Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Связь фармакологической активности арбутина с его электронным строением

«"ои49531

На правах рукописи

ВОЛОБОЙ НИНА ЛЕОНИДОВНА

СВЯЗЬ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АРБУТИНА С ЕГО ЭЛЕКТРОННЫМ СТРОЕНИЕМ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

< ФЕВ 2013

Томск-2013

005049531

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Смирнов Иван Владимирович

Официальные оппоненты:

Зуева Елена Петровна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, лаборатория онкофармакологии, заведующий лабораторией

Ахмеджанов Рафик Равильевич, доктор биологических наук, Национальный исследовательский Томский политехнический университет, кафедра технологии основного органического синтеза, профессор кафедры

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «_» _ 2013 г. в _ часов на

заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан «_»_2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Амосова Евдокия Наумовна

Актуальность темы. Одной из актуальных проблем современной фармакологии является поиск новых высокоэффективных и безопасных лекарственных средств [Панчук С., Яблучанский Н., 2002]. Благодаря успехам в области органического синтеза было создано множество лечебных средств. Однако в настоящее время поиск фармакологических веществ ведётся не только среди продуктов химического синтеза, но и среди лекарственного растительного сырья [Кукес В.Г., 2006]. Этому направлению способствует огромный опыт ученых и накопленные знания народной медицины.

Растительные препараты бесспорно имеют ряд преимуществ перед синтетическими, таких как низкая токсичность либо даже отсутствие таковой, относительная мягкость фармакологических эффектов, широта терапевтического действия и, как правило, многонаправленность лечебного воздействия на организм. Работы по поиску активных компонентов в лекарственных растениях и выяснение механизмов их терапевтического действия остаются весьма востребованы в условиях современного состояния фармацевтической и фармакологической науки.

Детальное изучение механизмов водно-солевого обмена привело к совершенствованию методов клинического исследования функции почек и поиску новых веществ, влияющих на клубочковую фильтрацию, реабсорбцию электролитов и воды, образование и экскрецию мочи, поскольку современные диуретики пока не отвечают всем требованиям к этой группе лекарственных средств [Литвинова О.Н., Березнякова М.Е.].

На сегодняшний день применение в клинической практике находят фитопрепараты, обладающие мочегонным действием. Группа растительных диуретиков включает в себя большое число растений разных семейств, но их отличает от современных диуретиков синтетического происхождения постепенное нарастание мочегонного действия и отсутствие потери электролитов. Многие из этих растений в своем составе содержат в большом количестве фенолгликозид арбутин. Известно, что арбутин обладает не только мочегонным, но и противовоспалительным, антиоксидантным, антимикробным свойствами, что дает ему преимущества перед синтетическими диуретиками. Общепринятым является мнение, что в организме арбутин гидролизуется до гидрохинона, который собственно и определяет фармакологические эффекты арбутинсодержащих растений. Однако, арбутин в чистом виде изучался очень мало, в основном были изучены фармакологические эффекты арбутинсодержащих фитопрепаратов. В литературе нет достаточных сведений о том, какое влияние на реализацию лечебного действия растений оказывает арбутин, детально не изучены его фармакологические эффекты, нет экспериментальных подтверждений тому, что арбутин действует через высвобождение гидрохинона, поскольку на сегодняшний день подробные данные о фармакодинамике арбутина и

гидрохинона отсутствуют.

Учитывая тот факт, что актуальной задачей современной фармакологической науки является поиск лекарственных веществ, влияющих на выделительную функцию почек, арбутин можно предложить в качестве

лекарственного вещества. Однако для этого необходимы сведения о фармакодинамике и фармакокинетике арбутина. Кроме того, эти сведения помогли бы в дальнейшем разработать принципы синтеза новых лекарственных средств с мочегонной активностью на основе гликозидной структуры.

Цель исследования: изучить особенности фармакодинамики арбутина и выявить связь его фармакологических эффектов с электронной структурой.

Задачи исследования

1. Изучить особенности пространственного и электронного строения молекулы арбутина и его синтетических производных, рассчитать термодинамические спектры их активности.

2. Исследовать и сравнить с синтезированными производными диуретическую и салуретическую активности арбутина в эксперименте на крысах. Оценить роль гидроксильной группы в структуре арбутина в обеспечении его диуретической и салуретической активности.

3. Выявить особенности фармакодинамики арбутина при энтеральном и парентеральном путях введения.

4. Оценить противовоспалительную активность гликозида арбутина и его агликона в эксперименте на крысах.

5. Изучить и сравнить антиоксидантную активность гликозида арбутина с его агликоном в экспериментах in vitro и in vivo.

6. Исследовать антимикробную активность арбутина и его агликона в отношении основных возбудителей инфекционных болезней мочевыводящих путей.

Научная новизна исследования. Впервые установлена взаимосвязь между фармакологической активностью и электронным строением арбутина. Показано, что ключевую роль в реализации мочегонного действия в молекуле арбутина играет гидроксильная группировка в пара-положении бензольного кольца агликона и гликоновый сегмент молекулы.

Впервые комплексно изучены основные фармакологические эффекты арбутина.

Впервые изучены фармакодинамические особенности арбутина при различных путях введения в организм. Установлено, что при парентеральном применении, в отличие от энтерального, арбутин не обладает мочегонной и противовоспалительной активностями.

Выявлена зависимость антиоксидантного эффекта арбутина и гидрохинона от концентрации в экспериментах in vitro и диуретического действия от дозы в экспериментах in vivo.

Впервые методами квантовой химии была оценена антирадикальная активность арбутина и гидрохинона.

Научно-практическая значимость. Практическая значимость исследования заключается в экспериментальном доказательстве возможности перорального применения арбутина как мочегонного средства при различных заболеваниях мочеполовой системы. Наряду с этим на основе полученных данных о взаимосвязи между фармакологической активностью и электронным строением арбутина сформулированы опорные предпосылки для создания новой группы мочегонных препаратов с наличием фармакологических преимуществ (незначительные нарушения водно-солевого обмена, постепенное нарастание диуретического эффекта, наличие противовоспалительного и антимикробного действия) перед существующими современными мочегонными средствами.

Данная работа имеет теоретическое значение, поскольку позволяет повысить уровень знаний относительно мочегонного,

противовоспалительного, антиоксидантного и антимикробного действия арбутина и гидрохинона, которые входят в состав многих лекарственных растений различных семейств, широко применяемых в терапевтической практике. Полученные данные несут информацию фундаментального характера, которая в будущем поможет объяснить некоторые механизмы биологической активности этих веществ.

Основные положения, выносимые па защиту

1. При энтералыюм применении арбутин обладает выраженным мочегонным действием, сопровождающимся увеличением экскреции креатинина и калия, и не является натрийуретиком. В реализацию диуретического действия арбутина существенный вклад вносят гидроксильная группировка в пара-положении бензольного кольца агликона и гликоновый

сегмент молекулы.

2. При парентеральном применении арбутин не обладает

диуретическим и противовоспалительным действием.

3. Аггтиоксидантная активность арбутина более выражена в почках крыс; агликона арбутина - в крови крыс. Действие на оксидантно-антиоксидантную систему арбутина и его агликона имеет схожую картину в

живом организме и в пробирке.

4. Арбутин не обладает противомикробной активностью в отношении микроорганизмов, специфичных для инфекционных заболеваний мочевого тракта. Гидрохинон оказывает выраженное антибактериальное действие в отношении всех представленных штаммов грамотрицательных микроорганизмов.

Апробация материалов диссертации

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Проблемы развития фармацевтической науки и образования» (г Томск, 2011г.), I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Ученые Урала и Сибири — развитию

отечественной фармации: от синтеза до инновационных лекарственных средств» (г. Новосибирск, 2011 г.), I Всероссийском сибирском медико-биологическом конгрессе (г. Барнаул, 2011 г.), XIII научно-практической конференции «Молодежь - Барнаулу» (г. Барнаул, 2011 г.), ежегодной Всероссийской научно-практической конференции «Наука, образование, медицина» (Самара, 2011 г.), международном молодежном медицинском конгрессе "Санкт-Петербургские научные чтения - 2011" (Санкт-Петербург, 2011), на П итоговой конференции Научного общества молодых ученых и студентов (г. Барнаул, 2012 г.), на IX научно-практической конференции «Молодежь - Барнаулу» (г. Барнаул, 2012 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 5 - в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста, иллюстрирована 39 рисунками, 30 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 188 источников, из них 81 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Квантово-химические расчеты. Квантово-химический расчет выполнен с помощью программного комплекса PC GAMESS (Firefly), версия 7.1 .С., разработанная группой под руководством профессора Грановского A.A. в лаборатории химической кибернетики МГУ. Оценка энергетики комплексообразования проводилась по методу A.A. Бондарева и И.В. Смирнова (2012).

Для оценки прочности комплексов были рассчитаны термодинамические параметры следующих процессов замещения:

(Агликон...пН20)Рсм+ (Аминокислота...пН20)рсм = (Агликон... Аминокислота)рсм + п(Н20...Н20)рсм

Расчеты были проведены в Межрегиональном супервычислительном центре Национального исследовательского Томского государственного университета на суперкомпьютере «СКИФ-СуЬепа».

Методика построении спектров. Спектры взаимодействия были построены на основе квантово-химических расчетов прочности комплексов органических молекул с белковыми мишенями. На первом этапе производили вычисление прочности комплекса между различными аминокислотными остатками и центрами агликонов, способными участвовать в образовании водородных связей.

На втором этапе производили оценку энергетики гидрофобного взаимодействия. Затем составляли спектр путем полного перебора всех

центров со всеми аминокислотными остатками. На следующем этапе строили распределение энергии Гиббса для этих состояний.

Молекулярное моделирование и визуализации. Визуализация рассчитанных квантово-химических систем выполнена с помощью пакета программ Molekel 5.3. Молекулярное моделирование и визуализация белковых молекул и их комплексов с органическими молекулами выполнены с помощью программного пакета Chimera 1.5.3.

Теоретические расчеты антирадикальной активности молекул арбутипа и гидрохинона. Для теоретической оценки антирадикальной активности был произведен квантово-химический расчет из первых принципов (ab initio) методом функционала плотности с использованием корреляционного функционала B3LYP в базисе 6-31G (d,p). Так как взаимодействие происходит в условиях водной среды, учет сольватации производили методом Томази -РСМ. Расчет выполнен с помощью программного комплекса PC GAMESS

(Firefly), версия 7.1 .С.

Синтез структурных аналогов арбутина. Для синтеза фенил-ß-D-глюкопиранозида предварительно получали фенил-2,3,4,6-тетра-0-ацетил-Р-D-глюкопиранозид. Далее проводили снятие ацетильной защиты и очищение полученного продукта. Для получения п-метоксифенил-о-ß-D-глюкопиранозида был использован метод гликозилирования с использованием мягкой кислоты Льюиса BF3*Et20. Дезацетилирование гликозида проводили метилатом натрия в метаноле. Структуры полученных гликозидов идентифицировали методом ЯМР-спектроскопии.

Спектры ЯМР 'Н, 13С записывали на Фурье-спекгрометре Brucker Avante-300 (300 МГц) фирмы Bruker (Германия) внутренний стандарт - ГМДС, в качестве растворителя использовали дейтерированный ацетон. Температуры плавления определяли на микронагревательном столике Boetius фирмы Boetius (Германия).

Изучение фармакологической активности арбутина и его структурных аналогов. Исследование фармакологической активности арбутина и его производных проводили на 200 белых крысах Wistar обоего пола, массой 180 - 230 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария на обычном пищевом рационе и свободном доступе к воде и пище. Все участвующие в эксперименте животные находились в аналогичных условиях. Исследования на животных проводили в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (приказ МЗ СССР №75 от 12.08.1997 года) и Федеральным законом РФ «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997 года.

Изучение диуретической и салуретической активности арбутина и его структурных аналогов. При исследовании влияния арбутина и его структурных аналогов на функцию почек крыс животные содержались в индивидуальных клетках, приспособленных для сбора мочи. Подопытные крысы были разделены на шесть групп (п=12), которым вводили: I - арбутин внутрижелудочно, II - гидрохинон внутрижелудочно, III - арбутин подкожно, IV - гидрохинон подкожно, V - фенил-р-О-глюкопиранозид внутрижелудочно,

VI - метиларбутин внутрижелудочно. В начале эксперимента были определены исходные показатели диуреза, экскреции креатинина и ионов натрия, калия в моче подопытных животных. Исследуемые вещества крысы получали в течение семи дней в дозе 18 мкМоль/кг, в последующие семь дней в дозе 54 мкМоль/кг. В качестве контроля крысам, получавшим вещества внутрижелудочно, вводили 2 мл воды рег ов; крысам, получавшим вещества инъекционно, вводили 1 мл физиологического раствора подкожно.

В собранной за сутки моче определяли содержание креатинина, экскреция которого служила мерой клубочковой фильтрации. Для расчета суточной экскреции электролитов в собранной моче устанавливали

содержание ионов Ыа+ и К+.

Экскрецию креатинина с мочой определяли унифицированным методом Поппера, основанном на реакции Яффе с помощью стандартного набора реактивов. Концентрацию ионов натрия и калия в моче определяли методом пламенной фотометрии на пламенном фотометре ФПА - 2 - 01 (Россия).

Изучение диуретической активности на фоне изменения функции печени. Животные были разделены на 2 группы по 12 крыс в каждой. Хлорамфеникол вводили в дозе 50 мг/кг внутрижелудочно в 10 часов утра. В 13.00 животным вводили внутрижелудочно арбутин в дозе 54 мкмоль/кг. Вещества животные получали в течение 7 дней. Фенобарбитал вводили в дозе 50 мг/кг внутрижелудочно в течение 4 дней. В следующие 7 дней вводили арбутин в дозе 54 мкмоль/кг. В начале эксперимента были определены исходные показатели диуреза, экскреции ионов натрия и калия в моче подопытных животных. В качестве контроля крысам вводили 2 мл воды рег ов. Ежесуточно у экспериментальных животных измеряли объем выделенной мочи. Концентрацию ионов натрия и калия в моче определяли методом пламенной фотометрии на пламенном фотометре ФПА - 2 - 01 (Россия).

Определение противовоспалительной активности арбутина и гидрохинона. Противовоспалительную активность исследовали на модели острого воспаления после недельного введения арбутина и гидрохинона 1 -й группе внутрь, 2-й группе подкожно в дозе 54 мкмоль/кг. Животные 1-й контрольной группы на протяжении 7 дней получали эквиобъемное количество воды внутрь, животным 2-й контрольной группы вводили по 1 мл физиологического раствора подкожно.

Острое экссудативное воспаление индуцировали субплантарным введением ОД мл 1%-ного раствора каррагенина. Измерение объема правой задней конечности производили с помощью плетизмометра по окончании курса применения арбутина и его агликона до введения, а также через 60, 120 и 240 минут после инъекции флогистика. На основании данных среднего прироста конечности животных, полученных в результате трех параллельных измерений, рассчитывали степень противовоспалительной активности. Эффективными считались препараты со степенью противовоспалительной активности, превышающей 30 %.

Определение антиоксидантной и прооксидантной активности арбутина и гидрохинона. Для исследования возможной прооксидантной и

антиоксидантной активности in vitro использовали водные растворы арбутина и гидрохинона в концентрациях МО'2 моль/л и 1-Ю" моль/л. Содержание продуктов окисления ТВИН-80 определяли спектрофотометрическим методом. В экспериментах in vivo исследовали влияние арбутина и гидрохинона на состояние свободно-радикального окисления в крови и почках крыс. Общую прооксидантную активность, суммарный показатель концентрации всех прооксидантов и свободно-радикальных метаболитов оценивали по накоплению в крови и почечной ткани продуктов перекисного окисления липидов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой. Антиоксидантную активность оценивали по изменению интегративного показателя общей антиоксидантной активности и активности _ антиоксидантных ферментов (каталазы, глутатионпероксидазы, супероксиддйсмутазы).

Определение антимикробной активности арбутина и гидрохинона. Антимикробную активность арбутина и его агликона изучали в отношении музейных стандартных штаммов Е. coli 163, Proteus mirabilis, Klebsiela pneumoniae и клинических штаммов E.coli 137, выделенной от больного хроническим пиелонефритом, и E.coli 379, выделенной от больного

хроническим циститом.

В качестве среды использовали мясо-пептонный бульон. В пробирках, содержащих по 5 мл среды, растворяли стандартный образец арбутина в количестве, необходимом для создания концентраций 37 ммоль/л, 70 ммоль/л, 100 ммоль/л, и химически чистый гидрохинон в тех же концентрациях. Далее в эти же пробирки стерильной пипеткой вносили по 0,2 мл культуры по стандарту мутности Мак Фарланда 1,0 и термостатировали при температуре 35°С. Время экспозиции составляло 10 часов, с измерением оптической плотности растворов каждые два часа, а затем через сутки термостатирования. Оптическую плотность измеряли на приборе Densi La Meter (Чехия). В качестве контроля использовали 5 мл среды, содержащей 0,2 мл соответствующей культуры. При растворении гидрохинона в бульоне происходило потемнение среды, поэтому для гидрохинона в качестве контроля использовали его растворы в концентрации 37,70 и 100 ммоль/л.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку полученных результатов проводили путём расчёта средней (X) и средней квадратичной ошибки (m). Малый объем выборок изучаемых показателей послужил основанием выбора непараметрических критериев для оценки достоверности их различий. В работе использован критерий Вилкоксона-Манна-Уитни (и), при помощи которого определяли значимость различий количественных показателей. Различия считали статистически достоверными при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Термодинамические расчеты структуры арбутина и его структурных

аналогов

На первом этапе были произведены термодинамические расчеты молекул арбутина и его структурных аналогов.

Современное состояние компьютерного кластера и его вычислительная мощность не дают возможности оценить термодинамические параметры всей молекулы гликозида. В связи с этим для сравнительной оценки термодинамических параметров арбутина и его структурных аналогов (метиларбутина и фенил-р-О-глюкопиранозида) были рассчитаны комплексы с их агликонами. Все исследованные молекулы имели отличия только в

структуре их агликонов.

Оценивая пространственное и электронное строение исследованных гликозидов, было выяснено, что у всех трех гликозидов межьядерные расстояния, угол связи и угол между плоскостями сахарного и несахарного компонентов молекул значимо не отличаются. Это значит, что если гликозиды будут обладать разной по силе фармакологической активностью, то основную роль в проявлении данной активности играет группировка агликона в пара-

положении по отношению к сахару.

Объединенные результаты проведенных расчетов представлены в

таблице 1. _ _ ,

Таблица 1.

Наиболее прочные комплексы, образуемые исследуемыми веществами с

Комплекс Энергия Гиббса, кДж/моль

Агликон арбутина-а12 + С1и-<128 -35,003

Агликон фенил-р-0-глюкопиранозида-(112 + Тгр-а17 -42,868

Агликон метиларбутина-с111 + Кя-аВ -50,248

Гидрохинон-а12 + 01и-(132 -34,918

Бензохинон-с112 + Тгр-а17 -30,696

Таким образом, исходя из теоретических расчетов, наибольшей отрицательной энергией Гиббса, а соответственно и наибольшей прочностью и активностью должен обладать метиларбутин, затем в порядке убывания активности фенил-Р-О-гтокопиранозид, арбутин, гидрохинон и бензохинон. При этом, следует отметить, что все изученные агликоны гликозидов имеют максимально возможный аффинитет к совершенно разным аминокислотам^. Это позволяет делать предположение о возможно различной фармакологической активности этих гликозидов в отношении основной мишени арбутина либо вообще отсутствии таковой.

Для подтверждения теоретических расчетов было проведено изучение фармакологической активности арбутина и его структурных аналогов.

Изучение фармакологической активности арбутина

Фармакологические исследования проводились в направлении изучения диуретической, противовоспалительной, антиоксидантной и

противомикробной активности.

Мочегонная активность арбутина и его агликона гидрохинона

Поскольку механизм действия арбутина связывают с гидролизом его до гидрохинона, целесообразным было сравнить мочегонную активность

арбутина и гидрохинона.

При введении арбутина и гидрохинона в дозе 18 мкмоль/кг наблюдалось постепенное увеличение диуреза, статистически достоверных значений по сравнению с контролем оно достигало с четвертого по шестой дни введения каждого из веществ. Такой характер действия свойственен растительным диуретикам.

При повышении дозы веществ до 54 мкмоль/кг наблюдалось выраженное увеличение диуреза крыс, начиная с первого дня введения (рис. 2).

□ арбутин 1 гидрохинон

контроль

Дни введения

Рис. 2. Диуретическая активность арбутина и гидрохинона при внутрижелудочном введении крысам в дозе 54 мкмоль/кг.

Примечание: здесь и далее * - различия достоверны в сравнении с показателем исходного уровня диуреза у крыс.

Диуретический эффект арбутина сопровождался повышением экскреции креатинина. При введении гидрохинона экскреция креатинина достоверно возрастала только в первый день эксперимента, в остальные дни этот показатель оставался на уровне контрольных значений.

Введение арбутина и его агликона гидрохинона в обеих дозах не вызывало натрийуретического эффекта, а в некоторые дни даже снижало экскрецию натрия (табл. 2).

Таблица 2.

Изменение экскреции натрия с мочой у крыс при внутрижелудочном ПОРПАИМИ яг>Я\ттаня и ГИЛППУИНПНЯ'ПП СПагаяенИЮ С контоолем, %

Доза 18 мкмоль/кг 1 день 3 день 5 день 7 день

Арбутин (п=12) 43,3 0 23,9 - 34,3* (р<0,05)

Гидрохинон (п=12) - 11,3 -40* (Р<0,05) 0 31,3

Доза 54 мкмоль/кг 1 день 3 день 5 день 7 день

Арбутин (п=12) - 37,3* (Р < 0,05) 4,5 - 34,3* (р<0,05) 5,9

Гидрохинон (п=12) -46,1* (Р < о, 05) - 49, 6* (р < 0, 05) -63,4* (Р < 0,01) - 54,8* (р < 0,05)

Примечание: здесь и далее * -1-------------------------

исходного уровня экскреции натрия у крыс.

Арбутин достоверно увеличивал экскрецию калия с первого дня введения и до завершения эксперимента (табл. 3). Гидрохинон, напротив, не оказывал никакого воздействия на экскрецию калия ни в одной дозе.

Таблица 3.

Изменение экскреции калия с мочой у крыс при внутрижелудочном введении арбупша и гидрохинона по сравнению с контролем, %

Доза 18 мкмоль/кг

Арбутин п=12

1 день

Гидрохинон п=12

Доза 54 мкмоль/кг

Арбутин п=12

Гидрохинон п=12

73,9* (р < 0, 05)

19

1 день

58,5* (р < 0,05)

29,6

3 день

62,2* (р < 0,05)

0

3 день

138,9* (р<0,01)

38,8

5 день

75,4* (Р < 0,05)

16,1

5 день

90,9* (р<0,01)

21,5

7 день

51,9* (р<0, 05)

16,9

7 день

164,3* (р < 0.01)

24

Примечание: здесь и далее * - различия достоверны в сравнении с показателем исходного уровня экскреции калия у крыс.

Полученные данные свидетельствуют о наличии выраженного мочегонного действия изучаемых веществ. При этом диуретический эффект арбутина превышает таковой гидрохинона в 2-3 раза. Диуретический эффект арбутина не связан с увеличением экскреции натрия, а соответственно, гипотеза о том, что арбутин действует посредством гидрохинона, который «дубит» почечные канальцы и тем самым препятствует реабсорбции ионов и жидкости из просвета канальцев, не находит своего подтверждения. Поскольку арбутин достоверно увеличивал экскрецию креатинина, то одним из возможных механизмов диуретического действия арбутина можно считать повышение почечного кровотока и, как следствие, увеличение клубочковой фильтрации.

Сравнительная характеристика мочегонной активности арбутина с его структурными аналогами

Для экспериментальной оценки роли гидроксилыюй группы агликона в структуре арбутина были синтезированы некоторые гликозидные производные арбутина с различными агликонами: фенил-р-О-глюкопиранозид и метиларбутин.

Молекула фенил-Р-Б-глюкопиранозида сходна по своему химическому строению и пространственной конфигурации природному гликозиду арбутину. Различие в строении данных гликозидов заключается в том, что в молекуле арбутина агликоном является гидрохинон, а у фенил-р-Б-глюкопиранозида - фенол.

Если мочегошгая активность синтезированного вещества будет ниже, чем у арбутина, то гидроксильная группировка агликона является ключевой группировкой, повышающей прочность комплекса и увеличивающей аффинитет белка-мишени, что обеспечивает относительно высокую диуретическую активность молекулы арбутина.

Если диуретическая активность фешш-р-О-глюкопиранозида будет выше, чем у арбутина, то тогда свободный гидроксильный радикал арбутина препятствует реализации гидрофобного эффекта при образовании комплекса неполярного фрагмента белка-мишени с неполярным участком гликозида.

Известно, что метиларбутин в растениях часто обнаруживается совместно с арбутином. При гидролизе метиларбутина отщепляется метиловый эфир и также, как у арбутина, освобождает гидрохинон. Если предположение о том, что мочегонный эффект арбутина зависит от высвобождения гидрохинона, верно, то метиларбутин должен оказывать по силе такой же мочегонный эффект, как и арбутин.

Введение крысам фенил-Р-О-глюкопиранозида в дозе 18 мкмоль/кг незначительно, но повышало их суточный диурез. Тенденция к его увеличению хорошо прослеживалась начиная с 4 дня введения гликозида. Метиларбутин в дозе 18 мкмоль/кг не вызывал значимого мочегонного эффекта у всех экспериментальных животных.

И метиларбутж ■ фенил-р-О-глюкатирангаид □арбути!

контроль

1 2 3 4 5 6 7 Дни введения

Рис. 4. Диуретическая активность синтетических аналогов арбутина при введении крысам в дозе 54 мкмоль/кг.

Увеличение дозы фенил-Р-О-глюкопиранозида в три раза с первого же дня вызывало увеличение суточного диуреза крыс более чем в два раза (рис. 4). При введении трехкратной дозы метиларбутина отмечалось достоверное увеличение диуреза на пятый и седьмой дни эксперимента в 1,5 раза по сравнению с контролем.

Сопоставляя полученные результаты с предыдущим исследованием диуретического действия арбутина, можно отметить, что мочегонная активность арбутина почти в 2 раза превышает активность метиларбутина и в 1,5 раза выше, чем фенил-р-О-глюкопиранозида.

Введение фенил-Р-О-глюкопиранозида не сопровождалось увеличением натрийуретического эффекта, а экскреция калия повышалась в 3 раза по сравнению с контролем. Метиларбутин не вызывал увеличения экскреции электролитов.

Так как диуретическое действие фенил-Р-О-глюкопиранозида и метиларбутина имеет существенно более низкие значения, чем у арбутина, то, вероятно, гидроксильная группировка в молекуле арбутина является ключевой в комплексообразовании с белком-мишенью и в реализации его диуретической активности. Кроме того, низкая диуретическая активность метиларбутина по сравнению с арбутином указывает на то, что механизм действия арбутина не связан с высвобождением после его гидролиза гидрохинона.

В результате проведенных исследований было установлено, что наиболее мощный диуретический эффект наблюдался при введении арбутина. Таким образом, результаты и интерпретация теоретических расчетов, на первый взгляд, не совпадают с экспериментальными данными. Однако теоретические расчеты также показали, что молекулы арбутина и гидрохинона образуют наиболее прочные комплексы с одинаковыми аминокислотами (аспарагиновой и глутаминовой кислотами), а все остальные вещества с

триптофаном, т.е. исследуемые вещества, скорее всего, имеют разные биологические мишени. С этой точки зрения мочегонный эффект наиболее выражено проявляется при взаимодействии вещества с белком-мишенью, имеющем свободные реакционно-способные группировки аспарагиновой и глутаминовой кислот. Кроме того, как предполагалось из теоретических расчетов, мочегонная активность арбутина и гидрохинона должна быть сопоставима, хотя в эксперименте диуретический эффект арбутина был значимо выше. Это связано с тем, что арбутин имеет гораздо более сложную структуру, чем гидрохинон. Наличие глюкозы в молекуле арбутина обеспечивает большую его селективность к потенциальной мишени, чем гидрохинона. Следует добавить, что в потенциальной мишени арбутина нужно искать центры взаимодействия с лигандом по наличию в них Glu и Asp.

Мочегонная активность арбутина и его агликона гидрохинона при парентеральном способе введения

Как показали эксперименты, арбутин и его агликон гидрохинон обладают выраженным мочегонным эффектом при энтеральном применении. Однако для понимания основ мочегонного механизма действия арбутина важным было сопоставить его диуретическую активность при парентеральном применении.

В результате парентерального введения, в отличие от энтерального, исследуемые вещества не оказывали выраженного мочегонного действия. Такое различие в действии может быть обусловлено тем, что попадая в желудочно-кишечный тракт, молекулы арбутина и гидрохинона претерпевают метаболические изменения. Как описано в литературе [Quintus J., Kovar К.А., Link P., 2005], арбутин под действием кислой среды желудка гидролизуется до гидрохинона, который затем поступая в печень, метаболизируется до сульфатов и глюкуронидов. В таком случае, мочегонный эффект от применения чистого гидрохинона должен быть выраженнее, чем от арбутина (поскольку возможно, что не все молекулы арбутина будут гидролизованы в желудке), или одинаков, так как вещества вводили в эквимолярной дозе. Но эксперименты показали, что мочегонное действие более выражено у арбутина. Этот факт свидетельствует о наличии у арбутина второго механизма мочегонного действия, не связанного с высвобождением свободного гидрохинона после гидролиза в желудочно-кишечном тракте.

Результаты исследования влияния на экскрецию натрия показали, что оба вещества, так же, как и при энтеральном введении, вызывали увеличение натрийуреза. Повышение выведения натрия при введении арбутина и гидрохинона в обеих дозах превышало контрольные значения в 2-3 раза в разные дни эксперимента. Однако этого оказалось недостаточно для проявления мочегонного эффекта.

Арбутин при приеме per os вызывал увеличение экскреции калия, а при инъекционном способе введения не обладал калийуретическим эффектом. Возможно, увеличение выведения калия арбутином связано с влиянием его на какой-либо вид калий-хлорных транспортеров. А поскольку калийурез

наблюдался только при энтеральном применении, скорее всего эффект вызывал не сам арбутин, а его метаболит, но очевидно это не гидрохинон. Гидрохинон в ходе всего эксперимента не вызывал повышения выведения ионов калия с мочой.

Таким образом, результаты проведенного исследования показали наличие у арбутина и гидрохинона выраженной мочегонной активности, которая не связана с повышением выделения ионов натрия с мочой. Этот факт отличает диуретический эффект исследуемых веществ от такового действия широко известного современного диуретика - фуросемида. Возникает вопрос: каким образом реализуется мочегонная активность арбутина и гидрохинона, если они не нарушают экскрецию ионов натрия, как большинство современных диуретических средств? Известно, что в почечных канальцах в большом количестве обнаружены аквапорины — белки, которые регулируют транспорт жидкости, не связанный с транспортом ионов. Возможно, арбутин и продукт его гидролиза гидрохинон нарушают работу этих белков и тем самым вызывают задержку реабсорбции жидкости в дистальных отделах нефрона. В таком случае, данные вещества можно отнести к группе акваретиков. Однако, интерпретируя результаты следующего эксперимента, можно предполагать и другие возможные механизмы действия арбутина. Поскольку в литературе встречаются сведения о метаболизме арбутина до активных форм гидрохинона в печени, то логично было посмотреть, как ведет себя арбутин в качестве диуретика при изменении функции печени.

Мочегонная активность арбутина при изменении функции печени

Установлено, что выведение арбутина почками человека после приема внутрь терапевтических доз извлечения из листа толокнянки осуществляется преимущественно в виде глюкуронида, сульфата гидрохинона и в меньшей степени - в виде гидрохинона [Quintos J., Kovar К.А., Link P., 2005]. Предположительно, арбутин гидролизуется в кишечнике с образованием гидрохинона, который затем претерпевает изменения в печени с образованием указанных метаболитов. Для оценки роли печени в метаболизме и механизме действия арбутина были проведены эксперименты с изменением микросомального окисления печени. Если активность арбутина зависит от высвобождения гидрохинона, то при усилении метаболизирующей функции печени следует ожидать увеличения мочегонного действия арбутина и, наоборот, при угнетении печеночных ферментов диуретическая активность арбутина будет снижаться.

Из рис. 5 видно, что при введении арбутина крысам как на фоне угнетения, так и на фоне активации микросомального окисления печени наблюдалось сопоставимое в обоих случаях увеличение диуреза в последние дни эксперимента.

Дни введения

Рис. 5. Диуретическая активность арбутина у крыс на фоне

хлорамфеникола и фенобарбитала.

При введении арбутина и на фоне угнетения функции печени, и на фоне ее активации экскреция натрия снижалась на протяжении всего эксперимента. Следует отметить, что похожая картина наблюдалась и при введении только арбутина. В то же время, в общей картине экскреция калия не изменялась.

Результаты проведенного эксперимента навели на мысль, что печень не играет существенной роли в механизме действия арбутина. Кроме того, анализируя результаты влияния арбутина на экскрецию электролитов и креатинина, можно предположить, что арбутин не оказывает прямого воздействия на почки. Исходя из вышеизложенного, гипотетически ключевую роль в механизме действия арбутина может играть кишечник. На этот факт указывают данные, что при энтеральном введении арбутин вызывает мочегонный эффект, а при парентеральном введении эффекта нет. Кроме того, относительно недавно установлено существование определенных кишечных гормонов инкретинов, которые, кроме всех прочих эффектов, обладают диуретическим действием [Александров A.A., 2011]. Возможно, что при попадании в кишечник арбутин вызывает активацию секреции данных белков, за счет которых и реализуется мочегонный эффект. Известно, что при активации секреции инкретинов вырабатывается инсулин и снижается уровень глюкозы в крови. На возможность мочегонного действия арбутина через активацию инкретинов указывают и данные о сахароснижающем эффекте арбутина [Jedsadayanmata А., 2005].

Другие фармакологические эффекты арбутина

Арбутин, как биологически активное вещество, обладающее мочегонной активностью, имеет преимущества перед рядом синтетических препаратов, поскольку, как и большинство природных соединений, способен оказывать комплексное воздействие на организм. Так, известно, что арбутину присущи противовоспалительное, антиоксидантное, противомикробное действия. Сочетание диуретической активности с перечисленными эффектами крайне

важно в лечении целого ряда воспалительных заболеваний мочевыделительной системы.

Влиянии арбутина и гидрохинона на развитие острого воспалении у

крыс

В рамках работы по поиску связи активности арбутина с его электронным строением оценка особенностей противовоспалительного, аитиоксидантного, противомикробного эффектов и их связи с основным метаболитом -гидрохиноном - явилась следующим важным этапом.

Как и в случае с мочегонной активностью, эксперимент проводили при энтеральном и парентеральном введении арбутина и гидрохинона.

И контроль □ арбутин ■ гидрохинон

Время, в часах

Рис. б.Влияние арбутина и гидрохинона на развитие каррагенинового отека у крыс при внутрижелудочном введении.

Примечание: * - здесь и далее достоверные различия с контролем.

Как видно из рис. 6, субплантарное введение каррагенина контрольной группе животных приводило к быстрому и последовательному формированию отека конечности.

У крыс, получавших арбутин и гидрохинон внутрижелудочно, через первые 120 минут после введения флогистика прирост объема конечностей был в среднем на 23% (р<0,05) меньше соответствующего прироста в контроле. К концу периода наблюдения появились различия между приростом объема лап крыс, получавших внутрижелудочно арбутин, и крыс, получавших гидрохинон. В это время прирост объема лап крыс был на 28% ниже контрольного показателя (р<0,05). Прирост объема лап животных, получавших внутрижелудочно гидрохинон, не отличался от контроля.

Таким образом, при энтеральном применении арбутин обладал определенной противовоспалительной активностью, хотя и не значительной. И, как показывает данный эксперимент, эта активность обеспечивается влиянием на все фазы острого воспаления. Гидрохинон при внутрижелудочном применении также обладал относительно слабым

противовоспалительным действием, но оно реализовалось только во влиянии на первые две фазы воспаления. 1.2-

и

Ы 1 -

л &

с 0,8-сз

I м-

•и Л

0,4

&

1 2 3

Время, в часах

Рис. 7. Влияние арбутина и гидрохинона на развитие каррагенинового

отека у крыс при инъекционном введении.

Совершенно иные результаты получены при инъекционном введении исследуемых веществ (рис. 7). В данном эксперименте положительное влияние арбутина и гидрохинона на воспалительный процесс проявлялось только в начале фазы экссудации. Затем этот эффект сменился противоположным. Во второй и четвертый часы наблюдения флогистическое действие каррагенина только усиливалось арбутином и гидрохиноном почти в равной степени.

Исходя из этого, при парентеральном применении арбутин и гидрохинон не оказывают противовоспалительного эффекта, а усиливают флогистическое

воздействие каррагенина.

Данный эксперимент еще раз подтверждает различия в действии

арбутина при энтеральном и парентеральном введении.

Квантово-химические расчеты антиоксидаитной активности молекул арбутина и гидрохинона

На первом этапе для прогнозирования, а также теоретического обоснования влияния арбутина и гидрохинона на процессы свободно-радикального окисления предварительно был проведен расчет теоретически возможной антирадикальной активности гликозида и его основного

метаболита гидрохинона.

Для сравнения антирадикальной активности реакционных центров этих молекул произведены расчеты термодинамики процесса взаимодействия арбутина и гидрохинона с гидроксильным радикалом.

Наибольшая антирадикальная активность для молекулы арбутина наблюдалась при взаимодействии центра Н35 с гидроксильным радикалом, энергия Гиббса составила -165,323 кДж/моль.

В молекуле гидрохинона центры Н12 и Н14 эквивалентны, энергии Гиббса взаимодействия равны и составляют -173,637 кДж/моль.

Термодинамические расчеты показали, что наибольшей антирадикальной активностью обладает молекула гидрохинона.

Разница энергий Гиббса для арбутина и гидрохинона 8.14 кДж/моль. Тогда соотношение констант равновесия этих процессов для данных молекул при температуре 298 К равно 28,64. Значит теоретически арбутин будет проявлять антирадикальную активность, сравнимую с гидрохиноном, лишь в концентрациях в 29 раз больших, чем гидрохинон.

Влияние арбутина и гидрохинона на процессы свободно-радикального окисления in vitro

В результате проведенных исследований in vitro было установлено, что арбутин и гидрохинон проявляли как антиоксидантные, так и прооксидантные свойства.

При этом в данных экспериментальных условиях значительно преобладала антиоксидантная активность гидрохинона в концентрации 1 • 10 моль/л. Выявленные различия в эффектах арбутина и гидрохинона обусловлены особенностями их химической структуры. Известно, что арбутин является фенологликозидом и имеет в молекуле один фенольный гидроксил. Гидрохинон же при наличии двух фенольных гидроксилов активнее связывает Fe2+, препятствуя тем самым образованию свободных радикалов под действием Ре2+/аскорбат -индуцированного окисления ТВИН-80. В таком случае антиоксидантная активность гидрохинона будет выше.

Прооксидантные свойства изучаемых молекул, также связаны с наличием в структуре фенольных гидроксилов. Следует отметить, что прооксидантный эффект для обоих исследуемых веществ был более выражен в концентрациях 1 • 10"3 моль/л. Это объясняется тем, что в случае, когда эффективная концентрация антиоксиданта мала относительно концентрации зарождающихся свободных радикалов, большая часть молекул антиоксиданта быстро превращается в феноксильные радикалы, которые способны с относительно высокой скоростью включаться в продолжение цепей реакций перекисного окисления липидов. В этом случае антиоксидант будет выступать не как ингибитор, а как субстрат реакций свободно-радикального окисления [Зайцев В.Г.,2001].

Влияние арбутина и гидрохинона на процессы свободно-радикального окисления in vivo

Поскольку, как было показано, арбутин и гидрохинон влияют на функцию почек, нам показалось интересным сравнить эффекты исследуемых соединений в крови и в почках крыс.

Результаты проведенных экспериментальных исследований показали, что арбутин и гидрохинон наряду с выраженной антиоксидантной активностью способны воздействовать и на оксидантный статус тканей. Вместе с тем, характер влияния этих веществ на процессы свободно-радикального окисления существенно различается. Так, выявленное в опытах in vivo падение ОПА в крови и отсутствие влияния гидрохинона на уровень

тиобарбитурчувствительных продуктов указывает на снижение концентрации свободных радикалов в плазме. Это может быть обусловлено прямой антирадикальной активностью гидрохинона. Напротив, при введении арбутина отмечается рост показателей оксидантного статуса. В основе этого эффекта может лежать накопление оксидантных производных фенологликозида, образующихся в процессе нейтрализации свободных радикалов.

Разный характер защитного действия арбутина и гидрохинона подтверждают и выявленные изменения общей антиоксидантной активности. Так, введение арбутина привело к мощной активации ОАА в ткани почек. Следует отметить, чтскрост ОАА преобладает над выявленными изменениями активности антиоксидйнтных ферментов. Учитывая, что ферментные и неферментные антиоксиданты составляют единую систему защиты организма от оксидативного стресса, можно предположить, что в данном случае общая антиоксидантная активность усиливается за счет неэнзимного звена антиоксидантной защиты. Следовательно, в данных экспериментальных условиях арбутин является активным скаванджером свободных радикалов. В экспериментах на животных также было установлено, что арбутин обеспечивает рост активности глутатионпероксидазы, тогда как гидрохинон оказывает направленное действие на каталазу. Субстратом для обоих ферментов может служить перекись водорода. Исходя из этого, можно предположить, что арбутин и гидрохинон влияют на продукцию Н202 в средах организма. Изменение концентрации перекиси водорода, вероятно, вторично, и объясняется высоким сродством гидрохинона и арбутина к гидроксильным радикалам.

Заметим, что гидрохинон реализует свой эффект преимущественно в крови, тогда как у арбутина в большей степени выражено нефропротекторное действие. Разная направленность действия арбутина и гидрохинона обусловлена особенностями их химического строения и, следовательно, отличиями в фармакокинетике. Известно, что арбутин является фенологликозидом, который под влиянием фермента арбутазы расщепляется на глюкозу, свободный гидрохинон и воду. В свою очередь гидрохинон относится к веществам с лабильным водородом. Высокая реакционная способность гидрохинона позволяет ему активно взаимодействовать со свободными радикалами в общем кровотоке и, не исключено, что лишь незначительное количество вещества достигает почек. В этом случае антиоксидантная активность гидрохинона будет преобладать в крови. Ввиду того, что арбутин отличается от гидрохинона наличием гликона, то разница в эффектах этих соединений обусловлена именно фрагментом молекулы глюкозы. По сравнению с гидрохиноном арбутин более устойчив к окислению, что позволяет ему транспортироваться в почки в неизмененном виде. Благодаря гликону арбутин в меньшей степени реабсорбируется в канальцах почек, где, таким образом, накапливается. Структурные особенности арбутина позволяют ему взаимодействовать с мембранными структурами клетки, что пролонгирует и усиливает его антиоксидантную активность в почках. Кроме того, глюкоза обладает собственной антиоксидантной активностью,

усиливающей эффект арбутина [Тимен Л .Я., Шерцингер А.Г., Мачнева Т.В. и др., 2005]. Результаты экспериментов позволяют делать вывод, что фрагмент глюкозы, встроенный в молекулу арбутина, изменяет антиоксидантную активность вещества.

Интересно, что, сравнивая данные эксперимента in vitro с полученными результатами оксидантной и антиоксидантной активности в опытах на крысах в условиях формалинового воспаления, можно отметить схожую картину поведения арбутина и гидрохинона в крови крыс и in vitro в концентрации 1 • 10'2 моль/л. Возможно, что исследуемые вещества реализуют свое действие на оксидантно-антиоксидантную систему по одинаковому механизму как в живом организме, так и in vitro.

Антимикробная активность арбутина и гидрохинона

В литературе описаны антимикробные эффекты арбутина. Однако, этот гликозид в составе молекулы содержит с одной стороны глюкозу, являющуюся питательной средой для микроорганизмов, с другой стороны гидрохинон, представляющий собой высокотоксичный двухатомный фенол. В связи с этим очередной задачей, которую предстояло решить, явилось исследование противомикробной активности арбутина в отношении основных возбудителей инфекций мочевыводящих путей в сравнении с гидрохиноном.

Исследования по сравнению антимикробного эффекта арбутина и гидрохинона выявили значительные различия их действия. Установлено, что наивысшие исследуемые дозы арбутина (100 мкмоль л) незначительно задерживают размножение стандартных штаммов Е. coli 163 и Pr. mirabilis. Штаммы Klebsiela pneumonia и Е. coli 137, оказались нечувствительными к растворам арбутина, т.е. антимикробная активность отсутствует. Интересно, что штамм Е. coli 379, выделенный от больного хроническим циститом, вопреки ожидаемому эффекту, активно размножался в растворах арбутина, и к завершению эксперимента бактериальная концентрация в опытных пробирках превышала контрольную почти в 2 раза. Такая разница в эффектах арбутина на различные представители грамотрицательных микроорганизмов очевидно зависит от химического строения вещества. Арбутин является гликозидом и способен при воздействии некоторых бактериальных ферментов разлагаться до гидрохинона и глюкозы. В литературе приводятся сведения о выраженной антибактериальной активности гидрохинона [Куцик Р.В., Зузук Б.М., Недоступ А.Т., Пецк Т., 2003]. Так, выделяясь при гидролизе арбутина, он, и оказывал противомикробное действие на изучаемые штаммы Е. coli 163 и Proteus mirabilis. Исследуемые штаммы Klebsiela pneumoniae и Е. coli 137 не выделяют ферментов, способных гидролизоватъ арбутин до гидрохинона, который мог бы оказать бактерицидный эффект. Однако штамм Е. coli 379, выделенный от больного хроническим циститом, разлагает арбутин и активно использует выделившуюся при этом глюкозу в качестве дополнительного источника питания. Об этом свидетельствует не только увеличение скорости размножения данного штамма, но и выделение пузырьков газа и пены, которые

образуются при разложении глюкозы в процессе обмена веществ микроорганизма до углекислого газа.

Исследование противомикробного эффекта гидрохинона показало высокую его активность в отношении всех изучаемых грамотрицательных микроорганизмов, что подтверждает данные литературы о

антибактериальных свойствах этого вещества, в том числе и в отношении антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов. Гидрохинон является фенолом и оказывает токсический эффект на живые клетки, в том числе и бактериальные [Todorovic V., 2003]. Окисляясь, он превращается в бензохинон, который, в свою очередь, также может оказывать бактерицидное действие на микроорганизмы.

В организме антимикробная активность арбутина не исключается, так как может происходить его гидролиз до гидрохинона, как указывают данные литературы.

ВЫВОДЫ

1. Ключевой группой в обеспечении мочегонной активности арбутина в его молекуле является гидроксильная группа в пара-положении агликона. Присутствие в структуре гликона обеспечивает больший, по сравнению с таковым чистого агликона фармакологический эффект. В активных центрах потенциального белка-мишени, ответственных за связывание с арбутином, необходимо наличие в цепи глутамшювой и (или) аспарагиновой кислот, с которыми возможна достаточная прочность водородной связи, обеспечивающая значимый для фармакодинамики диуретика аффинитет.

2. Арбутин обладает выраженной мочегонной активностью, которая не зависит от повышения экскреции ионов натрия, при этом повышается клубочковая фильтрация. Реализация мочегонного действия арбутина через агликон сопровождается альтернативным неустановленным механизмом. При парентеральном введении арбутин и его агликон не обладают мочегонной активностью.

3. Противовоспалительная активность арбутина при энтеральном введении выше, чем у его агликона, и проявляется во все фазы острого воспаления. При парентеральном введении оба вещества усиливают флогистическое действие каррагенина.

4. Прямой неферментный антиоксидантный эффект гидрохинона значительно выше, чем у арбутина. При этом изменения активности процессов свободно-радикального окисления у гидрохинона больше выражено в крови, а при действии арбутина - в почках. Сравнительный анализ показателей оксидантно-антиоксидантной системы в экспериментах in vivo и in vitro позволяет предполагать схожий механизм действия изучаемых веществ в пробирке и в живом организме.

5. Арбутин не обладает противомикробной активностью в отношении изученных штаммов Е. coli, Proteus mirabilis и Klebsiela pneumoniae. Его действие на микроорганизмы реализуется при гидролизе, и в зависимости от условий может быть прямо противоположным: от антибактериального, за счет

выделения гидрохинона, до способствующего росту бактерий, за счет выделения глюкозы. Гидрохинон оказывает выраженное антибактериальное действие в отношении всех представленных штаммов грамотрицательных микроорганизмов.

Практические рекомендации и предложения для создания новой группы мочегонных средств на основе феногликозидов

1. При проектировании диуретика, имеющего фенолгликозидную структуру в агликоновой части молекулы, представляющей собой гидрофобное бензольное кольцо, в пара-положении следует поместить полярную ключевую группу из набора высокоактивных, способных образовывать прочные водородные связи в водной среде.

2. Следует учесть существенный вклад гликоновой части молекулы гликозида в реализацию мочегонного эффекта и рассматривать ее как фармакодинамически значимый сегмент, наряду с обеспечением высокой

растворимости вещества.

3. Наряду с разработкой высокоактивного не токсичного соединения, обладающего необходимыми фармакологическими характеристиками, целесообразно учитывать возможность создания мочегонного средства для внутреннего применения на основе арбутина в лечении заболеваний мочевыделителыюй системы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Антиоксидантный и прооксидантный эффекты арбутина и гидрохинона в эксперименте in vitro // Бюллетень сибирской медицины. -2011. - Т. 10 №5. - С. 41-44 (в соавт. Я.Ф. Зверев, В.М.Брюханов, О.С. Талапаева, C.B. Замятина, О.Н. Зяблова, И.В. Смирнов).

2. Изучение механизма мочегонной активности арбутина в эксперименте на крысах // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2011. - №3/1(37). - С.24-25 (в соавт. О.Н. Мазко).

3. Активность фуросемида при различных значениях pH мочи у крыс // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2011. - №3/1(37). -С.47 (в соавт. И.В. Смирнов, A.A. Бондарев, O.A. Еремин, В.В. Удут).

4. Изучение антимикробного действия арбутина и гидрохинона // Материалы I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых « Сибирский медико-биологический конгресс». - Барнаул, 2011. -С.16-17 (в соавт. Л.Ю. Бутакова, И.В. Смирнов).

5. Теоретическое и экспериментальное изучение антиоксидантной и прооксидантной активностей арбутина и гидрохинона // Материалы I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых « Сибирский медико-биологический конгресс». - Барнаул, 2011. - С.15-16 (в соавт. О.С. Талалаева, C.B. Замятина, И.В. Смирнов).

6 Изучение антимикробного действия арбутина и гидрохинона в отношении некоторых штаммов Е. coli // Материалы медицинского раздела XIII научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь

Барнаулу». - Барнаул, 2011. - С.19-20.

7 Изучение антифлогистической активности арбутина и гидрохинона на модели острого воспаления в эксперименте на крысах // Материлы ежегодной Всероссийской научно-практической конференции «Наука, образование, медицина» - Самара, 2011. - С. 485-487 (в соавт. О.Н. Мазко, И.В Смирнов).

8 Мочегонная активность арбутина и гидрохинона // Тезисы IV международный молодежный медицинский конгресс "Санкт-Петербургские научные чтения - 2011". - СпБ, 2011. - С. 365-366 (в соавт. И.В. Смирнов). ^

9. Синтез фенил-Р-О-глюкопиранозида и изучение его мочегонной активности в эксперименте на крысах // Материалы межрегиональной научной конференции с международным участием, посвященной 70-летию фармацевтического факультета СибГМУ. - Томск, 2011. - С. 31-33 ( в соавт. Бондарев A.A., Смирнова И.В., Смирнов И.В., иванов A.A.)

10 Особенности мочегонной активности арбутина и гидрохинона // Сибирский медицинский журнал. - 2012. - Т.27 №3 С. 131-134 (в соавт. И.В.

Смирнов, A.A. Бондарев)

11. Исследование взаимосвязи структура-диуретическая активность некоторых фенольных гликозидов // Материалы Всероссийской молодежной научной коференции «Актуальные проблемы органической химии» -Новосибирск, 2012. - С. 66 (в соавт. A.A. Иванов, П.С. Плотников, Т.О. Мурашко, А.О. Немцев, A.A. никитенко, И.В. Смирнов, A.A. Бондарев)

12. Мочегонная активность арбутина на фоне изменений функции печени // Материалы медицинского раздела XIII научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь - Барнаулу» - Барнаул, 2012. - С. 25-26 (в соавт. Е.Д. Морозова, И.В. Смирнов).

13. Сравнение мочегонной активности арбутина и гидрохинона при различных способах введения в эксперименте на крысах // Нефрология. - 2012. - Т.16 №4 .- С. 84-87 (в соавт. Смирнов И.В., Бондарев A.A.)

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК активные формы кислорода

СОД _ супероксиддисмутаза

КАТ каталаза ---

ПОЛ _ перекисное окисление липидов

ОПА общая прооксидантная активность

ОАА общая антиоксидантная активность

Glu глутаминовая кислота

Asp аспарагиновая кислота

Волобой Нина Леонидовна

СВЯЗЬ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АРБУТИНА С ЕГО ЭЛЕКТРОННЫМ СТРОЕНИЕМ

Автореф. дие. на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 15.01.2013 Заказ №11 Формат 60 х 90/16 Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз.

Отпечатано в типографии «Принт-технология» Красногорское, ул. Раздольная, 2

Одной из актуальных проблем современной фармакологии является поиск новых высокоэффективных и безопасных лекарственных средств [79]. Благодаря успехам в области органического синтеза было создано множество лечебных средств. Однако в настоящее время поиск фармакологических веществ ведётся не только среди продуктов химического синтеза, но и среди лекарственного растительного сырья [57]. Этому направлению способствует огромный опыт ученых и накопленные знания народной медицины.

Растительные препараты бесспорно имеют ряд преимуществ перед синтетическими, такие как низкая токсичность, либо даже отсутствие таковой, относительная мягкость фармакологических эффектов, широта терапевтического действия и, как правило, многонаправленность лечебного воздействия на организм. Работы гто поиску активных компонентов в лекарственных растениях и выяснение их механизмов терапевтического действия остаются весьма востребованы в условиях современного состояния фармацевтической и фармакологической науки.

Поскольку запасы растительного сырья не бесконечны, методы культивирования лекарственных растений и выделение биологически активных веществ из них затратны и сложны, перспективным является направление по химическому синтезу тех или иных индивидуальных растительных компонентов с известной биологической активностью. Зная химическую структуру природных соединений ученые научились не только выделять индивидуальные компоненты из растений, но и синтезировать их. В то же время синтетическая химия позволяет не только синтезировать известные молекулы, но и экспериментировать с различными модификациями этих молекул с целью создания на базе природных соединений новых молекул с заданными фармакологическими свойствами. Кроме того, на современном этапе развития человечества требуется научный подход к лечению лекарственными растениями с учетом знаний о действующих веществах этих растений и их фармакологических эффектах.

Детальное изучение механизмов водно-солевого обмена привело к совершенствованию методов клинического исследования функции почек и поиску новых веществ, влияющих на клубочковую фильтрацию, реабсорбцию электролитов и воды, образование и экскрецию мочи, поскольку современные диуретики пока не отвечают всем требованиям к этой группе лекарственных средств [60].

На сегодняшний день применение в клинической практике находят фитопрепараты, обладающие мочегонным действием. Группа растительных диуретиков включает в себя большое число растений разных семейств, но их отличает от современных диуретиков синтетического происхождения постепенное нарастание мочегонного действия и отсутствие потери электролитов. Многие из этих растений в своем составе содержат в большом количестве фенолгликозид арбутин. Известно, что арбутин обладает не только мочегонным, но и противовоспалительным, антиоксидантым, антимикробным свойствами, что дает ему преимущества перед синтетическими диуретиками. Общепринятым является мнение, что в организме арбутин гидролизуется до гидрохинона, который собственно и определяет фармакологические эффекты арбутинсодержащих растений. Однако арбутин в чистом виде изучался очень мало, в основном были изучены фармакологические эффекты арбутинсодержащих фитопрепаратов. В литературе нет достаточных сведений о том, какое влияние на реализацию лечебного действия растений оказывает арбутин, детально не изучены его фармакологические эффекты, нет экспериментальных подтверждений тому, что арбутин действует через высвобождение гидрохинона, поскольку на сегодняшний день подробные данные о фармакодинамике арбутина и гидрохинона отсутствуют.

Учитывая тот факт, что актуальной задачей современной фармакологической науки является поиск лекарственных веществ, влияющих на выделительную функцию почек, арбутин можно предложить в качестве лекарственного вещества. Однако для этого необходимы сведения о фармакодинамике и фармакокинетике арбутина. Кроме того, эти сведения помогли бы в дальнейшем разработать принципы синтеза новых лекарственных средств с мочегонной активностью на основе гликозидной структуры.

Цель исследования

Изучить особенности фармакодинамики арбутина и выявить связь его фармакологических эффектов с электронной структурой.

Задачи исследования

1. Изучить особенности пространственного и электронного строения молекулы арбутина и его синтетических производных, рассчитать термодинамические спектры их активности.

2. Исследовать и сравнить с синтезированными производными диуретическую и салурегическую активности арбутина в эксперименте на крысах. Оценить роль гидроксильной группы в структуре арбутина в обеспечении его диуретической и салуретической активности.

3. Выявить особенности фармакодинамики арбутина при энтеральном и парентеральном пути введения.

4. Оценить противовоспалительную активность гликозида арбутина и его агликона в эксперименте на крысах.

5. Изучить и сравнить антиоксидантную активность гликозида арбутина с его агликоном в экспериментах in vitro и in vivo.

6. Исследовать антимикробную активность арбутина и его агликона в отношении основных возбудителей инфекционных болезней мочевыводящих путей.

Научная новизна исследования. Впервые установлена взаимосвязь между фармакологической активностью и электронным строением арбутина. Показано, что ключевую роль в реализации мочегонного действия в молекуле арбутина играет гидроксильиая группировка в пара-положении бензольного кольца агликона и гликоновый сегмент молекулы.

Впервые комплексно изучены основные фармакологические эффекты арбутина.

Впервые изучены фармакодинамические особенности арбутина при различных путях введения в организм. Получены данные о различии фармакологической эффективности арбутина и гидрохинона при разных способах введения. Установлено, что при парентеральном применении, в отличие от энтерального, оба вещества не обладают мочегонной и противовоспалительной активностями.

Выявлена зависимость антиоксидантного эффекта арбутина и гидрохинона от концентрации в экспериментах in vitro и in vivo и диуретического действия от дозы в экспериментах in vivo.

Впервые методами квантовой химии была оценена антирадикальная активность арбутина и гидрохинона.

Научно-практическая значимость. Практическая значимость исследования заключается в экспериментальном доказательстве перорального применения арбутина как мочегонного средства при различных заболеваниях мочеполовой системы. Наряду с этим полученные данные о взаимосвязи между фармакологической активностью и электронным строением сформулированы опорные предпосылки для создания новой группы мочегонных препаратов с наличием фармакологических преимуществ (незначительные нарушения водно-солевого обмена, постепенное нарастание диуретического эффекта, наличие противовоспалительного и антимикробного действия) перед существующими современными мочегонными средствами.

Данная работа имеет теоретическое значение, поскольку позволяет повысить уровень знаний относительно мочегонного, противовоспалительного, антиоксидантного и антимикробного действия арбутина и гидрохинона, которые входят в состав многих лекарственных растений различных семейств, широко применяемых в терапевтической практике. Полученные данные несут информацию фундаментального характера, которая в будущем поможет объяснить некоторые механизмы биологической активности этих веществ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При энтеральном применении арбутин обладает выраженным мочегонным действием, сопровождающимся увеличением экскреции креатинина и калия и не является натрийуретиком. В реализацию диуретического действия арбутина существенный вклад вносят гидроксильная группировка в пара-положении бензольного кольца агликона и гликоновый сегмент молекулы.

2. При парентеральном применении арбутин не обладает диуретическим и противовоспалительным действием.

3. Антиоксидантная активность арбутина более выражена в почках крыс; агликона арбутина - в крови крыс. Действие на оксидантно-антиоксидантную систему арбутина и его агликона имеет схожую картину в живом организме и в пробирке.

4. Арбутин не обладает противомикробной активностью в отношении микроорганизмов, специфичных для инфекционных заболеваний мочевого тракта. Гидрохинон оказывает выраженное антибактериальное действие в отношении всех представленных штаммов грамотрицательных микроорганизмов.

Апробация материалов диссертации

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Проблемы развития фармацевтической науки и образования» (г.Томск, 2011г.), I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Ученые Урала и Сибири — развитию отечественной фармации: от синтеза до инновационных лекарственных средств» (г. Новосибирск, 2011 г.), I Всероссийском сибирском медико-биологическом конгрессе (г. Барнаул, 2011 г.), XIII научно-практической конференции «Молодежь - Барнаулу» (г. Барнаул, 2011 г.), ежегодной Всероссийской научно-практической конференции «Наука, образование, медицина» (Самара, 2011 г.), международном молодежном медицинском конгрессе "Санкт-Петербургские научные чтения - 2011" (Санкт-Петербург, 2011), на II итоговой конференции Научного общества молодых ученых и студентов (г. Барнаул, 2012 г.), на IX научно-практической конференции «Молодежь - Барнаулу» (г. Барнаул, 2012 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 5 - в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста, иллюстрирована 39 рисунками, 30 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 188 источников, из них 81 иностранных авторов.

ВЫВОДЫ

1. Ключевой группой в обеспечении мочегонной активности арбутина в его молекуле является гидроксильная группа в пара-положении агликона. Присутствие в структуре гликона обеспечивает больший, по сравнению с таковым чистого агликона фармакологический эффект. В активных центрах потенциального белка-мишени, ответственных за связывание с арбутином необходимо наличие в цепи глутаминовой и (или) аспарагиновой кислот, с которыми возможна достаточная прочность водородной связи, обеспечивающая значимый для фармакодинамики диуретика аффинитет.

2. Арбутин обладает выраженной мочегонной активностью, которая не зависит от повышения экскреции ионов натрия, при этом повышается клубочковая фильтрация. Реализация мочегонного действия арбутина через агликон сопровождается альтернативным неустановленным механизмом. При парентеральном введении арбутин и его агликон не обладает мочегонной активностью.

3. Противовоспалительная активность арбутина при энтеральном введении выше, чем у его агликона и проявляется во все фазы острого воспаления. При парентеральном введении оба вещества усиливают флогистическое действие каррагенина.

4. Прямой неферментный антиоксидантный эффект гидрохинона значительно выше, чем у арбутина. При этом изменения активности процессов свободно-радикального окисления у гидрохинона больше выражено в крови, а при действии арбутина в почках. Сравнительный анализ показателей оксидантно-антиоксидантной системы в экспериментах in vivo и in vitro позволяет предполагать схожий механизм действия изучаемых веществ в пробирке и в живом организме.

5. Арбутин не обладает противомикробной активностью в отношении изученных штаммов Е. coli, Proteus mirabilis и Klebsiela pneumoniae Его действие на микроорганизмы реализуется при гидролизе, и в зависимости от условий может быть прямо противоположным: от антибактериального, за счет выделения гидрохинона, до способствующего росту бактерий, за счет выделения глюкозы. Гидрохинон оказывает выраженное антибактериальное действие в отношении всех представленных штаммов грамотрицательных микроорганизмов.

Практические рекомендации и предложения для создания новой группы мочегонных средств на основе феногликозидов

1. При проектировании диуретика, имеющего фенолгликозидную структуру в агликоновой части молекулы, представляющей собой гидрофобное бензольное кольцо, в пара-положении следует поместить полярную ключевую группу из набора высокоактивных, способных образовывать прочные водородные связи в водной среде.

2. Следует учесть существенный вклад гликоновой части молекулы гликозида в реализацию мочегонного эффекта и рассматривать ее как фармакодинамически значимый сегмент, наряду с обеспечением высокой растворимости вещества.

3. Наряду с разработкой высокоактивного не токсичного соединения, обладающего необходимыми фармакологическими характеристиками, целесообразно учитывать возможность создания мочегонного средства для внутреннего применения на основе арбутина в лечении заболеваний мочевыделительной системы.