Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Разработка методов анализа флавонов как индикаторных компонентов лекарственного растительного сырья

На правах рукописи

КОШЕЧКИНА АННА СЕРГЕЕВНА

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ АНАЛИЗА ФЛАВОНОВ КАК ИНДИКАТОРНЫХ КОМПОНЕНТОВ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва -2007

003173863

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия им И М Сеченова и ГУ НИИ питания РАМН

Научные руководители.

академик РАМН,

доктор фармацевтических наук,

профессор Арзамасцев Александр Павлович

доктор химических наук Эллер Константин Исаакович

Официальные оппоненты

доктор фармацевтических наук, профессор ГОУ ВПО

ММАим ИМ Сеченова Ермакова Валентина Алексеевна

доктор фармацевтических наук, Институт стандартизации и контроля лекарственных средств ФГУ «Научный центр экспертизы средств

медицинского применения» Титова Анна Васильевна

Ведущая организация. Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений РАСХН

Защита диссертации состоится У I_ 2007 г в 14 часов на

заседании диссертационного совета Д 208 040 09 при ГОУ ВПО Московская медицинская академия им ИМ Сеченова (119019 г Москва, Никитский б-р, 13)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО ММА им ИМ Сеченова (117998, г Москва, Нахимовский пр-т, 49)

Ifi У

Автореферат разослан «1и»_~_2007 г

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 208 040 09,

доктор фармацевтических наук, профессор

Наталья Петровна Садчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Флавоноидами называется группа природных полифенольных биологически активных соединений - производных бею-у-пирона, в основе которых лежит фенилпропановый скелет, состоящий из С6-СЗ-С6 углеродных единиц К основным классам флавоноидов относятся флавоны, флаваноны, дигидрохалконы, халконы, антоцианидины, флаванонолы (дигидрофлавонолы), флавонолы, и изофлавоноиды Разнообразие флавоноидов обуславливается наличием большого числа гидроксилированных, метилированных, ацилированых, О- и С-гликозилированных производных в ароматических ядрах А и В, а также асимметрических атомов углерода в пирановом гетероцикле К классу флавонов (выделено около 20 агликонов) относятся окисленные флавоноиды, не имеющие гидроксила в 3-м положении (кольцо В)

Интерес к природным флавонам связан с их выраженными антиоксидантными свойствами, для ряда флавонов показаны их антиаллергенные, противовоспалительные, антивирусные, антибактериальные свойства и другие типы биологической активности Наиболее ценными источниками флавонов являются прополис, трава петрушки кудрявой и корни шлемника, содержание флавонов в этих объектах превышает 2-2,5%

На основе прополиса разработан целый ряд препаратов, среди которых широко известны «Прополиса настойка», мазь «Пропоцеум», аэрозоль «Пропосол» и др Шлемник байкальский используется как сырье для приготовления настойки гипотензивного и седативного действия Петрушка кудрявая является традиционным пищевым растением Также прополис, шлемник байкальский и петрушка кудрявая входят в состав зарегистрированных биологически активных добавок (БАД) к пище

В настоящее время становится все более актуальной проблема безопасности и подлинности сборов лекарственных трав и биологически активных добавок, а также разработки достоверных критериев их идентификации

Необходимость определения незначительных концентраций действующих

\

веществ на фоне сложного матрикса БАД предъявляет высокие требования к селективности и чувствительности методов анализа

Решение этих задач тормозится отсутствием в большинстве случаев достоверных методов контроля действующих начал в составе комплексных БАД Большинство существующих нехроматографических методов определения индикаторных компонентов растительных БАД неселективны, трудоёмки и могут в отдельных случаях приводить к получению, как ложноположигельных результатов, так и к искажению количественных данных

Одними из наиболее перспективных методов для решения этих задач являются хроматографические методы, сочетающие высокую эффективность разделения компонентов БАД с избирательностью и чувствительностью детектирования Цель и задачи исследования

Цель настоящего исследования - разработать методики анализа флавонов в наиболее ценных источниках этих веществ прополисе, корнях шлемника и траве петрушки Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи

1 Изучить физико-химические свойства флавонов,

2 Разработать методики пробоподготовки сырья и продуктов на его основе, обеспечивающие наибольшую эффективность экстракции, характеризующиеся невысокой трудоемкостью,

3 Подобрать оптимальные хроматографические условия для определения флавонов на фоне сложного матрикса,

4 Оценить параметры пригодности хроматографических систем,

5 Разработать методики количественного определения флавонов,

6 Оценить метрологические характеристики разработанных методик,

7 Апробировать разработанные методики на образцах растительного сырья, экстрактах, лекарственных препаратах, БАД и обогащенных продуктах на его основе

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук Диссертационная работа выполнена в рамках НИР кафедры

фармацевтической химии ММА им ИМ Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств», № госрегистрации 01 200 110545

Научная новизна результатов исследования. Разработаны оригинальные методики идентификации и количественного определения индикаторных флавонов в лекарственных препаратах, Б АД ах и пищевых продуктах определение апигенина, акацетшга и хризина в прополисе, определение байкалина в шлемнике байкальском, определение апиина и малонилапиина в петрушке кудрявой

Практическая значимость результатов исследования. Разработанные методики использовались при гигиенической экспертизе более 80 БАД и сырья для БАД к пшце в ГУ НИИ Питания РАМН Методики определения апигенина, акацетшга и хризина в прополисе, определение байкалина в шлемнике байкальском, определение апиина и малонилапиина в петрушке кудрявой включены в «Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище» (дополнение к Р4 1 1672-03, Минздрав РФ)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ Апробация работы. Результаты исследований доложены на межрегиональной научно-практической конференции «Питание здорового и больного человека» (май 2007г, г Рязань), на научных конференциях кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии ММА им ИМ Сеченова (2005 - 2007гг), на Международной научно-практической конференции Арнпопйш (июль 2005г, г Дублин), на семинаре «Аналитическая химия в контроле безопасности, качества и подлинности пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище» Апа1уПсаЕхро-2006 (апрель 2006г, Москва), конгрессе «Фитофарм 2006» (июнь 2006г, Санкт-Петербург)

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 106 стр машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследования и их обсуждения,

выводов и библиографического указателя, включающего 115 источников Работа иллюстрирована 19 рисунками и 23 таблицами Положения, выносимые на защиту:

• Метод количественного ВЭЖХ-определения индикаторных производных флавоноидов прополиса кемпферола, изорамнетина, апигенина, хризина, акацетина, кемпферида, галантина, пиноцембрина и пиностромбина,

• Метод количественного ВЭЖХ-определения флавона байкалина в корнях шлемника байкальского Scutellaria baicalensis G,

• Метод количественного ВЭЖХ-определения флавона апиина и малонилапиина в траве петрушки кудрявой Petroselinum crispum L ,

• Результаты сравнительной оценки качества и подлинности различных лекарственных фитопрепаратов, БАД и пшцевых продуктов на основе прополиса, петрушки кудрявой и шлемника байкальского

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования В ходе эксперимента были исследованы различные виды растительного сырья (24 вида), экстрактов на основе растительного сырья (11), лекарственных препаратов (3), БАД (46), а также был проанализирован ряд обогащенных продуктов (6)

Методы исследования. Для количественного определения флавонов в различных объектах использовался метод ВЭЖХ на хроматографе «Agilent 1100 senes» (США) с УФ-спектрофотометрическим детектором на диодной матрице (СДДМ), флуориметрическим детектором (ФЛД) Идентификация неизвестных соединений проводилась на хроматографе с масс-спектрометрическим детектором «Agilent» 1100 senes LC/MSD Trap SL family (США), в качестве неподвижной фазы использовались хроматографические колонки разных производителей Phenomenex Lima 5ц С18 (2) 250 х 4,6 мм (США), Wakosil 5ц С18 (2) 250 х 4,6 мм, (Германия) Концентрация определялась методом внешнего стандарта.

Статистическую обработку результатов исследования проводили по ФС «Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний» (ГФ XI)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Анализ производных флавона в лекарственном сырье и фитопрепаратах на основе прополиса

Для подбора оптимального растворителя была приведена сравнительная характеристика смесей спирта с водой в различных концентрациях Оптимальным для экстракции оказался 80 % спирт Точную навеску содержимого капсул или растёртых таблеток, содержащую около 1,0 г прополиса, помещали в круглодонную колбу объемом 100 мл, прибавляли 80 мл 80 % этанола, экстракцию проводили при нагревании на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 20 минут Объем экстракта доводили 80 % спиртом до 100 мл, перемешивали

Прополис представляет собой сложный комплекс веществ разнообразной природы, поэтому прежде чем провести анализ полифенольных соединений необходимо предварительно избавиться от сопутствующих веществ, влияющих на интерпретацию результатов, снижающих срок службы и воспроизводимость хроматографической системы

Применение полимерного гидрофобного матрикса на основе полистеролдивинилбегоола типа ХАБ позволило получить очищенную флавоноидную фракцию свободную с одной стороны от полярных, водорастворимых соединений (органических кислот и углеводов), с другой - от неполярных, гидрофобных веществ (липидов и длинноцепочечных спиртов), дающих дополнительные пики на хроматограмме, которые существенно увеличивали время анализа

На гидрофобный матрикс помещали 2 мл 1 % экстракта прополиса и промывали 15 мл воды Агликоны флавоноидов не смываются с ХАБ водой, таким образом происходит очистка прополиса от водорастворимых веществ

(органических кислот и углеводов). Установлено, что оптимальными условиями очистки прополиса на ХАД является элюирование 2 мл 1 % экстракта 30 мл 80 % спирта, при необходимости элюент упаривают. На рисунке 1 представлена хроматограмма прополиса до очистки; на рисунке 2 - хроматограмма флавоноидной фракции прополиса после очистки.

Подтверждения флавоноидного состава прополиса с помощью химической модификации

На долю метилированных флавоноидов прополиса приходится более 50 % от общей суммы флавоноидов. Для идентификации данных соединений необходимы дорогостоящие, труднодоступные стандарты. Применение химической модификации позволило получить метилированные производные флавоноидов в условиях лаборатории.

Акацетин, кемпферид, диметилкемлферолл и пиностромбин были получены в ходе метилирования деазометаном чистых веществ апигенина кемпферола и

пиноцембрина. Для проведения реакции готовили растворы данных соединений в ацетонигриле с концентрацией 0,02 мг/мл. К 1 мл раствора стандарта прибавляли 2 мл раствора диазометана в эфире и 200 мкл метанола в качестве катализатора. Реакционную смесь выдерживали в течение 20 минут в темном месте без доступа воздуха. Затем проводили хроматографическое исследование.

До метилирования

т

Апигенин Mw(+1 )=271

После метилирования

„т„ Акацетинин Mw(+1)=285 Аиигенин 2570

Mw(+l)=271 „ -

' Диметщтапигешш

Mw(+1)=299

Рис.3 Изменение хроматограммы апигенина в ходе реакции с деазометаном

Время удерживания пиков соединений, полученных в ходе реакции с деазометаном, увеличивалось относительно пиков исходных стандартов, вследствие того, что метиллроизводные менее полярны. Структура полученных соединений подтверждалась данными ВЭЖХ-МС: молекулярные массы всех продуктов реакции отличались от исходного стандарта либо на 14, либо на 28 реже 42, что соответствует moho-, ди- и триметшгпроизводным.

Выбор оптимальных условий для разделения флавоноидов прополиса Для проведения анализа использовалась обращенно - фазовая ВЭЖХ. Учитывая, что флавоноиды, входящие в состав прополиса имеют разные максимумы поглощения, их содержание измеряют при разных длинах волн: длина волны детектирования 290нм (для пиноцембрина и пиностромбина) и 320нм (для остальных флавоноидов). Колонка; Luna С18, 5 мкм 250мм х 4.6 мм

фирмы «РЬепотепех». Скорость потока подвижной фазы 1,0 мл/мин. Подвижная фаза: Метанол : раствор трихлоруксусной кислоты (рН2.6) (3:2)

Флавоны, как полифенольные соединения обладают слабокислотными свойствами и способны к диссоциации. Добавление в систему кислоты, необходимо для подавления собственной диссоциации флавонов. Кроме того, кислота выравнивает дефекты сорбента и подавляет связывание разделяемых соединений кислотной природы компонентами сорбента. Установлено, что оптимальное значите рН подвижной фазы находится в пределах 2,5-2,8.

Характерная для российского прополиса хроматограмма представлена на рисунке 4. При длине волы 290 нм идентифицированы преимущественно производные флаванона: пиноцембрин и пиностромбин (рисунок 5).

Рис. 4.

Хроматограмма прополиса при 320 нм.

1- апигенин,

2- кемпферол,

3- изорамнетин,

4- хризин, 5 -акацетин, 6- галантин, 7 - кемпферид, 8- диметил-кемпферол

Рис. 5.

Хроматограмма прополиса при 290 нм.

1- пиноцембрин,

2- хризин,

3- галангин,

4- пиностромбин

Хроматографические характеристики и параметры пригодности хроматографической системы разработанной методики приведены в таблице 1

Как следует из таблицы 1, эффективность колонки составила более 4100 тт селективность колонки для всех соединений была более 1,0, а разрешение составило от 1,1 до 19,6

Таб 1 Параметры разделения флавоноидов прополиса в условиях изократического режима, скорость подвижной фазы 1 мл/мин, мертвый объем 1р=2,0, п-5_

флавоноиды 111, мин К N а Я

Апигенин 7,7 2,85 4100 1,14 1,09 2,42 1,65 1,06 1,18 1,05 1,20 2,03 1.4 1,1 2.5 19,6 1.6 4,5 1,2 4,3 3,3

Кемпферол 8,5 3,25 4800

Изорамнетин 9,1 3,55 3500

Пиноцембрин 17,2 6,49 12800

Хризин 24,4 11,20 22000

Акацетин 25,8 11,90 19900

Кемпферид 30,2 14,10 15500

Галангин 31,6 14,80 17000

Диметилкемпферол 37,6 17,80 20700

Пиностромбин 42,3 19,3 22000

Статистическая обработка результатов.

Таб 2 Метрологические характеристики метода и параметры количественного определения (КО-количественное определение; ДЛК-диапазон лилейных концентраций) анализа флавоноидов прополиса __

Флавоноиды X в2 Б Р КР,0 Дх Е,% Предел

обна руж ения КО ДЛК

мг/л

Кемпферол 262,3 0 06 0,24 95% 2,78 03 6 6,7 20,1 1-1000

Изорамнетин 213,2 0 06 0,24 95% 2,78 03 6 7,5 22,5 1-1000

Апигенин 321,8 0 065 0 25 95% 2,78 031 62 5,2 16,0 1-1000

Хризин 346Д 0 0075 0 087 95% 2,78 0 12 24 4,3 12,9 1-1000

Акацетин 353,1 0 02 0 14 95% 2,78 0 17 34 3,7 11,1 1-1000

Кемпферид 223,4 0 0675 0 26 95% 2,78 0 32 64 7,8 23,4 1-1000

Галангин 181,1 0 075 0 25 95% 2,78 0 34 65 9,3 27?9 1-1000

Диметилкемпферол 243,2 0 009 0 087 95% 2,78 0 19 27 8,4 25,2 1-1000

Пиноцембрин 343,5 0 02 0 14 95% 2,78 0 17 34 6,7 19,1 1-1000

Пиностромбин 386,9 0 03 0 18 95% 2,78 0 22 44 6,8 20,4 1-1500

Для оценки сопоставимости и правильности методики были рассчитаны метрологические характеристики по результатам 5 параллельных измерений Для флавоноидов проводились измерения раствора с концентрацией 0 05 мг/мл В таблице 2 рассмотрены метрологические характеристики метода и параметры количественного определения

Результаты анализа флавоноидов в опытных образцах Нами было проведено исследование содержания флавоноидов в образцах сырья прополиса из разных регионов мира, лекарственных препаратах и биологически активных добавках Полученные результаты представлены в таблице 3

Следует отметить, что характерным для прополиса является преобладание флавоновых и метилированных агликонов Высокие абсолютные концентрации флавонов в прополисе (2-3%) практически не встречаются в многочисленных растительных источниках флавоноидов

Российский прополис отличается более разнообразным состав флавоноидов, высокое содержание моно- и диметилпроизводных кемпферола является его характерной особенностью Для южно-американского и китайского прополиса является специфичным преобладание хризина (его содержание в 1,5-2 раза выше, чем в российском) и производных флаванона пинодембрин и пиностромбин (их содержание в 4-5 раз, выше чем в российском)

Суммарное содержание флавоноидов находится в пределах от 5 - 8%, что делает прополис одним из самых богатых источников флавоноидов

В лекарственных препаратах были обнаружены все индикаторные компоненты, полученные результаты являются достоверным подтверждением качества данных образцов

Невысокие концентрации флавоноидов в образцах «прополис №20», а также некоторых БАД обусловлены плохой очисткой и низким качеством сырья

По результатам анализа только «Прополис с витамином С на фруктозе» и мед с прополисом «Коломенский» может рассматриваться в качестве существенного источника флавоноидов, во всех остальных добавках

флавоноиды присутствуют в следовых количествах, либо не обнаружены Подтвержден тот факт, что в отличие от других растительных источников в прополисе преобладают агликоны, а не гликозиды, что связанно с энзиматической активностью пчелиной слюны

Таб 3 Содержание флавоноидов в образцах прополиса

Образец 1* 2 1 3 14 5 6 )7 |8 19 10 Ома

Сырье, иг/г

Прополис №1, РФ 3,1 3,9 2,8 17,6 13,2 18,1 15,6 7,2 2,4 2,1 86,1

Прополис №15, РФ 2,5 3,1 2,5 16,0 13,6 14,9 12,8 6,2 2,8 3,7 78,1

Пропэги: №16^ КНР 2,6 1,0 07 16,1 _ 14,3 - - 19,1 17,0 70,1

Проппе №17, КНР 2,4 1,6 1,1 12,7 - 18,5 - - 17,6 13,4 67,3

Прополис №18, Хорватия 3,6 2,1 1,9 15,4 11,2 13,4 14,1 - 4,5 2,6 68,8

Прополис №19, Южная Америка 5,1 4,5 4,0 18,6 - 15,6 - - 18,4 14,3 80,5

Пропагос№20, Липа 1,7 1,2 1,1 9,0 2,5 1,2 5,6 2,4 6,7 3,2 34,6

Прополис №20, Казахстан 3,7 2,8 2,2 4,8 16,1 17,4 2,1 2,8 12,3 1,3 65,5

Лекарственные препараты

Hacrofta içorcunc* мпЬст 0,40 0,26 0,21 1,44 1,29 1,62 1,41 0,56 0,54 0,22 7,95

Мазыомсогнпносжэт, мгЛООг 0,51 0,36 0,32 1,83 2,3 1,17 3,12 0,81 0,47 0,16 11,05

Аэрозоль «Пропххм», мтАот 0,18 0,11 0,10 0,73 0,92 0,56 0,81 0,22 0,09 0,03 3,75

Обогащенные продукты и биологически активные добавки

«Terra-plant Propolis», мг/твб 0,04 0,03 0,02 0,32 0,26 0,33 0,10 0,06 0,02 - 1,18

«Прополис с витамином С на фруктозе», мг/таб 0,61 0 33 0,27 1,95 1,73 2,11 2,56 0,8 4 0,45 0,55 10,23

Сироп «Цикола П», мг/100г 0,2 0,1 - - . - - - - - - 0,3

Сироп «Форлайф», мг/100г 0,18 0,11 0,1 0,73 0,93 0,72 0,85 0,22 0,13 0,14 4,11

Водый2% зкпракг грстлил, мг/100г

Мед с прополисом «КолмюзЛ), мг/ЮОг 3,1 0,6 0,4 6,9 23,8 10,1 12,8 10,1 0,9 1,1 69,8

* 1- апигенин, 2- кемпферол, 3- изорамнетин, 4 - хризин, 5 - акацетин, 6-кемпферид, 7- галантин, 8 - диметилкемпферол, 9- пиноцембрин, 10 -пиностромбин

Проведенное исследование подтверждает необходимость тщательного контроля содержания флавоноидов в сырье, лекарственных препаратах, БАД и других продуктов на основе прополиса

Разработанный метод позволяет оценивать качество и компонентный состав прополиса на фоне сложных матриксов БАД и лекарственных препаратов, а также делает возможным оценку его происхождения

Анализ флавонов в лекарственном сырье и фитопрепаратах на основе шлемника байкальского

Оптимизация условий экстракции байкалнна. В процессе работы нами оптимизировались условия проведения экстракции флавоноидов шлемника из лекарственных форм (состав экстрагента, время, температурный режим) Было установлено, что оптимальной для экстракции байкалина являются следующие условия экстракционная смесь этанол вода (7 3), экстракция на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 45 минут Содержимое капсул или растёртых таблеток, содержащее около 0,1 г сухого экстракта или 0,5 г порошка корней шлемника, взвешивали с точностью до четвертого знака и помещали в круглодонную колбу объёмом 100 мл, прибавляли 80 мл смеси этанол вода (7 3), экстракцию проводили при нагревании на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 45 минут Объем экстракта доводили спиртом до 100 мл, перемешивали

Для идентификации всего состава флавонов водно-спиртовых экстрактов корней шлемника байкальского, необходимо использовать сложные смеси труднодоступных стандартов флавонов и их глюкоронидов, что не представляется возможным В этой связи наиболее информативным и адекватным является анализ байкалина (7-О-глюкоронид- байкалеина), относительное содержание которого составляет более 80% от общей суммы флавонов

Выбор оптимальных хроматографических условий определения байкалина. При выборе условий хроматографирования нами сравнивались

смеси состава ацетонитрил/вода, метанол/вода в нейтральной среде и с добавлением трифторуксусной кислоты Пики, полученные при использовании каждой мобильной фазы, оценивались по показателям Ж. - время удерживания, степень разделения (Я) и селективность (а)

В результате экспериментальных исследований была подобрана изократичная система ацетонитрил - раствор трихлоруксусной кислоты рН 2,6 (23 77), которая является оптимальной для разделения байкалина с другими компонентами шлемника на колонке с силикагелем, связанным с октадицилселаном \Vakosil 5и С 18(2), 250x4,6 мм Пример хроматограммы экстракта корней шлемника приведен на рисунке 6 Скорость потока элюэнга составляла 1 мл/мин Объем вводимой пробы 10 мкл

Рис 6

Хроматограмма экстракта корней шлемника Время удерживания байкалина 11,59

Детектирование флавонов проводили на УФ - детекторе при X 320 им Выбор длины волны УФ-детектор а объясняется тем, что флавоны имеют два максимума поглощения (рисунок 7) в УФ-спекггре - 250-280 (первая полоса поглощения) и 310-330 нм (вторая полоса поглощения), но 320 нм - более специфичная длина волны, тк при первом максимуме поглощают и другие классы флавоноидов

Параметры количественного определения и метрологические характеристики методики.

Содержание байкалина определяли методом внешнего стандарта В результате проведенных анализов по стандартному образцу, были получены следующие результаты (таблица 4)

Таб 4 Хроматографические параметры и параметры количественного определения байкалина в условиях изократического режима, скорость фазы 1 мл/мин, мертвый объем 10=2,1

Соединен ие Предел обнаружения, мг/л ПКО, мг/л ДЖ, мг/л мин К N

Байкалин 3,9 0,3-100 11,6 4,2 7000

Таб 5 Метрологические характеристики методики определения байкалина (в образце экстракта шлемника)

Вещество X в2 б Р Дх Е

Байкалин 107,0 6,30 2 509 95% 2,78 3 12 2 91

Результаты анализа байкалина в опытных образцах содержащих компоненты растения шлемника байкальского

По разработанной методике проведен анализ корней шлемника байкальского, экстрактов и БАД, изготовленные на их основе,, представленные

в различных формах (таблетки, капсулы, порошки, фильтр-пакеты) Полученные результаты преведены в таблице 6

Таб 6 Содержание байкалита в образцах шлемника

Наименование образца Форма Декларируемое содержание Содержание байкалина

Экстракт шлемника 050301 -300505 (Китай) Сырье не менее 80 % 89%

Экстракт шлемника 050516-250505 (Китай) Сырье не менее 80 % 86%

Экстракт шлемнюса сухой №1 (РФ) Сырье Содержание не декларируется 0,5 %

Экстракт шлемника сухой №2 (РФ) Сырье Содержание не декларируется 15,5 %

Успокаивающие капли «Фитэкс» серия 0605 Капли 400 мг экстракта шлемника на 100 мл 0,02 % m мг/мл)

Успокаивающие капли «Фитэкс» серия 0705 Капли 1,2г экстракта шлемника на 100 мл 0,18% (1,8 мг/мл)

БАД «Времена года Шлемник + хмель» Капсулы 100 мг экстракта шлемника/капс 40,2 мг/капс

БАД к пище серии «Экоцвет» «Шлемяик байкальский» Сироп Содержание не декларируется 43,1 мг/100мл

Сухой чайный напиток «Бетоводье» чайный напиток 100% молотый корень шлемника 6,2%

БАД к пище «Брейн - тонус» Капсулы 5 мг экстракта шлемника (90% байкалина) 4,4 мг/капс

БАД «Альфа 20С» Капсулы Трава шпемн. 25% O^ÖMrtanc

ЗАО «Парафарм» Таблетки 50 мг экстракта шлемника (80% байкалина) 31,3 мг/таб

ООО «Белее» Капсулы 45 мг корня шлемника 0,02 мг/капс

БАД к пище «Полная очистка частях)* Капсулы 45 мг травы шлемника/капс 0,14 мг/капс

Из таблицы видно, что содержание байкалина в высушенных корнях шлемника составила около 6 %, следовательно, экстракт шлемника для производства БАД с содержанием байкалина менее 6 % - экстракт шлемника сухой №1 (РФ) с содержанием 0,5 %, может рассматриваться как низкокачественная продукция Невысокое содержание байкалина в траве шлемника не позволяет рекомендовать ее в качестве сырья при производстве

Б АД, заменяющего корни шлемника В тоже время, применение обогащенных экстрактов с содержанием активных компонентов 85-90 %, полученных по инновационным технологиям позволяет получить продукцию БАД со стандартизованным содержанием активного компонента

По результатам наших исследований байкалин может рассматриваться как достоверный критерий качества исходного сырья корней шлемника, а также использоваться для выявления неправильного этикетирования и фальсификации продукции

Данные о содержании флавона могут использоваться в оценке их уровня потребления с биологически активными добавками или лекарственными препаратами Рекомендуемый профилактический адекватный уровень потребления флавонов составляет 5 мг/сутки

Анализ флавонов в сырье и фитопрепаратах на основе петрушки кудрявой

Оптимизация условий экстракции апиина.

В процессе работы нами оптимизировались условия проведения экстракции флавонов петрушки из лекарственных форм (состав экстр агента, время, температурный режим) Было установлено, что оптимальной для экстракции апиина и малонилапиина является смесь этанол вода (1 1) Экстракция в течение 30 минут на кипящей водяной бане с обратным холодильником оказывается достаточной Точную навеску содержимого капсул или растёртых таблеток, содержащее около 0,5 г порошка травы петрушки, помещали в круглодонную колбу объёмом 100 мл, прибавляли 80 мл смеси этанол вода (1 1), экстракцию проводили при нагревании на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 30 минут Объем экстракта доводили спиртом до 100 мл, перемешивали

Наиболее информативным и адекватным для петрушки является анализ апиина (З-О-апиозид- апигенина) и малонилапиина (З-О- апиозид, З-О- малонил

—апигенина), относительное содержание этих двух флавонов составляет более 90% от общей суммы флавонов петрушки.

Для оптимизации разделения стандартных образцов флавонов и их отделения от мешающих компонентов в экстрактах петрушки нами были опробованы несколько вариантов подвижных фаз.

В результате экспериментальных исследований была подобрана изократичная система: ацетонитрил - раствор трихлоруксусной кислоты рН 2,6 (20 : 80), которая является оптимальной для разделения апиина и малонилапиина между собой с другими компонентами петрушки на колонке с силикагелем, связанным с октадицилселаном Wakosil 5u CI8(2), 250x4,6 мм. Скорость потока элюэнта составляла 1 мл/мин. Объём вводимой пробы 10 мкл. Пример хроматограммы экстракта листьев петрушки представлен на рисунке 8.

Рис. 8

7,9 Хроматограмма

экстракта травы петрушки (время удерживание апиина 5,2, малонилапиина -7,9)

5,2

Таб. 7 Параметры разделения апиина и малонилапиина в условиях изократического элюирования, скорость фазы 1 мл/мин, мертвый объем 10=2,1.

tR к' N а R

Апиин 5,2 1,81 7200 2,05 5,3

Малонилапиин 7,9 3,81 9800

Подобранная хроматографическая система показала хорошую селективность (2,05) и разделяющую способность (5,3) для флавонов петрушки. Эффективность системы - около 8000 теоретических тарелок для обоих

соединений, что позволяет использовать ее для определения апиина и малонилапиина на фоне сложного матрикса

Детектирование флавонов проводили на УФ - детекторе при к 340 км, что соответствует максиму поглощения апиина при более селективной длине волны (рисунок 9)

Параметры количественного определения и метрологические характеристики методики.

Содержание апиина определяли методом внешнего стандарта В результате проведенных анализов по стандартным образцам, были получены следующие результаты (таблица 8)

Таб 8 Параметры количественного определения производных апигенина

Соединение Предел обнаружения, мг/л Предел количественного определения мг/л Диапазон линейных концентраций мг/л

Апиин 1,3 3,9 0,3 -100

Малонилапиин 1,5 4,5 0,3 -100

Таб 9 Метрологические характеристики методики определения апиина (в образце экстракта травы петрушки)

Вещество X Б Р Дх Е

Апиин 161,4 3,20 1 788 95% 2,78 2 22 3 62

Малонилапиин 134,3 3,70 1938 95% 2,78 2 75 3 91

Данные статистической обработки полученных результатов, показывают, что методика характеризуется приемлемой относительной погрешность 3,9 % и свободна от систематической погрешности

Результаты анализа флавонов в опытных образцах содержащих компоненты растения петрушки кудрявой. По разработанной методике проведбн анализ травы петрушки, проанализированы некоторые Б АД, изготовленные на ее основе, представленные в различных формах (таблетки, капсулы, порошки, фильтр-пакеты) Полученные результаты преведены в таблице 10

Таб 10 Образцы, содержащие петрушку кудрявую.

Наименование образца Декларируемое содержание Содержание апшша Содержание малонил- апиина Суммарное содержание флавонов

БАД к пшце «БиоСпектру м», мг/таб 1 мг листьев и корня петрушки 0,07 0,05 0,12

БАД к пище «Вита-баланс 2000», мг/таб Листья петрушки 30 мг 0,52 0,31 0,83

БАД к пище «Дискавери» мг/таб Петрушка (лист) 50 мг 1,12 1,04 1,16

БАД к пище «Диуресс Формула» мг/капс порошок семян и листьев - 32 мг 0,05 0,04 0,09

БАД к пшце «Д-красота», мг/капс Листья петрушки 40 мг Не обнаружено Не обнаружено Не обнаружено

БАД к пище «Зеленая защита», мг/г петрушка 20,5 мг/г 0,02 0,01 0,03

БАД к пище «ОстеоПлюс», мг/таб Петрушка 150 мг 2,9 1,7 4,6

БАД к пище «Фиторен», мг/таб Петрушка (лист) 25 мг 0,47 0,35 0,82

Сухие листья петрушки «Гкрафесток», % 100% петрушка 1,9 0,9 2,8

Сухие листья петрушки «Котани», % 100% петрушка 2,7 2,1 4,8

Сухие листья петрушки «Аппетита», % 100% петрушка 1,7 1,3 2,8

Сухие листья петрушки «Магия востока», % 100% петрушка 2,1 1,2 3,3

В результате проведенных исследований нами установлено, что содержание апиина в траве петрушки составляет 2,8-4,8% Данные о содержании флавона могут использоваться в оценке их уровня потребления с биологически активными добавками или лекарственными препаратами Таким образом, разработанная нами методика может быть использована для стандартизации и контроля качества пищевых продуктов, сборов, биологически активных добавок и фиточаев, содержащих измельченную траву петрушки

ВЫВОДЫ

1) Изучены физико-химические свойства (растворимость, хроматографическая подвижность, уф - и видимые спектры, масс-спектры) флавонов, входящих в состав прополиса, шлемника байкальского и петрушки кудрявой

2) Разработаны универсальные методики пробоподготовки для сырья, лекарственных препаратов, БАД и пищевых продуктов Изучено влияние растворителя и условий экстракции на степень извлечения флавонов из сырья лекарственных препаратов, БАД и обогащенных продуктов Подобраны оптимальные и доступные растворители для извлечения флавонов Определено оптимальное время экстрагирования образцов

3) Подобранны оптимальные хроматографические условия для определения флавоноидов прополиса кемпферола, изорамнетина, апигенина, хризина, акацетина, кемпферида, галантина, пиноцембрина и пиностромбина, флавона байкалина в шлемнике байкальском и производных апигенина (апиина и малонилапиина) в петрушке кудрявой

4) При оценке пригодности хроматографических систем, все разработанные методики показали хорошую эффективность (3000-20000 теоретических тарелок), высокую степень разделения и селективность (Д= 1,019,6, а#1,0)

5) Разработаны методики количественного определения флавонов апигенина, хризина, акацетина, байкалина апиина и малонилапиина в сырье и

лекарственных препаратах, а также в сложных матриксах БАД и обогащенных продуктов

6) Предел обнаружения методик составил около 1,5 мг/л Предел количественного определения составил около бмг/л Относительная погрешность составила от 1,1 % и не более 5,5 %

7) С помощью разработанных методик было проанализировано около 80 образцов растительного сырья, экстрактов, лекарственных препаратов, БАД к пище и обогащенных продуктов, проходящих экспертизу в ГУ НИИ питания РАМН Обнаруженное содержание позволило стандартизовать продукт, оценить его качества и уровень потребления биологически активных веществ Использование разработанных методик позволили установить, что около 10% проанализированных образцов либо не содержали предполагаемых индикаторных компонентов, либо содержали следовые количества, что указывает на фальсификацию или низкое качество продукта Была показана целесообразность использования разработанных методик для включения в нормативно - техническую документацию на сырье, экстракты, лекарственные препараты, БАД к пище, содержащие прополис, шлемник байкальский и петрушку кудрявую

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Эллер К И, Балусова А С Идентификация и количественное определение индикаторных полифенольных соединений прополиса \\ Материалы Ш межрегиональной научно-практической конференции «Питание здорового и больного человека» - СПб, 2005 -С 356-357

2 Эллер К И, Комарова Е Л, Власов А М, Балусова А С Оценка подлинности растительных экстрактов, как сырья для Б АД БоиеЦапа Ъаюакпзю §еогд1 -Шлемник байкальский \\«Рынок БАД» №1 (27), 2006 - С 38-39

3 Эллер К И, Балусова А С Применение комбинированной ВЭЖХ и твердофазной очистки для анализа флавоноидных компонентов в растительных экстрактах и продуктах на их основе \\ Материалы IV межрегиональной научно-практической конференции «Питание здорового и больного человека» - СПб, 2006 - С 54-55

4 Кошечкина А С, Эллер К И, Власов А М, Коваленко Д Н Оценка биологической ценности и подлинности прополиса как сырья, используемого в пищевых продуктах и биологически активных добавках к пище \\ Вопросы питания Том 76, №2,2007- С 53-56

5 Кошечкина А С, Исследование индикаторных соединений прополиса для разработки методики стандартизации продуктов на его основе \\ Материалы П всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» - Рязань, 2007 -С 183-185

Формат 60 х 90 1/16 Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО КПСФ «Спецстройссрвис-92» Отдел оперативной полиграфии 101000, Москва, Мясницкая, 35, стр 2

Подписано в печать Объем /, Ь¡1А Заказ № ЗЧН

Актуальность темы

Флавоноидами называется группа природных полифенольных биологически активных соединений - производных бенз-у-пирона, в основе которых лежит фенилпропановый скелет, состоящий из С6-СЗ-С6 углеродных единиц. К основным классам флавоноидов относятся флавоны, флаваноны, дигидрохалконы, халконы, антоцианидины, флаванонолы (дигидрофлавонолы), флавонолы, и изофлавоноиды. Разнообразие флавоноидов обуславливается наличием большого числа гидроксилированных, метилированных, ацилированых, О- и С-гликозилированных производных в ароматических ядрах А и В, а также асимметрических атомов углерода в пирановом гетероцикле. К классу флавонов (выделено около 20 агликонов) относятся окисленные флавоноиды, не имеющие гидроксила в 3-м положении (кольцо В).

Интерес к природным флавонам связан с их выраженными антиоксидантными свойствами, для ряда флавонов показаны их антиаллергенные, противоспалительные, антивирусные, антибактериальные свойства и другие типы биологической активности.

Наиболее ценными источниками флавонов являются прополис, трава петрушки кудрявой и корни шлемника, содержание флавонов в этих объектах превышает 2-2,5 %.

На основе прополиса разработан целый ряд препаратов, среди которых широко известны «Прополиса настойка», мазь «Пропоцеум», аэрозоль «Пропосол» и др. Шлемник байкальский используется как сырье для приготовления настойки гипотензивного и седативного действия. Петрушка кудрявая является традиционным пищевым растением. Также прополис, шлемник байкальский и петрушка кудрявая входят в состав зарегистрированных биологически активных добавок (БАД) к пище.

В настоящее время становится все более актуальной проблема безопасности и подлинности сборов лекарственных трав и биологически активных добавок, а также разработки достоверных критериев их идентификации.

Необходимость определения незначительных концентраций действующих веществ на фоне сложного матрикса БАД предъявляет высокие требования к селективности и чувствительности методов анализа.

Решение этих задач тормозится отсутствием в большинстве случаев достоверных методов контроля действующих начал в составе комплексных БАД. Большинство существующих нехроматографических методов определения индикаторных компонентов растительных БАД неселективны, трудоёмки и могут в отдельных случаях приводить к получению, как ложноположительных результатов, так и к искажению количественных данных.

Одними из наиболее перспективных методов для решения этих задач являются хроматографические методы, сочетающие высокую эффективность разделения компонентов БАД с избирательностью и чувствительностью детектирования.

Цель и задачи исследования

Цель: разработать методики анализа флавонов в наиболее ценных источниках этих веществ: прополисе, корнях шлемника и траве петрушки. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи.

• Изучить физико-химические свойства флавонов;

• Разработать методики пробоподготовки сырья и продуктов на его основе, обеспечивающие наибольшую эффективность экстракции, характеризующиеся невысокой трудоемкостью;

• Подобрать оптимальные хроматографические условия для определения флавонов на фоне сложного матрикса;

• Оценить параметры пригодности хроматографических систем;

• Разработать методики количественного определения флавонов;

• Оценить метрологические характеристики разработанных методик;

• Апробировать разработанные методики на образцах растительного сырья, экстрактов растительного сырья, лекарственных препаратов, БАД и обогащенных продуктов на его основе.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена в рамках НИР кафедры фармацевтической химии ММА им. И.М. Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств», № госрегистрации 01.200.110545.

Научная новизна результатов исследования

Разработаны оригинальные методики идентификации и количественного определения индикаторных флавонов в лекарственных препаратах, БАДах и пищевых продуктах: определение апигенина, акацетина и хризина в прополисе, определение байкалина в шлемнике байкальском, определение апиина и малонилапиина в петрушке кудрявой.

Практическое значение работы

Разработанные методики использовались при гигиенической экспертизе более 80 БАД и сырья для БАД к пище в ГУ НИИ Питания РАМН. Методики определения апигенина, акацетина и хризина в прополисе, определение байкалина в шлемнике байкальском, определение апиина и малонилапиина в петрушке кудрявой включены в «Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище» (дополнение к Р4.1.1672-03, Минздрав РФ).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Апробация работы

Результаты исследований доложены на межрегиональной научно-практической конференции «Питание здорового и больного человека» (май 2007 г., г. Рязань); на научных конференциях кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии ММА им. И.М.Сеченова (2005 - 2007 гг.); на Международной научно-практической конференции Apimondia (июль

2005 г., г. Дублин); на семинаре «Аналитическая химия в контроле безопасности, качества и подлинности пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище» AnalyticaExpo-2006 (апрель 2006 г., Москва), конгрессе «Фитофарм 2006» (июнь 2006 г., Санкт-Петербург)

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 106 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследования и их обсуждения, выводов и библиографического указателя, включающего 115 источников. Работа иллюстрирована 19 рисунками и 23 таблицами.

Общие выводы

1) Изучены физико-химические свойства (растворимость, хроматографическая подвижность, уф- и видимые спектры, масс-спектры) флавонов, входящих в состав прополиса, шлемника байкальского и петрушки кудрявой.

2) Разработаны универсальные методики пробоподготовки для сырья, лекарственных препаратов, БАД и пищевых продуктов. Изучено влияние растворителя и условий экстракции на степень извлечения флавонов из сырья лекарственных препаратов, БАД и обогащенных продуктов. Подобраны оптимальные и доступные растворители для извлечения флавонов. Определено оптимальное время экстрагирования образцов.

3) Подобранны оптимальные хроматографические условия для определения флавоноидов прополиса: кемпферола, изорамнетина, апигенина, хризина, акацетина, кемпферида, гал ангина и пиноцембрина; флавона байкалеина в шлемнике байкальском и производных апигенина (апиина и малонилапиина) в петрушке кудрявой.

4) При оценке пригодности хроматографических систем, все разработанные методики показали хорошую эффективность (3000-20000 теоретических тарелок), высокую степень разделения и селективность (R= 1,019,6; (#1,0)

5) Разработаны, методики количественного определения флавонов: апигенина, хризина, акацетина, байкалина апиина и малонилапиина в сырье и лекарственных препаратах, а также в сложных матриксах БАД и обогащенных продуктов.

6) Предел обнаружения методик составил около 1,5 мг/л. Предел количественного определения составил около 4,5 мг/л. Относительная погрешность составила от 1,1 % и не более 5,5 %.

7) С помощью разработанных методик было проанализировано около 90 образцов растительного сырья, экстрактов, лекарственных препаратов, БАД к пище и обогащенных продуктов, проходящих экспертизу в ГУ НИИ питания РАМН. Обнаруженное содержание позволило стандартизовать продукт, оценить его качества и уровень потребления биологически активных веществ. Использование разработанных методик позволили установить, что около 10 % проанализированных образцов либо не содержали предполагаемых индикаторных компонентов, либо содержали следовые количества, что указывает на фальсификацию или низкое качество продукта. Была показана целесообразность использования разработанных методик для включения в нормативную документацию на сырье, экстракты, лекарственные препараты, БАД к пище, содержащие прополис, шлемник байкальский и петрушку кудрявую.