Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение короставника полевого (Knautia arvensis (L.) Coult.)

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ! ОБРАЗОВАНИЯ «КУРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ | 1 РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ I

На правах рукописи

Денисова Наталья Николаевн

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ КОРОСТАВНИКА ПОЛЕВОГО (ЮШША АКУЕ^Ю (Ь.) СОиЬТ.)

ю со

со

ю -со я

со

О °

СМ ю

Специальность: 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук И.Л. Дроздова

Курск - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ ......................................................................................................................................................6

ГЛАВА 1. Ботаническая характеристика, химический состав и применение короставника полевого в народной

медицине (Литературный обзор)............................................................12

1.1 Ботаническая характеристика, распространение семейства Ворсянковые, рода Короставник и вида Короставник полевой................................................................................................12

1.2 Химический состав короставника полевого....................................17

1.3 Применение короставника полевого в народной медицине................................................................................................................................................19

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования............................................................28

2.1 Характеристика объектов исследования................................................28

2.2 Фитохимический анализ травы короставника полевого на различные группы БАВ........................................................................................29

2.2.1 Приготовление водных извлечений для анализа........................29

2.2.1.2 Углеводы............................................................................................................................30

2.2.1.2.1 Свободные сахара......................................................................................................30

2.2.1.2.2 Связанные сахара......................................................................................................30

2.2.1.3 Азотсодержащие соединения................................................................................................30

2.2.1.3.1 Аминокислоты..............................................................................................................30

2.2.1.3.2 Азотистые основания..............................................................................................31

2.2.1.3.3 Алкалоиды........................................................................................................................32

2.2.1.4 Дубильные вещества................................................................................................32

2.2.1.5 Органические кислоты..........................................................................................33

2.2.1.5.1 Качественное обнаружение....................................................................................33

2.2.1.5.2 Количественное определение свободных органических кислот..................................................................................................................................33

2.2.1.5.3 Количественное определение аскорбиновой кислоты............34

2.2.2 Приготовление спирто-водных извлечений для анализа... 34

2.2.2.1 Кумарины..........................................................................................................................35

2.2.2.2 Фенолкарбоновые кислоты................................................................................35

2.2.2.3 Флавоноиды..............................................................................................................................35

2.2.2.4 Изучение фенольных соединений методом ВЭЖХ....................36

2.2.2.5 Тритерпеновые соединения................................................................................37

2.2.3 Приготовление гексановых извлечений для анализа..............39

2.2.3.1 Каротиноиды..........................................................................................................................39

2.2.4 Эфирное масло..............................................................................................................40

2.2.5 Макро- и микроэлементный состав........................................................................40

2.3 Выделение полисахаридов из травы короставника полевого........................................................................................................................................................41

2.3.1 Качественное и количественное определение состава моносахаридов............................................................................................................42

2.3.2 Количественное определение функциональных групп пектиновых веществ................................................................................................44

2.4 Методы токсико-фармакологических исследований................46

2.4.1 Изучение острой токсичности......................................................................46

2.4.2 Изучение отхаркивающего действия......................................................47

2.4.3 Изучение противовоспалительной активности..............................48

2.4.3.1 Влияние на процессы экссудации............................................................48

2.4.3.2 Влияние на процессы пролиферации........................................................49

2.4.3.3 Влияние на проницаемость капилляров........................................................49

2.4.4 Изучение анальгезирующего действия........................................................50

2.4.5 Изучение диуретической активности........................................................51

2.4.6 Изучение антимикробной активности....................................................51

2.4.7 Исследование антиоксидантной активности......................................52

2.4.7.1 Обнаружение БАВ, проявляющих антиоксидантную активность, методом ТСХ................................................................................52

2.4.7.2 Оценка антиоксидантной активности методом биохемилюминесцентного анализа..............................................................53

2.5 Методики стандартизации сырья..................................................................54

2.5.1 Методы отбора проб для анализа..................................................................54

2.5.2 Морфолого-анатомические исследования............................................54

2.5.3 Определение числовых показателей качества сырья................54

2.6 Статистическая обработка данных..........................................................55

ГЛАВА 3. Фитохимический анализ травы короставника

полевого..........................................................................................................................56

3.1 Исследование углеводов......................................................................................56

3.1.1 Качественный состав свободных Сахаров............................................56

3.1.2 Обнаружение связанных Сахаров................................................................56

3.1.3 Качественное обнаружение полисахаридов......................................57

3.2 Исследование азотсодержащих соединений....................................57

3.2.1 Аминокислотный состав............................................................................................57

3.2.2 Азотистые основания................................................................................................59

3.2.3 Алкалоиды........................................................................................................................61

3.3 Исследование дубильных веществ............................................................61

3.4 Исследование органических кислот..........................................................62

3.4.1 Качественное обнаружение............................................................................62

3.4.2 Количественное определение свободных органических кислот....................................................................................................................................63

3.4.3 Количественное определение аскорбиновой кислоты..............63

3.5 Исследование кумаринов....................................................................................63

3.6 Исследование фенолкарбоновых кислот..............................................64

3.7 Исследование флавоноидов..............................................................................64

3.8 Исследование фенольных соединений методом ВЭЖХ.... 66

3.9 Исследование тритерпеновых соединений........................................68

3.10 Исследование каротиноидов............................................................................69

3.11 Эфирное масло............................................................................................................70

3.12 Макро-и микроэлементный состав..........................................................70

3.13 Выделение полисахаридного комплекса и изучение его состава..................................................................................................................................74

3.13.1 Метод выделения полисахаридного комплекса..............................75

3.13.1.1 Выделение водорастворимых полисахаридов..................................77

3.13.1.2 Выделение пектиновых веществ..................................................................77

3.13.1.3 Выделение гемицеллюлозы А и гемицеллюлозы Б....................77

3.13.2 Изучение качественного и количественного состава полисахаридов................................................................................................................78

3.13.3 Количественное определение функциональных групп пектиновых веществ..............................................................................................79

Выводы по главе 3......................................................................................................................................................80

Глава 4. Стандартизация лекарственного растительного

сырья травы короставника полевого................................................83

4.1 Разработка показателей подлинности сырья....................................83

4.1.1 Характеристика морфологических признаков сырья................83

4.1.2 Характеристика микродиагностических признаков сырья. 84

4.1.2.1 Микродиагностические признаки листа..............................................84

4.1.2.2 Микродиагностические признаки чашелистика............................84

4.1.2.3 Микродиагностические признаки лепестка......................................85

4.1.2.4 Микродиагностические признаки стебля............................................85

4.2 Разработка показателей качества сырья..............................................97

4.2.1 Числовые показатели качества травы короставника

полевого..............................................................................................................................97

4.2.1.1 Определение влажности......................................................................................97

4.2.1.2 Определение золы....................................................................................................98

4.2.1.3 Определение примесей........................................................................................99

4.3 Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в траве короставника полевого................100

4.3.1 Изучение условий спектрофотометрического определения суммы флавоноидов в траве короставника полевого..............................................................................................................................101

4.3.2 Методика количественного определения суммы флавоноидов в траве короставника полевого..................................106

4.4 Разработка методики количественного определения суммы водорастворимых полисахаридов (ВРПС) в траве короставника полевого........................................................................................108

4.4.1 Изучение условий гравиметрического определения суммы ВРПС..................................................................................................................108

4.4.2 Методика количественного определения суммы ВРПС....................................................................................................................................110

4.5 Изучение динамики накопления основных групп

биологически активных веществ по фазам вегетации в

траве короставника полевого..........................................................................112

Выводы по главе 4........................................................................................................................................................113

ГЛАВА 5. Изучение фармакологической активности травы

короставника полевого........................................................................................115

5.1 Изучение острой токсичности..........................................................................115

5.2 Изучение отхаркивающего действия..........................................................117

5.3 Изучение противовоспалительной активности................................119

5.3.1 Влияние на процессы экссудации................................................................119

5.3.2 Влияние на процессы пролиферации........................................................120

5.3.3 Влияние на проницаемость капилляров..................................................121

5.4 Изучение анальгезирующего действия....................................................123

5.5 Изучение диуретической активности........................................................125

5.6 Изучение антимикробной активности..........................................................127

5.7 Изучение антиоксидантной активности....................................................130

Выводы по главе 5..........................................................................................................................................................135

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ......................................................................................................................................138

ЛИТЕРАТУРА..................................................................................................................................................140

ПРИЛОЖЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В последнее время неуклонно возрастает частота использования лечебно-профилактических средств растительного происхождения. Это объясняется тем, что фитопрепараты сочетают в себе широкий спектр биологической активности и относительную безвредность [10].

Однако, из всего видового разнообразия отечественной флоры, используемого исторически в народной медицине (более 10 тысяч видов), в Государственный Реестр лекарственных средств России включено около 350 растений [92]. Кроме того, антропогенное воздействие на природу приводит к сокращению естественных ресурсов многих дикорастущих лекарственных растений [30]. В связи с этим возникает необходимость в расширении сырьевой базы лекарственных растений за счет внедрения в официнальную медицину новых видов отечественной флоры и комплексного их использования.

Одним из перспективных отечественных сырьевых источников БАВ является короставник полевой (Кпаийа ап/егшз (Ь.) Соик.) семейства Ворсянковые (В1рзасасеае ^бб.). Короставник полевой широко распространен во флоре Центральной России [157], имеет значительную сырьевую базу (что обуславливает экономическую эффективность и целесообразность). Данный вид издавна и широко применяется в народной медицине в качестве противовоспалительного, отхаркивающего, антисептического средства.

Однако, в химическом плане состав растения практически не изучен, отсутствуют экспериментальные данные о фармакологической активности, что послужило причиной его исследования.

Таким образом, изучение химического состава и фармакологической активности короставника полевого, разработка показателей качества лекарственного сырья является актуальной проблемой.

Цель и задачи исследования.

Цель работы заключалась в фармакогностическом изучении травы короставника полевого и обосновании возможности его использования в медицинской практике как источника природных БАВ.

Задачи исследования:

1. Провести фитохимический анализ травы короставника полевого.

2. Провести морфолого-анатомические исследования и выявить диагностические признаки сырья.

3. Разработать методики стандартизации сырья и определить нормы содержания БАВ и других числовых показателей.

4. Установить научно-обоснованные сроки заготовки сырья.

5. Провести скрининговые фармакологические исследования.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Курского государственного медицинского университета (номер государственной регистрации 01201051084).

Научная новизна. Установлен химический состав основных групп БАВ травы короставника полевого. Изучен качественный состав и количественное содержание полисахаридов, фенольных (флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, кумаринов, дубильных веществ) и тритерпеновых соединений, органических кислот, каротиноидов, аминокислот, макро- и микроэлементов; обнаружены азотистые основания.

Впервые изучен компонентный состав свободных аминокислот в траве короставника полевого. Установлено наличие 15 аминокислот, из них 7 -незаменимых. Суммарное содержание свободных аминокислот в сухом остатке водного извлечения исследуемого вида составляет 4,6%, в том числе незаменимых - 1,6%; преобладающей является кислота глутаминовая.

Впервые изучен качественный и количественный элементный состав травы короставника полевого. Установлено, что трава короставника полевого

содержит 22 макро- и микроэлемента, из которых 10 являются эссенциальными и 5 - условно эссенциальными.

Впервые выделен и разделен на фракции полисахаридный комплекс травы короставника полевого. Установлено, что в его состав входят водорастворимые полисахариды, пектиновые вещества, гемицеллюлозы А и Б. Определен их качественный и количественный моносахаридный состав. Проведен анализ функциональных групп пектинов.

Впервые проведено изучение фенольных соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Установлено наличие флавоноидов (рутин, кверцетин, лютеолин-7-гликозид, кемпферол), кумаринов (кумарин, умбеллиферон), фенолкарбоновых кислот (галловая, о-кумаровая, кофейная, цикориевая, феруловая), танин, эпикатехин. Методом внутренней нормализации установлено, что из флавоноидных соединений преобладают лютеолин-7-гликозид и кверцетин, из фенолкарбоновых кислот - галловая кислота, из веществ кумариновой природы - умбеллиферон. Из 13 идентифицированных соединений фенольной природы 12 в короставнике полевом обнаружены впервые.

Впервые для стандартизации сырья травы короставника полевого разработаны методики количественного определения суммы водорастворимых полисахаридов (методом гравиметрии) и суммы флавоноидов (методом спектрофотометрии). Определены нормы содержания БАВ и других числовых показателей качества сырья.

Впервые изучено морфологическое и анатомическое строение травы короставника полевого. Выявлены диагностические признаки, позволяющие устанавливать подлинность сырья.

Впервые изучена динамика накопления водорастворимых полисахаридов и флавоноидов в траве короставника полевого в зависимости от фазы вегетации растений. Установлены научно обоснованные сроки заготовки сырья.

При проведении скрининговых фармакологических исследований экспериментально установлено наличие у травы короставника полевого

противовоспалительной, отхаркивающей, антимикробной,

диуретической, анальгезирующей, антиоксидантной активности.

Практическая значимость и внедрение результатов исследования.

Результаты исследований позволяют расширить сведения о химическом составе и фармакологической активности травы короставника полевого.

Проведенные фитохимическ�