Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Фармакологическая регуляция функционирования прогениторных клеток при экспериментальном сахарном диабете

На правах рукописи

ЕРМАКОВА НАТАЛИЯ НИКОЛАЕВНА

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология 14.00.16- патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск -2009

003463459

Работа выполнена в учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте фармакологии Сибирского отделения РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ

ДЫГАИ

Александр Михайлович

доктор медицинских наук профессор

ЖДАНОВ Вадим Вадимович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, ВЕНГЕРОВСКИЙ

заслуженный работник высшей школы РФ Александр Исаакович

доктор медицинских наук ВЕЛЬСКАЯ

Наталья Витальевна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО "Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию"

Защита состоится "_"_ 2009 г. в _ часов на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при НИИ фармакологии СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ фармакологии СО РАМН

Автореферат разослан "_"_2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, —

доктор биологических наук <С/ Амосова E.H.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последнее время отмечается рост числа эндокринных заболеваний, особенно сахарного диабета (СД), который считается болезнью века [Zimmet P.Z. et al., 1997; Ефимов A.C., Скробонская H.A., 1998]. СД занимает третье место в мире по распространенности после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний [Adeghate Е et al., 2006; Хавинсон В.Х. и др., 2007]. Актуальность изучения механизмов развития СД и разработки эффективных способов его лечения определяется как исключительно быстрым ростом заболеваемости, так и высокой степенью инвапиди-зации больных. По современным представлениям, повышенный уровень глюкозы в крови является ведущим фактором, лежащим в основе многообразных биохимических и структурных изменений в клетках и тканях [Thompson C.J. et al, 1996; Stratton I.M. et al, 2000; Атаманов B.M., 2003].

Несмотря на внедрение современных технологий в практику терапии СД, вопросы компенсации нарушений углеводного обмена и предупреждения развития осложнений диабета остаются актуальными. К сожалению, применение стандартных схем инсулинотерапии СД может приводить к тяжелым гипогликемическим реакциям. Именно этим объясняется стремление разработать такие методы лечения СД, которые предполагали бы реализацию целевых установок по компенсации углеводного и липидного обменов без риска развития гипогликемии [Аметов A.C., 2005].

Полученные в последние годы сведения о свойствах и закономерностях жизнедеятельности мультипотентных клеток-предшественников дали толчок к развитию нового направления в медицине - клеточной терапии [Сухих Г.Т. и др., 2002; In't Anker P.S. et al., 2003]. Клеточная терапия представляет собой совокупность методик, направленных на стимуляцию восстановления функционально активной ткани на месте повреждения за счет активации и использования регенераторного потенциала различных типов стволовых клеток (CK). К настоящему времени получены данные о наличии во многих тканях взрослого организма наряду с регионарными (тканеспецифическими прекурсорами) полипотентных клеток-предшественников, таких как мезенхималь-ные CK (МСК) [Orlic D. et al., 2001; Сухих Г.Т. и др., 2002; In't Anker P.S. et al., 2003].

Показано, что клетки костного мозга in vitro и in vivo могут дифференцироваться с образованием клеток эндокринной части поджелудочной железы [Ianus A. et al., 2003; Jahr H., Bretzel R.G., 2003], a также индуцировать регенерацию островков Лангерганса у мышей со стрептозотоциновым СД [Hess D. et al., 2003; Ianus A. et al., 2003]. В ряде исследований in vitro было установлено, что МСК обладают способностью к трансдифференцировке в инсу-линпродуцирующие клетки [Jiang Y. et al., 2002; Chen L.B. et al., 2004; Moris-cot С. et al., 2005; Timper К. et al., 2006]. Обнаружено, что клетки мононукле-арной фракции костного мозга могут мигрировать в ткань поджелудочной железы в ответ на её повреждение и стимулировать неоангиогенез, тем самым, запуская процессы регенерации пула ß-клеток [Hess D. et al., 2003; Mathews V. et al., 2004].

В связи с этим одним из наиболее перспективных направлений развития клеточной терапии представляется мобилизация эндогенных СК с их последующей миграцией и хомингом в пораженные ткани с помощью фармакологических агентов. По данным литературы, наиболее мощным стимулятором мобилизации регенераторно-компетентных клеток считается грануло-цитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) [Di Campli С. et al., 2004; Yannaki E. et al., 2005; Гольдберг Е.Д. и др., 2007; Жданов В.В. и др., 2007]. В то же время известно, что сверхмапые дозы антител к эндогенным регуляторам физиологических функций способны оказывать эффект, аналогичный тому, который осуществляют данные биологически активные вещества in vivo [Эпштейн О.И. и др., 2005; Эпштейн О.И., 2008].

С указанных позиций несомненный теоретический и практический интерес представляет изучение возможности стимуляции функций различных классов эндогенных СК с помощью препаратов на основе Г-КСФ и сверхмалых доз антител к Г-КСФ (СМД антител к Г-КСФ) при СД. Полученные в этом направлении данные позволили бы разработать принципиально новый патогенетически обоснованный способ активации процессов регенерации поджелудочной железы в условиях инсулярной недостаточности.

Цель исследования. Изучить состояние различных пулов регенераторно-компетентных клеток, изменений в системе крови и механизмов, лежащих в их основе, на модели аллоксанового диабета, оценить эффективность его терапии путем фармакологической модуляции функций прогени-торных клеток.

Задачи исследования:

1. Исследовать роль мезенхимальных и тканеспецифических предшественников различных классов в процессах регенерации поджелудочной железы на модели сахарного диабета;

2. Оценить влияние препаратов Г-КСФ и СМД антител к Г-КСФ на динамику течения экспериментального сахарного диабета и вскрыть механизмы, лежащие в его основе;

3. Исследовать действие препаратов Г-КСФ и СМД антител к Г-КСФ на мезенхимальные и регионарные клетки-предшественники различной степени зрелости в условиях экспериментального сахарного диабета;

4. Изучить изменения в системе крови и механизмы, лежащие в их основе, у животных с экспериментальным сахарным диабетом;

5. Оценить влияние препаратов Г-КСФ и СМД антител к Г-КСФ на систему крови животных с экспериментальным сахарным диабетом.

Научная новизна. В работе впервые всесторонне изученБ состояние различных пулов мезенхимальных клеток-предшественников в костном мозге и периферической крови, а также динамика содержания тканеспецифических и стромальных клеток-предшественников в поджелудочной железе при экспериментальном сахарном диабете. Установлено, что мезенхимальные перкурсоры участвуют в процессах регенерации поджелудочной железы при ее повреждении токсическим агентом - аплоксаном. Однако полученные ре-

зультаты свидетельствуют о недостаточности, либо несостоятельности указанных механизмов для восстановления инсулинпродуцирующей ткани.

Выполненные исследования позволили детально оценить изменения в кроветворной ткани при аллоксановом сахарном диабете и механизмы, лежащие в основе компенсаторных реакций со стороны системы крови.

В эксперименте на модели аплоксанового диабета изучены репаратив-ные свойства препаратов Г-КСФ и СМД антител к Г-КСФ, показана их высокая антисклеротическая и противовоспалительная активность. Установлено, что регенеративное действие обоих препаратов связано со стимуляцией функциональной активности прогениторных клеток различных классов, мобилизацией, миграцией и детерминированным хомингом их в пораженную поджелудочную железу.

Практическая значимость. Полученные результаты позволили разработать патогенетически обоснованные методы терапии сахарного диабета, основанные на восстановлении эндокринной части поджелудочной железы за счет фармакологической модуляции функций эндогенных стволовых клеток. Кроме того, в работе намечены возможные пути коррекции изменений в системе крови, развивающихся при СД. По материалам работы подготовлены отчеты о специфической активности указанных препаратов для получения разрешения на клинические исследования. Получены патенты (RU) № 2308281 от 20.10.2007 г. «Способ клонирования in vitro регионарных стволовых клеток поджелудочной железы» и № 2313361 от 27.12.2007 г. «Средство, обладающее антидиабетической активностью».

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на ежегодной Всероссийской конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (Москва, 2006), конференции молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2007), конференции «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007), на III съезде фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007), на международном конгрессе «EUROMEDICA-HANNOVER-2008» (Германия, Ганновер, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 2 - в реферируемых журналах, рекомендуемых перечнем ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 196 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 18 рисунками и 37 таблицами. Библиографический указатель включает 327 источников, в том числе 92 отечественных и 235 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментах использованы 600 мышей линии CBA/CaLac (330 самцов и 270 самок) в возрасте 2 - 2,5 месяцев, массой 18 - 20 г. Животные 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из питомника НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется). Перед началом экспе-

римгнта и в период исследования животные выдерживались на обычном пищевом режиме по 15-20 особей в пластиковых клетках в виварии при температуре воздуха 20-22°С. Опыты проводили в осенне-зимний период (для исключения сезонных колебаний), забор материала осуществляли в утренние часы.

Сахарный диабет вызывали введением одноводного аллоксана по следующей схеме: 1 раз в сутки подкожно в течение 4-х дней по 300 мг/кг в 0,2 мл физиологического раствора. Исследуемыми препаратами являлись: сверхмалые дозы потенцированных антител к гранулоцитарному колоние-стимулирующему фактору (СМД антител к Г-КСФ) в разведении C12+C30+C200 (ООО НПФ «Материа Медика Холдинг», г. Москва совместно с НИИ фармакологии СО РАМН) и препарат гранулоцитарного колоние-стимулирующего фактора (Г-КСФ) «Нейтростим» (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», г. Новосибирск совместно с НИИ фармакологии СО РАМН). Препарат СМД антител к Г-КСФ вводили, начиная с первого дня после начала введения аллоксана в течение всего эксперимента по 0,2 мл per os 1 раз в день. Контрольным животным (контрольная группа №1) по той же схеме в эквивалентном объеме вводили дистиллированную воду. Г-КСФ вводили подкожно в дозе 100 мг/кг в 0,2 мл физиологического раствора, начиная со следующего дня после 4-го введения аллоксана 1 раз в сутки в течение 5-ти дней. Контрольным животным по той же схеме в эквивалентном объеме вводили физиологический раствор (контрольная группа №2). Поскольку статистически значимых различий по изучаемым показателям между контрольными группами 1 и 2 зарегистрировано не было, эти данные были объединены в одну группу - общий усредненный контроль. В качестве фона использовали ин-тактных животных.

Для морфологического исследования выделяли часть поджелудочной железы, прилежащую к селезенке. На гистологических срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, определяли площадь 10 последовательных островков Лангерганса методом графического компьютерного анализа (микрофотографии, выполнены микровидеокамерой "Digital micro", с программой передачи изображения фирмы «Элекард», Томск) и подсчитывали в них общее количество клеток, число пикнотизированных клеточных элементов и вычисляли количество клеток на единицу площади островка и процент пикнотизированных элементов.

Содержание инсулина в сыворотке крови изучали методом иммуно-ферментного анализа с помощью набора фирмы Monobind Inc (США) согласно прилагаемой инструкции. Содержание глюкозы определяли с помощью глюкометра "Optilite" (Венгрия) согласно прилагаемой инструкции. Оценку показателей периферического звена системы эритрона осуществляли с помощью автоматического гематологического анализатора ABACUS, в ветеринарном режиме. Изучение количества различных форм лейкоцитов в периферической крови и показатели костномозгового кроветворения определяли стандартными гематологическими методами [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Содержание коммутированных клеток-предшественников эритропоэза (КОЕ-Э, КпОЕ-Э) и грануломоноцитопоэза (КОЕ-ГМ, КпОЕ-ГМ) в костном мозге

изучали in vitro методом клонирования миелокариоцитов в полувязкой куль-туральной среде [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Интенсивность созревания эритроидных и гранулоцито-макрофагальных прекурсоров определяли по величине индекса созревания (отношение числа кластеров к количеству колоний, выросших в той же лунке). Исследование пролиферативной активности предшественников эритро- и грануломоноцитопоэза производили с помощью метода «клеточного самоубийства» путем поглощения гидроксимочевины в культуре ткани [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Эритропоэтическую (ЭПА) и ко-лониестимулирующую (КСА) активности тестировали микрометодом в 96-луночных планшетах ("Corning", США) на неприлипающих клетках костного мозга, взятых от интактных мышей. ЭПА и КСА выражали количеством выросших эритроидных и гранулоцито-макрофагальных колоний (на 105 миелокариоцитов) [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Структурно-функциональную организацию костного мозга исследовали путем ферментативного выделения гемопоэтических островков (ГО) и последующей оценки их количественного и качественного состава [Crocker P.R., Gordon S., 1985; Гольдберг Е.Д. и др., 1992].

Определение способности адгезирукнцих. клеток костного мозга к связыванию стромальных предшественников (КОЕ-Ф) проводили путем их пре-инкубации с взвесью клеток костного мозга от интактной мыши. Подсчитывали число колоний, образованных клетками после совместного культивирования, и содержание КОЕ-Ф в исходной клеточной взвеси, полученной из костного мозга интактной мыши. По разности двух указанных показателей судили о способности адгезирующей фракции костного мозга опытных мышей к связыванию интактных КОЕ-Ф.

Содержание регионарных клеток-предшественников в поджелудочной железе исследовали с помощью метода клонирования клеточного материала в собственной модификации [Гольдберг Е.Д. и др., 2006]. Количество мезен-химальных стволовых клеток в костном мозге и периферической крови определяли с помощью метода лимитирующих разведений при длительном культивировании клеточного материала в собственной модификации [Гольдберг Е.Д. и др., 2006].

Статистическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере с использованием пакета статистических программ «Statistics 6.0».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Применение аллоксана приводило к гибели части животных, наблюдаемой во всех группах после второго введения токсического агента. Однако если в контрольной группе к концу эксперимента погибло 26,67% мышей, то в группах животных, получавших дополнительно препараты СМД антител к Г-КСФ и Г-КСФ, лишь 10,23% и 13,33% соответственно.

Процент прироста массы тела животных служит показателем интегрального действия токсического агента на организм. В данном исследовании этот показатель у мышей контрольной группы был достоверно ниже фоново-

го во все сроки наблюдения, а у животных, получавших СМД антител к Г-КСФ, не отличался от исходных значений и достоверно превышал показатели контроля в ходе всего эксперимента. У животных, которым вводили препарат Г-КСФ, процент прироста массы тела отличался от значений, полученных у здоровых животных, на 11, 15 и 21 сутки, но при этом оставался достоверно выше показателей контрольной группы.

Биохимические исследования крови экспериментальных животных выявили закономерное повышение содержания глюкозы и значительное снижение уровня инсулина под действием аллоксана. Начиная с 21 суток эксперимента у мышей, получавших дополнительно СМД антител к Г-КСФ, и с 15 суток - у животных, получавших препарат Г-КСФ, наблюдали достоверное снижение уровня глюкозы по отношению к контрольной группе, а на 40 сутки данный показатель в обеих опытных группах не отличался от такового у интактных животных. У опытных животных не наблюдали снижения содержания инсулина в сыворотке крови. Напротив, данный показатель превышал значения такового у интактных мышей в отдельные сроки исследования (особенно, на 15 сутки при лечении Г-КСФ), а к окончанию эксперимента не выходил за пределы фоновых значений в обеих опытных группах (рис. 1).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что снижение уровня глюкозы в периферической крови опытных животных обеих групп непосредственным образом связано с увеличением концентрации инсулина и объясняется его специфическим влиянием на углеводный обмен [МайИае1 Б. е1 а1., 1991; МайЬае1 Б., Сгйеп Н„ 1991; МаШше1 Б. е1 а!., 1992; Когка и., Но1тап в.Б., 1993; МайЬае1 Б. е1 а1., 1993]. Поэтому дальнейшие наши исследования были направлены на вскрытие механизмов нормализации секреции инсулина и утилизации глюкозы под действием изучаемых препаратов.

При исследовании морфологии поджелудочной железы было обнаружено увеличение содержания пикнотизированных клеток в островках Лан-герганса во всех группах на 8 - 28 сутки опыта (рис. 1). У животных, получавших СМД антител к Г-КСФ (на 8, 11 сутки) и Г-КСФ (на 11 сутки), данный показатель был достоверно ниже такового у контрольных животных, что указывает на предотвращение гибели клеток эндокринного аппарата поджелудочной железы. Количество клеток на единицу площади островка в контрольной группе не изменялось в течение 21 суток наблюдения по сравнению с фоном, что связано с развитием в островках умеренной клеточной инфильтрации (преимущественно макрофагами и лимфоцитами). На 28 сутки эксперимента инфильтрация в островках снизилась, поэтому уменьшилась и клеточность островков поджелудочной железы. На 40 сутки отмечалось появление фибробластов и за их счет - восстановление клеточности островков Лангерганса. Кроме того, с 21 суток эксперимента у контрольных животных наблюдали склеротические изменения эндокринного аппарата железы (рис. 1). При введении исследуемых препаратов на фоне СД отмечалась инфильтрация островков, но менее значительная в сравнении с контрольной группой животных. Так на 11, 21 сутки клеточность островков в опытных группах была достоверно ниже, чем в контроле, что дает возможность говорить о

противовоспалительном эффекте данных препаратов. Действительно, У. АёасЫ с соавторами было показано, что применение Г-КСФ способствует миграции СК в поврежденную ткань, но при этом не стимулирует накопление клеток воспалительного инфильтрата (лимфоцитов и макрофагов) [Ас1а-сЫ У. ег а!., 2004].

На фоне введения исследуемых препаратов имело место также уменьшение формирования соединительной ткани в островках Лангерганса поджелудочной железы животных по сравнению с контролем, что свидетельствует об антисклеротических свойствах обоих изучаемых средств.

цМЕ/мл

% пиксель * 10!

20 В 12 Г

18 1 16 -14 1 12 10 8 -6 -

В

фон 8 и 15 21 28 40 фон 8 11 15 2 1 28 40

Рисунок 1. Динамика содержания глюкозы (А) и инсулина (Б) в сыворотке крови, пикно-тизированных. клеток в островке Лангерганса (В) и клеток на площадь островка (Г) у мышей линии СВА/СаЬас после введения им аллоксана. аллоксана и СМД антител к Г-КСФ, либо аллоксана и Г-КСФ. По оси абсцисс - сроки исследования (сутки); по оси ординат величина исследуемого показателя. Доверительные интервалы при р<0,05

Таким образом, полученные данные позволяют говорить о наличии у препаратов Г-КСФ и СМД антител к Г-КСФ антидиабетического действия. Оба средства стимулировали процессы восстановления поврежденного ал-локсаном инсулярного аппарата поджелудочной железы и соответственно процессов утилизации глюкозы.

С целью выявления механизмов регенераторного действия исследуемых препаратов проведена серия экспериментов, в которых изучали состояние костномозговых, циркулирующих и регионарных СК.

При изучении состояния различных пулов СК у животных контрольной группы, получавших только аллоксан, было обнаружено увеличение количе-

ммоль/л

20 А

18 т 16

14 ]

12 -I 10 -8 4 6 4 2 0

□ аллоксан

антител к Г-КСФ

ства КОЕ-Ф в костномозговой ткани на 8, 11 и 15 сутки исследования (рис. 2). Среди этих клеток, как известно, содержатся как предшественники стро-мальных элементов, так и истинные МСК [Owen М., Friedenstein A.J., 1988], что подтверждалось возрастанием и числа мезенхимальных стволовых клеток в гемопоэтической ткани до 160% от фона на 8 сутки. Кроме того, в периферической крови на 21 сутки опыта отмечалось снижение содержания клеток-предшественников фибробластов, а число МСК на 8 сутки практически не отличалось от такового у здоровых животных. Выход КОЕ-Ф в кровь снижался, вероятно, в связи с усилением способности клеточных компонентов микроокружения костного мозга связывать CK. Исследование содержания регионарных клеток-предшественников в поджелудочной железе выявило достоверное снижение их числа на протяжении всего опыта. Вместе с тем, отмечали статистически значимое увеличение содержания КОЕ-Ф в поджелудочной железе на 15 и 21 сутки от начала эксперимента (рис. 2), что может быть обусловлено как усилением миграции мезенхимальных прекурсоров в поджелудочную железу в условиях аплоксанового диабета, так и ускорением пролиферации резидентных стромальных предшественников [Hess D. et al., 2003; Mathews V. et al., 2004]. Полученные результаты свидетельствуют об активации «глубокого резерва» механизмов компенсации (костномозговых стволовых клеток) при интоксикации аллоксаном, которые являются по своей сути неспецифическими, поскольку наблюдаются и на других моделях патологических процессов [Зюзьков Г.Н. и др., 2005; Сотникова Н.В. и др., 2005; Ставрова Л.А. и др., 2005] и представляют собой, по-видимому, проявление универсальной, генетически запрограммированной реакции организма на повреждение. В данном случае они оказываются недостаточными и/или несостоятельными для восстановления ткани поджелудочной железы. Рост же КОЕ-Ф в поджелудочной железе, возможно, и приводит к развитию склеротических изменений в эндокринном аппарате.

Исследование механизмов стимуляции регенерации эндокринной части поджелудочной железы с помощью СМД антител к Г-КСФ показало, что изучаемый препарат вызывал накопление в костном мозге большего по сравнению с контролем количества МСК на 8 сутки наблюдения, с дальнейшим более выраженным выходом в периферическую кровь МСК (до 325% от фона) и КОЕ-Ф. При этом содержание КОЕ-Ф в костном мозге не отличалось от показателей фона и на 8, 15 сутки достоверно не достигало значений контрольной группы (рис. 2). Указанные сдвиги в состоянии предшественников костного мозга и периферической крови, характерные для мобилизации МСК и КОЕ-Ф, сопровождались их миграцией и хомингом в ткань поджелудочной железы, о чем свидетельствует выраженное увеличение здесь количества КОЕ-Ф на 15 и 21 сутки (рис. 2). Количество регионарных клеток-предшественников на 21 сутки опыта достоверно превышало показатель контрольной группы, что также может быть связано с дифференцировкой МСК в инсулинпродуцирующие клетки под влиянием специфического микроокружения [Chen L.B. et al., 2004; Moriscot С. et al., 2005; Timper K. et al., 2006].

Препарат Г-КСФ оказывал во многом схожее с СМД антител к Г-КСФ влияние на динамику содержания мезенхимальных предшественников в костном мозге. При его назначении отмечалось увеличение числа КОЕ-Ф в костном мозге на 11 и 15 сутки эксперимента относительно фоновых значений, более выраженное, нежели у мышей, которым вводили СМД антител к Г-КСФ. В то же время, на 21 сутки содержание КОЕ-Ф в костном мозге достоверно снижалось по отношению и к фону и к контролю (рис. 2). Однако содержание МСК в крови превысило таковое в группе здоровых мышей. Количество КОЕ-Ф в периферической крови превысило не только фоновые значения, но и контрольные (8 сутки опыта), а затем не отличалось от групп сравнения, что, возможно, обусловлено режимом введения препарата.

на2,5*103 миелокариоцитов на 2.5* 103 мононуклеаров

□аллоксан

1° " Шаллоксан+СМД антител к Г-КСФ

о

. фен 8 Н 15 21

10' нуклеаров

12 ■

Г

фон S II 15 21 фон 8 II 15 21

Рисунок 2. Динамика содержания КОЕ-Ф в костном мозге (А), периферической крови (Б) и поджелудочной железе (Г), клеток-предшественников поджелудочной железы (В) в поджелудочной железе у мышей линии CBA/CaLac после введения им аллоксана, аллок-сана и СМД антител к Г-КСФ, либо аллоксана и Г-КСФ. По оси абсцисс - сроки исследования (сутки); по оси ординат величина исследуемого показателя. Доверительные интервалы при р<0,05.

Описанная картина соответствует мобилизации клеток-предшественников из костного мозга в периферическую кровь под действием Г-КСФ. Известно, что данный цитокин приводит к активации и повышенной продукции нейтрофилами ИЛ-8, который, в свою очередь, вызывает деграну-ляцию нейтрофилов и высвобождение из них различных энзимов, в том числе матриксных металлопротеиназ, эластазы, катепсина G [Jilma В. et. al., 2000; Chakraharti S., Pate! K.D., 2005; Domanovic D. et. al., 2005], что приводит

фон 8

на 10^ нуклеаров 18 - т

16 -14 J 12 10 8 6 4 2 0

к деградации и/или инактивации молекул адгезии (VCAM-1/VLA-4), хемоки-нов (SDF-1/CXCR-4), растворимой фракции KIT-лиганда и др., тем самым нарушая контакт между гемопоэтическими СК и костно-мозговым микроокружением. СК, таким образом, получают возможность беспрепятственной миграции из КМ через эндотелиапьный барьер в периферическую кровь [Thomas J. et. al., 2002; Robinson S.N. et. al., 2003]. В ткани поджелудочной железы животных, леченых Г-КСФ, отмечалось снижение количества регионарных клеток-предшественников (как и у мышей, получавших аллоксан) по сравнению со здоровыми животными, однако на 11 сутки величина данного показателя достоверно превысила таксвую у контрольных мышей. При этом на 15 сутки в поджелудочной железе резко увеличивалось содержание КОЕ-Ф. Таким образом, препарат Г-КСФ вызывал мобилизацию МСК костного мозга, их миграцию и хоминг в поврежденную ткань поджелудочной железы, что явилось основой развития процессов её регенерации.

В целом, исходя из полученных результатов, можно сделать вывод о том, что оба препарата оказывали стимулирующее влияние на СК костного мозга. При этом СМД антител к Г-КСФ вызывал более выраженную мобилизацию прогениторных клеток в периферическую кровь, но Г-КСФ эффективнее повышал их содержание в поджелудочной железе. Сходный характер кинетики родоначальных клеток при введении двух исследуемых препаратов объясняется видимо тем, что, по современным представлениям, антитела к эндогенным регуляторам функций не блокируют активность тех молекул, к которым они получены, а стимулируют их продукцию [Эпштейн О.И. и др., 2005; Эпштейн О.И., 2008]. Можно предположить, что под действием СМД антител к Г-КСФ активируется выработка эндогенного гемопоэтина, но для этого требуется время. Поэтому действие препарата антител проявляется позднее, чем эффект «готового» препарата Г-КСФ.

Известно, что аллоксан не является избирательным токсическим агентом. С одной стороны, прооксидантный механизм его действия заставляет предполагать, что эффект аллоксана не ограничивается угнетением функционирования инсулинпродуцирующих клеток. С другой стороны, дефицит инсулина, лежащий в основе развития экспериментального сахарного диабета, может явиться причиной вторичного нарушения регуляции и метаболизма различных тканей [Новицкий В.В. и др., 1997; Зайчик A.M., Чурилов J1.B., 2007; Мкртумян А.М., 2008]. В связи с этим мы предприняли исследование, направленное на изучение изменений, развивающихся в системе крови экспериментальных животных в условиях аллоксанового сахарного диабета.

Введение аллоксана приводило к выраженному угнетению всех ростков гемопоэза. Кратковременная активация грануломоноцитопоэза сменялась уменьшением числа незрелых (11, 15, 21 сутки) и зрелых (11 сутки) форм нейтрофильных гранулоцитов, эозинофильных гранулоцитов (11 и 15 сутки), лимфоидных клеток (11 и 15 сутки) и эритрокариоцитов (11, 15 и 21 сутки) в костном мозге (рис. 3). Содержание моноцитарно-макрофагальных элементов колебалось в пределах 7,41% - 88,89% от интактного контроля на протяжении всего периода наблюдения.

Депрессия костномозгового кроветворения сопровождалась изменениями содержания зрелых элементов в периферической крови. На 15 сутки отмечали достоверное увеличение ОКЛ до 155,31% от исходного за счет подъема содержания сегментоядерных нейтрофильных гранулоцитов и лимфоцитов до 149,30% и 172,50% соответственно (рис. 3), что связано, видимо, с их выходом в периферическую кровь. Повышение содержания нейтрофильных лейкоцитов в периферической крови при СД объясняют, как правило, неспецифическими инфекционно-воспалительными процессами, которые провоцируют развитие у больных нейтрофильного лейкоцитоза [Новицкий В.В. и др., 1997]. Развитию лейкоцитоза при СД может способствовать также нарушение эмиграции лейкоцитов в ткани, что увеличивает время их циркуляции в кровеносном русле. Количество лимфоцитов в крови больных часто варьирует, что обусловлено выраженной способностью этих клеток мигрировать из лимфоидных органов в кровь и обратно. Развитие лимфоцитоза при СД может быть обусловлено стимуляцией периферического лимфоцитопоэза и образования короткоживущих лимфоцитов. Кроме того, в условиях инсу-лярной недостаточности происходит изменение качественного состава лимфоцитов, характеризующееся повышением количества их неактивных форм [Кураева Т.Д., 2003]. Снижение количества моноцитов в периферической крови связывают с выраженным торможением скорости их обновления вследствие угнетения моноцитопоэза в костном мозге [Новицкий В.В. и др., 1997].

На протяжении всего эксперимента отмечалось достоверное увеличение содержания ретикулоцитов в крови, достигавшее максимума на 15-е сутки (208% от фона) (рис. 3). Наши результаты согласуются с данными литературы о том, что при СД в периферическую кровь выходят в повышенном количестве незрелые формы эритроцитов (ретикулоциты) [\Vaugh К.Е. й а1., 2001; Коигу МЛ. а!., 2005].Содержания эритроцитов достоверно не изменялось. Качественный анализ форменных элементов показал незначительное увеличение среднего объема зрелых клеток красной крови на 21 сутки опыта, вероятно, являющееся следствием поступления большого количества молодых форм эритроцитов в кровь [Захаров Ю.М., Рассохин А.Г., 2002]. Также отмечалось снижение уровня гемоглобина (на 11 и 15 сутки) и средней корпускулярной концентрации гемоглобина (на 11, 15 и 21 сутки), по-видимому, связанное с тем, что большую часть гематокрита составляли эритроциты, образование которых происходило в условиях несбалансированного гемопоэза. При этом достаточно низкая активность гемоглобинсинтетических процессов сочеталась с относительно высокой скоростью созревания эритроидных прекурсоров. Показано, что у больных с неосложненным СД содержание эритроцитов существенно не отличается от нормы, а увеличение среднего объема эритроцитов предполагает возможную патологию мембран клеток [Новицкий В.В. и др., 1997].

Паллоксан

А 0аялоксак+СМД антител к Г-КСФ 18 Б

фон 8 II 15 21 фон 8 II 15 21

фон 8 и 15 21 фон 8 11 15 21

Рисунок 3. Динамика общего количества миелокариоцитов (А), содержания незрелых (В) форм нейтрофильных гранулоцитов и эритроидных клеток (Д) в костном мозге, общего количества лейкоцитов (Б), содержания сегментоядерных (Г) форм нейтрофильных гранулоцитов и ретикулоцитов (Е) в периферической крови у мышей линии СВА/СаЬас после введения им аллоксана, аллоксана и СМД антител к Г-КСФ, либо аллоксана и Г-КСФ. По оси абсцисс - сроки исследования (сутки); по оси ординат - по оси ординат величина исследуемого показателя Доверительные интервалы при р<0,05

Снижение содержания гемоглобина объясняют, кроме того, особенностью использованной модели, связанной с гемолитическими свойствами аллоксана [\Vatala С., 1огш1ак Т., 1992]. Нами отмечалось повышение степени анизоцитоза эритроцитов на протяжении эксперимента, что также свидетельствует о нарушении процессов созревания эритроцитов и увеличении содержания молодых и незрелых форм эритроцитов [Стародубцева М.Н. и др., 2008]. Наблюдаемые изменения соответствуют картине эритропоэза при СД

по данным других исследователей [Випп НЛ\ ег а1., 1997; Новицкий В.В. и др., 1997; ЬауШе М.,2002].

У мышей, получавших дополнительно препарат СМД антител к Г-КСФ, динамика показателей костномозгового кроветворения носила в целом такой же характер, как и у нелеченых животных. Изменения ОКК и клеточ-ности отдельных ростков кроветворения отличались от контроля главным образом отсутствием подъема на 8 сутки и увеличением содержания нуклеа-ров на 11 сутки эксперимента.

Введение СМД антител к Г-КСФ приводило к отмене роста ОКЛ в основном за счет уменьшения содержания в крови сегментоядерных нейтро-фильных гранулоцитов (рис. 3). На 21 сутки наблюдали рост числа тромбоцитов до. 134,03% по сравнению с фоном. Количество ретикулоцитов достоверно превосходило контрольный уровень на 11 и 15 сутки, а на 8 и 21 сутки исследования было ниже контрольного значения (рис. 3). Использование СМД антител к Г-КСФ при СД приводило также к снижению в периферической крови числа эритроцитов и содержания гемоглобина, причем эти показатели на 8 сутки были достоверно ниже таковых у контрольных животных. Качественный анализ форменных элементов выявил увеличение размеров эритроцитов, что явилось закономерным отражением увеличения степени анизоцитоза. Отмечалось снижение средней корпускулярной концентрации гемоглобина на 11 сутки по сравнению с таковой у нелеченых мышей.

Картина костномозгового кроветворения у мышей, получавших на фоне аллоксана Г-КСФ, характеризовалась снижением ОКК по отношению к фону, а на 8 сутки - и по сравнению с контролем (рис. 3). Наблюдали падение количества нейтрофильных гранулоцитов и эритрокариоцитов (на 8 сутки), лимфоцитов (на 8, 11 сутки) (рис. 3). На 11, 15 сутки отмечалось увеличение содержания зрелых нейтрофильных гранулоцитов и на 15 сутки - лимфоид-ных клеток в костном мозге животных по отношению к таковым у нелеченых мышей. Однако восстановления показателей костномозгового кроветворения до исходных значений не регистрировалось.

Введение Г-КСФ животным с СД не влияло существенно на изменения у них ОКЛ, но при этом регистрировалось повышение уровня нейтрофильных лейкоцитов в крови на 15, 21 сутки (рис. 3). На 8 сутки количество моноцитов у опытных мышей достоверно превышало таковое в контроле. Наблюдали рост числа тромбоцитов в периферической крови на 11 и 15 сутки по сравнению с группой животных с нелеченой патологией поджелудочной железы.

Показатели красной крови изменялись над действием Г-КСФ незначительно, за исключением 11 суток, когда обнаруживалось достоверное увеличение содержания ретикулоцитов, гемоглобина и средней корпускулярной концентрации гемоглобина (рис. 3). Кроме того, лечение мышей Г-КСФ приводило к повышению степени анизоцитоза к окончанию наблюдения.

Описанная динамика содержания лейкоцитов, как в контрольной группе, так и у мышей, получавших исследуемые препараты, вероятно, была обусловлена в целом токсическим влиянием самого аллоксана на кроветворную

ткань и активизацией (особенно выраженной при дополнительном введении препаратов) перераспределительных реакций в системе крови. С этими процессами тесно связаны мобилизация и миграция мононуклеаров (фракции клеточных элементов, в состав которой входят стволовые клетки) [Pittenger M.F., Mackay А М., Beck S.C., 1999]. Как уже отмечалось, препараты СМД антител способны модулировать эффекты эндогенных регуляторов функций [Жданов В.В. и др., 2003; Эпштейн О.И. и др., 2005]. Видимо поэтому действие препарата СМД антител к Г-КСФ направленно на нормализацию показателей кроветворения, а не на их стимуляцию. Важнейшим же свойством Г-КСФ является быстрое, специфическое и дозозависимое увеличение количества нейтрофилов в крови, что объясняется уменьшением времени их созревания, увеличением числа клеточных делений и ускоренным выходом клеток в периферическую кровь [Kabutomori О. et al., 2002]. Вероятно, именно этими его свойствами объясняется увеличение содержания зрелых нейтрофилов в костном мозге и периферической крови. Что же касается активации других ростков кроветворения под действием гемопоэтина (в частности, эритроид-ного), то, по мнению D. Metealf, обусловленная Г-КСФ стимуляция эритро-поэза опосредована усилением выработки других регуляторных молекул добавочными клетками костного мозга. Аналогичные данные были получены в лаборатории патофизиологии НИИ фармакологии СО РАМН на модели ци-тостатической миелосупрессии [Гольдберг Е.Д. и др., 1999; Гольдберг Е.Д. и др., 2003; Гольдберг Е.Д. и др., 2005; Попова Н.О., 2005].

Таким образом, изучаемые препараты способствовали активации механизмов восстановления кроветворения, увеличивая скорость созревания и выход клеток в периферическое сосудистое русло.

По современным представлениям, различия изменений в системе крови под действием определенных факторов могут быть во многом обусловлены особенностями их влияния на функциональное состояние кроветворных предшественников, а также клеточных элементов системы локальной регуляции кроветворения. Роль такой локальной регуляторной системы выполняет комплекс клеточных, экстрацеллюлярных и гуморальных факторов, расположенных в непосредственной близости от гемопоэтических элементов и носящих название кроветворного, или гемопоэзиндуцирующего микроокружения (ГИМ) [Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В., 1999; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. и др., 2007]. В связи с этим нами была проведена серия экспериментов, в которой изучались состояние эритроидных и грану-лоцитарно-макрофагальных прекурсоров и локальные механизмы их контроля при СД и его терапии препаратами СМД антител к Г-КСФ и Г-КСФ.

Изучение колониеобразующей способности костного мозга мышей на фоне СД позволило выявить резкое увеличение содержания эритроидных прекурсоров в костном мозге на 11 сутки эксперимента (рис. 4). Угнетение гранулоцитарно-макрофагального колониеобразования было обнаружено на 8 и 21 сутки исследования. При этом не регистрировалось изменения темпов деления эритроидных прекурсоров. Рост же числа ДНК-синтезирующих КОЕ-ГМ наблюдался на 15 сутки опыта (до 205,24% по сравнению с фоном)

(рис. 4). Интенсивность дифференцировки грануломоноцитарных клеток-предшественников на 8 сутки исследования статистически достоверно снижалась, а на 15 сутки значение данного показателя, напротив, существенно возрастало. Индекс созревания эритроидных клеток-предшественников на 8, 11 и 15 сутки опыта был значительно выше такового в интактном контроле (рис. 4).

При использовании препарата СМД антител к Г-КСФ содержание клеток-предшественников в костном мозге носило волнообразный характер, при этом на 8 сутки число КОЕ-ГМ было достоверно ниже такового в контроле. Что касается КОЕ-Э, то их содержание на 11 сутки было достоверно ниже, чем у нелеченых животных (рис. 4). Выявленное в обоих случаях падение количества гемопоэтических предшественников может быть обусловлено резким ускорением их созревания в соответствующие сроки наблюдения. Исследование митотической активности прекурсоров гемопоэза при введении препарата СМД антител к Г-КСФ на фоне СД позволило установить возрастание доли КОЕ-ГМ в Б-фазе митотического цикла на 21 сутки и её снижение на 15 сутки по отношению к патологическому контролю . Темп деления эритроидных предшественников оказался выше такового у животных контрольной группы на 11 сутки. Интенсивность дифференцировки грануломоноцитарных клеток характеризовалась наличием периодов как увеличения (8 сутки), так и уменьшения величины данного показателя (15 сутки) по сравнению с группой патологического контроля. На 8 и 11 сутки отмечали рост индекса созревания эритроидных клеток-предшественников, а на 15 сутки данный показатель был достоверно ниже такового в группе сравнения (рис. 4).

Введение препарата Г-КСФ на фоне СД сопровождалось падением числа как эритроидных, гак и гранулоцитарных предшественников в костном мозге на 21 сутки по отношению к группе с нелеченой патологией островко-вого аппарата поджелудочной железы (рис. 4). Препарат Г-КСФ изменял темп деления гранулоцитарно-макрофагальных прекурсоров: число ДНК-синтезирующих КОЕ-ГМ возрастало на 8 сутки, когда оно превосходило значения контроля, а на 15 сутки напротив, не достигало их. Интенсивность дифференцировки гранулоцитарно-макрофагальных предшественников существенно не отличалась от контрольной. Индекс созревания эритроидных клеток-предшественников на 8 и 11 сутки достоверно превышал контроль, а на 15 сутки был достоверно ниже такового (рис. 4).

Ранее в опытах на мышах с аллоксановым диабетом показано, что хотя стволовые кроветворные клетки и чувствительны к инсулину, тем не менее, они могут быстро адаптироваться к его недостатку и к тем метаболическим нарушениям, которые свойственны диабету [Ростомова Л.Т., 1992; Тетерина В.И., 1997]. Поэтому дополнительное использование исследуемых нами препаратов в условиях аллоксанового диабета приводило к повышению интенсивности процессов деления и дифференцировки предшественников грану-лоцитарно-макрофагального и эритроидного ростка (в последнем случае видимо, опосредовано).

Указанные процессы сопровождались значительными изменениями структурно-функциональной организации костного мозга. Развитие СД приводило к увеличению количества ГО на 11 сутки исследования за счет увеличения формирования клеточных комплексов с центрально расположенным макрофагом (на 8, 11 сутки) и фибробластом (на 11 сутки). Анализ цито-грамм показал, что динамика содержания смешанных и гранулоцигарных ГО в целом повторяла таковую общего количества клеточных комплексов. На 21 сутки отмечали падение числа эритроидных ГО в костном мозге.

на 10г клеток 5 - □аплоксан

В аллоксан+СМД антител к Г-КСФ ■ аллоксан+Г-КСФ ,.

на 10' клеток

Рисунок 4. Динамика содержания эритроидных КОЕ (А) и гранулоцитарко-макрофагальных КОЕ (Б), изменения доли КОЕ-Э (В) и КОЕ-ГМ (Г), находящихся в 8-фазе митотического цикла и интенсивность созревания КОЕ-Э (Д) и КОЕ-ГМ (Е) в костном мозге мышей линии СВА/СаЬас после введения им аллоксана. аллоксана и СМД антител к Г-КСФ, либо аллоксана и Г-КСФ. По оси абсцисс - сроки исследования (сутки); по оси ординат величина исследуемого показателя. Доверительные интервалы при р<0,05.

Введение СМД антител к Г-КСФ на фоне СД не приводило к достоверным изменениям структурно-функциональной организации костного мозга по сравнению с нелечеными животными. А вот в случае использования препарата Г-КСФ отмечали достоверный рост числа ГО по сравнению контрольной группой за счет увеличения формирования макрофагпозитивных (11 и 15 сутки опыта) и макрофагнегативных клеточных комплексов (на 11 сутки). При этом на 8 и 21 сутки отмечали падение числа эритроидных ГО в костном мозге по сравнению с группой нелеченых животных.

При изучении роли гуморальных регуляторов в контроле процессов пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток установлено, что при сахарном диабете возрастала концентрация эритропоэтической активности (ЭПА) в супернатантах адгезирующих (11 и 15 сутки) и неадгезирующих (21 сутки) клеток ГИМ и сыворотке крови (во все сроки исследования) (рис. 5). Продукция колониестимулирующей активности (КСА) нуклеарами прилипающей и неприлипающей фракций ГИМ и уровень сывороточных факторов, составляющих КСА, также увеличивались на протяжении большей части эксперимента (рис. 5).

Препарат СМД антител не изменял уровень ЭПА в биологических средах по сравнению с группой контроля. Выработка КСА неприлипающими миелокариоцитами и способность сыворотки периферической крови стимулировать грануломоноцитарное колониеобразование значительно превосходили как исходные, так и контрольные значения (на 11, 15,21 сутки) (рис. 5).

При назначении препарата Г-КСФ, ЭПА адгезирующих клеток превосходила уровень контроля на 21 сутки, а вот способность сыворотки стимулировать эритропоэз на 15 сутки была достоверно ниже контрольной (рис. 5). Вместе с тем, выработка КСА прилипающими (21 сутки) и неприлипающими (на 11, 15 и 21 сутки) миелокариоцитами и способность сыворотки периферической крови стимулировать грануломоноцитарное колониеобразование (на 11,15 сутки) значительно превосходили аналогичные значения в группе нелеченых животных (рис. 5).

Совокупность выявленных феноменов указывает на многофакторную природу депрессии костномозгового кроветворения при сахарном диабете, которая сохраняется в ходе эксперимента, несмотря на стимуляцию образования ГО в костном мозге, увеличение продукции ЭПА и КСА и возрастание скорости деления и созревания эритроидных и грануломоноцитарных прекурсоров. Нарушения гемопоэза в условиях сахарного диабета обусловлены ускоренным выходом клеток в периферическую кровь в ответ на экстремальное воздействие, которым является для организма введение аллоксана, изменением регуляции вследствие снижения содержания инсулина (который в низких концентрациях не обладает митогенньш эффектом) в крови, а также метаболическими нарушениями [Быков В.Л., 1993; Соколова Г.А., 1996; Новицкий В.В. и др., 1997; Колосова М.В. и др., 2001].

Стимуляция же эритропоэза носит по-видимому компенсаторный характер. Гликозилирование гемоглобина эритроцитов приводит к изменению

его сродства к кислороду, что усиливает гипоксию периферических тканей. В результате прогрессирующей гипоксии почек, сочетающейся с развитием диабетической ангиопатии, усиливается образование эритропоэтина [Випп Н.Р. е( а!., 1997]. Эритропоэтин, в свою очередь, существенно ускоряет эрит-роидную дифференцировку с параллельным повышением интенсивности пролиферации. Кроме того, в периферическую кровь выходят в повышенном количестве незрелые формы эритроцитов (ретикулоциты).

8 Оаллоксан

7 В аллоксан+С'МД антител к Г-^ЕСХ И аллоксан+Г-КСФ

Рисуиок 5. Динамика колониестимулирующей и эритропоэтической активности в супер-натантах от прилипающих (А, Б), неприлилающих (В, Г), миелокариоцитов и в сыворотке крови (Д, Е) у мышей линии СВА/СаЬас после введения им аллоксана, аллоксана и СМД антител к Г-КСФ, либо аллоксана и Г-КСФ. По оси абсцисс - сроки исследования (сутки); по оси ординат величина исследуемого показателя. Доверительные интервалы при р<0,05.

Исследование действия препаратов СМД антител к Г-КСФ и Г-КСФ на показатели системы крови показало, что во всех случаях при их введении

имеет место стимуляция функциональной активности клеток-предшественников гемопоэза и аппарата регуляции кроветворения, что сопровождается увеличением количества ретикулоцитов и лейкоцитов в периферической крови, ростом образования ГО, возрастанием уровня индукторов гемопоэза в сыворотке крови, усилением секреции ЭПА и КСА миелокарио-цитами.

В целом, полученные результаты свидетельствуют о выраженном антидиабетическом эффекте изучаемых препаратов при аллоксановом СД. При этом механизмами действия Г-КСФ являются стимуляция, мобилизация и детерминированный хоминг в пораженные зоны поджелудочной железы эндогенных МСК костного мозга с дальнейшей дифференцировкой в специализированные элементы, а так же активация резидентных тканеспецифических предшественников. В основе фармакологических эффектов СМД антител к Г-КСФ, по-видимому, лежит возрастание эндогенной продукции Г-КСФ и модуляция его эффектов [Эпштейн О.И. и др., 2005; Эпштейн О.И., 2008].

ВЫВОДЫ

1. Развитие сахарного диабета у мышей линии СВА/СаЬас сопровождается изменениями со стороны резервных систем клеточного обновления (увеличение содержания в костном мозге стромальных предшественников, снижение количества регионарных и увеличение - фибробластных прекурсоров в поджелудочной железе), которые оказываются недостаточными для компенсации вызванных аллоксаном повреждений.

2. Введение как препарата СМД антител к Г-КСФ, так и препарата Г-КСФ на фоне аплоксана приводит к нормализации содержания инсулина и глюкозы в сыворотке крови за счет уменьшения выраженности воспалительно-некротических, а также регрессии склеротических изменений в поджелудочной железе и восстановления функционирования её эндокринного аппарата.

3. Регенераторные свойства препарата СМД антител к Г-КСФ и препарата Г-КСФ реализуются за счет стимуляции функциональной активности различных пулов прогениторных клеток. Под действием препарата СМД антител к Г-КСФ на фоне инсулярной недостаточности происходит более активная мобилизация мезенхимальных стволовых клеток и стромальных предшественников из костного мозга в кровь, а под влиянием Г-КСФ -более раннее повышение содержания тканеспецифических прекурсоров в поджелудочной железе, что обусловливает в этом случае более активное увеличение секреции инсулина и восстановление уровня глюкозы.

4. Стимуляция костномозгового кроветворения при экспериментальном сахарном диабете сменяется депрессией, которая имеет многофакторную природу и длительно сохраняется в ходе эксперимента, несмотря на активацию гемопоэзкндуцирующего микроокружения и возрастание скорости деления и созревания эритроидных и грануломоноцитарных прекурсоров.

5. Применение как препарата СМД антител к Г-КСФ, так и препарата Г-КСФ в условиях аллоксанового диабета приводит к повышению функциональ-

ной активности гемопоэтических предшественников и аппарата регуляции кроветворения. При этом действие препарата СМД антител к Г-КСФ на систему крови носит в большей степени модулирующий, а препарата Г-КСФ - стимулирующий характер.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИСЕРТАЦИИ

1. Механизмы изменений, развивающихся в системе крови при экспериментальном сахарном диабете // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии (Сборник научных работ молодых ученых). -Томск, 2007.-С. 115-117.

2. Фармакологическая регуляция гемопоэза при сахарном диабете // Создание новых лекарственных препаратов (Материалы конференции). - Томск: Изд-во Том. Ун-та, 2007. - С. 23-25 (соавторы Ставрова Л.А., Сергеева С.А., Эпштейн О.И).

3. Механизмы изменений системы клеточного обновления при экспериментальном сахарном диабете // Бюллетень СО РАМН. - 2007. - №6. - С. 7278. (соавторы A.M. Дыгай, В.В. Жданов, Г.Н. Зюзьков и др.).

4. Механизмы терапевтических эффектов гранулоцитарного колониестиму-лирующего фактора при экспериментальном сахарном диабете // Клеточные технологии в биологии и медицине. -2008. - №4. - С230-233 (соавторы Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, Жданов В.В. и др.).

5. Механизмы влияния сверхмалых доз антител к гранулоцитарному коло-ниестимулирующему фактору на восстановление поврежденной ткани поджелудочной железы при экспериментальном сахарном диабете // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 2009. - Приложение №1. - С. 190-195 (соавторы Жданов В.В., А.М. Дыгай, Г.Н. Зюзьков и др.).

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор ГО - гемопоэтический островок

КОЕ-ГМ колониеобразующая единица гранулоцито-макрофагальная

КОЕ-Э - колониеобразующая единица эритроидная

КОЕ-Ф - колониеобразующая единица фибробластов

КСА - колониестимулирующая активность

МСК - мезенхимальная стволовая клетка

ОКК - общее количество кариоцитов

ОКЛ - общее количество лейкоцитов

СД - сахарный диабет

СК - стволовая клетка

ЭПА - эритропоэтическая активность

Подписано в печать 03.03.09. Формат 60x84/16. Гарнитура Times. Бумага офсетная. Печать трафаретная. Усл. печ. л. 1,40. Тираж 100 экз. Заказ № 29.

Отпечатано в типографии ООО «Аграф-Пресс». 634055, г. Томск, пр. Академический, 10/3, стр. 4, к. 104, тел. 252-484, 8 901 610 7013. e-mail: agraf@rambler.ru

Актуальность проблемы. В последнее время отмечается рост числа эндокринных заболеваний, особенно сахарного диабета (СД), который считается болезнью века [Zimmet P.Z. et al., 1997; Ефимов А.С., Скробонская Н.А., 1998]. СД занимает третье место в мире по распространенности после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний [Adeghate Е et al., 2006; Хавинсон В.Х. и др., 2007]. Актуальность изучения механизмов развития СД и разработки эффективных способов его лечения определяется как исключительно быстрым ростом заболеваемости, гак и высокой степенью инвалиди-зации больных.

Наиболее частой причиной смерти при СД являются его осложнения, особенно диабетическая ангиопатия — генерализованное повреждение кровеносных микрососудов, сочетающееся с нарушениями гемостаза [Молитвословов А.Б., 1996; Балаболкин М.И., 2000; Arikawa Е. et al., 2006; Хавинсон В.Х. и др., 2007]. Несмотря на сложность патогенеза поздних осложнений СД, основное место в их инициации и прогрессировав и и принадлежит хронической гипергликемии и отсутствию компенсации метаболических расстройств [Harhaj N.S. et al., 2006J. По современным представлениям, именно повышенный уровень глюкозы в крови является ведущим фактором, лежащим в основе многообразных биохимических и структурных изменений в клетках и тканях [Thompson C.J. et al., 1996; Stratton l.M. et al., 2000; Атаманов B.M., 2003].

Несмотря на внедрение современных технологий в практику терапии СД (генноинженерный инсулин человека, шприц-ручки и инсулиновые помпы, глюкометры и др.), вопросы компенсации нарушений углеводного обмена и предупреждения развития сосудистых осложнений диабета остаются актуальными. К сожалению, применение стандартных схем интенсивной инсу-линотерапии СД может приводить к тяжелым гипогликемическим реакциям. Именно этим объясняется стремление разработать такие методы лечения СД, которые предполагали бы реализацию целевых установок по компенсации углеводного и липидпого обменов без риска развития гипогликемии. Это может быть достигнуто только путем применения технологий, предусматривающих наличие нормальной обратной связи регуляции углеводного обмена, имеющей место у здорового человека [Аметов A.C., 2005].

Полученные в последние годы сведения о свойствах и закономерностях жизнедеятельности мультипотентных клеток-предшественников дали толчок к развитию нового направления в медицине - клеточной терапии [Сухих Г.Т. и др., 2002; In'l Anker P.S. et al., 2003]. Клеточная терапия представляет собой совокупность методических подходов, направленных на стимуляцию восстановления функционально активной ткани на месте повреждения за счет активации и использования регенераторного потенциала различных типов стволовых клеток (CK). К настоящему времени получены данные о наличии во многих тканях взрослого организма наряду с регионарными (тканеспецифи-ческими прекурсорами) полипотентных клеток-предшественников, таких как мезенхимальные CK (МСК) [Orlic D. et al., 2001; Сухих Г.Т. и др., 2002; In't Anker P.S. et al., 2003].

Показано, что клетки костного мозга in vitro и in vivo могут дифференцироваться с образованием клеток эндокринной части поджелудочной железы [Ianus A. et al., 2003; Jahr H., Bretzel R.G., 2003], a также индуцировать регенерацию островков Лангерганса у мышей со стрептозотоциновым СД [Hess D. et al., 2003; Ianus A. et al., 2003].

В ряде исследований in vitro было установлено, что МСК обладают способностью к трансдифферепцировке в инсулин-продуцирующие клетки при культивировании в соответствующих средах [Jiang Y. et al., 2002; Chen L.B. et al., 2004; Moriscot С. et al., 2005; Timper К. et al., 2006]. Обнаружено, что клетки мононуклеарной фракции костного мозга могут мигрировать в ткань поджелудочной железы в ответ на её повреждение и стимулировать не-оангиогенез, тем самым, запуская процессы регенерации пула ß-клеток [Hess D. et al., 2003; Mathews V. et al., 2004].

В связи с этим одним из наиболее перспективных направлений развития клеточной терапии представляется мобилизация эндогенных CK с их последующей миграцией и хомингом в пораженные ткани с помощью фармакологических агентов. По данным литературы, наиболее мощным стимулятором мобилизации регенераторно-компетентпых клеток счи тается гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) [Козлов В.А., Сенников C.B., 2004; Di Campli С. et al., 2004; Yannaki E. et al., 2005; Гольдберг Е.Д. и др., 2007; Жданов В.В. и др., 2007].

В то же время известно, что сверхмалые дозы антител к эндогенным регуляторам физиологических функций способны оказывать эффект, аналогичный тому, который осуществляют данные биологически активные вещества in vivo [Эпштейн О.И. и др., 2005; Эпштейн О.И., 2008].

С указанных позиций несомненный теоретический и практический интерес представляет изучение возможности стимуляции функций различных классов эндогенных СК с помощью препаратов на основе Г-КСФ и сверхмалых доз антител к Г-КСФ (СМД антител к Г-КСФ) при СД. Полученные в этом направлении данные позволили бы разработать принципиально новый патогенетически обоснованный способ активации процессов регенерации поджелудочной железы, в условиях ипсулярной недостаточности.

Цель исследования. Изучить состояние различных пулов регенера-торно-компетентных клеток, изменений в системе крови и механизмов, лежащих в их основе, на модели аллоксанового диабета, оценить эффективность его терапии путем фармакологической модуляции функций прогени-торных клеток.

Задачи исследования:

1. Исследовать роль мезепхимальных и тканеспецифических предшественников различных классов в процессах регенерации поджелудочной железы на модели сахарного диабета.

2. Оценить влияние препаратов Г-КСФ и СМД антител к Г-КСФ на динамику течения экспериментального сахарного диабета и вскрыть механизмы, лежащие в его основе.

3. Исследовать действие препаратов Г-КСФ и СМД антител к Г-КСФ на мезепхимальные и регионарные клетки-предшествепники различной степени зрелости в условиях экспериментального сахарного диабета.

4. Изучить изменения в системе крови и механизмы, лежащие в их основе, у животных с экспериментальным сахарным диабетом.

5. Оценить влияние препаратов Г-КСФ и СМД антител к Г-КСФ на систему крови животных с экспериментальным сахарным диабетом.

Научная новизна. В работе впервые всесторонне изучено состояние различных пулов мезенхимальных клеток-предшественников в костном мозге и периферической крови, а также динамика содержания регионарных клеток-предшественников тканеспецифических и стромальных в поджелудочной железе при экспериментальном сахарном диабете. Установлено, что мезеп-химальные прекурсоры участвуют в процессах регенерации поджелудочной железы при ее повреждении токсическим агентом - ал л океаном. Однако полученные результаты свидетельствуют о недостаточности, либо несостоятельности указанных механизмов для восстановления инсулинпродуцирую-щей ткани.

Выявленные исследования позволили детально оценить изменения в кроветворной ткани при аллоксановом сахарном диабете и механизмы, лежащие в основе компенсаторных реакций со стороны системы крови.

В эксперименте на модели аллоксанового диабета изучены репаратив-ные свойства препаратов Г-КСФ и СМД антител к Г-КСФ, показана их высокая антисклеротическая и противовоспалительная активность. Установлено, что регенеративное действие обоих препаратов связано со стимуляцией функциональной активности прогениторных клеток различных классов, мобилизацией, миграцией и детерминированным хомингом их в пораженную поджелудочную железу.

Практическая значимость. Полученные результаты позволили разработать патогенетически обоснованные методы терапии сахарного диабета, основанные на восстановлении эндокринной части поджелудочной железы за счет фармакологической модуляции функций эндогенных стволовых клеток. Кроме того, в работе намечены возможные пути коррекции изменений в системе крови, развивающихся при СД. По материалам работы подготовлены отчеты о специфической активности указанных препаратов для получения разрешения на клинические исследования. Получены патенты (RU) № 2308281 от 20.10.2007 г. «Способ клонирования in vitro регионарных стволовых клеток поджелудочной железы» и № 2313361 от 27.12.2007 г. «Средство, обладающее антидиабетической активностью».

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на ежегодной Всероссийской конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (Москва, 2006), конференции молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2007), конференции «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007), на III съезде фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007), на международном конгрессе «EUROMEDICA-HANNOVER-2008» (Германия, Ганновер, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 2 - в реферируемых журналах, рекомендуемых перечнем ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 196 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 18 рисунками и 37 таблицами. Библиографический указатель включает 327 источников, в том числе 92 отечественных и 235 иностранных.

Выводы

1. Развитие сахарного диабета у мышей сопровождается изменениями со стороны резервных систем клеточного обновления (увеличение содержания в костном мозге стромальных предшественников, снижение количества регионарных и увеличение - фибробластных прекурсоров в поджелудочной железе), которые оказываются недостаточными для компенсации вызванных аллоксаном повреждений.

2. Введение как препарата СМД антител к Г-КСФ, так и препарата Г-КСФ на фоне аллоксана приводит к нормализации содержания инсулина и глюкозы в сыворотке крови за счет уменьшения выраженности воспалительно-некротических, а также регрессии склеротических изменений в поджелудочной железе и восстановления функционирования её эндокринного аппарата.

3. Регенераторные свойства препарата СМД антител к Г-КСФ и препарата Г-КСФ реализуются за счет стимуляции функциональной активности* различных пулов прогениторных клеток. Иод действием препарата СМД антител к Г-КСФ на фоне инсулярной недостаточности происходит более активная мобилизация мезенхимальных стволовых клеток и стромальных предшественников из костного мозга в кровь, а под влиянием Г-КСФ — более раннее повышение содержания тканеспецифических прекурсоров в поджелудочной железе, что обусловливает в этом случае более активное увеличение секреции инсулина и восстановление уровня глюкозы.

4. Стимуляция костномозгового кроветворения при экспериментальном сахарном диабете сменяется депрессией гемопоэза, которая имеет многофакторную природу и длительно сохраняется, несмотря на возрастание функциональной активности гемопоэзиндуцирующего микроокружения и возрастание скорости деления и созревания эритроидных и грануломоно-цитарных прекурсоров.

5. Применение как препарата СМД антител к Г-КСФ, так и препарата Г-КСФ в условиях аллоксанового диабета приводит к повышению функциональной активности гемопоэтических предшественников и клеточных элементов гемопоэзиндуцирующего микроокружения. При этом действие препарата СМД антител к Г-КСФ на систему крови носит в большей степени модулирующий, а Г-КСФ - стимулирующий характер.

1.6. Заключение

Система крови самым непосредственным образом участвует в адаптации организма к условиям, возникающим при воздействии различного рода экстремальных факторов, в том числе и при гипергликемии. В литературе достаточно подробно описаны изменения со стороны периферической крови и костномозгового кроветворения в условиях повышенного уровня глюкозы. Однако до сих пор, во многом еще не изучена роль как локальных, так и дистантных механизмов регуляции гемопоэза в формировании гематологических сдвигов при СД. В частности, не существует данных о секреторной активности отдельных компонентов ГИМ при СД, а также о роли межклеточной кооперации различных элементов микроокружения с кроветворными прекурсорами. Вместе с тем до настоящего времени пе решены вопросы, связанные со значимостью различных гуморальных факторов сыворотки крови в регуляции гемопоэза при гипергликемических состояниях. В мировой литературе не существует сведений об участии компенсаторно-приспособительных механизмов «глубокого резерва» КМ - мультипотентных (мезенхимальных) GK - в развитии ответа гемопоэтической ткани на избыток глюкозы, а также в восстановлении нарушений жизнедеятельности организма, вызванных дефицитом инсулина,-в целом. Кроме того, на сегодня не известна принципиальная возможность фармакологической коррекции (активации) репаративных процессов в ПЖ, поврежденной химическим агентом - аллоксаном, с помощью модификации функциональной активности эндогенных как регионарных, так и костномозговых СК.

Таким образом, весьма интересным представляется изучение механизмов регуляции и дизадаптации системы крови при СД. Вместе с тем учитывая единство механизмов управления деятельностью органов и систем, работы в данном направлении помогут в решении общебиологической проблемы адаптогенеза, а также в создании новых патогенетически обоснованных методов фармакотерапии болезней организма, основанных на изменении про-лиферативно-дифференцировочного баланса СК in situ, детерминировании их миграционных свойств и включении определенной заданной программы дифференцировки.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материал исследования

В экспериментах использованы 600 мышей линии СВА/СаЬас (330 самцов и 270 самок) в возрасте 2 - 2,5 месяцев, массой 18 - 20 г. Животные 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из питомника ГУ РЖИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).

Распределение животных по сериям экспериментов в соответствии с поставленными задачами, сроки забора материала для исследований в каждой серии отображено в таблице 1.

Перед началом эксперимента и в период исследования животные выдерживались на обычном пищевом режиме по 15-20 особей в пластиковых клетках в виварии при температуре воздуха 20-22°С. Забор материала для исследования осуществляли у интактных животных, а также после экспериментальных воздействий. Мышей умерщвляли методом кранио-цервикальной дислокации под эфирным наркозом.

Опыты проводили в осенне-зимний период (для исключения сезонных колебаний), забор материала осуществляли в утренние часы.