Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение любистка лекарственного (Levisticum officinale Koch.)

На правах рукописи ОВЧИННИКОВА СВЕТЛАНА ЯКОВЛЕВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЛЮБИСТКА ЛЕКАРСТВЕННОГО (LEVISTICUM OFFICINALE KOCH.)

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Пятигорск -2014

7 АВГ 2014

005551658

На правах рукописи

ОВЧИННИКОВА СВЕТЛАНА ЯКОВЛЕВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЛЮБИСТКА ЛЕКАРСТВЕННОГО (LEVISTICUM OFFICINALE KOCH.)

14.04.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Пятигорск —2014

Диссертационная работа выполнена в Пятигорском медико-фармацевтическом институте — филиале государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, доцент

Орловская Татьяна Владиславна

Официальные оппоненты: Федосеева Людмила Михайловна

Доктор фармацевтических наук, профессор, ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующая кафедрой фармацевтической химии с курсом органической и токсикологической химии Авдеева Елена Владимировна Доктор фармацевтических наук, доцент, ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «18» сентября 2014 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.008.09 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11 и на сайте http://pmedpharm.ru. Автореферат разослан «03» июля 2014 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета (Р? Ремезова Ирина Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения почти 80% населения нашей планеты предпочитают использовать для лечения препараты природного происхождения, поэтому, по-прежнему, актуальным является исследование и разработка лекарственных средств на основе растительного сырья.

Наряду с высоким и оправданным интересом исследователей к поиску принципиально новых источников фитопрепаратов заслуживают не меньшего внимания лекарственные растения, уже давно применяемые в медицине, но вместе с тем, имеющие не полностью раскрытый фармакотерапевтический потенциал. Научные сведения о многих из них, в частности, об их химическом составе, фармакологических свойствах были получены десятки лет назад в рамках, имевшихся в то время возможностей науки, и с тех пор практически не пополнялись.

Мировые статистические исследования показывают, что на долю заболеваний мочеполовой системы и патологий желчевыводящих путей среди населения Земли приходится около 70%. По данным той же статистики лекарственные средства, использующиеся в России при данной патологии, в большинстве синтетического происхождения. Препараты на основе природного сырья в основном выпускаются зарубежными фармацевтическими компаниями, и на российском рынке представлены биологически активными добавками (БАД). Однако такой путь на наш взгляд является нерациональным, так как в этом случае приходится применять БАДы практически постоянно. Кроме того, использование БАД не всегда эффективно при уже возникшей патологии, в то время как лекарственные препараты стандартизированы по биологически активным веществам, что повышает их качество и чем они выгодно отличаются от БАДов.

Особо актуальным представляется поиск лекарственных средств с направленным фармакологическим действием, например, диуретической и антимикробной активностями в сочетании с антиоксидантным эффектом, который связан с содержанием полифенольного комплекса.

3

В этой связи наше внимание привлек любисток лекарственный (Levisticum officinale Koch.) из сем. сельдерейные (Apiaceae). Сырье любистка лекарственного включено в ряд зарубежных фармакопеи, однако, в России используется только в традиционной медицине. Ограниченность использования данного сырья объясняется не только недостаточностью химических исследований, но и отсутствием современной нормативной документации.

А в связи с тем, что в целях рационального использования природного сырья основной акцент делается на разработку и внедрение новых конкурентоспособных, малоотходных и безопасных технологий, актуальным является изучение различных комплексов биологически активных соединений (БАС).

Особенно актуальна на сегодняшний день проблема преодоления зависимости отечественной фармацевтической промышленности от импортного сырья и лекарственных препаратов. Поэтому в настоящее время Правительство России разработало концепцию по развитию собственных возможностей производства инновационных отечественных лекарственных средств.

Таким образом, комплексное исследование химического состава, совершенствование нормирования качества, в зависимости от пути использования сырья и группы БАС, определяющих фармакологическую активность, является актуальной проблемой для фармацевтической науки и практики.

Степень разработанности темы исследования. В результате научных исследований ученых, в основном зарубежных, хорошо изучены такие классы соединений любистка лекарственного как эфирные масла, фталиды и полиацетилены. Изучена фармакологическая активность некоторых индивидуальных химических компонентов, характерных для видов рода Любисток и близкородственного рода Дудник. Несмотря на литературные данные, любисток лекарственный остается малоизученным, отсутствуют нормативные документы, регламентирующие подлинность и качество сырья, нет отечественных препаратов на основе его сырья.

Цель и задачи. Целью настоящей работы явилось фармакогностическое

изучение корневищ и корней любистка лекарственного, разработка норматив-

4

ной документации (НД) на сырье, как потенциального источника получения БАС, обладающих желчегонной и мочегонной активностью.

Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить возможность культивирования любистка лекарственного в условиях Кавказских Минеральных Вод (КМВ, Ставропольский край).

2. Провести фитохимический анализ подземной части любистка лекарственного (полифенольных соединений, углеводов, эфирного масла, аминокислот, макро- и микроэлементов).

3. Установить морфолого-анатомические диагностические признаки и числовые показатели качества сырья.

4. Разработать методики стандартизации корневищ и корней любистка лекарственного в зависимости от пути использования.

5. Определить острую токсичность и провести предварительное изучение специфической биологической активности различных извлечений.

6. Разработать проект фармакопейной статьи «Любистка лекарственного корневища и корни» и инструкцию по его сбору и сушке.

Научная новизна. Проведенные интродукционные исследования, позволили прогнозировать выращивание этого вида и особенности интродукции в условиях культуры на КМВ.

Изучен химический состав эфирного масла подземных органов любистка лекарственного, выращенного в условиях КМВ. Методом газожидкостной хроматографии с последующим анализом масс-спектров идентифицировали 17 компонентов, из них 5 ранее не описанных для этого вида:

• моноциклический терпен: эвкалиптол;

• бициклический терпен: борнеол;

• сесвитерпен: кариофиллен оксид;

• сложные эфиры: линалил ацетат, нерил ацетат.

Методами бумажной, тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) идентифицированы 16 фенольных соединений, из них 11 впервые для данного вида:

• фенолокислоты: галловая;

• кумарины: ангелицин, кумарин;

• флавоноиды: лютеолин, апигенин, кверцетин, гиперозид, кемпферол, ди-гидрокверцетин;

• дубильные вещества: катехин, эпигаллокатехин.

В индивидуальном виде выделено 14 соединений, среди которых впервые для данного вида 3 фенолкарбоновые кислоты: эллаговая, галловая, цикориевая и 6 кумаринов: императорин, псорален, оксипейцеданин, остол, ангелицин, кумарин.

Впервые изучен полисахаридный комплекс (22,2-24,1%). Выделены растворимые в спирте этиловом 96% (0,45%), воде (4,7%), растворе аммония окса-лата (6,0%) и растворах щелочей (12,0%) углеводы. Установлен их моносаха-ридный состав. Количественно определены функциональные группы пектиновых веществ.

Проведено морфолого-анатомическое изучение корневищ и корней любистка лекарственного с учетом современных требований и установлены диагностические признаки сырья.

Впервые предложены методики оценки качества корневищ и корней любистка лекарственного, достоверно устанавливающие спектрофотометрическим методом содержание суммы кумаринов в пересчете на ангелицин и суммы фе-нольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту.

Впервые изучен аминокислотный и минеральный состав подземных органов любистка лекарственного.

Установлены товароведческие показатели сырья (цельного, измельченного, порошка) и определены их нормы.

Скрининговые фармакологические исследования извлечений из сырья любистка лекарственного показали наличие антибактериальной, отхаркивающей, спазмолитической, диуретической и желчегонной активности.

Теоретическая и практическая значимость. Теоретическая значи-

мость исследования заключается в расширении знаний о химическом составе корневищ и корней любистка лекарственного, возможности его интродукции в условиях Ставропольского края и оценки урожайности различных видов сырья. Полученные данные в ходе фармакологического скрининга могут служить предварительным экспериментальным обоснованием перспективности использования исследованных субстанций в качестве лечебно-профилактических средств.

Практическая значимость исследования заключается в том, что в результате химического и фармакологического анализа доказана возможность использования отечественного сырья любистка лекарственного для производства препарата «Канефрон».

Предложен новый вид ЛРС да я включения в Государственную фармакопею России XII издания.

Разработан унифицированный подход к стандартизации корневищ и корней любистка лекарственного в соответствии с современными требованиями и группой действующих БАС.

Разработаны проект ФС «Любистка лекарственного корневища и корни» и инструкция по сбору и сушке любистка лекарственного корневища и корни.

Результаты диссертационных исследований используются в учебных процессах на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России и кафедрах фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России и ГБОУ ВПО ДВГМУ Минздрава России.

Методология и методы исследования. Методологической основой работы послужили методические рекомендации по расширению номенклатуры отечественных официнальных лекарственных растений, основанные на современных информационных ресурсосберегающих технологиях [Киселева Т.Л., 2009].

Фитохимические исследования проводились с использованием комплекса

различных физико-химических методов: тонкослойная хроматография (ТСХ),

7

бумажная (БХ), газожидкостная (ГЖХ), газожидкостная хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), спектрометрия в УФ-, видимой и ИК-областях, атомно-абсорбционная спектроскопия (ААС) и др.

Для выявления фармакологической активности использованы биологические методы анализа.

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты интродукционных исследований любистка лекарственного на территории КМВ.

2. Результаты изучения химического состава подземных органов любистка лекарственного физико-химическими методами.

3. Показатели подлинности и нормы качества «Любистка лекарственного корневища и корни», необходимые для разработки проекта нормативной документации.

4. Результаты изучения фармакологической активности сырья любистка лекарственного.

Степень достоверности и апробация результатов. Оценка степени достоверности научных результатов определяется большим объемом проанализированной информационной базы, использованием современных физико-химических, биологических методов анализа, позволяющих получать воспроизводимые и однозначные результаты их математико-статистической обработкой. Разработанные методики количественного определения валидированы.

Материалы исследования доложены и обсуждены на региональных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г. Пятигорск, 2012 г.) и «Инновационные идеи молодёжи Северного Кавказа - развитию экономики России» (г. Ставрополь, 2012 г.).

Работа была представлена на Международной научной конференции «Фундаментальные исследования» (Израиль, Тель-Авив, 16-23 октября 2013 г.), Международной научной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Тайланд, Бангкок-Паттайя, 20-30 декабря

8

2013 г.), Международной научной конференции «Перспективы развития растениеводства» (Италия, Рим-Венеция, 21-28 декабря 2013 г.), Международной научной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Таиланд, Паттайя, 19-27 февраля 2014 г.), Международной научной конференции «Фундаментальные исследования» (Доминиканская Республика, 13-22 апреля 2014 г.).

По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, из них 7 в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 174 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Объекты и методы исследования», пяти глав экспериментальной части, заключения, списка литературы и приложения. В тексте содержится 46 таблиц, 40 рисунков. Список цитируемой литературы включает 230 источников, из них — 101 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность исследования, определены цель и задачи исследования, показаны научная новизна и практическая значимость.

Глава 1. Современное состояние фармакогностических исследований любистка лекарственного (Levisticum ofßcinale Koch.)

В данной главе приводятся обобщенные сведения, основанные на анализе литературных источников, касающиеся ботанической характеристики рода Levisticum, химического состава любистка лекарственного, использования его в медицине и быту, ареале распространения, биологических особенностях и состоянии агрокультуры любистка лекарственного, а также представлены результаты контент-анализа зарегистрированных в РФ лекарственных препаратов, обладающих диуретическим действием, из которого следует, что применение и ассортимент завозимых из-за рубежа препаратов свидетельствует о необходимости восстановления Levisticum ofßcinale в статусе официнального растения в Российской Федерации.

Глава 2. Объекты и методы исследования

Глава посвящена описанию объектов и методов исследования, использованных в морфолого-анатомических, фитохимических и фармакологических экспериментах.

Глава 3. Интродукционные исследования любистка лекарственного в условиях Кавказских Минеральных Вод

Изучена лабораторная и полевая всхожесть семян любистка лекарственного, различного географического происхождения и режимов стратификации.

Стратификация при постоянной температуре не дала значимых результатов. Стратификация, проведенная в условиях чередования теплых и холодных температур в течение 6 месяцев, показала всхожесть от 33 до 71%. С увеличением интервала температур возрастала и энергия проращивания.

Установлено, что оптимальными сроками посева семян в открытый грунт являются конец августа — начало сентября. В этот период наблюдались благоприятные климатические факторы, и отмечался наибольший процент всхожести в весенний период (74%).

Растения за два года проходили все периоды развития: ювенильный, им-матурный, виргинильный и генеративный. Наблюдения показывают, что каждая фаза вегетации любистка лекарственного ежегодно приходится приблизительно на одно и то же время.

Установлены урожайность семян - до 16 ц/га, урожайность надземной части — до 200 ц/га, подземных органов — до 250 ц/га.

Средний выход воздушно-сухого сырья для травы составил - 12,85%, а корневищ и корней - 32,75%.

Ориентировочный выход кумаринов из подземных органов любистка лекарственного составил от 136,9 до 154,67 кг/га, эфирного масла - 111,43-136,73 кг/га.

Из полученных данных установлено, что экономически выгодно использовать в качестве лекарственного растительного сырья подземные органы (корневища и корни) любистка лекарственного.

10

Данную лекарственную культуру можно выращивать в лесостепной зоне с элементами горностепного климата Ставропольского края.

Глава 4. Морфолого-анатомическое изучение корневищ и корней любистка лекарственного Проведены морфолого-анатомические исследования цельных, измельченных и в виде порошка корневищ и корней любистка лекарственного.

На поперечном срезе корневища видно, что корневище имеет непучковое строение (рисунок 1). Покровная ткань - перидерма, состоящая из нескольких слоев клеток прямоугольной формы с толстыми стенками. Кора состоит из па-ренхимных клеток с утолщенными стенками и эфирномасличных каналов схизогенного происхождения. Центральный цилиндр состоит из перецикла, камбия, флоэмы, ксилемы и паренхимы сердцевины. Перицикл представлен паренхимными клетками. Камбий не дифференцирован. Флоэма представлена клетками округлой формы. Ксилема состоит из толстостенных сосудов округлой формы. Сердцевина состоит из крупных, округлых, тонкостенных парен-химных клеток, часто разрушена.

Корень на поперечном срезе имеет вторичное строение (рисунок 2). Покровная ткань представлена перидермой, состоящей из нескольких слоев прямоугольных клеток пробки. Клетки феллодермы имеют тонкие стенки, овальные или округлые, содержащие включения — крахмальные зёрна. Клетки флоэмы тонкостенные, округлой или многогранной формы, плотно прилегают между собой. В клетках паренхимы коры и флоэме имеются секреторные клетки, имеющие в поперечном срезе округлую форму. Содержимое секретирую-щих клеток окрашивается реактивом Судан III в оранжево-красный цвет, что свидетельствует о наличии эфирного масла. В ксилеме расположено большое количество одревесневших механических тканей. Сосуды ксилемы на продольном срезе корня пористые.

Рисунок 1. Динамика снижения активности ЭОП по шкале CAS в обеих группах

Время после окончания пульс-терапии, нед. * для межгруппового сравнения (критерий Манна-Уттш)

В обеих группах параллельно снижению активности офтальмопатии происходило уменьшение выраженности экзофтальма. В первой группе через 1 неделю после окончания терапии отмечалось достоверное снижение выраженности экзофтальма с 22 мм (18-28) до 20,5 мм (17-28). К 52 неделе экзофтальм составил 19 мм (15-25), что также достоверно различалось при сравнении с исходными данными (р<0,05). Во второй группе через 1 неделю после окончания терапии также отмечалось достоверное снижение выраженности экзофтальма с 20,5 мм (18-27) до 20 мм (16-25). К 52 неделе уровень экзофтальма составил 18 мм (14-22), что также достоверно различалось при сравнении с исходными данными. У большинства пациентов, получивших пульс-терапию МП в ежедневном режиме, клинически значимое уменьшение экзофтальма (уменьшение степени экзофтальма на 2 мм и более) произошло на 4 и 12 неделе после окончания терапии. Тогда как у большинства пациентов, получивших пульс-терапию в еженедельном режиме, клинически значимое уменьшение экзофтальма было достигнуто на 12 и 24 неделе после окончания пульс-терапии (рисунок 2). При сравнительном анализе двух групп статистически значимого отличия по выраженности экзофтальма за весь период наблюдения получено не было. Также при межгрупповом сравнении не было выявлено достоверно значимых отличий по клинически значимому уменьшению экзофтальма (р>0,05).

Рисунок 2. Клинически значимое снижение активности офтальмопатии и выраженности экзофтальма в обеих группах

МП ежедневно МП 1 раз в неделю

□ Экзофтальм 0CAS РЭкзофтальм OCAS

Время после окончания пульс-терапии, Время после окончания пульс-терапии,

нед. нед.

В первой группе 18 (90%) пациентов предъявляли жалобы на диплопию. Через 1 неделю после окончания терапии отмечалось достоверное снижение выраженности диплопии с 3,2 ± 0,8 баллов до 2,7 ± 0,8 баллов (р<0,05), которое прослеживалось до 12 недели после отмены терапии. Начиная с 24 недели после отмены терапии, степень диплопии усилилась, и достоверных отличий по выраженности диплопии с исходными значениями выявлено не было. В первой группе у большинства пациентов клинический эффект был достигнут на 1 и 4 неделе после окончания пульс-терапии МП. Однако к концу наблюдения достигнутый эффект сохранился лишь у 30% пациентов. Исходно во второй группе 14 (87,5%) пациентов предъявляли жалобы на диплопию. Статистически значимое снижение степени диплопии было зарегистрировано с 4 недели после отмены терапии и сохранялось в течение последующих 20 недель, при этом у большинства пациентов клинический эффект был достигнут на 12 и 24 неделе после окончания пульс-терапии метилпреднизолоном. В последующем к 52 неделе после окончания терапии степень диплопии несколько усилилась, и достоверной разницы с исходными значениями выявлено не было (рисунок 3). При этом к концу наблюдения достигнутый эффект сохранился у 50% пациентов. При межгрупповом сравнении в первой группе степень диплопии была достоверно выше, чем во второй группе на протяжении всего периода наблюдения, начиная с исходных значений. Однако при сравнении числа пациентов с положительной динамикой по диплопии (снижении на 1 балл и

более) статистически значимой разницы между группами выявлено не было (р>0,05).

Рисунок 3. Клинически значимое снижение диплопии в обеих группах

Таким образом, в группе ежедневного введения МП у большинства пациентов клинически значимое снижение активности ЭОП и степени экзофтальма было достигнуто на 4 и 12 неделе после отмены терапии, а диплопии на 1 и 4 неделе. В группе введения МП 1 раз в неделю у большинства пациентов выраженное снижение активности ЭОП, также как и в первой группе, произошло на 4 и 12 неделе после отмены терапии, а клинически значимое снижение степени экзофтальма и диплопии было достигнуто на 12 и 24 неделе после отмены терапии.

Сравнение безопасности двух режимов пульс-терапии метилпреднизолоном

Исходно пациенты обеих групп не отличались между собой по уровню AJIT, ACT, ЩФ Y-ГТ и общему билирубину, креатинина, глюкозы крови натощак. Также пациенты обеих групп достоверно не различались по массе тела, уровню систолического артериального давления (САД), уровню диастолического артериального давления (ДАД) (таблица 3).

МП ежедневно

1 4 12 24 52 Время после окончания пульс-терапии,

нед.

МП 1 раз в неделю

нед.

1 4 12 24 52 Время после окончания пульс-терапии,

Таблица 3. Показатели биохимических параметров сыворотки крови пациентов, массы тела и АД на момент включения в исследование ____

Показатель 1 группа (МП 1 раз в день) п=20 2 группа ^МП 1 раз в неделю) п=16 Р

АЛТ, Ед/л 21,5 [17; 31] 18 £15; 33] 0,4

ACT, Ед/л 18 [16; 25] 20 [14,5; 251 0,7

ЩФ, Ед/л 85,5[68; 95] 84[60; 156] 0,7

Общий билирубин, мг/дл 0,6 [0,5; 1] 0,6 [0,5; 0,7] 0,48

Y-ГТ, Ед/л 26,5 [17; 38] 23 [13; 34,5] 0,6

Глюкоза, ммоль/л 5,0 [4,5; 5,4] 4,9 [4,6; 5,3] 0,66

Креатинин, мг/дл 0,9 [0,8; 1] 1,0 [0,75; 1,045] 0,6

Масса тела, кг 75 [68,7; 881 69,25 [59,5; 89,5] 0,57

САД, мм рт.ст. 125 [117,5; 1351 122,5 [120; 130] 0,6

ДАД. мм рт.ст. 80 [70; 901 80 [72,5; 82,5] 0,87

Пациенты с АГ, п 7 4 0,39

Пациенты с СД 2 типа, п 1 1 0,69

Одиннадцать пациентов (семь из первой группы и четыре пациента из второй группы) имели артериальную гипертензию (АГ) и получали постоянную антигипертензивную терапию. При оценке динамики АД в группе пациентов, получивших пульс-терапию метилпреднизолоном ежедневно, было выявлено статистически значимое повышение АД после 3-й инфузии метилпреднизолона, в связи с чем потребовалась коррекция антигипертензивной терапии у 3-х пациентов. В последующем значимого повышения САД выявлено не было. Диастолическое артериальное давление (ДАД) в этой же группе пациентов ни вовремя проведения терапии, ни после ее окончания достоверно не отличалось по сравнению с исходными значениями (рисунок 4). В группе пациентов, получивших терапию метилпреднизолоном 1 раз в неделю, не выявлено достоверного повышения ни систолического, ни диастолического АД по сравнению с исходными значениями (рисунок 4). При сравнении систолического и диастолического АД между двумя группами на протяжении всего периода наблюдения статистически значимой разницы получено не было (р>0,05). При сравнении двух групп на протяжении всего периода наблюдения по числу пациентов, отвечающих критериям артериальной гипертензии, т.е. САД > 140 мм рт.ст. и/или ДАД > 90 мм рт.ст., было установлено, что ни одна из схем пульс-терапии не увеличивает риск развития АГ.

Рисунок 4. Динамика АД в обеих группах

Время после окончания пульс-терапии За период наблюдения в обеих группах пациентов отмечено значимое повышение массы тела, зарегистрированное с 4 недели после отмены терапии и сохраняющееся таковым по 12 неделю. С 24 недели после отмены терапии масса тела вернулась к исходным значениям. Максимальная прибавка массы тела в первой группе пациентов к 4 неделе после отмены терапии составила 9 кг, к 12 неделе после отмены терапии - 14 кг, зарегистрированная у одной и той же пациентки. Максимальная прибавка массы тела во второй группе составила 10 кг и 11 кг к 4 и 12 неделям после отмены терапии, соответственно. Тем не менее, при сравнении массы тела между группами на протяжении всего периода наблюдения значимых различий выявлено не было (р>0,05) (рисунок

5).

Рисунок 5. Динамика массы тела в обеих группах

Значение р для внугригруппового сравнения Время после окончания пульс-терапии

В результате установлено, что в корневищах и корнях любистка лекарственного содержится галловой кислоты 0,37% и ЭГКГ — 0,08%.

Макро- и микроэлементный состав. Качественное и количественное содержание макро- и микроэлементов в золе корневищ и корней любистка лекарственного проводилось полуколичественным спектральным методом. Переход различных элементов из почвы в сырье колеблется в пределах от 1,0 до 3,3. К малоподвижным элементам следует отнести Т1, Мо, V, Высокая степень подвижности установлена для Ъп, Са, Сг, Вг и др. Примечательно низкое накопление тяжелых и токсичных металлов, что делает безопасным фармацевтическое использование исследуемого сырья любистка лекарственного.

Аминокислоты. Для анализа аминокислот использовали метод ВЭЖХ с применением аминокислотного анализатора марки «ААА-339» (Чехия). Полученные данные свидетельствуют о наличии в корневищах и корнях любистка лекарственного 15 аминокислот с суммарным количественным содержанием 4,16%, 9 из которых являются незаменимыми, с суммарным содержанием 54,1%. Из количественно доминирующих аминокислот следует отметить накопление глутаминовой кислоты (0,58%), фенилаланина (0,45%), лейцина (0,34%), аланина (0,20%), аспарагиновой кислоты (0,37%), гистидина (0,34%).

Глава 6. Разработка норм качества сырья любистка лекарственного

Экспериментально установлено, что наиболее оптимальными являются условия экстракции: экстрагент — спирт этиловый 70%, время экстракции — 1 час, соотношение сырье : экстрагент 1:20 и степень измельченности сырья до частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм.

Разработана методика ТСХ-анализа определения кумаринов в корневищах и корнях любистка лекарственного.

Разработана спектрофотометрическая методика определения суммы кумаринов в пересчете на ангелицин с установлением валидационных характеристик по параметрам: линейность, прецизионность, правильность и специфичность. Содержание кумаринов в корневищах и корнях любистка лекарственного

составило 6,67%, а относительная погрешность определения — 3,04%.

17

Разработана спектрофотометрическая методика количественного определения суммы фенольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту с установлением метрологических характеристик (0,480±0,001%).

Установлены товароведческие показатели сырья (цельного, измельченного, порошка) и определены их нормы для включения в раздел фармакопейной статьи «Числовые показатели».

Образцы исследуемого сырья по показателю микробиологической чистоты соответствовали требованиям ГФ XII (категория 4А).

Анализ показал, что все образцы сырья удовлетворяют требованиям Сан-ПиН 2.3.2 1078-01 в редакции СанПиН 2.3.2 1280-03 по содержанию кадмия, свинца и ртути [ОФС 42-0011-03].

Исследуемые образцы растительного сырья не представляют радиологической опасности, так как накапливают до 1% С5-137 и 0,15-0,30% Бг-90 от допустимого нормативной документацией уровня.

На основании проведенных исследований по изучению содержания основных групп БАС, сроков годности сырья, товароведческих, морфолого-анатомических исследований предложены показатели и нормы качества для сырья исследуемого вида сырья, которые положены в основу современной нормативной документации (таблица 5).

Таблица 5 - Показатели норм качества _«Любистка лекарственного корневища и корни»

Показатели Методы Нормы

Внешние признаки Визуальный, органолептический В соответствии с ФС 42-

Микроскопия Микроскопический В соответствии с ФС 42-

Качественные реакции Поперечный срез корневища или корня помещают в раствор Судана III, накрывают покровным стеклом и нагревают. Капли эфирного масла окрашиваются в оранжево-желтый цвет (масла).

Хроматография ТСХ-анализ Зона адсорбции голубого цвета с Я/ около 0,8±0,02 (ангелицин)

УФ-спектры 1. УФ-спектр извлечений из сырья, полученных с помощью 70% спирта этилового Максимумы поглощения I области 278±2 нм, 327±2нм (хлорогеновая кислота)

2. УФ-спектр извлечений из сырья, полученных с помощью 96% спирта этилового Максимум поглощения при 270±2 нм (ангелицин)

Влажность ГФ XI, вып. 1. С. 285-286 Не более 12 %

Зола общая ГФ XI, вып. I, С. 24 Не более 10 %

Зола нерастворимая в 10%р-ре НС1 ГФ XI, вып. 1, С. 25 Не более 2%

Органические примеси ГФ XI, вып. 1, С. 276 Не более 1%

Минеральные примеси ГФ XI, вып. 1, С. 276 Не более 1%

Количественное определение Спектрофотометричесюш (сумма кума-ринов в пересчете на ангелицин) Не менее 5%

Спектрофотометрический (сумма фе-нольных соединений в пересчете на хло-рогеновую кислоту) Не менее 0,4%

ГФ XII - метод 3 (эфирное масло) Не менее 1,0%

Микробиологическая чистота ГФ XII ОФС 42-0016-07 Категория 4 А

Упаковка ГФХ1, вып. 2, С. 381 ГОСТ 6077-80 В мешки тканевые или льно-джуто-кенафные не более 40 кг нетто

Маркировка ГФ XI, вып. 12, С. 384 ГОСТ 14192-96 На этикетке указывается наименование предприятия—изготовителя, его товарный знак, юридический адрес, название лекарственного средства на русском языке, масса 40 кг при влажности не более 12%, регистрационный номер, номер серии, срок годности, условия хранения, «Продукция прошла радиационный контроль»

Транспортировка ГФ XI, вып. 2, С. 385 ГОСТ 14192-77 и ГОСТ 17768-80

Сок годности 2 года

Глава 7. Изучение фармакологической активности

Проведенные исследования по изучению безопасности применения сухого экстракта любистка лекарственного позволяют отнести исследуемый экстракт к 5 классу токсичности веществ по классификации К.К. Сидорова. Однако следует отметить, что применение экстракта повышает тревожность животных и снижает двигательную активность по сравнению с интактными животными.

Полученные данные по изучению отхаркивающей активности доказывают, что углеводные фракции любистка лекарственного обладают отхаркивающим действием, выраженным в разной степени. Наибольшей активностью обладают водорастворимые полисахариды, при этом двигательная активность мерцательного эпителия увеличивалась на 23,47% , по сравнению с препаратом сравнения «Мукалтин».

Изучение антибактериального действия выявило преимущественно активность эфирного масла и водного извлечения из корневищ и корней любистка лекарственного. Максимальную активность проявляло эфирное масло.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о выраженной диуретической активности экстракта любистка лекарственного. При этом его мочегонная активность не уступает гипохлортиазиду.

Результаты опыта показали, что при введении экстракта корневищ и корней любистка лекарственного тонус тонкого кишечника достиг 25,0±1,39 усл. ед., что соответствует снижению тонуса в среднем на 90,84% (Р<0,001). Полученные результаты позволяют рассматривать любисток лекарственный как растение, обладающее спазмолитической активностью.

Однократное введение спиртового извлечения любистка лекарственного привело к достоверному увеличению желчи на 57,8%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В рамках настоящей работы проведены интродукционные, морфолого-анатомические, фитохимические исследования, разработаны нормы качества сырья корневищ и корней любистка лекарственного (Levisticum officinale) и проведен фармакологический скрининг отдельных извлечений из сырья. Основные результаты диссертационного исследования отражены в следующих выводах:

1. Проведены интродукционные исследования по выращиванию любистка лекарственного на территории Ставропольского края (КМВ). Определена лабораторная и полевая всхожесть семян в условиях различных режимов стратификации, установлены оптимальные сроки посева в открытый грунт, урожайность семян в условиях культуры (до 16 ц/га), урожайность надзем-

ной части (до 200 ц/га), подземных органов (до 250 ц/га). На основании оценки среднего выхода воздушно-сухого сырья для травы (12,85%) и корневищ и корней (32,75%), а также ориентировочного выхода кумаринов из подземных органов любистка лекарственного (от 136,90 до 154,67 кг/га) и эфирного масла (111,43-136,73 кг/га) экономически обоснован вид сырья -корневища и корни.

2. Установлены морфолого-анатомические признаки цельных, измельченных и в виде порошка корневищ и корней любистка лекарственного позволяющие подтвердить подлинность и включить их в разделы фармакопейной статьи «Внешние признаки» и «Микроскопия». С помощью люминесцентной микроскопии установлено, что кумарины в корнях любистка лекарственного локализуются в содержимом секреторных каналов.

3. Исследован качественный состав сырья любистка лекарственного, выявлено наличие углеводных производных, дубильных веществ, флавоноидов, кумаринов, фенолкарбоновых, органических и аминокислот, сапонинов и антр-агликозидов.

4. Установлено количественное содержание полисахаридов (22,2-24,1%). Выделены различные углеводные фракции: растворимые в спирте этиловом (0,45%), воде (4,70%), растворе аммония оксалата (6,0%) и растворах щелочей (12,0%). Методом ГЖХ впервые установлен качественный и количественный моносахаридный состав. Определены физико-химические свойства пектинов: рН водных растворов, содержание свободных и этерифици-рованных карбоксильных групп. Содержание полигалактуроновой кислоты в сырье составило во фракциях ВРПС - 32,5%, ПВ - 58,8% и ГЦ - 20,1%.

5. Содержание эфирного масла в различных образцах сырья составляло от 1,2 до 2,4%. Методом газовой хромато-масс-спектрометрии в эфирном масле корневищ и корней любистка лекарственного идентифицировали 17 компонентов, что составляет 97,67% от всех обнаруженных. Доминирующими компонентами являются ациклические монотерпеновые углеводороды: ли-налоол (42,88%) и линалил ацетат (36,20%).

6. Методами БХ, ТСХ и ВЭЖХ в исследуемом сырье идентифицированы фе-нольные соединения: фенолкарбоновые кислоты, флавоноиды и кумарины. В индивидуальном виде выделены 14 соединений, среди которых 6 фенолкарбоновых кислот: эллаговая, галловая, кофейная, хлорогеновая, феруло-вая и цикориевая; 8 кумаринов: императорин, бергаптен, псорален, окси-пейцеданин, остол, ангелицин, умбелиферон, кумарин, структура которых

подтверждена методами УФ-, ИК-спектрометрии, физико-химическими характеристиками.

7. Изучен качественный и количественный состав свободных и связанных аминокислот, представленных 15 соединениями, 9 из которых являются незаменимыми с суммарным содержанием 54,1%.

8. Экспериментально обоснованы оптимальные параметры экстракции биологически активных веществ: экстрагент - спирт этиловый 70%, время экстракции - 1 час, соотношение сырье : экстрагент 1:20 и степень измельчен-ности сырья до частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм.

9. Разработана спектрофотометрическая методика определения суммы кума-ринов в пересчете на ангелицин с установлением валидационных характеристик по параметрам: линейность, прецизионность, правильность и специфичность.

10. Разработана спектрофотометрическая методика количественного определения суммы фенольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту с установлением метрологических характеристик.

11. Установлены товароведческие показатели сырья (цельного, измельченного, порошка) и определены их нормы для включения в раздел фармакопейной статьи «Числовые показатели».

12. Проведены фармакологические скрининговые исследования различных субстанций из подземных органов любистка лекарственного, в результате которых выявлены антибактериальное, спазмолитическое, желчегонное, отхаркивающее и диуретическое действия.

Таким образом, в ходе проведенных исследований расширены знания о химическом составе, экспериментально обоснованы нормы качества для разработки фармакопейной статьи «Любистка лекарственного корневища и корни» и инструкции по сбору и сушке, что открывает возможность для их внедрения в научную медицину и фармацевтическую промышленность. Полученные данные могут служить предварительным экспериментальным обоснованием перспективности использования исследованных субстанций в качестве лечебно-профилактических средств и внедрения новых отечественных фитопрепаратов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Овчинникова, С.Я. Изучение спазмолитической активности экстракта корневищ и корней любистока лекарственного / С.Я. Овчинникова, Т.В. Орловская // Научные ведомости Белгородского гос. университета. Серия Медицина. Фармация.-2012 .-№ 4 (123). - С. 275-277.

2. Овчинникова, С.Я. Изучение диуретической активности экстракта корневищ и корней любистока лекарственного / С.Я. Овчинникова, Т.В. Орловская, М.А. Оганова // Научные ведомости Белгородского гос. университета. Серия Медицина. Фармация.-2012. -№ 10 (129). - С. 158-159.

3. Изучение химического состава некоторых пищевых растений, культивируемых в Ставропольском крае / В.А. Челомбитько [и др.] // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. — 2012. — № 4. — С. 44-47.

4. Овчинникова, С.Я. Изучение углеводов Levisticum officinale / С.Я. Овчинникова, Т.В. Орловская, М.Х. Маликова // Химия природ, соединений. - № 5.-2013.-С. 788-798.

5. Овчинникова, С.Я. Морфолого-анатомическое изучение корневищ и корней любистока лекарственного / С.Я. Овчинникова, Т.В. Орловская // Фармация. -2013.- №2.-С. 14-17.

6. Овчинникова, С.Я. Определение хлорогеновой кислоты методом планар-ной хроматографии / С.Я.Овчинникова, Т.Д. Мезенова, Т.В. Орловская // Современные проблемы науки и образования. — 2013. — № 6.— Режим доступа: www.science-education.ru/113-11408.

7. Овчинникова, С.Я. Количественное определение кумаринов в корневищах и корнях любистка лекарственного / С.Я. Овчинникова, Л.Б. Губанова, Т.В. Орловская // Современные проблемы науки и образования. — 2014. — № 1, —Режим доступа: www.science-education.ru/1 15-1 1543.

8. Шемонаева, М.В. Изучение безопасности применения сухого экстракта любистока лекарственного / М.В. Шемонаева, С.Я. Овчинникова, A.B. Сергиенко // Экология и здоровье: сб. науч. тр. - Ессентуки, 2010. - Вып. 14.-С. 123-126.

9. Овчинникова, С.Я. Аминокислотный и элементный состав подземных органов любистока лекарственного / С.Я. Овчинникова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. — Пятигорск, 2012. - Вып. 67. - С. 93-94.

10. Овчинникова, С.Я. Некоторые результаты фитохимического исследования любистока лекарственного / С.Я. Овчинникова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2012. - Вып. 67. - С. 94-95.

11. Овчинникова, С.Я. Изучение фенольных соединений подземных органов любистока лекарственного / С.Я. Овчинникова, Т.В. Орловская // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2013. - Вып. 68. - С. 72-74.

12. Орловская, Т.В. Определение антибактериальной активности субстанций, полученных из корневищ с корнями любистка лекарственного / Т.В. Орловская, С.Я. Овчинникова // Междунар. журн. приклад, и фундамент, исследований. - 2013. -№ 10. - С. 474-475.

13. Орловская, Т.В. Изучение отхаркивающей активности углеводов корневищ и корней любистка лекарственного / Т.В. Орловская, С.Я. Овчинникова // Междунар. журн. приклад, и фундамент, исследований. - 2014. - № 1. - С. 94-95.

14. Орловская, Т.В. Опыт выращивания любистка лекарственного в условиях Ставропольского края / Т.В. Орловская, С.Я. Овчинникова // Междунар. журн. приклад, и фундамент, исследований.-2014.-№ 1.-С. 104-105.

15. Орловская, Т.В. Изучение желчегонной активности сухих экстрактов, полученных из корневищ и корней любистока лекарственного / Т.В. Орловская, С.Я. Овчинникова // Междунар. журн. приклад, и фундамент, исследований. -2014. -№ 1.-С. 118-119.

16. Овчинникова, С.Я. Изучение фенольных соединений корневищ и корней любистка лекарственного методом ВЭЖХ / С.Я. Овчинникова, Т.В. Орловская // Междунар. журн. приклад, и фундамент, исследований. - 2014. - № 4.-С. 216-217.

17. Овчинникова, С.Я. Количественное определение суммы фенольных соединений в корневищах и корнях любистка лекарственного / С.Я. Овчинникова, Т.В. Орловская // Междунар. журн. приклад, и фундамент, исследований. - 2014. - № 5. - С. 148-149.

ОВЧИННИКОВА СВЕТЛАНА ЯКОВЛЕВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЛЮБИСТКА ЛЕКАРСТВЕННОГО (LEVISTICUM OFFICINALE KOCH.)

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати «26» июня 2014 г. Формат 60x84/16 Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № 2215 ПМФИ - филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России

357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11 Отпечатано в типографии издательства ООО «РИА-КМВ». 357500, г. Пятигорск, ул. Февральская, 54 тел. (8793) 33-36-56, факс (8793) 39-09-03.