Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение травы шлемника обыкновенного Scutellaria galericulata L.

005005227

Дудсцкая Наталья Александровна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ТРАВЫ ШЛЕМНИКА ОБЫКНОВЕННОГО SCUTELLARIA GALERICULA ТА L.

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

-8 ЛЕН 2011

Санкт-Петербург - 2011

005005227

Диссертационная работа выполнена в ГБОУ ВПО Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия Минздравсоцразвития России

Научный руководитель: кандидат фармацевтических наук, доцент Теслов Леонид Степанович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Буданцев Андрей Львович кандидат фармацевтических наук Тулайкин Александр Игоревич

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО Ярославская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России

Защита состоится « 27 » декабря 2011 г. В 12.00 на заседании Диссертационного Совета Д 208.088.01 при ГБОУ ВПО Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия Минздравсоцразвития России (197376, г. Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 14, лит. А)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии Минздравсоцразвития России но адресу: 197227, г. Санкт-Петербург, пр. Испытателей, д. 14.

Автореферат разослан «_25_» ноября 2011 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 208.088.01,

кандидат фармацевтических наук, доцент

Н. В. Марченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Лекарственные растения в настоящее время остаются незаменимыми источниками получения некоторых лекарственных средств и занимают важное место в фармацевтической практике. По сравнению с синтетическими, растительные препараты, наряду с комплексным многосторонним действием на организм человека, обладают, как правило, меньшими побочными эффектами и менее токсичны. В связи с этим изыскание новых видов лекарственного растительного сырья, их внедрение в научную медицину и расширение сырьевой базы остается актуальной задачей современной фармакогнозии.

Многие растения сем. яснотковых - Lamiaceae обладают широким спектром биологической активности и используются как в официналыюй, так и в народной медицине. К числу таких представителей принадлежат виды рода шлемника - Scutellaria L., широко распространенные на территории РФ. Во многих видах этого рода обнаружены фенолыше соединения, в частности, флавоноиды, дубильные вещества и ароматические кислоты, а также аминокислоты, иридоидные гликозиды и стероидные соединения.

Из представителей рода шлемник в медицинской практике ранее использовался только один вид - шлемник байкальский (Scutellaria baicalensis Georgi). Настойка корней этого вида применялась в качестве гипотензивного и седативного средства. Шлемник обыкновенный (Scutellaria galericulata L.) широко распространен на всей территории РФ, что делает его перспективным в ресурсоведческом отношении. Основными биологически активными веществами двух видов шлемника является комплекс полифенольных соединений (флавоноидов, фенолкарбоновых кислот и дубильных веществ). Трава S. galericulata применяется в качестве седативного средства и включена в Британскую Травяную Фармакопею (2001).

Представляется актуальным углубленное изучение компонентного состава биологически активных веществ и фармакологической активности извлечений из травы S. galericulata, произрастающей на Северо-Западе России, с целью введения ее в научную медицину.

Диссертационная работа выполнена на кафедре фармакогнозии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии в соответствии с планом научно-исследовательских работ СПХФА по теме «Мониторинг перспективных лекарственных растений флоры России» (номер Государственной регистрации 01200852355). Исследования с использованием приборных хроматографических методов выполнены в аналитическом центре академии и лаборатории экологии растительных сообществ Ботанического института им. В. JI. Комарова Российской Академии Наук. Фармакологические исследования проводились на кафедре фармакологии СПХФА. Изучение гербарных образцов S. galericulata проводили на базе Ботанического Музея БИН РАН им. Комарова.

Цели и задачи исследования. Целью данного исследования является проведение фармакогностического изучения и стандартизация травы шлемника обыкновенного как перспективного лекарственного растительного сырья для введения в медицинскую практику. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Провести общий фитохимический анализ травы galericulata, заготовленной на территории Северо-Запада России, и сравнить с результатами анализа травы 5. бя/са/еш'Н'

• Изучить качественный состав основных групп биологически активных веществ 5. galericulata, провести исследование динамики накопления действующих веществ в траве 5. galericulata и разработать методики количественного определения маркерных групп соединений для установления доброкачественности сырья;

• Определить уровень острой токсичности и специфической биологической активности на животных сухого экстракта из травы Я. galericulctta;

• Установить макро- и микроскопические признаки сырья 5. galericulata;

• Провести товароведческий анализ для установления норм качества лекарственного растительного сырья;

• Разработать проект нормативной документации (проект фармакопейной статьи) на сырье «Шлемника обыкновенного трава».

Научная новизна. Изучен химический состав основных групп БАВ шлемника обыкновенного. Впервые установлена динамика накопления суммы флавоноидов и дубильных веществ в траве 5. galericulata, произрастающей на территории Северо-Запада России, получены данные о его компонентном составе.

С помощью современных физико-химических методов (ВЭЖХ, газовой хроматографии с масс-селективным детектором, спектрофотометрии) впервые для данного вида идентифицированы: флавоновый гликозид - космосиин; ароматические кислоты и их производные (галловая, хлорогеновая, феруловая, кофейная, и-гидроксикоричная, коричная и моно-2-этилгексиловый эфир 1,3-бензендикарбоксиловой кислоты), производные флаван-3-ола (эпигаллокатехин и эпикатехин); жирные кислоты и их производные (олеиновая, линоленовая и метиловый эфир пальмитиновой кислоты), алифатическое соединение тритерпеновой природы - сквален и два стероидных соединения - кампестерол и у-ситостерол.

В ходе общего фитохимического анализа показано, что Б. galericulata и 5. Аа/са/еи.?« содержат одни и те же группы биологически активных соединений.

Практическая значимость. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в траве шлемника обыкновенного, которая введена в практику научных исследований растительных объектов и учебного процесса на кафедре фармакогнозии СПХФА. Определена оптимальная фаза вегетации растения для заготовки сырья и установлены оптимальные сроки его заготовки. Установлены критерии, позволяющие оценить подлинность и доброкачественность сырья. Результаты работы использованы при разработке проекта нормативной документации на предлагаемый новый вид лекарственного сырья «Шлемника обыкновенного трава» (ФС). Разработана технология сухого экстракта травы шлемника обыкновенного. Экспериментально установлено, что сухой экстракт

S. galericulata обладает низкой токсичностью; также показана антигипоксическая активность сухого экстракта растения. Результаты фитохимического и фармакологического исследований могут быть использованы при целенаправленном создании фитопрепаратов из травы шлемника обыкновенного, обладающих аитигиноксическим эффектом.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: Межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений», посвященная 90-летию СПХФЛ (Санкт-Петербург, СПХФА 2009); I Съезде натуротсрапсвтов в рамках VII Международного конгресса «Традиционная медицина» (Москва, 2009); 65-й региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2010 г.); II Всеросийской молодежной научно-практической конференции «Перспективы развития и проблемы современной ботаники» (Новосибирск, 2010); Научной конференции студентов и молодых ученых (аспирантская сессия) (Санкт-Петербург, СПХФА, 2010); Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», посвященной 120-летию со дня основания НИИЭМ СЗО РАМН (Санкт-Петрбург, 2010); Научно-методической конференции «Гаммермановские чтения -2011) (Санкт-Петербург, СПХФА, 2011); Всероссийской научно-практической конференции «Современная фармацевтическая наука и практика: традиции, инновации, приоритеты» (Самара, 2011).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 9 работах, в том числе 2 статьи в рецензируемых научных изданиях.

Основные положения, выносимые на защиту.

• Результаты общего фитохимического изучения травы S. galericulata',

• Исследование динамики накопления и компонентного состава основных групп биологически активных веществ из травы S. galericulata (флавоноидов, фенольных кислот, дубильных веществ, углеводов);

• Результаты изучения некоторых аспектов биологической активности сухого экстракта из травы S. galericulata;

• Данные товароведческого анализа сырья «Шлемника обыкновенного трава» и его стандартизация.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 170 страницах машинописного текста, иллюстрирована 38 рисунками и 49 таблицами. Диссертация состоит из введения, 6 глав (обзор литературы, материалы и методы и четыре главы, содержащие результаты экспериментальных исследований), основных результатов и выводов, списка литературы, включающего 147 источника, из них 42 на иностранных языках, 4 приложений.

В первой главе рассмотрены систематическое положение, химический состав и биологическая активность видов рода Scutellaria. Во второй главе приведены основные материалы и методы исследований, использованные в экспериментальной работе. В третьей главе приведены результаты фитохимического анализа травы S. galericulata и 5. baicalensis. В четвертой главе отражены результаты фармакологического изучения сухого экстракта шлемника обыкновенного. В пятой главе указаны особенности распространения шлемника обыкновенного на территории Северо-Запада России и проведено ресурсоведческое исследование по определению запасов данного вида. Шестая глава посвящена вопросам

стандартизации сырья «Шлемника обыкновенного трава», проведению товароведческого анализа, разработке критериев подлинности, нормативов доброкачественности и определению сроков годности сырья. В разделе «Основные результаты и выводы» приведены заключительные результаты и выводы по проделанной работе. Приложение А включает список исследованных образцов шлемника обыкновенного; Приложение Б - Масс-спектры идентифицированных веществ; Приложение В - проект ФС на сырье «Шлемника обыкновенного трава» и пояснительную записку к нему, Приложение Г - Акты о внедрении результатов диссертационной работы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Материалы и методы исследования

Основными объектами исследований служили образцы травы шлемника обыкновенного, собранные от дикорастущих растений в разные фазы вегетации в Ленинградской, Псковской и Новгородской областях в мае-сентябре 2006-2010 гг. При проведении фитохимических исследований в качестве объекта для сравнения использовали траву шлемника байкальского от культивируемых растений, выращенных на приусадебном участке в Псковской области (2006-2008 г.).

Качественный и количественный анализ основных групп биологически активных веществ проводили с использованием общепринятых химических, а также современных физико-химических методов. Для выделения и идентификации природных компонентов использовали адсорбционную жидкостную колоночную хроматографию (ЖКХ), хроматографию на бумаге (БХ) и в тонком слое (ТСХ), а также ВЭЖХ, ГЖХ, УФ- и ИК-спектрофотометрию, газовую хроматографию с масс-селеетивным детектором (ГХ/МС), атомно-абсорбционную и атомно-эмиссионную спектрофотометршо. Фармакологические исследования проводили на белых нелинейных мышах самцах массой тела 18-20 г. Для определения острой токсичности и антигипоксического действия использовали сухой экстракт травы шлемника обыкновенного.

Отбор проб и товароведческий анализ сырья проводили в соответствии с требованиями ОФС 42-0013-03 «Правила приемки лекарственного растительного сырья и методы отбора проб» (2003) и ГФ XI, вып. 1, 2. Составление проекта нормативной документации -фармакопейной статьи на сырье осуществляли в соответствии с ОСТ 91.500.05.001-00. «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения» (2000).

2. Результаты исследования Фотохимическое изучение травы шлемника обыкновенного

Комплексная фитохимическая оценка травы шлемника обыкновенного показала, что основными группами биологически активных веществ являются соединения полифенольного комплекса (флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества), а также обнаружены углеводы, иридоидные гликозиды, азотистые основания, аминокислоты. S. baicalensis содержит, в основном, тот же набор природных соединений. Не обнаружены в обоих представителях рода Scutellaria кардиотонические гликозиды, антрацен производные и кумарины.

• Методами ЖКХ, ТСХ, БХ и УФ-спектрофотометрией установлено наличие в траве шлемника обыкновенного 5 флавоноидных гликозидов. Цинарозид, как один из доминирующих компонентов полифенольного комплекса, был выделен методом ЖКХ и идентифицирован по физико-химическим параметрам (значениям Rf, УФ- и ИК-спектрам).

Кроме того, методом ЖКХ выделили и идентифицировали в сравнении с образцами свидетелей, а также по результатам изучения продуктов ферментативного гидролиза и УФ-спектрам с различными диагностическими добавками следующие гликозиды: космосиин (7-О-глюкозид апигенина), скутеллярин (7-О-глюкуронид скутелляреина), байкалин (7-О-глюкуронид байкапеина) и 7-О-глюкуронид хризина. Причем присутствие космосиина в данном виде установлено впервые.

Для оценки количественного содержания флавоноидов в сырье была разработана методика дифференциальной спектрофотометрии. Методика основана на проведении реакции комплексообразования с 1% спиртовым раствором алюминия хлорида. В качестве стандартного вещества для пересчета содержания флавоноидов выбран доступный PCO цинарозида. Измерение оптической плотности исследуемых спиртовых извлечений и раствора стандартного образца после реакции с раствором алюминия хлорида проводили при 400 нм, т.к. максимумы поглощения при указанной длине волны практически совпадали (рис. 1).

Рисунок 1 - Дифференциальные УФ спектры (фрагмент) поглощения раствора PCO цинарозида (1) и спиртового извлечения из травы шлемника обыкновенного (2) с 2% спиртовым раствором алюминия хлорида

При разработке методики количественного определения подобраны оптимальные условия экстракции сырья: наибольшее количество флавоноидов извлекается при трехкратной экстракции 70% спиртом и нагревании на кипящей водяной бане в течение 20 минут, при соотношении сырья и экстрагента 1:30, оптимальный размер частиц сырья - 1 мм. Время взаимодействия алюминия хлорида с флавоноидами - 20 минут.

Проведена валидационная оценка методики, в результате чего установлено, что предложенная методика количественного определения отвечает современным требованиям, а именно, она специфична, носит линейный характер, позволяет получить достоверные результаты, воспроизводима в условиях лаборатории. Относительная ошибка опыта не превышает 1,5%.С использованием разработанной методики была определена динамика

35D.0 <51ХМ) 450.0 500.0 Длина волны, нм

накопления суммы флавоноидов в траве Я. galericulata в разные фазы вегетации и в зависимости от места заготовки (рис. 2).

отрастание бутонизация цветение начало массовое

- побегов плодоношения плодоношение

о

и [ЗЛениградская область О Псковская область

Рисунок 2 - Динамика накопления суммы флавоноидов в траве Scutellaria galericulata, заготовленной в различные фазы вегетации в Ленинградской и Псковской областях

Максимальное накопление флавоноидов в траве S. galericulata наблюдается в фазы цветения и начала плодоношения и составляет от 2,72 до 3,44%.

• Исследование фенольных кислот S. galericulata проводили методом ВЭЖХ. Всего пять фенольных кислот было идентифицировано в образцах сырья, собранных в разные фазы вегетации и определена динамика их содержания (табл. 1). Для каждой фазы вегетации было определено не более трех фенольных кислот. Хроматограмма спиртового извлечения из сырья, заготовленного в Ленинградской области в фазу цветения представлена на рисунке 3.

Таблица 1 - Содержание фенольных кислот в траве шлемника обыкновенного, заготовленного в Ленинградской области

Наименование кислот Время удерживания, мин Содержание по фазам вегетации, %

Отрастание побегов Цветение Начало плодоношения Массовое плодоношение

Галловая 3,8 0,015 0,021 0,014 - - —

Хлорогеновая Кофейная 11,6 18,0 0,051 0,052 0,031 0,018 0,021 0,014

я-Гидроксикоричная 26,4 — - — 0,065

Феруловая 28,2 - 0,021 0,041 -

Установлено, что галловая кислота в свободном виде определяется только в фазу отрастания побегов. Содержание кофейной, хлорогеновой кислот достигает максимальной концентрации в фазу цветения и заметно снижается в фазу массового плодоношения. Концентрация феруловой кислоты возрастает к фазе начала плодоношения, а в фазу массового плодоношения данная кислота не определяется. л-Гидроксикоричная кислота была обнаружена только в фазу массового плодоношения.

Рисунок 3 - Хроматограмма (ВЭЖХ) спиртового извлечения травы S. galericulata, заготовленной в Ленинградской области в фазу цветения (длина волны 330 нм): 1 - хлорогеновая, 2 - кофейная, 3 - феруловая кислоты

• Количественное содержание суммы таннидов в сырье определяли в сравнении двумя методами: перманганатометрическим титрованием по методике ГФ XI (метод 1) и спектрофотометрически в пересчете на танин (метод 2).

При разработке спектрофотометрической методики суммарного содержания дубильных веществ исследовали УФ спектры водной вытяжки из травы шлемника обыкновенного и раствора препарата танина, максимумы поглощения которых совпадали при длине волны 274±2 нм (рис. 4). Данная длина волны была предложена в качестве аналитической.

Установлены технологические параметры методики: оптимальная степень измельчения сырья составляет 2 мм; для полноты извлечения необходима однократная экстракция водой очищенной на кипящей водяной бане в течение 90 мин при соотношении сырья и экстрагента 1:125

0.50

к '' 4<> I

ё OJO

° 0.10 В.Ой

200 0 3Í0.0 <Г)00 35н,(3 то ISO" <00.0

Длина волны, ни

Рисунок 4 - УФ спектры поглощения водного извлечения из травы шлемника обыкновенного (1) и раствора танина (2)

В результате использования разработанной методики установлено, что максимальное содержание дубильных веществ в образцах из Ленинградской и Псковской областях накапливается в фазы цветения и начала плодоношения и колеблется от 4,9 до 5,4% (табл. 2).

1:' 1 ; ;

1,: ;............ i -i

1Ш....... I

: V;

Таблица 2 - Результаты определения содержания дубильных веществ перманганатометрическим (метод 1) и спектрофотометрическим (метод 2) методами в образцах сырья шлемника обыкновенного

Фаза вегетации Место и дата заготовки образца Суммарное содержание дубильных веществ, %

Метод 1 Метод 2

Отрастание побегов Ленинградская обл., Всеволожский район, 2009 г. 2,8 ± 0,3 2,0 ±0,06

Бутонизация Ленинградская обл., Всеволожский район, 2009 г. 5,7 ±0,2 3,9± 0,04

Псковская обл., Опочецкий район, 2009 г. 5,6 ± 0,2 3,9± 0,05

Цветение Ленинградская обл., Всеволожский район, 2009 г 7,8 ± 0,2 5,1± 0,05

Псковская обл., Опочецкий район, 2009 г. 9,1 ±0,3 5,4± 0,06

Начало плодоношения Ленинградская обл., Всеволожский район, 2009 г 7,6 ± 0,3 5,3± 0,04

Псковская обл., Опочецкий район, 2009 г. 8,7 ± 0,2 4,9± 0,04

. Массовое плодоношение Ленинградская обл., Всеволожский район, 2009 г 4,8 ± 0,3 4,1± 0,07

Псковская обл., Опочецкий район, 2009 г. 3,5 ± 0,3 3,0± 0,05

В результате использования двух методов количественного определения в образцах травы шлемника обыкновенного выявлена тенденция изменения содержания таннидов по фазам вегетации растения. Причем, более высокие значения по их содержанию во всех образцах получены методом перманганатометрии, что может быть объяснено различной избирательностью данных методик в отношении этой группы фенольных соединений.

• Из травы шлемника обыкновенного были выделены свободные моносахариды и водорастворимые полисахариды. Свободные моносахариды извлекали спиртом этиловым 80% из сырья, предварительно очищенного от липофильных веществ, а водорастворимые полисахариды (ВРПС) - водой из шрота, оставшегося после выделения свободных моносахаридов. Методом БХ среди моносахаридов идентифицированы глюкоза, галактоза, ксилоза, манноза. Установлена динамика содержания свободных моносахаридов и ВРПС по фазам вегетации растения, спектрофотометрическим методом после реакции с фенолом и кислотой серной концентрированной в пересчете на глюкозу: максимальное накопление свободных моносахаридов и ВРПС наблюдалось в фазу цветения - начала плодоношения и составило 3,9-4,7% и 2,7-3,2% соответственно. Минимальное количество углеводов обнаружено в траве в фазу бутонизации и фазу плодоношения - конца вегетации (табл. 3).

Мономерный состав ВРПС и пектиновых веществ определяли после гидролиза раствором кислоты трифторуксусной 2% методами БХ и ГЖХ триметилсилильных производных на хроматографе «Кристалл-2000М» (Россия) с пламенно-ионизационным детектором. Результаты показали, что в составе ВРПС 5. galericulata построенных преимущественно из остатков нейтральных моносахаридов, преобладает арабиноза. Кроме того, соотношение 01и:0а1 в составе ВРПС из сырья, собранного в Ленинградской области примерно одинаковое, а в составе ВРПС сырья, заготовленного в Псковской области,

содержание галактозы превышает содержание глюкозы почти в 2 раза, что, вероятно, связано с местом заготовки сырья (табл. 4).

Таблица 3 - Содержание свободных моносахаридов и водорастворимых полисахаридов в траве шлемника обыкновенного

Содержание углеводов, %

Фаза вегетации Свободных Водорастворимых

моносахаридов полисахаридов

Ленинградская обл., Всеволожский район, 2009 г.

Бутонизация 0,8 ±0,1 1,6 ±0,2

Цветение - начало плодоношения 3,9 ±0,3 2,7 ±0,1

Массовое плодоношение 2,8 ±0,3 2,3 ± 0,3

Плодоношение - конец вегетации 1,9 ±0,2 1,3 ±0,3

Псковская обл., Себежский район, 2009 г.

Бутонизация 1,0 ±0,2 2,0 ±0,1

Цветение - начало плодоношения 4,7 ±0,3 3,2 ±0,2

Массовое плодоношение 3,1 ±0,2 2,6 ± 0,3

Плодоношение - конец вегетации 1,7 ±0,2 1,8 ±0,2

Таблица 4 - Содержание основных моносахаридов (в %) в составе ВРПС шлемника обыкновенного

Место и дата заготовки Ara Glu Man Gal GlcA

Псковская обл., Себежский район, 2009 г. 27,4 22,6 6,3 9,7 13,6 12,1 0,5

Ленинградская обл., Всеволожский район, 2009 г. 9,5 9,2 0,3

Примечание - Надземная часть заготовлена в фазу цветения - начала плодоношения

В составе пектиновых веществ S. galericulata, дополнительно к моносахаридам, обнаруженным в составе ВРПС, установлено наличие рамнозы, ксилозы, фукозы и кислых моносахаридов (глюкуроновой и галактуроновой кислоты). По количественному соотношению также преобладает арабиноза.

• Для выявления неидентифицированных ранее соединений применяли метод газовой хроматографии с масс-селективным детектором на системе «Agilent 6890 N 5975 С» (США), состоящей из газового хроматографа 6890N и масс-селективного детектора 5975С. Исследованию подвергали образец травы S. galericulata, заготовленный в Ленинградской области в фазу цветении - начала плодоношения в 2010 году. Результаты газо-хроматографического разделения компонентов спиртового извлечения представлены на рисунке 5.

В траве S. galericulata впервые данным методом идентифицированы: два ароматических соединения - коричная кислота и моно 2-этилгексиловый эфир 1,2-бензендикарбоксиловой кислоты, стероидные соединения - кампестерол и у-ситостероп, алифатическое соединение терпеновой природы - сквален, жирные кислоты - олеиновая и линоленовая, а также метиловый эфир пальмитиновой кислоты (табл. 5).

Рисунок 5 - Хроматограмма газо-хроматографического разделения компонентов 70% спиртового

извлечения из травы S. galericulala

Условные обозначения: 1- коричная кислота; 2 - метиловый эфир пальмитиновой кислоты; 3 -линоленовая кислота; 4 - олеиновая кислота; 5 - моно 2-этилгексиловый эфир 1,2-бензендикарбоксиловой кислоты; 6 - сквален; 7 - кампестерол; 8 ~ у-ситостерол

Таблица 5 - Результаты хромато-масс-спектроскопического анализа идентифицированных соединений травы шлемника обыкновенного

Название соединений Время удерживания, мин Степень достоверности, %

Коричная кислота 8,47 92

Метиловый эфир пальмитиновой кислоты 11,92 98

Линоленовая кислота 13,34 99

Олеиновая кислота 13,44 99

Моно 2-этилгексиловый эфир 1,3-бензенди-карбоксиловой кислоты 15,62 91

Сквален 17,45 99

Кампестерол 22,64 91

у-Ситостерол 24,33 99

• Для изучения состава макро- и микроэлементов в траве растения использовали атомно-абсорбционный и атомно-эмиссионный спектральные методы на спектрофотометре «Квант-АФА» (Россия). Идентификацию и количественное определение микро- и макроэлементов проводили с помощью атласа спектральных линий и спектров стандартов. Полученные результаты представлены в таблице 6.

Следует обратить внимание на высокое содержание макроэлемента калия. Концентрация макро- и микроэлементов напрямую зависит от места произрастания растения, а именно от состава почв. Содержание марганца, цинка и меди достаточно высокое, что сопоставимо с литературными данньми по составу микроэлементов для другого вида рода -

шлемиика байкальского. Содержание макро- и микроэлементов не превышает верхних допустимых уровней потребления согласно Сан ПиН 2.3.2. 1078-01.

Таблица 6 - Содержание макро- и микроэлементов в траве шлемника обыкновенного (сбор 2010 года, фаза цветения)

------Образцы сырья Ленинградская обл., Псковская область,

Элементы ——----- Всеволожский район Опочецкий район

Макроэлементы, г/кг

К 1,78 2,94

Са 0,78 0,82

мй 0,26 0,30

Микроэлементы, мг/кг

Мп 117,92 63,42

Ъа 41,66 105,98

Ре 26,45 103,31

Си 4,95 9,06

Со ............. 0,45................................... 0,50

N1 0,39 0,41

РЬ 2,65 2,87

Экологическая приуроченность и оценка запасов сырья шлемника обыкновенного

Географическое распространение и экологическая приуроченность £ galericulata изучались на основе анализа гербарных образцов, из коллекционного фонда в Ботанического инстшута им. В.Л. Комарова РАН, а также в период сбора образцов в Ленинградской и Псковской области. Растительные сообщества с участием шлемника обыкновенного в травянистом ярусе, как правило, имеют мезофитный и гигромезофитный характер, вид распространен преимущественно на заболоченных территориях, нередко по заросшим кустарниками берегам рек, ручьев, озер и других водоемов. Иногда обитает в местах, связанных с деятельностью человека: на обочинах дорог, залежах и насыпях железнодорожного полотна, а также в садах и огородах как сорное растение.

Определение урожайности травы Я. galericulata проводили методом учетных площадок в пределах конкретных зарослей на примере заросли в Себежском районе Псковской области. Средняя урожайность составила (32,2 ± 2,9 г/м2), выход воздушно-сухого сырья (в среднем 18,9 % от свежей фитомассы), рассчитано значение эксплуатационного запаса (5,3 т воздушно-сухого сырья).

Изучение фармакологической активности шлемника обыкновенного

С целью изучения безопасности применения препаратов из травы 5. galericulata определяли острую токсичность сухого экстракта. Средняя смертельная доза сухого экстракта шлемника обыкновенного (СЭШО) при внутрибрюшинном введении составила 2,4 ± 0,3 г/кг. Значение ЬП50 при пероралыюм введении определить не удалось вследствие ограничения объема введения препарата. Таким образом, исследуемый СЭШО малотоксичен.

Ангигипоксическую активность СЭШО изучали на моделях: острой гисготоксической гипоксии (ОПТ), острой гемической гипоксии (ОГТ) и гипоксии с гиперкапнией (ГТК), для этого вводили СЭШО белым нелинейным мышам самцам в дозах 1/10 (0,24 г/кг) и 1/100 (0,024 г/кг) от 1ЛЭ50 (табл. 8). Установлено, что на модели ОПТ СЭШО проявляет антигипоксический эффект в дозе 1/10 Ы)50 близкий по эффективности препарату сравнения гутимину и немного уступает препарату сравнения в дозе 1/100 1ЛЭ50. В условиях ОГТ СЭШО в двух исследуемых дозах превосходит эффективность препарата сравнения гутимина. Продолжительность жизни экспериментальных животных возрастала на 92 % по сравнению с показателем контрольной группы животных при введении дозы 1/10 1Т)50- На модели ГТК максимальный эффект СЭШО отмечен при введении дозы 1/100 I -П50. Продолжительность жизни опытных животных возрастала на 37 % по сравнению с группой контрольных животных и уступала эффекту препарата сравнения гипоксену на 14 % (табл. 7). Сухой экстракт шлемника обыкновенного воздействует на различные участки гипоксических нарушений. Максимальная активность СЭШО наблюдается на модели гисготоксической гипоксии, т.е. в защите фермента цитохромоксидазы, что можно рассматривать как основу для более глубокого фармакологического исследования.

Таблица 7 - Влияние сухого экстракта шлемника обыкновенного на переносимость различных видов гипоксических состояний

Препарат Доза Продолжительность Продолжительность

жизни животных, мин. жизни к контролю, %

Острая гистотоксическая гипоксия

Контроль - 4,5 ±1* 100 + 5*

Гутимин 1 ООмг/кг 12,6 + 2* 280+ 10*

СЭШО 1/10 ГЛЭ50 1/100 №50 10,1 + 2* 6,5+3* 224 + 9* 144+10*

Острая гемическая гипоксия

Контроль - 23,5+1* 100 + 5*

Гутимин 1 ООмг/кг 28,0+ 1* 120 ±8*

СЭШО 1/10 1Л}50 45,1 ± 1* 192 ±8*

1/100Ь05о 34,2 + 2* 145 + 9*

Гипоксия с гиперкапнией

Контроль - 65,5 ±1 100 ±5

Гипоксен 1 ООмг/кг 91,1 + 1* 139 ±8*

СЭШО 1/ЮЬО50 77,3 ±1* 118 + 8*

1/1001Л}30 90,2 + 2 137 + 9

Примечание - * - Отличие от контроля статистически достоверно, р < 0,05

Разработка показателей подлинности и качества сырья «Шлемника обыкновенного травы» и его стандартизация

Проведение макроскопического анализа позволило выявить основные морфологические диагностические признаки сырья: стебель четырехгранный опушен по ребрам редкими

волосками; листорасположение супротивное, листья яйцевидные или узкояйцевидные, при основании слегка сердцевидные, верхушка - заостренная, край - тупогородчатый, жилкование - перисторассеченное; цветки располагаются по одному - два в пазухах верхних листьев, чашечка - короткоопушённая, двугубая, венчик - шлемовидный, на нижней его губе обычно заметно белое пятно с фиолетовыми вкраплениями; незрелые плоды светло-зелёные, мелкобугорчатые, состоят из четырёх эрем.

При изучении анатомических признаков сырья, было установлено, что диагностическое значение имеет строение листьев, венчика, чашечки и стебля X %а1епсиЫа. Для микроскопии листьев характерен устьичный аппарат диацитного типа; клетки эпидермиса верхней стороны листовой пластинки паренхимные извилистостенные, нижней стороны - с чуть более извилистыми стенками; на поверхности листьев характерно наличие восьми- четырехклеточных эфирномасличных железок, по жилкам и краю листовой пластинки - тонкостенных двухклеточных и одноклеточных, а также толстостенных бородавчатых и простых одноклеточных волосков. Чашечка обильна опушена простыми многоклеточными тонкостенными волосками и головчатыми волосками с многоклеточной и одноклеточной ножкой, а также восьмиклеточными железками. Для венчика характерно большое количество тонкостенных простых многоклеточных волосков и отсутствие железок. На поверхности стебля изредка встречаются простые двухклеточные волоски. Стебель имеет пучковое строение, пучки открытого коллатерального типа. Под покровной тканью (эпидермисом) на поперечном срезе отмечается наличие уголковой колленхимы - в 1-2 ряда на плоских сторонах и 7-10 рядов по ребрам.

Для определения подлинности травы шлемника обыкновенного предложены качественные реакции: на флавоноиды (с алюминия хлоридом, цианидиновую пробу и ТСХ) и на дубильные вещества (с 1% раствором желатина).

Оценку содержания флавоноидов проводили методом дифференциальной спектрофотометрии. Содержание суммы флавоноидов определяли в пересчете на цинарозид в 10 независимых повторностях. Относительная ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95% составляет 1,5%, что свидетельствует о достоверности результатов (табл. 8). Для оценки доброкачественности сырья рекомендуется показатель: «содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид не менее 2,6%».

Таблица 8 - Метрологические характеристики методики количественного определения флавоноидов в траве шлемника обыкновенного

/ X 1 ъ 8 Р, % 1( Р,/) Дх 6,%

10 3,22 0,0013 0,037 95 2,23 0,05 1,50

Для количественной оценки дубильных веществ в сырье использовали метод прямой спектрофотометрии. Содержание данной группы БАВ определяли в пересчете на препарат танина. Для разработанной методики установлены метрологические характеристики (табл. 9). Определен показатель доброкачесгвенности сырья: «содержание дубильных веществ в пересчете на танин не менее 4,8%».

Таблица 9 - Метрологические характеристики методики количественного определения дубильных веществ в траве шлемника обыкновенного

/ X 2 5 Б Р,% 1(Р,Л Дх Е,%

10 5,35 0,0032 0,056 95 2,23 0,04 1,70

В результате товароведческого анализа пяти партий сырья 51. galericulata установлены следующие числовые показатели, которые были включены в проект ФС (табл. 10).

Таблица 10 - Числовые показатели - шлемника обыкновенного травы (цельного и измельченного сырья)

Наименование показателя Среднее значение, % Рекомендуемое значение показателя, %

Цельное сырье Измельченное сырье

Суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид 3,24±0,12 Не менее 2,6 Не менее 2,6

Дубильных веществ в пересчете на танин 5,35±0,12 Не менее 4,8 Не менее 4,8

Потеря в массе при высушивании Золы общей Золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной Стеблей, в том числе отделенных при анализе Частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 5 мм 7,67±0,16 6,37±0,10 0,46±0,02 Не более 10 Не более 7 Не более 0,6 Не более 10 Не более 7 Не более 0,6

12,3±1,1 Не более 15 -

4,8±0,3 - Не более 7

Частиц, проходящих сквозь сито с отверстиям □ диаметром 0,5 мм 3,9±0,3 Не более 5

Частей сырья, изменивших окраску и поврежденных вредителями 1,8±0,3 Не более 5 Не более 1 Не более 5

Органической примеси Минеральной примеси 0,32±0,15 Не более 1

0,20±0,01 Не более 0,5 Не более 0,5

Примечание — Прочерк означает, что для данного сырья определение показателя не предусмотрено. Все партии сырья заготовлены в фазу цветения - начала плодоношения

Результаты анализа содержания основных групп действующих веществ - флавоноидов и дубильных веществ, а также влажности, золы общей, золы нерастворимой в 10% хлористоводородной кислоте и содержание стеблей, в том числе отделенных при анализе и частиц, изменивших окраску и поврежденных вредителями а образцах сырья, заготовленных в 2006-2008 годы показали, что срок годности шлемника обыкновенного травы составляет 3 года.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. В траве шлемника обыкновенного (£ galericulata Ь.) установлено наличие полифенольного комплекса (флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, дубильных веществ), полисахаридов, иридоидных гликозидов, азотистых оснований, аминокислот, следов эфирного масла, макро- и микроэлемиггов.

2. Методами жидкостной колоночной и препаративной хроматографии из сырья шлемника обыкновенного выделены и идентифицированы: цинарозид, космосиин, байкалин, скутеллярин, 7-0-глюкуронид хризина. Космосиин обнаружен в данном растении впервые. Для оценки качества сырья разработана методика количественного определения флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии в пересчете на цинарозид. Установлено, что максимальное их накопление наблюдается в фазу цветения - начала плодоношения и составляет до 3,44%.

3. Впервые методом ВЭЖХ в траве S. galericulata идентифицированы галловая, хлорогеновая, кофейная, и-гидроксикоричная, феруловая кислоты и изучена динамика их накопления по фазам вегетации растения. Используя метод газовой хроматографии с масс-селективным детектором впервые установлено присутствие в траве шлемника обыкновенного: коричной кислоты и моно 2-этилгексилового эфира 1,2-бензендикарбоксиловой кислоты, кампестерола и у-ситостерола, сквалена, жирных кислот (олеиновой и линоленовой), а также метилового эфира пальмитиновой кислоты.

4. С помощью качественных реакций и методом бумажной хроматографии установлено присутствие ташшдов гидролизуемой и конденсированной группы, а также производных флаван-3-ола - эпикатехина и эпигаллокатехина. Предложена спектрофотометрическая методика в пересчете на танин. Установлено, что максимальное накопление дубильных веществ наблюдается в фазы цветения - начала плодоношения и составляет до 5,43%.

5. Установлен качественный и количественный состав мономеров, входящих в структуру водорастворимых полисахаридов и пектиновых веществ S. galericulata. Максимальное накопление свободных моносахаридов и водорастворимых полисахаридов в траве изучаемого вида отмечается в фазы цветения - начала плодоношения.

6. Впервые определено содержание 3 макро- и 7 микроэлементов в траве шлемника обыкновенного, среди которых отмечено сравнительно высокое накопление калия, марганца, цинка, железа, меди.

7. Оценка острой токсичности показала, что сухой экстракт травы шлемника обыкновенного малотоксичен, обладает антигипоксическим действием на трех основных моделях гипоксических состояний (гемической, гистогоксической гипоксии и гипоксии с гиперкагагаей). Максимальная активность экстракта наблюдается на модели гистотоксической гипоксии, т.е. в защите фермента цитохромоксидазы.

8. На примере конкретной заросли в Себежском районе Псковской области определена средняя урожайность (32,2 ± 2,9 г/и2), выход воздушно-сухого сырья (в среднем 18,9 % от свежей фитомассы), эксплуатационный запаса (5,3 т воздушно-сухого сырья).

9. Разработан проект фармакопейной статьи на новый вид сырья «Шлемника обыкновенного трава». Установлены макро- и микроскопические признаки сырья, определены нормативы доброкачественности.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Дудецкая Н. А., Теслов JI. С. Перспективное лекарственное растение рода шлемника-Scutellaria galericulata L. // I Съезд натуротерапевтов. Приложение к специальному выпуску журнала «Традиционная медицина». - М., 2009. - № 3 (18). - С. 123.

2. Дудецкая Н. А. Спектрофотометрическое определение суммы флавоноидов в траве шлемника обыкновенного // Тезисы докладов межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений». - СПб., 2009. - С.34 - 35.

3. Дудецкая Н. А., Анисимова Н. А. Антигипоксическая активность сухого экстракта травы шлемника обыкновенного // Медицинский академический журнал. - СПб., 2010. - Т. 10, №5.-С. 158.

4. Дудецкая Н. А., Теслов JI. С. Количественное определение дубильных веществ и динамика их накопления в надземной части шлемника обыкновенного // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. Сборник научных трудов. -Пятигорск, 2010. - Вып. 65. - С. 40 - 42.

5. Дудецкая Н. А., Теслов Л. С. Особенности распространения и запасы травы Scutellaria galericulata на территории Северо-Западного региона России // Перспективы развития и проблемы современной ботаники. Материалы II (IV) Всероссийской молодежной научно-практической конференция. - Новосиборск, 2010. - С. 324 - 325.

6. Дудецкая Н. А., Теслов Л. С., Анисимова Н. А. Флавоноидный состав видов рода Scutellaria (Lamiaceae) флоры России // Раст. ресурсы. - 2010. - Т. 52, вып. 1. - С. 125 - 143.

7. Дудецкая Н. А. и др. Разработка технологии экстракта травы шлемника обыкновенного и получение гранул на его основе / Н. А. Дудецкая, Л. С. Теслов, М. Г. Ожигова, Ю. А. Махно // Научно-методическая конференция «Гаммермановские чтения - 2011»: сборник научных трудов.-СПб., 2011.-С. 28.

8. Дудецкая Н. А., Теслов Л. С., Сипкина Н. Ю. Состав и содержание фенольных соединений в надземной части Scutellaria galericulata (Lamiaceae) // Раст. ресурсы. - 2011. - Т. 59, вып. 4.-С. 96- 106.

9. Дудецкая Н. А., Теслов Л. С. Состав углеводов и динамика их накопления в надземной части Scutellaria galericulata L. // Всероссийская научно-практическая конференция «Современная фармацевтическая наука и практика: традиции, инновации, приоритеты»: сборник материалов. - Самара, 2011. - С. 116-117.

Подписано в печать 22.11.2011 Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ 563

Отпечатано в типографии «Адмирал» 199048, Санкт-Петербург, В.О., 6-я линия, д. 59 корпус 1, оф. 40

Актуальность темы. Лекарственные растения занимают важное место в фармацевтической практике. Доля лекарственных препаратов растительного происхождения составляет около 40% от всех официнальных средств на современном отечественном фармацевтическом рынке. По сравнению с синтетическими растительные препараты, наряду с комплексным многосторонним действием на организм человека, обладают, как правило, меньшими побочными эффектами и менее токсичны. В связи с этим изыскание новых видов лекарственного растительного сырья, их внедрение в научную медицину и расширение сырьевой базы остается актуальной задачей современной фармакогнозии.

Многие растения сем. яснотковых (губоцветных) - Lamiaceae Lindl. (.Labiatoe Juss.) обладают широким спектром биологической активности и используются как в официнальной, так и в народной медицине. К числу таких представителей принадлежат виды рода шлемника - Scutellaria L., широко распространенные на территории РФ. Для видов этого рода характерно наличие комплекса флавоноидных агликонов и гликозидов в надземных и подземных органах [80, 96].

Из представителей рода шлемник в отечественной медицинской практике ранее использовался только один вид — шлемник байкальский (,Scutellaria baicalensis Georgi). Настойка корней этого вида применялась в качестве гипотензивного и седативного средства [80]. Шлемник обыкновенный (.Scutellaria galericulata L.) широко распространен на всей территории РФ, что делает его перспективным в ресурсоведческом отношении [34, 37]. В народной медицине Сибири используют настой и отвар надземной части, которые применяют при гипертонической болезни, асците, острых респираторных инфекциях, малярии, при внутренних и наружных кровотечениях, а отвар, кроме того, рекомендуют как болеутоляющее средство, при тошноте, диспепсии, желудочно-кишечных расстройствах [33, 80]. За рубежом трава S. galericulata применяется в качестве седативного средства и включена в Британскую Травяную Фармакопею (1991 и 1996 года) [109]. В некоторых странах Западной Европы настой надземной части назначают при ларингитах [111]. В Болгарии отвар травы шлемника обыкновенного употребляют при тахикардии, болезнях сердца, анемии и эпилепсии, как седативное средство [107]. В индийской медицине — при эпилепсии и перемежающейся лихорадке [80].

Представляется актуальным углубленное изучение компонентного состава биологически активных веществ и фармакологической активности извлечений из надземной части S. galericulata, произрастающего на Северо-Западе России, с целью введения ее в научную медицину.

Диссертационная работа была выполнена на кафедре фармакогнозии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (СПХФА) в соответствии с научным направлением «Изыскание и изучение биологически активных веществ синтетического, микробного и растительного происхождения для создания на их основе импортозамещающих оригинальных отечественных лекарственных субстанций» и тематическим планом научно-исследовательских работ СПХФА по теме «Мониторинг перспективных лекарственных растений флоры России» (номер Государственной регистрации 01200852355). Фармакологические исследования проводились на кафедре фармакологии СПХФА. Исследования с использованием приборных хроматографических и спектроскопических методов выполнены в лаборатории аналитических методов НИУ академии и лаборатории экологии растительных сообществ Ботанического института им. В. Л. Комарова Российской Академии Наук.

Цели и задачи исследования.

Целью работы является фармакогностическое изучение травы galericulata как перспективного лекарственного растительного сырья для введения в научную медицину.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести общий фитохимический анализ травы 5. ga¡ericldata, собранных на территории Северо-Запада России и сравнить с результатами анализа надземной части 5. Ьтса1етгз

2. Изучить качественный состав основных групп биологически активных веществ £ ga¡ericldata, провести исследование динамики накопления действующих веществ в траве & gaIericulata и разработать методики количественного определения маркерных групп соединений для установления доброкачественности сырья;

3. Определить уровень острой токсичности и специфической биологической активности на животных сухого экстракта из травы galericlllata^,

4. Установить макро- и микроскопические признаки сырья б1, galericulata■,

5. Провести товароведческий анализ для установления норм качества лекарственного растительного сырья;

6. Разработать проект нормативной документации (проект фармакопейной статьи) на сырье «Шлемника обыкновенного трава».

Научная новизна. Изучен химический состав основных групп БАВ шлемника обыкновенного. Впервые установлена динамика накопления суммы флавоноидов и дубильных веществ в траве 5. galericulata, произрастающей на территории Северо-Запада России, получены данные о его компонентном составе.

С помощью современных физико-химических методов (ВЭЖХ, газовой хроматографии с масс-селективным детектором, спектрофотометрии) впервые для данного вида идентифицированы: флавоновый гликозид — космосиин; ароматические кислоты и их производные (галловая, хлорогеновая, феруловая, кофейная, и-гидроксикоричная, коричная и моно-2-этилгексиловый эфир 1,3-бензендикарбоксиловой кислоты), производные флаван-3-ола (эпигаллокатехин и эпикатехин); жирные кислоты и их производные (олеиновая, линоленовая и метиловый эфир пальмитиновой кислоты), алифатическое соединение тритерпеновой природы — сквален и два стероидных соединения - кампестерол и у-ситостерол.

В ходе общего фитохимического анализа показано, что S. galericulatci и S. baicalensis содержат одни и те же группы биологически активных соединений.

Практическая значимость. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в траве шлемника обыкновенного, которая введена в практику научных исследований растительных объектов и учебного процесса на кафедре фармакогнозии СПХФА. Определена оптимальная фаза вегетации растения для заготовки сырья и установлены оптимальные сроки его заготовки. Установлены критерии, позволяющие оценить подлинность и доброкачественность сырья. Результаты работы использованы при разработке проекта нормативной документации на предлагаемый новый вид лекарственного сырья «Шлемника обыкновенного трава» (ФС). Разработана технология сухого экстракта травы шлемника обыкновенного. Экспериментально установлено, что сухой экстракт S. galericulata обладает низкой токсичностью; также показана антигипоксическая активность сухого экстракта растения. Результаты фитохимического и фармакологического исследований могут быть использованы при целенаправленном создании фитопрепаратов из надземной части шлемника обыкновенного, обладающих антигипоксическим эффектом.

Внедрение результатов исследования. Результаты работы использованы при разработке проекта нормативной документации (ФС) на предлагаемый вид лекарственного сырья «Шлемника обыкновенного трава». Полученные данные рекомендованы для разработки новых препаратов растительного происхождения в отдел новой продукции ЗАО «Эвалар» г. Бийска. Методика спектрофотометрического определения содержания флавоноидов в сырье S. galericulata введена в практику научных исследований растительных объектов и учебного процесса на кафедре фармакогнозии СПХФА.

Основные положения, выносимые на защиту.

• Результаты общего фитохимического изучения травы 5". galericulata;

• Исследование динамики накопления и компонентного состава основных групп биологически активных веществ из травы S. galericulata (флавоноидов, фенольных кислот, дубильных веществ, углеводов);

• Результаты изучения некоторых аспектов биологической активности сухого экстракта из травы S. galericulata;

• Данные товароведческого анализа сырья «Шлемника обыкновенного трава» и его стандартизация.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

• Межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений», посвященная 90-летию СПХФА (Санкт-Петербург, СПХФА 2009);

• I Съезде натуротерапевтов в рамках VIT Международного конгресса «Традиционная медицина» (Москва, 2009);

• 65-й региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2010 г.);

• II Всеросийской молодежной научно-практической конференции «Перспективы развития и проблемы современной ботаники» (Новосибирск, 2010);

• Научной конференции студентов и молодых ученых (аспирантская сессия) (Санкт-Петербург, СПХФА, 2010);

• Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», посвященной 120-летию со дня основания НИИЭМ СЗО РАМН (Санкт-Петрбург, 2010);

• Научно-методической конференции «Гаммермановские чтения -2011) (Санкт-Петербург, СПХФА, 2011)

• Всероссийской научно-практической конференции «Современная фармацевтическая наука и практика: традиции, инновации, приоритеты» (Самара, 2011)

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 9 работах, в том числе 2 статьи в рецензируемых научных изданиях.

Личный вклад автора. Диссертация представляет собой самостоятельный научный труд и включает исследования автора за период с 2007 по 2011 гг.

Во всех работах, выполненных в соавторстве, вклад автора выражается личным участием в сборе, определении и паспортизации сырья, постановке и выполнении экспериментальных исследований по идентификации природных соединений, проведении товароведческих, фармакологических исследований и обобщении полученных результатов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. В траве шлемника обыкновенного (5. galericulata Ь.) установлено наличие полифенольного комплекса (флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, дубильных веществ), полисахаридов, иридоидных гликозидов, азотистых оснований, аминокислот, следов эфирного масла, макро- и микроэлементов.

2. Методами жидкостной колоночной и препаративной хроматографии из сырья шлемника обыкновенного выделены и идентифицированы: цинарозид, космосиин, байкалин, скутеллярин, 7-0-глюкуронид хризина. Космосиин обнаружен в данном растении впервые. Для оценки качества сырья разработана методика количественного определения флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии в пересчете на цинарозид. Установлено, что максимальное их накопление наблюдается в фазу цветения - начала плодоношения и составляет до 3,44%.

3. Впервые методом ВЭЖХ в траве 5. galericulata идентифицированы галловая, хлорогеновая, кофейная, л-гидроксикоричная, феруловая кислоты и изучена динамика их накопления по фазам вегетации растения. Используя метод газовой хроматографии с масс-селективным детектором впервые установлено присутствие в траве шлемника обыкновенного: коричной кислоты и моно 2-этилгексилового эфира 1,2-бензендикарбоксиловой кислоты, кампестерола и у-ситостерола, сквалена, жирных кислот (олеиновой и линоленовой), а также метилового эфира пальмитиновой кислоты.

4. С помощью качественных реакций и методом бумажной хроматографии установлено присутствие таннидов гидролизуемой и конденсированной группы, а также производных флаван-3-ола - эпикатехина и эпигаллокатехина. Предложена спектрофотометрическая методика в пересчете на танин. Установлено, что максимальное накопление дубильных веществ наблюдается в фазы цветения - начала плодоношения и составляет до 5,43%.

5. Установлен качественный и количественный состав мономеров, входящих в структуру водорастворимых полисахаридов и пектиновых веществ 5. galericulata. Максимальное накопление свободных моносахаридов и водорастворимых полисахаридов в траве изучаемого вида отмечается в фазы цветения - начала плодоношения.

6. Впервые определено содержание 3 макро- и 7 микроэлементов в траве шлемника обыкновенного, среди которых отмечено сравнительно высокое накопление калия, марганца, цинка, железа, меди.

7. Оценка острой токсичности показала, что сухой экстракт травы шлемника обыкновенного малотоксичен, обладает антигипоксическим действием на трех основных моделях гипоксических состояний (гемической, гистотоксической гипоксии и гипоксии с гиперкапнией). Максимальная активность экстракта наблюдается на модели гистотоксической гипоксии, т.е. в защите фермента цитохромоксидазы.

3. На примере конкретной заросли в Себежском районе Псковской области Л определена средняя урожайность (32,2 ± 2,9 г/м ), выход воздушно-сухого сырья (в среднем 18,9 % от свежей фитомассы), эксплуатационный запаса (5,3 т воздушно-сухого сырья).

9. Разработан проект фармакопейной статьи на новый вид сырья «Шлемника обыкновенного трава». Установлены макро- и микроскопические признаки сырья, определены нормативы доброкачественности.