Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Фармакологическая коррекция дисфункции эндотелия и ишемии миокарда в условиях экспериментального дефицита магния

На правах рукописи

005053474 >

\ м

ЖЕЛТОВА АНАСТАСИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ ДИСФУНКЦИИ ЭНДОТЕЛИЯ И ИШЕМИИ МИОКАРДА В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ДЕФИЦИТА МАГНИЯ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Волгоград 2012 1 8 ОКТ 2012

005053474

Работа выполнена в Государственном образовательном бюджетном учреждении высшего профессионального образования Волгоградский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Спасов Александр Алексеевич Академик РАМН,

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Резников Константин Михайлович Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой фармакологии ГОУ ВПО ВГМА им. Н.Н. Бурденко

Дудченко Галина Петровна доктор биологических наук, профессор

кафедры теоретической биохимии с курсом клинической биохимии ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России

Ведущая организация:

ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В.Закусова» РАМН.

Защита диссертации состоится « ?>> а 201 ¿-г. в // ч. на заседании Дис-

сертационного Совета Д 208.008.02 ГБОУ ВПО Волгоградский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения РФ (400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, 1).

С диссертацией можно ознаком!ггься в библиотеке ГБОУ ВПО Волгоградский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения РФ

Автореферат разослан « д 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Бабаева Аида Руфатовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Заболевания системы кровообращения являются одними из наиболее распространенных и часто приводящими к смерти и инвалндизации [Mozañarian D. е.а., 2008; Ford E.S. е.а., 2012]. Это определяет важность выяснения факторов их возникновения и возможностей коррекции и профилактики. Хотя значительное число механизмов, вовлеченных в развитие патологических изменений в системе кровообращения уже установлены [Griendling К.К., 2003; Stocker R., 2004; Скальный A.B., Рудаков И. А., 2004; Di Marzio D., 2006; Minuz Р. е.а., 2006; Razzouk L. е.а., 2012; Siontis G.C. е.а., 2012], но многое еще остается неясным. Дефицит магния может существенно повысить риск развития сосудистых патологий (артериальной ги-пертензии, ишемической болезни сердца, сердечных аритмий, атеросклероза и тромбоэмболии периферических сосудов), а также заболеваний, приводящих к развитию сосудистых осложнений, в том числе, метаболического синдрома и сахарного диабета 2 типа [Johnson S., 2001, Al-Delaimy W.K. е.а., 2004; Hordyjewska A., Pasternak K., 2004; Nielsen F.H. e.a., 2007; Rayssiguier Y. e.a., 2010; Champagne C.M., 2008]. В то же время, ряд лекарственных средств, применяемых при сердечно-сосудистых заболевания (диуретики, сердечные гликозиды), повышают вероятность развития недостаточности магния [Holzmacher R. е.а., 2005]. С другой стороны, дефицит магния может снижать терапевтическую эффективность и повышать токсичность сердечных глико-зидов и других лекарственных средств [Schwinger R.H. е.а., 1992; Crippa G. е.а., 1999]. В связи с этим значительно повысился интерес к выявлению механизмов взаимосвязи между недостаточностью магния и развитием сердечно-сосудистых заболеваний [Yo-koyama T. е.а., 2003; Петров В.И. и др., 2006; Иежица И.Н. и др., 2007; Nagai N. е.а., 2007; Спасов A.A. и др., 2007; Wolf F.I. е.а., 2008; Ferré S. е.а., 2010].

Известно, что недостаток магния в организме приводит к активации воспалительных процессов [King D.E. е.а., 2005; Mazur А. е.а., 2007]. Одним из основных механизмов повреждения ткани сосудов в этом случае является интенсивная продукция макрофагами/нейтрофилами в процессе «дыхательного взрыва» активных форм кислорода (АФК) [Touyz R.M., 2000]. Таким образом, повреждение сосудов вначале носит характер окислительного повреждения [Minuz Р. е.а., 2006]. Недостаток магния усиливает окислительное повреждение тканей за счет подавления активности антиок-сидантной системы (АОС) клеток,- в первую очередь, её глутатион-зависимого звена [Blache D. е.а., 2006; Mahabir S. е.а., 2008]. При активации воспалительных процессов изменяется спектр продукции цитокинов, что сказывается на функциональной и про-

лиферативной активности эндотелиальных и гладкомышечных клеток сосудов [Wolf F.I. е.а., 2008]. Одновременно недостаточность магния изменяет способность клеток формировать ответ на внешние стимулы. Естественным последствием дефицита магния является развитие дисфункции эндотелия [Wolf F.I. е.а., 2008; Paravicini Т.М. е.а., 2009], дополнительно усиливающейся окислотельным стрессом [McQuaid К.Е., Keenan А.К., 1997; Tawfik Н.Е. е.а., 2008]. В свою очередь, развитие эндотелиальной дисфункции и системное воспаление могут взаимно усиливать друг друга [Corti R. е.а., 2003]. Таким образом, известно, что дефицит магния индуцирует в организме развитие воспалительных реакций, дисфункции эндотелия и окислительного стресса -важнейших механизмов, вовлеченных в патогенез поражения кровеносных сосудов [Stocker R., 2004; Heistad D.D., 2006; Song Y. е.а., 2007; Bunte М.С. е.а., 2008]. Однако причинно-следственные связи между этими тремя патологическими процессами в ходе развития повреждения сосудов при дефиците магния до сих пор точно не установлены.

Таким образом, к настоящему времени степень вероятной взаимосвязи между дисфункцией эндотелия, активацией системного воспаления и выраженностью окислительного стресса при алиментарном дефиците магния изучена недостаточно. Это делает комплексную оценку взаимосвязи указанных патологических процессов между собой при развитии дефицита магния, влияние их на системные физиологические изменения в сердечно-сосудистой системе и возможности коррекции указанных нарушений различными солями магния важной и актуальной научной проблемой.

' Диссертационная работа является составной частью научно-исследовательской программы «Фундаментальные исследования и научное обоснования создания и использования препаратов на основе природного бишофита в медицине, гигиене и санитарии» (регистрационный номер 01.2006 09438), включенной в план НИР Волгоградского государственного медицинского университета. Тема работы утверждена на заседании Учёного Совета Волгоградского государственного медицинского университета (протокол № 8 от 15.04.2009 г.).

Целью настоящего исследования являлось сравнительное экспериментальное изучение влияния некоторых неорганических и органических солей магния на дисфункцию эндотелия, активацию системного воспаления, окислительный стресс, изменения тромбогенного потенциала крови, нарушения сократимости миокарда, развивающиеся в условиях алиментарного дефицита магния, а также изучение кардиопро-тективных свойств этих солей.

Для достижения указанной цели представлялось необходимым решить следующие задачи:

1. Изучить скорость компенсации гипомагнезиемии при пероральном введении некоторых солей магния (магния хлорида, магния сульфата, магния Ь-аспарагината, магния оксибутирата, магния таурината, магния !\т-ацетилтаурината, магния цитрата, магния сукцината, магния глицината) у крыс с алиментарным дефицитом магния.

2. Определить острую токсичность указанных солей магния при внутрибрюшин-ном введении мышам.

3. Провести изучение комплекса показателей, характеризующих различные стороны процесса активации системного воспаления, у крыс с алиментарным дефицитом магния.

4. Установить наличие и выраженность дисфункции эндотелия сосудов у крыс с алиментарным дефицитом магния с использованием широкого спектра специфических биологических маркеров.

5. Оценить эффективность коррекции активации системного воспаления и развития эндотелиальной дисфункции, сопровождающих дефицит магния, различными солями магния.

6. Выявить возможные изменения в интенсивности свободнорадикальных процессов, в уровне окислительных повреждений биомолекул и в функциональной активности антиоксидантной систему у крыс с алиментарным дефицитом магния и возможность коррекции окислительного стресса различными солями магния.

7. Изучить антитромботическую активность солей магния у крыс с гипомагне-зиемией.

8. Выявить наличие кардиопротективного действия солей магния у крыс с гипо-магнезиемией при экспериментальном некрозе миокарда, индуцированном токсическими дозами изопротеренола.

9. Оценить способность солей магния ослаблять патологические изменения кар-диогемодинамических показателей у крыс с алиментарным дефицитом магния.

Научная новизна: Впервые было проведено сравнительное изучение комплекса показателей, характеризующих активацию системного воспаления, развитие дисфункции эндотелия сосудов и выраженность окислительного стресса, при алиментарном дефиците магния у животных. Продемонстрирована взаимосвязь изменений био-

химических маркеров с функциональными и морфологическими изменениями миокарда, сопровождающими алиментарный дефицит магния. Показано, что при развитии гипомагнезиемии изменения в уровне маркеров поражения сосудов наблюдаются одновременно с усилением тромбогенного потенциала крови, патологическими изменениями кардиогемодинамических показателей и повышением чувствительности кар-диомиоцитов к цитолитическому действию изопротеренола. Установлено, что способность солей магния корректировать нарушения воспалительного ответа, функции эндотелия сосудов, окислительно-восстановительного баланса в организме, тромбо-генный потенциал крови и морфофункциональные нарушения миокарда существенно зависели от природы аниона.

Научно-практическая значимость работы: Установленные взаимосвязи между активацией системного воспаления, развитием эндотелиальной дисфункции и выраженностью окислительного стресса как важных детерминант патологических изменений в системе кровообращения при гипомагнезиемии позволяют более четко определить вероятные мишени фармакологического воздействия при дефищгге магния. Впервые проведен анализ эффектов солей магния на изменения в уровне маркеров системного воспаления, эндотелиальной дисфункции и окислительного стресса, происходящее у животных с гипомагнезиемией. Установлена перспективность применения неорганических и органических солей магния для коррекции вызванных дефицитом магния окислительного стресса и дисфункции эндотелия, а также ослабления чувствительности миокарда к действию изопротеренола. Органические соли в целом более эффективны в восстановлении нарушенных при гипомагнезиемии функций, чем неорганические соли. Наиболее эффективными среди изученных солей были М-ацетитауринат и Ь-аспарагинат магния. Установлено, что для оценки протективных свойств препаратов магния следует учитывать их действие на уровни специфических биомаркеров (системного воспаления, дисфункции эндотелия и окислительного повреждения биомолекул).

Реализация результатов исследования: Разработанный комплекс показателей для одновременной оценки активации системного воспаления, развития эндотелиальной дисфункции, выраженности окислительного стресса, тромбогенного потенциала крови и кардиогемодинамических показателей у лабораторных животных в условиях дефицита магния и методы фармакологической коррекции гипомагнезиемии используются в НИИ фармакологии ВолгГМУ и Волгоградском научном медицинском центре. Результаты работы включены в лекционный курс на кафедрах фармакологии,

фармакологии и биофармации ФУВ и фармацевтической и токсикологической химии Волгоградского государственного медицинского университета, кафедре фармакологии Кубанского государственного медицинского университета, кафедре фармакологии Саратовского государственного медицинского университета. Основные положения, выносимые на защиту:

1. В зависимости от скорости полной компенсации дефищгга магния у крыс исследуемые соли можно расположить в следующем порядке: магния оксибути-рат = магния Ь-аспарагинат ~ магния М-ацетилтауринат > магния хлорид ~ магния тауринат ~ магния сульфат > магния цитрат = магния глицинат > магния сукцинат. По величине показателя токсичности 1Л50 исследованные соли магния распределились в следующем порядке: магния №ацетилтауринат ~ магния Ь-аспарагинат > магния цитрат > магния сульфат > магния тауринат > магния хлорид > магния сукцинат > магния глицинат > магния оксибутират.

2. При алиментарном дефиците магния наблюдались патологические изменения в уровне всех исследованных маркеров системного воспаления (С-реактивный белок, интерлейкин-6, фактор некроза опухолей) и эндотелиальной дисфункции (эндотелии-1, оксид азота и его стабильные метаболиты, эндотелиальная КЮ-синтаза, белок межклеточной адгезии УСАМ-1). Одновременно наблюдается повышение содержания карбонильных продуктов окисления белков. Соли магния (сульфат, хлорид, оксибутират, Ь-аспарагинат и К-ацетилтауринат) в разной степени способны корригировать наблюдающиеся нарушения в уровне воспаления, функционировании эндотелия и в окислительно-восстановительном балансе в организме. Нормализация функции эндотелия и ослабление воспалительных процессов лучше всего протекают под воздействием 1М-ацетитаурината и Ь-аспарагината магния, однако из этих двух солей только Ь-аспарагинат магния эффективно снижал уровень маркеров окислительного повреждения белков.

3. Соли магния (сульфат, хлорид, оксибутират, Ь-аспарагинат и № ацетилтауринат) в различной степени способны нормализовать измененные при дефиците магния время тромбообразования, индексы сократительной функции сердца и чувствительность сердечной мышцы к повреждающим факторам.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на XV Региональных конференциях молодых исследователей Волгоградской области

(Волгоград, 2010 г.); 65-й, 67-й, 69-й и 70-й итоговых научных конференциях студеь тов и молодых ученых Волгоградского государственного медицинского университет (Волгоград, 2007, 2009, 2011 и 2012 гг.); Всероссийском научно-практическом сем» наре для молодых ученых «Методологические аспекты экспериментальной и клинг ческой фармакологии» (Волгоград, 2010 г.), научно-практической конференции, пс священной памяти чл.-корр. РАМН, ЗДН РФ, д.м.н., профессора В. Б. Писарева «Ак туальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии» (Волгоград, 201 г.); 57-й региональной научно-практической конференции профессорскс преподавательского коллектива ВолГМУ «Инновационные достижения фундамен тальных и прикладных исследований в развитии здравоохранения Волгоградской об ласти» (Волгоград, 2010 г.), 24th & 26th Scientific Meeting of the Malaysian Society о Pharmacology and Physiology (Малайзия, 2010 и 2012 гг.); XVI Всероссийской научно практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2011 г.); XD Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012 г.); 1\ Международной научной конференции Science4Health 2012 (Москва, 2012 г.), 1\ Съезде фармакологов России (Казань, 2012 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 35 работ (из них 10 - в изда ниях, рекомендованных ВАКом для публикации основных результатов диссертаций).

Объем а структура диссертации. Диссертация изложена на 197 страницах ма шинописного текста, иллюстрирована 46 рисунками и 30 таблицами. Состоит из вве дения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», экспериментальной част! (главы 3-8), обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 21 отечественный и 280 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Эксперименты проводили на 510 половозрелых нелинейных белых крысах обоего пола массой 250-350 г и 50 белых неинбредных мышах-самцах массой 18-32 г, содержавшихся в условиях вивария (температура 22-24°С, относительная влажность воздуха 40-50%) с естественным световым режимом на сбалансированной диете, удовлетворяющей требованиям «Руководства по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских технологиях» [Каркищенко Н.Н., 2010], в условиях свободного доступа к отстоянной водопроводной воде (содержание элементарного Mg 20 мг/л). У животных вызывали алиментарную гипомагнезиемию путем

содержания на сбалансированной Mg-дефицитной диете, содержавшей 20% казеина, 70% крахмала, 0,3% DL-метнонина, 0,2% холина битартрата, 5% кукурузного масла, 1% поливитаминной смеси и 3,5% полиминеральная смесь, аналогичная полиминеральной смеси AIN-76 (MP Biomedical), не содержащая Mg, в течение 2 мес при свободном доступе к дистиллированной воде. Исследование одобрено Региональным независимым этическим комитетом при Волгоградском научном центре РАМН и Администрации Волгоградской области (протокол № 93-2009 от 14.03.2009 г.) и выполнялось в соответствии с Международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997), и требованиями «Правил лабораторной практики», утвержденных приказом Минздравсоцразвития РФ от 23 августа 2010 г. № 708н.

В работе были изучены 9 различных органических и неорганических солей магния: магния сульфата гептагидрат (ОАО «Химзавод им. Л.Я.Карпова», Россия), магния хлорида гексагидрат (ООО «Реахимсервис», Россия), магния L-аспарагинат (ЗАО «Биоамид», Россия), магния оксибутират, магния тауринат, магния N-ацетилтауринат, магния цитарат, магния глицинат и магния сукцинат (были синтезированы на кафедре фармацевтической и токсикологической химии ВолгГМУ д.х.н., профессором A.A. Озеровым1). Исследование острой токсичности соединений при внутрибрю-шинном введении проводилось в соответствии с требованиями [Хабриев Р.У., 2005]. Расчет величины LD50 проводили пробит-анализом с использованием алгоритма максимального правдоподобия [Finney D.J., 1971] с помощью утилиты Probit Analysis 4.

Скорость и степень развития гипомагнезиемии у животных опытной группы определяли по содержанию магния в плазме крови и эритроцитах спектрофотометриче-ски по цветной реакции с титановым желтым [Меньшиков В.В., 1987]. После достижения целевого уровня гипомагнезиемии крысам в течение 14 сут вводили соли магния в дозах, соответствующих 50 мг элементарного Mg/кг массы тела.

Для характеристики окислительного стресса определяли фотометрически: гидроперекиси и липоперекиси липидов с ксиленоловым оранжевым [Hermes-Lima М. е.а., 1995], малоновый диальдегид с тиобарб1ггуровой кислотой [Андреева Л.И., Кожемякин Л.А., 1988], карбонильные продукты окислительной модификации белков с 2,4-динитрофенилгидразином [Hawkins C.L. е.а., 2009], общую антиоксидантную

1 Выражаем глубокую признательность заведующему кафедрой фармацевтической и токсикологической химии д.х.н., профессору Александру Александровичу Озерову за синтез и предоставление соединений магния для исследования.

активность (ОАОА) по обесцвечиванию катион-радикала АБТС (АБТО") [Re R. е.а., 1999] (в модификации [Шушкова И.Г. и др., 2010]), тиолы с реактивом Эллмана [Ell-man G.L., 1959]. Общее содержания белка в сыворотке (плазме) крови устанавливали биуретовым методом с использованием коммерческого набора реактивов производства «Витал Девелопмент Корпорэйшн» (Россия). Фотометрические измерения проводили на спектрофотометре APEL PD-303UV (Япония).

Определение маркеров функции эндотелия (эндотелина, эндотелиальной N0-синтазы - eNOS, VCAM-1) и системного воспаления (С-реактивного белка - СРБ, интерлейкина-б - IL-6, фактора некроза опухоли TNFa) проводили иммунохимически коммерческими наборами реактивов производства BioVendor (Чехия), Biomedica (Австрия), eBioscience (Австрия) и Usen Life Science (КНР). Определение оксида азота и его метаболитов нитрита и нитрата проводили колориметрически с реактивом Грисса коммерческими наборами реактивов (R&D Systems, США). Указанные измерения проводили на универсальном микропланшетном ридере ELX 800 производства фирмы Bio-Tek Instruments, Inc (США).

Время тромбообразования оценивали на модели артериального тромбоза, вызванного поверхностную аппликацию 50% раствора хлорида железа(Ш) на сонную артерию [Kurz K.D. е.а., 1990]. Момент окклюзии артерии определяли по прекращению пульсации выше участка аппликации, измеренной доплерографически неинва-зивным способом «Минимакс-Доплер-К» (Санкт-Петербург).

Основные показатели. кард и о- и zcmoôh ¡i амики определяли у животных после наркотизации этаминалом натрия (40 мг/кг, в/бр) в условиях искусственной вентиляции легких с помощью системы обработки сигналов BEAT (РКНПК РАМН, Россия) измерялись внутрижелудочковое давление и его первая производная (+dp/dt и -dp/dt), частота сердечных сокращений и систолическое и диастолическое артериальное давление. Величину интенсивности функционирования структур (ИФС) получали расчетным способом по формуле [Меерсон Ф.З., 1981; Тюренков И.Н. и др., 2006]:

нфс = ЛЖДхЧСС m

где m - масса левого желудочка + 2/3 массы межжелудочковой перегородки в мг, ЧСС - частота сердечных сокращений, ЛЖД - левожелудочковое давление.

Измерение кардиогемодинамических показателей проводили до и после функциональных нагрузочных проб: нагрузки объемом (быстрое внутривенное введение изотонического раствора NaCl 3 мл/кг), стимуляции адренорецепторов сердца (внут-10

ривенное введение адреналина 1 нг/кг), изометрической нагрузки (пережатие восходящей части дуги аорты на 20 секунд) [Тюренков И.Н. и др., 2006]. Морфологическое исследование ткани миокарда крыс проводили по общепринятым гистологическим методикам после фиксации формалином и окраски гематоксилином и эозином по Масону или гематоксилином, основным фуксином и пикриновой кислотой по Ли. Фотографии препаратов цифровой фотокамерой Canon (5 Мп) на базе микроскопа Axiostar Plus (Carl Zeiss, Германия) с использованием объективов 10х и 40х и окуляра 10" использовали для морфометрического анализа2. Определение кобальт-связывающей способности сыворотки крови (маркер ищемии миокарда) проводили по [Bar-Or D. е.а., 2000] в модификации [Литус Е.А. и др., 2008; Лопатин Ю.М. и др., 2011]. Некротическое повреждение миокарда вызывали введением токсических доз изопро-теренола (30 мг/кг, п/к, дважды с интервалом 24 ч) [Kung H.F., Blau M., 1978]. В качестве маркеров некроза кардиомиоцитов активность аспартатаминотрансферазы (АсАТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и креатинкиназы (КК) коммерческими наборами производства «Витал Девелопмент Корпорэйшн» (Россия).

Описание количественных признаков и статистический анализ данных в полученных выборках проводили в соответствии с рекомендациями, изложенными в [Гланц С., 1998; Реброва О.Ю., 2002]. Все статистические расчеты проводили с применением пакета прикладных программ Statistica for Windows 6.0, фирмы StatSoft, Inc. (США). Наличие различий между выборками несвязанных между собой данных по количественному признаку проверяли с помощью непараметрического дисперсионного анализа (ANOVA) по Краскелу - Уоллесу; если достигался уровень р < 0,05, то проводили дополнительное попарное сравнение выборок с использованием U-критерия Манна - Уитни. Гипотезу о существовании различий между выборками принимали при уровне р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

У крыс, находившихся на Mg-дефицитной диете, к концу второго месяца наблюдалось достоверное снижение уровня магния в эритроцитах (с 1,706±0,031 до 0,863±0,055 мМ), и в плазме (с 1,038±0,051 до 0,676±0,026 мМ) по отношению к

2 Выражаем глубокую признательность заведующему кафедрой патологической анатомии ВолгГМУ д.м.н., доценту A.B. Смирнову и ассистешу кафедры патологической анатомии ВолгГМУ, к.м.н. Н.Г. Паныдину за содействие в проведении исследований.

группе интактных крыс. У животных, содержавшихся на Mg-дефицитной диете, наблюдалось изменение внешнего вида: потускнение шерстного покрова и гиперемия открытых участков тела (ушных раковин, хвоста и лап), что соответствует типичным внешним изменениям при гипомагнезиемии [Schräder G.A. е.а., 1937; Mazur А. е.а., 2007].

В опытах на крысах с гипомагнезиемией было обнаружено, что все исследованные соли Mg приводили к полной компенсации гипомагнезиемии, однако сроки её достижения очень сильно зависели от природы аниона в составе соли. В зависимости от скорости полной компенсации дефицита магния в эритроцитах исследуемые соли можно расположить в следующем порядке: магния оксибутират = магния L-аспарагинат = магния N-ацетилтауринат > магния хлорид = магния тауринат = магния сульфат > магния цитрат ~ магния глицинат > магния сукцинат (табл.1). Наиболее быстро полная компенсация недостаточности магния достигалась при использовании оксибутирата, L-аспарагината и N-ацетилтаурината.

Таблица 1

Сроки полной компенсации дефицита магния в группах животных, получавших соли магния (50 мг элементарного М(*/кг массы тела)

Изучаемый препарат ! Время достижения полной компенсации*, сутки

1В плазме крови В эр1проциты

Mg оксибутират 9,92 (6,52-15,10) 10,09 (9,03+10,4)

Mg L -аспарагинат** ;4,52 (3,58-5,72) 10,40 (9,75+11,10)

Mg N-ацетилтау ринат ¡5,07(4,45-5,78) 11,30(10,42-12.3)

Mg хлорид** ' 7,71 (5,87-10,12) 15,21 (13,36+17,32)

Mg тауринат** 10,35 (9,91-10,80) 17,37(14,21+21,23)

Mg сульфат** j 12.22 (8.94-16,70) 18,47 (13,44+25,39)

Mg цитрат* * ¡11,45 (6,55-20,03) 21,18 (16,18+27,74)

Mg глицинат** ¡9,10 (6,93+11,96) 22,93 (19,73+26,66)

Mg сукцинат** ¡14.61 (9.86-21,65) 26,10 (18,87+36,11)

* Данные приведены в виде медианы с указанием границ 95% ДИ.

** Результаты совместных исследований с И.Н.Иежицей.

При исследовании острой токсичности при внутрибрюшинном введении мышам было установлено, что среди изученных солей магния (хлорид, сульфат, оксибутират, Ь-аспарагинат, тауринат, Ы-ацетилтауринат, цитрат, глицинат, сукцинат) наиболее токсичным был оксибутират магния. Показатель ЬО50 для него составил 582,8 мг/кг массы тела. Наименее токсичными из исследованных солей магния оказались Ь-

аспарагинат (LD50 1468,6 мг/кг) и N-ацетилтауринат (LD50 1 5 07,9 мг/кг). Оба этих соединения менее токсичны, чем неорганические соли магния (сульфат и хлорид).

При изучении системного воспаления у Mg-дефицитных крыс иммунохимиче-ски было обнаружено существенное повышение продукции у Mg-дефицитных крыс двух провоспалительных цитокинов - IL-6 (в 1,9 раза) и TNFa (в 1,35 раза). Кроме того, у взрослых крыс алиментарный дефицит магния приводил к повышению концентрации СРВ в сыворотке крови в 4,4 раза в сравнении с интактными животными. При оценке влияния солей Mg (табл.2) было установлено, что все изученные соли Mg снижали повышенный уровень СРВ до величин, статистически не отличавшихся от таковых у интактных крыс. Полная нормализация содержания TNFa происходила под действием хлорида, L-аспарагината, N-ацетилтаурината или оксибутирата магния, но не сульфата магния. В то же время, лишь две из исследованных солей Mg (хлорид и L-аспарагинат) полностью нормализовали уровень циркулирующего IL-6.

Таблица 2

Влияние солей магния на \ровни биомаркеров системного воспаления в условиях хронического дефицита магния и после компенсации гипомагнезиемии Группы животных i Отклонение (в %) величины показателя от

его величины у интактных животных

IL-6 TNFa СРБ

Mg-дефицитные |t 87* t 35 * t 342 *

Mg-дефицитные + магния N-ацетилтауринат i Г 34 * t 3» t 25"

Mg-дефицитные + магния оксибутират | Т 25 i 3" t 81 *

Mg-дефицитные + магния L-аспарагинат It 13* 1 6» t 58"

Mg-дефицигные + магния хлорид ТИ" i 6' t 47 е

Mg-дефицитные + магния сульфат It 45 110 t 89*

* Статистически значимые отличия от интактных животных (р < 0,05; критерий Манна - Уитни).

Статистически значимые отличия от животных, содержавшихся на 1^-дефицитной диете (р < 0,05; критерий Манна - Уитни).

У Mg-дeфицитныx животных происходило повышение уровня эндотелина в плазме крови в 1,8 раза по сравнению с интактными крысами, что свидетельствует о развитии дисфункции эндотелия (табл. 3). Одновременно у \^-дефицитных крыс наблюдалось повышение концентрации циркулирующей формы белка межклеточной адгезии УСАМ-1 (в 1,4 раза к контролю), что говорит не только о дисфункции эндотелия, но и об активации адгезии и миграции лейкоцитов через сосудистую стенку. При развитии алиментарного дефицита Mg у крыс наблюдалось резкое падение (в 3,4 раза к контролю) содержания эндотелиальной МО-спнтазы (еКОЭ) в сыворотке крови,

что служит показателем нарушений в функционировании клеток эндотелия и гладкой мускулатуры сосудистой стенки. В то же время, у М§-дефицитных крыс в сравнении с интактными произошло увеличение продукции общего N0 (на 32%) и его метаболитов - нитрита (на 8%) и нитрата (на 62%). Увеличение продукции N0 при ослаблении экспрессии еЖ)8 можно объяснить усиленным синтезом индуцибельной формы КО-сингазы (¡КОБ), активаторамми которой являются эндотелии-1 и провоспали-тельные цитокины.

Таблица 3

Влияние солей магния на уровни биомаркеров состояния эндотелия кровеносных сосудов в условиях хронического дефицита магния и после компенсации гипомагнезиемии

Группы животных Отклонение (в %) величины показателя от его величины у интактных животных

Эндотелии (1-21) Общий N0 Нитрит \ Нитрат Ш2~ йог еШБ УСАМ-1

М§-деф|щитные Т 80 * Т 32 * т 8 * | т 62 * 1 70 * Т 39 *

М§-дефицнтные + Mg Ы-ацетилтауринат Т 23 *■• 1 1" | 2" | | 15" 1 9* т 12

Mg-дeфицитныe + Mg оксибутират Т т 1 Т 0,1* ! 1 18 я | |28*'* ! Т 10 '

М§-дефицитные + Mg Ь-аспарагинат Т 13" 1 1" Т 2 | 17* ! X 56 Т 12

Mg-дeфицитныe + MgCl2 Т 26 \ 9' Т 2 " ; 22 * 1. 49 * " Т ю

Mg-дeфицитныe + MgSO.| т -46 * 1 0,2 * 1 3 * ! Т 4 * Ц 38 *■* т 19

* Статистически значимые отличия от интактных животных (р < (Х05; критерий Манна - Уитни).

Статистически значимые отличия от животных, содержавшихся на М§-дефищгтной диете (р < 0,05; критерий Манна - Уигни).

Из всех изученных солей М« полную нормализацию содержания эндотелина вызывали хлорид, оксибутират и Ь-аспарагинат магния, в то время, как 14-ацетилтауринат магния действовал слабее, а сульфат магния не вызывал улучшения в уровне эндотелина (табл. 3). Все исследованные соли Мз восстанавливали физиологически нормальное содержание УСАМ-1, но только одно вещество (магния 14-ацетилтауринат) полностью нормализовало уровень еКОБ.

Обобщая данные по системному воспалению и дисфункции эндотелия, можно сделать вывод, что нормализация функции эндотелия и ослабление воспалительных процессов лучше всего протекают при использовании К-ацетитаурината или Ь-аспарагината магния.

Было установлено, что выраженность окислительного стресса при алиментарном дефиците у взрослых крыс относительно слаба. Ни один го маркеров пе-14

рекисного окисления липидов (гидроперекиси и малоновый диальдегид) не был увеличен после 2 мес содержания крыс на М^-дефицитной диете по сравнению с интакт-ными крысами. Однако при развитии гипомагнезиемии у крыс наблюдалось повышенное содержание карбонильных продуктов окисления белков (в 1,4 раза к контролю после пересчета на содержание белка). Вместе с тем, у крыс с алиментарным дефицита было обнаружено повышение ОАОА плазмы крови (в 2 раза к контролю), но статистически значимых отличий в содержании общих тиолов у интактных и М£-дефицитных животных обнаружено не было.

Было показано, что компенсация дефицита в течение 2 нед не влияла или незначительно изменяла концентрацию карбонильных соединений в плазме крови (рис. 1). Лишь использование магния Ь-аспарагината приводило к снижению концентрации карбонильных соединений до уровня, статистически неотличимого от его величины у интактных животных. В то же время, все исследованные соли вызывали снижение величины ОАОА плазмы крови, повышенной в результате развития дефицита М8, однако величина ОАОА не достигала значений, наблюдавшихся у интактных крыс. Несколько лучший эффект, чем другие соли, продемонстрировал сульфат магния (см. рис. 1).

2 1

дофжшт МдС!2 ¥ц804 МН--А»п Mg.W-.AT Мд-ОЗ

икт. дефицт- №дС1г Мд504 Мд-ОБ

Рисунок 1. Влияние солей магния на уровень карбонильных продуктов окислительной модификации белков в пересчете на содержание общего белка в плазме крови крыс (слева) и на величину ОАОА плазмы крови крыс (справа). Обозначения: инт. - интактные животные; дефицит - магний-дефицитные животные: компенсация гипомагнезиемии: ]\^С12 - магния хлоридом, N^04 - магния сульфатом, Ту^-Ь-Абп - магния Ь-аспарагинатом, 1У^-Ы-АТ - магния И-ацетилтауринатом; 1У^-ОВ -магния оксибутиратом; * - статистически значимые отличия от интактных крыс; # - статистически значимые отличия от крыс с гипомагнезиемией (р < 0.05; критерий Манна - Уитни).

При оценке антитромботической активности магниевых солей при гипомагнезиемии было обнаружено, что у животных с дефицитом М§ время образования тромба было достоверно короче, чем у интактных крыс (табл. 4). В среднем срок образования тромба в сонной артерии у М§-дефицитных животных был на 44 % короче,

чем в интактного крыс. Все изученные в этих экспериментах соли магния (хлорид, сульфат, N-ацетилтауринат, L-аспарагинат и оксибутират) при использовании для компенсации гипомагнезиемии устраняли патологическое укорочение времени тром-бообразования, которое наблюдалось при развитии гипомагнезиемии (табл. 4). Это является свидетельством непосредственной связи между укорочением периода тром-бообразования в артериях и недостаточностью Mg2+ в организме.

Таблица 4

Влияние солей магния на время тромбообразования в сонной артерии крыс (аппликация 50%

раствора хлорида железа III)

Группа животных Время тромбообразования, мин

Интакгные 14,46 ± 1,16

Магний-дефицитные 8,20 ±0,18 *

Магний-дефицитные + магния хлорид 15,88 ± 1,77*

Магний-дефицитные + магния сульфат 15,36 ± 1,00 *

Магний-дефицитные + магния Ь-аспарагинат 18,00 ±0,82 *•"

Магний-дефицитные + магния К-ацстилтауринат 15,50 ± 0,80 *

Магний-дефицитные + магния оксибутират 16,63 ± 0,57 *

* Статистически значимые отличия от интактных животных (р < 0,05; критерий Манна - Уитни).

* Статистически значимые отличия от животных, содержавшихся на М§-дефицнгной диете (р < 0,05; критерий Манна - Уш-ни).

В следующей серии экспериментов были выявлены значительные различия в кардиогемодинамических показателях между интактными и М§-дефицитными крысами. С использованием трех нагрузочных моделей - нагрузка увеличением объема циркулирующей крови, стимуляция работы миокарда введением адреналина и пережатие восходящей дуга аорты - было показано, что развитие гипомагнезиемии при алиментарном дефиците существенно нарушает функциональную активность миокарда. Особенно существенно происходило снижение величины ИФС миокарда у Р^-дефицигных животных в сравнении с интактными крысами (на 67% при нагрузке объемом, на 60% при адреналиновой стимуляции на 30-й нагрузочных тестов и на 25% при пережатии восходящей части дуги аорты).

Три соли магния (хлорид, сульфат и Ь-аспаргинат) были протестированы на способность восстанавливать функции миокарда, нарушенные при алиментарном дефиците магния. Изученные соли М§ полностью или частично улучшали кардиогемоди-намические показатели в ходе нагрузочных проб. При этом в большинстве случаев их эффекты были сравнимыми. В ряде случаев (например, возрастание левожелудочко-

вого давления при нагрузке объемом) магния Ь-аспарагинат продемострировал более высокую эффективность.

Таблица 5

Влияние солей магния на активность креатинкиназы (КК), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и аспартатамннотрансферазы (АсАТ) после изопротериноловой интоксикации (М±т)

Группа животных КК, Ед/л ЛДГ, Ед/л АсАТ, ммоль/(ч-л)

Интакгные 141,42±20,91 593,63±52,60 0,35±0,04

Интактные + изопротеренол 270,46±13,73* 1395,04±110,05* 1,37±0,15*

М§- дефицитные 199,75±16,88*'** 771,18±95,42** 0,45±0,07**

Mg-дефицитные + изопротеренол 611^71,89***" 1703,73±6,68*'**-# 2,10±0,09*'**'#

Магния хлорид 429,21±44,86***Л!"* 1328,26±220,07*"':# 1,12±0,12*ÄW

Магния сульфат 362,14±44,01*л,а 1049,65±162,53*»' 1,10±0,07*'**'*-"*

Магния Ь-аспарагинат 305,63±58,32*-~ 1021,77±188,04*'**'"я 1,31±0,03*AW

Магния К-ацетилтауринат 354,01±55,64*'**'"*" 1319,49±153,52** 1,20±0,18*AW

Магния оксибутират 355.27±29,68*s* 1172,43±151,92*'*'™! 1,12±0,09*"'и

** Статистически значимые отличия от интактных животных + изопротеренол (р < 0,05; критерий Манна - Уитни)

* Статистически значимые отличия от животных, содержавшихся на К^-дефицигной диете (р < 0,05; критерий Манна - Уитни)

Статистически значимые отличия от М§-дефицитных животных + изопрстеренол (р < 0,05; критерий Манна - Уитни)

В ходе оценки морфологических изменений в миокарде животных при гипомаг-незиемии морфометрический анализ гистологических препаратов показал снижение объемной плотности кардиомиоцитов у дефицитных животных на 13% в сравнении с интактными крысами. Однако у крыс с гипомагнезиемией объемная плотность фуксинофильных кардиомиоцитов выросла примерно в 4 раза, значительно увеличился объем стромы и отношение объема стромы к объему паренхимы (примерно в 2 раза к контролю), что является свидетельством гипоксических изменений в ткани сердечной мышцы. Для оценки влияния дефицита М§ на чувствительность миокарда к повреждающим факторам у интактных и магний-дефицитных животных вызывали некроз кардиомиоцитов токсическими дозами изопротеренола. После введения изо-протеренола у животных, находившихся на магний-дефицитной диете, наблюдались достоверно более высокая активность ферментов, считающихся биохимическими маркерами некроза кардиомиоцитов в сравнении с интактными крысами (табл. 5). Компенсация гипомагнезиемии различными солями магния ослабляла кардиотокси-

ческое действие изопротеренола на миокард Г^-дефицитных крыс, что следует из снижения активности ферментов-биомаркеров поражения кардиомиоцитов в сравнении с М§-дефицитными животными (табл. 5). Наиболее эффективная нормализация чувствительности сердечной мыши крысы к действию изопротеренола наблюдалась при использовании для компенсации гипомагнезиемии магния сульфата и магния Ь-аспарагината. Кроме того, компенсация гипомагнезиемии любой из исследованных солей М§ в равной степени уменьшала объем фуксинофильных кардиомиоцитов после воздействия изопротеренола (в среднем на 22%). Таким образом, соли магния при введении ?^-дефицитным животным проявляли выраженный защитный эффект в отношении сердечной мышцы крыс.

Таким образом, были обнаружены системные изменения показателей, наблюдающиеся при развитии алиментарного дефицита магния. В частности, недостаточность магния в организме крыс сопровождалась нарушением функционального резерва миокарда, повышенным тромбообразованием в крови, активацией системного воспаления, нарушением функции эндотелия сосудов и развитием умеренного окислительного стресса. Была также проанализирована способность различных неорганических и органических солей магния компенсировать изменения, наблюдающиеся в организме на фоне недостаточности магния. В-целом, можно сделать вывод, что по воздействию на различные изученные показатели наиболее эффективными соединениями магния можно признать магния ]Ч-ацетилтауринат и магния Ь-аспарагинат.

ВЫВОДЫ:

1. В зависимости от скорости полной компенсации дефицита магния у крыс исследуемые соли можно расположить в следующем порядке: магния оксибути-рат = магния Ь-аспарагинат = магния М-ацетшттауринат > магния хлорид = магния тауринат = магния сульфат > магния цитрат = магния глицинат > магния сукцинат.

2. По величине показателя токсичности 1ЛЭ50 исследованные соли магния распределились в следующем порядке: магния Ы-ацетилтауринат = магния Ь-аспарагинат > магния щпрат > магния сульфат > магния тауринат > магния хлорид > магния сукцинат > магния глицинат > магния оксибутират.

3. У крыс с развившимся дефицитом магния обнаруживались согласованные изменения в уровне маркеров, специфически характеризующих различные стороны процесса развития системного воспаления,- повышение уровня всех изученных маркеров системного воспаления - С-реактивного белка, интерлейки-

на-б и фактора-а некроза опухолей (повышение в 4,4 раза, в 1,9 раза и в 1,35 раза относительно контроля, соответственно).

4. При алиментарном дефиците магния происходит повышение уровня маркеров эндотелиальной дисфункции - эндотелина(1-21) (в 1,7 раза) и УСАМ-1 (в 1,4 раза) при существенном снижении экспрессии эндотелиальной Ж)-синтазы (в 3,4 раза). Одновременно зафиксировано повышение продукции общего N0 (в 1,3 раза) и метаболитов N0 - нитрита (в 1,1 раза) и нитрата (в 1,6 раза).

5. Соли магния (магния оксибутират, магния Ь-аспарагинат, магния № ацетилтауринат, магния хлорид и магния сульфат) в значительной степени отличаются между собой по влиянию на маркеры воспаления, эндотелиальной дисфункции и окислительного стресса. Действие солей магния на патологически измененные показатели маркеров системного воспаления и эндотелиальной дисфункции при компенсации гипомагнезиемии заметно отстает по времени от нормализации содержания магния у крыс. М-ацетитауринат магния и Ь-аспарагинат магния наиболее эффективно вызывали нормализацию функции эндотелия и ослабление воспалительных процессов.

6. При гипомагнезиемии наблюдалось повышенное содержание карбонильных продуктов окисления белков (в 1,4 раза), но не продуктов перекисного окисления липидов. Одновременно наблюдалось повышение общей антиоксидантной активности плазмы крови (в 2 раза). Наиболее эффективным для коррекции уровня маркеров окислительного стресса оказался магния Ь-аспарагинат.

7. У животных с дефицитом магния время образования тромба при использовании экспериментальной модели артериального тромбоза, вызванного аппликацией хлорида железа(Ш) на сонную артерию крыс, было достоверно короче (8,20±0,18 мин), чем у интактных животных (14,46±1,16 мин). Четыре из изученных солей магния (магния хлорид, магния сульфат, магния ацетилтауринат и магния оксибутират) приводили к полной нормализации времени тромбообразования.

8. У крыс с гипомагнезиемией после воздействия изопротеренола в сердечной мышце развивался более выраженный некроз клеток, чем у интактных животных. После применения солей магния (сульфат, хлорид, оксибутират, 14-ацетилтауринат и Ь-аспарагинат) для компенсации гипомагнезиемии проявления поражения сердечной мышцы у крыс существенно ослаблялись в сравнении с магний-дефицитными животными.

9. При алиментарном дефиците магния существенно нарушалась функциональная активность миокарда. Исследованные в указанной модели соли магния (хлорид, сульфат и L-аспарагинат) полностью или частично улучшали кардиогемо-динамическне показатели в ходе нагрузочных проб.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Сравнительная коррекция фуросемидной гипомагнезиемии различными стерео-изомерами органических солей магния / A.A. Спасов, A.A. Озеров, ИН. Иежица, М.В. Харитонова, М.С. Кравченко, A.A. Желтова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011. Т. 151, № 3. С. 308-310.

2. Нарушение обмена магния и калия и его фармакологическая коррекция / АА Спасов, RH. Иежица, М.В. Харитонова, A.A. Желтова // Вестник Оренбургского государственного университета 2011. №15. С.131-135.

3. Морфологические изменения некоторых органов крыс при дефиците магния / AB. Смирнов, MB. Шмидт, Н.Г. Паныиин, Т Ф. Смирнова, А.А Спасов, М.В. Харитонова, АА. Желтова, MB. Черников // Вестник новых медицинских технологий. 2011. Т.18, № 2. С.63-65.

4. Морфологические изменения почек и семенников крыс при экспериментальном моделировании алиментарного дефицита магния/ A.B. Смирнов, НГ. Паныиин, Т.Ф. Смирнова, АА. Спасов, MB. Харитонова, А А. Желтова //Медицинский вестник Северного Кавказа 2011. Т. 23, № 3. С. 73-75.

5. Изучение эффективности некоторых органических солей магния при экспериментальной гипомагнезимии / М.В. Харитонова, АА. Желтова, ИН Иежица, А.А Озеров, А.А Спасов//Вестник Оренбургского государстветюго университета. 2011,№15 С. 153-155.

6. Влияние солей магния на концентрацию эндотелиальной NO-синтазы в условиях алиментарного дефицита магния /М.В. Харитонова, А.А Желтова, ИН. Иежица, АА. Озеров, А. А Спасов, // Вестник Оренбурского государственного университета 2011. №15. С. 156-157.

7. Магний и окислительный стресс / Спасов А. А, Желтова А А, Харитнова MB. // Российский физиологический журнал им. ИМ Сеченова 2012. Т.98, № 7. С.915-923.

8. Влияние солей магния на уровень TNF-a как маркера системного воспаления при дефиците магния / А А. Желтова, MB. Харитонова, AM. Пятиконнова // Вестник Российского государственного медицинского университета 2012. Специальный выпуск №1.

9. Влияние дефицита магния на процесс зачатия и антенатального развития плода / A.A. Спасов, Л.И. Бугаева, С.А. Лебедева, М.В. Харитонова, Т.М. Бундикова, A.B. Смирнов, В.А. Толокольников, О.Ю. Евсюков, A.A. Желтова // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2012. № 6. С.35-38.

10. Структурные изменения некоторых органов крыс при моделировании алиментарного дефицита магния / A.B. Смирнов, Г.Л. Снигур, М.В. Шмидт, Н.Г. Паньшин, О.Ю. Евсюков, В. А. Толокольников, Т.Ф. Смирнова, Д.В. Буланов, A.A. Спасов, М.В. Харитонова, A.A. Желтова, Т.М. Бундикова // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2012. № 6. С.44-50.

Другие работы, опубликованные по теме диссертации.

11. Особенности тревожного поведения у крыс в условиях алиментарного дефицита магния и их коррекция. / М.В. Харитонова, М.С. Кравченко, A.A. Желтова // Бюллетень Волгоградск. научн. центра РАМН и Адм. Волгоградск. обл. 2007. №2. С. 19-22.

12. Влияние солей магния на поведение крыс в тесте «Крестообразный лабиринт» в условиях алиментарного дефицита магния. / М.В. Харитонова, М.С. Кравченко, A.A. Желтова Мат. 65-й юбилейной открытой научно-практ. конф. мол. ученых и студентов с междунар. участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (25-27 апреля 2007). Сб. тезисов. Волгоград, 2007. С. 153.

13. Влияние магния L-аспарагината на кардиогемодинамику в условиях дефицита магния / М.В. Харитонова, A.A. Желтова, H.A. Корвегина, М.А. Курдыбайло, A.C. Тарасов // Мат. 67-й открытой научно-практ. конф. мол. ученых и студентов с междунар. участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (22-24 апреля 2009). Сб. тезисов. Волгоград, 2009. С. 185.

14. Адренореактивность миокарда в условиях дефицита магния /И.Н. Иежица, М.В. Харитонова, A.A. Желтова, Н.Г. Паньшин, Г.Л Снигур, A.B. Смирнов, H.A. Гурова, A.A. Спасов//Бюлл. Волгоградск. научн. центраРАМН. 2009. № 3. С.25-28.

15. Влияние органических солей магния на дисфункцию эндотелия в условиях дефицита магния / A.A. Желтова, М.В. Харитонова, H.A. Коновалова // Вестн. Волгоградск. гос. мед. университета. 2010. Приложение (мат. II Всеросс. науч-но-практ. семинара для молодых ученых «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии»).

16. Дефицит магния и морфофункциональные изменения эндотелия / М.В. Харитонова, Н.Г. Паньшин, A.A. Желтова, И.Н. Иежица, A.A. Спасов, A.B. Смирнов // Сб. тр. научно-практ. конф., посвященной памяти чл.-корр. РАМН, ЗДН РФ, д.м.н., проф. В.Б. Писарева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии». Волгоград, 2010. С.28-30.

17. Морфологические преобразования почек крыс при экспериментальном дефиците магния / A.B. Смирнов, Н.Г. Паньшин, A.A. Спасов, М.В. Харитонова, A.A. Желтова // Сб. научн. тр. 57-й региональной научно-практ. конф. профессорско-преподавательского коллектива ВолГМУ «Инновационные достижения фундаментальных и прикладных исследований в развитии здравоохранения Волгоградской области» Инновационные технологии. Волгоград, 2010. С.64-66.

18. Magnesium L-aspartate corrects functional heart reserves impaired due to magnesium deficiency. / A.A Spasov, I.N. Iezhitsa, M.V. Kharitonova, A.A. Zheltova, I.N. Tyurenkov, N.A. Gurova // Микроэлементы в медицине. 2010. Т. 11, вып. 2. С.64-64.

19. Effect of magnesium on functional heart reserves of magnesium-deficient rats in volume loading tests. / A.A Spasov, I.N. Iezhitsa, M.V. Kharitonova, A.A. Zheltova, I.N. Tyurenkov, N.A. Gurova /'/ 24th Scientific Meeting of the Malaysian Society of Pharmacology and Physiology (2-3 June 2010). 2010. P.68.

20. Effect of low dietary magnesium intake on development of endothelial dysfunction. / A.A. Spasov, I.N. Iezhitsa, M.V. Kharitonova, A.A. Zheltova // 24,h Scientific Meeting of the Malaysian Society of Pharmacology and Physiology (2-3 June 2010). 2010. P. 129.

21. Структурные изменения в супраоптических ядрах гипоталамуса крыс при моделировании экспериментального дефицита магния / A.B. Смирнов, О.Ю. Ев-сюков, Н.Г. Паньшин, М.В. Шмидт, A.A. Спасов, И.Н. Иежица, М.В. Харитонова, A.A. Желтова // Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии. Волгоград: ВолГМУ, 2010. С.121.

22. Морфологические изменения в крупноклеточных ядрах гипоталамуса крыс при экспериментальном моделировании алиментарного дефицита магния / О.Ю. Евсюков, A.A. Желтова // XV Региональная конф. молодых исследователей Волгоградск. обл., Волгоград, 9-12 ноября 2010 г. Волгоград, 2010.

23. Effect of magnesium L-aspartate and magnesium chloride alone and in combination with pyridoxine on hyperalgesia in rats fed with magnesium -deficient diet / I.N. Iezhitsa, A.A. Spasov, M.V. Kharitonova, A.A. Zheltova / J. Pharmacol. Sei. 2011. V. 115, suppl.l. P.255.

24. Ультраструктурные изменен™ эпителия проксимальных канальцев у крыс при экспериментальном моделировании алиментарного дефицита магния. / A.B. Смирнов, Н.Г. Паньшин, A.A. Спасов, М.В. Харитонова, A.A. Желтова // Волгоградский научно-медицинский журнал. 2011. №2. С. 12-14.

25. Морфологические изменения в головном мозге крыс при экспериментальном моделировании алиментарного дефицита магния / О.Ю. Евсюков, A.A. Желтова // Мат. 69-й открытой научно-практ. конф. мол. ученых и студентов с меж-дунар. участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (27-30 апреля 2011 г.). Сб. тезисов. Волгоград, 2011. С.237.

26. Изучение влияния магнийдефицитной диеты на половое поведение и эстраль-ный цикл крыс-самок / Т.М. Бундикова, С.А. Лебедева, A.A. Желтова, М.В. Харитонова // Мат. 69-й открытой научно-практ. конф. мол. ученых и студентов с междунар. участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (27-30 апреля 2011 г.). Сб. тезисов. Волгоград, 2011. С.194.

27. Изучение противоишемического действия некоторых солей магния в условиях гипомагнезимии. / К.Г. Шапошникова, A.A. Желтова, М.В. Харитонова, A.M. Пятиконнова, C.B. Любомудров / Мат. 69-й открытой научно-практ. конф. мол. ученых и студентов с междунар. участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (27-30 апреля 2011 г.). Сб. тезисов. Волгоград, 2011. С.209.

28. Противоишемическое действие некоторых солей магния в условиях алиментарного дефицита магния у крыс. / A.A. Желтова, Н.С. Костерина, М.В. Харитонова // XVI Всероссийская научно-практ. конф. «Молодые ученые в медицине». Казань, 22-23 апреля 2011 г. Казань, 2011. С.109.

29. Влияние солей магния на уровень С-реактивного белка в условиях гипомагне-зиемии. / A.A. Желтова, М.В. Харитонова / Мат. 70-й открытой научно-практ. конф. мол. ученых и студентов с междунар. участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (11-14 апреля 2012 г.). Сб. тезисов. Волгоград, 2012. С.326.

30.Иммуногистохимическая характеристика коры больших полушарий головного мозга при моделируемой магниевой недостаточности / О.Ю. Евсюков, A.A. Желтова / Мат. 70-й открытой научно-практ. конф. мол. ученых и студентов с междунар. участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (11-14 апреля 2012 г.). Сб. тезисов. Волгоград, 2012. С.386.

31. Влияние магнийдефицитной диеты на показатели периферической крови крыс-самок / С.А. Лебедева, Л.И. Бугаева, М.В. Харитонова, Т.М. Бундикова, A.A. Желтова, A.A. Спасов // XIX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Сб. материалов Конгресса (23-27 апреля 2012). Москва, 2012. С.525.

32. Влияние магния L-аспарагината на дисфункцию эндотелия и системное воспаление / М.В. Харитонова, A.A. Желтова // IV Международная научн. конф. Sci-ence4Health-2012 (18-21 апреля 2012 г., Москва). Материалы конф. Москва, 2012. С.46-47.

33. Изучение повреждающего действия изопротеринола на миокард / С.М. Сорокин, М.В. Харитонова, A.A. Желтова, A.B. Грачева, Е.В. Резников // IV Международная научн. конф. Science4Health-2012 (18-21 апреля 2012 г., Москва). Материалы конф. Москва, 2012. С.63-64.

34. Antithrombotic potency of magnesium L-aspartate on the model of FeC13-induced thrombosis. / A.A. Spasov, I.N. Iezhitsa, M.V. Kharitonova, A.A. Zheltova, I.N. Ty-urenkov, N. A. Gurova // 26lh Scientific Meeting of the Malaysian Society of Pharmacology and Physiology (18-20 May 2012). 2012. P.89.

35. Фармакологическая коррекция дисфункции эндотелия и системного воспаления при экспериментальном дефиците магния. / М.В. Харитонова, A.A. Спасов, A.A. Желтова, И.Н. Иежица, A.A. Озеров // IV Съезд фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». Мат. съезда. 18-21 сентября 2012 года. Казань. М.: Фолиум, 2012. С.190.

Отпечатано в ООО «Экспресс-печать» 400005, г. Волгоград, ул. Пражская, 12 Тираж 130 экз.

Актуальность проблемы. Заболевания системы кровообращения являются одними из наиболее распространенных и нередко приводят к смерти и ин-валидизации [Nabel E.G., 2003; Mozaffarian D. e.a., 2008]. Это определяет важность выяснения факторов их возникновения и возможностей коррекции и профилактики. Хотя значительное число механизмов, вовлеченных в развитие патологических изменений в системе кровообращения, уже установлено, но многое еще остается неясным [Griendling К.К., 2003; Stocker R., 2004; Di Marzio D., 2006; Minuz P. e.a., 2006; Razzouk L. e.a., 2012; Siontis G.C. e.a., 2012]. Дефицит магния может существенно повысить риск развития сосудистых патологий (артериальной гипертензии, ишемической болезни сердца, сердечных аритмий, атеросклероза и тромбоэмболии периферических сосудов), а также заболеваний, приводящих к развитию сосудистых осложнений, в том числе метаболического синдрома и сахарного диабета 2 типа [Johnson S., 2001; Al-Delaimy W.K. e.a., 2004; Hordyjewska A., Pasternak K., 2004; Nielsen F.H. e.a., 2007; Champagne C.M., 2008; Rayssiguier Y. e.a., 2010]. В то же время, ряд лекарственных средств, применяемых при сердечно-сосудистых заболевания (диуретики, сердечные гликозиды), повышают вероятность развития недостаточности магния [Holzmacher R. e.a., 2005]. С другой стороны, дефицит магния может снижать терапевтическую эффективность и повышать токсичность сердечных гликозидов и других лекарственных средств [Schwinger R.H. e.a., 1992; Crippa G. e.a., 1999]. В связи с этим значительно повысился интерес к выявлению механизмов взаимосвязи между недостаточностью магния и развитием сердечно-сосудистых заболеваний [Wolf F.I. e.a., 2008].

Известно, что недостаток магния в организме приводит к активации воспалительных процессов [King D.E. e.a., 2005; Mazur A. e.a., 2007]. Одним из основных механизмов повреждения ткани сосудов в этом случае является интенсивная продукция макрофагами/нейтрофилами в процессе «дыхательного взрыва» активных форм кислорода (АФК) [Touyz R.M., 2000]. Таким образом, повреждение сосудов вначале носит характер окислительного повреждения [Mi-nuz Р. е.а., 2006]. Недостаток магния усиливает окислительное повреждение тканей за счет подавления функциональной активности антиоксидантной системы (АОС) клеток,- в первую очередь, её глутатион-зависимого звена [Barba-gallo М. е.а., 1999; Hans С.Р. е.а., 2002; Blache D. е.а., 2006; Boparai R.K. е.а., 2007; Mahabir S. е.а., 2008]. При активации воспалительных процессов изменяется спектр продукции цитокинов, что сказывается на функциональной и про-лиферативной активности эндотелиальных и гладкомышечных клеток сосудов [Wolf F.I. е.а., 2008]. Одновременно недостаточность магния изменяет способность клеток формировать ответ на внешние стимулы. Естественным последствием дефицита магния, поэтому является развитие дисфункции эндотелия [Wolf F.I. е.а., 2008; Paravicini Т.М. е.а., 2009], дополнительно усиливающейся окислительным стрессом [McQuaid К.Е., Keenan А.К., 1997; Tawfik Н.Е. е.а., 2008]. Дополнительную опасность для организма создает тот факт, что развитие эндо-телиальной дисфункции и неадекватно повышенный воспалительный ответ также способны взаимно усиливать друг друга [Corti R. е.а., 2003]. Таким образом, дефицит магния индуцирует в организме развитие воспалительных реакций, дисфункции эндотелия и окислительного стресса, которые являются важнейшими механизмами, вовлеченными в патогенез поражения кровеносных сосудов [Stocker R., 2004; Heistad D.D., 2006; Song Y. е.а., 2007; Bunte M.C. е.а., 2008].

Однако к настоящему времени степень вероятной взаимосвязи между дисфункцией эндотелия, активацией системного воспаления и выраженностью окислительного стресса при алиментарном дефиците магния изучена недостаточно. Это делает комплексную оценку взаимосвязи указанных патологических процессов между собой при развитии дефицита магния, влияцие их на системные физиологические изменения в сердечно-сосудистой системе и возможности коррекции указанных нарушений различными солями магния важной и актуальной научной проблемой.

Диссертационная работа является составной частью научно-исследовательской программы «Фундаментальные исследования и научное обоснования создания и использования препаратов на основе природного би-шофита в медицине, гигиене и санитарии» (регистрационный номер 01.2006 09438), включенной в план НИР Волгоградского государственного медицинского университета. Тема работы утверждена на заседании Учёного Совета Волгоградского государственного медицинского университета (протокол № 8 от 15.04.2009 г.).

Целью настоящего исследования являлось сравнительное экспериментальное изучение влияния некоторых неорганических и органических солей магния на дисфункцию эндотелия, активацию системного воспаления, окислительный стресс, изменения тромбогенного потенциала крови, нарушения сократимости миокарда, развивающиеся в условиях алиментарного дефицита магния, а также изучение кардиопротективных свойств этих солей.

Для достижения указанной цели представлялось необходимым решить следующие задачи:

1. Изучить скорость компенсации гипомагнезиемии при пероральном введении некоторых солей магния (магния хлорида, магния сульфата, магния Ь-аспарагината, магния оксибутирата, магния таурината, магния Ы-ацетилтаурината, магния цитрата, магния сукцината, магния глицината) у крыс с алиментарным дефицитом магния.

2. Определить острую токсичность указанных солей магния при внутри-брюшинном введении мышам.

3. Провести изучение комплекса показателей, характеризующих различные стороны процесса активации системного воспаления, у крыс с алиментарным дефицитом магния.

4. Установить наличие и выраженность дисфункции эндотелия сосудов у крыс с алиментарным дефицитом магния с использованием широкого спектра специфических биологических маркеров.

5. Оценить эффективность коррекции активации системного воспаления и развития эндотелиальной дисфункции, сопровождающих дефицит магния, различными солями магния.

6. Выявить возможные изменения в интенсивности свободнорадикальных процессов, в уровне окислительных повреждений биомолекул и в функциональной активности антиоксидантной систему у крыс с алиментарным дефицитом магния и возможность коррекции окислительного стресса различными солями магния.

7. Изучить антитромботической активности солей магния у крыс с гипомаг-незиемией.

8. Выявить наличие кардиопротективного действия солей магния у крыс с гипомагнезиемией при экспериментальном некрозе миокарда, индуцированном токсическими дозами изопротеренола.

9. Оценить способность солей магния ослаблять патологические изменения кардиогемодинамических показателей у крыс с алиментарным дефицитом магния.

Научная новизна. Впервые было проведено сравнительное изучение комплекса показателей, характеризующих активацию системного воспаления, развитие дисфункции эндотелия сосудов и выраженность окислительного стресса, при алиментарном дефиците магния у животных. Продемонстрирована взаимосвязь изменений биохимических маркеров с функциональными и морфологическими изменениями миокарда, сопровождающими алиментарный дефицит магния. Показано, что при развитии гипомагнезиемии изменения в уровне маркеров поражения сосудов наблюдаются одновременно с усилением тромбогенного потенциала крови, патологическими изменениями кардиогемодинамических показателей и повышением чувствительности кардиомиоцитов к цитолитическому действию изопротеренола. Полученные данные свидетельствуют о взаимосвязи способности солей магния корректировать нарушения воспалительного ответа, функции эндотелия сосудов, окислительновосстановительного баланса в организме, тромбогенный потенциал крови и морфофункциональные нарушения миокарда с химической природой аниона.

Научно-практическая значимость работы. Установленные взаимосвязи между активацией системного воспаления, развитием эндотелиальной дисфункции и выраженностью окислительного стресса как важных детерминант патологических изменений в системе кровообращения при гипомагнезиемии могут позволить более четко определить вероятные мишени фармакологического воздействия при дефиците магния. Впервые проведен анализ эффектов солей магния на изменения в уровне маркеров системного воспаления, эндотелиальной дисфункции и окислительного стресса, происходящее у животных с гипомагнезиемией. Были получены экспериментальные данные, позволяющие обосновать перспективность применения неорганических и органических солей магния для коррекции вызванных дефицитом магния окислительного стресса и дисфункции эндотелия, а также ослабления чувствительности миокарда к действию изопротеренола. Показано, что органические соли в целом более эффективны в восстановлении нарушенных при гипомагнезиемии функций, чем неорганические соли. Ы-ацетитауринат и Ь-аспарагинат магния оказались наиболее эффективными в коррекции как гипомагнезиемии в целом, так и изменений в сосудистой системе и миокарде. Результаты исследования также свидетельствуют, что оценка протективных свойств препаратов магния в отношении состояния сердечно-сосудистой системы должна проводиться с учетом воздействия на уровни соответствующих специфических биомаркеров (системного воспаления, дисфункции эндотелия и окислительного повреждения биомолекул).

Реализация результатов исследования. Разработанный комплекс показателей для одновременной оценки активации системного воспаления, развития эндотелиальной дисфункции, выраженности окислительного стресса, тромбо-генного потенциала крови и кардиогемодинамических показателей у лабораторных животных в условиях дефицита магния и методы фармакологической коррекции гипомагнезиемии используются в НИИ фармакологии ВолгГМУ и

Волгоградском научном медицинском центре. Результаты работы включены в лекционный курс на кафедрах фармакологии, фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета, кафедре фармакологии Кубанского государственного медицинского университета, кафедрах фармакологии и клинической фармакологии Саратовского и Ростовского медицинских университетов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В зависимости от скорости полной компенсации дефицита магния у крыс исследуемые соли можно расположить в следующем порядке: магния ок-сибутират ~ магния Ь-аспарагинат ~ магния Ы-ацетилтауринат > магния хлорид ~ магния тауринат ~ магния сульфат > магния цитрат ~ магния глицинат > магния сукцинат. По величине показателя токсичности ЬБ50 исследованные соли магния распределились в следующем порядке: магния Ь-аспарагинат ~ магния И-ацетилтауринат > магния цитрат > магния сульфат > магния тауринат > магния хлорид > магния сукцинат > магния глицинат > магния оксибутират.

2. Алиментарный дефицит магния приводит к патологическим изменениям в уровне всех исследованных маркеров системного воспаления (С-реактивный белок, интерлейкин-6, фактор некроза опухолей) и эндотели-альной дисфункции (эндотелии-1, оксид азота и его стабильные метаболиты, эндотелиальная ЫО-синтаза, белок межклеточной адгезии УСАМ-1). Одновременно наблюдается повышение содержания карбонильных продуктов окисления белков. Соли магния (сульфат, хлорид, оксибутират, Ь-аспарагинат и Ы-ацетилтауринат) в разной степени способны корригировать наблюдающиеся нарушения в уровне воспаления, функционировании эндотелия и в окислительно-восстановительном балансе в организме. Нормализация функции эндотелия и ослабление воспалительных процессов лучше всего протекают под воздействием Ы-ацетитаурината и

L-аспарагината магния, однако из этих двух солей только L-аспарагинат магния эффективно снижал уровень маркеров окислительного стресса.

3. Соли магния (сульфат, хлорид, оксибутират, L-аспарагинат и N-ацетилтауринат) в различной степени способны нормализовать укороченное время тромбообразования, нарушения сократительной функции сердца и повышение чувствительности сердечной мышцы к индуцирующим некроз факторам, сопровождающим алиментарный дефицит магния. Эффективность органических солей магния в целом была выше, чем неорганических солей.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на XV Региональных конференциях молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2010 г.); 65-й, 67-й, 69-й и 70-й итоговых научных конференциях студентов и молодых ученых Волгоградского государственного медицинского университета (Волгоград, 2007, 2009, 2011 и 2012 гг.); Всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученых «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» (Волгоград,

2010 г.), научно-практической конференции, посвященной памяти чл.-корр. РАМН, ЗДН РФ, д.м.н., профессора В. Б. Писарева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии» (Волгоград, 2010 г.); 57-й региональной научно-практической конференции профессорско-преподавательского коллектива ВолГМУ «Инновационные достижения фундаментальных и прикладных исследований в развитии здравоохранения Волгоградской области» (Волгоград, 2010 г.), 24th & 26th Scientific Meeting of the Malaysian Society of Pharmacology and Physiology (Малайзия, 2010 и 2012 гг.); XVI Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань,

2011 г.); XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012 г.); IV Международной научной конференции Science4Health 2012 (Москва, 2012 г.) , IV Съезде фармакологов России (Казань, 2012 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 35 работ (из них 10 - в изданиях, рекомендованных ВАКом для публикации основных результатов диссертаций).

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 197 страницах машинописного текста, иллюстрирована 46 рисунками и 30 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (главы 2-8), обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 21 отечественный и 280 зарубежных источников.

выводы

1. В зависимости от скорости полной компенсации дефицита магния у крыс исследуемые соли можно расположить в следующем порядке: магния ок-сибутират ~ магния Ь-аспарагинат ~ магния И-ацетилтауринат > магния хлорид ~ магния тауринат ~ магния сульфат > магния цитрат ~ магния глицинат > магния сукцинат.

2. По величине показателя токсичности ЬО50 исследованные соли магния распределились в следующем порядке: магния Ы-ацети л тауринат ~ магния Ь-аспарагинат > магния цитрат > магния сульфат > магния тауринат > магния хлорид > магния сукцинат > магния глицинат > магния оксибути-рат.

3. У крыс с развившимся дефицитом магния обнаруживались согласованные изменения в уровне маркеров, специфически характеризующих различные стороны процесса развития системного воспаления,- повышение уровня всех изученных маркеров системного воспаления - С-реактивного белка, интерлейкина-6 и фактора-а некроза опухолей (повышение в 4,4 раза, в 1,9 раза ив 1,35 раза относительно контроля, соответственно).

4. При алиментарном дефиците магния происходит повышение уровня маркеров эндотелиальной дисфункции - эндотелина( 1-21) (в 1,7 раза) и УСАМ-1 (в 1,4 раза) при существенном снижении экспрессии эндотелиальной 1МО-синтазы (еМЭБ) (в 3,4 раза). Одновременно зафиксировано повышение продукции общего N0 (в 1,3 раза) и метаболитов N0 - нитрита (в 1,1 раза) и нитрата (в 1,6 раза).

5. Соли магния (магния оксибутират, магния Ь-аспарагинат, магния 14-ацетилтауринат, магния хлорид и магния сульфат) в значительной степени отличаются между собой по влиянию на маркеры воспаления, эндотелиальной дисфункции и окислительного стресса. Действие солей магния на патологически измененные показатели маркеров системного воспаления и эндотелиальной дисфункции при компенсации гипомагнезиемии заметно отстает по времени от нормализации содержания магния у крыс.

Ы-ацетитауринат магния и Ь-аспарагинат магния наиболее эффективно вызывали нормализацию функции эндотелия и ослабление воспалительных процессов.

6. При гипомагнезиемии наблюдалось повышенное содержание карбонильных продуктов окисления белков (в 1,4 раза), но не продуктов перекисно-го окисления липидов. Одновременно наблюдалось повышение общей антиоксидантной активности плазмы крови (в 2 раза). Наиболее эффективным для коррекции уровня маркеров окислительного стресса оказался магния Ь-аспарагинат.

7. У животных с дефицитом магния время образования тромба при использовании экспериментальной модели артериального тромбоза, вызванного аппликацией хлорида железа(Ш) на сонную артерию крыс, было достоверно короче (8,20±0,18 мин), чем у интактных животных (14,46±1,16 мин). Четыре из изученных солей магния (магния хлорид, магния сульфат, магния Ы-ацетилтауринат и магния оксибутират) приводили к полной нормализации времени тромбообразования.

8. У крыс с гипомагнезиемией после воздействия изопротеренола в сердечной мышце развивался более выраженный некроз клеток, чем у интактных животных. После применения солей магния (сульфат, хлорид, оксибутират, 1Ч-ацетилтауринат и Ь-аспарагинат) для компенсации гипомагнезиемии проявления поражения сердечной мышцы у крыс существенно ослаблялись в сравнении с магний-дефицитными животными.

9. При алиментарном дефиците магния существенно нарушалась функциональная активность миокарда. Исследованные в указанной модели соли магния (хлорид, сульфат и Ь-аспарагинат) полностью или частично улучшали кардиогемодинамические показатели в ходе нагрузочных проб.

8.5. Заключение

Совокупность полученных данных позволяет сделать недвусмысленный вывод о развитии ишемии миокарда в сердце крыс в условиях алиментарного дефицита магния. В частности, гипомагнезиемия у крыс сопровождалась снижением кобальт-связывающей способности сыворотки крови, что служит маркером развития ишемии миокарда. Магний L-аспарагинат продемонстрировал способность полностью нормализовать кобальт-связывающую способность сыворотки, в то время, как хлорид и N-ацетилтауринат магния вызывали лишь частичное улучшение этого показателя, а сульфат магния оказался полностью неэффективным.

Интоксикация изопротеренолом приводила к развитию ишемии миокарда и некрозу части кардиомиоцитов, что было показано как результатами анализа сердечных маркеров, так и гистологическими тестами. Магния сульфат и магния L-аспарагинат, но не магния хлорид, когда они использовались для компенсации гипомагнезиемии, приводили к нормализации уровня чувствительности сердечной мыши крысы к действию изопротеренола. С другой стороны, все исследованные соли магния при введении магний-дефицитным животным в равной степени уменьшали объем фуксинофильных кардиомиоцитов после воздействия изопротеренола.

Таким образом, можно говорить, что введение солей магния у магний-дефицитных животных обладает выраженным, хорошо детектируемым проти-воишемическим эффектом.

ГЛАВА 9. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Дефицит любого из биологически значимых макро- и микроэлементов имеет большое значение для развития заболеваний человека [Park S. е.а., 2008; Boy Е. е.а., 2009; Suskind D.L., 2009]. Одним из примеров является дефицит магния [Rude R.K., 1998; Спасов A.A., 2000; Wolf F.I., Cittadini А., 2003]. Магний - один из важнейших элементов в человеческом организме, по содержанию он занимает четвертое место среди макроэлементов [Euser A.G., Cipolla M.J., 2009]. Вовлеченность ионов магния практически во все биохимические и клеточные процессы в организме объясняет его чрезвычайно важную роль для существования живых организмов. В качестве кофактора ферментов магний участвует в энергетическом метаболизме, в процессах синтеза белков, РНК и ДНК, в регуляции клеточного цикла, в поддержания баланса между пролиферативной активностью клеток и их дифференцировкой, в формировании и контроле трансмембранного потенциала на плазматической мембране клеток. На уровне целого организма ионы магния необходимы для поддержания нормального функционирования нервной и мышечной тканей, формирования костной ткани, поддержания нормального сердечного ритма и развития адекватного иммунного ответа. Поэтому гомеостаз магния является чрезвычайно важным для живого организма [Rude R.K., Shils М.Е., 2006].

Дефицит магния независимо от вызвавшей его причины может существенно повышать риск развития таких заболеваний, как артериальная гипертен-зия, ишемическая болезнь сердца, сердечные аритмии, атеросклероз и тромбоэмболия периферических сосудов, метаболический синдром, сахарный диабет 2 типа, преэклампсия [Johnson S., 2001; Al-Delaimy W.K. е.а., 2004; Hordyjewska A., Pasternak K., 2004; Nielsen F.H. e.a., 2007; Champagne C.M., 2008; Rayssiguier Y. e.a., 2010]. Подобные заболевания могут возникать намного позже момента возникновения недостаточности магния в организме. Особенно важным фактором риска является хронический дефицит магния [Rude R.K., Shils М.Е., 2006; WolfF.I., Trapani V., 2008a; Rayssiguier Y. e.a., 2010].

Вместе с тем, известно, что в человеческой популяции в современном мире распространенность дефицита магния является достаточно высокой и может достигать 23% во взрослой популяции [Elin R.J., 1988; Ford E.S., Mokdad А.Н., 2003; Beckstrand R.L., Pickens J.S., 2011]. Основной причиной развития дефицита магния у взрослых считается алиментарный фактор, в то время как у детей первичная алиментарная гипомагнезиемия встречается существенно реже [Lon-nerdal В., 1995]. Столь широкая распространенность первичной алиментарной гипомагнезиемии и повышенный риск развития дефицита магния при ряде социально значимых заболеваний делает актуальным изучение патологических изменений, возникающих в организме при недостаточности магния.

В Волгоградском государственном медицинском университете проводятся систематические исследования различных препаратов, содержащих магний [Спасов A.A. и др., 1997; Спасов A.A., 2000; Спасов A.A. и др., 2007а; Иежица И.Н. и др., 2007а; Иежица И.Н. и др., 20076]. Изучалась способность неорганических и органических солей магния восстанавливать обеспеченность организма человека и животных в условиях дефицита магния, возникшего в результате различных причин. Кроме того, постоянно проводятся исследования биологической активности различных солей магния в отношении самых разнообразных систем организма, но в первую очередь сердечно-сосудистой. Одним из важных результатов проведенных к настоящему моменту исследований является обнаружение взаимосвязи качественных и количественных характеристик биологических активностей солей магния от химической природы их анионов [Спасов A.A. и др., 2007; Спасов A.A. и др., 2007а].

Считается, что дефицит магния в организме может приводить к активации двух ключевых механизмов, вовлеченных в развитие сосудистых поражений и ишемии тканей - эндотелиальной дисфункции [Carlin Schooly M., Franz K.B., 2002; Yokoyama T. e.a., 2003; Maier J.A. e.a., 2004a; Nagai N. e.a., 2007; Ferré S. e.a., 2010; Spasov A.A. e.a., 2010] и активации системного воспаления [Malpuech-Brugere С. e.a., 2000; King D.E. e.a., 2005; Mazur A. e.a., 2007; Song Y. е.а., 2007; King D.E., 2009; Chako S.A. e.a., 2010]. Особенно важно, что эти два процесса способны взаимно усиливать друг друга [Corti R. e.a., 2003], а при дефиците магния протекают совместно с развитием окислительного стресса [Hans С.Р. е.а., 2002; Kuzniar А. е.а., 2003; Blache D. e.a., 2006; Boparai R.K. e.a., 2007; Wolf F.I. e.a., 2008]. Окислительный стресс способен усугублять поражение кровеносных сосудов и ткани сердечной мышцы [Wei Y.-H., Lee Н.-С., 2002; Heistad D.D., 2006; Wolf F.I. e.a., 2008; Giacco F., Brownlee M., 2010]. В то же время, ранее практически не проводилось исследований, которые бы могли оценить возможные взаимосвязи между всеми тремя упомянутыми процессами на основании анализа множества биологических маркеров при алиментарном дефиците магния.

Всё указанное говорит о важности понимания вероятных механизмов взаимосвязи между алиментарным дефицитом магния и особенностями развития системного воспаления, дисфункции эндотелия и окислительного стресса в данных условиях. Понимание подобных взаимосвязей могло бы способствовать выявлению препаратов магния, в наилучшей степени не только компенсирующих недостаточность магния в организме, но и наиболее эффективно противодействующих патологическим механизмам поражения кровеносных сосудов и сердечной мышцы.

Для наиболее полного решения указанных проблем в данной работе, было использовано определение широкого набора биологических маркеров для всех трех рассматриваемых патологических процессов при дефиците магния: системного воспаления (С-реактивный белок, интерлейкин-6, фактор некроза опухолей), дисфункции эндотелия (эндотелии-1, оксид азота и его стабильные метаболиты, эндотелиальная NO-синтаза, белок межклеточной адгезии VCAM-1) и окислительного стресса (гидроперекиси, малоновый диальдегид, карбонильные продукты окислительного повреждения белков, тиолы, общая антиок-сидантная активность). Количественное изучение данных маркеров проводилось у животных с алиментарным дефицитом магния параллельно с морфофункциональной оценкой состояния миокарда гистохимическими методами и с помощью функциональных проб. Кроме оценки влияния дефицита магния на изученные показатели также была проведена оценка биологических активностей широкого спектра неорганических и органических солей магния в условиях алиментарного дефицита магния.

Наиболее важным терапевтическим эффектом солей магния считается их способность компенсировать дефицит магния в организме человека и животных. В исследованиях на крысах с предварительно вызванным дефицитом магния было обнаружено, что все исследованные соли приводили к полной компенсации гипомагнезиемии, однако сроки её достижения отличались достаточно сильно. Наиболее быстро полная компенсация недостаточности магния (по его содержанию в эритроцитах) достигалась при использовании оксибутирата, Ь-аспарагината и Ы-ацетилтаурината. Сроки полной компенсации гипомагнезиемии при использовании указанных солей составила 10,1 сут, 10,40 сут и 11,30 сут соответственно. Статистически значимых отличий между этими тремя солями обнаружено не было.

Несколько большее время для компенсации гипомагнезиемии требовалось при использовании неорганических солей магния (хлорида и сульфата) или органической соли таурината магния. Остальные три органических соли магния (цитрат, сукцинат и глицинат) оказались наименее эффективными в восстановлении нормального уровня магния в эритроцитах. Следовательно, в зависимости от скорости полной компенсации дефицита магния в эритроцитах исследуемые соли можно расположить в следующем порядке: магния оксибу-тират ~ магния Ь-аспарагинат ~ магния 1М-ацетилтауринат > магния хлорид ~ магния тауринат ~ магния сульфат > магния цитрат ~ магния глицинат > магния сукцинат.

Таким образом, сроки компенсации очень сильно зависели от природы конкретного аниона: некоторые органические соли были более эффективны, чем неорганические (хлорид и сульфат), другие органические соли, наоборот, менее эффективны, чем неорганические. Известно, что природа аниона может существенно влиять на биодоступность и эффективность действия солей магния как у человека [Ranade V.V., Somberg J.C., 2001], так и у лабораторных животных [Coudray С. е.а., 2005]. Возможно, этим и объясняются различия в сроках полной компенсации гипомагнезиемии при использовании различных органических и неорганических солей магния. Однако механизмы, определяющие подобные различия, не установлены. Кишечник млекопитающих содержат четыре типа транспортных систем для магния: Mrs2, MgtE/SLC41, MagTl и TRPM6/TRPM7. Все эти переносчики являются катионными транспортерами, и нет каких-либо сведений об их прямом участии в регуляции биодоступности различных солей магния [Bohn Т., 2008].

Исследование острой токсичности при внутрибрюшинном введении мышам позволило установить, что среди изученных солей магния (хлорид, сульфат, оксибутират, L-аспарагинат, тауринат, N-ацетилтауринат, цитрат, глици-нат, сукцинат) наибольшей токсичностью обладал оксибутират магния. Показатель LD50 для него составил 582,8 мг/кг массы тела. Оксибутират магния оказался наиболее токсичным из солей магния. Возможно, это связано с особенностями биологического действия у-гидроксимасляной кислоты (ГОМК) и её солей - оксибутиратов. В центральной нервной системе млекопитающих ГОМК функционирует в роли нейромедиатора [Benarroch Е.Е., 2009; van Amsterdam J.G. е.а., 2012], взаимодействующего как с возбуждающими [Cash С. е.а., 1999], так и с тормозными рецепторами [Bettler В. е.а., 2004]. Неблагоприятные эффекты ГОМК связаны в первую очередь с её нейротоксичностью [Pedraza С. е.а., 2009; van Amsterdam J.G. е.а., 2012]. Одной из причин нейротоксичности ГОМК является её способность индуцировать окислительный стресс в клетках нервной ткани [Sgaravatti A.M. е.а., 2007; Sgaravatti A.M. е.а., 2009].

Наименее токсичными из исследованных солей магния оказались L-аспарагинат и N-ацетилтауринат. При внутрибрюшинном введении L-аспарагинат магния и N-ацетилтауринат магния имеют показатель острой токсичности LD50 1468,6 и 1507,9 мг/кг массы тела соответственно, что позволяет отнести их к малотоксичным веществам [Каракчиев Н.И., 1973; Саноцкий И.В., Уланова И.П., 1975]. Оба этих соединения значительно менее токсичны, чем неорганические соли магния (сульфат и хлорид), обычно используемые в качестве эталонных магний-содержащих соединений в биомедицинских исследованиях.

Поскольку было установлено, что из трех наиболее эффективных органических солей магния, выявленных в экспериментах по компенсации алиментарного дефицита магния у крыс (оксибутират, L-аспарагинат и N-ацетилтауринат магния), два соединения (L-аспарагинат и N-ацетилтауринат магния) оказались наименее токсичными из всех изученных к настоящему моменту, то можно полагать, что они являются наиболее перспективными для дальнейших исследований в отношении коррекции патологических изменений, вызванных недостаточностью магния.

Как говорилось выше, дефицит магния способствует развитию выраженного системного воспаления и дисфункции эндотелия. В рамках данного исследования у магний-дефицитных крыс наблюдались отеки, эритема и гиперемия, особенно хорошо заметная на лишенных шерсти участках кожи ушей и лап, что согласуется с литературными данными [Mazur А. е.а., 2007]. Иммунохимически было обнаружено существенное повышение продукции у магний-дефицитных крыс двух провоспалительных цитокинов - интерлейкина-6 (IL-6) (в 1,9 раза) и фактора-a некроза опухолей (TNFa) (в 1,35 раза). Кроме того, у взрослых крыс алиментарный дефицит магния приводил более чем к 4-кратному (в 4,4 раза) повышению концентрации С-реактивного белка (СРБ) в сыворотке крови в сравнении с интактными животными. Важно отметить параллельное повышение уровня сразу трех маркеров воспалительных процессов при развитии дефицита магния, поскольку повышение только одного из маркеров не позволяет делать вывод об активации системного воспаления [Su Y.F., Chou К.Т., 2011].

В проведенных экспериментах также было установлено, что содержание животных в течение 2 месяцев на магний-дефицитной диете приводит к почти 2-кратному повышению уровня эндотелина(1-21) в плазме крови по сравнению с интактными крысами. Эндотелин(1-21) является циркулирующей формой эн-дотелина-1 - наиболее широко используемого маркера дисфункции эндотелия [Barton M., Yanagisawa M., 2008], повышение уровня которого наблюдается при развитии дисфункции эндотелия и связано с повышенным риском сердечнососудистых патологий [Kedzierski R.M., Yanagisawa Y., 2001]. Одновременно с повышением содержания эндотелина(1-21) у магний-дефицитных крыс наблюдалось повышение концентрации циркулирующей формы белка межклеточной адгезии VCAM-1. Активация экспрессии и секреции этого белка, как считается, свидетельствует не только о дисфункции эндотелия [Van Buul J.D. е.а., 2007], но и об активации адгезии и миграции лейкоцитов через сосудистую стенку [Cinamon G. е.а., 2001] и стимуляции сокращения сосудов [Braun M. е.а., 1999].

Параллельно с повышением уровня указанных двух маркеров дисфункции эндотелия при развитии алиментарного дефицита магния наблюдалось резкое падение содержания эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) в сыворотке крови, причем степень изменения активности eNOS оказалась заметно больше (в 3,4 раза), чем степень изменения содержания эндотелина(1-21) (в 1,7 раза) или VCAM-1 (в 1,4 раза). Снижение экспрессии eNOS является хорошо известным показателем выраженных нарушений в функционировании клеток эндотелия и гладкой мускулатуры сосудистой стенки [Braam В., Verhaar М.С., 2007; Dud-zinski D.M., Michel T., 2007]. Тем не менее, несмотря на падение экспрессии eNOS, продукция оксида азота (NO) при развития гипомагнезиемии существенно возросла. Произошло увеличение продукции и общего NO (в 1,3 раза), так и отдельных метаболитов NO - нитрита (в 1,1 раза) и нитрата (в 1,6 раза). Столь существенное увеличение продукции NO при статистически значимом ослабления экспрессии eNOS можно объяснить активацией синтеза другой формы NO-синтазы - индуцибельной (iNOS). В частности, одним из индукторов iNOS является эндотелии-1 [Klabunde R.E., 2011], повышенная продукция которого была выявлена при дефиците магния. Другими индукторами iNOS являются различные провоспалительные цитокины [Lirk G. е.а., 2002; Kleinert Н. е.а., 2003; Brovkovych V. е.а., 2011], продукция которых повышена при дефиците магния [Bussiere F.I. е.а., 2002; Rayssiguier Y. е.а., 2010].

Суммируя полученные данные по определению маркеров системного воспаления и дисфункции эндотелия у магний-дефицитных крыс, можно сделать заключение, что алиментарный дефицит магния вызывает существенные сдвиги в функционировании кровеносной и иммунной систем. Важно отметить, что у дефицитных животных наблюдаются статистически значимые изменения в уровне всех изученных биомаркеров. Это говорит о тесной взаимосвязи между активацией системного воспаления, нарушением функции эндотелия сосудов и измененной экспрессии eNOS. По-видимому, можно говорить, что активация системного воспаления является первичной по отношению к дисфункции эндотелия. Во-первых, недостаточность магния непосредственно вызывает активацию образования СРБ [Chako S.A. е.а., 2010]. СРБ прямо подавляет экспрессию eNOS в эндотелиальных клетках [Venugopal S.K. е.а., 2002]. TNFa, в свою очередь, способен активировать в клетках распад молекул мРНК, кодирующих eNOS, без нарушения транскрипции соответствующего гена [Govers R., Rabelink T.J., 2001]. Таким образом, установленное повышение уровня СРБ и TNFa может отвечать за уменьшение количества функциональных молекул eNOS внутри клеток эндотелия и вызывать развитие и/или усиливать выраженность дисфункции эндотелия.

При оценке вероятных защитных свойств различных солей магния было обнаружено, что соли магния в разной степени различаются между собой по эффекту на маркеры системного воспаления (табл. 29) и на маркеры эндотели-альной дисфункции (табл. 30).

Влияние солей магния на уровни биомаркеров системного воспаления в условиях хронического дефицита магния и после компенсации гипомагнезиемии

Группы животных Отклонение (в %) величины показателя от его величины у интактных животных

1Ь-6 ЮТа СРБ

М£-дефицитные т 87 т 35 т 342 дефицитные + магния Ы-ацетилтауринат т 34 Т 3 | 25

М§-дефицитные + магния оксибутират т 25 1 3 т 81

1У^-дефицитные + магния Ь-аспарагинат Т13 1 6 т 58

Mg-дефицитные + магния хлорид Т11 1 6 Т 47

У^-дефицитные + магния сульфат т 45 Т ю т 89

Влияние солей магния на уровни биомаркеров, характеризующих состояние эндотелия кровеносных сосудов, в условиях хронического дефицита магния и после компенсации гипомагнезиемии

Группы животных Отклонение (в %) величины показателя от его величины у интактных животных

Эндотелии (1-21) Общий N0 Нитрит N02 Нитрат ЫОз еЖ^ УСАМ-1

1У^-дефицитные Т 80 Т 32 т 8 г 62 4 70 Т 39 дефицитные + магния 1\т-ацетилтауринат т 23 1 7 4 2 4 15 4 9 т 12

М§-дефицитные + магния оксибутират Т 7 1 8 1 од 4 18 4 28 т ю

М^-дефицитные + магния Ь-аспарагинат Т13 I 7 Т 2 4 17 4 56 т 12

Mg-дeфицитныe + магния хлорид т 26 4 9 Т 2 4 22 4 49 т 10

1У^-дефицитные + магния сульфат т 46 4 0,2 4 3 | 4 4 38 т 19

В отношении системного воспаления (табл. 29) было установлено, что все изученные соли магния уменьшали повышенное содержание СРБ до величин статистически не отличавшихся от таковых у интактных животных. Полная нормализация содержания ТЫРа происходила под действием хлорида, Ь-аспарагината, 1чГ-ацетилтаурината или оксибутирата магния, в то время как сульфат магния не проявлял какого-либо эффекта. В то же время, лишь два из исследованных соединений магния (хлорид и Ь-аспарагинат) были способны полностью нормализовать уровень циркулирующего 1Ь-6.

Если говорить о влиянии солей магния на состояние эндотелия сосудов (табл. 30), то полная нормализация содержания эндотелина(1-21) происходила под действием хлорида, оксибутирата или Ь-аспарагината магния, действие Ы-ацетилтаурината магния было более слабым, а сульфата магния не вызывал улучшения уровня эндотелина(1-21). В то же время, все исследованные соли (как органические, так и неорганические) оказались способны полностью восстанавливать физиологически нормальное содержание белка внеклеточной адгезии УСАМ-1. С другой стороны, только одно соединение из изученных -магния И-ацетилтауринат - полностью нормализовало уровень е>Ю8 в сыворотке крови. Остальные соли могли лишь в большей или меньшей степени частично восстанавливать содержание еМЖ По способности повышать уровень е1ЧЮ8 в сыворотке крови крыс с алиментарным дефицитом магния исследованные соединения можно было расположить в таком порядке: магния 14-ацетилтауринат > магния оксибутират > магния сульфат > магния хлорид > магния Ь-аспарагинат. В-целом, можно, по-видимому, говорить, что полной нормализации содержания магния в плазме крови и эритроцитах еще недостаточно для того, чтобы ликвидировать все последствия алиментарного дефицита магния в части нарушения функциональной активности эндотелия и регуляции тонуса сосудов.

Суммируя данные по системному воспалению и дисфункции эндотелия, можно сделать вывод, что нормализация функции эндотелия и ослабление воспалительных процессов лучше всего протекают при использовании N-ацетитаурината или L-аспарагината магния.

Известно, что развитие дефицита магния может сопровождаться активацией свободнорадикальных процессов и продукции активных форм кислорода [Dickens B.F. е.а., 1992; Gueux Е. е.а., 1995; Barbagallo M. е.а., 1999а; Hans С.Р. е.а., 2002; Martin H. е.а., 2003; Blache D. е.а., 2006; Boparai R.K. е.а., 2007; Wolf F.I. е.а., 2008] на фоне снижения функциональной активности антиоксидантной системы [Мак I.T. е.а., 1996; Barbagallo M. е.а., 1999; Cernak I. е.а., 2000; Hans С.Р. е.а., 2002; Kuzniar А. е.а., 2003; Martin H. е.а., 2003; Mahabir S. е.а., 2008]. Из исследований, не связанных с изучением магниевого гомеостаза, также известно, что окислительный стресс может сопровождать такие процессы, как активация системного воспаления [Butterfield Т.А. е.а., 2006] и изменения в продукции NO и цитокинов при эндотелиальной дисфункции [Kawashima S., Yo-koyama M., 2004; Salvemini D. e.a., 2006; Han W. e.a., 2008].

Тем не менее, на сегодняшний день сведения о многих аспектах причинно-следственных взаимосвязей между развитием окислительного стресса, эндотелиальной дисфункции и системного воспаления при алиментарном дефиците магния остаются недостаточными. Поэтому важным было оценить вероятность развития и степень выраженности окислительного стресса у взрослых крыс с алиментарной недостаточностью магния в сопоставлении со степенью активации системного воспаления и нарушением состояния эндотелия.

В результате проведенных экспериментов было установлено, что только часть маркеров, характеризующих интенсивность свободнорадикальных процессов, изменяли свою величину при развитии алиментарного дефицита магния у крыс. Ни один из маркеров перекисного окисления липидов (гидроперекиси и малоновый диальдегид) не был увеличен после 2 месяцев содержания крыс на магний-дефицитной диете по сравнению с интактными крысами. Однако у тех же самых животных на фоне недостаточности магния в организме наблюдалось повышенное содержание карбонильных продуктов окисления белков. Поскольку интактные и магний-дефицитные крысы имели несколько различающиеся концентрации белка в сыворотке крови, пересчет содержания карбонилов на содержание общего белка позволил выявить большую выраженность повреждения белков (в 1,4 раза).

Объяснение обнаруженных фактов может быть связано с тем, что карбонильные продукты окисления белков являются более долгоживущими соединениями, чем гидроперекиси и малоновый диальдегид. Можно предположить, что при алиментарном дефиците магния происходит относительно незначительная активация свободнорадикальных процессов, которая еще не может быть зафиксирована по образованию продуктов перекисного окисления липидов. В то же время, даже такая степень активации вызывает постепенное накопление продуктов окисления белков. Достаточно длительный период жизни карбонильных продуктов окисления обеспечивает их накопление до определяемого уровня.

По-видимому, при развитии алиментарного дефицита магния в течение 2 месяцев у крыс всё ещё сохраняется достаточно высокая способность к компенсации происходящих изменений в продукции свободных радикалов. Это следует из того факта, что при дефиците магния было обнаружено повышение общей антиоксидантной активности плазмы крови (в 2 раза). Выявление отсутствия статистически значимых отличий в содержании общих тиолов у интакт-ных и магний-дефицитных животных может служить подтверждением относительно слабой выраженности окислительного стресса у крыс с алиментарным дефицитом магния. Тем не менее, можно предположить, что наблюдавшиеся изменения в показателях, характеризующих окислительное повреждение белков могут говорить о вероятном повышении чувствительности животных к действию внешних повреждающих факторов.

Было также исследовано, могут ли те или иные соли магния влиять на наблюдающееся при алиментарном дефиците магния повышение уровня карбонильных продуктов окисления. Оказалось, что компенсация дефицита магния в течение 2 недель либо не влияет, либо относительно незначительно изменяет концентрацию карбонильных соединений в плазме крови. Лишь использование магния L-аспарагината приводило к снижению концентрации карбонильных соединений до уровня, статистически неотличимого от величины этого показателя у интактных животных. Не было выявлено какого-либо эффекта введения магния хлорида, магния сульфата и магния оксибутирата на содержание карбонильных соединений. Компенсация гипомагнезиемии магния N-ацетилтауринатом сопровождалось тенденцией к повышению содержания карбонильных продуктов окислительной модификации белков в сравнении с магний-дефицитными животными, однако статистически значимых отличий между этими группами выявлено не было.

В то же время, все исследованные соли магния вызывали снижение величины антиоксидантной активности плазмы крови, повышенной в результате развития дефицита магния. Однако эффект всех исследованных солей был лишь частичным. Несколько лучший эффект, чем у других солей, оказался у магния сульфата. Величина общей антиоксидантной активности у крыс после компенсации гипомагнезиемии сульфатом магния составила 0,44±0,009 ммоль эквивалентов галловой кислоты/л сыворотки (против 0,33±0,008 у интактных животных и 0,66±0,012 у магний-дефицитных). Эффекты других солей были еще менее выраженными.

Следует отметить, что развитие окислительного стресса (даже в относительно незначительной степени) может существенно усугублять патологические изменения в организме, возникающие из-за дисфункции эндотелия. Алиментарный дефицит магния стимулирует продукцию NO как в эндотелии сосудов, так и в других тканях через активацию индуцибельной изоформы NO-синтазы [Мак I.T. е.а., 1996; Carlin Schooly M., Franz K.B., 2002; Yokoyama T., 2003; Nagai N. е.а., 2007]. Если повышенный уровень свободных радикалов наблюдается на фоне усиленная продукции NO, так как в этом случае существенная часть молекул NO расходуется на образование пероксинитрита в реакции с супероксидным анион-радикалом [Kawashima S., Yokoyama M., 2004]. Пероксинитрит является сильным вазоконстриктором и чрезвычайно легко вызывает окислительное повреждение различных биомолекул и клеточных структур [ОЬ-ata Т., 2002; Salvemini D. е.а., 2006]. Возможно, именно образование перокси-нитрита является главной опасностью совместного развития дисфункции эндотелия и окислительного стресса.

Активация системного воспаления параллельно с развитием окислительного стресса может дополнительно усиливать окислительные повреждения биомолекул. При воспалении происходит активация циркулирующих нейтро-филов и инфильтрация части из них в ткани, окружающие сосуды. В таких активированных фагоцитирующих клетках инициируется процесс, известный под названием дыхательного взрыва и приводящей к интенсивному образованию активных форм кислорода - индукторов свободнорадикального окисления в организме [Wright H.L. е.а., 2010]. Это, в свою очередь, усиливает окислительное повреждение молекул и клеточных структур [Klebanoff S.J., 2005; Segel G.B. е.а., 2011].

В настоящее время считается, что дефицит магния способствует развитию тромботических микроангиопатий [Van Laecke S. е.а., 2012], поэтому важным было оценить антитромботическую способность магниевых солей при его дефиците. Для анализа противотромботической активности изучаемых солей магния была использована экспериментальная модель артериального тромбоза, вызванного аппликацией хлорида железа(Ш) на сонную артерию крыс [Kurz K.D. е.а., 1990]. У животных с дефицитом магния время образования тромба было достоверно короче, чем у интактных животных. В среднем срок образования тромба в сонной артерии у магний-дефицитных животных был на 44 % короче, чем в группе интактного контроля. Полученные результаты подтвердили риск повышенного тромбообразования у магний-дефицитных животных. В то же время, все исследованные соли магния обращали эффект патологического снижения времени тромбообразования при гипомагнезиемии. Четыре из изученных солей - магния хлорид, магния сульфат, магния N-ацетилтауринат и магния оксибутират - приводили к полной нормализации времени тромбообразования. Это свидетельствует о непосредственной связи между укорочением периода тромбообразования в артериях и недостаточностью ионов магния в организме.

В то же время, магния L-аспарагинат не только приводил к нормализации времени тромбообразования в примененной модели, а статистически значимо удлиняла время тромбообразования относительно интактных животных. В рамках проведенных экспериментов сложно ответить на вопрос, какие именно свойства магния L-аспарагината позволяют ему не просто ликвидировать увеличенное время тромбообразования при гипомагнезиемии, но и формировать в результате умеренное увеличение времени тромбообразования.

Так как опубликованные результаты исследований влияния препаратов магния на сократимость сердечной мышцы противоречивы [Нага А. е.а., 1990; Maulik М. е.а., 1999; Parikka Н. е.а., 1999; Miyoshi К. е.а., 2000; Teragawa Н. е.а., 2001; Besogul Y. е.а., 2009; Trancota S.L. е.а., 2011], то представлялось целесообразным оценить кардио- и гемодинамические показатели у крыс как после развития выраженной гипомагнезиемии, так и после её компенсации различными солями магния.

Проведение нагрузочных тестов для исследования показателей кардиоге-модинамики позволило выявить значительные отличия в изменении этих показателей у интактных и магний-дефицитных животных. С использованием трех нагрузочных моделей - нагрузка увеличением объема циркулирующей крови (имитация увеличенной преднагрузки), стимуляция работы миокарда введением адреналина (имитация стрессовой активации работы сердца) и пережатие восходящей дуги аорты (изометрическая нагрузка сердечной мышцы) - было показано, что развитие гипомагнезиемии при алиментарном дефиците магния существенно нарушает функциональную активность миокарда. Особенно явно это было видно по существенному снижению величины интенсивности функционирования структур (ИФС) миокарда у магний-дефицитных животных в сравнении с интактными крысами (на 67% при нагрузке объемом, на 60% при адреналиновой стимуляции на 30-й секунде нагрузочных тестов и на 25% при пережатии восходящей части дуги аорты).

Три соли магния (хлорид, сульфат и Ь-аспаргинат) были протестированы на способность ослаблять дисфункцию миокарда, развивающуюся в результате алиментарного дефицита магния. В экспериментах с нагрузкой объемом в группах животных, получавших соли магния, левожелудочковое давление, скорости сокращения и расслабления миокарда, величины ИФС были достоверно выше, чем в контрольной группе и группе с дефицитом магния. При адреналиновой стимуляции наблюдался более выраженный рост гемодинамических показателей у крыс, получавших магниевые соли, по сравнению с животными, получавшими только магний-дефицитную диету. При этом, показатели кардио-гемодинамики несколько превышали показатели контрольной группы, но достоверно от них не отличались. В ходе адреналиновой нагрузки все изученные соли магния проявили примерно равную эффективность. Аналогично этому, в группах животных, получавших соли магния, прирост кардиодинамических показателей в ответ на возросшую изометрическую нагрузку был более выражен, чем в группе с дефицитом магния.

Таким образом, соли магния (хлорид, сульфат или Ь-аспарагинат) полностью или частично улучшали кардиогемодинамические показатели в ходе нагрузочных проб. При этом в большинстве случаев эффекты всех трех изученных солей (хлорида, сульфата и Ь-аспарагината) были сравнимыми. В отдельных ситуациях (например, возрастание левожелудочкового давления при нагрузке объемом) магния Ь-аспарагинат продемострировал более высокую эффективность, чем магния хлорид и магния сульфат.

Одной из важных проблем является вопрос о степени ишемических изменений в миокарде животных в условиях алиментарного дефицита магния. С этой целью было проведено сравнение соотношения основных морфологически различимых компонентов миокарда после окраски по Масону и по Ли у ин-тактных и магний-дефицитных крыс. Из морфометрических данных, полученных при анализе гистологических препаратов, следует, что у магний-дефицитных животных объемная плотность кардиомиоцитов была достоверно меньше, чем у интактных крыс. Однако при этом объемная плотность фукси-нофильных кардиомиоцитов выросла примерно в 4 раза. Одновременно с этим у животных с алиментарным дефицитом магния происходило значительное увеличение объема, занимаемого стромой, а отношение объема стромы к объему паренхимы увеличилось примерно двукратно. Это всё является свидетельствами гипоксических изменений в ткани сердечной мышцы. Такой результат позволяет говорить о развитии ишемии миокарда в сердце крыс в условиях алиментарного дефицита магния. Этот факт может объяснить повышение риска сердечно-сосудистых поражений, включая инфаркт миокарда, при недостаточной обеспеченности организма магнием.

Целесообразным является не только выявление более или менее выраженных ишемических изменений в миокарде животных с гипомагнезиемией, но также и оценка, насколько дефицит магния в организме способен ухудшить протекание и исход острого инфаркта миокарда. Для этой цели у интактных и магний-дефицитных животных вызывали некроз кардиомиоцитов с помощью введения изопротеренола. После введения изопротеренола у животных, находившихся на магний-дефицитной диете, наблюдались достоверно более высокая активность ферментов, считающихся биохимическими маркерами некроза кардиомиоцитов (креатинкиназа, лактатдегидрогеназа и аспартатаминотранс-фераза), в сравнении с интактными крысами. Это позволяет говорить, что наличие дефицита магния существенно повышает чувствительность миокарда к действию повреждающих факторов. Другими словами, при дефиците магния развивается более выраженный изопротеренол-индуцированный некроз кардиомиоцитов, чем у здоровых животных. Выводы, сделанные на основании анализа данных по биохимическим маркерам нарушения целостности клеток миокарда, были подтверждены и прямыми гистологическими исследованиями ткани сердца крыс.

У интактных животных после введения изопротеренола, отмечалась дистрофия кардиомиоцитов. Было отмечено увеличение (по сравнению с контрольной группой) объемной плотности кардиомиоцитов с фуксинофильной цитоплазмой при окраске по Ли. В артериях среднего и мелкого калибра обнаруживались признаки спазма, плазматического пропитывания стенки и выраженного периваскулярного отека, их эндотелий имел набухший вид, местами отслаивался от подлежащего слоя, образуя выпячивания в просвет.

Морфологически у животных с дефицитом магния после введения изопротеренола в препаратах миокарда левого и правого желудочков обнаруживались дистрофические изменения кардиомиоцитов (вакуольная дистрофия). Отмечалось умеренное венозное полнокровие, спазм интрамуральных артерий среднего и мелкого калибра, их плазматическое пропитывание и выраженный периваскулярный отек. Эндотелий имел набухший вид, местами отслаивался от подлежащего слоя, образуя выпячивания в просвет. Периваскулярно располагались рассеянные лимфогистиоцитарные инфильтраты. Обнаруживались признаки разрастания молодой соединительной ткани (периваскулярный склероз).

На модели изопротеренол-индуцированного некроза кардиомиоцитов ни одна из исследованных солей магния не повышала статистически значимо выживаемость животных в сравнении с группой дефицита магния. У выживших животных наблюдались более слабые проявления поражения сердечной мышцы после применения солей магния для компенсации гипомагнезиемии. Соли магния, использованные для компенсации гипомагнезиемии, оказывали выраженный эффект на уровень маркеров некроза миокарда после введения изопротеренола. После воздействия изопротеренола у животных, получавших магния хлорид и магния Ь-аспарагинат, уровень активности аспартатаминотрансферазы был сравним с показателем у интактных крыс. Более того, у крыс, получавших магния сульфат, активность аспартатаминотрансферазы оказалась даже ниже, чем у интактных животных. Уровень лактатдегидрогеназы после введения изопротеренола был статистически неотличим у интактных животных и животных, получавших сульфат или хлорид магния, а у животных, получавших магния Ь-аспарагинат, был достоверно ниже. К понижению активности креатинкиназы до уровня, сравнимого с группой интактных животных с интоксикацией изопроте-ренолом, приводило применение только магния сульфата и магния Ь-аспарагината. То есть, можно говорить, что магния сульфат и магния Ь-аспарагинат, когда они использовались для компенсации гипомагнезиемии, наиболее эффективным образом приводили к нормализации степени чувствительности сердечной мыши крысы к действию изопротеренола. С другой стороны, все исследованные соли магния при введении магний-дефицитным животным в равной степени уменьшали объем фуксинофильных кардиомиоцитов после воздействия изопротеренола.

Таким образом, можно сделать вывод, что соли магния при введении магний-дефицитным животным проявляют выраженное противоишемическое действие на сердечную мышцу крыс.

Таким образом, комплекс проведенных экспериментов позволил обнаружить системные изменения показателей, наблюдающиеся при развитии алиментарного дефицита магния. В частности, недостаточность магния в организме крыс сопровождалась ишемией и нарушением функционального резерва миокарда, повышенным тромбообразованием в крови, активацией системного воспаления, нарушением функции эндотелия сосудов и развитием умеренного окислительного стресса. Была также проанализирована способность различных неорганических и органических солей магния компенсировать изменения, наблюдающиеся в организме на фоне недостаточности магния. В-целом, можно сделать вывод, что по воздействию на различные изученные показатели наиболее эффективными соединениями магния можно признать магния Ы-ацетилтауринат и магния Ь-аспарагинат.