Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Фармакологическая модуляция сигнальной функции Na+, K+-ATФазы

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР СЕРДЦА, КРОВИ И ЭНДОКРИНОЛОГИИ ИМ. В. А. АЛМАЗОВА РОСМЕДТЕХНОЛОГИЙ»

На права$Й&!Кртси

003494545

ЛОПАТИНА ЕКАТЕРИНА ВАЛЕНТИНОВНА

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ МОДУЛЯЦИЯ СИГНАЛЬНОЙ ФУНКЦИИ №+,К+-АТФазы

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология 03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2 í [,!А? 23'.О

2010

003494545

Работа выполнена в отделе экспериментальной физиологии и фармакологии ФГУ «Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова Федерального агентства по оказанию высокотехнологичной медицинской помощи» и лаборатории физиологии возбудимых мембран Института физиологии им. И.П. Павлова РАН

Научные консультанты:

Заслуженный деятель науки РФ, профессор, доктор медицинских наук Цырлин Виталий Александрович

профессор, доктор биологических наук Крылов Борис Владимирович

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, профессор, доктор медицинских наук Лосев Николай Андреевич

Ведущая организация:

Профессор, доктор медицинских наук Звартау Эдвин Эдуардович

Лауреат Государственной премии СССР, профессор, доктор биологических наук Кропотов Юрий Дмитриевич

Санкт-Петербургский Государственный Университет (медицинский факультет)

Защита состоится «

'11»

апреля 2010 г. в И часов на заседании диссертационного совета Д 001.022.03 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины СЗО РАМН» по адресу: 197376 Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., 69/71 (конференц-зал).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН по адресу: 197376 Санкт-Петербург, ул. акад. И.П. Павлова, 12

Автореферат разослан " \ " ^ХХО^К1^ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.022.03 п

доктор биологических наук, профессор гтС^ ПучковаЛ.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема аналгезии привлекает особое внимание исследователей и клиницистов. Несмотря на наличие в арсенале современной медицины широкого круга лекарственных препаратов, обладающих аналгетичсскими свойствами, изучение фундаментальных механизмов, лежащих в основе кодирования и восприятия ноцицептивных сигналов с целью создания принципиально новых лекарственных средств, остается по-прежнему актуальным.

Большинство субстанций, претендующих на роль лекарственных препаратов, выявляют с помощью одного из трех подходов: 1) химическая модификация известных молекул; 2) скрининг биологической активности большого количества натуральных продуктов, ряда ранее открытых химических структур, больших «библиотек» пептидов или нуклеиновых кислот; 3) направленный синтез (рациональный дизайн лекарств), основанный на понимании биологических механизмов реализации их эффектов и химической структуры мишеней (Катцунг Б.Г, 1998).

Создание полусинтстических и синтетических агонистов и антагонистов опиатов является примером первого подхода. Второй подход можно проиллюстрировать созданием препаратов, представляющих собой пептидные биорегуляторы. Пример реализации третьего подхода - создание ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента, которое стало возможным благодаря изучению связи между строением и действием блокаторов активного сайта фермента и компьютерному конструированию гипотетической химической структуры лекарства.

Для создания нового лекарственного препарата, относящегося к группе аналгетиков, наряду с общепринятыми способами может использоваться и принципиально иной подход. В его основе лежит исследование возможности фармакологической модуляции сигнальной функции Ка\К_'-АТФазы при прохождении ноцицептивного сигнала в сенсорном нейроне спинального ганглия в системе: опиоидоиодобный рецептор - Ыа+,К+-АТФаза - Nav1.8-канал (Крылов Б.В. и др., 1999). Первая стадия формирования болевого ощущения связана с активацией тканевых периферических рецепторов, так называемых ноцицепторов, кодирующих информацию не только о болевом воздействии, но и сигналы других модальностей. Ноцицептивные сигналы передаются по афферентным волокнам группы С и А6 через сенсорные нейроны спинальных ганглиев. Эти темные ноцицептивные нейроны (их размер не превышает 30 мкм) представляют собой клетки, характеризующиеся наличием опиоидных, опиоидоподобных и неопиоидных рецепторов и высокой плотностью медленных натриевых каналов (Gold M.S., et al., 1996). Медленные тетродотоксиннечувствительные натриевые каналы (Nav1.8) определяют процесс кодирования ноцицептивных сигналов в афферентах и сенсорных нейронах (Borovikova L.V., et al., 1997; Cardenas C.G., et al., 1997).

Модуляторы активности медленных натриевых каналов являются субстанциями, применение которых представляется перспективным с точки

зрения разработки новых аналгетических лекарственных препаратов, поскольку аналъгезирующие агенты, независимо от первичной мишени воздействия, избирательно снижают их функциональную активность (Brau М.Е., et al., 2001; OgataN., Ohishi Y„ 2002).

Механизм болеутоляющего действия наркотических аналгетиков (наиболее эффективных соединений) обусловлен влиянием препаратов на разных уровнях прохождения ноцицептивного сигнала. Аналгезия на спинальном уровне осуществляется за счет взаимодействия опиоидного соединения с pi-, <5- или к- рецепторами. Опиоидные рецепторы вовлечены в однотипный механизм сигнализации, включающий в себя опиоидный рецептор - G белок - кальциевый или калиевый канал (Катцунг Б.Г., 1998). G белок в этом механизме выполняет функцию транедуктора, усиливая величину сигнала при передаче ноцицептивной информации от рецептора к ионному каналу, а также передавая его на геном. При этом изменяются системы вторичных посредников, связанных с током кальция, ингибированием аденилатциклазы и стимуляцией синтеза G белков (Катцунг Б.Г., 1998). Повышение уровня экспрессии G белков стимулирует синтез опиоидных рецепторов и увеличение числа ионных каналов.

Модуляция ноцицептивного сигнала может оцениваться по снижению потенциалочувствительности активационного воротного устройства медленных натриевых каналов сенсорных нейронов спинального ганглия, которое возникает вследствие уменьшения величины эффективного заряда. Исследование механизма кодирования ноцицептивного сигнала в системе опиоидоподобный рецептор - Ыа',К. -АТФаза - Мау1,8-канал (Крылов Б.В. и др., 1999) с помощью метода локальной фиксации потенциала {patch-clamp метод) показало, что не только наркотические аналгетики оказывают влияние на этот процесс. Эффективность гидрохлорида морфина (Крылов Б.В. и др.,

1999) была сопоставима с эффективностью производных гамма-пирона (Derbenev A.V., et al., 2000; Рогачевский И.В. и др., 2006, Плахова В.Б. и др., 2006). При этом оказалось, что на фоне блокаторов G белков эффекты исследуемых соединений сохранялись. Приложение налтрексона или оуабаина к наружной стороне мембраны сенсорного нейрона устраняло влияние изученных соединений на эффективный заряд воротного устройства медленного натриевого канала (Крылов Б.В. и др., 1999; Derbenev A.V. et al.,

2000). Были получены экспериментальные доказательства участия Na+,K+-АТФазы в модуляции ноцицептивного сигнала (Крылов Б.В. и др., 1999; Derbenev А. V. et al., 2000).

Фармакологическая модуляция сигнальной (транедукторной) функции №+,К+-АТФазы при помощи производных гамма-пирона может позволить направленно регулировать ноцицептивные сигналы и зарегистрировать обезболивающий эффект соединения in vivo. Последнее открывает перспективы для создания аналгетического препарата нового класса.

Как транедуктор сигнала Ыа+,К+-АТФаза участвует не только в регуляции ноцицепции, но и в модуляции роста и пролиферации клеток разных тканей (Пеннияйнен В.А. и др., 2003; Xie Z., Askari А., 2002; Schiener-Bobis G., 2002;

Schoner W„ 2002a; Schoner W., 20002b; Schoner W„ Schiener-Bobis G., 2005). Ec активность в организме человека и животных регулируют эндогенные дигиталисоподобные факторы, выделяющиеся в кровь в наномолярных концентрациях. Возможно, эндогенные стероиды могут модулировать сигнальную функцию Ь'а+,К+-АТФазы в системе опиоидоподобный рецептор -Ыа+,К.+-АТФаза - Navl-8-канал н изменение функциональной активности Ыа+,К+-АТФазы будет оказывать как аналгетический, так и иные эффекты.

Цель исследования. Исследовать болеутоляющий эффект и изменение пролиферативной активности клеток разных тканей при фармакологической модуляции сигнальной функции Ка+,К+-АТФазы и разработать оригинальный лекарственный препарат с аналгетической активностью, механизм действия которого связан с модуляцией этой функции фермента.

Задачи:

1. Исследовать участие №+,1С-АТФазы в модуляции ноцицептивных сигналов в системе опиоидоподобный рецептор - К'а^К'-АТФаза - Nav1.8-канал.

2. Исследовать действие эндогенного блокатора Ыа',К!-АТФазы оуабаина на процессы роста и пролиферации нейритов сенсорных нейронов, ткани сердца и сетчатки глаза 10-12-дневных куриных эмбрионов.

3. Выявить физиологическую роль рамнозильного остатка в молекуле оуабаина.

4. Исследовать действие препаратов группы сердечных гликозидов как экзогенных блокаторов №+,К+-АТФазы на процессы роста и пролиферации нейритов сенсорных нейронов, ткани сердца и сетчатки глаза 10-12-дневных куриных эмбрионов.

5. Исследовать действие производной гамма-пирона коменовой кислоты как экзогенного модулятора Ыа+,К+-АТФазы на процессы роста и пролиферации нейритов сенсорных нейронов, ткани сердца и сетчатки глаза 10-12-дневных куриных эмбрионов.

6. Исследовать аналгстическую активность коменовой кислоты в экспериментах in vivo.

7. На основе коменовой кислоты разработать лекарственную форму препарата, обладающего аналгетическим эффектом и реализующего свои свойства за счет модуляции сигнальной функции № ,К'-ЛТФазы.

8. Оценить фармакологическую активность препарата «Аноцептин» в экспериментах in vitro и in vivo.

9. Изучить возможность формирования лекарственной зависимости при длительном введении препарата «Аноцептин».

10. Изучить безопасность действия и фармакокинетику препарата «Аноцептин» в исследованиях на животных и человеке.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработана методологическая система поиска и изучения обезболивающих препаратов, механизм действия которых основан на модуляции сигнальной функции Ыа^,К+-АТФазы.

2. Сигнальная функция К'а+,К.+-АТФазы проявляется в модуляции ноцицептивных сигналов ансамблем: опиоидоподобный рецептор -№\К+-АТФаза - Ыа„1.8-канал (либо Na+,K+-ATФaзa - Ыа¥1.8-каиал) и регуляции процесса тканевого моделирования на различных этапах онтогенеза.

3. Оуабаин в концентрациях, сопоставимых с эндогенными, модулирует сигнальную функцию Ыа+,К+-АТФазы. Наличие в молекуле оуабаина рамнозильного остатка повышает аффинность Ма+,К+-АТФазы к этому сердечному гликозиду и определяет тканеспецифичность действия гликозида.

4. При регуляции процессов роста и пролиферации в эмбриональный период развития оуабаин по эффективности превосходит строфантин К, дигоксин, оуабагенин и сопоставим с коменовой кислотой. Трофотропные эффекты оуабаина и коменовой кислоты наиболее выражены в отношении ткани сетчатки.

5. На основе производной гамма-пирона коменовой кислоты создан препарат «Аноцептин», обладающий аналгетической и противовоспалительной активностью и не вызывающей лекарственной зависимости и выраженных побочных эффектов при его длительном (90 суток) парентеральном введении.

Научная новизна. Доказано, что Ыа+,К+-АТФаза как транедуктор участвует в модуляции ноцицептивных сигналов в системе опиоидоподобный рецептор - Ыа+,К+-АТФаза - Ыа,,Л.8-канал и направленной регуляции процесса тканевого моделирования. Показано, что физиологическое значение эндогенных дигиталисоподобных факторов заключается в регуляции этих процессов на разных этапах онтогенеза. Обнаружено, что оуабаин в концентрациях, сопоставимых с эндогенными, участвует в регуляции ноцицептивных сигналов в ансамбле Ыаь,К4-АТФаза - Кау1.8-канан мембраны сенсорных нейронов спинальных ганглиев млекопитающих.

Наличие в молекуле оуабаина рамнозильного остатка повышает аффинность №',К'-АТФазы к этому гликозиду на пять порядков. При регуляции процессов роста и пролиферации в эмбриональный период развития оуабаин по эффективности превосходит строфантин К, дигоксин, оуабагенин и сопоставим с коменовой кислотой.

Установлено, что трофотропные эффекты оуабаина и коменовой кислоты наиболее выражены в отношении ткани сетчатки.

Действие препарата «Аноцептин», разработанного на основе коменовой кислоты, основано на рецептор-опосредованной регуляции сигнальной функции Ыа+,К+-АТФазы сенсорных нейронов спинальных ганглиев. Доказана его эффективность как аналгетического средства. Обнаружен противовоспалительный эффект препарата. Применение препарата «Аноцептин» не вызывает активации системы положительного подкрепления латерального гипоталамуса. Лекарственная зависимость при длительном

парентеральном введении препарата не формируется. Побочные эффекты при использовании аноцептина в аналгетических дозах не проявляются.

Теоретически и экспериментально обосновано новое перспективное направление создания аналгетических средств, механизм действия которых основан на фармакологической модуляции сигнальной функции Na+,K+-АТФазы.

Научно-практическое значение работы. Разработана методологическая система поиска и изучения обезболивающих препаратов, механизм действия которых основан на модуляции сигнальной функции №\К1-АТФазы.

Создана лекарственная форма принципиально нового отечественного препарата «Аноцептин», относящегося к классу аналгетиков. Отчет о доклиническом исследовании безопасности, фармакокинетики и фармакологической активности препарата «Аноцептин» (лекарственная форма в виде I и 2% раствора для внутривенных инъекций) представлен в Фармакологический комитет Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации. На основании разрешения Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития N 185 от 03 05.2007 г. в Институте мозга человека РАН проведено исследование безопасности и фармакокинетики препарата «Аноцептин» в клинических условиях. Безопасность препарата для организма человека клинически доказана. Отчет о клиническом исследовании безопасности и фармакокинетики представлен в ФГУ Научный центр экспертизы средств медицинского применения Росздравнадзора РФ и утвержден (протокол N12 от 5 июня 2009 г.). Выпуск препарата планируется в виде 1 и 2% раствора для инъекций в ампулах объемом 1, 2 и 5 мл. Получены патенты Российской Федерации: патент РФ № 2322977 «Синтетическое анальгетическое средство и способ лечения на основе этого средства», приоритет от 01.08.2006, авторы: Крылов Б.В., Лопатина Е.В; патент РФ № 2367432 «Анальгетическое средство и способ лечения болевого синдрома различной этиологии с помощью этого средства», приоритет от 27.09.2007, авторы Крылов Б.В., Лопатина Е.В.; патент РФ № 2362554 «Регенерирующее противовоспалительное средство и способы лечения с помощью этого средства», приоритет от 27.09.2007, авторы: Лопатина Е.В., Карецкий A.B., Крылов Б.В.

Основные положения диссертации используются в научно-исследовательской работе научно-исследовательского отдела экспериментальной физиологии и фармакологии ФГУ «ФЦСКИЭ им. В. А. Алмазова», Института физиологии им И.П. Павлова РАН, экспериментальных исследованиях отделения туберкулеза глаз ФГУ «СПбНИИФ», научно-клинической работе Института Мозга человека РАН, педагогической работе кафедры общей физиологии биолого-почвенного факультета СПбГУ.

Под руководством д.х.н. И.Н. Домнина налажен промышленный синтез коменовой кислоты на базе ФГУП «СКТБ» «Технолог». Лабораторный регламент изготовления готовой лекарственной формы препарата адаптирован

к промышленным условиям. Экспериментальные партии препарата «Аноцептин» произведены на базе НИИ ОЧБ и ООО «НТФФ» «Полисан».

Апробация работы. Результаты работы доложены на: конгрессе ассоциации кардиологов стран СНГ «Фундаментальные исследования и прогресс в кардиологии», СПб, 18-20 сентября 2003 г.; Научно-практической конференции «Фундаментальные науки - медицине», Москва, 10-11 декабря

2003 и 3-4 декабря 2007 г.; III Всероссийской с международным участием Школе-конференции по физиологии кровообращения, Москва. 27-30 января

2004 г.; Международной конференции «Проблемы интеграции функций в физиологии и медицине (к 100-летнему юбилею присуждения Нобелевской премии академику И.П.Павлову)», Минск, 15-16 июня 2004 г.; XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова, Екатеринбург. 20-24 сентября

2004 г.; Конференции "Современные возможности диагностики и лечения витрео-ретинальной патологии", Москва, 27 мая 2004 г.; Международной конференции «Клеточные технологии в офтальмологии», Москва, 16-17 марта

2005 г.; Humboldt-Kolleg Conference «Technologies of the 21st Century: Biological, Physical, Informational and Social Aspects», SPb, September 27-29 2005 г.; I съезде физиологов СНГ, Сочи, 19-23 сентября 2005 г.; Международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности» [Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования, образование], СПб, 7-9 февраля 2006 г.; V Международной конференции по функциональной нейроморфологии (Колосовские чтения - 2006), СПб. 2006 г.; на XX Съезде Физиологического общества им И.П. Павлова, Москва, 4-8 июня, 2007 г.; Всероссийском симпозиуме с международным участием «Гормональные механизмы адаптации» (Посвящается памяти проф. A.A. Филаретова), СПб, 3-5 октября, 2007 г.; Конференции «Нейрохимические механизмы формирования адантивных и патологических состояний мозга», СПб. 10-12 сентября, 2008 г.; Всероссийском симпозиуме по фармакологии «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств. Фундаментальные науки новым лекарствам», Москва, 9-11 июня 2008 г.; The 2nd St.-Petersburg Humboldt-Kolleg Conference «Technologies of the 21st Century: Biological, Physical, Informational and Social Aspects», SPb. October 7-9, 2008; II съезде физиологов СНГ, Кишинев, 29-31 октября, 2008 г.; международной конференции «Висцеральные системы», СПб, 29 сентября-2 октября 2009 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 научных работ в отечественной и зарубежной печати и три патента РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на •Щ страницах машинописного текста, иллюстрирована Цт рисунками, содержит таблиц. Работа построена по стандартному плану и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, методы, результаты исследований, обсуждение результатов. . выводы и список литературы, включающий ^ отечественных и 9 \ зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Метод локальной фиксации потенциала (patch-clamp)

Patch-clamp эксперименты осуществляли на культивируемых изолированных нейронах спинальных ганглиев новорожденных крыс линии IVistar. Дорзальные ганглии выделяли из областей Ц - S) спинного мозга и

помещали в раствор Хенкса. Для выделения ноцицептивных нейронов применяли модифицированный метод краткосрочного культивирования (Elliott A.A., Elliott J.R., 1993). Внеклеточный раствор (концентрации представлены в миллимолях): NaCl - 65, СаС12 - 2, MgCl2 - 2, Choline Cl - 70, HEPES Na - 10, TTX - 0.0001, pH = 7.4; внутриклеточный раствор: CsF - 100, NaCl - 10, CsCI -40, MgCl2 - 2, HEPES Na - 10, pH=7.2. Оуабаин вводили во внеклеточный раствор в диапазоне концентраций от 1 имоль/л до 200 мкмоль/л, налтрексон в дозе 50 мкмоль/л. Применяли реактивы фирмы "Sigma" (США). Опыты проводили при комнатной температуре 22 - 24°С. Использовали аппаратно-программный комплекс на основе усилителя «L/M ЕРС-7», ПЭВМ и специальной системы автоматизации. Эффективный заряд (Zcff) активационной воротной системы медленных натриевых каналов использовали как количественный показатель, отражающий воздействие оуабаина и налтрексона. Zefr - это физическая величина, отражающая состояние сенсора напряжения активационного воротного устройства медленного Nav, «-канала, выраженная в зарядах электрона (Крылов Б.В. и др., 1999). Уменьшение величины Zeff после приложения исследуемого агента свидетельствует о способности последнего регулировать ноцицептивные сигналы на уровне мембраны нервной клетки (Крылов Б.В. и др., 1999). Для оценки величины ZеП- использовали подход Ходжкина-Хаксли (Hodgkin A., Huxley A.F, 1952; Aimers V., 1981). Достоверность различий величин Z активационной воротной системы до и

после воздействия исследуемых агентов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

1.2. Синтез коменовой кислоты

Синтез коменовой кислоты (QH4O5; М.м. 156.10) осуществляли в три стадии по методу Гаркуши Ж.А. (Гаркуша Ж.А., 1961), модифицированному И.Н. Домниным. (Домнин И.Н. и др., 2008). Полученная субстанция представляла собой порошок от белого до белого с желтовато-сероватым оттенком цвета с легким специфическим запахом.

1.3. Метод органогинического культивирования ткани

В разных сериях экспериментов объектами исследования являлись культивируемые нейроны спинальных ганглиев, эксплантаты ткани сердца и сетчатки 10-12-дневных куриных эмбрионов. Исследования выполнены на 2000 эксплантатах, культивируемых в чашках Петри с коллагеновым покрытием дна в питательной среде в течение 3 суток в С02-инкубаторе («Sanyo», Япония) при температуре 37 С и 5% содержании С02. Контрольные эксплантаты культивировали в питательной среде стандартного состава (Пеннияйнен В.А. и

др., 2003). В культуральную среду экспериментальных чашек добавляли оуабаин, оуабагенин, ЭГТА (Sigma, USA), строфантин К, дигоксин и коменовую кислоту (Россия) в широком диапазоне концентраций. Для оценки влияния исследуемых веществ использовали относительный критерий - индекс площади (ИП), который рассчитывали как отношение площади всего эксплантата, к площади центральной зоны. Контрольное значение ИП принимали за 100%. В каждой серии опытов "п" - количество культивируемых эксплантатов. Для визуализации использовали микротеленасадку для микроскопа (серия 10, МТН-13 «Альфа телеком», Россия). 1.3.1. «Цитологические» методы исследования

Окрашивание гематоксилином и эозином и метиленовым синим осуществляли по стандартной методике (Меркулов Г.А., 1969). Препараты фотографировали при помощи установки, включающей в себя микроскоп Carl Zeiss Axiostar Plus, цифровую фотокамеру Nicon 8М и компьютер с пакетом программ для обработки изображений и описывали.

1.4. Приготовление лекарственной формы препарата «Аноцептин» (раствор для инъекций)

Препарат «Аноцептин» содержит индивидуальное вещество — коменовую (5-гидрокси-у-пирон-2-карбоновую) кислоту. В качестве вспомогательного вещества в состав препарата включен натрия гидрокарбонат. Лекарственная форма представляет собой прозрачную жидкость желтого или желто-зеленого цвета без запаха. Испытания на определение посторонних примесей проводили методом высокоэффективной жидкостной хромотографии (ВЖХ). Стерилизацию препарата осуществляли методом мембранной фильтрации в асептических условиях. Фильтрат разливали в ампулы нейтрального стекла и запаивали.

1.5. Тест «горячая пластина»

Аналитическое действие препарата «Аноцептин» определяли на 20 мышах по методу «горячей пластинки». Пластина, представляющая собой пол экспериментальной камеры, в которую помещали животных во время исследования, была Haipera до 52 С. Латентный период появления у животных подергивания лап, двигательного беспокойства, прыжковой активности оценивали в секундах. Опыты проводили спустя 30, 60 и 120 минут после внутривенного введения препарата «Аноцептин» в дозах 5, 10 и 50 мг/кг, препаратом сравнения был анальгин в дозе 50 мг/кг.

1.6. Формалиновый тест

Обезболивающие действие препарата «Аноцептин» исследовали в условиях формалинового теста на 19 самцах крыс линии Wistar с массой тела 200-250 г по стандартной методике (Руководящие и методические материалы по экспериментальному и клиническому изучению новых лекарственных средств. 4.2. М., 1980, с. 126-133; Dubbisson D., Dennis S.G., 1977; Tjolsen А. ct. al„ 1992; Abbott F., Guy E„ 1995; Clavelou P. et al., 1995; Dallel R., et al., 1995). В левую заднюю лапу животного подкожно вводили 50 мкл 5%-ного раствора формалина. Животным экспериментальной группы внутрибрюшинно вводили аноцептин 35 мг/кг или оуабаин 0,3 мг/кг.

Животным контрольной группы внутрибрюшинно вводили физиологический раствор. Регистрацию количества сгибаний, встряхиваний и продолжительности вылизывания (измеряется в секундах) инъецированной формалином конечности осуществляли каждую минуту в течение 60-90 минут с помощью оригинального пакета программ для обработки данных (Буткевич И.П. и др., 2009). Интенсивность болевого ответа в первую и во вторую фазы теста оценивали по количеству паттернов сгибания+встряхивания и продолжительности паттернов вылизывания (в секундах). Продолжительность каждой фазы и межфазного интервала измеряли в минутах. Снижение количества паттернов сгибания+встряхивания, возникающее благодаря действию исследуемых веществ, характеризует изменение в восприятии ноцицептивных сигналов на спннальном уровне. Уменьшение продолжительности паттернов вылизывания доказывает наличие болеутоляющего действия у изучаемых агентов на супраспинальном уровне (Abbott F., Guy Е., 1995; Dallel R., et al., 1995).

1.7. Метод самостимуляции латерального гипоталамуса

Возможность формирования физической зависимости от приема аноиептина исследовали с помощью метода самостимуляции латерального гипоталамуса. Опыты выполнены на 16 крысах самцах линии Wislar (из которых 6 - контрольные). В стерильных условиях под наркозом в область латерального гипоталамуса (А 1,5 мм, L 1,5 мм, Н 8,5 мм), согласно координатам атласа мозга крысы (Pellegrino L.J. et al., 1979), вживляли биполярные концентрические электроды. Через 5-7 дней после операции крыс помещали в экспериментальную камеру (40x40x60 см) с рычагом, нажатие на который замыкало цепь тока и подачу на электрод пачки импульсов (длительность импульса - 0,5 мс, частота следования - 100 Гц, сила тока 90-300 мкА. Силу тока, вызывающую стабильную частоту нажатий на рычаг, условно принимали за пороговую. Регистрировали количество нажатий за 10 мин. Реакцию самостимуляции (СС) тестировали после внутри брюшинного введения препарата «Аноцептин» в дозах 1, 10 и 30 мг/кг. Контрольным крысам вводили раствор Хенкса 1,5 мл рН=7,0-7,4. Частоту СС в течение всего опыта регистрировали на чернильном самописце Н320-5. На компьютере в режиме реального времени строили гистограммы и таблицы количества нажатий на рычаг в течение 10 минут до инъекции аноцептина, сразу после и через 30 и 60 минут после инъекции, с одновременной обработкой средней величины. Наблюдали за изменением порога реакции СС. Определяли достоверность различий полученных данных по критерию Сгьюдента-Фишера. Локализацию кончика стимулирующего электрода в области латерального гипоталамуса подтверждали гистологически.

1.8. Методика определения антимикробного действия препарата «Аноцептин» на М. tuberculosis

Использовали стандартный метод двукратных серийных разведений препарата в синтетической полужидкой среде Сотона с добавлением 25%

нормальной лошадиной сыворотки и питательного агара (0,35 г на 100 мл среды). Диапазон исследуемых доз препарата «Аноцеитин» составил 1,56 -200 мкг/мл. Контролем питательной среды служила плотная среда Левенштейна-Иенсена. Суспензии тест-культур М. tuberculosis Н37 Rv и ЛИХТ-98 в объеме 0,2 мл (10 миллионов микробных тел) засевали методом поверхностного наслоения в контрольные и опытные пробирки. Результаты учитывали через 7 суток инкубации посевов в условиях термостата при +37°С по интенсивности роста микобактериальной нленки на поверхности питательной среды.

1.9. Методика моделирования туберкулезного очагового хориоретинита

Моделирование туберкулезного хориоретинита выполнили на 20 кроликах (40 глаз) по методу Э.Н. Белендира (1971). После формирования хориоретинальных очагов (в среднем на 7-10 день после заражения) 20 животным на протяжении всего периода исследования проводили стандартную противотуберкулезную терапию (ПТТ), включающую изониазид - 3% раствор парабульбарно (по 0,5 мл в оба глаза) и 10% раствор внутримышечно (10 мг/ кг); стрептомицин внутримышечно (40 000 ЕД/кг). На 45-й день после заражения кролики были распределены на серии: 1-я (п-10) - местно (парабульбарно) 2% раствор аноцепгина по 0,5 мл в каждый глаз на фоне ПТТ; 2-я (п=10) - животные, получающие только I1TT. Курс лечения аноцептином составил 10 дней. Эффективность лечения оценивали по динамике массы тела животных, общеповеденческим реакциям, офтальмоскопическим параметрам (размер очага, уровень проминенции и экссудации). Животные основной и контрольной серий по трем оцениваемым показателям достоверно не отличались. Офтальмоскопическое исследование выполняли один раз в 3 дня. Через 6 недель от начала лечения аноцептином экспериментальных животных выводили из опыта, глаза энуклеировали, гистологические препараты готовили по стандартной методике (окраска гематоксилином и эозином). Было изготовлено и исследовано более 160 срезов. Препараты фотографировали при помощи установки, описанной в и. 1.3.1. Эффективность лечения экспериментальных туберкулезных хориоретинитов в процентах для каждого из трех изучаемых параметров (размер очага, проминенция, экссудация) вычисляли по формуле:

d =———^—100, где ¿Hi- величина показателя до и после лечения в (di+dï)/2

реальных единицах измерения. Статистическую обработку данных выполняли на персональном компьютере с использованием прикладных программ для статистического анализа «Microsoft: Excel» и «STATGRAPHICS Plus» для Windows.

1.10. Исследование острой токсичности препарата «Аноцептин»

Исследования проведены на 70 мышах и 72 крысах обоего пола. Для определения показателей острой токсичности препарат вводили белым мышам и крысам обоего пола внутривенно в хвостовую вену в возрастающих дозах. Расчеты средних летальных доз проводили по В.Б. Прозоровскому (1978). Контрольным животным вводили 1,1%-ный раствор бикарбоната

натрия. Период наблюдения составил 14 дней. Регистрируемые показатели: летальность, время гибели, симптоматика отравления, ежедневное наблюдение общего состояния и поведения, взвешивание до введения, на 7 и 14 дни наблюдения, объемы потребления корма и воды (для этого животные помещались в обменные клетки итальянской фирмы «Texnoplast»), вскрытие и макроскопическое исследование всех погибавших и выживших животных в конце исследования (эвтаназия у грызунов осуществлялась передозировкой эфира), определение массовых коэффициентов внутренних органов. 1.11. Исследование безопасности препарата «Аноцептин» при хроническом 90-дневном внутривенном введении

В опытах на крысах обоего пола препарат вводили внутривенно ежедневно на протяжении 90 дней в 3-х дозах: 5 мг/кг, 100 мг/кг и 300 мг/кг. Общее количество животных - 160, из них 40 - контрольная группа. Регистрируемые показатели: общее состояние животных (оценивали ежедневно у всех животных), взвешивание, потребление воды (1 раз в неделю), летальность, время гибели, симптоматика отравления, ежедневное наблюдение общего состояния и поведения, вскрытие и макроскопическое исследование всех иогибавших и выживших животных в конце исследования (эвтаназия у грызунов осуществлялась передозировкой эфира), определение массовых коэффициентов внутренних органов. При офтальмологическом исследовании у животных оценивали величину зрачка и ширину глазной щели.

1.11.1. Изучение эмбриотоксического действия препарата «Аноцептин»

Исследование эмбриотоксического действия препарата «Аноцептин» проведено в 2 этапа на нелинейных белых крысах-самках весом 180-200 г. Первая группа самок получала внутривенно препарат в дозе 5 мг/кг, вторая -50 мг/кг. Препарат вводили с 1 по 19 день беременности. Животным контрольной группы в те же сроки вводили внутривенно 1,1%-ный раствор соды. В каждой экспериментальной группе было по 20 животных. Вскрытие самок осуществляли на 20 день беременности, при этом определяли количество желтых тел в яичниках, подсчитывали количество мест имплантации, резорбции и живых плодов.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием t-критерия Стъюдента и U-критерия Уилкоксона-Манна-Уитни.

На втором этапе исследования препарат «Аноцептин» вводили внутривенно с 1 по 21 день беременности в тех же дозах 5 и 50 мг/кг. Контрольным животным вводили 1,1%-ный раствор соды. В каждой группе было получено потомство от 15 самок. После родов в каждом помете оставляли не более 8 крысят для дальнейшего изучения физического развития потомства, скорости созревания сенсорно-двигательных рефлексов в период вскармливания, исследования эмоционально-двигательного поведения крысят после окончания периода вскармливания. Регистрировали размер помета, число живых и мертвых новорожденных, число особей разного пола, массу тела крысят на 4-й, 7-й, 14-й и 21-й дни после рождения,

а также сроки отлипания ушной раковины, появление первичного волосяного покрова, прорезывание резцов, открытие глаз, опускания семенников и открытия влагалища. Скорость созревания сенсорно-двигательных рефлексов в период вскармливания оценивали с помощью тестов: переворачивание на плоскости (2-4 дни), отрицательный геотаксис (5-6 дни), избегание обрыва (4-6 дни). Опыты проводили 1 раз в день в одно и то же время до полного формирования рефлексов по указанным тестам. При исследовании физического развития и скорости созревания сенсорно-двигательных рефлексов в период вскармливания для статистической обработки использовали (.-критерий Стъюдента и U-критерий Уилкоксона-Манна-Уитни. За единицу наблюдения при статистической обработке принимали помет. В возрасте 30 дней у потомства изучали эмоционально-двигательное поведение в тесте «открытое поле». Статистическую обработку по тесту «открытое поле» проводили по U-критерию Уилкоксона-Манна-Уитни, при этом за единицу наблюдения принимали одного крысенка. 1.11.2. Изучение влияния препарата «Аноцептин» на репродуктивную функцию

Исследование действия препарата «Аноцептин» на репродуктивную функцию было проведено на 120 нелинейных белых крысах массой 180-200 г. Наблюдение и оценку состояния животных проводили ежедневно. Аноцептин (50 мг/кг) вводили внутривенно. Контрольные животные получали внутривенно 1,1%-ный раствор соды. В течение 60 дней до спаривания с интактными самками самцам вводили аноцептин или 1,1%-ный раствор соды. Самкам введение препарата или 1,1%-ного раствора соды производили в течение 15 дней до спаривания с интактными самцами. После окончания введения препарата либо 1,1%-ного раствора соды самок подсаживали к соответствующей группе самцов в соотношении 2:1 сроком на 2 эстральных цикла (10 дней). Половину самок вскрывали на 18-21 дни беременности, подсчитывали количество желтых тел, мест имплантации, количество живых и погибших плодов. Вторую половину самок оставляли до родов, наблюдали за течением родов и физическим развитием потомства в период вскармливания. Индекс беременности рассчитывали как отношение числа беременных самок к числу самок, подсаженных к самцам, умноженное на 100%. За единицу наблюдения при статистической обработке принимали одну самку или один помет. Статистическую обработку результатов производили с использованием t-критерия Стъюдента и U-критерия Уилкоксона-Манна-Уитни.

1.12. Методы исследования, используемые для оценки влияния препарата «Аноцептин» на рост трансплантируемых опухолей

Рак Эрлиха привили 20 мышам под кожу правого бока в количестве 107 клеток в 0,1 мл физраствора. Спустя 48 часов после перевивки опухоли животных рандомизировали. Препарат «Аноцептин» (50 мг/кг) экспериментальным животным (п=10) вводили внутрибрюшинно. В контрольной группе (п= 10) внутрибрюшинно вводили физиологический раствор (0,125 мл/мышь). Общее количество инъекций - 10. Лимфосаркому

Плисса привили 20 крысам иод кожу правого бока в количестве 10% суспензии опухоли в 0,5 мл физиологического раствора. Спустя 48 часов после перевивки опухоли животных рандомизировали. Аноцептин (50 мг/кг) экспериментальным животным (п=10) вводили внутрибрюшинно. Животным контрольной группы (п=10) внутрибрюшинно вводили физиологический раствор (0,125 мл/крыса). Общее количество инъекций - 10. Длину н ширину опухолевых узлов измеряли регулярно. Объем опухоли рассчитывали по формуле: V=(a*b2)/2, где а - больший, ab- меньший линейный размер узла.

1.13. Оценка иирогенности препарата «Аноцептин»

Для испытаний препарат подогревали до 37°С и асептически вводили в ушную вену 3 кроликов в дозе 0,5 мл/кг медленно за 30 секунд. Температуру у кроликов измеряли электрическим медицинским термометром ТПЭМ-1 (допустимая основная погрешность от диапазона измеряемых температур ±1%) в фоне (до начала исследования) и три раза с промежутками в 1 час после введения.

1.14. Материалы и методы, используемые при изучении фармакокинетики препарата «Аноцентин»

Исследование проведено на 2-х беспородных собаках-самцах массой 23,3 и 24,5 кг, возраст 3-4 года (питомник «Рапполово»). Обе собаки получили внутривенно по 5 мл 2% аноцептина (общая доза 100 мг). Забор крови осуществляли до введения препарата, сразу после введения на 3-4 минуте, и далее через увеличивающиеся интервалы времени вплоть до 24 ч. Исследование проведено на образцах гепаринизированной плазмы крови. Количественное определение коменовой кислоты производили методом ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием. Работа выполнена на приборе «Gold System» (Beckman, США), включающем двойной насос (модель 126), спектрофотометрический детектор (модель 166), компьютер (486 DX4). Для описания фармакокинетики препарата в плазме крови были привлечены стандартные показатели (в их условных обозначениях, принятых в литературе (Соловьев В.Н. и др., 1980; Пиотровский В.К., 1985). 1.14.1. Методика оценки фармакокинетических показателей у здоровых добровольцев. Анализ фармакокинетических данных

В исследовании приняли участие 12 здоровых добровольцев, подписавших форму информированного согласия и соответствующих критериям включения в исследование. Все 12 человек были одновременно госпитализированы в стационар Института мозга человека РАН.

Аноцептин вводили внутривенно в общей дозе 60 мг. Образцы плазмы крови отбирали через 10, 20 и 30 мин, а также 1, 2, 4, 6, 8 и 10 часа после введения исследуемого вещества. Кроме того, у каждого из испытуемых брали одну пробу перед введением препарата и одну пробу через 1,5-3,0 мин после инъекции. Отбор образцов крови осуществляли в стеклянные гепаринизированные пробирки через катетер, введенный в вену. Объем каждой пробы составил 8 мл. Определение концентрации препарата в плазме крови проводили с помощью метода, разработанного на стадии доклинических исследований. Для описания фармакокинетики препарата

использованы стандартные показатели (Соловьев В.Н. и др., 1980; Пиотровский В.К. 1985; Беллман Р., 1987). Исследование было выполнено на базе психиатрического отделения Института мозга человека РАН совместно с Ю.И.Поляковым и И.К. Журкович.

РЕЗУЛЬТАТЫ

2.1. Исследование влияния оуабаина на потенциалочувствитсльность активационного воротного устройства медленных ^»1.8-каналов сенсорных нейронов снинальных ганглиев млекопитающих

Согласно рабочей гипотезе сигнальную (трансдукторную) функцию Ыа+,К+-АТФазы можно регулировать двумя путями: 1) непосредственно, когда мишенью атакующей молекулы - молекулы оуабаина - служит сама Ыа+,К+-АТФаза; 2) со стороны рецептора - фармакологическим агентом в этом случае может являться коменовая кислота либо лекарственный препарат, изготовленный на ее основе. Для доказательства первого предположения с помощью метода локальной фиксации потенциала исследовали влияние оуабаина (от 1 пмоль/л до 200 мкмоль/л) на величину эффективного заряда (Zeff) активационного воротного устройства медленных натриевых каналов Nav1.8 сенсорных нейронов спинальных ганглиев новорожденных крысят. В контроле эффективный заряд составил 6,67±0,59 (п=15). Экстраклеточное приложение 1 пмоль/л оуабаина на эффективный заряд практически не влияло (2сп=6,33±0,38; п=12). Оуабаин в концентрации 100 пмоль/л снижал Zcff до 5,06±0,33 (п=11). Аппликация 1 нмоль/л оуабаина вызывала снижение Ztif до 4,83±0,37 (п=15), 10 нмоль/л до 4,29±0,23 (n=15), 1 мкмоль/л до 4,1±0,22 (n=10). KD для оуабаина была рассчитана с помощью уравнения Хилла и составила 3 нмоль/л. Оуабаин в дозе 200 мкмоль/л на величину эффективного заряда и, как следствие, на потенциалчувствитсльность, активационного воротного устройства Nav1.8 канала не влиял. Значение Zefr не отличалось от контрольного и составило 6,67±0,57 (п=9). Исследование эффектов низких концентраций оуабаина показало, что влияние этого гликозида на эффективный заряд и, как следствие, на трансдукторную функцию №+,К+-АТФазы носит монотонный дозозависимый характер в диапазоне от 1 пмоль/л до 1 мкмоль/л. Снижение величины эффективного заряда активационного воротного устройства медленных натриевых каналов сохранялось на фоне предварительно добавленного в наружный раствор налтрексона (50 мкмоль/л). Полученный результат свидетельствовал о существовании возможности модуляции сигнальной функции №+,К+-АТФазы непосредственно, благодаря трансдуктор-опосредованному действию оуабаина. В аналогичных экспериментальных условиях обнаружено, что Кр для гидрохлорида морфина составляет 8 нмоль/л (Крылов Б.В. и др., 1999), а для производной гамма-пирона коменовой кислоты - 100 нмоль/л (Дербенев A.B. и др., 1999). Проведенные исследования и ранее полученные данные позволили предположить, что коменовая кислота и оуабаин, имея общее эффекторное

звено активационное воротное устройство медленных натривевых каналов, могут регулировать ноцицентивные сигналы и влиять на процесс восприятия боли.

В основе действия обоих соединений лежит модуляция сигнальной функции №+,К+-АТФазы мембраны сенсорных нейронов теплокровных. Эта функция фермента проявляется в регуляции процессов роста и пролиферации клеток тканей разных типов (Неннияйнен В.А. и др., 2003; Xie Z., Askari А., 2002; Schiener-Bobis G., 2002; Schoner W„ 2002a; Schoner W., 20002b; Schoner W., Schiener-Bobis G., 2005). Поэтому следующая часть работы была проведена in vitro при помощи метода органотинического культивирования ткани.

2.2. Сравнительный анализ действия сердечных гликозидов и коменовой кислоты на рост эксплантатов различных тканей куриного эмбриона

Для оценки участия Иа+,К+-АТФазы в качестве транедуктора сигнала в регуляции роста и развития клеток разных тканей в эмбриональный период онтогенеза использовали фармакологический анализ. В качестве фармакологических агентов были выбраны сердечные гликозиды: оуабаин, строфантин К и дигоксин.

В разных сериях опытов экспериментальными объектами были эксплантаты ткани сердца, спинальных ганглнев и сетчатки 10-12-дневных куриных эмбрионов. Исследуемые ткани характеризуются наличием разных изоформ а-субъединицы №+,К+-АТФазы, которые отличаются по чувствительности к сердечным гликозидам, в частности к оуабаипу. Оуабаин был исследован в широком диапазоне концентраций от 10* М до 10"в М. В опытах на эксплантатах ткани сердца 10-12-дневных куриных эмбрионов впервые выявлена эффективная концентрация оуабаина (10"'° М), сопоставимая с эндогенной, в которой гормон стимулировал пролиферацию кардиомиоцитов. Было доказано, что высокоаффинная к оуабаину аг изоформа №+,К*-АТФазы кардиомиоцитов участвует в регуляции кардиомоделирования. Оуабаин достоверно стимулировал рост эксплантатов исследуемой ткани на 33% в дозе 10"'° М. Прижизненно и на фиксированных препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, было обнаружено, что зона роста экспериментальных и контрольных эксплантатов состоит из кардиомиоцитов и небольшого количества фибробластов. Наблюдалась спонтанная сократительная активность кардиомиоцитов.

Ранее было показано, что гликозид в концентрации 10"'° М на 50% ингибируег рост нейритов спинальных ганглиев 10-12-дневных куриных эмбрионов (Пеннияйнен В.А и др., 2003). Оуабаин (10"'° М) практически не влиял на рост эксплантатов ткани сетчатки и недостоверно стимулировал их рост в концентрации 10" М и 10"'2 М. Необходимо отметить, что эти концентрации гликозида не оказывали существенного влияния на рост нейритов сенсорных нейронов (Пеннияйнен В.А. и др., 2003) и эксплантатов ткани сердца. Впервые обнаружено, что в концентрации 10"13 М оуабаин достоверно стимулирует рост эксплантатов ткани сетчатки 10-12-дневных

куриных эмбрионов. Значение ИП экспериментальных эксплантатов превышало контрольное на 34%. Проведенные исследования показали, что в концентрации 10~8 М оуабаин полностью угнетал рост нейритов сенсорных нейронов, эксплантатов ткани сердца и сетчатки 10-12-дневных куриных эмбрионов. Анализ полученных данных доказал, что действие оуабаина на рост исследуемых тканей является дозозависимым и тканеспецифичным. Гипотеза об участии №+,К+-АТФазы в регуляции роста нейритов сенсорных нейронов, эксплантатов ткани сердца и сетчатки в эмбриональный период онтогенеза получила экспериментальное подтверждение. По-видимому, оуабаин в низких «эндогенных» концентрациях модулирует функцию транедуктора сигнала, которую выполняет а^-изоформа а-субъединицы №+,К+-АТФазы. Эта изоформа Ка+,К'-ЛТФазы более чувствительна к оуабаину, чем «^-изоформа, активность которой оуабаин регулирует, начиная с концентрации 104 М (Dobretsov M.G. et al., 1999; Mathias R.T et al„ 2000; Mobashcri A. et al., 2000). Эти данные получены авторами при работе с нейронами спинальных ганглиев взрослых крыс. Необходимо отметить, что гомология а- и уЗ-субъединиц Ма+,К+-АТФазы млекопитающих и птиц составляет 92-95% (Fambrough D.M, Bayane E.K, 1983). В качестве препаратов сравнения были использованы строфантин К и дигоксин. Исследования последних лет показали, что эндогенный дигоксин выделяется в системный кровоток из коры надпочечников в концентрациях, не затрагивающих активность ионного насоса (Goto A. et al., 1991; Kelly R.A., Smith T.W., 1992; Schoner W., Schiener-Bobis G., 2005). Функция эндогенного дигоксина пока не ясна, однако есть данные, указывающие, что его выделение провоцирует рост эндотелия сосудов (Aperia А., 2008).

В концентрации 10"6 М строфантин К практически полностью угнетал рост всех исследуемых тканей. В дозах 10'7 М и 10"8 М ингибирующее рост действие строфантина К было менее выражено. В концентрации 10 М строфантин К на рост эксплантатов ткани сердца и нейритов сенсорных нейронов практически не влиял и недостоверно стимулировал рост эксплантатов ткани сетчатки. Впервые обнаружено, что строфантин К в концентрации 10"п М вызывал достоверную стимуляцию роста эксплантатов ткани сетчатки 10-12-дневных куриных эмбрионов и почти не влиял на рост эксплантатов ткани сердца и нейритов сенсорных нейроноЕ. Достоверное стимулирующее действие по отношению к эксплантатам ткани сердца препарат проявлял в концентрации 10~14 М и ниже. Таким образом, были обнаружены трофические свойства строфантина К. Действие препарата на рост эксплантатов исследуемых тканей, также как в случае с оуабаином, было дозозависимым и тканеспецифичным.

По отношению к ткани сердца дигоксин проявлял выраженное ингибирующее действие во всех исследуемых концентрациях. Дигоксин почти полностью блокировал рост нейритов сенсорных ганглиев и эксплантатов сетчатки. При введении в питательную среду сердечного гликозида в концентрациях

10"7М и 10~8М наблюдали достоверное угнетающее рост исследуемых тканей действие. В концентрации 10"9М

дигоксин незначительно угнетал роет эксплантатов ткани сетчатки. Введение в питательную среду дигоксина (Ю10 М) на рост эксплантатов не влияло. Впервые обнаружено, что дигоксин в концентрации Ю-" М достоверно стимулировал рост эксплантатов ткани сетчатки и практически не влиял на рост нейритов.

Результаты, полученные при изучении влияния строфантина К и дигоксина на рост эксплантатов ткани сердца, нейритов сенсорных ганглиев и эксплантатов ткани сетчатки, подтвердили предположение об участии №+,К+-АТФазы в регуляции роста эксплантатов исследуемых тканей. Влияние сердечных гликозидов было тканеспецифичным и дозозависимым. Необходимо отметить, что используемые концентрации дигоксина, строфантина К и оуабаина сопоставимы с концентрациями эндогенных дигиталисоподобных факторов в плазме крови. Проведенные исследования показали, что эксплантаты ткани сердца, сенсорные нейроны и эксплантаты сетчатки 10-12-дневных куриных эмбрионов более чувствительны к оуабаину, чем строфантину К и дигоксину.

Результаты экспериментов также свидетельствовали о том, что Na+,K+-АТФаза (по-видимому, я3-изоформа ее а-субъединицы) оказывает тонкое регуляторное действие на рост и пролиферацию клеток исследуемых тканей в эмбриональный период онтогенеза, выполняя функцию транедуктора сигнала.

В части экспериментов оценивали возможный механизм модуляции транедукторной функции №',К'-ЛТФазы молекулой оуабаина.

С помощью квантовохимических расчетов проведен полный конформационный анализ хелатных комплексов молекулы оуабаина с Са2+ в стехиометрии 1:1. В первом случае катион образует координационные связи с пятью атомами кислорода О1, О3, О5, О19 и О5, захватывая атомы кислорода стероидного кольца и рамнозильного остатка. Во втором случае ион Са2+ связан с тремя атомами кислорода О1, О11 и О19 стероидного кольца (Рогачевский И.В. и др., 2008). Возможность модуляции сигнальной функции Ка+,К'-АТФазы комплексом оуабаин-Са исследовали в экспериментальных условиях на эксплантатах ткани сердца и спинальных ганглиев 10-12-дневных куриных эмбрионов. Влияние хелатора ионов Са2+ ЭГТА на рост эксплантатов ткани сердца и нейритов сенсорных ганглиев 10-12-дневных куриных эмбрионов оценивали в диапазоне концентраций от 102М до 10"5М. При введении в питательную среду ЭГТА в концентрации 10~3 М наблюдали достоверное угнетение степени роста, как эксплантатов ткани сердца, так и нейритов сенсорных ганглиев. ИГ1 эксплантатов был ниже контрольного значения в среднем на 45,5%. При культивировании сенсорных ганглиев и эксплантатов ткани сердца в среде, содержащей ЭГТА (10 3 М) и оуабаин (10"8М), наблюдали почти полное снятие ингибирующего действия оуабаина. ИП эксплантатов сенсорных ганглиев и ткани сердца незначительно отличался от контрольного значения. Стимулирующий эффект оуабаина (1010 М) при культивировании эксплантатов ткани сердца в среде, содержащей оуабаин (10 loM) и ЭГТА (10 3М) также отсутствовал. ИП

экспериментальных эксплантатов практически не отличался от контроля. Для того чтобы оценить вклад рамнозильного остатка молекулы оуабаина в способность гликозида модулировать сигнальную функцию №+,К+-АТФазы в аналогичных экспериментальных условиях был исследован оуабагенин в концентрациях от 10"4 до 10"9 М. Гликозид регулировал рост эксплантатов ткани сердца и спинальных ганглиев дозозависимо. В концентрации 10"5 М оуабагенин достоверно угнетал рост нейритов сенсорных ганглиев и эксплантатов ткани сердца в среднем на 45% по отношению к контролю. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что чувствительность №+,К+-АТФазы нейритов сенсорных нейронов (Пеннияйнен В.А. и др., 2003) и кардиомиоцитов к оуабагенину гораздо ниже, чем к оуабаину. Действие оуабагенина, в отличие от оуабаина, не было тканеспецифичным. Со структурно-химической точки зрения оуабагенин является агликоном оуабаина. Указанные молекулы различаются только присутствием рамнозильного остатка в положении ЗД Чувствительность аминокислотной последовательности №+,К+-АТФазы рецептирующей сердечные гликозиды значительно повышается при наличии в атакующей молекуле рамнозильного остатка.

Отдельная часть работы была посвящена выявлению трофических и нейротрофических свойств производной гамма-пирона коменовой кислоты. Коменовую кислоту добавляли в питательную среду в диапазоне концентраций от 10"6 М до Ю"10 М. Коменовая кислота (10 6 М) достоверно угнетала рост эксплантатов ткани сетчатки на 24%. На рост нейритов коменовая кислота в этой концентрации действия не оказывала. Влияние коменовой кислоты в концентрации 10"6 М на рост эксплантатов ткани сердца оказалось противоположным. В этой концентрации субстанция достоверно стимулировала рост эксплантатов ткани сердца на 40% по отношению к контролю. На фиксированных препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, обнаружено, что в зоне роста присутствуют кардиомиоциты и небольшое количество фибробластов. В концентрации 10"7 М коменовая кислота угнетала рост эксплантатов ткани сетчатки незначительно, ИП эксплантатов был ниже контрольного значения на 17,5%. В этой дозе (10"7 М) субстанция достоверно стимулировала рост нейритов сенсорных нейронов. ИП был выше контрольного значения на 23%. Величина ИП эксплантатов ткани сердца в аналогичных условиях культивации была незначительно выше контрольного значения на 17% (р>0,05). Добавление в питательную среду коменовой кислоты в концентрации 1 (Ух М приводило к достоверной стимуляции роста эксплантатов ткани сетчатки и нейритов сенсорных нейронов на 18% и 81%, соответственно. Зона роста содержала нейриты сенсорных нейронов. На рост эксплантатов ткани сердца субстанция в этой концентрации влияния не оказывала. При введении в питательную среду коменовой кислоты в концентрации Ю~10 М наблюдали достоверную стимуляцию роста эксплантатов ткани сетчатки. ИП был выше контрольного значения на 58%. На фиксированных препаратах в зоне роста присутствовали клетки

пигментного эпителия сетчатки, палочки, колбочки, ганглиозные клетки. Рост нейритов сенсорных нейронов сохранялся на прежнем уровне. На рост эксплантатов ткани сердца препарат в этой концентрации не влиял. Проведенные исследования показали, что производная гамма пирона комсновая кислота обладает нейрогрофическими и трофическими свойствами. Действие субстанции является дозозависимым и тканеспецифичным. Наибольшую тропность комсновая кислота, как и оуабаин, проявила в отношении регуляции роста эксплантатов ткани сетчатки.

В части экспериментов в питательную среду вместе с коменовой кислотой в эффективной для каждого вида ткани концентрации добавляли оуабаин (10~8 М). При культивировании эксплантатов исследуемых тканей в среде, содержащей коменовую кислоту в эффективной для каждой ткани концентрации и оуабаин (108 М), оказалось, что коменовая кислота устраняла ингибиругощее действие оуабаина. ИГ1 экспериментальных эксплантатов ничем не отличался от контрольного значения. Последнее свидетельствует о том, что коменовая кислота модулирует сигнальную функцию №',К'-АТФазы не прямо, а опосредованно, через рецептор.

Дальнейшие исследования заключались в изучении фармакологической активности аноцептина - препарата, созданного на основе коменовой кислоты. Лекарственная форма аноцептина представляет собой 1% и 2% раствор для внутривенных инъекций, каждая ампула содержит 10 или 20 мг коменовой кислоты в 1 мл.

2.3. Оценка обезболивающего действия препарата «Аноцептин» и анальгина в условиях теста «горячая нластина»

Эксперименты показали, что препарат «Аноцептин» при внутривенном введении проявляет выраженное аналгезирущее действие (Таблица 1). Обнаружено, что обезболивающее действие аноцептина в условиях используемого теста имеет дозозависимый характер в диапазоне доз от 5 до 50 мг/кг (Таблица 1). Средняя эффективная доза препарата «Аноцептин» составила 25мг/кг. Латентный период появления двигательного беспокойства и прыжковой активности у животных, получивших аноцептин в дозе 5 мг/кг, или анальгин в дозе 50 мг/кг достоверно не отличались. В дозах 10 мг/кг и 50 мг/кг исследуемый препарат по болеутоляющей активности достоверно превосходил анальгин (50 мг/кг). Эффективность аналгезии в условиях теста «горячая пластина» сохранялась в течение 2-х часов после инъекции препарата «Аноцептин (Таблица 1).

Таблица 1. Влияние препарата «Аноцептин» и анальгина на болевую чувствительность мышей в условиях теста «горячая пластина», М±т

Препарат, доза Латентный период (секунды)

30 мин 60 мин 120 мин

Контроль (1,1% раствор соды) 10,5±0,9 10,8±0,6 11, J ±0,8

Аноцептин, 5 мг/кг 22,0±1,1* 21,7±0,7* 22,3±0,8*

Аноцептин, 10 мг/кг 31,8±0,7* 32,5±1,4* 33,7±1,2*

Аноцептин, 50 мг/кг 37,0±1,6* 37,2±1,9* 38,2±1,8*

Анальгин, 50 мг/кг 20,1±0,6* 22,1±1,8* 22,5±0,9*

*— достоверные различия с контролем, Р<0,05

2.4. Исследование свойств препарата «Аноцептин» н оуабаина в условиях формалинового теста

Формалиновый тест позволяет проследить реакции организма крысы на протяжении всего пути передачи ноцицептивного сигнала (Abbott F., Guy Е., 1995; Clavelou P., et al., 1995; Hong Y., Abbott F, 1995). Во время эксперимента, после подкожной инъекции 5% раствор формалина, у животных контрольной и экспериментальной групп наблюдали два вида боли: острую и тоническую. Первая фаза формалинового те ста характеризует острую боль, возникающую в ответ на инъекцию химического раздражителя (длится около 5 мин). Вторая фаза теста позволяет оценить тоническую боль, возникающую вследствие воспаления от действия формалина (время наблюдения 60-90 мин). Межфазный интервал составил около 10 мин. В этот период животное находилось в покое.

Контрольную группу составили 8 крыс, которым внутрибрюшинно вводили физиологический раствор. 11 экспериментальным крысам, внутрибрюшинно вводили аноцептин в дозе 35 мг/кг. Инъекция аноцептина (35 мг/кг) полностью подавила ответ на введение формалина у 4 из 11 крыс. У этих животных обезболивающее действие препарата фактически составило 100%. У 7 животных инъекция препарата вызвала подавление первой или второй фазы ответа. Обе фазы ответа (первая фаза характеризует острую боль, вторая -тоническую), оцениваемые на спинальном уровне по паттернам «сгибание+встряхивание» (Abbott F., Guy Е., 1995; Буткевич И.П., 2009), обнаружены у всех контрольных крыс и только у 4 животных, получивших инъекцию аноцептина. Болевая чувствительность в ответ на острую боль в контроле составила 17,1±0,3 (п=8), у экспериментальных животных она снизилась до 15,3 ±0,1 (п=4).

Обезболивающее действие аноцептина по отношению к тонической боли, возникающей при воспалении, было более значительным. В контроле болевая чувствительность на спинальном уровне составила 294,6± 1,4 (п=8). Применение аноцептина достоверно снижало болевую реакцию до 93,7 ±0,4 (п=4; р<0,05).

Ощущение боли на супраспинальном уровне характеризует длительность паттернов вылизывания (Abbott F., Guy Е., 1995; Буткевич И.П., 2009).

Животные, у которых имелись обе фазы ответа, отсутствовали. У 6 из 7 экспериментальных животных ответ на острую боль, которую характеризует первая фаза формалинового теста, на супраспинальном уровне не наблюдался, то есть инъекция аноцептина вызывала 100% обезболивание.

Вторая фаза формалинового теста, отражает тоническую боль, возникающую при воспалении, и на супраспинальном уровне наблюдалась только у 3 экспериментальных животных. У контрольных животных болевая реакция была 219,5±0,9 (п=8). Применение аноцептина снижало болевой ответ до 204,7 ±1,1 (п=3).

Практически полное блокирование комплекса реакций нервной системы крысы, возникающего в ответ, как на острую, так и на тоническую боль на спинальном и супраспинальном уровне, у животных является доказательством глубоких изменений в процессе передачи и рецепции ноцицептивной информации, развивающихся под влиянием аноцептина. Статистическая обработка результатов экспериментов показала их (статистическую значимость). Таким образом, аноценгин проявляет выраженное аналгетическое действие и модулирует ноцицептивный сигнал, как на периферии, так и в центральных структурах. Средняя эффективная доза препарата составила 17,5 мг/кг. Аналитический эффект развивался через 4 минуты после инъекции и сохранялся до 6 часов.

Анализ результатов, полученных в условиях формалинового теста, и в тесте «горячая пластина», позволил обнаружить, что аналгетические свойства разработанного препарата на спинальном уровне реализуются после его внутривенной или впутрибрюшинной инъекции в дозе 5 мг/кг. В дозе 50 мг/кг аноцептин купирует болевой синдром в целом. Получены экспериментальные доказательства, подтверждающие способность препарата «Аноцептин» проникать через гематоэнцефалический барьер и адекватность применения инъекционной лекарственной формы.

Внутрнбрюшинная инъекция оуабаина в дозе 0,3 мг/кг вызывала достоверное снижение болевой чувствительности у крыс. На спинальном уровне оуабаин в 2 раза снижал реакцию крыс, развивающуюся в первой фазе формалинового теста в ответ на острую боль. Число паттернов сгибания+встряхивания в контроле составило 39,3±0,2, после инъекции препарата - 17,1±0,3 (п=6; р<0,05). Продолжительность паттернов вылизывания в первой фазе формалинового теста также снижалась с 30,6±0,3 в контроле до 21,3 ±0,1 (п=6). Исследование показало, что оуабаин достоверно уменьшает ответ организма крысы на ноцицептивный раздражитель на фоне острой боли на спинальном уровне. На супраспинальном уровне обезболивающее действие гликозида в первой фазе формалинового теста, оцениваемое по изменению продолжительности паттернов вылизывания, выражено менее.

Обнаружено, что гликозид регулирует восприятие ноцицептивного стимула на спинальном и супраспинальном уровне, на фоне болевой реакции, возникающей при воспалении. Оуабаин в 5 раз уменьшал число паттернов сгибания+встряхивания (354,3±59 в контроле; 71,7±13,6 в эксперименте, п=6; р<0,05) во вторую, тоническую фазу ответа в формалиновом тесте и

продолжительность паттернов вылизывания-в 4 раза (158,5±24,9 в контроле; 42,8±17,9 в эксперименте, п=6; р<0,05). Необходимо отметить, что у всех экспериментальных животных был выявлен не только аналгетический, но и седативный эффект препарата. Таким образом, in vivo нашла подтверждение гипотеза о том, что оуабаин в низких, сопоставимых с эндогенными, концентрациях может оказывать болеутоляющее действие.

С помощью формалинового теста доказана возможность регуляции ноцицептивного сигнала in vivo, в основе которой лежит фармакологическая модуляция сигнальной функции Ыа+,К+-АТФазы.

Общим свойством препаратов, вызывающих лекарственную зависимость, является интенсификация реакции самостимуляции (СС) (Буров Ю.В., Борисенко С .А., 1978; Звартау Э.Э., 1979; Звартау Э.Э., Паткина H.A., 1974; Шабанов П.Д., Штакельберг О.Ю., 2001; Carlezon W.A., Wise R.A., 1993). Поэтому, чтобы оценить возможность формирования физической зависимости от применения препарата «Аноцептин», было проведено специальное исследование.

2.5. Исследование возможности формирования физической зависимости от применения препарата «Аноцептин» с помощью метода стимуляции латерального гипоталамуса

В опытах на крысах оценивали реакцию СС структур мозга, входящих в систему положительного подкрепления гипоталамуса. Аноцептин угнетал реакцию СС латерального гипоталамуса в дозах 1, 10 30 мг/кг. Внутрибрюшинная инъекция препарата достоверно снижала вознаграждающий эффект СС. Действие аноцептина было пропорционально его дозе. В дозе 1 мг/кг препарат практически не влиял на реакцию СС. Аноцептин в дозе 10 мг/кг угнетал реакцию СС. Число нажатий на педаль было ниже контрольного значения на 12%. Максимальный эффект обнаружен при инъекции аноцептина в дозе 30 мг/кг. Препарат уменьшал число нажатий на педаль на 40% по сравнению с контролем. Ослабление реакции СС, вызванное препаратом, проявлялось сразу после его инъекции. Таким образом, обнаружено, что аноцептин не вызывает усиления реакции СС, а, наоборот, подавляет ее. Такой же подавляющий эффект исследуемого препарата на реакцию СС был получен при повторных его инъекциях. Исследование показало, что физическая зависимость от введения препарата «Аноцептин отсутствует.

2.6. Эффективность препарата «Аноцептин» при лечении экспериментальных туберкулезных хориоретинитов

Поскольку коменовая кислота, действующая субстанция препарата «Аноцептин», наибольшую тропность проявила в отношении тканей нейронального происхождения, для экспериментов по дальнейшему исследованию фармакологической активности препарата «Аноцептин» была выбрана модель туберкулезного хориоретинита (Беллиндир Э.Н., 1971). Эта модель объединяет в себе компонент воспаления и элементы деструктивных изменений в клетках ткани сетчатки.

2.6.1. Действие «Аноцеитина» на M.tuberculosis iit vitro.

Антимикробным действием на М, tuberculosis препарат «Аноцептин» в дозах от 200 до 1,56 мкг/мл не обладал.

Предварительные исследования показали, что аноцептин при парабульбарном введении не проявляет раздражающих свойств, не оказывает негативного влияния на структуры переднего отрезка глаза. Инъекции препарата были безболезненными.

2.6.2. Результаты эффективности лечения экспериментальных туберкулезных хориорегинитов по офтальмоскопическим признакам

Эффективность лечения экспериментальных хориорегинитов оценивали по офтальмоскопическим признакам и гистоморфологической каргине. Эффективность проводимой терапии в основной серии для размера очага составила 25%, для уровня проминенции 130%, для уровня экссудации 124%. В контрольной серии значения этих параметров составили 4%, 53% и 109%, соответственно. У животных контрольной серии сохранялись помугнения и инфильтрация в стекловидном теле. Полученные данные свидетельствуют о том, что препарат «Аноцептин» достоверно повышает эффективность ПТТ по всем исследуемым параметрам и сочетается с антибиотиками. Для проявления противовоспалительных свойств необходим курс препарата. Эффект, в отличие от аналгетического, развивается не сразу.

2.6.3. Результаты гистологических исследований тканей глазного дна экспериментальных животных с туберкулезными хориоретинитами

Анализ 164 гистоморфологических срезов, полученных с 40 глаз кроликов опытной и контрольной серий, показал, что во всех глазах присутствовали туберкулезные гранулемы в хориоидее, которые располагались рядом с диском зрительного нерва или миелиновым волокном. Изменения сегчатки просматривались на препаратах всех глаз; основные изменения касались вершины очага, где сетчатка была частично, либо полностью разрушена, с деструкцией пигментного эпителия. В 33 % случаев в основной серии исследования пигментный эпителий имел свою нормальную структуру даже на периферии очага, а в 90% - в перифокальной зоне, что не наблюдалось ни в одном случае контрольной серии. В гистологических срезах контрольной серии определялась деструкция пигментного эпителия с выходом пигмента из клеток.

Изучение фармакологической активности препарата «Аноцептин» in vivo позволило выявить и оценить его болеутоляющее действие и обнаружить противовоспалительные и трофотропные свойства.

Для того чтобы рекомендовать препарат для применения в клинических условиях, необходимо было оценить безопасность его действия. 2.7. Токсикометрия при изучении острой токсичности

Результаты токсикомегрии, данные наблюдений за экспериментальными животными в постинтоксикационном периоде острого отравления, а также данные некропсии позволили отнести лекарственную форму препарата «Аноцептин» к V классу практически нетоксичных лекарственных веществ (Hodge Н., et al. Clinical Toxicology of Commercial Products. Acute Poisoning. Ed.

IV, Baltimore, 1975, 427 p.; Сидоров K.K. 1973). Индексы легальных доз, выявленные в исследовании на мышах-самцах: ДЦ5о = 1064+100 мг/кг, ЛД,А = 656±60 мг/кг; ЛД84 = 1440+110 мг/кг. Индексы летальных доз для мышей-самок были несколько выше: ЛД50 =1190±100 мг/кг; ЛД|6 = 900+80 мг/кг; ЛД84 = 1570±110 мг/кг.

Дозозависимые летальные эффекты препарата «Аноцептин», выявленные в исследовании на крысах, наблюдались при значениях ЛД50 = 1300±150 мг/кг; ДД16 = 450±50 мг/кг; ЛД§4 = 1850±200 мг/кг. Половых различий не обнаружено. Состояние животных, переживших острую интоксикацию, свидетельствовало о хорошей переносимости и безвредности препарата в дозах, превышающих максимальные терапевтические для человека в десятки раз.

В дальнейших экспериментах оценивали безопасность препарата при хроническом внутривенном введении.

2.8. Исследование безопасности препарата «Аноцептин» при хроническом 90-дневном внутривенном введении

На протяжении 90 дней крысам в хвостовую вену ежедневно вводили аноцептин в 3-х дозах: 5, 100 и 300 мг/кг. Оценивали общее состояние животных. Различий между животными трех экспериментальных и контрольной группы по массе тела, потреблению пищи и воды, поведению животных и их состоянию не обнаружено. Половых различий по переносимости препарата и различий, связанных с уровнем его дозирования, не было.

При хроническом 90-дневном введении крысам аноцептина в дозах 5, 100 и 300 мг/кг веса формирование зависимости от приема препарата и пристрастия к нему не обнаружено. Величина зрачка и ширина глазной щели у животных контрольной группы и у экспериментальных животных практически не менялись в течение всего периода наблюдения. Угнетение дыхания, ригидность мышц туловища, рвота у экспериментальных животных не наблюдались. Синдром «отмены» не наблюдался.

Исследование безопасности препарата «Аноцептин» при хроническом 90-дневном внутривенном введении в дозах 5, 100 и 300 мг/кг показало, что препарат безопасен, хорошо переносится, не имеет наркогенного потенциала.

2.9. Экспериментальные исследования по изучению эмбриотоксического действия препарата «Аноцептин» и его влияния на репродуктивную функцию животных

2.9.1 Результаты изучения эмбриотоксического действия препарата «Аноцептин»

На первом этапе исследования гибели или других признаков токсикоза у крыс-самок экспериментальных и контрольной групп не обнаружено. Достоверных различий в темпах прироста массы тела беременных самок опытных и контрольной групп также не было.

Инъекции препарата «Аноцептин» в дозе 50 мг/кг в течение всей беременности не вызвали достоверного увеличения пред- и постимплантационной смертности. Внешний осмотр плодов, изучение

состояния внутренних органов и скелета каких-либо аномалий и отставания в росте и развитии плодов всех исследуемых групп не выявил.

На втором этапе исследования самкам экспериментальных групп вводили аноцептин в дозах 5 и 50 мг/кг с 1 по 20 дни беременности. Темпы прироста массы тела беременных крыс в изучаемых группах достоверно не отличались, гибели самок не было. Отклонения в протекании бсременносги, родов, заботе о потомстве в исследуемых группах отсутствовали.

Среднее количество плодов на одну самку и соотношение крысят по полу в экспериментальных и контрольной группах достоверно не отличалось. Проведенные исследования показали, что сроки отлипания ушной раковины, появления первичного волосяного покрова, прорезывания резцов, опускание семенников и открытия влагалища в контрольной и 2-х экспериментальных группах достоверно не различаются. Тератогенных свойств у препарата не обнаружено. Изучение скорости созревания сенсорно-двигательных рефлексов в период вскармливания не выявило различий между потомством экспериментальных и контрольной групп. Исследование эмоционально-двигательного поведения 30-дневного потомства крыс в тесте «открытое ноле» показало, что длит ельность латентного периода, число пересеченных квадратов, количество подъемов на задние лапы и заглядываний в отверстия, число актов фумши а, эмоциональный фон в контрольной и экспериментальных группах не различались.

Проведенные исследования показали, что эмбриотоксического действия у препарата «Аноцептин» нет.

2.9.2. Результаты изучения влияния препарата «Аноцептин» на репродуктивную функцию

В период введения препарата «Аноцептин» в дозе 50 мг/кг не обнаружено снижения темпов прироста массы тела, изменений в поведении, гибели животных ни в одной из изучаемых групп самцов или самок. При вскрытии самок экспериментальных групп не выявлено повышения уровней пред- и постимплантационной смертности по сравнению с соответствующими контрольными группами. Внутривенное введение аноцептина в дозе 50 мг/кг не влияло на репродуктивную функцию с.амцов и самок крыс их плодовитость, а также пре- и постнатальное развитие, полученного потомства. Индекс беременности в изучаемых группах достоверно не отличался. Таким образом, были получены экспериментальные доказательства того, что аноцептин при внутривенном применении не влияет на репродуктивную функцию экспериментальных животных.

Поскольку с помощью метода органотипической культуры ткани было обнаружено, что действующая субстанция препарата «Аноцептин» коменовая кислота регулирует процессы роста и пролиферации клеток разных тканей, далее исследовали влияние препарата на рост трансплантируемых опухолей.

2.10. Влияние препарата «Аноцептин» на рост трансплантируемых опухолей

Исследования на мышах и крысах показали, что препарат «Аноцептин» не влияет на рост трансплантируемых опухолей - рака Эрлиха и лимфосаркомы Плисса.

Чтобы оценить может ли внутривенное введение аноцептина вызывать повышение температуры тела, было проведено специальное исследование.

2.11. Исследование пирогенности

Сумма повышения температуры у трех кроликов составила 0,6°С, что, в соответствии с требованиями ГФ XI, вып. 2, свидетельствует об отсутствии пирогенности у препарата «Аноцептин».

2.12. Результаты фармакокинетического исследования

2.12.1. Результаты исследования фармакокинетики препарата «Аноцептин» на животных

При внутривенном введении аноцептина собакам фармакокинетика препарата в плазме крови описывается 3-компартментной зависимостью. Первая фаза распределения протекает стремительно. За первые 10 минут из плазмы крови уходит около 95% препарата. Следующая фаза длится с 10 минуты и до начала 2-го часа. Среднее время присутствия препарата в организме - показатель MRT - составляет 5,5—6,0 часов. Высокие значения таких показателей, как клиренс (450-500 мл/кг/ч) и стационарный объем распределения (2,5 л/кг) свидетельствуют о том, что препарат очень активно распределяется из системного кровотока. Отсюда следует, что большая часть препарата, вероятно, не выводится, а подвергается метаболизму и утилизируется в самом организме. Учитывая химическую природу коменовой кислоты (наличие в ее структуре гидроксильной и карбоксильной групп), возможными ее метаболитами могут быть комплексные соединения с катионами металлов.

2.12.2. Результаты исследования фармакокинетики препарата «Аноцептин» у здоровых добровольцев ;

При внутривенном введении аноцептина здоровым людям изменение концентрации действующего вещества - коменовой кислоты - в плазме крови на основном участке описывается 2-х или 3-х частевой зависимостью (рис.1 и рис.2). Фаза распределения протекает быстро. В течение первых 10 минут концентрация снижается примерно в 4-5 раз, а в течение первого часа - в 200 раз. После 1-го часа, по-видимому, наступает фаза истинной элиминации с периодом полувыведения порядка 2.0-2.5 ч. MRT - лежит в диапазоне от 0,5 до 1,0 час. Клиренс - около 1000 мл/кг/ч. Основная часть препарата, не выводится, а матаболизируется и утилизируется в самом организме. Возможными метаболитами могут быть комплексные соединения с катионами металлов. Характер полученных кинетических кривых заставляет предположить, что фармакокинетика аноцептина определяется сочетанием кинетических и метаболических процессов. При высоких концентрациях основную роль играют распределение и выведение, а при низких - мегаболизм. Следует отметить высокий уровень индивидуального разброса, особенно на

участке, на котором можно предполагать доминирующую роль метаболических процессов. Возможно, именно эти процессы определяют судьбу препарата в организме в долгосрочном плане.

При изучении безопасности обнаружено, что препарат «Аноцептин» в исследуемых дозах (10, 20, бОмг/в сутки) при рекомендованном курсе лечения (10 дней) безопасен. Аноцептин не обладает раздражающим действием в местах инъекций, аллергических реакций в ходе исследования не выявлено. Препарат не оказывает негативного действия на нервную, пищеварительную, дыхательную, сердечно-сосудистую, выделительную, репродуктивную системы (Поляков Ю.И. и др., 2007; Ро1уакоу Уи. I, е1 а1, 2008).

Особое внимание было уделено клинической оценке возможных проявлений развития физической и психической зависимости. При структурированной беседе и клиническом обследовании ни у одного добровольца признаков психофизической зависимости, наблюдаемых при приеме наркотических аналгетиков, выявлено не было. Результаты исследования подтвердили данные доклинического исследования об отсутствии у препарата наркогенного потенциала (Поляков Ю.И. и др., 2007; Ро1уакоу Уи. I., й а1„ 2008).

.Я-

^ 60 120 1Й0 240 300 360

4 -{■. .... ........

........ *

I

Рис. I. Испытуемый № 3

С, мкг/мп

t

Время, мин

? " " -..... -

ео 120 180 240 300 360

f

■I-

Рис. 2. Испытуемый № 7

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования позволили теоретически и экспериментально обосновать новое перспективное направление - создание аналгетических средств, механизм действия которых основан на фармакологической модуляции сигнальной функции №т,К+-АТФазы нейронов ЦНС. Тест-системой для исследований в экспериментах in vitro, осуществляемых с помощью patch-clamp метода, стал ансамбль, состоящий из 3-х (Крылов Б.В. и др., 1999) или 2-х звеньев. В первом случае ноцицептивные сигналы при прохождении через систему, включающую в себя опиоидоподобный рецептор - Na ,К -АТФазу (трансдуктор) - Ыау1.8-канал (эффекторное звено) можно регулировать рецептор-оноредованно при помощи коменовой кислоты. Во втором случае ансамбль составляют два звена - №+,Кт-АТФаза и Ыау1.8-канал. Оуабаин в концентрациях, сопоставимых с эндогенными, регулирует ноцицептивные сигналы трансдуктор-опосредованно. Впервые на сенсорных нейронах ЦНС млекопитающих удалось получить доказательства того, что Ыат,К+-АТФаза одновременно может выполнять функции рецептора к сердечным гликозидам и трансдуктора ноцицептивных сигналов, функционируя в ансамбле с Nav1.8-каналом. Участие №~,К~-АТФазы в модуляции ноцицептивных сигналов нашло свое подтверждение в условиях формалинового теста. Анализ полученных данных показал, что физиологическая роль эндогенного оуабаина заключается в трансдуктор-опосредованной регуляции ноцицептивной информации на разных этапах онтогенеза, при стрессе и развитии воспалительного процесса.

Исследование участия №+,1С-АТФазы в регуляции роста и развития клеток разных тканей в эмбриональный период онтогенеза подтвердило, что сигнальную функцию фермента также можно модулировать двумя путями. В первом случае фармакологическими агентами были оуабаин, строфантин К, дигоксин. Сочетание теоретических квантовохимических расчетов и метода

органотипической культуры ткани позволило доказать, что наличие в молекуле оуабаина рамнозильного остатка определяет тканеспецифичность сердечного гликозида, повышает аффинность Кта~,К -АТФачы к этому стероиду и увеличивает вероятность модуляции сигнальной функции фермента. Во втором случае сигнальную функцию фермента рецептор-оиосредованно модулировала производная гамма-пирона коменовая кислота. Наибольшую троиность исследуемые вещества проявили в отношении регуляции роста и пролиферации клеток тканей нейронального происхождения. Результаты экспериментов свидетельствуют о том, что ягизоформа «-субьединицы №+,К'-АТФазы оказывает тонкое регуляторнос действие на рост и пролиферацию клеток возбудимых тканей в эмбриональный период онтогенеза, выполняя функцию транедуктора сигнала.

Благодаря проведенным исследованиям разработан оригинальный лекарственный препарат с аналгетической активностью, механизм действия которого связан с рецептор-опосредованной модуляцией сигнальной функции фермента. Доказана его безопасность и эффективность. Взаимодействие лиганда (хелатного комплекса натриевой соли коменовой кислоты) с рецептором мембраны ноцицеитивных нейронов сиинальных ганглиев служит сигналом для активации ансамбля: оииоидоподобный рецептор -АТФаза (транедуктор) - №у1.8-канал (эффекторное звено). Аноцептин проникает через гематоэнцефалический барьер, аналгетический эффект наступает через 4 минуты после попадания препарата в кровоток и сохраняется до 6 часов. Обнаружены противовоспалительный и трофотропный эффекты препарата. Эти эффекты отставлены во времени и развиваются постепенно после курса инъекций аноцептина. Доказано, что применение препарата «Аноцептин» не вызывает активации системы положительного подкрепления латерального гипоталамуса. При длительном парентеральном введении аноцептина не отмечается развитие лекарственной зависимости, наркогенный потенциал у препарата отсутствует. На модели экспериментального туберкулезного хориоретинита показано, что препарат «Аноцептин» достоверно повышает эффективность стандартной терапии, хорошо сочетается с антибиотиками и позволяет сохранить клетки пигментного эпителия сетчатки в зоне параспецифичсского воспаления.

Аналгетические свойства аноцептина реализуются за счет снижения потенциалочувствительности активационного воротного устройства №у1.8-канала. Проведенные исследования позволили теоретически и экспериментально обосновать новое перспективное направление - создание аналгетичсских средств, обладающих противовоспалительными свойствами, механизм действия которых основан на фармакологической модуляции сигнальной функции Ыа+,К+-АТФазы.

выводы

1. Оуабаин в концентрациях, сопоставимых с эндогенными, модулирует сигнальную функцию №+,К+-АТФазы. Наличие рамнозильного остатка в молекуле гликозида определяет его тканеспецифичность и повышает аффинность Ка+,К+-АТФазы мембраны клеток разных типов к оуабаину.

2. При трансдуктор-опосредованной модуляции оубаином Ыа+,К+-АТФазы происходит снижение потенциалочувствительности активационного воротного устройства Nav1.8 каналов мембраны ноцицептивных нейронов спинальных ганглиев, что свидетельствует о способности гликозида регулировать ноцицептивные сигналы.

3. Сигнальная функция Ыа+,К+-АТФазы заключается в обеспечении модуляции процесса кодирования ноцицептивных сигналов ансамблем: опиоидоподобный рецептор - На\КЛАТФаза - №у1.8-канал (либо Ыа+,К+-АТФаза - Nav1.8-Kanaa) мембраны ноцицептивных нейронов спинальных ганглиев и регуляции тканевого моделирования на различных этапах онтогенеза.

4. При регуляции процессов роста и пролиферации кардиомиоцитов и клеток ткани сетчатки и роста нейритов сенсорных нейронов в эмбриональный период онтогенеза оуабаин в эндогенных концентрациях по эффективности превосходит строфантин К, дигоксин, оуабагеннн и сопоставим с комсновой кислотой.

5. По своему действию на потенциалочувствительность активационного воротного устройства медленных натриевых каналов мембраны ноцицептивных нейронов коменовая кислота близка к влиянию сердечного гликозида оуабаина.

6. На основе производной гамма-пирона коменовой кислоты создан препарат «Аноцептин». Инъекция аноцептина мышам в тесте «горячая пластина» и крысам в формалиновом тесте оказывает выраженное болеутоляющее действие. Аналгстический эффект препарата проявляется через 4-6 минут после парентерального введения и сохраняется до 6 часов. В дозах, оказывающих аналгетическое действие, аноцептин угнетает реакцию самостимуляции латерального гипоталамуса крысы, что свидетельствует об отсутствии у животных лекарственной зависимости от препарата. Терапевтический индекс аноцептина в экспериментах на крысах соответствует 64. У препарата отсутствуют канцерогенные и тератогенные свойства. Аноцептин апирогенен.

7. После парабульбарного введения аноцептина в течение 10 дней проявляется противовоспалительный эффект препарата. В опытах in vitro аноцептин не обнаружил антимикробной активности в отношении микобактерий туберкулеза. Использование аноцептина при комплексной химиотерапии экспериментального туберкулезного хориоретинита сопровождается повышением эффективности лечения за счет уменьшения воспалительных явлений в очаге поражения. Аноцептин, оказывая активирующее влияние на трофические процессы в сетчатке, на фоне комплексной противотуберкулезной

терапии экспериментальных туберкулезных хориоретннитов способствует сохранению клеток пигментного эпителия как в зоне параспецифичсского воспаления (в 90%), так и в области очага (в 33%).

8. Безопасность действия аноцентина в терапевтических дозах подтверждена в клиническом исследовании. Препарат в дозах, вызывающих анапестическое действие, у здоровых людей не оказывает побочного влияния на нервную, пищеварительную, дыхательную, сердечно-сосудистую, выделительную системы, не обладает раздражающим действием в местах инъекций. Отсутствует психофизическая зависимость при длительном приема препарата.

9. Распределение препарата при внутривенном введении у здоровых добровольцев описывается 2-х или 3-х компартментной зависимостью. Аноцептин быстро исчезает из системного кровотока, в течение первых 10 минут концентрация препарата снижается в 4-5 раз. Среднее время присутствия препарата в организме лежит в диапазоне от 0,5 до 1,0 час. Клиренс - около 1000 мл/к г/ч. Основная часть препарата, не выводится, а магаболизируется и утилизируется в самом организме.

10. На основе изучения влияния соединений, изменяющих активность Na+,K+-АТФазы, разработана новая методология поиска и изучения обезболивающих препаратов, механизм действия которых основан на модуляции сигнальной функции этого фермента.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

ПАТЕНТЫ

1. Крылов Б.В., Лопатина Е.В. «Синтетическое анальгетическое средство и способ лечения на основе этого средства» патент РФ № 2322977 приоритет от 01.08. 2006 МПК А61 КОЗ 1 /351А61Р029/02 дата публикации 27.04.2008. Бюллетень изобретений. № 12- 2008. - С. 1-24.

2. Крылов Б.В., Лопатина Е.В «Анальгетическое средство и способ лечения болевого синдрома различной этиологии с помощью этого средства» патент РФ № 2367432 приоритет от 27.09.2007 МГ1К А61КА61Р дата публикации 20.09.2009. Бюллетень изобретений. - 2009. № 26 - С. 1-25.

3. Лопатина Е.В., Карецкий A.B., Крылов Б.В. «Регенерирующее противовоспалительное средство и способы лечения с помощью этого средства» патент РФ № 2362554 приоритет от 27.09.2007 МПК А61КА61Р дата публикации 27.07.2009. Бюллетень изобретений. № 21 - 2009. - С. 1-27.

СТАТЬИ В ЖУРНАЛАХ, РЕКОМЕНДОВАННЫХ ВАК 1. Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Зайка A.A. Исследования участия Ыа+,К+-АТФазы в регуляции роста эксплантатов ткани сердца в органотипической культуре. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2005. Т. 140. № 8. С. 150-153.

2. Пеннияйнен В.А., Лопатина E.B. Исследование роли Иа+,К+-АТФазы в регуляции роста нейритов сенсорных нейронов. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2005. Т. 139, № 2. С. 147-160.

3. Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Цырлин В.А. Сравнительный анализ действия сердечных гликозидов на роста эксплантатов ткани сердца. Российский Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2005. Т. 91. № 11. С.1299-1304.

4. Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В., Цырлин В.А., Крылов Б.В. Влияние ингибиторов натриевого насоса на рост нейритов сенсорных ганглиев. Российский Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2008. Т.94. №3. С. 326-330.

5. Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Рогачевский И.В., Крылов Б.В. Фармакологическая модуляция трансдукторной функции №+,К+-АТФазы Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2008. Т.146. №10. С. 416-418.

6. Лопатина Е.В., Карецкий A.B., Пеннияйнен В.А., Виноградова Т.В. Участие сердечных гликозидов в регуляции роста эксплантатов ткани сетчатки. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2008. Т.146. №12. С. 651-653.

7. Рогачевский И.В., Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Крылов Б.В. Неэмпирический конформационный анализ хелатных комплексов молекулы оуабаина с Са2+ и возможный механизм модуляции трансдукторной функции Na+, К+-АТФазы. Журнал общей химии. 2008. Т.78. Вып. 10. С. 1673-1683.

В. Penniyainen V.A., Lopatina E.V., Tsyrlin V.A., Krylov B.V.The effects of sodium pump inhibitors on sensory ganglion neurite growth //Neurosci. and Behav. Physiol. 2009. Vol.39. N. 3. - P. 301-304.

9. Кипенко A.B., Пеннияйнен B.A., Лопатина E.B., Рогачевский И.В., Цырлин В.А., Крылов Б.В. Роль оуабаина в регуляции роста тканей разных типов. Российский Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2009. Т.95. №2. С. 137-142.

ПУБЛИКАЦИИ

10. Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Шевцова Е.С. Роль Ка',К.'-АТФазы, как регулятора процессов роста в клетках разных типов. Конгресс ассоциации кардиологов стран СНГ «Фундаментальные исследования и прогресс в кардиологии», СПб. 2003 г. Научно-практический ж. Кардиология СНГ Т. 1. С. 173.

11. Крылов Б.В., Щеголев Б.Ф., Лопатина Е.В., Буткевич И.П., Отеллин В.А. Новый метод купирования опиатного абстинентного синдрома. Роль медленных натриевых каналов. Фундаментальные науки - медицине. Москва (10-11 декабря) 2003. С.39-40.

12. Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Зайка A.A. Исследование роли сердечных гликозидов в регуляции роста кардиомиоцитов. Ill Всероссийская с международным участием Школа-конференция по физиологии кровообращения, Москва. 2004. С.55-56.

13. Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А. Участие сердечных гликозидов в регуляции роста кардиомиоцитов. XIX съезд физиологического общества им. И.Г1. Павлова. Российский Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2004. Т. 90. № 8. С. 442-443.

14. Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В. Исследование участия Na', К+-АТФазы в регуляции роста клеток разных типов в органотипической культуре ткани. Сборник статей Международная конференция, посвященная юбилею И.П. Павлова, Минск. 2004. С. 298-299.

15. Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В., Карецкий А.В., Хокканен В.М., Крылов Б.В. Влияние оуабаина и норадреналина на рост клеток сетчатки в органотипичсской культуре ткани. Сборник статей конференции, посвященной 60-летию Института глазных болезней им. Гсльмгольца, Москва. 2004. С.25-26.

16. Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В., Карецкий А.В., Хокканен В.М., Крылов Б.В. «3 изоформа Na/K-АТФазы модулирует процессы роста клеток сетчатки. XIX съезд физиологического общества им. И.П. Павлова. Российский Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2004. Т. 90. № 8. С. 331-332.

17. Карецкий А.В., Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В., Хокканен В.М., Крылов Б.В. Перспективы лечения осложнений хориоретинитов, в том числе туберкулезного характера. "Современные возможности диагностики и лечения витреоретинальной патологии", Москва 27 мая 2004 года. Сб. науч. Статей по материалам науч.-пр. конф. - М.: "Экономика", 2004. С. 49-50.

18. Карецкий А.В., Лопатина Е.В., Крылов Б.В., Пеннияйнен В.А., Хокканен В.М. Влияние Q-134 на рост клеток сетчатки в органотипичсской культуре ткани // Клеточные технологии в офтальмологии: регенеративная медицина и трансплантация тканей в офтальмологии: материалы международ, конф. - М., 2005. - С. 26-27.

19. Karetsky A.V., Lopatina E.V., Penniyaynen V.A. аЗ-izoform of Na+, K+-ATPase modulates process of cells growth in the chicken retina, Humboldt-Kolleg Conference "Technologies of the 21st century: biological, physical, informational and social aspects", Saint-Petersburg. 2005. P.30.

20. Lopatina E.V., Tsyrlin A.V. The influence of cardiac glycoside on the growth of explantat of cardiac tissue Humboldt-Kolleg Conference "Technologies of the 21st century: biological, physical, informational and social aspects" Saint-Petersburg. 2005. P.54-55.

21. Рогачевский И.В., Плахова В.Б., Лопатина Е.В., Буткевич И.П., Крылов Б.В. Принципы создания новых лекарственных препаратов: от молекулряной физиологии до клинического эффекта // Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности: Сб. трудов 2-й междунар. науч.-практ. конф. /Под ред. А.П.Кудинова и др.- Т.6. Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования, образование. СПб.: Изд-во Политехи. Ун-та, 2006. С. 169-183.

22. Лопатина Е.В., Карецкий A.B., Пенниянен В.А., Хокканен В.М., Крылов Б.В. Моделирование процесса пролиферации клеток сетчатки теплокровных. Морфология. 2006. Т .129. №2. С .55.

23. Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Крылов Б.В., Цырлин В.А. Na/Ka -АТФаза модулирует синтетические процессы в тканях разных типов. Физиологическое общество им И.П.Павлова. Съезд XX, Москва. 4-8 июня, 2007,- М.: Издат. дом «Русский врач», 2007. С.311-312.

24. Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Виноградова Т.В. Участие Na+, К+-АТФазы в регуляции роста ткани сетчатки в органотииической культуре. Всероссийская конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и инновации в технических университета», Санкт-Петербург. 10-12 октября, 2007. С. 189.

25. Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А.Физиологическая роль эндогенного оуабаина.// Гормональные механизмы адаптации: Программа и тезисы Всероссийского симпозиума с международным участием «Гормональные механизмы адаптации» (Посвящается памяти проф. A.A. Филаретова), Санкт-Петербург, 3-5 октября, 2007,- СПб.: Ин-т физиологии им. И.П. Павлова, 2007. С.49-50.

26. Карецкий A.B., Хокканен В.А., Лопатина Е.В. Использование метода органотипической культуры ткани в экспериментальной офтальмологии // Новейшие достижения в лечении и диагностике глазных заболеваний. - М., 2007. -С.45-46.

27. Рогачевский И.В., Плахова В.Б., Лопатина Е.В., Крылов Б.В. Технология создания новых лекарственных препаратов на основе производных гамма-пирона // Новые технологии и их применение. 2007. N 3. С. 46-53.

28. Поляков Ю.И., Лопатина Е.В., Короткое А.Д. Механизм действия и специфическая фармакологическая активность нового синтетического ненаркотического анальгетического средства - препарата "Аноцецтин". Конференция «Фундаментальные науки медицине» - Москва, 3-4 декабря 2007 г.

29. Лопатина Е.В., Карецкий A.B., Пеннияйнен В.А., Крылов Б.В. Новые подходы к лечению дистрофических заболеваний сетчатки глаза.// Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга. Санкт-Петербург, 10-12 сентября, 2008.- СПб.-Колтуши: Ин-т физиологии им. И.П. Павлова, 2008. С. 82.

30. Lopatina E.V., Penniyaynen V.A., Plakhova V.B., Butkevich LP., Tsyrlin V.A. Endogenous ouabain controls analgesic function of sodium pump.// The 2nd St.-Petersburg Humboldt-Kolleg Conference «Technologies of the 21st Century: Biological, Physical, Informational and Social Aspects». Saint-Petersburg. October 7-9,2008. P. 21-22.

31. Лопатина E.B., Пеннияйнен В.А., Плахова В.Б., Подзорова С.А., Кипенко A.B., Крылов Б.В., Цырлин В.А. Физиологическая роль сигнальной функции №,К-АТФазы // II съезд физиологов СНГ, Кишинев, Молдова, 2830 октября 2008.

32. Кипенко A.B., Пеннияйнсн В.А., Лопатина E.B. О возможности образования хслатного комплекса оуабаин-Са2'.// Второй всероссийский форум студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и инновации в технических университетах». Санкт-Петербург. 28-31 октября, 2008. С. 172173.

33. Лопатина Е.В., Карецкий A.B., Крылов Б.В. Синтетический нснаркотический анальгетик «Аноцептин» Симпозиум «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств». Фундаментальные науки новым лекарствам. ОАО «Московская типография № 6». Москва, 9-11 июня 2008. С.117-118,

34. Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В., Панова Т.Н., Крылов Б.В. Новый механизм модуляции роста нейритов: роль коменовой кислоты. Питания експериментальноТ та клничноУ медицини зб1рник статей, 2008, Випуск 12, Том 1 С. 120-125.

35. Кипенко A.B., Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В. Исследование действия коменовой кислоты на состояние сердечно-сосудистой системы теплокровных животных // Материалы конференций политехнического симпозиума «Молодые ученые - промышленности северо-западного региона». - Санкт-Петербург, 22 мая, 2009. - С. 166-167.

36. Лонатина Е.В., Плахова В.Б., Шелых Т.Н., Рогачевский И.В., Пеннияйнен В.А., Подзорова С.А., Крылов Б.В. Ионные механизмы кодирования ноцицептивных сигналов. Биологические мембраны. 2009. Т. 26. № 4. С. 319.

37. Лопатина Е.В Рецептор-опосредованная фармакологическая модуляция сигнальной функции №+,К~-АТФазы. Механизмы функционирования висцеральных систем. VII Всероссийская конференция с международным участием, посвященная 160-летию со дня рождения И.П.Павлова. - 2009. - 29 сентября-02 октября. Санкт-Петербург. Издательство ООО «Турусел». Россия. С.249.

38. Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Кипенко A.B., Цырлин В.А. Физиологическое значение рамнозильного остатка в молекулах сердечных гликозидов. VII Всероссийская конференция с международным участием, посвященная 160-летию со дня рождения И.П.Павлова. - 2009. - 29 сентября-02 октября. Санкт-Петербург. Издательство ООО «Турусел». Россия. С.250-251.

39. Рогачевский И.В., Лонатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Крылов Б.В. Квантовохимические механизмы лиганд-рецепторного связывания молекулы уабаина с №+,К+-АТФазой возбудимых клеток. VII Всероссийская конференция с международным участием, посвященная 160-летию со дня рождения И.Г1.Павлова. - 2009. - 29 сентября-02 октября. Санкт-Петербург. Издательство ООО «Турусел». Россия. С. 370-371.

Подписано в печать 04.02.2010 Формат 60x90/16. Объем 1,125 усл.п.л. Печать ризографическая. Бумага офсетная. Тираж 120 экз. Заказ № 35

Отпечатано в типографии ООО "Фирма "Стикс" 196128, Санкт-Петербург, ул. Кузнецовская. 19

Актуальность проблемы. Проблема аналгезии привлекает особое внимание исследователей и клиницистов. Несмотря на наличие в арсенале современной медицины широкого круга лекарственных препаратов, обладающих аналгетическими свойствами, изучение фундаментальных механизмов, лежащих в основе кодирования и восприятия ноцицептивных сигналов с целью создания принципиально новых лекарственных средств, остается по-прежнему актуальным.

Большинство субстанций, претендующих на роль лекарственных препаратов, выявляют с помощью одного из трех подходов: 1) химическая модификация известных молекул; 2) скрининг биологической активности большого количества натуральных продуктов, ряда ранее открытых химических структур, больших «библиотек» пептидов или нуклеиновых кислот; 3) направленный синтез (рациональный дизайн лекарств), основанный на понимании биологических механизмов реализации их эффектов и химической структуры мишеней (Катцунг Б.Г, 1998).

Создание полусинтетических и синтетических агонистов и антагонистов опиатов является примером первого подхода. Второй подход можно проиллюстрировать созданием препаратов, представляющих собой пептидные биорегуляторы. Пример реализации третьего подхода - создание ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента, которое стало возможным благодаря изучению связи между строением и действием блокаторов активного сайта фермента и компьютерному конструированию гипотетической химической структуры лекарства.

Для создания нового лекарственного препарата, относящегося к группе аналгетиков, наряду с общепринятыми способами может использоваться и принципиально иной подход. В его основе лежит исследование возможности фармакологической модуляции сигнальной функции Ма+,К+-АТФазы при прохождении ноцицептивного сигнала в сенсорном нейроне спинального ганглия в системе: опиоидоподобный рецептор — Ыа+,К+-АТФаза - Nav1.8-канал (Крылов Б.В. и др., 1999). Первая стадия формирования болевого ощущения связана с активацией тканевых периферических рецепторов, так называемых ноцицепторов, кодирующих информацию не только о болевом воздействии, но и сигналы других модальностей. Ноцицептивные сигналы передаются по афферентным волокнам группы С и Ag через сенсорные нейроны спинальных ганглиев. Эти темные ноцицептивные нейроны (их размер не превышает 30 мкм) представляют собой клетки, характеризующиеся наличием опиоидных, опиоидоподобных и неопиоидных рецепторов и высокой плотностью медленных натриевых каналов (Gold M.S., et al., 1996). Медленные тетродотоксиннечувствительные натриевые каналы (Nav1.8) определяют процесс кодирования ноцицептивных сигналов в афферентах и сенсорных нейронах (Borovikova L.V., et al., 1997; Cardenas C.G., et al., 1997).

Модуляторы активности медленных натриевых каналов являются субстанциями, применение которых представляется перспективным с точки зрения разработки новых аналгетических лекарственных препаратов, поскольку анальгезирующие агенты, независимо от первичной мишени воздействия, избирательно снижают их функциональную активность (Brau М.Е., et al., 2001; Ogata N., Ohishi Y., 2002).

Механизм болеутоляющего действия наркотических аналгетиков (наиболее эффективных соединений) обусловлен влиянием препаратов на разных уровнях прохождения ноцицептивного сигнала. Аналгезия на спинальном уровне осуществляется за счет взаимодействия опиоидного соединения с //-, 3- или If- рецепторами. Опиоидные рецепторы вовлечены в однотипный механизм сигнализации, включающий в себя опиоидный рецептор - G белок - кальциевый или калиевый канал (Катцунг Б.Г., 1998). G белок в этом механизме выполняет функцию транедуктора, усиливая величину сигнала при передаче ноцицептивной информации от рецептора к ионному каналу, а также передавая его на геном. При этом изменяются системы вторичных посредников, связанных с током кальция, ингибированием аденилатциклазы и стимуляцией синтеза G белков (Катцунг Б.Г., 1998). Повышение уровня экспрессии G белков стимулирует синтез опиоидных рецепторов и увеличение числа ионных каналов.

Модуляция ноцицептивного сигнала может оцениваться по снижению потенциалочувствительности активационного воротного устройства медленных натриевых каналов сенсорных нейронов спинального ганглия, которая возникает вследствие уменьшения величины эффективного заряда. Исследование механизма кодирования ноцицептивного сигнала в системе опиоидоподобный рецептор - №+,К+-АТФаза - Navl .8-канал (Крылов Б.В. и др., 1999) с помощью метода локальной фиксации потенциала (patch-clamp метод) показало, что не только наркотические аналгетики оказывают влияние на этот процесс. Эффективность гидрохлорида морфина (Крылов Б.В. и др.,

1999) была сопоставима с эффективностью производных гамма-пирона (Derbenev A.V. et al., 2000; Рогачевский И.В. и др., 2006, Плахова В.Б., Карымова Е.А., 2007). При этом оказалось, что на фоне блокаторов G белков эффекты исследуемых соединений сохранялись. Приложение налтрексона или оуабаина к наружной стороне мембраны сенсорного нейрона устраняло влияние изученных соединений на эффективный заряд воротного устройства медленного натриевого канала (Крылов Б.В. и др., 1999; Derbenev A.V. et al.,

2000). Были получены экспериментальные доказательства участия Na+,K+-АТФазы в модуляции ноцицептивного сигнала (Крылов Б.В. и др., 1999; Derbenev А. V. et al., 2000).

Фармакологическая модуляция сигнальной (трансдукторной) функции №+,К+-АТФазы при помощи производных гамма-пирона может позволить направленно регулировать ноцицептивные сигналы и зарегистрировать обезболивающий эффект соединения in vivo. Последнее открывает перспективы для создания аналгетического препарата нового класса.

Как трансдуктор сигнала Na ,К -АТФаза участвует не только в регуляции ноцицепции, но и в модуляции! роста и пролиферации клеток разных тканей (Пеннияйнен В.А. и др., 2003; Xie Z., Askari А., 2002; Schiener-Bobis G., 2002; Schoner W., 2002a; Schoner W., 20002b; Schoner W., Schiener-Bobis G., 2005). Ее активность в организме человека и животных регулируют эндогенные дигиталисоподобные факторы, выделяющиеся в кровь в наномолярных концентрациях. Возможно, эндогенные стероиды могут модулировать сигнальную функцию №+,К+-АТФазы в системе опиоидоподобный рецептор — Na+,K+-АТФаза - Nav 1.8-канал и изменение функциональной активности №+,К+-АТФазы будет оказывать как аналгетический, так и иные эффекты.

Цель исследования. Исследовать болеутоляющий эффект и изменение пролиферативной активности клеток разных тканей при фармакологической модуляции сигнальной функции №+,К+-АТФазы и разработать оригинальный лекарственный препарат с аналитической активностью, механизм действия которого связан с модуляцией этой функции фермента.

Задачи:

1. Исследовать участие Ыа+,К+-АТФазы в модуляции ноцицептивных сигналов в системе опиоидоподобный рецептор — Na+,K+-АТФаза — Nav1.8-канал.

2. Исследовать действие эндогенного блокатора №+,К+-АТФазы оуабаина на процессы роста и пролиферации нейритов сенсорных нейронов, ткани сердца и сетчатки глаза 10-12-дневных куриных эмбрионов.

3. Выявить физиологическую роль рамнозильного остатка в молекуле оуабаина. t

4. Исследовать действие препаратов группы сердечных гликозидов как экзогенных блокаторов №+,К+-АТФазы на процессы роста и пролиферации нейритов сенсорных нейронов, ткани сердца и сетчатки глаза 10-12-дневных куриных эмбрионов.

5. Исследовать действие производной гамма-пирона коменовой кислоты как экзогенного модулятора Ыа+,К+-АТФазы на процессы роста и

11 пролиферации нейритов сенсорных нейронов, ткани сердца и сетчатки глаза 10-12-дневных куриных эмбрионов.

6. Исследовать аналитическую активность коменовой кислоты в экспериментах in vivo.

7. На основе коменовой кислоты разработать лекарственную форму препарата, обладающего аналгетическим эффектом и реализующего свои свойства за счет модуляции сигнальной функции Na^K ' -АТФазы.

8. Оценить фармакологическую активность препарата «Аноцептин» в экспериментах invitroиinvivo.

9. Изучить возможность формирования лекарственной зависимости при длительном введении препарата «Аноцептин».

10. Изучить безопасность действия и фармакокинетику препарата «Аноцептин» в исследованиях на животных и человеке.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработана методологическая система поиска и изучения обезболивающих препаратов, механизм действия которых основан на модуляции сигнальной функции Na+,K+-ATOa3bi.

2. Сигнальная . функция Ыа+,К+-АТФазы проявляется в модуляции ноцицептивных сигналов. ансамблем: опиоидоподобный рецептор -На+,К+-АТФаза - Ыау1.8-канал (либо Na^K'-АТФаза - Г\Гау1.8-канал) и регуляции процесса тканевого моделирования: на различных этапах онтогенеза;.

3. Оуабаин в концентрациях, сопоставимых с эндогенными^ модулирует сигнальную функцию Ма+,К+-АТФазы. Наличие в молекуле оуабаина рамнозильного остатка повышает аффинность Ма+,К+-АТФазы к этому сердечному гликозиду и определяет тканеспецифичность действия гликозида.

4. При регуляции процессов роста и пролиферации в эмбриональный период развития оуабаин по эффективности превосходит строфантин К, дигоксин, оуабагенин и сопоставим с коменовой кислотой. Трофотропные эффекты оуабаина и коменовой кислоты наиболее выражены в отношении ткани сетчатки.

5. На основе производной гамма-пирона коменовой кислоты создан препарат «Аноцептин», обладающий аналгетической и противовоспалительной активностью и не вызывающей лекарственной зависимости и выраженных побочных эффектов при его длительном (90 суток) парентеральном введении.

Научная новизна. Доказано, что №+,К+-АТФаза как трансдуктор участвует в модуляции ноцицептивных сигналов в системе опиоидоподобный рецептор - Ка+,К+-АТФаза — Ыау1.8-канал и направленной регуляции процесса тканевого моделирования. Показано, что физиологическое значение эндогенных дигиталисоподобных факторов ^ заключается в регуляции* этих процессов на разных этапах онтогенеза. Обнаружено, что оуабаин в концентрациях, сопоставимых с эндогенными, участвует в регуляции ноцицептивных сигналов в ансамбле №+,К+-АТФаза - 1.8-канал мембраны сенсорных нейронов спинальных ганглиев млекопитающих.

Наличие в молекуле оуабаина* рамнозильного остатка повышает аффинность №+,К+-АТФазы к этому гликозиду на пять порядков. При регуляции процессов роста и пролиферации в эмбриональный период развития оуабаин по эффективности превосходит строфантин К, дигоксин, оуабагенин и сопоставим с коменовой кислотой.

Установлено, что трофотропные эффекты оуабаина.и коменовой кислоты» наиболее выражены в отношении ткани сетчатки.

Действие препарата «Аноцептин»,- разработанного на основе коменовой кислоты, основано на рецептор-опосредованной регуляции сигнальной функции Ыа+,К+-АТФазы сенсорных нейронов спинальных ганглиев. Доказана его эффективность как аналгетического средства. Обнаружен противовоспалительный эффект препарата. Применение препарата «Аноцептин» не вызывает активации системы положительного подкрепления латерального гипоталамуса. Лекарственная зависимость при длительном парентеральном введении препарата не формируется. Побочные эффекты при использовании аноцептина в аналитических дозах не проявляются.

Теоретически и экспериментально обосновано новое перспективное направление создания аналгетических средств, механизм действия которых основан на фармакологической модуляции сигнальной функции №+,К+-АТФазы.

Научно-практическое значение работы. Разработана методологическая система поиска и изучения обезболивающих препаратов, механизм действия которых основан на модуляции сигнальной функции №+,К+-АТФазы.

Создана лекарственная форма принципиально нового отечественного препарата «Аноцептин», относящегося к классу аналгетиков. Отчет о доклиническом исследовании безопасности, фармакокинетики и фармакологической активности препарата «Аноцептин» (лекарственная форма , в виде 1- и 2% раствора для внутривенных инъекций) представлен в Фармакологический комитет Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской.Федерации. На основании разрешения Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития N 185 от 03 05.2007 г. в Институте мозга человека РАН < проведено исследование безопасности и фармакокинетики препарата «Аноцептин» в клинических условиях. Безопасность препарата для организма человека клинически доказана. Отчет о клиническом исследовании безопасности и фармакокинетики представлен в ФГУ Научный центр экспертизы средств медицинского применения Росздравнадзора РФ и утвержден (протокол N12 от 5 июня 2009 г.). Выпуск препарата планируется в виде 1 и 2% раствора для инъекций в ампулах объемом 1, 2 и 5 мл. Получены патенты Российской Федерации: патент РФ № 2322977 «Синтетическое анальгетическое средство и способ лечения на основе этого средства», приоритет от 01.08.2006, авторы: Крылов Б.В., Лопатина Е.В; патент РФ № 2367432 «Анальгетическое средство и способ лечения болевого синдрома различной этиологии с помощью этого средства», приоритет от 27.09.2007, авторы Крылов Б.В., Лопатина Е.В.; патент РФ № 2362554 «Регенерирующее противовоспалительное средство и способы лечения с помощью этого средства», приоритет от 27.09.2007, авторы: Лопатина Е.В., Карецкий A.B., Крылов Б.В.

Основные положения диссертации используются в научно-исследовательской работе научно-исследовательского отдела экспериментальной физиологии и фармакологии ФГУ «ФЦСКИЭ им. В. А. Алмазова», Института физиологии им И.П. Павлова РАН, экспериментальных исследованиях отделения туберкулеза глаз ФГУ «СПбНИИФ», научно-клинической работе Института Мозга человека РАН, педагогической работе кафедры общей физиологии биолого-почвенного факультета СПбГУ.

Под руководством д.х.н. И.Н. Домнина налажен промышленный синтез коменовой кислоты на базе ФГУП «СКТБ» «Технолог». Лабораторный регламент изготовления готовой лекарственной формы препарата адаптирован к промышленным условиям. Экспериментальные партии препарата «Аноцептин» произведены на базе НИИ ОЧБ и ООО «НТФФ» «Полисан».

Апробация работы. Результаты работы доложены на: конгрессе ассоциации кардиологов стран СНГ «Фундаментальные исследования и прогресс в кардиологии», СПб, 18-20 сентября 2003 г.; Научно-практической конференции «Фундаментальные науки - медицине», Москва, 10-11 декабря

2003 и 3-4 декабря 2007 г.; 1П Всероссийской с международным участием Школе-конференции по физиологии кровообращения, Москва. 27-30 января

2004 г.; Международной конференции «Проблемы интеграции функций в физиологии и медицине (к 100-летнему юбилею присуждения Нобелевской премии академику И.П.Павлову)», Минск, 15-16 июня 2004 г.; XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова, Екатеринбург. 20-24 сентября

2004 г.; Конференции "Современные возможности диагностики и лечения витрео-ретинальной патологии", Москва, 27 мая 2004 г.; Международной конференции «-Клеточные технологии в офтальмологии», Москва, 16-17 марта

2005 г.; Humboldt-Kolleg Conference «Technologies of the 21st Centuiy: Biological,

Physical, Informational and Social Aspects», SPb, September 27-29 2005 г.; I съезде физиологов СНГ, Сочи, 19-23 сентября 2005 г.; Международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности» [Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования, образование], СПб, 7-9 февраля 2006 г.; V Международной конференции по функциональной нейроморфологии (Колосовские чтения — 2006), СПб. 2006 г.; на XX Съезде Физиологического общества им И.П. Павлова, Москва, 4-8 июня, 2007 г.; Всероссийском симпозиуме с международным участием «Гормональные механизмы адаптации» (Посвящается памяти проф. A.A. Филаретова), СПб, 3-5 октября, 2007 г.; Конференции «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга», СПб. 10-12 сентября, 2008 г.; Всероссийском симпозиуме по фармакологии «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств. Фундаментальные науки новым лекарствам», Москва, 9-11 июня 2008 г.; The 2nd St.-Petersburg Humboldt-Kolleg Conference «Technologies of the 2Ist Century: Biological, Physical, Informational and Social Aspects», SPb. October 7-9, 2008; II съезде физиологов СНГ, Кишинев, 29-31 октября, 2008 г.; международной конференции «Висцеральные системы», СПб, 29 сентября-2 октября 2009 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 научных работ в отечественной и зарубежной печати и три патента РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 203 страницах машинописного текста, иллюстрирована 45 рисунками, содержит 45 таблиц. Работа построена по стандартному плану и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, методы, результаты исследований, обсуждение результатов, выводы и список литературы, включающий 53 отечественных и 95 зарубежных источников.

VI. выводы

1. Оуабаин в концентрациях, сопоставимых с эндогенными, модулирует сигнальную функцию Ка+,К+-АТФазы. Наличие рамнозильного остатка в молекуле гликозида определяет его тканеспецифичность и повышает аффинность Ыа+,К+-АТФазы мембраны клеток разных типов к оуабаину.

2. При трансдуктор-опосредованной модуляции оубаином Ыа+,К+-АТФазы происходит снижение потенциалочувствительности активационного воротного устройства Иау1.8 каналов мембраны ноцицептивных нейронов спинальных ганглиев, что свидетельствует о способности гликозида регулировать ноцицептивные сигналы.

3. Сигнальная функция На+,К+-АТФазы заключается в обеспечении модуляции процесса кодирования ноцицептивных сигналов ансамблем: опиоидоподобный рецептор - Ка+,К+-АТФаза - №У1,8-канал (либо №+,К+-АТФаза — №У1.8-канал) мембраны ноцицептивных нейронов спинальных ганглиев и регуляции тканевого моделирования на различных этапах онтогенеза.

4. При регуляции процессов роста и пролиферации кардиомиоцитов и клеток ткани сетчатки и роста нейритов сенсорных нейронов в эмбриональный период онтогенеза оуабаин в эндогенных концентрациях по эффективности превосходит строфантин К, дигоксин, оуабагенин и сопоставим с коменовой кислотой.

5. По своему действию на потенциалочувствительность активационного воротного устройства медленных натриевых каналов мембраны ноцицептивных нейронов коменовая кислота близка к влиянию сердечного гликозида оуабаина.

6. На основе производной гамма-пирона коменовой кислоты создан препарат «Аноцептин». Инъекция аноцептина мышам в тесте «горячая пластина» и крысам в формалиновом тесте оказывает выраженное болеутоляющее действие. Аналитический эффект препарата проявляется через 4-6 минут после парентерального введения и сохраняется до 6 часов. В дозах, оказывающих аналгетическое действие, аноцептин угнетает реакцию самостимуляции латерального гипоталамуса крысы, что свидетельствует об отсутствии у животных лекарственной зависимости от препарата. Терапевтический индекс аноцептина в экспериментах на крысах соответствует 64. У препарата отсутствуют канцерогенные и тератогенные свойства. Аноцептин апирогенен.

7. После парабульбарного введения аноцептина в течение 10 дней проявляется противовоспалительный эффект препарата. В опытах in vitro аноцептин не обнаружил антимикробной активности в отношении микобактерий туберкулеза. Использование аноцептина при комплексной химиотерапии экспериментального туберкулезного хориоретинита сопровождается повышением эффективности лечения за счет уменьшения воспалительных явлений в очаге поражения. Аноцептин, оказывая активирующее влияние на трофические процессы в сетчатке, на фоне комплексной противотуберкулезной терапии экспериментальных туберкулезных хориоретинитов способствует сохранению клеток пигментного эпителия как в зоне параспецифического воспаления (в 90%), так и в области очага (в 33%).

8. Безопасность действия аноцептина в терапевтических дозах подтверждена в клиническом исследовании. Препарат в дозах, вызывающих аналгетическое действие, у здоровых людей не оказывает побочного влияния на нервную, пищеварительную, дыхательную, сердечно-сосудистую, выделительную системы, не обладает раздражающим действием в местах инъекций. Отсутствует психофизическая зависимость при длительном приема препарата.

9. Распределение препарата при внутривенном введении у здоровых добровольцев описывается 2-х или 3-х компартментной зависимостью. Аноцептин быстро исчезает из системного кровотока, в течение первых 10 минут концентрация препарата снижается в 4-5 раз. Среднее время присутствия препарата в организме лежит в диапазоне от 0,5 до 1,0 час. Клиренс - около 1000 мл/кг/ч. Основная часть препарата, не выводится, а матаболизируется и утилизируется в самом организме.

10. На основе изучения влияния соединений, изменяющих активность Na+,K+-АТФазы, разработана новая методология поиска и изучения обезболивающих препаратов, механизм действия которых основан на модуляции сигнальной функции этого фермента.