Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Адаптационная защита сосудистой системы при гиперпродукции оксида азота

На правах рукописи

- - поп ¡гз

ПОКИДЫШЕВ ДМИТРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

АДАПТАЦИОННАЯ ЗАЩИТА СОСУДИСТОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ГИПЕРПРОДУКЦИИ ОКСИДА АЗОТА

14.00.16. - патологическая физиология

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1999

Работа выполнена в лаборатории патофизиологии сердца Научно-исследовательского института общей патологии и патофизиологии Российской АМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Е.Б.Манухина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.А.Медведева доктор биологических наук А.М.Мелькумянц

Ведущее учреждение: Российский Университет Дружбы народов

Автореферат разослан20 сентября 1999 года

Защита диссератции состоится «21» октября 1999 года в!5г. на заседании Диссертационного совета Д 001.03.01 при Научно-исследовательском институте общей патологии и патофизиологии РАМН по адресу: 125315 Москва, Балтийская ул., д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук Л.Н. Скуратовская

р ЯЗ'Я

ь о ^ (

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

Оксид азота (N0) является наиболее мощным из всех известных эндогенных вазодилататоров и играет ключевую роль в поддержании нормального тонуса сосудов в физиологических условиях. Гиперпродукция NO составляет важное звено патогенеза многих тяжелых состояний, сопровождающихся острой гипотензией и снижением реактивности кровеносных сосудов на констрикторные стимулы. В настоящее время доказана роль гиперпродукции N0 в развитии септического (Szabo С. е.а., 1993), анафилактического (Mitsuhata Н. е.а., 1995), кардиогенного (Vanin A.F. е.а., 1994), теплового (Манухина Е.Б. и др. 1996) и других видов шока. Избыток N0, вырабатывающийся в организме, вызывает чрезмерное усиление эндотелийзависимого расслабления гладкой мышцы сосудов и эндотелийзависимого подавления ее сократительных ответов (Vanin A.F. е.а., 1994., Szabo С. е.а.,1993).

Поиск путей предупреждения и устранения гиперпродукции N0 в последнее время привлекает все большее внимание исследователей. Единственный существующий пока подход к решению этой проблемы состоит в блокаде продукции N0 с помощью ингибиторов NO-синтазы. Однако, его применение имеет серьезные ограничения. Во-первых, ни один из существующих ингибиторов NO-синтазы не обладает достаточной избирательностью и поэтому блокирует не только индуцибельную N0-синтазу, которая, по-видимому, вносит основной вклад в гиперпродукцию N0 при шоках, но и другую изоформу - конститутивную NO-синтазу, работа которой необходима для предупреждения гипертонии, вазоспазмов, тромбозов и т.д. (Малышев И.Ю.,Манухина Е.Б.,1998., Nava Е. е.а., 1991). Во-вторых, ингибиторы NO-синтазы обладают серьезными побочными эффектами, в частности, оказывают прямое кардиотоксическое действие (Nava Е. е.а., 1991). Поэтому проблема селективного ингибирования индуцибельной NO-синтазы без ингибирования конститутивной в условиях гиперпродукции N0 приобретает особую актуальность.

Наиболее перспективный подход к коррекции гиперпродукции N0 может состоять в применении нефармакологических методов, не имеющих таких ограничений, как использование фармакологических препаратов. Одним из таких методов является дозированная адаптация организма к факторам среды, которая является модулятором NO-продуцирующих систем организма (Малышев И.Ю.,Манухина Е.Б.,1998) и одновременно давно и широко применяется в эксперименте и клинике для профилактики и лечения различных заболеваний, и, в первую очередь, сердечнососудистых (Meerson F.Z., Manukhina Е.В., 1984). В предыдущих

исследованиях было установлено, что с помощью адаптации к гипобарической гипоксии (Меегеоп Р.2., МапикЫпа Е.В., 1984), коротким неповреждающим стрессам (Манухина Е.Б. и др., 1989 ) или к физической нагрузке (Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г., 1988) можно предупредить нарушения сосудистого тонуса и тяжелую гипотензию при остром экспериментальном инфаркте миокарда. Однако, связь этих защитных эффектов с коррекцией гиперпродукции N0 не доказана. Следовательно, вопрос о возможности применения адаптационной защиты организма в условиях избыточного синтеза N0 остается открытым.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы состояла в изучении возможности и механизмов предупреждения или ограничения гиперпродукции N0 и связанных с ней нарушений функции сосудистой системы с помощью дозированной адаптации к факторам среды.

В рамках поставленной цели решались следующие задачи:

1. Сопоставить вклад индуцибельной и конститутивной изоформ N0-синтазы в повреждения сосудистой системы, вызванные гиперпродукцией N0 при тепловом шоке (ТШ), и оценить возможность предупреждения этих повреждений путем избирательного ингибирования изоформ ЫО-синтазы.

2. Изучить возможность применения предварительной адаптации к стрессорным воздействиям для предупреждения острой гипотензии и нарушений сосудистых реакций, вызванных гиперпродукцией N0 при ТШ.

3. Изучить влияние адаптации к стрессорным воздействиям на продукцию N0 в организме и оценить возможность применения такой адаптации для предупреждения гиперпродукции N0.

4. Оценить роль N0 в адаптационной защите сосудистой системы и изучить возможность воспроизведения защитных эффектов адаптации к стрессорным воздействиям с помощью донора N0.

Научная новизна исследования определяется следующими основными результатами.

Впервые установлено, что при ТШ гиперпродукция N0 обусловлена главным образом активностью индуцибельной и в меньшей степени -активностью конститутивной ЬЮ-синтазы. На основе этих данных продемонстрирована принципиальная возможность защиты сосудистой системы от повреждения при ТШ путем преимущественного ингибирования индуцибельной 1\Ю-синтазы с помощью невазоактивных доз неселективного ингибитора ЫО-синтазы Ы' -нитро-Ьаргинина.

Впервые показано, что адаптация организма к мягким стрессорным воздействиям эффективно предупреждает чрезмерное угнетение эндотелием сократительных реакций сосудов, избыточное усиление эндотелийзависимого расслабления, падение АД, а также снижает смертность животных при ТШ с 57 до 8%. Адаптация сама по себе несколько увеличивает уровень тканевой продукции N0, но, в то же время,

у адаптированных животных ТШ не вызывает дополнительного прироста продукции N0. Это означает, что адаптация к стрессорным воздействиям предупреждает гиперпродукцию NO. Защитный эффект адаптации был более выраженным, чем защитный эффект ингибитора NO-синтазы, что указывает на преимущество нефармакологического способа защиты организма над фармакологическим.

Впервые показано, что адаптация к стрессорным воздействиям, проводимая на фоне введения малых доз ингибитора NO-синтазы не приводит к формированию защиты сосудистой системы от повреждений, связанных с гиперпродукцией N0. Тем самым доказана роль активации синтеза N0 в развитии адаптационной защиты сосудистой системы.

Впервые показана возможность воспроизведения адаптационной защиты и ограничения гиперпродукции N0 путем предварительного введения донора N0. Это подтверждает гипотезу о том, что предупреждение гиперпродукции N0 на фоне адаптивного повышения мощности NO-синтезирующих систем может быть обусловлено ингибированием NO-синтазы по механизму отрицательной обратной связи.

Теоретическое значение работы определяется тем, что в ней впервые выдвинуто и обосновано положение о ведущей роли повышения мощности NO-синтезирующих систем в формировании адаптационной защиты сосудистой системы от повреждений, вызванных гиперпродукцией N0.

Практическое значение работы определяется тем, что в ней продемонстрированы и сопоставлены возможности фармакологического и нефармакологического предупреждения нарушений сосудистого тонуса и острой гипотензии, вызванных шоковой гиперпродукцией N0.

Положения, выносимые на защиту.

1. Гиперпродукция N0 при тепловом шоке (ТШ) обусловлена главным образом активностью индуцибельной и в меньшей степени - активностью конститутивной NO-синтазы.

2. Адаптация организма к мягким стрессорным воздействиям эффективно предупреждает гиперпродукцию N0 и сопутствующие нарушения сосудистых реакций.

3. Важную роль в предупреждении гиперпродукции N0 играет адаптационное повышение мощности NO-синтезирующих систем.

Апробация диссертации. Основные результаты проведенных исследований были представлены на международном симпозиуме "Кислород и свободные радикалы" (Гродно, Беларусь, 1996), Международной конференции «ЭПР-спектроскопия оксида азота в биологических системах (Суздаль, 1996), V Всемирном конгрессе Международного общества адаптационной медицины (Фрамингам, США, 1997), II Международном конгрессе "N0 в сердечно-сосудистой регуляции и интенсивной терапии" (Стокгольм, Швеция, 1997), XXXIII

Международном конгрессе по физиологическим наукам (Санкт-Петербург, 1997), Международной конференции "Роль монооксида азота в процессах жизнедеятельности" (Минск, Беларусь, 1998), Международном симпозиуме "Оксид азота: от молекулярного уровня до клинического применения" (Братислава, Словацкая Республика, 1999).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 130 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения собственных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Список литературы содержит 190 источников. Диссертация иллюстрирована 10 таблицами и 28 рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа была проведены на 214 крысах - самцах линии Вистар массой 230-250 г.

В качестве модели повреждения сосудистой системы, опосредованного гиперпродукцией N0, использовали тепловой шок (ТШ). ТШ вызывали путем прогрева бодрствующих животных в термостате в течение 15 минут после достижения ректальной температуры 41,5+0,5° С. Общая длительность прогрева не превышала 35 минут. Через 1 час после ТШ животным измеряли АД и брали их в эксперимент. Выбор этого срока был основан на ранее полученных данных о том, что именно в этот период после ТШ наблюдается максимальное увеличение продукции N0 (Манухина Е.Б. и ДР., 1996).

Измерение АД проводили непрямым бескровным способом на хвостовой артерии. Для регистрации использовали пневматический датчик DY-4 и Physiograph DMP-4F (Narco Bio-Systems, США).

В качестве ингибитора NO-синтазы (NOS) использовали N"'-HHTpo-L-аргинин (L-NNA, Sigma). Исходя из литературных данных о различной чувствительности ÍNOS и cNOS к замещенным аналогам L-аргинина (Nava Е. е.а., 1991), для сравнительного анализа вклада изоформ NOS в повреждающее действие ТШ и изучения возможности предупреждения повреждений, вызванных ТШ, L-NNA вводили внутрибрюшинно за 60 минут до Tili в различных дозах, соответствующих задаче: 10, 30 или 300 мг/кг.

Для сравнения базальной и стимулированной продукции N0 в организме животных методом ЭПР-анализа продукцию N0 стимулировали введением крысам агониста мускариновых рецепторов карбахолина. Карбахолин вводили внутрибрюшинно в дозе 375 мкг/кг через 10 мин. после инъекции Na-ДЭТК.

Адаптация к иммобилизационному стрессу производилась путем фиксации животных в положении на спине. В первый день адаптации длительность иммобилизации составляла 15 минут, на второй день - 30, на третий день - 45 и на четвертый день - 60 минут. В последующие дни

иммобилизация длилась 60 минут и проводилась через день. Курс адаптации состоял из 8 сеансов иммобилизации. Животных брали в эксперимент через 48 часов после последнего сеанса адаптации.

К концу курса адаптации ни у одного из животных не возникало стрессорных повреждений слизистой оболочки желудка и видимых изменений поведения.

В качестве донора N0 использовали динитрозильный комплекс железа (ДНКЖ) (\/ес1егт^ У.Р. е.а., 1992) (синтезирован и любезно предоставлен профессором А.Ф.Ваниным в Институте химической физики РАН, Москва), который вводили в хвостовую вену.

Для подбора оптимальной дозировки ДНКЖ, которая, с одной стороны, обеспечивала бы эффективный уровень N0 в тканях, а, с другой стороны, не оказывала бы неблагоприятных воздействий на животных, было проведено сопоставление гипотензивного действия и тканевого распределения различных доз ДНКЖ. Содержание N0, включенного в состав ДНКЖ, определяли в крови, печени, почках, сердце, селезенке, тонком кишечнике и мозге крыс через 1,5 и 24 часа после введения ДНКЖ и сравнивали с изменениями АД у бодрствующих крыс, которое мониторировали в течение 3 часов. ДНКЖ вводили внутривенно в дозах 30, 100, 200 и 300 мкг/кг в пересчете на железо в составе комплекса.

Для изучения возможности предупреждения повреждений, вызванных ТШ, ДНКЖ вводили в дозе 200 мкг/кг и брали животных в эксперимент через 24 часа после введения ДНКЖ.

Для оценки вклада синтезированной с!е поуо индуцибельной ЫО-синтазы в гиперпродукцию N0 и падение АД, вызванные ТШ, использовали ингибитор синтеза белка на уровне трансляции циклогексимид. Циклогексимид вводили внутрибрюшинно в дозе 3.5 мг/кгза 60 мин. до ТШ.

Измерение скорости продукции N0 проводили методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) по включению N0 в комплексы с Ре2* -диэтилдитиокарбаматом [Ре2+ - ДЭТК, (СбНи^ЭгЬРе] с образованием парамагнитных мононитрозильных комплексов железа (МНКЖ) с ДЭТК. По интенсивности характерного ЭПР-сигнала МНКЖ-ДЭТК оценивали количество МНКЖ-ДЭТК в образце и тем самым количество N0, включенного в этот комплекс.

Для образования в организме МНКЖ животным за 30 минут до забоя (декапитации) вводили внутрибрюшинно раствор Ыа-ДЭТК (С5Н1С^52№) (500 мг/2,5 мл Н20/кг) и подкожно раствор РеЭС^+цитрат натрия (20 мг+95 мг/2,5 мл Н20/кг). В качестве тест-органа для изучения продукции N0 в организме использовали печень. Печень извлекали сразу после декапитации животных, измельчали и замораживали в пресс-форме в жидком азоте. Регистрацию ЭПР-сигнала проводили на модифицированном радиоспектрометре ЭПР Яасйорат (Польша) при 77 К, амплитуде модуляций поля 0,5 мТ и СВЧ-мощности мВт. (Уапт АТ. е.а., 1997).

Сразу после измерения давления животных забивали, извлекали сегмент грудной аорты и помещали в раствор Кребса при комнатной температуре. Сегмент аорты, не касаясь внутренней поверхности, очищали от жировой и соединительной ткани. Из сегмента вырезали кольцо длиной 3 мм и помещали на держателях из нержавеющей стали в рабочую термостатируемую (Т=37°С) камеру объемом 30 мл, заполненную непрерывно оксигенируемым раствором Кребса следующего состава: NaCI - 130 мМ, глюкоза -11 мМ, NaHC03 - 14,9 мМ, KCI - 4,7 мМ, CaCI2 - 2,5 мМ, MgS04 - 1,2 мМ, КН2Р04 - 1,18 мМ, рН 7,4. Один конец препарата фиксировали неподвижно, а другой присоединялся к изометрическому датчику силы DY-1 (Ugo Basile, Италия) так, чтобы препарат располагался строго вертикально. Вертикальным перемещением датчика создавали растягивающую нагрузку стандартной величины 1200 мг. Предварительно было установлено, что при таком напряжении покоя препарат дает ответы максимальной силы на используемые в работе стандартные дозы норадреналина. Препарат находился в этих условиях в течение часа (период стабилизации). Для регистрации сообщений использовали двухканальный регистратор Gemini (Ugo Basile, Италия).

Сокращение аорты вызывали кумулятивным добавлением в камеру норадреналина (НА) в возрастающих концентрациях (10"8-5 Ю"7 М). Каждая последующая концентрация НА добавлялась после выхода на плато ответа, вызванного добавлением предыдущей концентрации. Физиологическая оценка стимулированной и базальной продукции N0 эндотелием проводилась по эндотелийзависимому расслаблению (ЭЗР) и степени угнетения эндотелием сократительных реакций аорты, соответственно. ЭЗР вызывали ацетилхолином (10"8-10"5 М), добавляя его на плато сократительного ответа, вызванного НА в концентрации 510"7 М. После отмывки в течение 30 минут продукцию эндотелиального N0 блокировали путем инкубации в течение 20 минут с 10"5 M L-NNA, после чего повторяли протокол.

Силу сокращения аорты под действием норадреналина выражали в мг, а скорость сокращения - в мг/сек. Ингибирующее влияние эндотелия на констрикторные реакции оценивали по изменению силы сокращения после инкубации с L-NNA путем сравнения площадей между кривыми "концентрация-эффект". Величину ЭЗР под действием ацетилхолина выражали в процентах от величины сокращения под действием норадреналина в дозе 5x10-7 М.

Полученные данные обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента. Для оценки достоверности различий по площадям между кривыми «доза-эффект» использовали метод парных сравнений. Для оценки достоверности различий по смертности животных использовали точный метод Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ТШ вызывал резкое усиление продукции N0. Через 1 час после ТШ ЭПР-сигнал (ЧО-содержащих комплексов МНКЖ-ДЭТК в печени, которая использовалась в качестве тест-органа, увеличился с 46,3+4,7 нг ИО/г ткани до 115,6+18,0 нг Ы0/г ткани (р<0,05).

Через 1 час после ТШ у крыс наблюдалось падение АД со 111+1 до 81+3 мм рт.ст. При этом смертность животных в течение 24 часов после ТШ составляла 57% (Рис. 1 ).

мм рт. ст. 1 -то —|

-1 ;zo —

о о —

¡о —

GO —

К TLLI

Рисунок 1 Влияние теплового шока на АД (столбчатая диаграмма) и смертность (круговая диаграмма). К-контроль, ТШ-тепловой шок.

Устранение ингибирующего влияния эндотелия на сокращения гладкой мышцы во всех сериях экспериментов приводило к сдвигу вверх кривой "доза-эффект" (Рис. 2 ). ТШ подавлял констрикторный ответ препарата с сохраненной продукцией эндотелиального N0. В результате площадь между кривыми достоверно возрастала по сравнению с контролем.

Till существенно увеличивал реакцию ЭЗР аорты на ацетилхолин (Рис. 3). Если в контроле максимальное ЭЗР, вызванное ацетилхолином в концентрации 10~5 М, составляло 34,8+4,4%, то под действием ТШ оно возросло до 66,9+4,5% (р<0,05).

Таким образом ТШ вызывает гиперпродукцию N0, которая сопровождается острым падением АД и гибелью более чем половины животных. На уровне сосудов нарушения, вызванные ТШ, проявляются как

гиперактивация эндотелия, т.е. избыточное усиление ЭЗР и угнетение эндотелием сократительных реакций аорты на норадреналин.

Рисунок 2. Влияние ТШ на сократительные реакции изолированного кольцевого препарата аорты крыс.. +NO - препарат с сохраненной продукцией эндотелиального NO; -NO - препарат с блокированной L-NNA продукцией эндотелиального NO. *р<0,05. По оси абсцисс- концентрация НА, М. По оси ординат-сила сокращения препарата, мг.

Одной из наиболее вероятных причин гиперпродукции N0 при ТШ является активация свободно-радикального окисления ( Шепелев А. П. 1976). Кислородные радикалы через фактор транскрипции NFkB вызывают экспрессию iNOS в макрофагах и гладкой мышце сосудов, которая продуцирует NO в избыточном количестве и в течение длительного времени (Xie Q., Nathan С. 1994). Следствием этого является резкое падение тонуса сосудов и АД, а также угнетение вазоконстрикторных ответов.

Согласно современным представлениям о роли N0 в патогенезе шока, основной вклад в гиперпродукцию N0, которая вызывает при этих состояниях падение АД и угнетение вазоконстрикторных ответов на адренергические стимулы, вносит индуцибельная NO-синтаза (Heineman А., Stauber R.E. 1995., Weigert A.L., е.а., 1995). При этом нормальное функционирование конститутивной NO-синтазы оказывает защитное действие (Mitsuhata H. е.а., 1995).

Однако, по мнению некоторых исследователей, в гипотензию при шоке большой вклад вносит не только индукция ¡NOS, но и активация cNOS, которая, в отличие от ¡NOS, постоянно присутствует в эндотелии сосудов и в норме обеспечивает равновесие между сокращением и расслаблением

гладкой мышцы (Moneada S. е.а., 1991). Такая точка зрения основана на наблюдении, что опосредованная N0 гипореактивность сосудов на адренергическую стимуляцию при шоке по времени предшествует индукции ¡NOS (Szabo С., е.а., 1993). В пользу этого предположения говорит и тот факт, что в наших экспериментах ТШ усиливал подавление эндотелием сократительных ответов на НА и увеличивал ЭЗР под действием ацетилхолина. Это свидетельствует об активации, соответственно, базальной и стимулированной продукции N0, которая осуществляется эндотелиальной cNOS (Moneada S. е.а., 1991).

..-8 -7 -5 -5 10 10 10 10

Рисунок 3. Влияние теплового шока на эндотелийзависимое расслабление изолированной аорты крысы. По оси ординат- эндотелийзависимое эасслабление, вызванное ацетилхолином в % от силы сокращения, вызванного норадреналином в концентрации 5х10"7М.

Для сравнительной оценки вклада ¡NOS и cNOS в развитие ювреждающего эффекта ТШ были сопоставлены эффекты полного Злокирования обеих изоформ NOS и избирательного ингибирования ¡NOS эазными дозами неселективного блокатора NOS L-NNA (Nava Е. е.а., 1991). При поиске путей защиты организма от повреждающих воздействий важно фименять такие факторы, которые сами по себе не нарушают процессов юрмальной физиологической регуляции. Поэтому в данной работе особое жимание уделялось сопоставлению потенциального защитного эффекта

используемого вещества с тем влиянием которое оно оказывает на интактное животное.

Литературные данные показывают, что попытки полностью блокировать синтез N0 замещенными аналогами L-аргинина в условиях шока не приводят к увеличению выживаемости или даже снижают ее за счет сопутствующего усиления тромбообразования, угнетения иммунитета, развития вазоспазмов и прямого токсического действия высоких доз L-NNA или L-NMMA на сердце (Kilboum R.G., е.а., 1990, Mitsuhata Н„ е.а., 1995). Исследования с применением различных доз L-NNA, L-NMMA и других замещенных аналогов аргинина позволили предположить, что разные изоформы NO-синтазы обладают разной чувствительностью к этому классу ингибиторов, и на этой основе использовать их для предупреждения и устранения гиперпродукции NO. При этом защитное действие оказывают, как правило, только невазоактивные дозы L-NNA (Mulder M.F., е.а., 1994, Nava Е., е.а., 1991).

В наших экспериментах введение L-NNA в дозе 300 мг/кг само по себе приводило к резкому подъему АД до 139+3 мм рт. ст. TIJJ на фоне этой дозы L-NNA снижал АД со 139+3 до 111+4 мм рт.ст. (Рис. 4 ). При этом смертность от ТШ не уменьшалась. По-видимому, падение АД на фоне этой дозы было обусловлено не продукцией N0, а угнетением сердечной деятельности (Klaubunde R.E., RitgerR.C. 1991). При этом L-NNA в дозе 300 мг/кг не увеличил выживание животных после ТШ. Поэтому нет оснований говорить о защитном эффекте L-NNA в данной дозе.

мм рт.ст.

К ТШ L-NNA.300 L-NNA.10

43'А

41%

64%

57%

Тепловой шок

59% L-NNA.300 + TUJ

36% L-NNA.10 + ТШ

Рисунок 4. Влияние предварительного ингибирования ЫО-синтазы на АД (столбчатая диаграмма) и смертность (круговая диаграмма) крыс при тепловом

шоке. Белые столбики - до ТШ, черные столбики - после ТШ. Белый сектор -выживаемость после ТШ, черный - смертность в течение 24 часов.

Анализ влияния L-NNA на сократительные реакции аорты показал, что L-NNA в дозе 300 мг/кг исходно достоверно ингибировал базальное высвобождения NO in vivo. При этом после ТШ дополнительных изменений не происходило.

У всех животных получивших инъекцию L-NNA в дозе 300 мг/кг, ЭЗР полностью отсутствовало.

При предварительном введении животным L-NNA в дозе 10 мг/кг в наших экспериментах ТШ не приводил к падению АД, угнетению сократительных ответов изолированной аорты на НА и чрезмерному усилению ЭЗР. Одновременно выживаемость животных после ТШ увеличилась более, чем в 1,5 раза (Рис.4). При этом такая доза L-NNA сама по себе не вызывала никаких изменений изученных показателей. Таким образом блокирование только индуцированной генерации N0, в отличие от ее полной блокады, оказывает выраженный защитный эффект при ТШ.

ЭПР-анализ показал, что L-NNA в дозе 10 мг/кг частично ингибирует базальную продукцию N0, но совершенно не влияет на продукцию N0, стимулированную карбахолином (Табл. 1 ). Поскольку эта доза L-NNA по физиологическим показателям была невазоактивной, по-видимому, остаточной базальной продукции N0 было вполне достаточно для сохранения нормальных эндотелий-опосредованных реакций сосудов.

Таблица 1. Влияние невазоактивной дозы L-NNA 10 мг/кг на базальный и стимулированный синтез N0.

Группа Продукция N0 (нг/г сырого веса ткани/30 мин.)

Контроль (п=8) L-NNA (п=10) Карбахолин(п=6) L-NNA+карбахолин (п=6) 52,3+7,2 27,4+2,6аЬ 165,0+28,3" 151,9+27,4"

а: достоверность эффекта L-NNA; Ь: достоверность отличий от контроля. р<0,05.

Большинство исследователей считает, что именно ¡NOS, индукция которой может происходить не только в макрофагах, но и непосредственно в гладкой мышце сосудов (Vanhoute P.M. 1992), вносит основной вклад в падение тонуса сосудов и гипотензию при шоковых состояниях (Mulder M.F е.а., 1994, Weigert A.L., е.а., 1995). Однако, имеются и другие данные, свидетельствующие в пользу преимущественной роли в этих нарушениях активации cNOS. Показано, в частности, что гиперпродукция N0 и падение АД при шоке начинаются раньше, чем экспрессия гена iNOS (Hauser G.J.,

е.а., 1996).

В настоящей работе мы обнаружили, что ТШ вызывает усиление подавления эндотелием сократительных ответов сосудов на норадреналин. Это свидетельствует об увеличении базальной продукции N0 эндотелием. Известно, что в базальную продукцию эндотелиального N0 вносит вклад как Са2+-зависимая, так и Са2+-независимая (очевидно, индуцибельная) изоформы NO-синтазы (Busse, R., е.а., 1993). Факт, что избирательное ингибирование ¡NOS L-NNA в дозе 10 мг/кг привело к нормализации адренергической реакции аорты, говорит о том, что экспрессия ¡NOS играет основную роль в нарушениях вазоконстрикторных ответов на адренергические стимулы, которые могут сделать необратимым падение АД при шоке.

Известно, что ЭЗР опосредовано рецептор-зависимым повышением внутриклеточной концентрации Са2+ и активацией эндотелиальной cNOS (Busse R., е.а., 1993). Однако, источник избытка N0, вызвавшего в наших опытах резкое усиление ЭЗР при ТШ, остается недостаточно ясным, поскольку это усиление ЭЗР удалось полностью предупредить ингибированием iNOS. Можно предположить, что это явление обусловлено экспрессией эндотелиальной NO-синтазы, которая, как недавно установлено, может быть и индуцирована, например, гормональными факторами (Weiner O.P. е.а., 1994).

Полученные в настоящей работе данные позволяют полагать, что L-NNA в дозе 10 мг/кг обеспечивает не избирательное, а, скорее, преимущественное ингибирование индуцибельной NO-синтазы. Возможно, что частичное ингибирование конститутивной NO-синтазы вносит свой вклад в наблюдавшийся защитный эффект L-NNA, т.к. в развитии гипотензии при шоках разного происхождения, по-видимому, играет роль не только индуцибельная, но и конститутивная NO-синтаза. Действительно, показано, что при септическом шоке гиперпродукция N0 и падение АД начинаются раньше, чем экспрессия гена индуцибельной NO-синтазы (Szabo С. е.а., 1993), а тепловой шок приводит к чрезмерному усилению эндотелийзависимого расслабления сосудов, которое опосредовано активностью конститутивной NO-синтазы (Манухина Е.Б. и др., 1996).

Механизм избирательного ингибирования разных изоформ NO-синтазы разными дозами замещенных аналогов L-аргинина пока не вполне ясен. Предполагается, что индукторы индуцибельной NO-синтазы (цитокинины, липополисахариды и др.) способствуют активному транспорту этих ингибиторов в клетку и тем самым создают их повышенную внутриклеточную концентрацию (Bogle R.G. е.а., 1995).

В целом полученные нами данные демонстрируют принципиальную возможность преимущественного ингибирования индуцибельной NO-синтазы при патологических состояниях, связанных с гиперпродукцией N0, с помощью невазоактивных доз неселективного ингибитора NO-синтазы L-

NNA и подтверждают наше предположение о том, что нарушение сосудистого тонуса при тепловом шоке опосредовано, главным образом , функционированием iNOS.

Для проверки предположения о том, что гиперпродукция N0 при ТШ и сопутствующая острая гипотензия обусловлены главным образом индукцией синтеза iNOS было изучено влияние на эти нарушения предварительного введения животным блокатора синтеза белка циклогексимида.

Введение циклогексимида не влияло на продукцию N0 в печени, но предотвратило увеличение уровня N0 после TILI примерно на 73%. При этом циклогексимид в значительной степени предупредил падение АД, вызванное ТШ (Табл 2 ). Эти результаты подтверждают предположение о ведущей роли iNOS в гиперпродукции N0 при ТШ. Поскольку iNOS не присутствует в организме в базальных условиях, а синтезируется de novo под действием триггерных факторов, предварительная блокада синтеза белка должна исключить ее вклад в гиперпродукцию N0. Факт, что в нашей работе циклогексимид ограничил падение АД и на 73% гиперпродукцию N0, говорит о соответствующем вкладе в эти процессы iNOS. Можно предположить, что остальная часть гиперпродукции N0 обеспечивается активацией уже присутствующего в клетках белка фермента cNOS.

Таблица 2. Влияние циклогексимида на продукцию N0 при ТШ.

Продукция NO

Группа (нг/г сырого веса ткани/30 мин.)

Контроль (п=6) 43± 10

ТШ (п=6) 123± 10*

ЦГИ (п=6) 43+7

ЦГИ+ТШ (п=6) 67+7*

"Достоверность отличий от контроля, р < 0,05.

Из рисунка 5 следует, что при ТШ продукция N0 в печени крыс возрастала почти в 2,5 раза по сравнению с контролем. Адаптация к стрессу сама по себе вызывала достоверное увеличение продукции N0, хотя далеко не такое значительное, как ТШ. Главный результат данного эксперимента состоял в том, что ТШ на фоне предварительной адаптации не вызывал дополнительного прироста продукции N0 по сравнению с адаптированными животными, не подвергнутыми ТШ.

Наиболее важный результат, полученный в настоящей работе, состоит в гом, что, предварительная адаптация к стрессорным воздействиям эказалась эффективным фактором защиты сосудистой системы при ТШ.

Адаптация к стрессу сама по себе не повлияла на АД, но полностью предупредила его падение: после ТШ. Более того, адаптация резко

сократила смертность от ТШ, которая у адаптированных животных составила лишь 8% (Рис. 6 ).

НГ ГМО/Г ткани 140т

120-

100-

80-

60-

40"

20-

0 I !

К

X.

щ

'А

ТШ 'Адапт.1 Адапт.1 +ТШ

Рисунок 5. Влияние адаптации к стрессу на продукцию N0 при тепловом шоке. *р < 0.05.

мм рт. ст. 1 л О

Рисунок 6. Влияние адаптации к стрессу на АД (столбчатые диаграммы) и смертность (круговые диаграммы) крыс при тепловом шоке. *р < 0,05.

На рисунке 7 представлены данные по силе сокращений изолированной аорты под действием норадреналина. Адаптация к стрессу сама по себе не влияла на сократительные реакции аорты интактных животных, но предупреждала чрезмерное угнетение этих реакций при ТШ. Видно, что площади между кривыми для аорты как интактных, так и перенесших ТШ животных на фоне предварительной адаптации не отличаются от контроля.

Рисунок 7. Влияние адаптации к стрессорным воздействиям на силу сокращений аорты в контроле и при тепловом шоке. А - контроль, Б - тепловой шок, В - адаптация, Г - тепловой шок на фоне предварительной адаптации. 1 -интактный препарат, 2 - после блокады продукции эндотелиального N0. По оси абсцисс - концентрация норадреналина в М, по оси ординат - сила сокращений в мг. *р < 0,05.

Как видно на рисунке 8 , адаптация не оказывала достоверного влияния

на ЭЗР аорты интактных животных, но практически полностью предупреждала усиление ЭЗР, вызванное ТШ: максимальное ЭЗР при ТШ на фоне предварительной адаптации составляло 36,2+2,3%, то есть не отличалось от контроля.

а*

-ч

но

1

в

ЧЖ«

чм

-оо

- I

41

тч нтш

4«.

ч»

^тш

- 5

10"° - 10" * 10 10

Концентрация аиетилхопина. М

Рисунок 8. Влияние адаптации к стрессорным . воздействиям на эндотелийзависимсе расслабление изолированной аорты крысы в контроле и при тепловом шоке.

По оси ординат - эндотелийзависимое расслабление, % от силы сокращения. К - контроль, ТШ - тепловой шок, А - адаптация, А+ТШ - тепловой шок на фоне предварительной адаптации. Заштрихованная зона отражает защитный эффект адаптации. *р < 0,05.

Таким образом, адаптация к стрессорным воздействиям ограничивает гиперпродукцию N0 при ТШ, значительно снижает смертность животных, предупреждает падение АД, чрезмерное угнетение констрикторных и усиление дилататорных реакций, связанные с гиперпродукцией N0. В то же время такая адаптация приводит к увеличению мощности N0-продуцирующих систем и создает некоторый повышенный уровень N0 в организме. Поскольку основной естественный путь ограничения синтеза N0 в организме состоит в ингибировании 1\Ю-синтазы по механизму отрицательной обратной связи (\Zicroy Т.\/., Ма1рЬигз М.Ц1995), возникло предположение, что защитный эффект адаптации обусловлен именно этим предварительным увеличением синтеза N0.

Введение перед каждым сеансом адаптации ингибитора NO-синтазы L-NNA препятствовало развитию защитного эффекта адаптации при ТШ. Это подтверждает предположение о ведущей роли адаптивного усиления синтеза N0 в формировании адаптационной защиты. Поэтому мы предприняли попытку воспроизвести защитный эффект адаптации с помощью экзогенного NO, вводимого с донором N0.

Применявшийся в данной работе донор N0 ДНКЖ представляет собой соединение, которое эндогенный N0 образует в организме в естественных условиях (Ванин А.Ф и др., 1998). Действие ДНКЖ в организме обусловлено высвобождением из него N0 и проявляется в виде гипотензивного эффекта. Особенности и механизм гипотензивного действия ДНКЖ достаточно хорошо изучены. Высвобождающийся из ДНКЖ N0 активирует растворимую гуанилатциклазу. В экспериментах на наркотизированных и бодрствующих животных установлено, что ДНКЖ оказывает более эффективное и длительное гипотензивное действие, чем нитроглицерин и нитропруссид натрия. Пролонгированный характер эффекта ДНКЖ обусловлен образованием в тканях депо NO-ДНКЖ с тиоловыми группами белков (в результате переноса групп Fe(NO)2 из вводимых низкомолекулярных ДНКЖ на белки), которое в течение длительного времени обеспечивает поступление N0 в организм, причем это депо сохраняется в тканях и после исчезновения гипотензии (Ванин А.Ф и др. 1998).

Применение ДНКЖ в качестве возможного протекторного фактора при ТШ требовало предварительного подбора такой его дозы, которая, с одной стороны, обеспечивала бы эффективный уровень N0 в тканях, а с другой, стороны не оказывала бы неблагоприятного действия на животных. С этой целью было проведено сопоставление гипотензивного действия различных доз ДНКЖ с распределением этого донора в разных органах и тканях крыс.

После внутривенного введения крысам донор N0 ДНКЖ дозозависимо распределялся по органам и тканям животного. Высвобождающийся из ДНКЖ N0 оказывал гипотензивное действие, которое зависело от дозы, и времени прошедшего после введения ДНКЖ. При этом наблюдалось близкое соответствие между содержанием комплекса в органах и степенью снижения АД. Доза 30 мкг/кг, которая не вызывала накопления ДНКЖ в тканях, не влияла на АД. Доза 100 мкг/кг не обеспечивала стабильного поступления N0 в ткани и оказывала лишь небольшое гипотензивное действие. В отношении обеспечения тканей N0 оптимальной, по-видимому, являлась доза ДНКЖ 200 мкг/кг, которая вызывала снижение АД без явных неблагоприятных эффектов. Дальнейшее повышение дозы ДНКЖ до 300 мкг/кг приводило к чрезмерно глубокой и стойкой гипотензии, сопровождавшейся нарушениями сердечной деятельности.

ДНКЖ а дозе 200 мкг/кг, введенный за 24 часа до ТШ, сам по себе несколько снизил продукцию N0 и полностью предупредил гиперпродукцию NO при ТШ. Через 24 ч после введения ДНКЖ АД не отличалось от

контрольного. При этом ДНКЖ полностью предупредил падение АД: после ТШ на фоне ДНКЖ давление составило 106+2 мм рт.ст. Более того, введение ДНКЖ резко сократило смертность крыс от ТШ. На фоне ДНКЖ смертность в течение 24 ч после ТШ, как и после адаптации, составила всего лишь 8%. Одновременно ДНКЖ, как и адаптация, полностью предупреждал чрезмерное угнетение констрикторных реакций изолированной аорты при ТШ и предотвращал усиление ЭЗР, вызванное ТШ: максимальное ЭЗР при ТШ на фоне предварительного введения ДНКЖ составляло 37,0+5,4%, то есть не отличалось от контроля. Важно отметить, что защитное действие ДНКЖ наблюдалось через 24 часа после введения, когда его ЭПР-сигнал в тканях уже не регистрировался. Следовательно оно было связано либо с сохранением депо N0 в небольшом нерегистрируемом количестве, либо с NO-зависимой индукцией образования каких-то других протекторных факторов. Точный механизм этого отставленного действия ДНКЖ еще предстоит выяснить.

Таким образом донор N0 воспроизводит защитные эффекты адаптации к стрессу, а ингибитор NOS препятствует их развитию. Это свидетельствует в пользу предположения о важной роли активации NO-продуцирующих систем в адаптационной защите организма от повреждающего действия гиперпродукции N0.

В основе такой защиты, по-видимому, лежит хорошо известный механизм ограничения гиперпродукции N0 самим же N0 по принципу отрицательной обратной связи. Поскольку сама по себе адаптация не влияла ни на один из исследованных показателей, можно предположить, что образующийся в процессе адаптации избыток N0 запасается в виде биологически активного депо а в дальнейшем, высвобождаясь из этого депо, оказывает либо прямое защитное действие, либо опосредует активацию или синтез какого-то другого защитного фактора (Ванин А.Фи др., 1998).

В целом полученные данные согласуются с выдвинутым предположением, что при адаптации формируются NO-зависимые механизмы ограничения гиперпродукции N0, которые могут лежать в основе адаптационной защиты.

Тесная связь развития защитных эффектов адаптации с усилением синтеза N0 подтверждается полученными нами данными об устранении этих эффектов с помощью курсового введения L-NNA, которое ограничивало активацию NO-синтазы на фоне адаптации. С другой стороны, введение донора N0 ДНКЖ полностью воспроизводило эффекты адаптации. Таким образом фармакологическое модулирование процесса депонирования N0 с помощью доноров N0 и ингибиторов NO-синтазы может воспроизводить или ограничивать развитие адаптационной устойчивости организма к повреждающим факторам.

Исходя из литературных и полученных нами данных механизм повреждающего действия ТШ и защитного эффекта адаптации можно

предположительно представить себе следующим образом.

Участие N0 в защитных эффектах адаптации не ограничивается только механизмами, обсуждавшимся выше. В последнее время выяснилось, что N0 активирует синтез протекторных стресс-белков HSP70 (Malyshev, I.Yu. е.а., 1996). HSP70 участвуют в ренатурации поврежденных белков (Pelham H.R.B., 1986). Показано, что эти белки играют важную роль в адаптационной защите организма и могут напрямую ингибировать iNOS, тем самым ограничивая гиперпродукцию NO (Hauser G.J. е.а., 1996). Это означает, что NO-зависимая активация HSP70 может составлять важный механизм клеточной защиты.

Кроме того показано, что при стрессорных воздействиях может происходить накопление эндогенного ингибитора NOS асимметричного диметиларгинина (Aneman А. е.а., 1995).

Один из защитных эффектов NO связан с его способностью увеличивать активность антиоксидантных ферментов (Dobashi К. е.а., 1997, Rotzinger S., et al 1995) и экспрессию кодирующих их генов (Nunoshiba Т. е.а., 1993, White А.С е.а., 1995). Сама молекула N0 также может проявлять антиоксидантные свойства (Kanner J. е.а., 1992). Эти механизмы могут лежать в основе эффективного ограничения активации свободнорадикального окисления.

Имеются данные, что N0 может предупреждать повышение внутриклеточной концентрации Са2+ (Andriantsitohaina R. е.а., 1995, Minowa T., et al 1997). В результате такого действия N0 могут ограничиваться повреждающие эффекты кальция на сердце и сосуды. Особенно важно, что этот эффект реализуется при ингибировании Са2+ АТФ-азы (Petkov G.V., Boev К.К., 1996).

Один из механизмов ограничения повреждений мембран связан с простагландинами группы Е и l2(Van Bilsen M., et al 1989). Как оказалось, N0, за счет активации циклооксигеназ, может стимулировать синтез этих цитопротекторных простагландинов (Uno H., et al 1997). Имеются и противоположные данные о том, что N0 может ингибировать циклооксигеназы, связываясь с их гемопротеиновой группой (Kanner J., et al 1992). Предполагается, что характер влияния N0 на синтез простагландинов определяется продолжительностью воздействия и концентрацией NO (SwierkoszT.A., et al 1994).

Наконец, данные о ключевой роли N0 в предупреждении агрегации и адгезии тромбоцитов (Radomski M.W., et al 1987, Vallance P., et al 1992) позволяют предположить, что N0 может участвовать в ограничении усиления тромбообразования и, соответственно, в снижении ишемических повреждений сердца и мозга.

Таким образом механизмы участия N0 в адаптационной защите организма многообразны и, по-видимому, не сводятся только к непосредственному ограничению гиперпродукции N0. В перспективе использование адаптационных методов, направленных на стимулирование

продукции N0 в организме, может оказаться эффективным способом предупреждения и лечения заболеваний, связанных с нарушениями метаболизма N0.

ВЫВОДЫ

1. Тепловой шок (ТШ), сопровождающийся генерализованной гиперпродукцией N0 в организме, приводит к гибели 57% крыс. У выживших животных ТШ вызывает падение системного АД со 111 до 81 мм рт. ст. и гиперактивацию эндотелия, проявляющуюся в угнетении эндотелием констрикторных реакций и почти двукратном усилении эндотелийзависимых дилататорных реакций изолированных сосудов.

2. Предварительное введение животным блокатора синтеза белка циклогексимида на 73% снижало гиперпродукцию N0 и предупреждало падение АД при ТШ, что свидетельствует о ведущей роли в этом явлении экспрессии индуцибельной изоформы МО-синтазы при значительно меньшем вкладе активации конститутивной МО-синтазы.

3. Предварительное введение ингибитора ЫО-синтазы КР-нитро-Ь аргинина в невазоактивной дозе 10 мг/кг, обеспечивающей преимущественное ингибирование индуцибельной ЫО-синтазы, оказывает защитное действие при ТШ. 1\Г"-нитро-1_-аргинин в дозе 300 мг/кг, которая тотально блокирует продукцию N0 в организме, ингибируя как индуцибельную, так и конститутивную изоформы МО-синтазы, таким эффектом не обладает. Это указывает на принципиальную возможность защиты сосудистой системы от повреждения при ТШ путем преимущественного ингибирования индуцибельной МО-синтазы.

4. Предварительная адаптация крыс к коротким неповреждающим стрессорным воздействиям снижает смертность животных при ТШ с 57 до 8%, а также полностью предупреждает острую гипотензию и гиперактивацию эндотелия, вызванные ТШ.

5. Адаптация к стрессорным воздействиям сама по себе несколько увеличивает уровень тканевой продукции N0, но, в то же время, у адаптированных животных ТШ не вызывает дополнительного прироста продукции N0. Это означает, что адаптация к стрессорным воздействиям предупреждает гиперпродукцию N0.

6. Адаптация к стрессорным воздействиям, проводимая на фоне постоянного введения ингибитора МО-синтазы не приводит к формированию защиты сосудистой системы от повреждений, связанных с гиперпродукцией N0, в то время, как предварительное введение донора N0 полностью воспроизводит защитные эффекты адаптации. Это доказывает ведущую роль N0 в развитии адаптационной защиты сосудистой системы при ТШ.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Защитный эффект ингибитора NO-синтазы при тепловом шоке. // Известия РАН. Серия биологическая.-1996.-Ы5.-С.583-588. (соавт. Манухина Е.Б., Голубева Л.Ю., Зенина Т.А., Малышев И.Ю.)

2. Роль оксида азота в развитии и предупреждении острой гипотензии при экстремальных состояниях. // Кислород и свободные радикалы. Материалы международного симпозиума.- Гродно, 1996.-С.77-79. (соавт. Манухина Е.Б., Малышев И.Ю., Микоян В.Д., Ванин А.Ф.)

3. Selective inhibition of inducible NO-synthase protects the circulatory system of rat in heat shock. // Biochemistry and Molecular Biology of Nitric Oxide. Second International Conference. UCLA.-Los Angeles, 1996.-P. 14. (соавт. Манухина Е.Б., Голубева Л.Ю., Зенина Т.А., Малышев И.Ю.)

4. Adaptation to stress prevents acute hypotension induced by NO overproduction: Protective role of NO. // EPR-spectroscopy of nitric oxide in biological systems, Interenational Conference. Suzdal, 1996.-P.23-24. (соавт. Манухина Е.Б., Малышев И.Ю., Микоян В.Д., Кубрина Л.Н., Ванин А.Ф.)

5. Adaptation to stress prevents acute hypotension: protective role of nitric oxide. // NO in cardiovascular regulation and intensive care. Second International Congress.-Stockholm, 1997.-P.60. (соавт. Манухина Е.Б., Малышев И.Ю., Микоян В.Д., Кубрина Л.Н., Ванин А.Ф.)

6. Adaptation to stress prevents acute hypotension: protective role of nitric oxide. // Fifth World Congress. International Society for Adaptive Medicine (ISAM).-1997.-P.101. (соавт. Манухина Е.Б., Малышев И.Ю., Микоян В.Д., Кубрина Л.Н., Ванин А.Ф.)

7. Предупреждение острой гипотензии и гиперактивации эндотелия при тепловом шоке с помощью адаптации к стрессорным воздействиям. // Бюл. эксперим. биол. мед.-1997.-Т.123.-№10,- С.380-384. (соавт. Манухина Е.Б., Малышев И.Ю.)

8. Защитный эффект окиси азота при тепловом шоке. // Известия РАН. Серия биологическая.-1997.-№1.-С. 54-58. (соавт. Манухина Е.Б., Маленюк Е.Б., Малышев И.Ю., Ванин А.Ф.)

9. Adaptation to stress prevents acute hypotension: Protective role of NO. И Abstr. XXXIII International Congress of Physiological Sciences - St. Petersburg, 1997.-P.41-56. (соавт. Манухина Е.Б., Малышев И.Ю., Микоян В.Д., Кубрина Л.H., Ванин А.Ф.)

10.Оксид азота как фактор защиты организма при экстремальных состояниях. // Роль монооксида азота в процессах жизнедеятельности. Минск,-/Полибиг/, 1998.-С.203-205. (соавт. Манухина Е.Б., Смирин Б.В., Малышев И.Ю., Микоян В.Д., Кубрина Л.Н., Ванин А.Ф.)

11 .Депонирование оксида азота в кровеносных сосудах in vivo. // Там же, С.147-149. (соавт. Манухина Е.Б., Смирин Б.В., Малышев И.Ю., Ванин А.Ф.)

12. Оценка возможности избирательного ингибирования индуцибельной NO-синтазы с помощью неселективного ингибитора. // Российский физиол. журнал.-1998,- №12.-С.1420-1427. (соавт. Бондаренко НА,Малышев И.Ю., Микоян В.Д., Кубрина Л.Н., Ванин А.Ф.)

13. Предупреждение гиперпродукции оксида азота с помощью адаптации к стрессорным воздействиям. // Известия АН. Серия Биологическая.-1998,-№2.-С.300-304. (соавт. Манухина Е.Б., Малышев И.Ю., Машина С.Ю. Виегант Ф., Микоян В.Д., Кубрина Л.Н., Ванин А.Ф.)

14.Гипотензивное действие и тканевое распределение донора оксида азота - динитрозильных комплексов железа. II Бюл. эксперим. биол. мед,-1998.-Т.-125.-№1 .-С. 30-33. (соавт. Манухина Е.Б., Зенина Т.А., Малышев И.Ю., Маленюк Е.Б., Микоян В.Д., Кубрина Л.Н., Ванин А.Ф.)

15.Депонирование оксида азота в кровеносных сосудах in vivo. II Бюл. эксперим. биол. мед.-1999.-Т.127.-№6.-С.629-632. (соавт. Смирин Б.В., Ванин А.Ф., Малышев И.Ю., Манухина Е.Б.)