Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.01) на тему:Разработка технологии и нормирование качества жидкого и сухого экстрактов травы стальника полевого

Давитавян Наира Альбертовна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ И НОРМИРОВАНИЕ КАЧЕСТВА ЖИДКОГО И СУХОГО ЭКСТРАКТОВ ТРАВЫ СТАЛЬНИКА ПОЛЕВОГО ^ ^

15.00.01. - технология лекарств и организация фармацевтического дела

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

I!

ООЗ 1 Т68Т~7

ПЯТЙГОРСК-2007

Диссертационная работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: двтор фармацевтических наук, профессор

Сампиев Абдулмуталип Магаметович

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессиональною образования «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

аионного совета Д 208 069 01 при ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (357532, Ставропольский край, г Пятигорск, пр Калинина, 11)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Пятигорской I ФА Росздрава

Андреева Ирина Николаевна

доктор фармацевтических наук, профессор

Кузякова Людмила Михайловна

Защита состоится <о

'Ж» 2007 г. в

часов на заседании диссерта-

Автореферат разослан ^л^^с. 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, цоклор фармацевтических наук, профессор

Е.В. Компанцева

Давитавян Наира Альбертовна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ И НОРМИРОВАНИЕ КАЧЕСТВА ЖИДКОГО И СУХОГО ЭКСТРАКТОВ ТРАВЫ СТАЛЬНИКА ПОЛЕВОГ О

15.00.01. - технология лекарств и организация фармацевтическою дела

АВТОРЕФЕРАТ

ДИСС1-Р1АЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

ГГЯТШ ОРСК - 2007

Диссертационная работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кубанский юсударственный медицинский университет Федеральною агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Шучный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор

Сампиев Абдулмуталин Магаметович

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высше-н> профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

-- í"7 Защита состоится <t¿(£_» 2007 г в часов на заседании диссерта-

ционного совета Д 208 069 01 при ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (357532, Ставропольский край, г Пятигорск, нр Калинина, 11)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава

Андреева Ирина Николаевна

доктор фармацевтических наук, профессор

Кузякова Людмила Михайловна

Автореферат разослан «¿^У» /¿¿¡Ck^fcJL__2(307 г

Ученый секретарь диссертационного совета, докюр фармацевтических наук, профессор

Е В Компанцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время по ассортиментному составу грутта слабительных фитосредств в своем большинстве представлена лекарственными препаратами, содержащими антрагликозиды Однако, использование последних ограничено по ряду причин, к числу которых относятся быстрое к ним привыкание, развитие кишечной непроходимости, кровотечения, циститы, геморрой в стадии обострения, беременность, а также раздражающее действие на слизистую кишечника Более того, в некоторых странах гидроксипроизводные антрахинона запрещены и/или не рекомендованы к применению в связи с их канцерогенными свойствами В этой связи, становится очевидным, что актуальным является поиск новых сырьевых источников, не содержащих производные антрацена, но являющихся основой для создания лекарственных препаратов слабительного действия

С этой точки зрения особое место занимает корень стальника и получаемая из него настойка, поскольку они не содержат антра1 ликозиды и лишены указанных выше противопоказаний Валено отметить, что корень стальника и настойка из него обладают эффективным противогеморроидаяьным действием По мнению ряла ав торов, наибольший вклад в фармакологическую активность этих лекарственных препаратов стальника вносят две группы полифенолов - производные флавона и изофлавона В народной медицине наряду с корнем используется и трава стальника Химический состав надземной части растения практически не отличается от корня

Исходя из этого, представляется целесообразным исследование травы сталь пика полевого как дополнительного источника для получения слабительных лекарственных средств К тому же, такой подход очевиден с точки зрения комплексною использования лекарственного растительного сырья и разработки ресурсосбере гающих технологий

Все изложенное выше свидетельствует об актуальности исследований по фар-макогностическому изучению травы стальника, разработке технологии фитопрепаратов на ее основе и обоснованию применения в медицинской практике

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка технологии и нормирование качества жидкого и сухого экстрактов травы стальника полевоз о

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

- провести фармакогностическое изучение и стандартизировать траву стальника,

- рафабогать технологию жидкого экстракта травы стальника с учетом фармако-химических исследований,

- предложить нормы качества для разработанного жидкого экстракта, изучить условия и сроки его хранения,

разработать технологию и предложить нормы качества для сухого экстракта травы стальника, изучить условия и сроки его хранения,

- обосновать состав, разработать технологию твердых капсул сухого экстракта травы стальника,

- провести иандартизацию разработанных твердых капсул сухого экстракта травы сальника, изучить условия и сроки их хранения

Научная новиша. Впервые изучена динамика накопления флавоноидов, изо-флааоноидов, фенолкарбоновых кислот по фазам вегетации травы стальника полевого и установлено, что максимальное содержание этих соединений наблюдалось в конце цветения — начале плодоношения Для селективного количественного определения флавоноидов, изофлавоноидов и фенолкарбоновых кислот в траве стальника полевого использованы прямая и дифференциальная спектрофогометрия Установлено, что в траве стальника полевою содержание водорастворимых полисахаридов составляет в среднем 6,6%, пектиновых веществ - 8,3%, гемицеллюлозы А - 2,1%, I емицеллюлозы В - 3,9%, органических кислот - 2,1% Из макро- и микроэлементов преобладающими являются калий и железо На основе анатомо-морфологических исследований травы стальника уточнены диагностические признаки сырья Осуществлены исследования по стандартизации и предложены нормы качества травы стальника полевого

С учетом проведенных химических и фармаколсн ических исследований обоснован выбор экстрагента для получения жидкого и сухого экстрактов Выявлен» зависимость количественного содержания флавоноидов и изофлавоноидов в извлечениях из травы стальника полевого от способа экстракции Установлено, что мак сималыюе их содержание наблюдалось в первых двух стопах, получаемы* вакуум -фильтрационным методом

Фармакологический скрининг полученных извлечений выявил выраженное слабительное и желчегонное действие, превосходящее действие настойки из корнч, а также наличие умеренного обезболивающего свойства Наибольшая активное характерна для извлечения с использованием 70% спирта этилового

Разработана технология, обоснованы и нормированы показатели качества жидкого и сухого экстрактов, определены условия и сроки хранения Предложены состав и технолошя твердых капсул сухого экстракта травы стальника полевого, проведена их стандартизация, установлены условия и сроки хранения

Практическая значимость результатов исследования. Полученные уточненные и расширенные сведения о фиточимическом составе травы стальника свидетельствуют о целесообразности ее использования в качестве дополнит ел шого источника новых фитопрепаратов слабительного и желчегонного действия

Разработанная методика количественной оценки присутствующих совместно ч граве стальника и ее фитопрепаратах флавоноидов, изофлавоноидов и фенольарбо-новых кислот позволяет в одной пробе и раздельно определять содержание т.чг, трех I рупп БАВ

Установленные в ходе проведенного морфолого-анатомичегкого исследования характерные диагностические признаки травы стальника позволяют идентифицировать это сырье в измельченном виде

Предложенная технология жидкого экстракта (1 2) с использованием вакуум-фильтрационного способа позволяет извлечь из гравы стальника около 85% суммы БАВ, что гарантирует 2,5% концентрацию действующих веществ в целевом продукте Разработанная 1ехнология имеет несомненные преимущества по сравнению (

пользуемыми на фармацевтических фабриках ускоренной дробной мацерации и ре-перколяции, поскольку повышает выход БАВ в среднем на 40% и 37%

Для переработки травы стальника в условиях крупносерийного фармацевтического производства в более прогрессивный вид суммарною фитопрепарата предложена технология сухого экстракта с 25% содержанием действующих веществ Разработан состав и технология капсул с сухим экстрактом и предложена методика их стандартизации

Установленное слабительное и желчеюнное действие наряду с умеренным обезболивающим эффектом для извлечения из травы сталЕ.ника является обоснованием для разработки на его основе суммарных фитопрепаратов

Степень внедрения. По результатам исследований разработано два проекта 11'С 11 рапа стальника» (акт внедрения ООО «Кубаньлектравы» от 05 12 06 г, заключение по экспертизе проекта ФСП от КГУ «Центр по контролю качества и сер-шФикации лекарственных средств Краснодарского края» от 01 02 2007 г), и «Жидкий эксгракт стальника» (акт внедрения ЗАО «Роскарфарм» от 18 12 06 г) Разработанная методика количественного определения флавоноидов, изофлавоновдов и фенол-карбомовых кисло г в траве стальника внедрена в НИР Северо-Кавказской ЗОС РАСХН (акт внедрения от 20 12 06 г) Методики оценки качества травы стальника полевого и жидкого экстракта апробированы в отделах контроля качества ООО «Кубаньлектравы» (акт от 22 11 06 г) и ЗАО «Роскарфарм» (акт от 11 12 06 г) Технология иро-игводсгьа жидкого экстракта травы стальника апробирована в условиях ЗАО «Роскарфарм» (акт апробации 07 12 06 г)

Материалы диссертационного исследования внедрены в учебный процесс кафедры фармации ГОУ ВПО КГМУ Росздрава (акт внедрения от 28 09 06 г)

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно — исследовательских работ ГОУ ВПО К1 МУ Росздрава (№ гос регистрации 0120 0500289) Основные положения, выносимые на защиту: - результаты фотохимического, морфолого-анатомического исследования и стандартизации травы стальника полевого,

- данные по выбору оптимального экстрагента для получения фитопрепаратов из травы стальника полевого,

- итоги исследования по разработке технологии жидкого и сухого экстрактов, изучению их химического состава и установлению норм их качества;

- обоснование и результаты исследования по разработке состава, технологии и норм качества твердых капсул сухого экстракта травы стальника полевого

Апробация работы и публикации. Материалы диссертационной работы доложены на II и IV региональных научно-практических конференциях молодых ученых и студентов Краснодарского края «Медицинская наука и здравоохранение» (г Анапа, 2004, 2006гг), на 60-й региональной научной конференции по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г Пятигорск, 2005г), Всеукраинской научно-практической конференции с международным участием «Современные достижения фармацевтической науки и практики» (г Запорожье, 2006г)

По теме диссертации опубликовано 7 научных статей Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 173 страницах машинописного текста, содержит 51 таблицу, иллюстрирована 21 рисунком и изложена в пяти главах Список литературы включает 200 библиографических источников, из них 35 иностранных авторов

В первой главе (обзор литературы) приведены сведения, отражающие современное состояние исследований в области химии, фармакологии и применения стальника полевого Дается информация об ассортименте слабительных средств растительного происхождения Во второй главе охарактеризованы объекты, а Iакже перечислены материалы и методики исследования В третьей главе представлены результаты фармакогностического изучения травы стальника полевого Четвертая глава посвящена разработке технолоши и стандартизации жидкого экстракта травы стальника полевого Пятая глава включает исследования по разработке технологии и стандартизации сухого экстракта и его капсулированной формы

Выражаем искреннюю благодарность директору ГУП «Институт аллергии и астмы» профессору Р А Ханферяну за организацию и проведение фармакологиче-

ских и биологических исследований (отчет по их результатам приложен к диссертационной работе).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Фармако! ностическое изучение и стандартизация травы стальника полевого

Анализ научных данных по исследованию стальника полевого показал, что основными действующими веществами этого растения являются изофлавоноиды, флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты Наряду с этим было выявлено, что качественный их состав достаточно и подробно изучен, чего нельзя сказать о количественном содержании и фазе их максимального накопления в траве стальника Вместе с тем отсутствовали сведения о полигликанах, органических кислотах, сапонинах

Также не обнаружено полноценных данных о морфолого — анатомическом строении надземной части этого растения На первом этапе для восполнения этого пробела мы сочли целесообразным провести соответствующие исследования

Для количественной оценки упомянутых выше трех групп фенольных соединений необходимо было разработать методику их определения Необходимость разработки обосновывалась тем, что широко применяемые спектрофотометрические методы определения количественного содержания, в том числе для оценки качества корня и настойки стальника, не предусматривают селективного анализа изофлаво-ьоидон и фенолкарбоновых кислот в присутствии флавоноидов в испытуемом растворе В частности, при использовании метода прямой спектрофотометрии для анализа выбор длины воины 260 нм в качестве аналитической для определения изо-флавоноидов не корректен, поскольку при этой же длине волны характерно наличие интенсивной полосы для фенолкарбоновых кислот и флавоноидов То же самое справедливо и в отношении фенолкарбоновых кислот, определяемых при 325 нм, так как в этом случае на величину оптической плотности значимое влияние оказывают присутствующие в растворе флавоноиды В результате получаются завышенные результаты, не соответствующие истинному содержанию фенольных соединений в растительном сырье или хотя бы приближенные к таковому

Суть предлагаемой нами методики заключается в определении сначала флаво-ноидов по образующемуся комплексу с алюминия хлоридом в кислой среде методом дифференциальной спектрофотометрии, а затем, с учетом установленного их количества и принципа аддитивности, — содержания фенолкарбоновых кислот прямым спектрофотометрированием при длине волны 325 нм, при которой изофлавоноиды практически не поглощают. Установленная концентрация в испытуемом растворе флавоноидов и фенолкарбоновых кислот и рассчитанные для используемых стандартов (гинерозид и хлорогеновая кислота, соответственно) значения удельных показателей поглощения позволяют, на следующем этапе, рассчитать по принципу аддитивности количество изофлавоноидов при длине волны 260 нм (в пересчете на ононин)

Разработанная методика была успешно апробирована на модельных смесях указанных выше стандартных веществ и валидирована по «специфичности», «линейности», «точности», «сходимости», «воспроизводимости» и «достоверности» С ее использованием было уточнено содержание изофлавоноидов в корнях стальника - в среднем 0,7% и подтверждено получение завышенных результатов в случае оп ределения по фармакопее (около 2%) На основании разработанной методики нами установлено, что в фазе конца цветения - начала плодоношения накапливается максимальное количество фенольных соединений в траве стальника В этой связи в последующих исследованиях использовали траву стальника, заготовленную в этой фа зе вегетации растения

Фитохимический анализ травы стальника показал, что в ней содержатся фи-терпеновые сапонины - гликозиды олеаноловой кислоты Моносахаридный состав водорастворимых полисахаридов, пектинов, гемицеллюлоз А и В представлен 1лю-козой, галактозой, арабинозой, ксилозой и рамнозой Присутствуют также глюкуро-новая и галактуроновая кислоты Из группы органических кислот капиллярным электрофорезом обнаружены щавелевая, янтарная, лимонная, молочная, винная, аскорбиновая и количественно (0,85%) доминирующая в их ряду - яблочная Результаты определения суммы этих и других исследованных групп веществ в образцах тра-

вы стальника, заготовленных в разных местах произрастания, представлены в таб лице 1

Таблица 1 - Содержание биологически активных веществ в траве стальника

Группы биологически активных веществ Количественное содержание в абсолютно-сухом сырье, %

Ставропольский край, г Пятигорск Краснодарский край, п Чибий Краснодарский край, ст Динская Краснодарский край, ст Васюрин-ская Ростовская область, г Ростов

Изофлавоноиды 1,95±0,049 1,92±0,054 1,87±0,046 1,85±0,051 1,83±0,044

Флавоноиды 1,12±0,026 1,10±0,023 1,09±0,028 0,98±0,023 0,93±0,021

Фенолкарбоновые кислоты 4,06±0,098 4,15±0,103 4,25±0,108 4,47±0,105 4,39±0,111

Дубильные вещества 5,55±0,098 5,01±0,091 4,67±0,073 4 99±0,086 4,76±0,072

Органические кислоты 1,95±0,024 2,36±0,028 1,84±0,021 2,12±0,023 1,93 ±0,015

Тритерпеновые сапонины 1,72±0,044 1,71±0,039 1,79±0,046 1,80±0,041 1,75±0,049

Водорас1 воримые полисахариды 6,45±0,100 6,52±0,151 6,59±0,132 6,60±0,145 6,62±0,090

Пектиновые вещества 7,98*0,130 8,23^0,142 8,54±0,160 8,06±0,156 8,63±0,141

I емицеллюлоза Л 1,95±0,021 2,04±0,033 1,98±0,042 2,13^0,048 п 2,15±0 030

1 емицеллюлоза В 3,78±0,052 4,12±0,064 3,95±0,071 3,84 ±0,059 4.17±0,070

Из данных таблицы очевидно, что место произрастания существенно не влияет на количественное содержание биологически активных соединений

В траве стальника полевого определяли содержание макро- и микроэлементов (в сумме от 6,17% до 8,36%), так как минеральные вещества входят в состав крови и костей, необходимы для регуляции мышечных функций, включая мышцы сердечнососудистой системы, а также выступают в роли коферментов, обеспечивая многие

функции организма человека. Установлено, что в ряду макроэлементов преобладает калий, а в ряду микроэлементов - железо.

Проведенный микроскопический анализ листа, черешка, стебля, цветка выявил для травы стальника ряд характерных диагностических признаков, позволяю щих идентифицировать это сырье, в том числе в измельченном и порошкованном виде: головчатые железистые и простые многоклеточные волоски, анизоцитный и аномоцигный тип устьичного аппарата, извилистые стенки клеток эпидермиса и другие. На рисунке 1 представлены микрофотографии одной из исследованных частей травы стальника - листа.

Рисунок 1 - Эпидерма листа стальника полевого (10х)

А-верхняя эпидерма; Б- нижняя эпидерма; 1-устьице; 2-железистый волосок; 3-место прикрепления волоска; 4-простой многоклеточный волосок; 5- кристаллоносная обкладка

Совокупность проведенных исследований позволили предложить нормы качества для травы стальника, основные показатели которых представлены в таблице 2.

Таблица 2 — Основные показатели и нормы качества травы стальника

Показатели Нормы качества

Внешние признаки Смесь листьев, стеблей, цветков Все части растения опушены Листья очередные, черешковые Цветки мелкие, венчик розовый Запах ароматный

Микроскопия Извилистые стенки клеток эпидермиса Наличие на всех частях растения волосков простых многоклеточных, расположенных вблизи и непосредственно по краю и многоклеточных головчатых железистых волосков, расположенных по всей поверхности, в том числе по краю

Качественные реакции Ультрафиолетовый спектр водно-спиргового извлечения в диапазоне длин волн от 220 нм до 350 нм имеет три максимума поглощения при длинах волн 26012 нм, 300±2 нм, 325±2 нм На хроматограмме должно появиться пятно малинового цвета со значением Яг 0,78±0,02 (олеаноловая кисло га) Образование зеленовато-желтого окрашивания при добавлении алюминия хлорида (флавоноиды) Голубая флюоресценция водно-спиртовою извлечения стальника в УФ-свете, усиливающаяся при обработке аммиаком (изофлавоноиды)

Содержание флавоноидов Не менее 0,9%

Содержание изофлавоноидов Не менее 1,8%

Содержание фенолкарбоновых кислот Не менее 4,0%

Микробиологическая чистота Категория 4Б

В разделе «качественные реакции», помимо подтверждения подлинности сы-

рья по наличию фенольных соединений, характерных максимумов поглощения (260±2 нм, 300 Ь2 нм, 325±2 нм) УФ - спектра 70% водно - спиртового извлечения, предусмотрен ТСХ - анализ олеаноловой кислоты

Далее было установлено, что заложенные в проект ФСП нормируемые показа-гечи качества остаются неизменными в течение 24 месяцев хранения (в естественных условиях) в прохладном и защищенном от света месте для цельного, измельченного сырья и 18 месяцев - порошкованного в фильтр - пакетах Разработка технологии жидкого экстракта травы стальника полевого и его стандартизация Наиболее распространенным видом суммарных фитопрепаратов, выпускаемых отечественными фармацевтическими фабриками, являются настойки и жидкие экстракты

Используемые на фармацевтических фабриках в производстве жидких экстрактов технологии ускоренной дробной мацерации и реперколяции имеют низкую эффективность (40-70% по выходу БАВ) и большую продолжительность по времени получения водно - спиртовых извлечений В этой связи представлялось целесооб разным рассмотреть в сравнительной оценке с традиционными способами возможность получения жидкого экстракта стальника современным методом экстрагирова ния сырья - вакуум-фильтрационным Данный метод разработан в ГНЦЛС и основан на принципах растворения и смыва веществ с высокоразвитой поверхности тон коизмельченного растительного материала в динамически неравновесных условиях Он позволяет резко сократить время экстракции, повысить выход действующих веществ до 90% - 97%, получить высококонцентрированные извлечения и заменить батарею из 3-х диффузоров на один экстрактор

Известно, что стадия предэкстракционной подготовки сырья во многом определяет весь последующий процесс производства фитопрепаратов Наиболее подходящим способом измельчения сырья для вакуум - фильтрационного экстрагирования является его вальцевание по принципу раздавливания и одновременного истирания, что позволяет получать тонкий помол материала (размер частиц до 1,0 мм) Для подготовки сырья в случае традиционных способов экстрагирования на фабри ка\ применяются измельчители, работа которых основана на его пзрезывании (до 5,0-7,0 мм) При сравнении этих двух способов подготовки сырья оказалось, что в случае диспершрования сырья на двухвалковом измельчителе увеличивается сум марная поверхность частиц (в 8 раз), значение насыпной массы (в 6 раз), повышаемся сыпучесть сырья (в 22 раза)

Дальнейшие исследования были направлены на выбор оптимального экстра-гента для получения фитопрепаратов вакуум — фильтрационным способом из тртвы стальника С этой целью изучался фитохимический состав 40%, 50%, 60% и /0% водно - спиртовых извлечений (ВСИ) Результаты хромато1 рафического анапи<а полученных извлечений показали, что 70% ВСИ наиболее богато фенольными соединениями Представленные на рисунке 2 диаграммы по количественному составу изофлавоноидов, флавоноидов и фенолкарбоновых кислот 40-70% ВСИ, получен

ные в идентичных условиях, свидетельствуют о том, что 70% спирт этиловый в ряду исследованных водно - спиртовых извлечений является наиболее подходящим экст-рагентом по отношению к фенольным соединениям.

40 50 60 70

концентрация спирта этилового, %

□ изофлааоноиды Шфяааоноиды Ш фенолкарбоновые кислоты

Рисунок 2 - Содержание шофла коноидов, флавоноидов к фенолкарбоновых кислот в водно-спиртовых извлечениях травы стальника

Фармакологический скрининг свидетельствует о том, что наибольшая желчегонная активность характерна для 50-70% водно — спиртовых извлечений (таблица

.3).

Таблица 3 - Желчегонная, анальгетическаи активности и влияние на тонус тонкого кишечника крыс водно-спиртовых извлечений из травы стальника

Иссле- Желчегонная актив- Аналыетическая акгивностъ Влияние ВСИ на тонус тонко-

дуемый объект ность го кишечника

объем Д% к Сила тока, вызвавшая лока- скорость дви- Д% относи-

желчи, мл контро- лизацию болевой реакции у жения угля ак- тельно кон-

лю крыс, А тивированно- троля

исход через час после вве-

дения

Контроль ] ,2±0,22 19,3±1,2 20,1±1,4 121,5±6,2

70% ВСИ 2,4±0,20х 108,3 20,3±1,3 28,9±0,9 152,5±4,4Х 25,5

60% ВСИ 2,5±0,20х 100,0 19,2±0,9 21,3±1,1 140,2±6,2 15,4

I 50% ВСИ ¡>40% вей 2,4±0,40х 100,0 20,1 ±0,8 23,8±1,2 127,5±9,1 4,5

2,1 ±0,20" 75,0 19,8±1,3 29,2±1,1 125,4±5,5 3,2

Примечание - х - изменения достоверны по отношению к контролю, р<0,05

Что касается слабительного действия, то в этом случае 70% водно-спиртовое извлечение из гравы стальника повышало тонус и перистальтику кишечника сильнее, чем 40%, 50%, 60% ВСИ (таблица 3) Сопоставление данных фитохимического анализа фенольных соединений, а также проведенных фармакологических исследований позволили сделать вывод, что в качестве экстрагента для получения суммар ных фитопрепаратов из травы стальника лучше всего использовать 70% спирт этиловый

Для смоделированного в лабораторных условиях процесса вакуум - фильтрационного экстрагирования травы стальника были выбраны оптимальные условия его проведения и изучен переход суммы БАВ и групп действующих веществ в 70% водно-спиртовое извлечение Для этого измельченную траву стальника равномерно загружали в вакуум - фильтрационный экстрактор, затем пропускали сквозь сырье 70% спирт этиловый, постоянно сохраняя «зеркало» эксгра1еша и осуществляя с^ир извлечения Самотеком получали первые три слива экстракт а, а затем экстрагиров', ние вели с подключением вакуума для преодоления гидросопротивления набухл ¡о щею сырья С одной загрузки сырья массой 100,0 г последовательно получали в равных условиях пять отдельных сливов по 100 мл, в каждом из коюрых определи ли «сухой остаток» и содержание изофлавоноидов, флавоноидов и фенолкарбоно-вых кислот (таблица 4)

Таблица 4 - Содержание суммы БАВ и групп действующих веществ в гливьх, полученных вакуум - фильтрационным способом экстрагирования трачы стальника полевого

№ Содержание, %

слива «сух01 о остатка» юофлавоиоидов флавоноидов фенолкарбоновых кислот

1 15,62±0,42 1,18*0,027, е-=2,29% 0,57±0,012,е=2,11% 1,65*0,041,6-2 48%

2 8,09±0,24 0,43*0,010, 6=2,32% 0,22*0,005, е=2,27% 0,95*0,025, с=?,63%

3 2,12±0,0б 0,0810,002, е=2,50% 0,05 t0.no 12, 6=2,40% 0,51*0,014, е=2, /5%

4 1,06*0,03 0,05*0,0014, 8-2,80% 0,ОНО,0003, е=3,0% 0,30*0,009, е-3,0%

5 0,67*0,02 0,02*0,0008, е=4 0% 0,001*0,00004, е=4,0% 0,16*0,005,6=3,13%

На основании полученных результатов была рассчитана эффективность извлечения суммы БАВ и действующих веществ по пяти поочередно получаемым спи-

вам в процессе вакуум - фильтрационного экстрагирования травы стальника (рисунок 3). Результаты изучения динамики экстракции выявили характерную особенность экстракционного поведения флавоноидов и изофлавоноидов травы стальника полевого при использовании способа вакуум - фильтрации и 70% спирта этилового. Данная особенность заключалась в максимальном переходе флавоноидов и изофлавоноидов из сырья в первые два слива (1:2) в отличие от фенолкарбоновых кислот, дубильных веществ, органических кислот и сапонинов. Учитывая это, а также недостаточность истощения сырья одним сливом по основным БАВ, было решено принять оптимальным соотношение «сырье - готовый продукт» 1:2 в производстве жидкого экстракта. В этом случае эффективность извлечения суммы БАВ составила 85,7%, а действующих веществ - 71,5%.

Щ сумма БАВ

□ мзофлавокоиды

0 флавоноиды

П фенолкарбоновые

кислоты 18 дубильные вещества

□ органические кислоты

□ сапонины

2 з

номер слива

Рисунок 3— Эффективность извлечении суммы и отдельных групп биологически активных веществ вакуум - фильтрационным экстрагированием травы стальника по пяти поочередно получаемым сливам (1:1)

По предложенной технологии травы стальника был получен жидкий экстракт и проведен его сравнительный фитохимический анализ с фитопрепаратами, приготовленными по традиционно применяемыми на фармацевтических фабриках репер-коляцией и ускоренной дробной мацерацией. Анализ представленных в таблице 5

усредненных величин говорит о том, что применение вакуум — фильтрационного экстрагирования позволило добиться значительного увеличения эффективности экстракционного процесса по сравнению с традиционными методами (в среднем в 2 раза) как в целом по сумме БАВ, так и по отдельным группам действующих веществ Более того, доля изофлавоноидов, флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в составе всех проэксграгированных БАВ, содержащихся в жидком экстракте, возрастала в среднем в 1,4 раза

Таблица 5 — Содержание биологически активных веществ в жидком экстракте травы стальника, полученном различными методами экстрагирования

Способ получения жидкого экс трак га |

Вакуум - Реперколя- Ускоренная |

Показатель фильтрационное ция дробная

экстрагирование с закончен- мацерацич

ным циклом

Сухой остаток, % 11,98±0,420 3,88+0,150 3,67+0,130

Содержание изофлавоноидов, % 0,59+0,018 0,25±0,006 0,23^0,007

Содержание флавоноидов, % 0,29±0,007 0,10+0,003 0,09+0,002 !

Содержание фенолкарбоновых 0,88±0,022 0,23+0,005 0,21+0,005

кислот, %

Эффективность извлечения

(% от содержания в сырье)

- суммы БАВ 85,70 48,68 45,67

- изофлавоноидов 65,56 27,78 25,56

- флавоноидов 64,44 22,22 20,00

- фенолкарбоновых кислот 44,01 11,50 10,50

С целью нормирования качества было проанализировано шесть серий жидкого экстракта, полученных по разработанной технологии На основании резулыатов этого исследования предложено нормировать содержание «сухого остат ка» не мене 10%, в том числе изофлавоноидов — не менее 0,50%, флавоноидов — не менее 0,25 %,

17

фенолкарбоновых кислот - не менее 0,85% Срок хранения в прохладном и защищенном от света месте жидкого экстракта во флаконах из темного стекла (по 25 мл) составил 21ода

Разработка технологии сухого экстракта и его капсулироваиной формы

В целях получения более очищенного, чем жидкий экстракт, суммарного фитопрепарата и создания на его основе удобной для применения лекарственной формы мы сочли целесообразным разработать сухой экстракт из травы стальника

При разработке технологии сухого экстракта принимали во внимание данные, полученные при исследовании выбора экстрагента, способов подготовки и экстрагирования сырья, эффективности извлечения БАВ из травы стальника по сливам Учитывая, чго объем экстрагента в технологии сухого экстракта не ограничивается одним или двумя сливами, как в случае жидкого экстракта, была рассмотрена возможность повышения истощения сырья по сумме БАВ и группе фенольных соединений Как показали исследования, пятью сливами (1 1) достигается истощение сырья по экстрактивным веществам на 93,3% Степень извлеченное™ изофлавоноидов, флавоноидов и фенолкарбоновых кислот при этом достигает соответственно 96,7%, 92,5%, 90,4% Для очистки водно-спиртового извлечения от хлорофиллов и других липофильных веществ использовали прием частичного его концентрирования (до 1/3 от первоначального объема) и выдерживания в прохладном месте В результате комплексных исследований была предложена оптимальная технология сухого экстракта, предусматривающая получение водно-спиртового извлечения (по тому же принципу, что и жидкий экстракт, но с коэффициентом съема готовой продукции -Н концентрированию и очистке его от сопутствующих липофильных веществ, сгущению отфильтрованного концентрата на вакуум-роторном испарителе и высушиванию в вакуум - сушильном шкафу с последующим измельчением и просеиванием продукта Выход экстракта, содержащего около 25% суммы флавоноидов, изофлавоноидов и фенолкарбоновых кислот, из воздушно сухого сырья составил в среднем 22,5%. Сухой экстракт из травы стальника представлял собой гигроскопичный порошок желто-коричневого цвета Технологическая схема производства сухого экс-гра/сга травы стальника приведена на рисунке 4

ВР1.1

Санитарная обработка помещения и оборудования

ВР.1.2

Подготовка персонала

ВР.2 1

Приготовление 70% этанола

ВР.2 2 Измельчение и просеивание сырья

ВР.2.3 Подготовка стеклотары, упаковочного и маркировочного материала

ТП.3.1 Экстра1 ирование сырья 70% этанолом

ТП.3 2 Концентрирование, отстаивание, фильтрация, сгущение извлечения

ТП.ЗЗ Сушка, измельчение, просеивание экстракта

ТП 3 4 Регенерация этилового спирта

УМО 4 1 Фасовка экстракта в банки, укупоривание и маркировка

УМО 42 Размещение банок с экстрактом в г р\шювую тару, маркировка

ВР.1 Кх, Км, Санитарная подготовка производства и персонала

ВР.2 Кх, Кт Подготовка сырья и вспомогательного материала

Измельченное сырье и 70% этанол на ТП 3 1

N

Потери

1

таз Кх, Кт Получение сухого экстракта стальника

Ч

УМО 4 Кх,Км, Кт Упаковка, маркировка сухого экстракта стальника

Спиртовые отгоны на ВР 2 1

Сухой эк< тракт на УМО 4

Потери

Отходы в о г ва.-1

И

Потери

I отовыи продук;

На склад гоювой продукции

р^дук;

Каран Iинное хранение

Рисунок 4 - Технологическая схема производства сухого экстракта гравы стальника полевого

Для исследования фотохимического состава и нормирования качества из различных образцов травы стальника было наработано пять серий сухою экстракта травы стальника по предложенной технологической схеме

Среднее содержание флавоноидов составило 3,42%, изофлавоноидов - 7,18%, фенолкарбоновых кислот - 14,55%, дубильных веществ — 16,89%, сапонинов -19

6,14%, органических кислот - 12,86%, макроэлементов - около 8%, микроэлементов --0,013%

В качестве основных показателей качества сухого экстракта травы стальника предложены следующие числовые характеристики изофлавоиоидов не менее 7,0%, флавоноидов не менее 3,0% и фенолкарбоновых кислот не менее 14,0% Результаты изучения стабильности сухого экстракта стальника показали, что его свойства не меняются в течение 2-х лет хранения

Учитывая результаты проведенного фармакологического исследования водно-спиртовых извлечений, показавшие наличие у травы стальника сопоставимого с корнем слабительного, желчегонного и обезболивающего действия, представлялось рациональным разработать для сухого экстракта лекарственную форму для перо-рального приема с дозировкой в 0,5 г один раз в суши Исходя из этого, а также принимая во внимание наличие гигроскопичных свойств у порошка сухого экстракта, мы выбрали для не1 о капсулированную форму

Для придания экстракту стальника необходимых технологических свойств для капсулирования были апробированы различные вспомогательные ингредиенты сахар молочный, микрокристаллическая целлюлоза, кальция дигидрофосфат, магния сгеарат, стеариновая кислота, тальк и аэросил С целью выбора рационального состава содержимого капсулы изучали основные технологические и физико-химические критерии капсулированных порошковых масс сыпучесть, гигроскопичность, содержание влаги, насыпная масса и другие В результате анализа их технологических и физико-химических показателей была выбрана оптимальная смесь, состоящая из сухого экстракта стальника полевого (0,500г), сахара молочного (0,080г) и талька (0,006г) Исходя из насыпной массы порошка, наиболее соответствующим является размер твердой капсулы — «0» Далее проводили стандартизацию капсул с сухим экстрактом Оценка качества твердых капсул, наработанных в лабораторных условиях способом «наполнения вдавливанием», проводилась по предусмотренным ОСТ 91500 05 001 00 показателям (таблица 6)

Таблица 6-Показатели и нормы качества капсул с сухим экстрактом стальника

Показатели Нормы качества

Описание Капсулы желтого цвета Содержимое капсул - порошок желто-коричневого цвета

Подлинность Спектр поглощения в диапазоне длин волн от 220 им до 350 нм имеет три максимума поглощения при длинах волн 260±2 нм, 300*2 нм, 325*2 нм На хрома гограмме должно появиться пятно малиново! о цвета со значением Яг 0,78*0,02 (олеаяоловая кислота) Образование зеленовато-желтого окрашивания при добавлении алюминия хлорида (флавоноиды) Голубая флюоресценция (изофлавоноиды)

Средняя масса содержимого капсул и однородность по массе В соо га с ГФ XI изд, вып 2, стр 143

Растворение В соотв с ГФ XI изд, вып 2, стр 159

Содержание флавоноидов Не менее 0,015 г

Содержание изофлавоноидов Не менее 0,034 г

Содержание фенолкарбоновых кислот Не менее 0,068 г

Содержание талька Не более 1,0%

Микробиологическая чистота Категория ЗБ

Результаты изучения стабильности твердых капсул с сухим экстрактом сталь-

ника в процессе хранения в прохладном и защищенном от света месте, помещенных в стеклянные банки из светозащитного стекла вместимостью 50 мл, показали, что основные показатели их качества оставались неизменные в течение срока наблюдения - 1 года

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1 Осуществлен химический анализ полисахаридов травы стальника, позволивший установить наличие водорастворимых полисахаридов до 6,6%, пектине вых веществ - 8,3%, гемицеллюлозы А - 2,1% и В - 3 9%, дубильных веществ -5,1%, органических кислот - 2,1%, флавоноидов - 1,0%, изофлавоноидов -1,9%, фенолкарбоновых кислот - 4,3%, сапонинов - 1,8%, макро- и микроэлементов - 7,3%

2 Разработана методика количественною определения изофлавоноидов, фланг,-ноидов и фенолкарбоновых кислот в траве стальника полевого с исшмизовл-иием прямой и дифференциальной спектрофотометрии С помощью этой ме тодики изучена динамика накопления фенольных соединений и установлено, что их максимальное содержание соответствует фазе - конец цветения - начало плодоношения На этой основе определены сроки сбора сырья

3 На основании морфолого-анатомического исследования листьев и их черешков, цветков, стеблей травы стальника выявлены характерные признаки, позволяющие осуществлять диагностику сырья (извилистые клетки эпидермиса, наличие на всех частях растения многоклеточных простых волосков и многоклеточных железистых волосков, анизоцитный и аномоцитный тип устьичного аппарата), а также определены числовые показатели- содержание изофлавоноидов не менее 1,8%, флавоноидов не менее 0,9% и фенолкарбоновых кислот не менее 4,0%

4 Установлен оптимальный экстрагент - 70% спирт этиловый для получения экстракционных препаратов из травы стальника полевого Экстракция биологически активных веществ данным экстрагентом с использованием вакуум — фильтрационного метода обеспечивает максимальный переход изофлавонои-дов и флавоноидов из сырья в первые два слива

5 Разработана технология жидкого экстракта (1 2) с использованием вакуум -фильтрационного способа, позволяющая извлечь из травы стальника около 85% суммы биологически активных веществ, что значительно эффективнее по сравнению с используемыми методами на фармацевтических фабриках — ускоренной дробной мацерации или реперколяции

6 Предложена технология сухого экстракта травы стальника и проведено нормирование его качества с учетом установленной общей суммы действующих веществ - изофлавоноидов, флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в пределах 25%, органических кислот- 12%, дубильных веществ-17%, тритерпено-вых сапониггов - 6%, макро — и микроэлементов - 8%

7 Разработан состав, технология и нормы качества твердых капсул сухого экстракта из травы стальника полевого Содержание флавоноидов в них должно быть не менее 0,015 г, изофлавоноидов не менее 0,034 г, фенолкарбоновых кислот не менее 0,068 г

8. Фармакологическим скринингом доказано слабительное, желчегонное и обезболивающее действие экстрактов травы стальника полевого, что создает пред-

посылки для ее использования в качестве дополнительного сырьевого источника лекарственных средств

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Целесообразность и возможность использования а медицине травы стальника полевого // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения (8 междунар съезд, Миккели, Финляндия) материалы - СПб ВВМ, 2004 - С.424-426 (соавт А М Сампиев)

2 Современное состояние и перспективы дальнейшего исследования стальника полевого Ononis arvensis L (обзор) // Кубанский науч мед вестн - 2005 - № 3-4 (76-77) - С 38-49 (соавт А М Сампиев)

3 Исследования по выбору оптимального экстрагента для получения жидкою экстракта травы стальника полевого // Разработка, исследование и маркегиш новой фармацевтической продукции сб науч тр - Пятигорск, 2005 - Вьш 60 - С 96-97 (соавт А М Сампиев)

4 Некоторые концептуальные подходы к оптимизации производства и исноль зования растительною сырья на фармацевтических фабриках П Актуальш питания фармацевтично! та медично1 науки та практики збфник наукових см тей -Запоргжжя видавництво ЗДМУ, 2006 - Випуск XV, том 2 - С 391 -394 (соавт А М Сампиев, М Р Хочава, Е Б Никифорова, М М Дзаурова, А И Шевченко, Н С Сергеев)

5 Микроскопическое изучение травы стальника полевою // Фармация - 2006-№2 - С 5-7 (соавт А М Сампиев)

6 Сравнительное изучение фармакологической активности экстрактов из травы и настойки из корня стальника полевого // Кубанский науч мед вестн. - 2006 -№12(93) - С 102-106 (соавт AM Сампиев)

7 Исследование полисахаридов травы стальника полевого // И*в вузов Сев Кав регион Естеств науки - 2007 - №4 - С.63-66 (соавт А М Сампиев)

ДАВИТАВЯН НАИРА АЛЬБЕРТОВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ И НОРМИРОВАНИЕ КАЧЕСТВА ЖИДКОГО И СУХОГО ЭКСТРАКТОВ ТРАВЫ СТАЛЬНИКА ПОЛЕВОГО

15.00.01 -технология лекарств к организация фармацевтического дела

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДА ГА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пяти1 орская государственная фармацевтическая академия Федерального а1 ентства по здравоохранению и социальному развитию» (357532, г Пятигорск, пр Калинина, 11)

Подписано к печати //_2007 г формат 60x84 1/16

Бумага книжно-журнальная Печать ротапринт пая Уел печ л 1,0 Тираж 100 экз Закат № 9££ Отпечатано ООО «Фирма ТАМЗИ», г Краснодар, ул Пашковская, 79 Тел 255-73-16

/ - д

ДАВИТАВЯН НАИРА АЛЬБЕРТОВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ И НОРМИРОВАНИЕ КАЧЕСТВА ЖИДКОГО И СУХОГО ЭКСТРАКТОВ ТРАВЫ СТАЛЬНИКА ПОЛЕВОГО

15.00.01 -технология лекарств и организация фармацевтического дела

АВТОРЕФЕРАТ

Д ИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (357532, г. Пятигорск, пр Калинина, 11)

Подписано к печати ^ 2007 г Формат 60x84 1/16 Бумага книжно-журнальная Печать рогапринтная Уел печ л 1,0 Тираж 100 экз Заказ № 9£5

Отпечатано ООО «Фирма ТАМЗИ», г Краснодар, ул Пашковская, 79 Тел 255-73-16

Актуальность темы. В настоящее время по ассортиментному составу группа слабительных фитосредств в своем большинстве представлена лекарственными препаратами, содержащими антрагликозиды. Однако, использование последних ограничено по ряду причин, к числу которых относятся быстрое к ним привыкание, развитие кишечной непроходимости, кровотечения, циститы, геморрой в стадии обострения, беременность, а также раздражающее действие на слизистую кишечника. Более того, в некоторых странах гидроксипроизвод-ные антрахинона запрещены и/или не рекомендованы к применению в связи с их канцерогенными свойствами. В этой связи, становится очевидным, что актуальным является поиск новых сырьевых источников, не содержащих производные антрацена, но являющихся основой для создания лекарственных препаратов слабительного действия.

С этой точки зрения особое место занимает корень стальника и получаемая из него настойка, поскольку они не содержат антрагликозиды и лишены указанных выше противопоказаний. Важно отметить, что корень стальника и настойка из него обладают эффективным противогеморроидальным действием. По мнению ряда авторов, наибольший вклад в фармакологическую активность этих лекарственных препаратов стальника вносят две группы полифенолов -производные флавона и изофлавона. В народной медицине наряду с корнем используется и трава стальника. Химический состав надземной части растения практически не отличается от корня.

Исходя из этого, представляется целесообразным исследование травы стальника полевого как дополнительного источника для получения слабительных лекарственных средств. К тому же, такой подход очевиден с точки зрения комплексного использования лекарственного растительного сырья и разработки ресурсосберегающих технологий.

Все изложенное выше свидетельствует об актуальности исследований по фармакогностическому изучению травы стальника, разработке технологии фитопрепаратов на ее основе и обоснованию применения в медицинской практике.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка технологии и нормирование качества жидкого и сухого экстрактов травы стальника полевого.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести фармакогностическое изучение и стандартизировать траву стальника;

- разработать технологию жидкого экстракта травы стальника с учетом фар-макохимических исследований;

- предложить нормы качества для разработанного жидкого экстракта, изучить условия и сроки его хранения;

- разработать технологию и предложить нормы качества для сухого экстракта травы стальника, изучить условия и сроки его хранения;

- обосновать состав, разработать технологию твердых капсул сухого экстракта травы стальника;

- провести стандартизацию разработанных твердых капсул сухого экстракта травы стальника, изучить условия и сроки их хранения.

Научная новизна. Впервые изучена динамика накопления флавоноидов, изофлавоноидов, фенолкарбоновых кислот по фазам вегетации травы стальника полевого и установлено, что максимальное содержание этих соединений наблюдалось в конце цветения — начале плодоношения. Для селективного количественного определения флавоноидов, изофлавоноидов и фенолкарбоновых кислот в траве стальника полевого использованы прямая и дифференциальная спектрофотометрия. Установлено, что в траве стальника полевого содержание водорастворимых полисахаридов составляет в среднем 6,6%, пектиновых веществ — 8,3%, гемицеллюлозы А - 2,1%, гемицеллюлозы В - 3,9%, органических кислот — 2,1%. Из макро- и микроэлементов преобладающими являются калий и железо. На основе анатомо-морфологических исследований травы стальника уточнены диагностические признаки сырья. Осуществлены исследования по стандартизации и предложены нормы качества травы стальника полевого.

С учетом проведенных химических и фармакологических исследований обоснован выбор экстрагента для получения жидкого и сухого экстрактов. Выявлена зависимость количественного содержания флавоноидов и изофлаво-ноидов в извлечениях из травы стальника полевого от способа экстракции. Установлено, что максимальное их содержание наблюдалось в первых двух сливах, получаемых вакуум-фильтрационным методом.

Фармакологический скрининг полученных извлечений выявил выраженное слабительное и желчегонное действие, превосходящее действие настойки из корня, а также наличие умеренного обезболивающего свойства. Наибольшая активность характерна для извлечения с использованием 70% спирта этилового.

Разработана технология, обоснованы и нормированы показатели качества жидкого и сухого экстрактов, определены условия и сроки хранения. Предложены состав и технология твердых капсул сухого экстракта травы стальника полевого, проведена их стандартизация, установлены условия и сроки хранения.

Практическая значимость результатов исследования. Полученные уточненные и расширенные сведения о фитохимическом составе травы стальника свидетельствуют о целесообразности ее использования в качестве дополнительного источника новых фитопрепаратов слабительного и желчегонного действия.

Разработанная методика количественной оценки присутствующих совместно в траве стальника и ее фитопрепаратах флавоноидов, изофлавоноидов и фенолкарбоновых кислот позволяет в одной пробе и раздельно определять содержание этих трех групп БАВ.

Установленные в ходе проведенного морфолого-анатомического исследования характерные диагностические признаки травы стальника позволяют идентифицировать это сырье в измельченном виде.

Установленное слабительное и желчегонное действие наряду с умеренным обезболивающим эффектом для извлечения из травы стальника является обоснованием для разработки на его основе суммарных фитопрепаратов.

Предложенная технология жидкого экстракта (1:2) с использованием вакуум-фильтрационного способа позволяет извлечь из травы стальника около 85% суммы БАВ, что гарантирует 2,5% концентрацию действующих веществ в целевом продукте. Разработанная технология имеет несомненные преимущества по сравнению с используемыми на фармацевтических фабриках ускоренной дробной мацерации и реперколяции, поскольку повышает выход БАВ в среднем на 40% и 37%.

Для переработки травы стальника в условиях крупносерийного фармацевтического производства в более прогрессивный вид суммарного фитопрепарата предложена технология сухого экстракта с 25% содержанием действующих веществ. Разработан состав и технология капсул с сухим экстрактом и предложена методика их стандартизации.

Степень внедрения. По результатам исследований разработано два проекта ФСП: «Трава стальника» (акт внедрения ООО «Кубаньлектравы» от 05.12.06 г; заключение по экспертизе проекта ФСП от КГУ «Центр по контролю качества и сертификации лекарственных средств Краснодарского края» от 01.02.2007 г); и «Жидкий экстракт стальника» (акт внедрения ЗАО «Роскар-фарм» от 18.12.06 г). Разработанная методика количественного определения фла-воноидов, изофлавоноидов и фенолкарбоновых кислот в траве стальника внедрена в НИР Северо-Кавказской ЗОС РАСХН (акт внедрения от 20.12.06 г). Методики оценки качества травы стальника полевого и жидкого экстракта апробированы в отделах контроля качества ООО «Кубаньлектравы» (акт от 22.11.06 г) и ЗАО «Роскарфарм» (акт от 11.12.06 г). Технология производства жидкого экстракта травы стальника апробирована в условиях ЗАО «Роскарфарм» (акт апробации 07.12.06 г).

Материалы диссертационного исследования внедрены в учебный процесс кафедры фармации ГОУ ВПО КГМУ Росздрава (акт внедрения от 28.09.06 г).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно — исследовательских работ ГОУ ВПО КГМУ Росздрава (№ гос. регистрации 0120.0500289).

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты фитохимического, морфолого-анатомического исследования и стандартизации травы стальника полевого;

- данные по выбору оптимального экстрагента для получения фитопрепаратов из травы стальника полевого;

- итоги исследования по разработке технологии жидкого и сухого экстрактов, изучению их химического состава и установлению норм их качества;

- обоснование и результаты исследования по разработке состава, технологии и норм качества твердых капсул сухого экстракта травы стальника полевого.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертационной работы доложены на II, IV региональной научно-практической конференции молодых ученых и студентов Краснодарского края «Медицинская наука и здравоохранение» (г. Анапа, 2004, 2006гг); на 60-й региональной научной конференции по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г. Пятигорск, 2005г); Всеукраинской научно-практической конференции с международным участием «Современные достижения фармацевтической науки и практики» (г. Запорожье, 2006г).

По теме диссертации опубликовано 7 научных статей.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 173 страницах машинописного текста; содержит 51 таблицу, иллюстрирована 21 рисунком и изложена в пяти главах. Список литературы включает 200 библиографических источников, из них 35 иностранных авторов.

В первой главе (обзор литературы) приведены сведения, отражающие современное состояние исследований в области химии, фармакологии и применения стальника полевого. Дается информация об ассортименте слабительных средств растительного происхождения. Во второй главе охарактеризованы объекты, а также перечислены материалы и методики исследования. В третьей главе представлены результаты фармакогностического изучения травы стальника полевого. Четвертая глава посвящена разработке технологии и стандартизации жидкого экстракта травы стальника полевого. Пятая глава включает исследования по разработке технологии и стандартизации сухого экстракта и его капсу-лированной формы.

Выражаем искреннюю благодарность директору ГУП «Институт аллергии и астмы» профессору P.A. Ханферяну за организацию и проведение фармакологических и биологических исследований (отчет по их результатам приложен к диссертационной работе).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Осуществлен химический анализ полисахаридов травы стальника, позволивший установить наличие водорастворимых полисахаридов до 6,6%, пектиновых веществ - 8,3%, гемицеллюлозы А - 2,1% и В - 3,9%, дубильных веществ - 5,1%, органических кислот - 2,1%, флавоноидов - 1,0%, изофлавоноидов - 1,9%, фенолкарбоновых кислот - 4,3%, сапонинов -1,8%, макро- и микроэлементов - 7,3%.

2. Разработана методика количественного определения изофлавоноидов, флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в траве стальника полевого с использованием прямой и дифференциальной спектрофотометрии. С помощью этой методики изучена динамика накопления фенольных соединений и установлено, что их максимальное содержание соответствует фазе — конец цветения - начало плодоношения. На этой основе определены сроки сбора сырья.

3. На основании морфолого-анатомического исследования листьев и их черешков, цветков, стеблей травы стальника выявлены характерные признаки, позволяющие осуществлять диагностику сырья (извилистые клетки эпидермиса, наличие на всех частях растения многоклеточных простых волосков и многоклеточных железистых волосков, анизоцитный и аномоцитный тип устьичного аппарата), а также определены числовые показатели: содержание изофлавоноидов не менее 1,8%, флавоноидов не менее 0,9% и фенолкарбоновых кислот не менее 4,0%.

4. Установлен оптимальный экстрагент - 70% спирт этиловый для получения экстракционных препаратов из травы стальника полевого. Экстракция биологически активных веществ данным экстрагентом с использованием вакуум - фильтрационного метода обеспечивает максимальный переход изофлавоноидов и флавоноидов из сырья в первые два слива.

5. Разработана технология жидкого экстракта (1:2) с использованием вакуум - фильтрационного способа, позволяющая извлечь из травы стальника около 85% суммы биологически активных веществ, что значительно эффективнее по сравнению с используемыми методами на фармацевтических фабриках — ускоренной дробной мацерации или реперколяции.

6. Предложена технология сухого экстракта травы стальника и проведено нормирование его качества с учетом установленной общей суммы действующих веществ — изофлавоноидов, флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в пределах 25%, органических кислот- 12%, дубильных веществ-17%, тритерпеновых сапонинов - 6%, макро — и микроэлементов - 8%.

7. Разработан состав, технология и нормы качества твердых капсул сухого экстракта из травы стальника полевого. Содержание флавоноидов в них должно быть не менее 0,015 г, изофлавоноидов не менее 0,034 г, фенолкарбоновых кислот не менее 0,068 г.

8. Фармакологическим скринингом доказано слабительное, желчегонное и обезболивающее действие экстрактов травы стальника полевого, что создает предпосылки для ее использования в качестве дополнительного сырьевого источника лекарственных средств.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ

Анализ научных данных по исследованию стальника полевого показал, что основными действующими веществами этого растения являются изофлавоноиды, флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты. Наряду с этим было выявлено, что качественный их состав достаточно и подробно изучен, чего нельзя сказать о количественном содержании и фазе их максимального накопления в траве стальника. Кроме того, не были исследованы присутствующие в траве стальника полевого полигликаны, органические кислоты, сапонины. Также не обнаружено полноценных данных о морфолого — анатомическом строении надземной части этого растения. При изучении ассортиментного состава слабительных средств установлено, что данная группа фитосредств представлена в подавляющем большинстве антрагликозидсодержащими препаратами. Однако, ограничивают использование последних быстрое к ним привыкание и ряд противопоказаний: кишечная непроходимость, геморрой в стадии обострения, беременность, а также серьезные побочные эффекты, в числе которых - раздражающее действие на слизистую кишечника, иногда приводящее к язвенному колиту, проктиту, тяжелым поражениям печени. Особое место в группе всех слабительных фитосредств занимает корень стальника и получаемая из него настойка, поскольку они не содержат антрагликозиды, лишены указанных выше противопоказаний и представляющих собой угрозу для здоровья побочных эффектов. Кроме того, они отличаются от аналогов по группе применением при геморрое и в этом качестве пока не имеют альтернативы. Вместе с тем, издревле в народной медицине наряду с корнем используется трава стальника. Состав ее биологически активных веществ (БАВ) ни чем не уступает, а в чем - то даже превосходит корень, в том числе - по составу фенольных соединений. Исходя из этого, представляется целесообразным исследование травы стальника полевого как источника слабительных лекарственных средств и очевидного аналога корня. Все изложенное выше позволяет считать актуальным исследование, посвященное фармакогностическому изучению травы стальника, разработке технологии ее фитопрепаратов, нормированию их качества и выявлению перспектив применения в медицинской практике.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ

ЧАСТЬ

ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Объекты и материалы исследований

Объектом исследования явилась трава стальника полевого, произрастающая в Краснодарском крае (ст. Васюринская, ст. Динская, пос. Чибий), Ставропольском крае (г. Пятигорск), Ростовской области (г. Ростов). Сырье заготавливалось в июне-августе 2002 - 2006 гг. в период бутонизации, цветения, цветения и плодоношения надземной части. Для отдельных сравнительных исследований использовался корень стальника полевого промышленной заготовки (ГФ СССР XI изд., стр.350), а также собранный в указанных выше местах произрастания осенью - с конца цветения до полного отмирания надземных частей и приведенный в стандартное состояние.

В экспериментальной работе использовали весы аналитические лабораторные 2 класса по ГОСТ 24108-80 с пределом взвешивания 200,0 г; термостат по ГОСТ 25336-82; сушильный шкаф, роторный испаритель ИР-1М2, валки лабораторные типа ПД 320-160/160, фильтрационные установки. Электронные спектры поглощения измеряли на спектрофотометре СФ-56 в кварцевых кюветах с толщиной рабочего слоя 1 см, атомно-адсорбционном-эмиссионном спектрофотометре; электрофореграммы снимали на приборе «Капель 105», минерализацию проводили в приборе СВЧ-минерализатор Минотавр -1, приготовленные микропрепараты изучали с помощью микроскопа серии LW 200 Т.

В данной работе использовали лекарственные и вспомогательные вещества, отвечающие требованиями нормативной документации (ФС, ГОСТ, ТУ).

2.2 Методы и методики исследований

2.2.1 Определение влажности сырья проводили по методике ГФ СССР XI изд., вып. 1, стр. 285

Определение экстрактивных веществ проводили по методике ГФ СССР XI изд., вып. 1, стр. 295

Определение общей золы и золы, нерастворимой в хлористоводородной кислоте проводили по методике ГФ СССР XI изд., вып. 2, стр. 24

Определение дубильных веществ проводили по методике ГФ СССР XI изд., вып. 1, стр. 286

Определение органических кислот проводили по методике ГФ СССР XI изд., вып. 2, стр. 296

Определение изофлавоноидов проводили по методике ГФ СССР XI изд., вып. 2, стр. 350

Микроскопический анализ лекарственного растительного сырья проводили по методике ГФ СССР XI изд., вып. 1, стр. 277

Статистическую обработку результатов проводили в соответствии с ГФ СССР XI изд. (далее по тексту ГФ XI изд.), вып. 1, стр. 199.

2.2.2 Определение сапонинов

Методика определения тритерпеноидов заключалась в следующем [124, 135,34,40]:

Около 1,0 г (точная навеска) измельченного до 1,0 мм сырья экстрагировали 70% спиртом в колбе с обратным холодильником на кипящей, водяной бане порциями по 20 мл и 2 раза по 15 мл в течение 1 часа в каждом случае. Полученные извлечения фильтровали в круглодонную колбу, фильтрат упаривали под вакуумом до 1/5 первоначального объема (10 мл). Концентрат обезжиривали в делительной воронке 75 мл хлороформа, используя для этой цели 5 ступеней экстракции. Водный слой переносили в ту же круглодонную колбу, аккуратно добавляли смесь, состоящую из 3 мл концентрированной серной кислоты и 12 мл ледяной уксусной кислоты. Содержимое колбы кипятили с обратным холодильником в течение 1,5 часов. После этого, остывший до комнатной температуры гидролизат количественно переносили в ранее использованную делительную воронку, для чего колбу ополаскивали 2 объемами воды по 10 мл. Олеаноловую кислоту из содержимого делительной воронки извлекали хлороформом четырехкратно по 10 мл, ополаскивая им круглодонную колбу. Гидрофильный слой в воронке отбрасывали, а хлороформный промывали водой до нейтрального значения рН (пятикратно по 25 мл). Извлечение фильтровали через плотный бумажный фильтр, предварительно смоченный хлороформом, в мерную колбу вместимостью 50 мл. Делительную воронку ополаскивали 5 мл хлороформа и также фильтровали в колбу. Содержимое в колбе доводили до метки тем же растворителем. Полученный раствор в объеме 1 мл вносили в колбу вместимостью 25 мл, отгоняли под вакуумом растворитель и добавляли 10 мл концентрированной серной кислоты. Раствор олеаноловой кислоты в серной кислоте термостатировали при 70°С в течение 1 часа. Параллельно проводили контрольный опыт. После охлаждения до комнатной температуры определяли оптическую плотность испытуемого раствора в сравнении с концентрированной серной кислотой на спектрофотометре при длине волны 315 нм (максимум поглощения, отмеченный на спектре испытуемого раствора и олеаноловой кислоты, наблюдался при этой длине волны) в кюветах с толщиной слоя 10 мм.

Содержание олеаноловой кислоты в траве стальника полевого рассчитывали по формуле (1):

Р-У1-У2-1М (!)

311-У3-т-(Ю0-\\0 где О —значение оптической плотности исследуемого раствора V] — общий объем хлороформного извлечения, мл Уг — объем концентрированной серной кислоты, мл У3 - объем хлороформного извлечения, взятый на анализ, мл 311 - удельный показатель поглощения олеаноловой кислоты в концентрированной серной кислоте ш — навеска сырья, г

- потеря в массе при высушивании сырья, %

2.2.3 Определение полисахаридов

Сумму водорастворимых полисахаридов, пектиновых веществ и гемицел-люлозу А и В из травы стальника выделяли по приведенной схеме в соответствии с рисунком 1.

Хлороформное извлечение

Спиртовое извлечение

Объединенное водное извлечение

Упаривание, осаждение 96% этанолом, фильтрование

1

Осадок

1 г

Промывка 96% этанолом, сушка г

Сумма водорастворимых полисахаридов

Прибавление ледяной уксус ной кислоты

Осаждение 96% этанолом, промывка осадка 96% этанолом, сушка

Гемицеллю лоза В

Осадок

Исчерпывающая экстракция хлороформом, сушка

Исчерпывающая экстракция 70% спиртом этиловым, сушка

Экстракция горячей водой

Экстракция смесью щавелевой кислоты и окса-лата аммония ние у Упаривание, осаждение 96% этанолом, г фильтрование

Промывка 96% этанолом, сушка

1 г

Рисунок 1- Схема выделения фракций полисахаридов из травы стальника

Измельченное сырье исчерпывающе экстрагировали сначала хлороформом для обезжиривания, а затем 70 % спиртом этиловым с целью удаления пигментных, фенольных и легкоокисляющихся веществ. Шрот высушивали до удаления запаха растворителей и подвергали трехкратной экстракции водой при температуре 90-95°С в течение 1 часа при постоянном перемешивании (соотношение сырья и экстрагента при первой и второй экстракции 1:20, при третьей — 1:10). Объединенное и отфильтрованное извлечение упаривали под вакуумом с помощью роторного испарителя до 1/5 первоначального объема при температуре 45-50°С [138, 139].

Сумму водорастворимых полисахаридов получали осаждением путем добавления четырехкратного по отношению к объему упаренного извлечения 96% спирта этилового; осадок отфильтровывали, многократно промывали спиртом этиловым, затем высушивали при комнатной температуре и взвешивали.

Сумму пектиновых веществ выделяли из шрота сырья. После выделения водорастворимых полисахаридов трехкратно экстрагировали смесью 0,5% растворов щавелевой кислоты и оксалата аммония (1:1) при температуре 90°С в течение 3-х часов (соотношение шрота и экстрагента при первом контакте 1:20, при втором и третьем 1:10). Полученное извлечение концентрировали до 1/5 первоначального объема при температуре 45-50°С с помощью роторного испарителя; к сгущенному извлечению прибавляли трехкратное количество 96% этилового спирта, осадок отделяли фильтрованием, промывали спиртом этиловым, высушивали при комнатной температуре и взвешивали.

Далее проводили выделение гемицеллюлозы А и В. Остаток сырья после выделения пектиновых веществ экстрагировали пятикратным объемом 10% раствора натрия гидроксида при температуре 20°С, перемешивая на магнитной мешалке в течение 12 часов, добавляли к щелочному фильтрату двукратный объем (по отношению к сырью) ледяной уксусной кислоты для осаждения гемицеллюлозы А. В фильтрате (после отделения гемицеллюлозы А) двукратным объемом 96% спирта этилового осаждали гемицеллюлозу В. Раствор декантировали, осадок несколько раз промывали порциями 96% спирта этилового, высушивали в вакуум-сушильном шкафу до постоянной массы и взвешивали.

Для определения мономерного состава полисахаридных комплексов проводили их гидролиз серной кислотой [24]. Навески полисахаридных комплексов (0,05 г) помещали в ампулы емкостью 5-10 мл, прибавляли 2,5 мл раствора серной кислоты (1 моль/л), запаивали ампулы и проводили гидролиз при температуре 100-105°С в течение 6 часов для водорастворимых полисахаридов, в течение 24 часов для пектиновых веществ, 48 часов для гемицеллюлозы А и В. Содержимое ампул переносили в стаканчики, промывали ампулы 5 мл воды, нейтрализовали бария карбонатом по универсальному индикатору до нейтральной реакции. Растворы фильтровали, фильтры промывали водой до объема фильтратов 10 мл. К полученным растворам прибавляли 3 объема 96% этилового спирта, тщательно перемешивали и образовавшиеся осадки отфильтровывали через 1-2 часа. Фильтраты упаривали на кипящей водянойбане до получения объема около 0,5 мл (раствор А). Осадки бариевых солей уроновых кислот снимали с фильтров, растворяли в 2,5 мл воды, прибавляли катионит КУ-2 (1-Г) до рН 3-4 по универсальному индикатору. Растворы фильтровали, упаривали до получения около 0,5 мл раствора (раствор Б).

Растворы А, содержащие нейтральные моносахариды, хроматогра-фировали нисходящим способом в системе: н-бутанол-пиридин-вода (6:4:3) в течение 17-18 часов с образцами нейтральных моносахаридов, а растворы Б, содержащие кислые моносахариды — восходящим способом в системе: этилацетат-уксусная кислота-муравьиная кислота-вода (18:3:1:4) в течение 5-6 часов с образцами гексауроновых кислот на бумаге Хроматограммы высушивали на воздухе 1 час, обрабатывали раствором анилингидрофталата и нагревали в сушильном шкафу при температуре 100-105°С. Через 10-15 минут наблюдали наличие красноватых и красновато-коричневых пятен. По величине и интенсивности окраски проводили сравнительную оценку содержания моносахаров в исследуемых фракциях.

Для количественного определения восстанавливающих Сахаров в составе полисахаридных фракций был использован метод, основанный на их реакции с пикриновой кислотой в щелочной среде [103].

0,05 г (точная навеска) полисахаридного комплекса помещали в ампулу, прибавляли 2,5 мл разведенной соляной кислоты, ампулу запаивали и нагревали при температуре 100±5°С в течение 2 часов, по окончании гидролиза содержимое ампулы переносили в стакан и нейтрализовали по бумаге Конго: сначала 30% раствором гидроксида натрия, затем раствором разведенной соляной кислоты, и наконец 10% раствором гидроксида натрия.

Раствор фильтровали через плотный фильтр, переносили количественно в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводили объем раствора водой до метки (раствор А). В колбу вместимостью 50 мл помещали 1,0 мл 1% раствора пикриновой кислоты, 3,0 мл 20% раствора карбоната натрия и 1 мл раствора А.

Колбу с содержимым погружали в кипящую водяную баню на 10 минут, затем охлаждали до комнатной температуры. Содержимое количественно переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили водой до метки. Измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 460 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали смесь, состоящую из 1,0 мл 1% раствора пикриновой кислоты, 3,0 мл 20% раствора карбоната натрия и 1,0 мл воды, которую нагревали на кипящей водяной бане в течение 10 минут и доводили объем раствора водой до 25 мл. Параллельно проводили определение оптической плотности 1 мл раствора стандартного образца глюкозы.

Содержание восстанавливающих Сахаров в полисахаридном комплексе в % в пересчете на глюкозу вычисляли по формуле (2):

Д-0,0056-10-100

X —--(—)

П0-т-\ где Э] - оптическая плотность испытуемого раствора

- оптическая плотность стандартного раствора глюкозы 0,0056 -концентрация глюкозы в 1 мл раствора стандартного образца, г ш - навеска полисахарида, г

2.2.4 Определение фенольных соединений

Для предварительного обнаружения фенольных соединений в траве стальника полевого использовали следующие качественные реакции: цианиди-новю пробу; реакцию реакция со щелочью; реакция с алюминия хлоридом; реакция с железа (III) хлоридом; реакция Вильсона; реакция с ванилином в кислоте хлороводородной концентрированной.

Пробоподготовку сырья проводили по следующей методике: 3-5 г измельченной травы стальника заливали 30-50 мл 70% спирта этилового в колбе с обратным холодильником и проводили экстракцию на водяной бане в течение 20-30 мин. Извлечение охлаждали, фильтровали через фильтровальную бумагу. Полученный фильтрат наносили на колонку диаметром 1 см, заполненную 1,0 г полиамидного сорбента, промывали 50 мл воды и элюировали фенольные соединения с колонки 70% сиртом этиловым, отбирая фракцию, окрашенную в желтый цвет. Полученный элюат упаривали до Уг объема и использовали для проведения выше указанный качественный реакций [103].

2.2.5 Определение макро- и микроэлементов

Навеску предварительно истолченного исследуемого материала массой 250 мг, помещали в кварцевую колбу, заливали 5 мл концентрированной азотной кислоты, устанавливали на умеренно нагретую плитку, помешивали, не допуская интенсивного вскипания. Для предотвращения разбрызгивания минерали-зационной массы в качестве пробки использовали каплеуловитель от колб Къельдаля. При появлении коричневой окраски минерализата нагревание прекращали, добавляли 1-3 мл азотной кислоты и продолжали нагревание при боле низкой температуре. Минерализация считается законченной, когда жидкость становится прозрачной или с легким желтоватым оттенком. Выпариванием минерализата доводили объем до 0,1-0,2 мл. При этом наблюдали интенсивное образование тяжелых белых паров хлорной кислоты. Остатки минеральных солей смывали в мерные колбы водой очищенной. Объем жидкости доводили до 15 мл [131].

Приготовление стандартных растворов металлов, калибровка: стандартные растворы ионов металлов готовили из ГСО путем его разбавления в воде очищенной или в равной смеси 10% растворов хлорной и азотной кислот. Концентрация ГСО - 1000 мг/л. Максимальная концентрация стандарта - 500 мг/л, минимальная - 0,24 мг/л. Концентрации стандартных растворов приведены в таблице 2.