМ также демонстрировали такую способность. Так, сравнительное изучение противоопухолевого действия циклофосфана и соединения Т-1023 при их раздельном

и сочетанном применении показало, что эти средства обладают однонаправленной противоопухолевой активностью, но разными механизмами действия на карциному лёгких Льюис (рис. 20).

Рисунок 19 - Сосудистая сеть перитуморальных зон опухолевых узлов карциномы лёгких Льюис на 15 сутки роста (х250). Иммуноокрашивание антителами к С031. Слева - опухоль контрольного животного, справа - опухоль животного, получавшего

соединение Т-1023.

Объём опухоли,

Объёмное содержание Объёмное содержание паренхимы. % зон некроза,г

Плотность клеток карциномы, %

Митотический

индекс, %

Алоптотическии индекс, %

Контроль

Т-1023 с 7 по 11 сутки

Циклофосфан на 7 сутки

Циклофосфан на 7 сутки и Т-1023 с 7 по 11 сутки

Рисунок 20 - Влияние на морфофункциональные показатели тканей карциномы лёгких Льюис циклофосфана и соединения Т-1023 при их раздельном и сочетанном применении. Символом * отмечены статистически значимые различия с группами, получавшими циклофосфан и Т-1023 раздельно.

Соединение Т-1023, нарушая васкулогенез, снижало пролиферативную активность клеток карциномы, способствовало их апоптотической гибели и выраженно стимулировало формирование зон некроза в экспериментальной опухоли. Циклофосфан вызывал альтеративно-деструктивные изменения паренхимы и стромы опухоли, сопровождавшиеся снижением пролиферации клеток карциномы и значительным усилением их апоптотической гибели. При сочетанном применении Т-1023 и циклофосфана наблюдалось отчётливое усиление выраженности патоморфологических нарушений в тканях КЛЛ, степени индукции апоптотической и некротической гибели клеток карциномы, и резкое снижение репопуляционной способности неопластических клеток (рис. 21).

Контроль

Т-1023 с 7 по 11 сутки

Рисунок 21 - Пролиферативная активность в опухолевых узлах карциномы лёгких Льюис на 11 сутки роста. Обзорные препараты. Иммуноокрашивание антителами

к РС^.

Циклофосфан на 7 сутки

Циклофосфан на 7 сутки и Т-1023 с 7 по 11 сутки

Полученные данные свидетельствуют, что ингибиторы NOS, в том числе, и изучаемые производные ИТМ, могут являться перспективной основой для разработки лекарственных средств комплексной терапии онкологических заболеваний.

ВЫВОДЫ

1. Выявлены особенности химического строения ^8-алкил/ацил-замещённых изотиомочевин, определяющие их NOS-ингибирующие свойства. Наиболее активными конкурентными, обратимыми ингибиторами NO-синтаз являются соединения, в которых S-замещающий радикал представлен низшим алкилом. Селективность таких производных к изоформам NOS определяется N-замещающим радикалом.

2. Полученные в результате направленного синтеза ^ацил-8-алкил-замещённые изотиомочевины под шифрами Т-1004, Т-1020, Т-1023, Т-1032, Т-1049 и Т-1059 проявляют селективность к ингибированию eNOS и iNOS, и в нетоксических дозах in vivo вызывают выраженное подавление эндогенного синтеза NO в биологических

жидкостях и тканях организма, что свидетельствует о целесообразности детального изучения их фармакологических свойств.

3. Сосудосуживающее действие М,5-замещённых ИТМ: Т-1020, Т-1023, Т-1049 и Т-1059 (однократно, в/б) в нетоксических дозах (-1/25 ЛД1б) реализуется на различных моделях гипотонических состояний, в том числе, резистентных к действию существующих вазопрессорных лекарственных средств, и отличается большой длительностью и отсутствием нежелательных эффектов, характерных для адреномиметиков.

4. При нормотензивном состоянии вазопрессорное действие исследованных производных ИТМ сопровождается незначительным гипертензивным эффектом вследствие развития барорефлекторной реакции, ограничивающей подъём АД. Назначение таких соединений в эффективных «гипертензивных» дозах (-1/25 ЛД|6) сопровождается умеренной рефлекторной реакцией, не требующей фармакологической коррекции.

5. Противолучевое действие алкил-замещённых изотиомочевин реализуется путём индукции гипоксии. Испытанные соединения: Т-1004, Т-1023, Т-1032, Т-1049 обеспечивают эффективную радиационную защиту в меньших дозах, по сравнению с известными серосодержащими радиопротекторами, действующими в субтоксических дозах, и повышают противолучевую эффективность серотонин- и адренергических радиопротекторов.

6. Противолучевое действие исследованных производных ИТМ (Т-1004, Т-1023) способно обеспечивать селективную защиту немалигнизированных тканей при лучевой терапии солидных опухолей, без ослабления противоопухолевой эффективности радиационного воздействия.

7. Исследованные производные ИТМ при субхроническом введении оказывают выраженное противоопухолевое и антиметастатическое действие, подавляя опухолевый ангиогенез и стимулируя апоптотическую и некротическую гибель опухолевых клеток, и повышают эффективность радио- и химиотерапии новообразований.

8. Полученные данные свидетельствуют о перспективности разработки на основе наиболее активных соединений (Т-1004, Т-1023, Т-1059) лекарственных средств принципиально нового механизма действия, способных расширить возможности фармакотерапии при лечении ряда распространённых заболеваний, при оказании экстренной, неотложной помощи и терапии критических состояний.

РЕКОМЕНДАЦИИ

Выявленные в данном исследовании особенности молекулярной структуры N,S-замещённых ИТМ, определяющие их способность к ингибированию NOS, и установленная зависимость селективности изученных соединений к изоформам NOS от характера N-замещающего ацильного радикала создают основу для рационального поиска и дизайна селективных, конкурентных тиоамидиновых ингибиторов NOS в ряду производных ИТМ, тиазола, тиазолина, тиазина.

Полученные в результате проведённых исследований данные, подтверждённые патентами РФ RU2353614 (Проскуряков С .Я., Филимонова М.В., 2009), RU2475479 (Филимонова М.В., 2013), RU2503450 (Филимонова М.В., 2014), RU2506082 (Мандругин A.A., Филимонова М.В., 2014), RU2552529 (Филимонова М.В., 2015),

дают основание планировать разработку новых лекарственных средств: на основе соединения Т-1059 - вазопрессорного и противошокового средства, на основе соединения Т-1023 - радиопротектора экстренного действия и средства профилактики осложнений лучевой терапии, а также свидетельствуют о целесообразности детального изучения перспективности применения конкурентных ингибиторов NOS в качестве средств адъювантной терапии злокачественных новообразований.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1. Проскуряков, С.Я. NO-ингибирующая и вазотропная активность некоторых соединений, содержащих тиоамидиновую группу / С.Я. Проякуряков, Н.Г. Кучеренко, А.И. Тришкина, М.В. Филимонова, А.Г.Шевчук, Л.В.Штейн, Ю.Г.Верховский,

A.Г.Коноплянников, А.А.Мандругин, В.М.Федосеев, В.Г.Скворцов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2002. - Т. 134, № 10. - С. 393-396.

2. Проскуряков, С.Я. Влияние ингибитора NO-синтазы 2-АДТ на эндотоксин-индуцированные изменения гемодинамики и дыхания крыс / С.Я. Проскуряков, М.В. Филимонова, Ю.Г. Верховский, А.Г. Коноплянников, А.А.Мандругин,

B.М.Федосеев, В.Г.Скворцов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2004.-Т.138, № 10. -С.446-449.

3. Проскуряков, С.Я. Влияние NO-ингибиторов на гипотензию, вызванную гиповолемическим шоком / С.Я. Проскуряков, М.В. Филимонова, О.Н. Боровая, Н.Г. Кучеренко, А.И.Тришкина, Л.В.Штейн, В.Г.Скворцов, Л.П.Ульянова, Л.И.Шевченко, Ю.Г.Верховский // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. -Т. 150, № 7.- С.23-27.

4. Филимонова, М.В. Влияние ^пропионил-8-изопропил-изотиомочевины на продукцию биогенного оксида азота (NO) и гемодинамические параметры животных при эндотоксическом шоке / М.В. Филимонова, Л.И. Шевченко, В.И. Суринова, С.П. Орленко, В.М.Макарчук, С.Я.Проскуряков // Вопросы биологической, медицинской, фармацевтической химии. - 2011. - №.9. - С.35-39.

5. Филимонова, М.В. Антигипотензивная активность Ы-2-ацетиламино-5,6-дигидро-4Н-1,3-тиазина / М.В. Филимонова, Т.П. Трофимова, Г.С. Борисова, A.A. Мандругин // Химико-фармацевтический журнал. - 2012. - Т.46, № 3. - С.39-41.

6. Филимонова, М.В. Радиозащитные свойства производных изотиомочевины с NO-ингибирующим механизмом действия / М.В. Филимонова, С.Я. Проскуряков, Л.И. Шевченко, A.C. Шевчук, Г.А.Лушникова, В.М.Макарчук, Е.В.Арзамасцев, В.И.Лаба, К.И.Малиновская, Е.Л.Левицкая. // Радиационная биология. Радиоэколология. - 2012. - Т.52, № 6. - С.593-601.

7. Орлова, М.А. Влияние производных тиазина и тиомочевины - эффекторов NO-синтазы - на выживаемость лейкемических клеток / М.А. Орлова, Т.П. Трофимова, М.В. Филимонова, А.Н. Прошин, Зайцев Д.А. // Известия РАН. Серия Химическая. -2013. -№4.-С.1111-1114.

8. Плотникова, Е.Д. Молекулярное моделирование, рентгеноструктурный анализ и изучение iNOS-ингибирующей активности гидрохлорида З-имино-2,4-

диазабицикло[3.3.1 ]нонан-1 -ола / Е.Д. Плотникова, Е.В. Нуриева, Д.И. Перегуд, М.В. Онуфриев, Н.В. Гуляева, В.М. Макарчук, М.В. Филимонова, Зефиров Н.С., Зефирова

0.Н. // Журнал органической химии. - 2013. - Т.49, Вып.8. - С.1128-1131.

9. Филимонова, М.В. К вопросу о механизме радиозащитного действия ингибиторов NO-синтаз / М.В. Филимонова, Л.И. Шевченко, Т.П. Трофимова, В.М. Макарчук, А.С.Шевчук, Г.А.Лушникова // Радиационная биология. Радиоэколология.

- 2014. - Т.54, №.5. - С.500-506.

10. Орлова, М.А. О перспективах некоторых новых подходов воздействия на лейкемические клетки / М.А. Орлова, С.А. Румянцев, А.П. Орлов, С.В.Никулин, Т.П.Трофимова, М.В. Филимонова, А.А.Полозников, Е.Ю.Осипова // Известия РАН. Серия Химическая. - 2014. - № 5. - С. 1205-1210.

11. Филимонова, М.В. Экспериментальное исследование противоопухолевой активности нового ингибитора синтаз оксида азота Т1023 / М.В. Филимонова, В.В. Южаков, Л.И. Шевченко, Л.Н. Бандурко, Л.Е.Севанькаева, В.М.Макарчук, Е.А.Чеснакова, А.С.Шевчук, М.Г.Цыганова, Н.К.Фомина, И.Э.Ингель, В.И.Суринова // Молекулярная медицина. - 2015. - № 1. - С.61-64.

Патенты

1. Антигипотензивное средство : пат. 2353614 Рос. Федерация : МПК С07С335/32, А61К31/27, А61Р9/02 / Проскуряков С.Я., Верховский Ю.Г., Филимонова М.В., Шевченко Л.И., Мандругин A.A., Трофимова Т.П., Федосеев В.М.., заявители и патентообладатели Государственное учебно-научное учреждение Химический факультет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова, Государственное учреждение Медицинский радиологический научный центр РАМН.

- № 2007140745/04, заявл. 06.11.2007, опубл. 27.04.2009. .- 14с.

2. Вазоконстрикторное средство : пат. 2475479 Рос. Федерация : МПК С07С 335/38, А61Р 9/02, А61Р 9/08, А61Р 43/00 / Филимонова М.В., Шевченко Л.И., Макарчук В.М., Шевчук A.C., Лушникова Г.А., заявитель и патентообладатель Федеральное Государственное бюджетное учреждение Медицинский радиологический научный центр Минздравсоцразвития России. - № 2011152553/04, заявл. 23.12.2011, опубл..

20.02.2013 Бюл. №5. - 14 с.

3. Противоопухолевое средство : пат. 2503450 Рос. Федерация : МПК А61К 31/155, А61Р 35/00 / Филимонова М.В., Шевченко Л.И., Макарчук В.М., Шевчук A.C., Южаков В.В., Цыб А.Ф., заявитель и патентообладатель Федеральное Государственное бюджетное учреждение Медицинский радиологический научный центр Минздравсоцразвития России. - № 2012115543/15, заявл. 19.04.2012, опубл.

10.01.2014 Бюл. № 1.-9 с.

4. Антигипотензивное средство : пат. 2506082 Рос. Федерация : МПК А61К 31/54, А61Р 9/00 / Мандругин A.A., Трофимова Т.П., Борисова Г.С., Филимонова М.В., Шевченко Л.И., Макарчук В.М., Проскуряков СЛ., заявители и патентообладатели Государственное учебно-научное учреждение Химический факультет Московского

Государственного Университета им. М.В. Ломоносова, Федеральное Государственное бюджетное учреждение Медицинский радиологический научный центр Минздравсоцразвития России. - № 2011120567/15, заявл. 24.05.2011, опубл. 10.02.2014 Бюл. № 4. - 14 с.

5. Вазопрессорное средство : пат. 2552529 Рос. Федерация : МПК С07С 335/30, А61К 31/155, А61Р 9/00 / Филимонова М.В., Шевченко Л.И., Макарчук В.М., Чеснакова Е.А., Цыб А.Ф., заявитель и патентообладатель Федеральное государственное бюджетное учреждение «Медицинский радиологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации. - № 2013152926/04, заявл. 29.11.2013, опубл. 10.06.2015 Бюл. №16. - 16 с.

Статьи в научных изданиях

1. Верховский, Ю.Г. Синтез и отбор новых ингибиторов продукции биогенного оксида азота / Ю.Г. Верховский, М.В. Филимонова, Н.Б. Борышева, Г.А. Лушникова и др. // Труды Регионального конкурса научных проектов в области естественных наук,- Калуга,- 2008,- Вып. 13,- С.254-265.

2. Верховский, Ю.Г. Исследование связи между структурой и NOS-ингибирующей активностью N,S-3aMemeinn,ix производных изотиомочевины и обоснование нового направления в создании на их основе антигипотензивных средств широкого спектра действия / Ю.Г. Верховский, М.В. Филимонова, О.Н. Боровая, Г.А. Лушникова и др. // Труды Регионального конкурса научных проектов в области естественных наук-Калуга,- 2009,- Вып. 14,- С.361-372.

3. Макарчук, В.М. Антигиповолемическое действие Ы-пропионил-8-изопропил-изотиомочевины гидробромида при септическом шоке у крыс-самцов Wistar / В.М. Макарчук, М.В. Филимонова, С.Я. Проскуряков, В.И. Суринова и др. // Сборник научных работ лауреатов конкурса им. Е.Р.Дашковой. - Калуга: КГУ им. К.Э.Циолковского - 2010. - Вып. 4. - С.34-42.

4. Макарчук, В.М. Влияние ряда производных изотиомочевины на показатели артериального давления крыс в состоянии тяжёлого геморрагического шока / В.М. Макарчук, М.В. Филимонова, Г.С. Борисова / Мед. академич. журнал. - 2010. - Т. 10, №5.-С. 167.

5. Filimonova, M.V. Vasopressive and radioprotective effects of NOS inhibitors -isothiourea derivatives / M.V. Filimonova, S.E. Ulyanenko, T.P. Trofimova, L.I. Shevchenko et al. // Proc. Int. Conf. "Radiation safety challengers in the 21th century". -Yerevan, 2012. - P.33-35.

6. Филимонова, М.В. Ангиостатическое влияние ингибиторов NO-синтаз из класса 8,М-замещённых производных изотиомочевины на опухолевый ангиогенез / М.В. Филимонова, Л.И. Шевченко, В.В. Южаков, В.М. Макарчук и др. // Труды Регионального конкурса проектов в области естественных наук. - Калуга. - 2013. -Вып.18. - С.147-151.

7. Филимонова, М.В. Экспериментальная и теоретическая разработка противошоковых и противоопухолевых средств нового поколения на основе ингибиторов NO-синтаз / М.В. Филимонова, Л.И. Шевченко, В.В. Южаков, В.М.

Макарчук и др. // Труды регионального конкурса проектов фундаментальных научных исследований. Калужский региональный научный центр им. А.В Дерягина. -Калуга. - 2014. - Вып.19. - С 151-155.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

АД, АДС, АДд - артериальное давление, систолическое и диастолическое АД

в/б, в/в, в/м, п/к - внутрибрюшинное, внутривенное, внутримышечное, подкожное

введение

НИМ - индекс ингибирования метастазирования

ИР - индекс роста опухоли

ИТМ - изотиомочевина

KJIJI - карцинома лёгких Льюис

ЛПС - липополисахарид

МОК - минутный объём крови

СИ - сердечный индекс

ТРО - индекс торможения роста опухоли

УО - ударный объём

УПСС - удельное периферическое сопротивление сосудов

ФИД - фактор изменения дозы

ЧСС - частота сердечных сокращений

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс

CD31 - или РЕСАМ-1 (адгезионная молекула тромбоцит/эндотелиальной клетки-1) в иммуногистохимии используется как маркер эндотелиоцитов

1С50 - средняя эффективная концентрация ингибитора, подавляющая активность

ферментов на 50%

NO - оксид азота

NOS - синтаза оксида азота

nNOS, iNOS, eNOS - нейрональная, индуцибельная и эндотелиальная NOS

PCNA - (циклин) белок, экспрессируемый на 0г02-стадиях митотического цикла, в

иммуногистохимии используется как маркер пролиферирующих клеток

VEGF - васкулоэндотелиальный фактор роста

а - среднеквадратичное отклонение

Подписано в печать 08.07.2015. Формат 60x84 Vi6. Объём 2 п.л. Тираж 100 экз. Печать офсетная. Заказ № 1259.

Отпечатано в МП «Обнинская типография» 249035 Калужская обл., г. Обнинск, ул. Комарова, 6