Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение короставника полевого

На правах рукописи

00500°^'

Денисова Наталья Николаевна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ КОРОСТАВНИКА ПОЛЕВОГО (ЮЧАШТА АИУЕ^К (Ь.) СОиЬТ.)

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

16 МАП 2013

Курск - 2013

005058347

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук Дроздова Ирина Леонидовна

Официальные оппоненты:

Киселева Татьяна Леонидовна - доктор фармацевтических наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры фармакогнозии

Оганесян Эдуард Тониковнч - доктор фармацевтических наук, профессор, Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой органической химии

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «-/7» , 2013 г. в до часов на заседании

диссертационного совета Д 208.039.03 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России.

Автореферат разослан « » (У^флЛЯ 2013 г.

Ученый секретарь /

диссертационного совета ___Пашин Евгений Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последнее время неуклонно возрастает частота использования лечебно-профилактических средств растительного происхождения. Это объясняется тем, что фитопрепараты сочетают в себе широкий спектр биологической активности и относительную безвредность (Анисимова М.М., Куркин В.А., 2010).

Однако из всего видового разнообразия отечественной флоры, используемого исторически в народной медицине (более 10 тысяч видов), в Государственный Реестр лекарственных средств России включено около 350 растений (Киселева Т.Л., Смирнова Ю.А., 2009). Кроме того, антропогенное воздействие на природу приводит к сокращению естественных ресурсов многих дикорастущих лекарственных растений (Белоногова В.Д., 2009). В связи с этим возникает необходимость в расширении сырьевой базы лекарственных растений за счет внедрения в официнапьную медицину новых видов отечественной флоры и комплексного их использования.

Одним из перспективных отечественных сырьевых источников БАВ является короставник полевой (Knautia arvensis (L.) Coult.) семейства Ворсянковые (Dipsacaceae Juss.). Короставник полевой широко распространен во флоре Центральной России (Полуянов A.B., Прудников H.A., 2005), имеет значительную сырьевую базу (что обуславливает экономическую эффективность и целесообразность). Данный вид издавна и широко применяется в народной медицине в качестве противовоспалительного, отхаркивающего, антисептического средства.

Однако в химическом плане состав растения практически не изучен, отсутствуют экспериментальные данные о фармакологической активности, что послужило причиной его исследования.

Таким образом, изучение химического состава и фармакологической активности короставника полевого, разработка показателей качества лекарственного сырья является актуальной проблемой.

Цель работы заключалась в фармакогностическом изучении травы короставника полевого и обосновании возможности его использования в медицинской практике как источника природных БАВ.

Задачи исследования:

1. Провести фитохимический анализ травы короставника полевого.

2. Провести морфолого-анатомические исследования и выявить диагностические признаки сырья.

3. Разработать методики стандартизации сырья и определить нормы содержания БАВ и других числовых показателей.

4. Установить научно обоснованные сроки заготовки сырья.

5. Провести скрининговые фармакологические исследования.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Курского государственного медицинского университета (номер государственной регистрации 01201051084).

Научная новизна. Установлен химический состав основных групп БАВ травы короставника полевого. Изучен качественный состав и количественное содержание полисахаридов, фенольных (флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, кумаринов, дубильных веществ) и тритерпеновых соединений, органических кислот, каротиноидов, аминокислот, макро- и микроэлементов; обнаружены азотистые основания.

Впервые изучен компонентный состав свободных аминокислот в траве короставника полевого. Установлено наличие 15 аминокислот, из них 7 -незаменимых. Суммарное содержание свободных аминокислот в сухом остатке водного извлечения исследуемого вида составляет 4,6%, в том числе незаменимых - 1,6%; преобладающей является кислота глутаминовая.

Впервые изучен качественный и количественный элементный состав травы короставника полевого. Установлено, что трава короставника полевого содержит 22 макро- и микроэлемента, из которых 10 являются эссенциальными и 5 — условно эссенциальными.

Впервые выделен и разделен на фракции полисахаридный комплекс травы короставника полевого. Установлено, что в его состав входят водорастворимые полисахариды, пектиновые вещества, гемицеллюлозы А и Б. Определен их качественный и количественный моносахаридный состав. Проведен анализ функциональных групп пектинов.

Впервые проведено изучение фенольных соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Установлено наличие флавоноидов (рутин, кверцетин, лютеолин-7-гликозид, кемпферол), кумаринов (кумарин, умбеллиферон), фенолкарбоновых кислот (галловая, о-кумаровая, кофейная, цикориевая, феруловая), танин, эпикатехин. Методом внутренней нормализации установлено, что из флавоноидных соединений преобладают лютеолин-7-гликозид и кверцетин, из фенолкарбоновых кислот -галловая кислота, из веществ кумариновой природы — умбеллиферон. Из 13 идентифицированных соединений фенольной природы 12 в короставнике полевом обнаружены впервые.

Впервые для стандартизации сырья травы короставника полевого разработаны методики количественного определения суммы водорастворимых полисахаридов (методом гравиметрии) и суммы флавоноидов (методом

спектрофотометрии). Определены нормы содержания БАВ и других числовых показателей качества сырья.

Впервые изучено морфологическое и анатомическое строение травы короставника полевого. Выявлены диагностические признаки, позволяющие устанавливать подлинность сырья.

Впервые изучена динамика накопления водорастворимых полисахаридов и флавоноидов в траве короставника полевого в зависимости от фазы вегетации растений. Установлены научно обоснованные сроки заготовки сырья.

При проведении скрининговых фармакологических исследований экспериментально установлено наличие у травы короставника полевого противовоспалительной, отхаркивающей, антимикробной, диуретической, анальгезирующей, антиоксидантной активности.

Практическая значимость и внедрение результатов исследования.

Результаты исследований позволяют расширить сведения о химическом составе и фармакологической активности травы короставника полевого.

Проведенные фитохимические исследования травы короставника полевого свидетельствуют о возможности ее использования в качестве перспективного отечественного источника природных БАВ.

Скрининговые фармакологические исследования показали, что трава короставника полевого является перспективным лекарственным растительным сырьем для дальнейшего более глубокого изучения и внедрения в медицинскую практику.

На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

- методика количественного определения суммы полисахаридов в траве короставника полевого (Акт внедрения в учебный и научно-исследовательский процессы ГБОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет»);

- методика количественного определения суммы флавоноидов в траве короставника полевого (Акты внедрения в учебный и научно-исследовательский процессы: ГБОУ ВПО «Пятигорский фармацевтический институт - филиал Волгоградского государственного медицинского университета»; Воронежской государственной медицинской академии имени H.H. Бурденко; ФГБОУ ВПО «Северо-Осетинский государственный университет имени K.JI. Хетагурова»);

результаты микродиагностического анализа лекарственного растительного сырья «Короставника полевого трава» (Акты внедрения в учебный и научно-исследовательский процессы: ГБОУ ВПО «Пятигорский фармацевтический институт - филиал Волгоградского государственного медицинского университета»; ГБОУ ВПО «Кубанский государственный

медицинский университет»; ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия»);

- результаты фитохимического анализа лекарственного растительного сырья - травы короставника полевого (Акты внедрения в учебный и научно-исследовательский процессы Воронежской государственной медицинской академии имени H.H. Бурденко; ФГБОУ ВПО «Северо-Осетинский государственный университет имени K.JI. Хетагурова»),

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты фитохимического анализа травы короставника полевого.

2. Результаты морфолого-анатомических исследований и диагностические признаки сырья.

3. Методики стандартизации сырья по содержанию суммы водорастворимых полисахаридов и суммы флавоноидов. Числовые показатели качества сырья.

4. Результаты установления научно обоснованных сроков заготовки сырья.

5. Результаты скрининговых фармакологических исследований.

Апробация работы. Основные положения диссертации были

представлены на ежегодных итоговых научных конференциях молодых ученых и студентов и итоговых научных сессиях КГМУ и отделения медико-биологических наук Центрально-Черноземного научного центра РАМН «Актуальные вопросы медицины и фармации» (Курск, 2009, 2010, 2012, 2013), на II, III Международных научно-практических конференциях «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» (Владикавказ, 2011, 2012); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Традиции и инновации фармацевтической науки и практики», посвященной 45-летию фармацевтического факультета КГМУ (Курск, 2011); симпозиуме «Актуальные аспекты разработки и регистрации препаратов природного происхождения, БАД к пище и функциональных пищевых продуктов» (Москва, 2011), на II Международном конгрессе «Физическое и духовное здоровье: традиции и инновации» (Москва, 2012).

Личный вклад автора. Диссертант принимал участие в постановке цели, задач и составлении плана исследований. Автор проанализировал отечественные и зарубежные литературные источники по теме диссертации, проводил экспериментальные фитохимические, морфолого-анатомические, фармакологические исследования, статистическую обработку, обобщение и анализ полученных данных, формулировку выводов, написание диссертации. В работах, выполненных в соавторстве, использованы результаты исследования с долей личного участия автора 85-90%.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 29 печатных работ, из которых - 6 в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 170 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (] глава), главы «Объекты и методы исследования», экспериментальной части (3 главы), общих выводов, списка литературы и приложения. В тексте содержится 32 таблицы, 35 рисунков. Список цитируемой литературы включает 290 источников, из них - 61 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектом исследований явилась трава короставника полевого (Кпаи^а агуег^в (Ь.) СоиН.), заготовленная в Курской области в 2007-2012 гг. в различные фазы вегетации растений.

Фитохимический анализ травы короставника полевого

При изучении качественного состава БАВ в траве короставника полевого обнаружены свободные и связанные сахара, фенольные соединения (кумарины, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества), азотсодержащие соединения (аминокислоты, азотистые основания), каротиноиды, сапонины.

Из свободных Сахаров в изученном растении обнаружены: арабиноза, глюкоза, галактоза, фруктоза. Связанные сахара содержатся в виде гликозидов и полисахаридов.

Впервые в траве короставника полевого количественно определено содержание: дубильных веществ - 4,6%; суммы органических кислот - 1,4% (в т.ч. аскорбиновой кислоты - 0,1%); тритерпеновых соединений - 0,01%; каротиноидов - 3,2 мг%.

Впервые исследован аминокислотный состав травы короставника полевого. Установлено наличие 15 аминокислот (из них 7 - незаменимых): аланин, аргинин, аспарагиновая кислота, валин, гистидин, глицин, глутаминовая кислота, лейцин, изолейцин, лизин, метионин, тирозин, треонин, серин, фенилаланин. Содержание свободных аминокислот в сухом остатке водного извлечения составляет 4,6%, в т.ч. незаменимых - 1,6%; преобладающей является кислота глутаминовая.

Впервые методом элементного спектрального анализа в траве короставника полевого определено количественное содержание 22 макро- и микроэлементов (в т.ч. 10 - эссенциальных и 5 - условно эссенциальных).

В траве короставника полевого методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) обнаружено 21 соединение фенольной природы, идентифицировано 13 веществ (из них 4 - флавоноида, 5 -

фенолкарбоновых кислот, 2 вещества кумариновой природы, 2 производных дубильных веществ) (табл. 1).

Таблица 1

Результаты исследования фенольных соединений травы короставника полевого методом ВЭЖХ

Наименование вещества Время удерживания, мин Содержание вещества в смеси, % от суммы

Галловая кислота * 3,34 17,17

Кверцетин * 28,47 5,09

Кемпферол * 56,72 0,97

Кофейная кислота * 5,61 1,63

Кумарин * 11,4 0,96

Лютеолин-7-гликозид 8,41 5,39

О-кумаровая кислота * 4,97 5,21

Рутин * 8,76 1,27

Танин * 3,78 2,23

Умбеллиферон * 2,89 7,74

Феруловая кислота * 7,02 1,24

Цикориевая кислота * 6,21 3,35

Эпикатехин* 4,42 2,70

Неидентифицированное вещество 9,20 1,07

Неидентифицированное вещество 10,7 1,45

Неидентифицированное вещество 15,12 2,47

Неидентифицированное вещество 17,06 2,15

Неидентифицированное вещество 20,34 3,74

Неидентифицированное вещество 21,43 2,45

Неидентифицированное вещество 25,75 7,52

Неидентифицированное вещество 31,26 24,20

* - означает, что вещество в исследуемом растении обнаружено впервые

Методом внутренней нормализации установлено, что преобладающими в траве короставника полевого являются: из флавоноидных соединений -лютеолин-7-гликозид и кверцетин, из фенолкарбоновых кислот - галловая кислота, из кумаринов - умбеллиферон. Из 13 идентифицированных веществ в исследуемом виде 12 обнаружены впервые (табл. 1).

С помощью методики Н.К. Кочеткова полисахаридный комплекс из травы короставника полевого был выделен и разделен на фракции, содержащие водорастворимые полисахариды (ВРПС), пектиновые вещества (ПВ), гемицеллюлозы А и Б (ГЦ А, ГЦ Б). Выход их составил: ВРПС - 5,90%, ПВ -7,90%, ГЦ А - 4,80%, ГЦ Б - 3,75% (табл. 2).

Определение качественного и количественного содержания моносахаров в гидролизатах выделенных ВРПС, ПВ, ГЦ А и ГЦ Б проводили денситометрически после хроматографии в тонком слое сорбента параллельно с достоверными образцами моносахаридов. Установлено, что в состав ВРПС травы короставника полевого входят нейтральные (глюкоза, галактоза,

арабиноза, рамноза) и кислые (галактуроновая и глюкуроновая кислоты) сахара. Из нейтральных Сахаров преобладают арабиноза (8,6%) и глюкоза (8,1%), из кислых - глюкуроновая кислота (6,1%). Основу ПВ составляет галактуроновая кислота (73,7%). Кроме того, в выделенных ПВ обнаружены нейтральные моносахариды - глюкоза, галактоза, арабиноза, ксилоза. В гидролизатах ГЦ А и ГЦ Б обнаружены нейтральные моносахариды: ксилоза, арабиноза, глюкоза и галактоза, преобладающим из них является ксилоза (13,515,8%), что указывает на наличие полисахаридов типа ксилана (табл. 2).

Таблица 2

Количественное содержание и моносахаридный состав полисахаридов из травы короставника полевого

Группа полисахаридов Выход, % от воздушно-сухого сырья Моносахаридный состав, % к полисахаридному комплексу

Глюкоза Галактоза Ксилоза Арабиноза Рамноза Галактуроновая кислота Глюкуроновая кислота

-ВРПС 5,90 8,1 3,2 - 8,6 7,9 2,2 6,1

-ПВ 7,90 2,5 0,7 6,3 6,7 - 73,7 -

-ГЦ А 4,80 5,2 1,7 13,5 4,1 - - -

-ГЦ Б 3,75 1,8 3,5 15,8 6,0 - - -

Выделение и анализ полисахаридов травы короставника полевого проведены впервые. Высокий выход полисахаридов говорит о перспективности использования травы короставника полевого в качестве источника ВРПС и ПВ.

Проведен анализ функциональных групп ПВ. Количественное определение функциональных групп (свободных карбоксильных, метоксилированных карбоксильных, общее количество карбоксильных, метоксильных групп) проводили титриметрическим методом. Установлено, что содержание свободных карбоксильных групп в исследуемых ПВ составляет 8,47%, метоксилированных карбоксильных групп - 4,34%, метоксильных групп - 2,99%. Данные ПВ относятся к группе низкоэтерифицированных пектинов, т.к. характеризуются невысокой (\<50%) степенью этерификации.

Морфолого-анатомические исследования Данные фитохимических исследований показали, что трава короставника полевого содержит комплекс БАВ и может быть рекомендована к внедрению в медицинскую практику. Это делает необходимым проведение морфолого-анатомических исследований с целью выявления признаков дифференциальной диагностики сырья.

При макроскопическом анализе были описаны морфологические признаки травы короставника полевого. Лекарственное сырье представляет собой цельные или частично измельченные олиственные стебли длиной до

40 см, с цветками, а также кусочки стеблей, листьев, цветков. Стебли бороздчатые, простые или ветвистые. Листья продолговатые, перистораздельные, иногда цельные, нижние - с черешками, верхние - сидячие, супротивные, длиной до 15 см. Стебли и листья густо опушены жесткими простыми волосками. Цветки мелкие, 7-10 мм длиной, собраны в соцветия -головки, диаметром 20-40 мм. Листочки обертки двухрядные, ланцетные, заостренные, по краю реснитчатые, бледно-зеленые, травянистые. Венчик воронковидный, с отгибом, образован пятью сросшимися лепестками (с разновеликими лопастями). Наружный ряд цветков в соцветиях резко отличается от остальных цветков значительно увеличенным венчиком. Чашечка 3-4 мм длиной, бледно-зеленая, с 8-10 длинными остистыми зубцами. Цвет листьев и стеблей серовато-зеленый, цветков - синевато-лиловый. Запах слабый. Вкус водного извлечения слабо-горьковатый.

При микроскопическом анализе были описаны анатомические признаки травы короставника полевого.

Диагностическое значение для листа имеют клетки эпидермиса со слегка извилистыми стенками. Устьица аномоцитного типа, преобладают на нижней стороне листа. Волоски простые и головчатые. Простые волоски многочисленные, особенно на нижней стороне листа, толстостенные, одноклеточные, прямые и изогнутые. По всей поверхности на обеих сторонах листа имеются головчатые волоски с одноклеточной ножкой и многоклеточной головкой. Вокруг базальной клетки простых и головчатых волосков образуется розетка эпидермальных клеток. В мезофилле листа наблюдается большое количество включений оксалата кальция в виде крупных друз (рис. 1, 2, 3).

Диагностическое значение для чашелистика имеют клетки эпидермиса со слегка извилистыми стенками. Волоски простые и головчатые, характерные для листа, большое количество крупных друз оксалата кальция (рис. 4, 5, 6).

Диагностическое значение для лепестка венчика имеют клетки эпидермиса с сосочковидными выростами и сильно извилистыми стенками. Характерно наличие двух типов волосков - простых и головчатых. Простые волоски многочисленные, одноклеточные, прямые и изогнутые. Головчатые волоски с одно- или многоклеточной ножкой и с одно- или многоклеточной головкой. Имеются друзы оксалата кальция и пыльца шаровидной формы (рис. 7, 8).

Микродиагностические признаки стебля: на поперечном срезе стебель ребристый, имеет вторичное строение. Покровная ткань представлена однослойным эпидермисом. Первичная кора хорошо развита, состоит из уголковой колленхимы, паренхимы первичной коры (с друзами оксалата кальция) и эндодермы. В центральном цилиндре проводящая система представлена открытыми коллатеральными пучками, расположенными по

Рис. 1. Фрагмент эпидермиса листа с устьицами и друзами (Увел. х200)

Рис. 2. Фрагмент эпидермиса листа с простыми волосками и друзами (Увел. х80)

Рис. 3. Фрагмент эпидермиса листа с головчатым волоском (Увел. х400)

Рис. 5. Фрагмент края чашелистика с простыми и головчатым волоском (Увел. х200)

Рис. 4. Фрагмент края чашелистика с простыми одноклеточными длинными и короткими волосками (Увел. х200)

Рис. 6. Фрагмент чашелистика с друзами (Увел. х80)

Рис. 7. Фрагмент края лепестка с сосочковидными выростами, простыми короткими одноклеточными и головчатыми волосками (Увел. х400)

Рис. 9. Фрагмент поперечного среза стебля короставник полевого (Увел, х 120)

Рис. 8. Фрагмен т края лепестка -клетки эпидермиса и пыльца (Увел. х200)

Рис. 10. Фрагмент поперечного среза стебля с простыми одноклеточными толстостенными короткими и длинными волосками (Увел. х200)

' ' I

Й-- '"¿Лалг-Дь *

й' Ж,Ш§

г. | . * а я

Рис. I I. Фрагмент поперечного среза стебля - простой одноклеточный волосок с бородавчатой поверхностью (Увел. х200)

Рис. 12. Фрагмент поперечного среза стебля с головчатым волоском (Увел. *400)

кругу. В центральной части стебля находится полость, окруженная тонкостенными клетками паренхимы сердцевины округлой формы. На эпидермисе стебля имеются простые и головчатые волоски. Простые волоски нескольких типов. Первый - толстостенные, одноклеточные, короткие. Второй -толстостенные, одноклеточные, крупное основание сильно расширено. Третий -простые одноклеточные тонкостенные волоски с бородавчатой поверхностью. Головчатые волоски - с одноклеточной ножкой и многоклеточной головкой (рис. 9, 10, 11, 12).

Разработка методик стандартизации сырья

Для объективной оценки качества сырья по содержанию суммы флавоноидов и суммы ВРПС нами использованы методики спектрофотометрического определения флавоноидов и гравиметрического определения ВРПС в траве короставника полевого.

Для анализа сырья травы короставника полевого разработана методика спектрофотометрического определения суммы флавоноидов непосредственно в извлечении из сырья. В основу данной методики положена реакция комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом в среде спирта этилового 70% в сочетании со спектрофотометрическим дифференциальным способом определения оптической плотности комплексов. Данная методика отличается экспрессностью, проста в исполнении, характеризуется использованием оборудования, доступного для любой контролирующей лаборатории, и рекомендуется ГФ-Х1 для анализа лекарственного растительного сырья, содержащего флавоноиды.

Определение оптимальных условий экстракции флавоноидов из травы короставника полевого проводили на одном образце сырья. В составе суммы флавоноидов короставника полевого содержатся производные кверцетина, лютеолина, кемпферола, одним из преобладающих является кверцетин. При исследовании спектров поглощения спиртового извлечения из травы короставника полевого с алюминия хлоридом установлено, что максимум поглощения находится при 430 нм и совпадает с максимумом поглощения комплекса кверцетина с алюминия хлоридом. Поэтому в качестве стандартного образца был использован кверцетин-стандарт. Для проведения расчетов применен удельный показатель поглощения комплекса кверцетина с алюминия хлоридом.

На основании проведенных исследований определены оптимальные условия количественного определения суммы флавоноидов в траве короставника полевого (табл. 3).

Таблица 3

Оптимальные условия количественного определения суммы флавоноидов в траве короставника полевого спектрофотометрическим методом

Наименование параметра Величина показателя

Навеска сырья, г 1,0

Степень измельчения сырья, мм 1

Условия экстракции Концентрация спирта этилового, % 70

Время, мин. 90

Параметры спектрофото- метрирования Количество экстракта, мл 3,0

Концентрация спирта этилового, % 70

^пах, НМ 430

Время образования комплексов с А1СЬ, мин 45

Стандартное вещество Кверцетин

Содержание суммы флавоноидов, % от 0,280±0,003 до 0,370±0,004

По данной методике проанализировано 5 партий травы короставника полевого, заготовленных в различных районах Курской области в разные годы. Результаты исследований показывают, что содержание суммы флавоноидов находится в пределах от 0,280% до 0,370%. Ошибка единичного определения с 95% вероятностью не превышает 2,7%. В связи с этим рекомендуем установить норму содержания суммы флавоноидов в траве короставника полевого не менее 0,2%.

Для количественного определения суммы водорастворимых полисахаридов (ВРПС) использован гравиметрический метод, основанный на экстракции полисахаридов из сырья с последующим осаждением их спиртом этиловым 96%. Этот метод рекомендуется ГФ-Х1 для анализа сырья, содержащего полисахариды. Определение оптимальных условий экстракции и условия осаждения ВРПС из травы короставника полевого проводили на одном образце сырья. Установлено, что оптимальными условиями, обеспечивающими максимальный выход ВРПС из сырья и полноту их осаждения, являются: степень измельчения сырья - 2 мм, трехкратная экстракция водой в течение 90 минут (3 раза по 30 минут) в соотношении сырье-растворитель (1:10) и трехкратное количество спирта этилового 96% по отношению к извлечению. На основании проведенных исследований разработана методика количественного определения суммы ВРПС для травы короставника полевого (табл. 4).

Таблица 4

Оптимальные условия количественного определения суммы ВРПС в траве короставника полевого гравиметрическим методом

Наименование параметра Величина показателя

Навеска сырья, г 10,0

Степень измельчения сырья, мм 2

Условия экстракции Экстрагент вода

Соотношение сырье-экстрагент 1:10

Время экстракции, мин 90 (3x30)

Условия осаждения Осадитель Спирт этиловый 96%

Объем осадителя 3

Содержание суммы ВРПС, % от 5,50±0,09 до 5,90±0,09

Предложенной методикой проанализировано 5 партий сырья. Содержание суммы ВРПС находится в пределах от 5,50% до 5,90%. Ошибка единичного определения с 95% вероятностью не превышает 4,7%. В связи с этим рекомендуем установить норму содержания суммы ВРПС в траве короставника полевого не менее 5,0%.

Разработка числовых показателей качества сырья Для разработки критериев качества травы короставника полевого проведены исследования по определению числовых показателей сырья, согласно требованиям ГФ-Х1. Было проанализировано 5 партий сырья травы короставника полевого, заготовленных в различных районах Курской области в разные годы. В результате проведенных исследований впервые предложены следующие требования и нормы на сырье травы короставника полевого: влажность - не более 8,0%, зола общая - не более 16,0%, зола, нерастворимая в 10% растворе кислоты хлористоводородной - не более 2,0%, части сырья, утратившие естественную окраску (пожелтевшие, почерневшие) - не более 0,5%, другие части растения, не соответствующие установленному описанию сырья (корневища, плоды), - не более 0,5%, органическая примесь - не более 0,5%, минеральная примесь - не более 0,5%.

Установление научно обоснованных сроков заготовки сырья С целью оптимизации сроков заготовки сырья была изучена динамика накопления флавоноидов и ВРПС в траве короставника полевого по фазам вегетации растений. Результаты показывают, что флавоноиды и ВРПС максимально накапливаются в траве в фазу массового цветения растений, которая является оптимальным сроком заготовки сырья (табл. 5).

Таблица 5

Содержание суммы флавоноидов и суммы ВРПС в траве короставника полевого в зависимости от фазы вегетации растений

Фаза вегетации растения Содержание суммы флавоноидов, %, Содержание суммы ВРПС, %

Начало вегетации 0,220±0,003 4,80±0,Ю

Бутонизация - начало цветения 0,300±0,003 5,60±0,09

Массовое цветение 0,370±0,004 5,90±0,09

Плодоношение 0,260±0,004 3,95±0,12

Проведение скрининговых фармакологических исследований

Сведения о применении короставника полевого в народной медицине, а также результаты фитохимического изучения позволили определить направления скрининговых фармакологических исследований настоя (по ГФ-Х1), ВРПС, ПВ.

Острую токсичность настоев (в дозах 0,2-1,0 мл) и ВРПС (1500 мг/кг) определяли по методике Б.М. Штабского на мышах. Установлено, что настой и ВРПС относятся к классу практически нетоксичных веществ.

Изучение отхаркивающего действия настоя и ВРПС травы короставника полевого проводили на модели изучения двигательной активности мерцательного эпителия пищевода лягушки по методике В.В. Гацура. Результаты показывают, что настой травы короставника полевого достоверно повышает двигательную активность ресничек мерцательного эпителия пищевода лягушки на 24,2% (коэффициент ускорения 0,76), ВРПС - на 8,5% (коэффициент ускорения 0,92) соответственно. Изучение отхаркивающего действия настоя и ВРПС травы короставника полевого проведено впервые.

Изучено противовоспалительное действие настоя и ВРПС травы короставника полевого с учетом их влияния на разные стадии воспалительного процесса. Исследование антиэкссудативной активности показало, что при введении ВРПС мышам в дозе 200 мг/кг отек уменьшался на 12,3%, настоя в дозе 1 мл/кг — на 17,0% по сравнению с контролем.

При изучении влияния настоя и ВРПС на пролиферативную фазу хронического воспаления установлено, что для настоя травы короставника полевого в дозе 1 мл/кг угнетение образования гранулемы у крыс составило 14,5%, для ВРПС (100 мг/кг) - 45,1%.

Изучение влияния на проницаемость капилляров проводили при моделировании локальной воспалительной реакции с помощью ксилола на кроликах-альбиносах. Результаты показали, что максимальное увеличение латентного периода появления пятен окрашивания (на 141,0%) наблюдалось при введении животным настоя травы короставника полевого в дозе 1 мл/кг.

Диаметр пятен также уменьшался на 21,3% по сравнению с контрольной группой животных. ВРПС травы короставника полевого достоверно влияли на проницаемость капилляров в дозе 100 мг/кг, увеличивая при этом латентный период появления пятен окрашивания на 91,7% и уменьшая их диаметр на 23,5%. Влияние настоя и ВРПС из травы короставника полевого на различные стадии воспалительного процесса изучено впервые.

Впервые исследовано анальгезирующее действие настоя и ВРПС короставника полевого на моделях термического и химического раздражения. Данные экспериментов показывают, что настой и ВРПС достоверно снижают уровень болевой чувствительности у мышей при химическом раздражении брюшины (настой - на 21,9% , ВРПС - на 22,9%) и при локальном термическом раздражении, увеличивая время спокойного пребывания животных на нагретой пластинке по сравнению с контролем (настой - на 23,4%, ВРПС - на 11,0%).

Изучение диуретической активности показало, что однократное внутрижелудочное введение крысам настоя травы короставника полевого в дозе 1 мл достоверно увеличивает количество выделяемой за сутки мочи на 37,3% по сравнению с контролем, что свидетельствует о наличии у данного вида мочегонного эффекта. Однако диуретический эффект у настоя травы короставника полевого ниже, чем у официнапьных лекарственных растений -хвоща полевого и брусники обыкновенной. Исследование диуретической активности настоя травы короставника полевого проведено впервые.

Впервые исследована антимикробная активность настоя и раствора ПВ (1%) травы короставника полевого методом серийных разведений в сравнении с контролем. При этом установлено, что настой травы короставника полевого проявляет антимикробное действие в отношении следующих микроорганизмов: Pseudomonas aeruginosa (в соотношении 1:2 и 1:4) и Proteus vulgaris (1:2 и 1:4). Раствор ПВ показал антимикробную активность в отношении Pseudomonas aeruginosa (в соотношении 1:2), Proteus vulgaris (1:2), Bacillus cereus (1:2 и 1:4). Не чувствительными к исследуемому настою и ПВ оказались штаммы Escherichia coli, Staphylococcus aureus и грибы рода Candida: в указанных концентрациях они не влияли на рост данных микроорганизмов.

При изучении антиоксидантной активности настоя, спиртового извлечения (на спирте этиловом 70%) и ВРПС из травы короставника полевого методом тонкослойной хроматографии обнаружили по 4 вещества, относящиеся к среднеполярным (Rf 0,21-0,50) и неполярным (Rf 0,51-1,0). Установлено, что настой из травы короставника полевого оказывает ингибирующее влияние на кинетику Ре2+-индуцированной хемилюминесценции, снижая уровень свечения модельной системы на 12,9%

по сравнению с контролем. Антиоксидантная активность травы короставника полевого изучена впервые.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Исследован состав БАВ травы короставника полевого. Установлено наличие дубильных веществ, органических кислот, кумаринов, флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, тритерпеновых сапонинов, каротиноидов, свободных и связанных Сахаров, азотистых оснований. Впервые определено количественное содержание 15 аминокислот (в том числе 7 незаменимых) и 22 макро- и микроэлементов (в том числе 10 - эссенциальных и 5 - условно эссенциальных).

2. В траве короставника полевого методом ВЭЖХ обнаружено 21 соединение фенольной природы, идентифицировано 13 веществ (из них 4 -флавоноида, 5 - фенолкарбоновых кислот, 2 - вещества кумариновой природы, 2 производных дубильных веществ). 12 веществ в исследуемом сырье обнаружены впервые.

3. Из травы короставника полевого впервые выделено и исследовано четыре фракции полисахаридов: ВРПС - 5,90%, ПВ - 7,90%, ГЦ А - 4,80%, ГЦ Б - 3,75%. В ВРПС преобладающими моносахарами являются арабиноза (8,6%) и глюкоза (8,1%), в ПВ - галактуроновая кислота (73,7%), в ГЦ А и ГЦ Б -ксилоза (13,5-15;8%), что указывает на наличие полисахаридов типа ксиланов. Проведен анализ функциональных групп ПВ; установлено, что они относятся к группе низкоэтерифицированных пектинов (Зк50%).

4. Впервые проведено морфолого-анатомическое изучение травы короставника полевого и выявлены макро- и микродиагностические признаки сырья, позволяющие устанавливать его подлинность. Микродиагностическое значение имеют: извилистостенные клетки эпидермиса, аномоцитный тип устьиц, трихомы - простые (3 типов) и головчатые волоски, включения - друзы оксалата кальция.

5. Для стандартизации сырья разработаны методики количественного спектрофотометрического определения суммы флавоноидов и гравиметрического определения суммы ВРПС в траве короставника полевого. С помощью разработанных методик установлено, что содержание суммы флавоноидов в пересчете на кверцетин в траве исследуемого растения находится в пределах от 0,280% до 0,370%; содержание суммы ВРПС колеблется от 5,50% до 5,90%,

На основании результатов изучения динамики накопления ВРПС, флавоноидов в траве короставника полевого в зависимости от фазы вегетации

предложены научно обоснованные сроки заготовки сырья - период массового цветения растений.

6. На основании анализа 5 партий сырья, заготовленных в различных районах Курской области в разные годы, предложены следующие критерии оценки качества и нормы: содержание суммы флавоноидов — не менее 0,2%, содержание суммы ВПРС - не менее 5,0%, влажность - не более 8,0%, зола общая - не более 16,0%, зола, нерастворимая в 10% растворе кислоты хлористоводородной - не более 2,0%, части сырья, утратившие естественную окраску (пожелтевшие, почерневшие) - не более 0,5%, другие части растения, не соответствующие установленному описанию сырья (корневища, плоды) - не более 0,5%, органическая примесь - не более 0,5%, минеральная примесь - не более 0,5%.

7. Проведенные скрининговые фармакологические исследования настоя и двух полисахаридных фракций (ВРПС, ПВ) травы короставника полевого позволили установить, что настой и ВРПС относятся к классу практически нетоксичных веществ; настой обладает диуретическим и антимикробным действием; настой и ВРПС - противовоспалительным, отхаркавающим, анальгезирующим, антиоксидантным действием; ПВ - антимикробной активностью.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Денисова, H.H. Выделение водорастворимого полисахаридного комплекса травы короставника полевого / H.H. Денисова, И.Л. Дроздова // Молодежная наука: от фундаментальной идеи до инновационных проектов : материалы 73-й итог, межвуз. конф. студентов и молодых ученых (15-16 апр. 2008 г.): в 2 ч. - Курск: Изд-во КГМУ, 2008. - Ч. II. - С. 76.

2. Дроздова, И.Л. Изучение микродиагностических признаков травы короставника полевого / И.Л. Дроздова, H.H. Денисова // Актуальные проблемы регионоведения : тр. 3-й междунар. краевед, конф. (18 дек. 2008 г.): в 2 ч. - Курск, 2008. - Ч. 1. - С. 65-66.

3. Дроздова, И.Л. Изучение содержания дубильных веществ в траве короставника полевого (Knautia arvensis (L.) Coult.) семейства ворсянковые (Dipsacaceae Juss.) / И.Л. Дроздова, H.H. Денисова // Университетская наука: теория, практика, инновации : сб. тр. 74-й науч. конф. КГМУ, сес. Центр.-Чернозем, науч. центра РАМН и отд-ния РАЕН : в 3 т. - Курск: Изд-во КГМУ, 2009. - Т. II. - С. 226-228.

4. Денисова, H.H. Тритерпеновые соединения травы короставника полевого / H.H. Денисова, И.Л Дроздова // Молодежная наука и современность : материалы 74-й межвуз. итог. науч. конф. студентов и молодых ученых, посвящ. Году молодежи в России (21-22 апр. 2009 г.) : в 3 ч. - Курск: Изд-во КГМУ, 2009. - Ч. II. - С. 173-174.

5. Дроздова, И.Л. Изучение содержания органических кислот в траве короставника полевого / И.Л. Дроздова, H.H. Денисова // Биотехнология Биомедицинская инженерия и технология современных социальных практик : сб. тр. Всерос. науч.-практ. конф. - Курск: Изд-во КГМУ, 2009. - . С. 124-126.

6. Дроздова, И.Л. Изучение веществ первичного биосинтеза травы короставника полевого (Knautia arvensis L.) флоры Центрального Черноземья / И.Л. Дроздова, H.H. Денисова // Актуальные проблемы регионоведения : тр. 4-й междунар. науч. конф. (28-29 дек. 2009 г) -Курск: Издат. дом VIP, 2009. - С. 44-46.

7. Дроздова, И.Л. Фитохимическое изучение короставника полевого (Knautia arvensis L.) / И.Л. Дроздова, H.H. Денисова // Актуальные вопросы фармакологии и фармации: сб. тр. межвуз. науч. конф., посвящ. памяти проф. В. В. Пичугина и 75-летию КГМУ. - Курск: Изд-во КГМУ, 2009. -С. 183-184.

8. Денисова, H.H. Определение числовых показателей качества сырья короставника полевого / H.H. Денисова // Материалы IV междунар. науч. конф. молодых ученых-медиков (25-26 фев. 2010 г.) / под ред

B.А. Лазаренко. - Курск: Изд-во КГМУ, 2010. - Т. I. - С. 333-335.

9. Дроздова, И.Л. Короставник полевой - перспективное лекарственное растение / И.Л. Дроздова, H.H. Денисова // XVII Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство»: сб. материалов конгр. (тез. докл.) (12-16 апреля 2010 г) -М„ 2010.-С. 607-608.

10. Денисова, H.H. Выделение пектиновых веществ травы короставника полевого / H.H. Денисова, И.Л. Дроздова // Молодежная наука и современность : материалы 75-й юбилейной итог. Всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием, посвящ. 75-летию КГМУ (20-21 апр. 2010 г.) : в 3 ч. - Курск: Изд-во КГМУ, 2010. - Ч II -

C. 261-262.

11. Дроздова, И.Л. Изучение содержания каротиноидов в траве короставника полевого (Knautia arvensis (L.) Coult.) семейства ворсянковые (Dipsacaceae Juss.) / И.Л. Дроздова, H.H. Денисова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / под ред. М.В. Гаврилина. - Пятигорск: Изд-во Пятигор. ГФА, 2010. - Вып 65 -С. 39-40.

12. Дроздова, И.Л. Обнаружение веществ, обладающих антиоксидантной активностью в траве короставника полевого методом ТСХ / И.Л. Дроздова, H.H. Денисова // Интегративная медицина - 2010 : сб. тез. науч. докл!

Междунар. форума (г. Москва, 18-20 июня 2010 г.). - М„ 2010. - С. 19013. Дроздова, И.Л. Обоснование возможности использования короставника полевого в фитотерапии различных заболеваний на основании изучения его химического состава / И.Л. Дроздова, H.H. Денисова // II Рос. фитотерапевтический съезд: сб. науч. тр. съезда (г. Москва, 22-23 окт. 2010 г.). - М.: Изд-во Профессиональной ассоциации натуротерапевтов, 2010. -С. 124-126. - (Прил. к журн. «Традиционная медицина»; № 3(22), 2010).

14. Дроздова, И.Л. Фенолкарбоновые кислоты травы короставника полевого (Knautia arvensis (L.) Coult.) / И.Л. Дроздова, H.H. Денисова // Создание лекарственных средств на основе продуктов природного происхождения : материалы Рос. науч.-практ. конф. (19-23 октября 2010 г.) // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. - 2010. - № 7. -С. 67-69.

15. Дроздова, И.Л. Определение функциональных групп пектиновых веществ травы короставника полевого / И.Л. Дроздова, H.H. Денисова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / под ред. М.В. Гаврилина. - Пятигорск: Изд-во Пятигор. ГФА, 2011. -Вып. 66.-С. 71-72.

16. Дроздова, И.Л. Изучение отхаркивающей активности настоя травы короставника полевого / И.Л. Дроздова, H.H. Денисова // Современное решение актуальных научных проблем в медицине : сб. материалов X науч. сес. молодых ученых и студентов (г. Нижний Новгород, 17-18 марта 2011 г.) // Медицинский альманах. - 2011. - Март (Спецвып.) -С. 197-198.

17. Гладченко, М.П. Определение острой токсичности настоя травы короставника полевого / М.П. Гладченко, И.Л. Дроздова, H.H. Денисова // XVIII Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство»: сб. материалов конгр. (тез. докл.) (11-15 апр. 2011 г.).-М„ 2010.-С. 429-430.

18. Диуретическая активность травы короставника полевого / М.П. Гладченко, Е.Б. Артюшкова, И.Л. Дроздова, H.H. Денисова // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки : сб. работ молодых ученых II Междунар. науч.-практ. конф. (13-15 мая 2011 г.) : в 2 ч. - Владикавказ, 2011. - Ч. I. - С. 194-196.

19. Анальгезирующая активность травы короставника полевого (Knautia arvensis (L.) Coult.) / М.П. Гладченко, Е.Б. Артюшкова, И.Л. Дроздова, H.H. Денисова // Кубанский научный медицинский вестник. - 2011. -№ 3(126). - С. 44-46.

20. Дроздова, ИЛ. Анализ полисахаридного состава травы короставника полевого флоры Центрального Черноземья / И.Л. Дроздова, H.H. Денисова // Научные ведомости Белгородского государственного университета. - 2011. - № 4(99), вып. 13/2. - С. 161-164.

21. Дроздова, И.Л. Азотистые основания травы короставника полевого / И.Л. Дроздова, H.H. Денисова // Традиции и инновации фармацевтической науки и практики : материалы Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 45-летию фарм. фак-та КГМУ (27 октяб. 2011 г.) / под ред. В.А. Лазаренко, А.И. Конопли, И.Л. Дроздовой, И.В. Зубковой, Л.А. Гордиенко. - Курск: Изд-во КГМУ, 2011. - С. 314-316.

22. Дроздова, И.Л. Изучение возможности использования полисахаридов травы короставника полевого для лечения заболеваний органов дыхания / И.Л. Дроздова, H.H. Денисова // Традиционная медицина, 2011. - № 5 (28). - С. 345-346.

23. Противовоспалительная активность настоя и водорастворимых полисахаридов травы короставника полевого (Knautia arvensis (L.) Coult.) / М.П. Гладченко, Е.Б. Артюшкова, И.Л. Дроздова, H.H. Денисова // Хабаршы («Вестник») : респ. науч. журн. - 2011. - № 4(55). - С. 2-4.

24. Дроздова, И.Л. Короставник полевой как потенциальный источник отечественного лекарственного растительного сырья / И.Л. Дроздова, H.H. Денисова // Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации : материалы науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 75-летию Пермской гос. фармацевт, акад. (7-9 дек. 2011 г.). - Пермь, 2011. - С. 203-204.

25. Печенин, О .Д. Антимикробная активность настоя и пектиновых веществ травы короставника полевого / О.Д. Печенин, И.Л. Дроздова, H.H. Денисова // XIX Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство»: сб. материалов конгр. (тез. докл.) (23-27 апр. 2012 г.). - М„ 2012. - С. 412-413.

26. Денисова, H.H. Изучение антиоксидантной активности настоя травы короставника полевого (Knautia arvensis (L.) Coult.) / H.H. Денисова, И.Л. Дроздова, T.M. Григорьева // Молодежная наука и современность : материалы 77-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием (18-19 апр. 2012 г.) : в 3 ч. - Курск: Изд-во КГМУ 2012.-Ч. II.-С. 326.

27. Дроздова, И.Л. Изучение кумаринов травы короставника полевого (Knautia arvensis (L.) Coult.) / И.Л. Дроздова, H.H. Денисова // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки : сб. работ молодых ученых III Междунар. науч.-практ. конф. (18-20 мая 2012 г.) : в 2 ч. - Владикавказ -Ч. I. - С. 197-199.

28. Дроздова, И.Л. Изучение возможности использования травы короставника полевого как источника природных антиоксидантов / ИЛ. Дроздова, Т.М. Григорьева, H.H. Денисова // Традиционная медицина, 2012. - № 5. - С. 216-218.

29. Дроздова, И.Л. Изучение состава фенольных соединений надземной части короставника полевого (Knautia arvensis (L.) Coult.) методом ВЭЖХ / И.Л. Дроздова, H.H. Денисова // Ученые записки Орловского государственного университета. Серия «Естественные, технические и медицинские науки». - Орел: Изд-во ОГУ, 2012. - JV» 6 (50), Ч I -С. 241-243.

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 10.04.2013 г. Подписано в печать 11.04.2013 г. Формат 30х42'/8 Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 242«А». Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.