Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое исследование представителей родов Origanum L. и Rhododendron L.флоры Восточной Сибири

На правах рукописи

00460

Мирович Вера Михайловна

195

и

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДОВ ОИГСАШМ Ь. И ННООСЮЕЮШОТ Ь. ФЛОРЫ ВОСТОЧНОЙ СИБИРИ

14.04.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

1 3 МАЙ 2010

Улан-Удэ - 2010

004601195

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Иркутский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант: доктор фармацевтических наук, профессор

Федосеева Галина Михайловна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Анцупова Татьяна Петровна

доктор фармацевтических наук Боковикова Татьяна Николаевна

доктор фармацевтических наук, профессор Федосеева Людмила Михайловна

Ведущая организация ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится 03 июня 2010 г. в 10 часов на заседании Диссертационного совета ДМ 003.028.02 при Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу: 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН

Автореферат разослан__2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Хобракова В.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В последние годы во всем мире проявляется все больший интерес к лекарственным препаратам, созданным на основе природного сырья.

В профилактике и комплексной терапии заболеваний органов дыхания широко используются растительные средства с антимикробным, противовоспалительным и иммуномодулирующим действием. Значительная часть таких средств создана на основе эфирных масел, природных полифенольных соединений, терпеноидов, полисахаридов (Машковский М.Д., 2008).

Распространенность патологии дыхательных путей носит глобальный характер и занимает одно из лидирующих мест в структуре заболеваемости по классам и группам болезней. Рост болезней органов дыхания обусловливается неблагоприятной экологической обстановкой, нерациональным питанием, стрессами, а также прогрессирующим ростом резистентности возбудителей патологии к широко применяемым и относительно новым антибиотикам, возрастающей этиологической ролью условно-патогенной микрофлоры (Чучалин А.Г., 2007; Стрельцова Е.Н., 2007).

В связи с этим была разработана Федеральная целевая программа «Концепция развития пульмонологической службы России на 2002-2007 годы». Одной из важных концепций этой программы является разработка и внедрение для лечения и профилактики заболеваний органов дыхания отечественных препаратов.

Обоснованность применения растительных средств в профилактике и лечении заболеваний органов дыхания определяется тем, что к ним практически не наблюдается привыкания микроорганизмов, они сочетают в себе комплексы биологически активных веществ (БАВ), обусловливающих многопрофильное действие на основные стадии патологического процесса (Соколов С .Я., 2000).

Расширение ассортимента растительных средств, применяемых для лечения болезней органов дыхания, может осуществляться за счет углубленного изучения растений научной, а также народной медицины. Особого внимания заслуживают растения, имеющие в своем химическом составе несколько групп БАВ, сочетание которых расширяет и усиливает фармакотерапевтиче-ское действие. Представители родов Origanum L. и Rhododendron L. накапливают эфирные масла, тритерпеноиды, полифенольные соединения, для них свойственно разностороннее фармакологическое действие (Ткаченко К.Г. в со-авт., 2002; Мурашкина И.А., 2003; Белоусов М.В., 2004; Рогачев А.Д., 2009).

Номенклатура растительных средств отхаркивающего и противовоспалительного действия с душицей обыкновенной ограничена. Душица обыкновенная - Origanum vulgare L. используется в виде настоя, в составе сбора грудного №1, а также многокомпонентного бальзама «Первопрестольный».

Растения рода Rhododendron L. в Восточной Сибири широко распространены, имеют достаточные сырьевые ресурсы, и, несмотря на проведенные ранее химико-фармакологические исследования, они не внедрены в ме-

дицинскую практику. Сравнительное фармакогностическое исследование восточносибирских рододендронов позволит решить вопрос о целесообразности использования отдельных видов в комплексном лечении заболеваний органов дыхания.

Таким образом, расширение ассортимента растительных средств, рекомендуемых в терапии заболеваний органов дыхания за счет растений родов Origanum L. и Rhododendron L., является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является комплексное фармакогностическое исследование представителей родов Origanum L. и Rhododendron L. флоры Восточной Сибири для получения новых растительных средств антимикробного, противовоспалительного и иммуномодулирующего действия, предназначенных для лечения и профилактики заболеваний органов дыхания.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

- изучить ассортимент растительных средств, применяемых для лечения заболеваний органов дыхания; дать анализ современного состояния изученности растений родов Origanum L. и Rhododendron L;

- разработать научно-методические подходы к поиску и исследованию растений Восточной Сибири как возможных источников средств для лечения и профилактики заболеваний органов дыхания;

- провести изучение химического состава душицы обыкновенной и видов рододендронов флоры Восточной Сибири; установить закономерности накопления и распределения БАВ по органам и фазам развития, обосновать рациональные сроки заготовки для указанных видов сырья;

- провести исследования по стандартизации перспективных видов сырья, разработать новую и усовершенствовать действующую нормативную документацию;

- разработать и экспериментально обосновать состав растительного сбора «Бронхофит», определить критерии подлинности, разработать методики количественного определения основных групп биологически активных веществ и нормы их содержания, составить проект Фармакопейной статьи предприятия;

- разработать технологии получения экстракционных средств из сбора «Бронхофит», травы душицы обыкновенной и побегов рододендрона Адамса, провести их стандартизацию.

Научная новизна работы

Сформулированы научно-методические подходы к изучению растений Восточной Сибири, в основе которых лежит проведение теоретических и экспериментальных исследований по поиску растений антимикробного, противовоспалительного и иммуномодулирующего действия, имеющих достаточный ресурсный потенциал, в дальнейшем осуществляется их комплексное

фармакогностическое изучение и разработка одно- и ¡многокомпонентных растительных средств.

В составе изучаемых растений выделено и идентифицировано 35 фе-нольных соединений: из них для рододендрона Адамса новых 5 фенольных соединений, для рододендрона мелколистного -10.

Впервые хромато-масс-спектрометрическим методом исследован состав эфирных масел. Идентифицировано 128 компонентов, из них для душицы обыкновенной впервые определено 22, для рододендрона Адамса -19, а рододендрона мелколистного - 34 компонента эфирного масла.

Выявлены закономерности накопления отдельных групп БАВ в душице обыкновенной, обусловленных климато-географическими факторами. Установлено, что душица обыкновенная, произрастающая в сибирском регионе, относится к хеморасе, характеризующейся низким содержанием фенольной фракции (соединений тимола и карвакрола) в составе эфирного масла, а накопление флавоноидов, производных лютеолина и апигенина, зависит от географической широты и климатических условий. Впервые изучена динамика накопления БАВ у восточносибирских видов рододендронов по органам и фазам развития, установлено, что их максимальное количество накапливают листья и побеги текущего года в период плодоношения.

Разработана рецептура грудного сбора «Бронхофит», содержащего БАВ антимикробного, противовоспалительного, иммуномодулирующего действия. Изучен его химический состав: идентифицировано 55 компонентов эфирного масла и 16 фенольных соединений, обнаружены незаменимые аминокислоты, эссенциальные для иммунной системы микроэлементы, полисахариды, витамины.

Определены оптимальные условия получения экстрактов из сбора «Бронхофит», душицы обыкновенной и рододендрона Адамса. Для них установлены показатели подлинности и предложены методики количественного определения основных групп БАВ.

Эффективность и безопасность разработанных средств подтверждена биолого-фармакологическими испытаниями.

Новизна полученных результатов подтверждена 6 патентами РФ и авторским свидетельством.

Практическая значимость

Результаты фармакогностических, химических и фармакологических экспериментов свидетельствуют о перспективности разработки новых эффективных растительных средств для лечения и профилактики заболеваний органов дыхания с использованием душицы обыкновенной дикорастущей и культивируемой, а также видов рододендронов флоры Восточной Сибири.

Разработан проект изменения № 2 к ст.55 ГФ XI «Трава душицы». Проект изменения, пояснительная записка, таблицы аналитических данных, материалы сравнительного изучения с аналогами находятся на рассмотрении в Фармакопейном комитете (письмо № 773/07 от 25.09.2008 г). Методика количественного определения суммы флавоноидов в траве душицы включена в

межгосударственный стандарт «Трава душицы» (ГОСТ 2103-93), являющийся действующим и в настоящее время.

Предложены способы получения экстрактов, которые могут быть реализованы в условиях фармацевтического производства: «Бронхофит» экстракт сухой, душицы экстракт жидкий (1:1), рододендрона Адамса экстракты жидкий (1:2) и сухой.

Разработаны проекты ФСП: на сбор «Бронхофит», «Рододендрона Адамса побеги», «Бронхофит» экстракт сухой», которые приняты в ООО «Русский лес» к рассмотрению и включены в план перспективного развития предприятия.

Материалы исследований включены в методические пособия, два из которых изданы с грифом УМО: «Охрана лекарственных и редких исчезающих растений» (Иркутск, 2002, 99 е.); «Морфологический анализ растений и лекарственного растительного сырья. Характеристика и представители основных растительных семейств» (Иркутск, 2003, 96 е.); «Микроскопические диагностические признаки лекарственных растений народной медицины Восточной Сибири» (Иркутск, 2007, 114 е.); «Фитохимический анализ растений и сырья, содержащих простые фенольные соединения и кумарины» (Иркутск, 2009, 47 е.). Материалы диссертации используются в учебном процессе при изучении фармакогнозии, основ экологии и охраны природы, а также на факультете повышения квалификации провизоров.

По результатам исследований в соавторстве опубликована монография «Дикорастущие и культивируемые лекарственные растения Восточной Сибири» (Иркутск, 2010,192 е.).

Положения, выдвигаемые на защиту:

- обоснование перспективности использования растений родов Origanum L. и Rhododendron L. флоры Восточной Сибири для разработки на их основе новых эффективных растительных средств, предназначенных для лечения заболеваний органов дыхания;

- результаты фитохимического изучения душицы обыкновенной и видов рододендронов восточносибирского региона, исследования закономерностей накопления БАВ в зависимости от некоторых экологических факторов;

- результаты исследований по стандартизации сырья душицы обыкновенной и рододендрона Адамса, материалы по разработке и совершенствованию нормативной документации на указанные виды сырья;

-, результаты теоретических и экспериментальных исследований по разработке состава и стандартизации сбора «Бронхофит»;

- результаты по разработке технологии и показателей качества экстракционных средств.

Конкретное участие автора в получении научных результатов

Основная часть исследований (85% общего объема) выполнена лично автором. Отдельные фрагменты работы по стандартизации сырья душицы

обыкновенной и побегов рододендрона Адамса проведены совместно с доцентом каф. фармакогнозии СПХФА Р.К. Шатохиной и ассистентом каф. фармакологии ИГМУ А.И. Левентой. Фармакологические исследования проведены на кафедре фармакологии и Центре лабораторной диагностики ИГМУ под руководством д-ра мед. наук, профессора JI.A Усова.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы были представлены на конференциях: - первом международном научном конгрессе «Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты» (Москва, 1994);

- «Состояние и перспективы научных исследований в области фармации» (Самара, 1996); - «Сохранение разнообразия в Байкальском регионе» (Улан-Удэ, 1996, 1997); - международном симпозиуме «Россия - Германия: история, культура, наука» (Иркутск, 1999); - международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2003); - «Лекарственные растения в фармакологии и фармации» (Барнаул, 2004); - «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2004, 2006-2009); - «Traditional medicine: a current situation and perspectives development: materials of the III international scientific conference» (Ulan-Ude, 2008);

- «Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства» (Шымкент, 2009).

Связь задач исследований с проблемным планом

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом основных научных исследований ГОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по комплексной теме: «Изучение перспективных лекарственных растений Восточной Сибири» (номер государственной регистрации 01.2.00304320).

Публикации

Содержание работы отражено в 54 научных работах, из которых 16 статей в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ, 1 монография, 6 патентов РФ на изобретение и 1 авторское свидетельство.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 310 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований (4 главы), выводов, списка использованной литературы, включающего 334 источника, из которых 81 - на иностранных языках, и приложений. Работа иллюстрирована 80 таблицами и 72 рисунками.

В первой главе дан анализ ассортимента растительных средств, применяемых при заболеваниях органов дыхания, и обоснована необходимость его расширения, а также проанализированы результаты современного состояния изученности растений родов Origanum L. и Rhododendron L.

Вторая глава содержит характеристику объектов, описание методов исследований и способы статистической обработки результатов.

Последующие 4 главы посвящены комплексному фармакогностиче-скому исследованию душицы обыкновенной и видов рододендронов. В разделе «Заключение» обсуждены полученные результаты и перспективы их практического применения, а также изложены научно-методические подходы к поиску и изучению лекарственных растений Восточной Сибири перспективных для разработки новых эффективных растительных средств, предназначенных для лечения заболеваний органов дыхания.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Образцы сырья представителей рода Rhododendron (рододендрон Адамса - Rh. adamsii Rehd., р. мелколистный - Rh. parvifolium Adams, р. даурский - Rh. dauricum L. и р. золотистый - Rh. aureum Georgi) заготавливали на территории Иркутской области и Бурятии. Сырье душицы обыкновенной -Origanum vulgare L. было собрано в Иркутской области, Ставропольском крае, Новосибирской области, а также использовались коммерческие образцы. Образцы сырья душицы обыкновенной культивируемой собирали в питомнике лекарственных растений Иркутского государственного медицинского университета.

Растительное сырье для разработки и исследования сбора «Бронхофит» было приобретено через аптечную сеть и соответствовало требованиям нормативной документации.

Анатомическое исследование растительного сырья проводили по методике, описанной в ГФ XI, вып. 1. Микропрепараты изучали и фотографировали на световом инвестированном микроскопе «Zeiss Axiovert 200» с обработкой фотографий в программе Windows Adobe Photoshop 7,0.

Спектральные исследования проводили на приборах СФ-46; СФ-26; Unicam SP-800; Specord UV-Vis, FTLR Perkin Elmer Spectr One; ЯМР-спектры снимали на приборе VXR-500S фирмы «Varían».

Состав эфирного масла исследовали на газовом хроматографе Agilent Technologies (689QN) с квадрупольным масс-спектрометром (MSD 5973) в качестве детектора, на кварцевой колонке HP- 5MS. Идентификацию соединений проводили путем сравнения полных масс-спектров и времен удерживания с соответствующими данными чистых соединений и по данным масс-спектральной библиотеки «NIST/MS».

Исследования методом ВЭЖХ проводили на приборах «GILSTON» и «Shimadzu CLASS VP V6. 12SP1» с последующей компьютерной обработкой данных исследования с помощью программы «Мультихром» для «Windows».

Качественный и количественный состав аминокислот исследовали с помощью аминокислотного анализатора «KLA-3B» (Hitachi, Япония).

Изучение элементного состава образцов проводили на квадрупольном масс-спектрометре Agilent 7500 се с использованием инертной системы ввода образца.

Золу общую и золу, нерастворимую в 10% растворе кислоты хлористоводородной, определяли на приборе ММ «Мелистон».

При разработке методик количественного определения использовали государственные стандартные образцы (ГСО): лютеолин — ФС 42-0174-06; кверцетин - ТУ 9369-139-04868244-07, гиперозид - ФС 42-0106-03 и лютео-лин-7-глюкозид - ФС 42-0175-06.

Использованы статистические методы обработки результатов химического эксперимента и биологических испытаний (ГФ XI).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Фотохимическое изучение душицы обыкновенной и видов рододендронов, произрастающих в Восточной Сибири

Выделение суммы фенольных соединений проводили по схеме (рис. 1). Для изучения состава агликонов флавоноидов в очищенных водных экстрактах изучаемых растений проводили ферментативный (душица обыкновенная) и кислотный (рододендроны) гидролиз. При разделении агликонов флавоноидов колоночной и препаративной бумажной хроматографией было выделено 8 агликонов (1-8). Исследования УФ-, ИК-спектров показали, что фла-воноиды душицы обыкновенной являются производными лютеолина, апиге-нина, хризина и 5-оксифлавона; рододендрона Адамса - производными кверцетина, мирицетина и азалеатина; рододендрона мелколистного - кверцетина, мирицетина и дигидрокверцетина; даурского - кверцетина, мирицетина; золотистого - кверцетина (табл. 1).

Далее проводили изучение состава нативных флавоноидов душицы обыкновенной, рододендронов Адамса и мелколистного. Извлечения из сырья получали по схеме (рис. 1), разделение флавоноидов проводили на колонках, заполненных полиамидом.

Было выделено в индивидуальном состоянии 13 веществ флавоноидной природы. Вещества (9), (12), Q5), (16), (20) являются агликонами. По спектральной характеристике, физико-химическим свойствам и в сравнении с заведомо известными веществами идентифицированы соединения: (9) - 5-оксифлавон, (12) - лютеолин, (15) - 7,3',4'-триокси-5-метоксифлавонол (аза-леатин), Ц6) - 5,7,3',4'- тетраоксифлавонол (кверцетин), (20) - 5,7,3',4',5'-пентаоксифлавонол (мирицетин) (табл. 2).

Рис. 1. Схема выделения индивидуальных фенолъных соединений из душицы обыкновенной и видов рододендронов

Таблица 1

Основные свойства агликонов флавонондов, выделенных из растений родов Origanum L. и Rhododendron L. после гидролиза экстрактов

Вещество и его шифр Формула Т.пл.°С Полосы поглощения в УФ-спектре, нм Источник выделения

Апигенин (Г) С15Н10О5 340 338, 270 Origanum vulgare

Лютеолин (2) CisHioOe 330 350,293 пл., 255,266 пл. Origanum vulgare

Хризин (3) С15Н10О4 290 313, 270, 245 пл. Origanum vulgare

5-оксифлавон (4) С15Н10О3 158-160 338, 296, 268 Origanum vulgare

Кверцетин (5) Cl5H,o07 316318 370, 258,274 пл. Rhododendron adamsii Rhododendron dauri-cum Rhododendron aureum Rhododendron parvifo-lium

Мирицетин © CisHgOs sso-ss? 374, 254,270 пл. Rhododendron adamsii Rhododendron dauri-cum Rhododendron parvifo-lium

Азапеатин (2) С16Н12О7 317320 364, 252, 272 пл. Rhododendron adamsii

Дигидрокверцетин (8) С15Н12О7 221239 290, 327 пл., 262 пл. Rhododendron parvifo-lium

Для идентификации гликозцдов проводили кислотный и ферментативный гидролиз, регистрировали УФ-, ИК-спектры.

По результатам проведенного анализа в сравнении с достоверными образцами и по данным литературы были идентифицированы соединения: (10) -апигенин-7-В-0-глюкопиранозид (космосиин), (Д) - лютеолин-7-6-0-глюкуронозид, ЦЗ) - хризин-7-В-0-глюкуронозид, (17) - азалеатин-З-В-О-глюкопиранозид, (18) - кверцетин-3- В-О-галактопиранозид (гиперозид), (19) - кверцетин-З-а-Ь-арабофуранозид (авикулярин), (21) -дигидрокверцетин -3-В-Ь-арабофуранозид. Соединение (14) отнесено к гликозидам (апигенина) (табл. 2).

Идентификацию фенолкарбоновых кислот проводили по температуре плавления, хроматографическому поведению, продуктам расщепления, данным элементного анализа, УФ- и ИК-спектроскопии (табл. 3).

Таблица 2

Основные свойства нативных флавонондов, выделенных из расте-_нчй родов Origanum L. и Rhododendron L._

Вещество и его шифр Формула Т.пл°С Полосы поглощения в УФ-спектре, нм Источник выделения

5-оксифлавон (9) С15Н10О3 158160 338, 296, 268 О. vulgare

Космосиин (апиге-нин-7-ß-D-глюкопиранозид) (10) С21Н20ОЮ 178 337,330, 267,284 О. vulgare

Лютеолин-7-ß-D-глюкуронозид (11) с2,н18о12 190193 350, 257,267 О. vulgare

Лютеолин (12) С15Н10О0 330 350, 293, 255, 266 пл. О. vulgare

Хризин-7-ß-D-глгокуронозид (13) C2iHi8Oio 224226 306 пл., 270 О. vulgare

Гликозид апигени-на(_14) - - 338, 270 О. vulgare

Азалеатин (¿5) С16Н12О7 317320 364, 252, 272 пл. Rh. adamsii

Кверцетин (16) С15Н10О7 316318 370, 258, 274 пл. Rh. adamsii Rh. parvifolium

Азалеатин-3-ß-D-глюкопиранозид (17) С22Н22О12 359, 265 Rh. adamsii

Гиперозид (квер- цетин-3-ß-D-галактопиранозид) (18) C2iH2o012 236237 362, 257, 269 пл. Rh. adamsii Rh. parvifolium

Авикулярин (квер- цетин-3-a-L-арабофуранозид) (19) C2oHi8On 216217 360, 260, 270 пл. Rh. adamsii Rh. parvifolium

Мирицетин (20) CisHsOs 350357 374, 254, 270 пл. Rh. adamsii Rh. parvifolium

Дигидрокверцетин-3-ß- L -арабофуранозид (21) С20Н16ОЦ 295, 245 Rh. parvifolium

Таблица 3

Физико-химические свойства ароматических кислот, выделенных из растений родов Origanum L. и Rhododendron L.

Соединение и шифр Формула Т.пл.иС Значения Rf Окраска пятен 2-10° M р-р в абс. этаноле Источник выделения

1 1 2 1 3 УФ-свет 1 + пары NH3

Производные бензойной кислоты:

Ванилиновая (23) C8Hs04 201-204 0,40 0,29 0,50 голубая голубая фл. 260,290 пл. Origanum vulgare Rh. adamsii

Протокатеховая (24) С7Н6О4 196-198 0,86 0,23 0,64 фиолетовая фиолетовая фл. 217,258, 295 пл. Origanum vulgare Rh. adamsii

П-оксибен-зойная (25) С7Н603 212-214 0,88 0,39 0,58 фиолетовая фиолетовая 255 Origanum vulgare Rh. adamsii

Сиреневая (26) С9Н11О4 - 0,82 0,22 0,53 - - 219,272 Origanum vulgare

Производные коричной кислоты

Феруловая (27) С10Н10О4 - 0,84 0,32 0,63 синяя фиолетовая 242, 300 пл., 328 Rh. adamsii

Кофейная (28) с9н8о4 196-198 0,69 0,25 0,47 сине-голубая желто-зеленая фл. 245, 290пл, 330 Origanum vulgare Rh. adamsii

Синаповая (29) СпН1205 - 0,57 0,25 0,66 сине-зеленая сине-зеленая фл. 235, 260, 300 Rh. parvifolium

Хлорогеновая (30) С16Н603 203-204 0,63 0,33 (0,55) 0,74 сине-голубая зелено-голубая фл. 245, 300 пл., 326 Origanum vulgare Rh. parvifolium

Коричная (31) c9Hso2 133 0,81 0,27 0,56 - - 275 Origanum vulgare

Системы: 1 - н-бутанол-лед. кислота уксусная -вода (4:1:2); 2 - 2% кислота уксусная; 3-15% кислота уксусная.

Наличие ароматической части в молекуле и карбоксильные группы подтверждаются соответствующими полосами поглощения в ИК-спектрах. Идентифицированы производные бензойной кислоты: (23) - ванилиновая, (241 — протокатеховая, (25) - п-оксибензойная, (26) — сиреневая; коричной кислоты: (27) - феруловая, (28) - кофейная, (29) - синаповая, (30) - хлороге-новая, (31) - коричная.

Соединение (32) имеет температуру плавления 67-68сС, в УФ-спектре (ЕЮН) максимумы поглощения 'ктш: 275, 310 им, в ИК-спектре имеются частоты характерные для кумарина. Соединение (32) идентифицировано как кумарин. Соединение (33) имеет температуру плавления 269-270°С, в УФ-спектре (ЕЮН) имеются максимумы поглощения Х^: 230, 250, 271, 316; + натрия этилат - 240, 390. Соединение (33) идентифицировано как 6,7-диоксикумарин (эскулетин).

Идентификация соединения (22) проведена по данным УФ-, ИК- и ЯМР-спектроскопии. В УФ-спектре (ЕЮН) имеется максимум поглощения при 268 нм, от прибавления натрия этилата наблюдается гипсохромный сдвиг до 263 нм. В ИК-спектре имеются максимумы поглощения 1680-1545 см - валентные колебания -С=С-, 1680 см - альдегидная группа, 3380-3490 см валентные колебания ОН-групп.

При анализе ПМР-спектра вещества (22) выявлен тип соединения: АгОН (8, м.д. 4,62); АгН (5, м.д. триплет в области 6,69-6,71 и дуплет 7,52-7,54). Из анализа ЯМР 13С спектра выявлен тип соединения: АгОН (5, м.д. 128,7); АгХ в мета- положении (б, м.д. 130,4); АгХ в орто-положении (5, м.д. 116,4); R-С=0 (5, м.д. 181,3). На основании проведенных исследований соединение (22) идентифицировано как 2,3-диоксибензальдегид.

Использование ВЭЖХ в определении некоторых БАВ рододендрона Адамса

Метод ВЭЖХ более информативен и позволяет охарактеризовать основные компоненты, содержащиеся в смеси. Изучение состава спиртового извлечения рододендрона Адамса проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы «CILSTON» (рис. 2)

В результате были идентифицированы соединения: олеаноловая кислота (0,06%); урсоловая кислота (5,64%); В-ситостерин (17,35%); 2,3- диокси-бензальдегид (1,50%); арбутин (3,98%); кемпферол (0,49%); кофейная кислота (2,43%); гиперозид (0,29%); рутин (16,52%); нарингенин (15,31%); кверце-тин (6,83%).

Таким образом, в результате фитохимического исследования для рододендрона Адамса впервые идентифицировано 5, а для рододендрона мелколистного -10 фенольных соединений.

nua

Рис. 2. Хроматограмма спиртового извлечения побегов рододендрона Лдамса

Изучение компонентного состава эфирных масел

В составе эфирного масла душицы обыкновенной дикорастущей было обнаружено 136 компонентов (идентифицировано 33), в культивируемой -155 компонентов (идентифицировано 39). Состав эфирного масла душицы обыкновенной в период цветения в условиях Восточной Сибири представлен в основном сесквитерпенами (31 компонент). Из монотерпенов идентифицировано 9 компонентов, а фенолы представлены 2 соединениями.

По нашим данным в составе эфирного масла душицы обыкновенной дикорастущей содержание фенольной фракции невысокое, суммарное количество тимола и карвакрола составляет 1,34%. Основными компонентами эфирного масла являются: монотерпены - (-)-4-терпинеол (14,39%), а-терпинеол (5,14%), fi-линалоол (2,0%); сесквитерпены - кариофиллен оксид (27,20%), (-)-спатуленол (7,89%), (+,-)-В-бисаболен (2,84%), 12-оксабшдикло[9.1.0]додека-3,7-диен (3,58%), кариофиллен (2,59%) (рис. 3).

В эфирном масле душицы обыкновенной культивируемой сумма фенолов составляла только 0,27%. Основные компоненты эфирного масла: монотерпены - (-)-4-терпинеол (2,15%), 6-линалоол (1,74%), а-терпинеол (0,85%); сесквитерпены - (-)-спатуленол (25,02%), кариофиллен оксид (13,77%), ка-

риофиллен (5,62%), 12-оксабицикло[9.1.0]додека-3,7-диен (4,00%), (+,-)-ß-бисаболен (3,70%), а-кариофиллен (1,22%) (рис. 4).

Кроме того, в анализируемых образцах эфирного масла были обнаружены другие компоненты, которые приводятся в литературе как характерные для душицы обыкновенной: р-цимен, 1,8-цинеол, (-)-В-боурбонен, ß-кариофиллен, р-цимен-8-ол и др. (Ткачев A.B., 2002). Впервые в эфирном масле душицы обыкновенной идентифицировано 22 компонента.

Качественный состав эфирного масла душицы обыкновенной, культивируемой в условиях Восточной Сибири, незначительно отличается от душицы обыкновенной дикорастущей этого же региона. Разница основных компонентов эфирного масла заключается в их количественных соотношениях.

Таким образом, нами установлено, что душица обыкновенная, произрастающая и культивируемая в сибирском регионе по содержанию фенолов в составе эфирного масла относится к четвертой хеморасе, а именно, с низким содержанием тимола и карвакрола, что характерно также для душицы обыкновенной из европейской части России и Западной Сибири (Ткачев A.B., 2002; Ткаченко Г.К. в соавт., 2002). В составе эфирного масла душицы обыкновенной преобладают сесквитерпены.

/Ч1 fi i т и'*;

Рис. 3. Хроматограмма компонентного состава эфирного масла душицы обыкновенной дикорастущей

В составе эфирного масла рододендрона Адамса было обнаружено 53 компонента, методом хромато-масс-спектрометрии идентифицировано 27

"пс/телладао

Гкмэгоол 4-Терп*«ол аТЕТшвзл

ЗОпЕЮТ РЦ«**! у , I-

Отат^тэ-сл

Ке**ХЭС>ТПЗН СКО/Д

К^ИОфТТЕН

ХДи

"Г"1 . ....

аоо юао 1ьоо гпоо 2ЬОз эаао зьоо чаоо чйоо эаао еьаа

Рис. 4. Хроматограмма компонентного состава эфирного масла душицы обыкновенной культивируемой

компонентов. В составе монотерпенов идентифицировано 3 компонента, а в составе сесквитерпенов 24 соединения.

Преобладающими компонентами эфирного масла являются гермакрон (26,24%), ±-транс-неролидол (18,44%), селин-3,7(11)-диен (8,28%), гвайя-3,9-диен (5,8%), (+)-ледол (4,56%), фенилметилкетон (3,89%), (+)- леден (2,5%), Ш-циклопроп [е] азулен, декагидро - 1,1,7 - триметил - 4 - метилен (2,39%).

В составе эфирного масла рододендрона мелколистного было установлено 134 компонента, идентифицировано 29. Все компоненты эфирного масла рододендрона мелколистного отнесены к сесквитерпенам.

Преобладающие компоненты эфирного масла рододендрона мелколистного: изоаромаденрен эпоксид (13,78%), патчоулол (4,928%), а-кадинол (4,72%), т-кадинен (4,23%).

Впервые в составе эфирного масла рододендрона Адамса идентифицировано 19, а рододендрона мелколистного - 34 компонента.

Закономерности накопления БАВ в надземных органах душицы обыкновенной и видах рододендронов

Душица обыкновенная характеризуется изменчивостью химического состава под влиянием условий внешней среды, что сказывается на качественном и количественном содержании БАВ, а также, учитывая, что при вве-

дении растения в культуру могут наблюдаться изменения его химического состава, нами исследованы закономерности накопления основных групп БАВ душицы обыкновенной дикорастущей и культивируемой.

В надземных органах душицы обыкновенной, несмотря на различное количественное содержание флавоноидов, обращает на себя внимание закономерность накопления производных лютеолина и апигенина (табл. 4).

Для средней полосы России и сибирского региона характерно соотношение лютеолина и апигенина в среднем как 75:25 (или 3:1), т.е. производных лютеолина накапливается в 3 раза больше. Для южных районов характерно соотношение как 58:42 (или 1,4:1). Таким образом, у душицы обыкновенной по содержанию производных лютеолина и апигенина имеется две хе-морасы (с соотношением указанных соединений - 3:1 и 1,4:1).

Увеличение содержания производных лютеолина в душице обыкновенной в средней полосе России и сибирском регионе, по нашему мнению, связано с приспособлением этого растения к более суровым климатическим условиям (низкие зимние температуры, короткий летний период).

Таблица 4

Количественное содержание флавоноидов в надземных органах душицы обыкновенной в период цветения из различных географических мест

Место сбора Содержание, в % Соотношение производных лютеолина и апигенина

Производные лютеолина Производные апигенина Сумма флавоноидов, производных лютеолина и апигенина

Иркутская обл., с. Ново-Грудинино, 0,3 8±0,02 0,13±0,03 0,51 78,7:21,3

Иркутская обл., с. Каменка 0,58±0,03 0,21±0,02 0,79 73,4:26,6

Иркутская обл., п. Куйтун 0,71±0,0б 0,26±0,02 0,97 74,2:25,8

Новосибирская обл.,с. Карпы-сак 0,31±0,04 0,10±0,03 0,41 75,6:34,4

Московская обл. 0,37±0,02 0,14±0,01 0,51 72,4:27,6

Ставропольский край, г. Армавир 0,49±0,03 0,36±0,03 0,85 57,7:42,3

Азербайджан, окрести, г. Баку 0,52±0,03 0,38±0,02 0,90 57,8:42,2

При изучении количественного содержания флавоноидов спектрофо-тометрическим методом, а дубильных веществ — перманганатометрическим методом установлено, что в надземных органах душицы обыкновенной культивируемой и дикорастущей наибольшее количество этих соединений накапливается в листьях.

Изучение динамики накопления БАВ по фазам вегетации показало, что в период цветения отмечается не только максимальное содержание эфирного масла, но также флавоноидов и дубильных веществ. Душица обыкновенная, культивируемая в условиях Восточной Сибири по содержанию эфирного масла, флавоноидов и дубильных веществ равноценна душице обыкновенной дикорастущей и может бьггь рекомендована для использования в медицинской практике (табл. 5).

Таблица 5

Количественное содержание БАВ в траве душицы обыкновенной в период цветения из различных мест сбора

Место сбора Содержание, в %

Эфирное масло Флавоноиды Дубильные вещества

общие полифенолы осаждаемые раствором желатина

Иркутская обл. (культивируемая) 0,13 1,65±0,06 13,53±1,30 5,12±0,16

Иркутская обл. (дикорастущая) 0,10 1,55±0,04 12,33±1,38 4,66±0,15

Новосибирская обл. (дикорастущая) 0,12 1,45±0,03 10,17±0,89 4,12±0,18

Ставропольский край (дикорастущая) 0,10 1,66±0,07 13,63±0,29 5,34±0,20

Флавоноиды кверцетин, гиперозид, дигидрокверцетин-З-В-Ь-арабинозид содержались во всех надземных органах исследуемых видов рододендронов. Накопление авикулярина было характерно для листьев этих растений, листья рододендрона Адамса содержали также азалеатин-З-В-О-глюкозид. Рутин был обнаружен в листьях рододендронов даурского, золотистого и Адамса.

В цветках рододендрона даурского накапливается цианидин-3-рамно-глюкозид, в листьях рододендрона мелколистного цианидин-З-а-Ь-арабшю-зид, а в цветках - хризантемин.

Цветки рододендрона даурского содержали суммы антоцианов 3,58%, листья рододендрона мелколистного - 2,87%, цветки - 2,00%, а стебли -0,75%.

В исследуемых видах рододендронов максимальное количество дубильных веществ и флавоноидов накапливается в цветках, листьях и стеблях текущего года (рис. 5).

2,5

1,5

1 -

0,5

fll; г,-

Ц;

С1

46

Л1; 2,13

Li; 1,1 В

1.41

сс

; 0,85

С]

Л1; 1,67 Ц; 1 .Щ:

1,07

. ГО: 0.9:

; 1,1

0.53

с :>; 0,2

18 16

# « 14

й

5 12

4)

3 10

1)

ш я а 8

I 6

с я

2 -

Ц; 6,36

ПI; 11,3 Sfel

р¥п

4,99 3,93

2,26

; 7,6

rb

AI; Г4,52

СС

Л1; 6,73

II; 4,J!i rb

; 2,87

4,76

Hb

СС; 2,37

£

Ш

ее

4,54

IV

Рис 5. Динамика накопления флавоноидов и дубильных веществ (общие полифенолы) в надземных органах рододендронов: I - Адамса, II- мелколистного, III- даурского, IV- ЗОЛОТИСТОГО. Ц- цветки, J11 - листья первого года жизни, Л2 - листья второго года жизни, С1 - стебли текущего года, С2- стебли второго года жизни, СО - стебли одревесневшие

Максимальное содержание дубильных веществ и флавоноидов в надземных органах рододендронов приходилось на период цветения и плодоношения, снижение же их количества было характерно в период завязывания и созревания плодов. Только у рододендрона золотистого максимум содержания простых фенолов наблюдался в фазу завязывания и созревания плодов. В

качестве лекарственного сырья рододендронов Адамса, даурского и мелколистного нами рекомендуется использовать побеги текущего года, у рододендрона золотистого - листья 2 и 3 года жизни. Сроки заготовки сырья - период плодоношения, когда заканчивается основной прирост побегов текущего года жизни. Данные рекомендации способствуют быстрому восстановлению зарослей после заготовки сырья.

В значительном количестве накапливают дубильные вещества рододендроны золотистый и мелколистный, простые фенольные соединения - рододендроны золотистый и даурский, флавоноиды и эфирное масло (более 0,8%) накапливают рододендроны Адамса, мелколистный и даурский (табл. 6).

Таблица 6

Количественное содержание БАВ в надземных органах рододендронов в период плодоношения

Вид Место сбора Содержание в %

Эфирное масло Флавоноиды Простые фенолы Дубильные вещества

общие полифенолы осаждаемые раствором желатина

Р. Адамса (побеги) Бурятия, окр. п. Монды 1,20±0,09 2,19±0,025 4,27±0,29 6,24±0,10 4,30±0,10

Р. мелколистный (побеги) Иркутская обл. окр. п. Култук 1,02±0,10 1,72±0,09 5,58±0,15 9,68±0,53 7,34±0,17

Р. даурский (побеги) Иркутская обл., окр. г. Тулупа 0,08±0,01 1,82±0,05 10,20±0,35 4,97±0,24 2,85±0,11

Р. золотистый (листья) Иркутская обл., Нижиеу-депский р-он следы 1,19±0,11 10,66±1,13 15,28±0,76 11,76±0,57

Стандартизация и разработка нормативной документации на сырье душицы обыкновенной и рододендрона Адамса

Исследования заключаются в разработке методик качественного и количественного определения основных групп БАВ, отвечающих за фармакологическую активность, определении числовых показателей, а также макро и микроскопических признаков сырья.

Стандартизация сырья душицы обыкновенной проводится в соответствии с ГФ XI по содержанию эфирного масла (для цельного сырья не менее 0,1 %, для измельченного сырья - не менее 0,08 %).

По результатам фармакологических исследований, проведенных нами и другими исследователями, установлено, что флавоноиды душицы обыкновенной обладают противовоспалительной, антиоксидантной, спазмолитиче-

ской активностью, что обеспечивает широту фармакотерапевтического действия. Для повышения качества сырья душицы обыкновенной нами предложено проводить стандартизацию по дополнительному показателю - содержанию суммы флавоноидов.

Разработаны и предложены методики качественного обнаружения флавоноидов: проба СЫпос1а; тонкослойная хроматография на пластинках «Си-луфол» в системе хлороформ-этанол-вода (52:28:7) с детекцией основных флавоноидных соединений лютеолина, лютеолин-7-глюкуронозида и космо-сиина по окраске пятен и значению Яб с использованием ГСО лютеолина.

Количественное содержание суммы флавоноидов предлагается проводить спектрофотометрическим методом. При добавлении к спиртовому извлечению душицы обыкновенной раствора алюминия хлорида в УФ спектре появляется максимум поглощения при 400 нм, который совпадает с максимумом поглощения спектра лютеолина в присутствии алюминия хлорида, поэтому в качестве стандартного образца нами был использован ГСО лютеолина. Было установлено, что оптимальным экстрагентом является 60% спирт этиловый, максимальный выход флавоноидов из сырья с размером частиц 1-2 мм достигается через 90 минут с последующим наступлением равновесия, соотношение сырья и экстрагента 1:50, устойчивое окрашивание извлечения наступает при добавлении 2 мл 2% раствора алюминия хлорида через 30 минут.

Относительная ошибка среднего результата с достоверной вероятностью 95% не превышала ±5,52%. Оценка основных валидационных параметров предлагаемой методики позволила сделать вывод о ее соответствии критериям: правильность, прецизионность, специфичность и линейность.

Экспериментальные исследования по изучению стабильности сырья душицы обыкновенной по содержанию суммы флавоноидов показали, что количество флавоноидов не снижается в течение 2-х лет наблюдения, что соответствует срокам годности сырья травы душицы (ст. 55 ГФ XI). Таким образом, в результате проведенных исследований нами предложено проводить стандартизацию сырья душицы обыкновенной, наряду с определением эфирного масла, по содержанию флавоноидов (табл. 7).

Для анализа сырья рододендрона Адамса были разработаны и обоснованы методики качественной реакции и тонкослойной хроматографии флавоноидов (с детекцией основных соединений - кверцетина и гиперозида).

Стандартизацию сырья рекомендовано проводить по содержанию эфирного масла и флавоноидов. Содержание эфирного масла в сырье предлагается проводить методом 1 (ГФ XI) в навеске сырья 25 г при степени из-мельченности сырья 3 мм, время перегонки -2 ч.

Разработана методика спектрофотометрического количественного определения суммы флавоноидов. Максимумы поглощения извлечения из побегов рододендрона Адамса и спиртового раствора кверцетина при добавлении к ним алюминия хлорида совпадают при длине волны 430 нм, поэтому ГСО кверцетина был выбран нами в качестве стандартного образца.

Таблица 7

Показатели и нормы качества травы душицы обыкновенной (проект изменения № 2 к ст. 55 ГФ XI «Трава душицы»)_

Разделы ФС Метод анализа Нормы

Качественные реакции

Флавоноидм Качественная реакция (проба Chi-noda) Красное окрашивание

Хроматографии (ТСХ) Обнаруживается 3 пятна

Числовые показатели Раздел дополнен нормой содержания суммы флавоноидов

Количественное определение

Цельное сырье

Эфирное масло, %, не менее Метод 2, ГФ XI 0,1

Сумма флавоноидов, %, в Спектрофото- 1,0

пересчете на лютсолии, не мстрия

менее

Измельченное сырье

Эфирное масло, %, не менее Метод 2, ГФ XI 0,08

Сумма флавоноидов, %, в Спектро фото- 1,0

пересчете на лютеолин, не метрия

менее

Примечание: жирным шрифтом в таблице выделены показатели и нормы, которые для данного вида лекарственного растительного сырья предложены впервые

Установлены оптимальные параметры экстракции сырья побегов рододендрона Адамса: размер частиц сырья 1 мм, соотношение сырья и экстра-гента 1:100, экстрагент - 90% спирт этиловый, содержащий 1% HCl, время экстракции 90 мин. Устойчивое окрашивание извлечения наступает через 30 минут при добавлении 1 мл 1% раствора алюминия хлорида.

Относительная ошибка среднего результата с достоверной вероятностью 95% не превышала ±5,20%. Валидационная оценка методики количественного определения суммы флавоноидов в побегах рододендрона Адамса показала соответствие критериям: правильность, прецизионность, специфичность и линейность. Были установлены также другие числовые показатели, нормы качества и сроки годности сырья (табл. 8).

Душица обыкновенная является пластичным видом, поэтому были изучены микроскопические признаки душицы обыкновенной, выращенной в условиях Восточной Сибири. Исследования показали идентичность анатомического строения душицы обыкновенной культивируемой дикорастущим образцам сырья и соответствие их разделу «Микроскопия» нормативной документации (ст.55 ГФ XI).

Для определения анатомо-диагностических признаков сырья рододендрона Адамса было проведено сравнительное анатомическое изучение надземных органов других видов рододендронов, произрастающих в сибирском регионе (рододендронов даурского, золотистого и мелколистного). В результате установлено, что микродиагностика побегов рододендрона Адамса мо-

жет проводиться по листьям и почечным чешуйкам, т. к. в их строении имеются отличительные признаки от близких видов (строение желёзок, наличие сосочковидного эпидермиса, дендроидных волосков).

Таблица 8

Требования и нормы на сырье «Рододендрона Адамса побеги»

ПОКАЗАТЕЛИ НОРМЫ

цельное | измельченное

Качественная реакция (проба Chinoda) Красное окрашивание

Хроматография (ТСХ) Обнаруживается 3 пятна

Сумма флавонондов, в пересчете на кверце-тин %, не менее 1,6 1,6

Эфирное масло, %, не менее 0,1 0,1

Влажность, %, не более 13 13

Зола общая, %, не более 4 4

Зола, нерастворимая в 10% р-ре кислоты хлористоводородной, %, не более 1 1

Листьев пожелтевших, %, не более 5 5

Ветвей с буровато-серой корой, %,не более 10 10

Частиц, не проходящих сквозь сито диаметром 5 мм, %, не более 5

Частиц, проходящих сквозь спто диаметром 0,5 мм, %, не более 10

Органическая примесь, %, не более 1 1

Минеральная примесь, %, не более 0,5 0,5

Срок годности 2 года 2 года

Разработка рецептуры и стандартизация сбора «Бронхофит»

Разработка рецептуры грудного сбора «Бронхофит» (трава душицы 30,0; трава чабреца 20,0; листья подорожника 20,0; трава череды 20,0; плоды шиповника 10,0) проводилась на основе изучения сведений об этиологии и патогенезе заболеваний органов дыхания, состава биологически активных веществ растений, опыта их использования в академической и традиционной медицине. Оптимальное соотношение компонентов сбора устанавливали экспериментально по результатам фармакологического изучения вариантов сбора.

При изучении химического состава в сборе были обнаружены эфирное масло, флавоноиды, полисахариды, фенолкарбоновые кислоты, тритерпено-вые соединения, аскорбиновая кислота, каротиноиды.

Методом хромато-масс-спектрометрии в составе эфирного масла было идентифицировано 55 компонентов. Основными компонентами являются р-цимен (24,75%), карвакрол (18,74%), у-терпинен (10,01%), борнеол (9,94%), 1,8 цинеол (5,74%), тимол (5,27%), терпинеол-4-ол (4,46%), кариофиллен оксид (2,69%), камфен (1,38%) (рис. 6).

АхлЛзпое

Т1<2 /ч^ >.}\МХ(1)

1.&2+07

1.&М07

1.2*3-Ю7 1еЮ7

аоооооо асюсххю

40СОХО

2000000

^ [| 5г, I

Бор^ап

К^таэкрсп

М1

ТергтнэьИсп

,1 1ц1 ИЩ]

500 1й(Х) 1500 20.00 2^00 За 00 35-00 4СЮО "13.00 3100 3500

Рис. 6. Хроматофамма компонентного состава эфирного масла сбора «Бронхофит»

Содержание фенольных соединений исследовали методом ВЭЖХ на хроматографе «СИ^ЙТСЖ» (рис. 7).

Рис. 7. Хроматофамма спиртового извлечения сбора «Бронхофит»

В составе сбора идентифицировали 16 фенольных соединений: флаво-ноиды - рутин, лютеолин-7-глюкуронозид, лютеолин, иарингенин, дигидро-кверцетин, кверцетин, кемпферол, апигенин; кислоты - галловая, хлорогено-вая, феруловая, коричная; кумарины - дигидрокумарин, эскулетин; танин, эпикатехин. Методом ТСХ установили содержание лютеолин-7-глюкозида, космосиина, кофейной кислоты.

С помощью аминокислотного анализатора в сборе идентифицировали 17 аминокислот, среди них 8 незаменимых аминокислот.

При изучении элементного состава в сборе было обнаружено 9 макро и 54 микроэлемента. Среди них содержатся эссенциальные для иммунной системы микроэлементы: Fe, I, Cu, Zn, Со, Cr, Мо, Se, Mn, Li.

По содержанию токсичных элементов сбор «Бронхофит» соответствует ПДК, указанным в СанПиН 2.3.2.1078-01 от 2001 года: свинца не более 6 мг/кг (найдено 1,6 мг/кг), мышьяка не более 0,5 мг/кг (найдено 0,16 мг/кг), кадмия не более 2 мг/кг (найдено 0,044 мг/кг), ртути не более 0,1 мг/кг (найдено 0,018 мг/кг).

В анализируемом сборе было найдено экстрактивных веществ, извлекаемых 30% спиртом этиловым 37,77±1,9%, эфирного масла - 0,12%, дубильных веществ (общие полифенолы) 9,57±0,28%, полисахаридов (гравиметрическим методом) - 7,83±0,28%, флавоноидов - 1,28±0,07%, аскорбиновой кислоты -109±0,10 мг%, органических кислот-2,83±0,18%.

Стандартизацию сбора, исходя из количественного содержания БАВ и их фармакологической активности, предложено проводить по содержанию эфирного масла, флавоноидов и полисахаридов, как групп веществ, определяющих фармакотерапевтическое действие.

В ходе проведения работы по стандартизации были определены внешние и анатомо-диагностические признаки компонентов сбора «Бронхофит». Предложены качественные реакции обнаружения флавоноидов (проба Chino-da), полисахаридов и восстанавливающих Сахаров.

Количественное содержание эфирного масла в сборе предлагается проводить методом 2 (ГФ XI) в навеске 25 г со степенью измельченности сырья 3 мм, время перегонки 2 часа.

Для количественного определения суммы флавоноидов нами разработан спектрофотометрический метод. При изучении спектральной характеристики спиртового извлечения сбора в присутствии алюминия хлорида установлено, что максимум поглощения находится при 385 нм и совпадает с максимумом ГСО лютеолин-7-глюкозида, который был использован нами в качестве стандартного образца.

Было установлено, что оптимальными параметрами экстракции сырья являются: 60% спирт этиловый, измельченность сырья 1 мм, соотношение сырья и экстрагента 1:100, время экстракции 60 мин. Количество комплексо-образователя 1% раствора алюминия хлорида 1 мл, комплекс становился стабильным через 40 минут. Относительная ошибка среднего результата с достоверной вероятностью 95% не превышала ±5,47%.

Для количественного определения суммы полисахаридов предложен спектрофотометрический метод с использованием кислоты пикриновой. При разработке методики были изучены оптимальные условия экстракции и осаждения водорастворимого полисахаридного комплекса. Размер частиц сырья должен быть 1 мм, соотношение сырья и экстрагента 1:25, время экстракции 2ч, соотношение извлечения и 95% спирта этилового, необходимого для осаждения полисахаридов 1:3. Время кислотного гидролиза суммы полисахаридов 2 ч.

Относительная ошибка среднего результата с достоверной вероятностью 95% не превышала ±3,24%. Валидационная оценка методик количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на люгеолин-7-глюкозид и суммы полисахаридов показала их соответствие критериям: правильность, прецизионность, специфичность и линейность.

По результатам анализа 5 серий сбора «Бронхофит» были определены числовые показатели и нормы качества, установлен срок годности сбора (табл. 9).

Таблица 9

Требования и нормы на сбор «Бронхофит»

Показатели Нормы

Качественные реакции: Флавоноиды (проба Chinoda) Полисахариды Восстанавливающие сахара Красное окрашивание Появление осадка Оранжево-красный осадок

Влажность, %, не более 13

Эфирное масло, %, не менее 0,08

Сумма флавоноидов, %, не менее 1,2

Сумма моносахаридов после гидролиза 3,5

полисахаридов, % не менее

Зола общая, %, не более 10

Зола, нерастворимая в 10% р-ре кислоты хлористоводородной, %, не более 3

Побуревших и почерневших частей сбора, %, не более 5

Частиц, не проходящих сквозь сито диаметром 7 мм, %, не более 5

Частиц, проходящих сквозь сито диаметром 0,5 мм, %, не более 10

Органическая примесь, %, не более 1

Минеральная примесь, %, не более 1

Срок годиости 2

Разработка и стандартизация фитоэкстракционных средств из сбора

«Бронхофит», душицы обыкновенной и рододендрона Адамса

а) «Бронхофит» экстракт сухой

Растительные сборы используются в виде водных извлечений, которые имеют небольшой срок годности и неточны в дозировании. Для увеличения сроков годности и точности дозирования удобны для применения экстракты сухие, поэтому из сбора «Бронхофит» нами предложена технология получения экстракта сухого. Экспериментально были подобраны оптимальные условия экстракции: измельченность сырья душицы, чабреца, подорожника, череды >1,0<2,0 мм, плодов шиповника >0,5<1,0; экстрагент 30% спирт этиловый, соотношение сырья и экстрагента 1:12, температура экстракции 60°С, время экстракции на 1-ой ступени 2 часа, на 2-ой - 1,5 часа, на 3-ей - 1 час. Эффективность экстракции по флавоноидам составляла 66%, по экстрактивным веществам - 86,42%.

Для определения подлинности экстракта сухого были разработаны методики качественных реакций обнаружения флавоноидов, полисахаридов и восстанавливающих Сахаров.

Разработка методик количественного определения суммы флавоноидов и суммы полисахаридов проводилась с учетом принципов сквозной стандартизации. Поэтому в их основу были положены методики количественного определения, рекомендованные для стандартизации сбора «Бронхофит». Относительная ошибка методики количественного определения суммы флавоноидов не превышала ±3,90% (табл. 10), а суммы полисахаридов - ±3,93%. Отсутствие систематической ошибки в указанных методиках подтверждено «опытами с добавками» ГСО лютеолин-7-глюкозида и PCO глюкозы.

Таблица 10

Метрологические характеристики методик количественного определения суммы флавоноидов в экстрактах (Р 95%)

Экстракт Статистические параметры

f X Sx t(P,f) Ах Е

«Бронхофит» 8 2,31 0,0380 2,36 0,09 ±3,90

экстракт су-

хой

душицы экс- 8 0,78 0,0073 2,36 0,017 ±2,18

тракт жидкии

рододендрона Адамса экс- 8 6,85 0,0930 2,36 0,22 ±3,21

тракт сухой

рододендрона Адамса экс- 8 0,84 0,0090 2,36 0,02 ±2,38

тракт жидкии

Определение показателей и норм качества проводили на 5 сериях экстракта сухого. Сроки годности экстракта сухого устанавливали методом ускоренного старения. Разработанные показатели и нормы качества экстракта сухого включены в проект ФСП (табл. 11).

Таблица 11

Показатели и нормы качества «Бронхофит» экстракта сухого

ПОКАЗАТЕЛИ МЕТОДЫ НОРМЫ

Описание Визуальный Порошок коричневого или темно-коричневого цвета, со специфическим ароматным запахом. Гигроскопичен.

Подлинность Качественные реакции: 1. на флавоноиды (проба СЬ1по(1а) 2. на полисахариды 3. на восстанавливающие сахара Красное окрашивание Хлопьевидный осадок Красно-оранжевый осадок

Влага ГФ XI, вып. 2. с. 160 Не более 5%

Количественное определение: Сумма флавоноидов в пересчете па лютеолин-7-глюкозид Сумма моносахаридов после гидролиза полисахаридов Спектрофо тометрия Спектрофотомстрия Не менее 2,0% Не менее 9,0%

Срок годности 2 года

б) душицы экстракт жидкий Е.В.Ковтун в 1999 году была предложена технология получения душицы экстракта жидкого (1:2,6) с использованием 40% спирта этилового. В данном экстракте жидком нормировалось содержание сухих веществ не менее 9,5%, флавоноидов не менее 0,3%. До сих пор душицы экстракт жидкий (1:2,6) не внедрен в медицинскую практику.

Нами предлагается технология получения душицы экстракта жидкого (1:1), с использованием оптимального экстрагента 70% спирта этилового. По результатам изучения технологических параметров травы душицы предложено проводить получение экстракта жидкого методом реперколяции с завершенным циклом в батарее из 6 перколяторов, при соотношении сырья и экстрагента на ступени экстракции 1:3,5. Время настаивания 8,16 часов.

В составе экстракта жидкого было обнаружено присутствие флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, дубильных веществ. Методом ВЭЖХ идентифицировали флавоноиды: лютеолин, лютеолин-7-глюкуронозид.

Для стандартизации душицы экстракта жидкого нами предложены одноименные методики, используемые для анализа сырья душицы обыкновен-

ной (качественная реакция обнаружения флавоноидов, тонкослойная хроматография, методика количественного определения суммы флавоноидов). Относительная ошибка среднего результата при 9 независимых определениях не превышала ±2,18% (табл. 10). Отсутствие систематической ошибки методики подтверждено «опытами с добавками» ГСО лютеолина.

Теоретически рассчитаны и экспериментально подтверждены на 5 сериях экстракта показатели и нормы качества душицы экстракта жидкого (1:1), которые включены в проект ФСП (табл.12).

Таблица 12

Показатели и нормы качества душицы экстракта жидкого

ПОКАЗАТЕЛИ МЕТОДЫ НОРМЫ

Описание Визуальный Жидкость коричневого цвета, ароматного запаха, вкус слегка вяжущий

Подлинность 1 .Качественная реакция на флавоноиды (проба СЬшо<]а) 2. ТСХ Красное окрашивание Обнаруживается 3 пятна

Сухой остаток Гравиметрический Не менее 16%

Плотность Не более 1,0200

Количественное определение: Сумма флавоноидов в пересчете на лютеолин Спектрофотометрия Не менее 0,5%

Срок годности 2 года

в) рододендрона Адамса экстракт сухой

Из побегов рододендрона Адамса предложена технология получения экстракта сухого. Экспериментально определены оптимальные параметры экстракции: измельченность сырья >1,0<2,0 мм, экстрагент 60% спирт этиловый, соотношение сырья и экстрагента 1:12, температура 45-50°С, время на 1-ой ступени -120 минут, на 2-ой - 75 минут, на 3-ей - 30 минут.

В составе экстракта сухого были обнаружены дубильные вещества, флавоноиды, кумарины, простые фенольные соединения. Методом ВЭЖХ идентифицировали флавоноиды: кверцетин и гиперозид. В основу методик качественного обнаружения флавоноидов и их количественного определения были положены методики, используемые для анализа сырья рододендрона Адамса.

Статистическая обработка результатов количественного определения показала, что относительная ошибка среднего результата составляет ±3,21% (табл. 10). Отсутствие систематической ошибки методики подтверждено «опытами с добавками» ГСО кверцетина.

По результатам анализа 5 серий экстрактов были установлены показатели и нормы качества рододендрона Адамса экстракта сухого, которые включены в проект ФСП (табл. 13).

Таблица 13

Показатели и нормы качества рододендрона Адамса _ экстракта сухого _

ПОКАЗАТЕЛИ МЕТОДЫ НОРМЫ

Описание Визуальный Порошок коричневого или темно-коричневого цвета, своеобразного ароматного запаха. Гигроскопичен.

Подлинность 1. Качественная реакция на флавоноиды (проба Chinoda) 2. ТСХ Красное окрашивание Обнаруживается 3 пятна

Количественное определение: Сумма флавоноидов в пересчете на квериетип

Спектрофотомстрня Не менее 5,5%

Влага ГФ XI, вып. 2. с. 160 Ile более 5%

Срок годности 2 года

г) рододендрона Адамса экстракт жидкий

По результатам изучения технологических характеристик сырья рододендрона Адамса разработана технология получения экстракта жидкого (1:2) методом реперколяция с завершенным циклом в батарее из 6 экстракторов. Оптимальные условия экстракции: измельченность сырья 5-7мм, соотношение сырья и экстрагента на ступени экстракции 1:4. Эффективность экстракции при этом составляла 83%.

. Таблица 14

Показатели и нормы качества рододендрона Адамса экстракта

жидкого

ПОКАЗАТЕЛИ МЕТОДЫ НОРМЫ

Описание Визуальный Жидкость коричневого цвета, ароматного запаха

Подлинность 1.Качественная реакция на флавоноиды (проба Chinoda) 2.ТСХ Красное окрашивание Обнаруживается 3 пятна

Сухой остаток Гравиметрический Не менее 11%

Плотность Не более 0,9830

Количественное определение: Сумма флавоноидов в пересчете на кверцетин

Спектрофотометрия Не менее 0,7%

Срок годности 2 года

В составе экстракта жидкого обнаружены флавоноиды, дубильные вещества, кумарины, простые фенольные соединения.

Стандартизацию экстракта жидкого предлагается проводить по содержанию флавоноидов с использованием одноименных методик на сырье рододендрона Адамса. Относительная ошибка среднего результата не превышала ±2,38% (табл.10). Отсутствие систематической ошибки методики подтверждено «опытами с добавками» ГСО кверцетина.

Теоретически рассчитаны и экспериментально подтверждены на 5 сериях экстрактов показатели и нормы качества экстракта рододендрона Адамса жидкого, которые включены в проект ФСП (табл. 14).

Проведенные фармакологические исследования показали безопасность (малую токсичность) предложенных экстрактов. По результатам изучения специфической фармакологической активности установлено, что «Бронхо-фит» экстракт сухой обладает антимикробной активностью; душицы экстракт жидкий - антимикробным, противовоспалительным и антиоксидант-ным действием; экстракты рододендрона Адамса проявляют антимикробное, противовоспалительное, иммуномодулирующее и актопротекторное действие (заключение от 1.10.2009 г). Таким образом, разработанные новые растительные средства могут использоваться для лечения и профилактики заболеваний органов дыхания.

Результаты проведенных теоретических и экспериментальных исследований позволили сформулировать научно-методические подходы к поиску и фармакогностическому изучению лекарственных растений Восточной Сибири (на примере представителей родов Origanum L. и Rhododendron L.) для получения растительных средств антимикробного, противовоспалительного, иммуномодулирующего действия.

Предлагаемые методические подходы базируются на проведении комплекса теоретических, фитохимических, технологических и биолого-фармакологических исследованиях (рис. 8).

На первом этапе проводятся теоретические исследования по изучению структуры заболеваний органов дыхания, их этиологии, принципов фитотерапии отдельных видов болезней (острые респираторые заболевания, бронхиты, пневмонии, хроническая обструктивная болезнь легких), определяется роль фитотерапии в лечении этих патологий.

Затем проводится анализ ассортимента растительных средств, используемых для лечения заболеваний органов дыхания, изучается состав биологически активных веществ.

На основании анализа сведений научной и традиционной медицины по использованию лекарственных растений в лечении патологий органов дыхания проводится отбор соответствующих растений для проведения тестирования их на антимикробную и иммуномодулирующую активность.

Затем осуществляется выбор перспективных растений и оценка их ресурсного потенциала.

На втором этапе проводят фитохимическое изучение перспективных растений. Исследуют компонентный состав эфирного масла и устанавливают

Рис. 8. Структурная схема поиска и комплексного фармакогностического исследования растений Восточной Сибири как возможных источников средств для лечения и профилактики заболеваний органов дыхания

структуру фенольных соединений (флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, простых фенолов, кумаринов) и других БАВ.

Для обоснования выбора сырьевых органов новых растений, сроков и рациональных способов заготовки растительного сырья, для изучения влияния на химический состав приемов культивирования растения в условиях Восточной Сибири проводится изучение динамики накопления основных биологически активных веществ.

Исследование спектра фармакологической активности извлечений из выбранных растений позволит определить виды с заданными свойствами для дальнейшего изучения.

Далее проводится разработка нормативной документации на новые виды растительного сырья, или совершенствуется при необходимости в соответствии с современными требованиями действующая документация. Разрабатываются методики качественного и количественного анализа основных групп БАВ, проводится валидационная оценка предложенных методик. Составляется нормативная документация.

На третьем этапе осуществляется разработка растительных средств -однокомпонентных в виде экстрактов сухих и жидких, а также многокомпонентных - сборы и экстракты на их основе.

Следующий этап предусматривает изучение химического состава предложенных средств и разработку методов их стандартизации с использованием принципов сквозной стандартизации. В дальнейшем проводится определение показателей качества, их нормирование и составление документации. Фармакологическими исследованиями подтверждается безопасность и специфическая фармакологическая активность предложенных средств.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Анализ ассортимента растительных средств, применяемых для лечения и профилактики заболеваний органов дыхания, показал необходимость разработки средств с антимикробным, противовоспалительным и иммуномо-дулирующим действием отечественного производства, в том числе, из растений родов Origanum L. и Rhododendron L.

2. Сформулированы научно-методические подходы к поиску и изучению растений Восточной Сибири, которые заключаются в отборе растений с антимикробным, противовоспалительным, иммуномодулирующим действием, имеющих достаточный ресурсный потенциал, поэтапном фармакогно-стическом изучении и разработке новых растительных средств в виде сборов и экстрактов.

3. При изучении химического состава душицы обыкновенной восточносибирского региона (дикорастущей и культивируемой) идентифицировано 5 флавоноидов, 6 фенолкарбоновых кислот и 33 компонента эфирного масла (из них 22 определены впервые); установлено, что душица обыкновенная по количественному содержанию флавоноидов, производных лютеолина и апи-

гешша в зависимости от климато-географических факторов образует хемора-сы; основными компонентами эфирного масла являются кариофиллен оксид, (-)-терпинеол, (-)-спатуленол.

4. В результате изучения химического состава рододендронов Адамса и мелколистного идентифицированы: 11 флавоноидов, 5 фенолкарбоновых кислот, арбутин, 2,3-диоксибензальдегид, кумарин, эскулетин (из них новые для рододендрона Адамса 5 соединений, для рододендрона мелколистного -10); в составе эфирного масла рододендрона Адамса идентифицировано 27 компонентов (впервые - 19), основные из них: гермакрон, ±транс-неролидол, селин-3,7-(11) -диен; впервые установлен компонентный состав эфирного масла рододендрона мелколистного, при этом идентифицировано 34 компонента, основные из них: изоаромадендрен эпоксид, патчоулол, а-кадинол, т-кадинен, платамбин.

5. По результатам изучения динамики накопления биологически активных веществ в качестве сырья рододендронов Адамса, мелколистного и даурского предлагаются побеги текущего года, а у рододендрона золотистого листья - 2 и 3 года жизни; сроки заготовки сырья указанных видов - период плодоношения; душица обыкновенная с хемотипом (3:1), культивируемая в условиях Восточной Сибири, по составу эфирного масла и фенольных соединений соответствует душице обыкновенной дикорастущей и рекомендуется для использования в медицине.

6. Обосновано проведение стандартизации сырья душицы обыкновенной и рододендрона Адамса по содержанию эфирного масла и флавоноидов; предложены рациональные методики качественного обнаружения и количественного определения суммы флавоноидов; по результатам исследований разработаны проекты нормативных документов: изменение №2 к ст. 55 ГФ XI «Трава душицы»; ФСП «Рододендрона Адамса побеги»; методика количественного определения суммы флавоноидов включена в межгосударственный стандарт ГОСТ 2103-93 «Трава душицы».

7. На основании теоретических и экспериментальных исследований разработан сбор «Бронхофит»; в составе сбора содержатся: эфирное масло, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, кумарины, танин, эпикатехин, полисахариды, аскорбиновая кислота, а также аминокислоты, макро- и микроэлементы.

8. По результатам макро и микроскопического исследования определены диагностические признаки компонентов сбора; предложены качественные реакции и методики спектрофотометрического количественного определения суммы флавоноидов и суммы полисахаридов; определены числовые показатели и сроки годности сбора, разработан проект ФСП «Сбор «Бронхофит».

9. Разработаны технологии получения и методы стандартизации экстракционных средств: «Бронхофит» экстракт сухой, душицы экстракт жидкий, рододендрона Адамса экстракт сухой и жидкий; экспериментальными исследованиями подтверждена их безопасность и специфическая фармакологическая активность; на созданные средства разработаны проекты ФСП.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Пешкова В.А. Флавоноиды Origanum vulgare / В.А. Пешкова, В.М. Миро-вич // Химия природных соединений. - 1984. - № 4. - С. 522.

2. Авторское свидетельство 1213415 СССР. Способ определения флавонои-дов / В.А. Пешкова, В.М. Мирович, A.A. Шамырина. - опубл. в Б.И. -1986,-№7.-С. 215.

3. Мирович В.М. Исследование фенольных соединений душицы обыкновенной / В.М. Мирович // Ресурсоведческое и фармакогностическое изучение лекарственной флоры СССР: сбориик научных трудов НИИФ. - М., 1987. -Т.25.-С. 105-109.

4. Мирович В.М. Фенолкарбоновые кислоты Origanum vulgare / В.М. Мирович, В.А. Пешкова, Р.К. Шатохина // Химия природных соединений. -1989.-№6.-С. 850-851.

5. Мирович В.М. Материалы к разработке ГОСТа на траву душицы / В.М. Мирович, Р.К. Шатохина, Регир В.Г./ Резервы совершенствования лекарственного обеспечения населения РСФСР: тез. докладов научно-практической конференции и пленума всероссийского научного общества фармацевтов. Секция б.-Владимир, 1991.-С. 103-104.

6. Ресурсное и биолого-фитохимическое исследование флоры южных районов Иркутской области / Г.М. Федосеева, В.А. Пешкова, В.М. Мирович,

B.В. Наркевич // Ресурсоведческое и фотохимическое изучение лекарственной флоры СССР: сб. научных Трудов НИИФ. - М.,1991. - Т. 29. - С. 55-60.

7. Мирович В.М. Исследование антимикробных свойств отваров и этаноль-ных экстрактов побегов рододендрона золотистого и коры дуба черешча-того / В.М. Мирович, Е.Л. Кичигина, З.И. Будникова // Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты. Первый международный научный конгресс (26-29 июля 1994 г.) - М., 1994. - С. 182.

8. Изучение иммуностимулирующего и тонизирующего действия экстракта рододендрона Адамса / В.М. Мирович, JI.A. Усов, А.И. Левента, Л.Н. Ми-накина, Е.Л. Кичигина // Человек и лекарство: тезисы докладов 2 Всеросс. национального конгресса. - М.: Фармединфо, 1995. - С. 240.

9. К сравнительной оценке тонизирующего и стимулирующего действия рододендрона Адамса / Л.А. Усов, В.М. Мирович, А.И. Левента, Е.Л. Кичигина // Сибирский медицинский журнал. -1995. -№ 3. -С. 37-40.

10.К морфолого-анатомическому изучению рододендрона Адамса, произрастающего в Восточной Сибири / В.М. Мирович, А.И. Левента, Г.М. Федосеева, Л.А. Усов // Сибирский медицинский журнал. - 1997. - Т. 11, №4. -

C. 34-37.

11.К противовоспалительному действию рододендронов Прибайкалья / Л.А. Усов, В.М. Мирович, Е.Л. Кичигина, А.И. Левента // Сибирский медицинский журнал. - 1997. - Т. 10, № 3. - С. 31-32.

12. К фармакологическому изучению действующих веществ рододендрона Адамса / А.И. Левента, Г.М. Федосеева, Л.А. Усов, А.П. Федосеев, В.М.

Мирович // Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов: материалы конференции фармакологов Сибири и пленума патофизиологов Сибири и Дальнего Востока. - Томск, 1997. -Т.9. - С. 63-64.

13.Мирович В.М. Исследование отваров и спиртовых извлечений из листьев рододендрона золотистого / В.М. Мирович // Фармацевтическая наука и практика в новых социально-экономических условиях: сб. науч. тр.- М., 1997.-Т. 36, ч.2.-С. 265-269.

14.Патент № 2095075. Российская Федерация. Способ получения суммы фла-воноидов, обладающих противовоспалительным и спазмолитическим действием /В.А. Пешкова, А.П. Федосеев, В.М. Мирович (РФ). - Ks 93037860; заявл. 23. 06.1993; опуб. 10.11.97.

15.Исследование экопротекторных свойств растений Байкальского региона / E.JI. Кичигина, В.М. Мирович, Г.М. Федосеева, А.И. Левента, Л.А. Усов, И.В. Шмидт // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 1998. - № 2(8). - С. 197-200.

16.Мирович В.М., Макаренко С.П., Левента А.И. Изучение фенольных соединений рододендрона Адамса // Физиолого-биохимические аспекты изучения лекарственных растений: материалы междунар. совещания, по-свящ. памяти В.Г. Минаевой. - Новосибирск, 1998. - С. 40.

17.Патент № 2118165. Российская федерация. Средство, обладающее тонизирующим и иммуностимулирующим действием / В.М. Мирович, Л.А. Усов, Е.Л. Кичигина, А.И. Левента, Е.Б. Ракова. - № 95114191; заявл. 8.08.1995; опубл. 27. 08. 98.

18.Антимикробные свойства спиртовых извлечений из листьев рододендрона золотистого в зависимости от фазы вегетации растения / В.М. Мирович, Г.М. Федосеева, А.П. Федосеев, Р.В. Киборт // Актуальные вопросы современной клинической медицины в условиях ОМС: сб. статей науч.-практ. конф. -Иркутск, 2000. -Вып. 3. - С. 459-460.

19.Биологические свойства рододендрона мелколистого / В.М. Мирович, Г.М. Федосеева, А.П. Федосеев, Р.В. Киборт, Г.И. Бочарова // Сибирская фармация на рубеже 21 века: материалы конф.. - Новосибирск, 2000. - С. 101.

20.Исследование антимикробных свойств рододендронов Прибайкалья / В.М. Мирович, Г.М. Федосеева, А.П. Федосеев, Р.В. Киборт, Г.И. Бочарова // Актуальные проблемы теории и практики фармации: сб. статей. — Барнаул: Изд-во Алтайского госуд. ун-та, 2000. - С. 213-216.

21.Патент № 21469337. Российская Федерация. Способ выделения суммы действующих веществ, обладающих тонизирующим и стимулирующим действием / А.И. Левента, В.М. Мирович, Г.М. Федосеева, Л.А. Усов, А.П. Федосеев, С.М. Николаев, Г.Г. Николаева. - № 97118177; заяв. 30.10.97; опубл. 27. 03. 2000.

22.Патент № 2171685. Российская Федерация. Средство, обладающее антимикробной активностью / А.П. Федосеев, А.И. Левента, В.М. Мирович, Г.М. Федосеева, Р.В. Киборт, Л.А. Усов, С.М. Николаев, Г.Г. Николаева. -№ 97117397; заявл. 15.10.1997; опубл. 10.08.2001.

23.Перспективы внедрения в медицинскую практику некоторых видов лекарственных растений Прибайкалья / А.П. Федосеев, Г.М. Федосеева, В.М. Мирович, Е.Г. Горячкина, Г.И. Бочарова // Сибирский медицинский журнал. - 2001. - Т. 27, № 3. - С. 70-75.

24.Макаров В.Е. Исследование состава биологически активных веществ рододендрона мелколистного / В.Е. Макаров, В.М. Мирович, А.П. Федосеев // Науки о человеке: материалы III междунар. конгресса молодых ученых и специалистов. - Томск, 2002. - С. 223-224.

25.Патент № 2182829. Российская Федерация Средство, обладающее проти-вомикробным и противовоспалительным действием / В.М. Мирович, E.JI. Кичигина. -№ 96121175; заявл. 25.10.96; опубл. 27.05.2002.

26.Патент № 2179449. Российская Федерация. Средство, подавляющее патологическое влечение к этанолу / Г.М. Федосеева, А.И. Левента, А.П. Федосеев, В.М. Мирович, Р.В. Киборт. - № 2000107693; заявл. 28.03.2000; опубл. 20.02. 2002.

27.Биолого-фармакологическое действие настоек из растений представителей рода Rhododendron L. / В.М. Мирович, А.П. Федосеев, Г.М. Федосеева, Р.В. Киборт, В.Е. Макаров, Л.К. Носкова // Сибирский медицинский журнал. - 2003. - Т. 27, № 5. - С. 70-57.

28.Исследование антиоксидантных свойств спиртовых извлечений из рододендронов / В.Е. Макаров, В.М. Мирович, А.П. Федосеев, Г.М. Федосеева // Науки о человеке: материалы IV междунар. конгресса молодых ученых и специалистов. - Томск, 2003. - С. 209-210.

29.Макаров В.Е. Кумарины рододендронов Центральной Сибири / В.Е. Макаров, В.М. Мирович // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: материалы 58-й межрегиональной конф. по фармации и фармакологии. Пятигорск, 2003. - С. 64-65.

30.Поиск иммуномодуляторов среди рододендронов Центральной Сибири / В.М. Мирович, А.П. Федосеев, Г.М. Федосеева, В.Е. Макаров // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: материалы 58-й межрегиональной конференции по фармации и фармакологии. - Пятигорск, 2003. - С. 61-62.

31 .Анатомическое исследование сырья Rhododendron dahuricum L. / В.М. Мирович, Г.И. Бочарова, Г.М. Федосеева, А.В. Чепогузова II Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: материалы 59-й межрегиональной конференции по фармации и фармакологии. -Пятигорск, 2004. - С. 61-62.

32.Доклиническое исследование антиалкогольного действия настоя побегов рододендрона Адамса / А.П. Федосеев, В.М. Мирович, А.И. Левента, Г.М. Федосеева, Р.В. Киборт // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2004. - Т. 1, №1. -С. 201-203.

33.Морфолого-анатомическое исследование побегов рододендрона мелколистного (Rhododendron parvifolium Adam) семейства вересковые (Ericaceae) / В.М. Мирович, Г.И. Бочарова, Г.М. Федосеева, И.В. Шубина // Актуаль-

ные проблемы биологии, медицины и экологии: сб. науч. работ. Томск, 2004.-Т. 3,№ 1.-С. 193. 34.0бзор применения лекарственных и полезных растений Восточной Сибири в практическом здравоохранении / Г.М. Федосеева, А.П. Федосеев,

B.М. Мирович, Е.Г. Горячкина, Д.А. Лаврушина, Ю.С. Кахерская // Фармацевтической службе Республики Бурятия - 80 лет: матер, юбилейной науч.-практ. конф. - Улан-Удэ, 2004. - С.89-92.

35.Динамика содержания флавоноидов и дубильных веществ в, надземных органах рододендрона даурского / В.М. Мирович, Г.М. Федосеева, Г.И. Бочарова, А.В. Чепогузова // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2005. - № 6. -

C. 149-152.

36.Изучение динамики накопления фенольных соединений в надземных органах рододендрона золотистого / В.М. Мирович, А.П. Федосеев, Г.М. Федосеева, Г.И. Бочарова // Юбилейный сб. научных трудов. Фармацевтическому факультету 30 лет. - Барнаул, 2005. - С. 115-118.

37.Мирович В.М. Динамика накопления фенольных соединений в надземных органах рододендрона Адамса / В.М. Мирович, Г.М. Федосеева, А.П. Федосеев // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. научных трудов. — Пятигорск, 2005. - Вып. 60. - С. 38-39.

38.Мирович В.М. Изучение химического состава надземных органов рододендрона Адамса методом ВЭЖХ / В.М. Мирович, С.П. Макаренко, О.И. Паисова// Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. -2005. - № 7. - С. 164-167.

39.0пределение суммарного содержания флавоноидов в надземной части Rhododendron adamsii (Ericaceae) спектрофотометрическим методом /

B.М. Мирович, Г.М. Федосеева, А.И. Левента, С.П. Макаренко // Растительные ресурсы. - 2005. - Т.41, вып. 4. - С. 64-73.

40.Перспективы применения в медицинской практике побегов рододендрона Адамса ! В.М. Мирович, Г.М. Федосеева, А.И. Левента, А.П. Федосеев,

C.П. Макаренко // Естествознание и гуманизм. Сб. научных работ. -Томск, 2005. - Т. 2, №2. - С.13.

41.Мирович В.М. Химический состав душицы обыкновенной, культивируемой в условиях Иркутской области / В.М. Мирович, Г.М. Федосеева, Н.Н. Головных // Естествознание и гуманизм: сб. науч. Работ. - Томск, 2006. -Т. 3, № З.-С. 37.

42. Разработка способа получения сухого экстракта из побегов рододендрона Адамса, обладающего актопротекторной и антимикробной активностью / В.М. Мирович, Федосеева Г.М., Зюбр Т.П., Федосеев А.П., Паисова О.И., Куклина Л.Б. // Сибирский медицинский журнал. - 2006. - Т. 67, № 9. - С. 96-98.

43.Разработка метода стандартизации сухого экстракта из побегов рододендрона Адамса / О.И. Паисова, В.М. Мирович, С.П. Макаренко, И.Г. Петрова // Сибирский медицинский журнал. - 2006. - Т. 67, № 9. — С. 98-100.

44.Динамика накопления флавоноидов и дубильных веществ в душице обыкновенной траве, культивируемой в Прибайкалье / В.М. Мирович, Г.М. Федосеева, Н.Н. Головных, Г.И. Бочарова // Разработка, исследование и

маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. научи, трудов. - Пятигорск, 2007. - Вып. 62. - С. 93-95.

45.Разработка показателей качества жидкого экстракта душицы / В.М. Миро-вич, Г.М. Федосеева, H.H. Головных, И.Г. Петрова // Сибирский медицинский журнал. - 2007. - Т. 73, № 6. - С. 85-87.

46.Мирович В.М. Компонентный состав эфирного масла рододендронов Адамса и мелколистного, произрастающих в Восточной Сибири / В.М. Мирович, Т.А. Коненкина, Г.М. Федосеева // Сибирский медицинский журнал. - 2008. - Т.76, № 1. - С. 79-82.

47.Мирович В.М. Исследование качественного состава эфирного масла душицы обыкновенной, произрастающей в Восточной Сибири / В.М. Мирович, Т.А. Коненкина, Г.М. Федосеева, H.H. Головных // Химия растительного сырья. - 2008,- № 2. С. 61-64.

48.Мирович В.М. Разработка фотоколориметрического метода количественного определения кумаринов в растениях рода Рододендрон семейства Вересковых / В.М. Мирович, Г.М. Федосеева // Естествознание и гуманизм. Сборник науч. тр. - Томск, 2008. - Т.5, № 1. - С. 61-62.

49.Мирович В.М. Разработка способа получения и стандартизация душицы обыкновенной травы экстракта жидкого / В.М. Мирович, Г.М. Федосеева, H.H. Головных // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. научных трудов. - Пятигорск, 2008. - Вып. 63. — С. 304-305.

50.Мирович В.М. Разработка способа получения и показателей качества ро-доденрона Адамса экстракта жидкого / В.М. Мирович, Г.М. Федосеева, А.П. Федосеев II Фармация из века в век: труды науч.-практ. конф. - СПб, 2008,-4.2.-С. 87-89.

51.Results of pharmacognostic investigation of medicinal herbs from Pribaikal folk medicine / G.M. Fedoseeva, V.M. Mirovich, E.G. Gorjachkina, G.I. Bo-charova, A.P. Fedossev, J.S. Kachersraja, V.S. Petsuha // Traditional medicine: a current situation and perspectives development: materials of the III international scientific conference. - Ulan-Ude, 2008. - S. 40-41.

52.Мирович В.М. Ресурсная характеристика видов рододендронов на территории Иркутской области и западной части республики Бурятия / В.М. Мирович, Г.М. Федосеева Г.М., Г.И. Бочарова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: Сб. научных трудов. Вып. 64. - Пятигорск, 2009. - С. 85-87.

53.Мирович В.М. Фитохимическое изучение сбора для комплексного лечения заболеваний верхних дыхательных путей / В.М. Мирович, Г.М. Федосеева, Т.А. Асеева // Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства: Материалы научно-практической конференции. - Шым-кент, Казахстан, 2009. - Т. 1, - С. 256-258.

54.Федосеева Г.М. Дикорастущие и культивируемые лекарственные растения Восточной Сибири / Г.М. Федосеева, В.М. Мирович, Е.Г. Горячкина. -Иркутск, 2010.-192 с.

Мирович Вера Михайловна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДОВ ORIGANUM L. И RHODODENDRON L. ФЛОРЫ ВОСТОЧНОЙ СИБИРИ

14.04.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

Сдано в печать 06.04.2010 Формат 60x84 1/16. Усл. печ. л. 2,55 Уч. изд. л.3,1 Заказ № 42. Тираж 100 экз. Отпечатано в Центре оперативной полиграфии БМБШ ИГУ. г. Иркутск, ул. К.Маркса, 1. Тел.: 334-395

Актуальность темы

В последние годы во всем мире проявляется все больший интерес к лекарственным препаратам, созданным на основе природного сырья.

В профилактике и комплексной терапии заболеваний органов дыхания широко используются растительные средства с антимикробным, противовоспалительным и иммуномодулирующим действием. Значительная часть таких средств создана на основе эфирных масел, природных полифенольных соединений, терпеноидов, полисахаридов (Машковский М.Д., 2008).

Распространенность патологии дыхательных путей носит глобальный характер и занимает одно из лидирующих мест в структуре заболеваемости по классам и группам болезней. Рост болезней органов дыхания обусловливается неблагоприятной экологической обстановкой, нерациональным питанием, стрессами, а также прогрессирующим ростом резистентности возбудителей патологии к широко применяемым и относительно новым антибиотикам, возрастающей этиологической ролью условно-патогенной микрофлоры (Чучалин А.Г., 2007; Стрельцова E.H., 2007).

В связи с этим была разработана Федеральная целевая программа «Концепция развития пульмонологической службы России на 2002-2007 годы». Одной из важных концепций этой программы является разработка и внедрение для лечения и профилактики заболеваний органов дыхания отечественных препаратов.

Обоснованность применения растительных средств в профилактике и лечении заболеваний органов дыхания определяется тем, что к ним практически не наблюдается привыкания микроорганизмов, они сочетают в себе комплексы биологически активных веществ (БАВ), обусловливающих многопрофильное действие на основные стадии патологического процесса (Соколов С.Я., 2000).

Расширение ассортимента растительных средств, применяемых для лечения болезней органов дыхания, может осуществляться за счет углубленного изучения растений научной, а таюке народной медицины. Особого внимания заслуживают растения, имеющие в своем химическом составе несколько групп Б AB, сочетание которых расширяет и усиливает фармакотерапевтическое действие. Представители родов Origanum L. и Rhododendron L. накапливают эфирные масла, тритерпеноиды, полифенольные соединения, для них свойственно разностороннее фармакологическое действие (Ткаченко К.Г. в соавт., 2002; Мурашкина И.А., 2003; Белоусов М.В., 2004; Рогачев А.Д., 2009).

Номенклатура растительных средств отхаркивающего и противовоспалительного действия на основе травы душицы ограничена. Душица обыкновенная - Origanum vulgare L. используется в виде настоя, в составе сбора грудного №1, а также многокомпонентного бальзама «Первопрестольный».

Растения рода Rhododendron L. в Восточной Сибири широко распространены, имеют достаточные сырьевые ресурсы, и, несмотря на проведенные ранее химико-фармакологические исследования, они не внедрены в медицинскую практику. Сравнительное фармакогностическое исследование восточносибирских рододендронов позволит решить вопрос о целесообразности использования отдельных видов в комплексном лечении заболеваний органов дыхания.

Таким образом, расширение ассортимента растительных средств, рекомендуемых в терапии заболеваний органов дыхания за счет растений родов Origanum L. и Rhododendron L., является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является комплексное фармакогностическое исследование представителей родов Origanum L. и Rhododendron L. флоры Восточной Сибири для получения новых растительных средств антимикробного, противовоспалительного и иммуномодулирующего действия, предназначенных для лечения и профилактики заболеваний органов дыхания.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

- изучить ассортимент растительных средств, применяемых для лечения заболеваний органов дыхания; дать анализ современного состояния изученности растений родов Origanum L. и Rhododendron L;

- разработать научно-методические подходы к поиску и исследованию растений Восточной Сибири как возможных источников средств для лечения и профилактики заболеваний органов дыхания;

- провести изучение химического состава душицы обыкновенной и видов рододендронов флоры Восточной Сибири; установить закономерности накопления и распределения БАВ по органам и фазам развития, обосновать рациональные сроки заготовки для указанных видов сырья;

- провести исследования по стандартизации перспективных видов сырья, разработать новую и усовершенствовать действующую нормативную документацию;

- разработать и экспериментально обосновать состав растительного сбора «Бронхофит», определить критерии подлинности, разработать методики количественного определения основных групп биологически активных веществ и нормы их содержания, составить проект Фармакопейной статьи предприятия;

- разработать технологии получения экстракционных средств из сбора «Бронхофит», травы душицы обыкновенной и побегов рододендрона Адамса, провести их стандартизацию.

Научная новизна работы

Сформулированы научно-методические подходы, в основе которых лежит проведение теоретических и экспериментальных исследований по поиску растений антимикробного, противовоспалительного и иммуномодулирующего действия, имеющих достаточный ресурсный потенциал, в дальнейшем осуществляется их комплексное фармакогностическое изучение и разработка одно- и многокомпонентных растительных средств.

В составе изучаемых растений выделено и идентифицировано 35 фенольных соединений: из них для рододендрона Адамса новых 5 фенольных соединений, для рододендрона мелколистного -10.

Впервые хромато-масс-спектрометрическим методом исследован состав эфирных масел. Идентифицировано 128 компонентов, из них для душицы обыкновенной впервые определено 22, для рододендрона Адамса -19, а рододендрона мелколистного - 34 компонента эфирного масла.

Выявлены закономерности накопления отдельных групп БАБ в душице обыкновенной, обусловленных климато-географическими факторами. Установлено, что душица обыкновенная, произрастающая в сибирском регионе, относится к хеморасе, характеризующейся низким содержанием фенольной фракции (соединений тимола и карвакрола) в составе эфирного масла, а накопление флавонов (производных лютеолина и апигенина) зависит от географической широты и климатических условий. Впервые изучена динамика накопления БАВ у восточносибирских видов рододендронов по органам и фазам развития, установлено, что их максимальное количество накапливают листья и побеги текущего года в период плодоношения.

Разработана рецептура грудного сбора «Бронхофит», содержащего БАВ антимикробного, противовоспалительного, иммуномодулирующего и антиаллергического действия. Изучен его химический состав: идентифицировано 55 компонентов эфирного масла и 16 фенольных соединений, обнаружены незаменимые аминокислоты и эссенциальные для иммунной системы микроэлементы.

Определены оптимальные условия получения экстрактов из сбора «Бронхофит», душицы обыкновенной и рододендрона Адамса. Для них установлены показатели подлинности и предложены методики количественного определения основных групп БАВ.

Эффективность и безопасность разработанных средств подтверждена биолого-фармакологическими испытаниями.

Новизна полученных результатов подтверждена 6 патентами РФ и авторским свидетельством.

Практическая значимость

Результаты фармакогностических, химических и фармакологических экспериментов свидетельствуют о перспективности разработки новых эффективных растительных средств для лечения и профилактики заболеваний органов дыхания с использованием душицы обыкновенной дикорастущей и культивируемой, а также видов рододендронов флоры Восточной Сибири.

Разработан проект изменения № 2 к ст. 55 ГФ XI «Трава душицы». Проект изменения, пояснительная записка, таблицы аналитических данных, материалы сравнительного изучения с аналогами находятся на рассмотрении в Фармакопейном комитете (письмо № 773/07 от 25.09.2008 г). Методика количественного определения суммы флавоноидов в траве душицы включена в межгосударственный стандарт «Трава душицы» (ГОСТ 2103-93), являющийся действующим и в настоящее время.

Предложены способы получения экстрактов, которые могут быть реализованы в условиях фармацевтического производства: «Бронхофит» экстракт сухой, душицы экстракт жидкий (1:1), рододендрона Адамса экстракты жидкий (1:2) и сухой.

Разработаны проекты ФСП: на сбор «Бронхофит», «Рододендрона Адамса побеги», «Бронхофит» экстракт сухой», которые приняты в ООО «Русский лес» к рассмотрению и включены в план перспективного развития предприятия.

Материалы исследований включены в методические пособия, два из которых изданы с грифом У МО: «Охрана лекарственных и редких исчезающих растений» (Иркутск, 2002, 99 е.); «Морфологический анализ растений и лекарственного растительного сырья. Характеристика и представители основных растительных семейств» (Иркутск, 2003, 96 е.); «Микроскопические диагностические признаки лекарственных растений народной медицины Восточной Сибири» (Иркутск, 2007, 114 с); «Фитохимический анализ растений и сырья, содержащих простые фенольные соединения и кумарины» (Иркутск, 2009, 47 с). Материалы диссертации используются в учебном процессе при изучении фармакогнозии, основ экологии и охраны природы, а также на факультете повышения квалификации провизоров.

По результатам исследований в соавторстве опубликована монография «Дикорастущие и культивируемые лекарственные растения Восточной Сибири» (Иркутск, 2010, 192 с).

Положения, выдвигаемые на защиту:

- обоснование перспективности растений родов Origanum L. и Rhododendron L. флоры Восточной Сибири для разработки на их основе новых эффективных растительных средств, предназначенных для лечения заболеваний органов дыхания;

- результаты фитохимического изучения душицы обыкновенной и видов рододендронов восточносибирского региона, исследования закономерностей накопления БАВ в зависимости от некоторых экологических факторов; результаты исследований по стандартизации сырья душицы обыкновенной и рододендрона Адамса, материалы по разработке и совершенствованию нормативной документации на указанные виды сырья;

- результаты теоретических и экспериментальных исследований по разработке состава и стандартизации сбора «Бронхофит»;

- результаты по разработке технологии и показателей качества экстракционных средств.

Конкретное участие автора в получении научных результатов

Основная часть исследований (85% общего объема) выполнена лично автором. Отдельные фрагменты работы по стандартизации сырья душицы обыкновенной и побегов рододендрона Адамса проведены совместно с доцентом каф. фармакогнозии СПХФА Р.К. Шатохиной и ассистентом каф. фармакологии ИГМУ А.И. Левентой. Фармакологические исследования проведены на кафедре фармакологии и Центре лабораторной диагностики ИГМУ под руководством д-ра мед. наук, профессора J1.A Усова.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы были представлены на конференциях: - первом международном научном конгрессе «Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты» (Москва, 1994); -«Состояние и перспективы научных исследований в области фармации» (Самара, 1996); - «Сохранение разнообразия в Байкальском регионе» (Улан-Удэ, 1996, 1997); - международном симпозиуме «Россия - Германия: история, культура, наука» (Иркутск, 1999); - международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2003); - «Лекарственные растения в фармакологии и фармации» (Барнаул, 2004); - «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2004, 2006-2009); - «Traditional medicine: a current situation and perspectives development: materials of the III international scientific conference» (Ulan-Ude, 2008); - «Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства» (Шымкент, 2009).

Связь задач исследований с проблемным планом

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом основных научных исследований ГОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по комплексной теме: «Изучение перспективных лекарственных растений Восточной Сибири» (номер государственной регистрации 01.2.00304320).

Публикации

Содержание работы отражено в 54 научных работах, из которых 16 статей в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ, 1 монография, 6 патентов РФ на изобретение и 1 авторское свидетельство.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 310 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований (4 главы), выводов, списка использованной литературы, включающего 334 источника, из которых 81 - на иностранных языках, и приложений. Работа иллюстрирована 80 таблицами и 72 рисунками.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Анализ ассортимента растительных средств, применяемых для лечения и профилактики заболеваний органов дыхания, показал необходимость разработки средств с антимикробным, противовоспалительным и иммуномодулирующим действием отечественного производства, в том числе из растений родов Origanum L. и Rhododendron L.

2. Сформулированы научно-методические подходы к поиску и изучению растений Восточной Сибири, которые заключаются в отборе растений с антимикробным, противовоспалительным, иммуномодулирующим действием, имеющих достаточный ресурсный потенциал, поэтапном фармакогностическом изучении и разработке новых растительных средств в виде сборов и экстрактов.

3. При изучении химического состава душицы обыкновенной восточносибирского региона (дикорастущей и культивируемой) идентифицировано 5 флавоноидов, 6 фенолкарбоновых кислот и 33 компонента эфирного масла (из них 22 определены впервые); установлено, что душица обыкновенная по количественному содержанию флавоноидов, производных лютеолина и апигенина в зависимости от климато-географических факторов образует хеморасы; основными компонентами эфирного масла являются кариофиллен оксид, (-)-терпинеол, (-)-спатуленол.

4. В результате изучения химического состава рододендронов Адамса и мелколистного идентифицированы: 11 флавоноидов, 5 фенолкарбоновых кислот, арбутин, 2,3-диоксибензальдегид, кумарин, эскулетин (из них новые для рододендрона Адамса 5 соединений, для рододендрона мелколистного — 10); в составе эфирного масла рододендрона Адамса идентифицировано 27 компонентов (впервые - 19), основные из них: гермакрон, ±транс-неролидол, селин-3,7-(11) —диен; впервые установлен компонентный состав эфирного масла рододендрона мелколистного, при этом идентифицировано 34 компонента, основные из них: изоаромадендрен эпоксид, патчоулол, а-кадинол, т-кадинен, платамбин.

5. По результатам изучения динамики накопления биологически активных веществ в качестве сырья рододендронов Адамса, мелколистного и даурского предлагаются побеги текущего года, а у рододендрона золотистого листья - 2 и 3 года жизни; сроки заготовки сырья указанных видов — период плодоношения; душица обыкновенная с хемотипом (3:1), культивируемая в условиях Восточной Сибири, по составу эфирного масла и фенольных соединений соответствует душице обыкновенной дикорастущей и рекомендуется для использования в медицине.

6. Обосновано проведение стандартизации сырья душицы обыкновенной и рододендрона Адамса по содержанию эфирного масла и флавоноидов; предложены рациональные методики качественного обнаружения и количественного определения суммы флавоноидов; по результатам исследований разработаны проекты нормативных документов: изменение №2 к ст. 55 ГФ XI «Трава душицы»; ФСП «Рододендрона Адамса побеги»; методика количественного определения суммы флавоноидов включена в межгосударственный стандарт ГОСТ 2103-93 «Трава душицы».

7. На основании теоретических и экспериментальных исследований разработан сбор «Бронхофит»; в составе сбора содержатся: эфирное масло, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, кумарины, танин, эпикатехин, полисахариды, аскорбиновая кислота, а также аминокислоты, макро- и микроэлементы.

8. По результатам макро- и микроскопического исследования определены диагностические признаки компонентов сбора; предложены качественные реакции и методики спектрофотометрического количественного определения суммы флавоноидов и суммы полисахаридов; определены числовые показатели и сроки годности сбора, разработан проект ФСП - Сбор «Бронхофит».

9. Разработаны технологии получения и методы стандартизации экстракционных средств: «Бронхофит» экстракт сухой, душицы экстракт жидкий, рододендрона Адамса экстракт сухой и жидкий; экспериментальными исследованиями подтверждена их безопасность и специфическая фармакологическая активность; на созданные средства разработаны проекты ФСП.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В связи с ростом респираторных заболеваний в России была разработана Федеральная целевая программа «Концепция развития пульманологической службы России на 2002-2007 гг», в которой отмечалось необходимость разработки новых отечественных лекарственных средств для лечения и профилактики заболеваний органов дыхания.

Особое место в терапии заболеваний органов дыхания занимают растительные средства, т.к. они малотоксичны, к ним, практически, не развивается резистентность микроорганизмов, и они обладают многопрофильным воздействием на различных стадиях патологического процесса.

Анализ ассортимента растительных средств, используемых для лечения болезней органов дыхания, на отечественном рынке показал преобладание средств импортного производства и недостаточное количество препаратов, сочетающих в себе антимикробное, противовоспалительное и иммуномодулирующее действие. Разработка новых эффективных средств на основе отечественных растений научной и традиционной медицины для лечения заболеваний органов дыхания остается актуальной задачей.

Результаты изучения ботанико-географической, химической и фармакологической характеристики представителей родов Origanum L. и Rhododendron L. позволили сделать вывод, что эти растения перспективны для разработки новых антимикробных, противовоспалительных, иммуномодулирующих средств.

Скрининговые исследования, проведенные в лаборатории микроэкологии ГУ НИМЭ ВСНЦ СО РАМН (г. Иркутск), подтвердили перспективность использования видов рододендронов и душицы обыкновенной флоры Восточной Сибири в качестве средств с антимикробным и иммуномодулирующим действием (приложение 1).

Использование растений в практических целях возможно при наличии достаточной сырьевой базы за счет дикорастущих или культивируемых полезных растений. Изучаемые виды рододендронов имеют достаточные сырьевые ресурсы на территории Иркутской области и республики Бурятии (приложение 1). Душица обыкновенная в Восточной Сибири в естественных местообитаниях не образует плотных зарослей, поэтому для увеличения сырьевой базы этого растения, нами были проведены исследования по возможности культивирования душицы в этом регионе.

В связи с тем, что душица обыкновенная образует хеморасы в зависимости от географического фактора, мы изучили химический состав душицы обыкновенной, произрастающей в Восточной Сибири.

В составе полифенольного комплекса душицы обыкновенной идентифицированы флавоноиды: лютеолин, 5-оксифлавон, лютеолин-7-глюкуронозид, космосиин, хризин-7-глюкуронозид; фенолкарбоновые кислоты: ванилиновая, протокатеховая, п-оксибензойная, сиреневая, кофейная, хлорогеновая, коричная. По составу флавоноидов и фенолкарбоновых кислот душица восточносибирского региона соответствует душице обыкновенной других регионов России.

Изучение количественного содержания в душице обыкновенной флавоноидов, производных лютеолина и апигенина, показало наличие у нее хеморас по соотношению этих компонентов. Для средней полосы европейской части России, в Сибири флавоноиды, производные лютеолина и апигенина, соотносятся как 3:1, а в южных районах - Краснодарский край, Кавказ - соотношение 1,4:1, что подтверждает пластичность душицы обыкновенной.

Хромато-масс-спектральным анализом в составе эфирного масла душицы обыкновенной дикорастущей и культивируемой было идентифицировано 72 компонента. Основными компонентами эфирного масла являются: кариофиллен оксид, спатуленол, (-)-4-терпинеол. Эфирные масла исследуемых растений отличались по количественному соотношению компонентов и характеризовались низким содержанием фенольных соединений тимола и карвакрола (0,27 - 1,34 %).

По сведениям К.Г. Ткаченко, A.B. Ткачева, E.JI. Тумановой для душицы обыкновенной из других регионов России также свойственно низкое содержание тимола и карвакрола (0,2-2,3%).

При изучении химического состава установлено, что флавоноиды рододендрона Адамса являются производными кверцетина, мирицетина, азалеатина; рододендрона мелколистного — кверцетина, мирицетина и дигидрокверцетина; рододендрона даурского - кверцетина и мирицетина; рододендрона золотистого - кверцетина.

В надземных органах рододендрона Адамса идентифицированы флавоноиды: кверцетин, азалеатин, мирицетин, кемпферол, гиперозид, авикулярин, азалеатин-З-В-Б-глюкопиранозид, нарингенин, рутин; фенолкарбоновые кислоты: ванилиновая, протокатеховая, п-оксибензойная, феруловая, кофейная; арбутин; 2,3-диоксибензальдегид; эскулетин. Из них кемпферол, азалеатин-З-В-Б-глюкопиранозид, нарингенин, рутин, 2,3-диоксибензальдегид, эскулетин идентифицированы впервые.

В эфирном масле рододендрона Адамса содержится 53 компонента, из них 27 идентифицированы. Основные компоненты масла сесквитерпены: гермакрон (26,24%), ±-транс- неролидол (18,44%), селин-3, 7- (11) - диен (8,28%). Для эфирного масла характерно присутствие многочисленных сескивитерпенов ряда гвайана. В составе эфирного масла впервые идентифицировано 19 новых компонентов.

В надземных органах рододендрона мелколистного идентифицированы флавоноиды: кверцетин, мирицетин, гиперозид, авикулярин, дигидрокверцетин-З-В-Ь-арабофуранозид; фенолкарбоновые кислоты: синаповая, хлорогеновая; кумарины: кумарин, эскулетин; простые фенолы: 2,3-диоксибензальдегид.

Эфирное масло рододендрона мелколистного содержит 134 компонента (34 идентифицированы). Основные компоненты: изоаромадендрен эпоксид (13,78%), патчоулол (4,93%), а- кадинол (4,72%), т-кадинен (4,23%), платамбин (3,56%), ледол (1,53%). Для эфирного масла характерно содержание производных ряда кадалина, селинана, гвайана. Все фенольные соединения и компоненты эфирных масел выделены впервые.

В ходе изучения динамики накопления БАВ в душице обыкновенной в условиях Восточной Сибири выявлено, что максимум содержания эфирного масла, флавоноидов и дубильных веществ у дикорастущей и культивируемой душицы обыкновенной приходится на период цветения. Душица обыкновенная (с хемотипом 3:1), культивируемая в сибирском регионе, морозоустойчива и по количественному содержанию основных групп БАВ превосходит душицу обыкновенную естественных местообитаний этого региона.

По результатам изучения закономерностей накопления биологически активных веществ по органам и по фазам развития у рододендронов Адамса, даурского и мелколистного в качестве сырья предлагаются побеги текущего года, у рододендрона золотистого - листья 2 и 3-его года жизни, сроки заготовки сырья - плодоношение.

Сравнительный анализ количественного содержания основных биологически активных веществ в рододендронах показал, что в значительном количестве накапливают эфирное масло, флавоноиды рододендроны Адамса, мелколистный и даурский; простые фенольные соединения - рододендроны золотистый и даурский; дубильные вещества -рододендроны золотистый и. мелколистный. Антоциановые соединения содержатся в цветках рододендрона даурского и во всех надземных органах рододендрона мелколистного.

Экспериментальными исследованиями, проведенными на кафедре фармакологии и в Центре лабораторной диагностики ИГМУ, установлено, что спиртовые извлечения изучаемых видов рододендронов обладают антимикробной активностью, противовоспалительным, антиоксидантным действием, повышают устойчивость организма к инфекции. Рододендрон Адамса, кроме того, обладает адаптогенным действием, стимулирует Т-клеточное звено иммунитета (приложение 1), поэтому для дальнейшего исследования был выбрано это растение.

Для использования растительного сырья в медицинской практике необходимо наличие современной нормативной документации, отвечающей требованиям ОСТ 91500.05.001-00.

Полифункциональные свойства душицы обыкновенной определяются комплексом биологически активных веществ — эфирным маслом, флавоноидами. В соответствии со ст. 55 ГФ XI стандартизация травы душицы обыкновенной проводится по содержанию эфирного масла и не предусматривается проведение качественных реакций и хроматографии. Учитывая значимость флавоноидов в развитии фармакологического эффекта душицы обыкновенной, нами предлагается дополнительный метод стандартизации сырья - по содержанию флавоноидов. Для этого нами разработаны методики качественной реакции и тонкослойной хроматографии обнаружения флавоноидов; количественного определения суммы флавоноидов спектрофотометрическим методом. Валидация методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин показала ее соответствие показателям: правильность, прецизионности, специфичность, линейность.

Разработанный проект изменения №2 к ст. 55 ГФ XI «Трава душицы» направлен для рассмотрения в Фармакопейный комитет (письмо от 25.09.2008г). Методика количественного определения суммы флавоноидов включена в межгосударственный стандарт «Трава душицы» (ГОСТ 2103-93), являющийся действующим и в настоящее время.

Стандартизацию побегов рододендрона Адамса предлагается проводить по содержанию эфирного масла и сумме флавоноидов. Для обнаружения флавоноидов предложены методики качественной реакции и тонкослойной хроматографии. Количественное содержание эфирного масла предлагается проводить перегонкой с водяным паром методом 1 (ГФ XI), суммы флавоноидов - спектро фотометрическим методом. Валидация предлагаемой методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на кверцетин показала соответствие показателям: правильность, прецизионность, специфичность, линейность. По результатам анализа 5 партиях сырья определены числовые показатели и нормы их содержания, а также установлен срок годности сырья - 2 года.

Для установления анатомо-диагностических признаков сырья рододендрона Адамса было проведено сравнительное изучение анатомического строения надземных органов и других видов рододендронов.

По результатам проведенных исследований разработан проект ФСП «Рододендрона Адамса побеги».

По рейтингу продаж среди отхаркивающих средств первое место занимают сборы, поэтому расширение их ассортимента является важной задачей. С учетом этиологии заболеваний органов дыхания, а так же опыта официальной и традиционной медицины разработана рецептура пятикомпонентного сбора «Бронхофит» (травы душицы - 30,0; травы чабреца -20,0; листьев подорожника -20,0; травы череды -20,0; плодов шиповника -10,0). Оптимальные соотношения компонентов были установлены по результатам фармакологического изучения вариантов сбора.

В сборе «Бронхофит» обнаружены эфирное масло, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества, полисахариды, тритерпеновые соединения, аскорбиновая кислота. В составе эфирного масла идентифицировано 55 компонентов, основные из которых: р-цимен (24,75%), карвакрол (18,74%), у-терпинен (10,01%) и др. Из полифенольных соединений идентифицированы флавоноиды: лютеолин-7-глюкуронозид, лютеолин-7-глюкозид, рутин, лютеолин нарингенин, дигидрокверцетин, апигенин, кемпферол; фенолкарбоновые кислоты: хлорогеновая, феруловая, коричная, галловая, кофейная; кумарины: дикумарин, эскулетин; танин; эпикатехин.

Сбор «Бронхофит» содержит 17 аминокислот, 9 макро и 54 микроэлемента, в том числе эссенциальные для иммунной системы.

По результатам количественного определения основных групп БАВ сбора показана целесообразность его стандартизации по содержанию эфирного масла, сумме флавоноидов и полисахаридов, как групп БАВ, определяющих его основную фармакологическую активность.

Количественное содержание эфирного масла предлагается проводить методом 1 (ГФ XI) в навеске 25 г, содержание суммы флавоноидов и суммы полисахаридов спектрофотометрическими методами. Валидационная оценка методик количественного определения суммы флавоноидов и суммы полисахаридов показала их соответствие показателям: правильность, прецизионность, специфичность, линейность. По результатам анализа 5 серий сбора «Бронхофит» установлены числовые показатели и нормы их содержания. Установлен срок годности сбора - 2 года. Полученные результаты включены в проект ФСП.

Разработка фитоэкстракционных средств выгодна с точки зрения экономичности и рациональности использования сырья, поскольку в этом случае обеспечивается максимальный выход биологически активных веществ.

Разработаны технологии получения и методы стандартизации экстракционных средств: «Бронхофит» экстракт сухой, душицы экстракт жидкий, рододендрона Адамса экстракт сухой и жидкий.

В основу методов стандартизации, предложенных экстрактов, положены методики качественного и количественного определения БАВ в исходном сырье. Это соответствует принципу сквозной стандартизации, которая предполагает использование одноименных методик и соответственно одного стандарта для обнаружения и количественного определения биологически активных веществ в растительном сырье на всех этапах постадийного контроля, в субстанциях и готовых фитопрепаратах [207].

Установлены показатели и нормы качества предлагаемых экстрактов, определены сроки годности. На их основании разработаны проекты ФСП.

Проведенные биолого-фармакологические исследования показали безопасность (малую токсичность) предложенных экстрактов. Изучение специфической фармакологической активности показало, что «Бронхофит» экстракт сухой обладает антимикробной активностью, душицы экстракт жидкий - антимикробным, противовоспалительным и антиоксидантным действием; экстракты рододендрона Адамса проявляют антимикробное, противовоспалительное, иммуномодулирующее и актопротекторное действие (приложение 1).

Таким образом, разработанные новые растительные средства могут использоваться для лечения и профилактики заболеваний органов дыхания.

Результаты проведенных теоретических и экспериментальных исследований позволили сформулировать научно-методические подходы к поиску и фармакогностическому изучению лекарственных растений Восточной Сибири (на примере представителей родов Origanum L. и Rhododendron L.) для получения растительных средств антимикробного, противовоспалительного, иммуномодулирующего действия.

Предлагаемые методические подходы базируются на проведении комплекса теоретических, фитохимических, технологических и биолого-фармакологических исследованиях (рис. 72).

На первом этапе проводятся теоретические исследования по изучению структуры заболеваний органов дыхания, их этиологии, принципов

Рис. 72. Структурная схема поиска и комплексного фармакогностического исследования растений Восточной Сибири как возможных источников средств для лечения и профилактики заболеваний органов дыхания фитотерапии отдельных видов болезней (острые респираторые заболевания, бронхиты, пневмонии, хроническая обструктивная болезнь легких); определяется роль фитотерапии в лечении этих патологий.

Затем проводится анализ ассортимента растительных средств, используемых для лечения заболеваний органов дыхания, изучается состав биологически активных веществ.

На основании анализа сведений научной и традиционной медицины по использованию лекарственных растений в лечении патологий органов дыхания проводится отбор соответствующих растений для проведения тестирования их на антимикробную и иммуномодулирующую активность.

Затем осуществляется выбор перспективных растений и оценка их ресурсного потенциала.

На втором этапе проводят фитохимическое изучение перспективных растений. Исследуют компонентный состав эфирного масла и устанавливают структуру фенольных соединений (флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, простых фенолов, кумаринов) и других БАВ.

Для обоснования выбора сырьевых органов новых растений, сроков и рациональных способов заготовки растительного сырья, для изучения влияния на химический состав приемов культивирования растения в условиях Восточной Сибири проводится изучение динамики накопления основных биологически активных веществ.

Исследование спектра фармакологической активности извлечений из выбранных растений позволит определить виды с заданными свойствами для дальнейшего изучения.

Далее проводится разработка нормативной документации на новые виды растительного сырья, или совершенствуется действующая документация в соответствии с современными требованиями. Разрабатываются методики качественного и количественного анализа основных групп БАВ, проводится валидационная оценка предложенных методик. Составляется нормативная документация.

На третьем этапе осуществляется разработка растительных средств -однокомпонентных в виде экстрактов сухих и жидких, а также многокомпонентных - сборы и экстракты на их основе.

Следующий этап предусматривает изучение химического состава предложенных средств и разработку методов их стандартизации с использованием принципов сквозной стандартизации. В дальнейшем проводится определение показателей качества, их нормирование и составление документации. Фармакологическими исследованиями подтверждается безопасность и специфическая фармакологическая активность предложенных средств.

272