Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение будры плющевидной (Glechoma hederacea L.)

На правах рукописи

'есйо^

ВАСИЛЕНКО ЕВГЕНИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ БУДРЫ ПЛЮЩЕВИДНОЙ (вЬЕСНОМА НЕБЕИАСЕА Ь.)

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Пятигорск - 2014

1 з ;:оя 2014

005555052

Работа выполнена в Пятигорском медико-фармацевтическом институте -: филиале государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор фармацевтических наук, профессор Попова Ольга Ивановна

Куркин Владимир Александрович

доктор фармацевтических наук, профессор, ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский

университет» Минздрава России, заведующий кафедрой фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии; Кусова Раиса Дзиппоевна

кандидат фармацевтических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Северо-Осетинский государственный университет им. К.Л. Хетагурова», доцент кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии

государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится « 24 » декабря 2014 года в 10ю часов на заседании диссертационного совета Д 208.008.09 при ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России (357532, Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ПМФИ - филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11) и на сайте http://www.pmedpharm.ru

Автореферат разослан «

Учёный секретарь диссертационного совета

I

» ноября 2014 года.

Ремезова Ирина Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Перспективными источниками для создания фитопрепаратов являются растения, широко используемые в народной медицине. К таким растениям можно отнести будру плющевидную (Glechoma hederacea L., сем. Lamiaceae), извлечения из которой применяются в качестве противовоспалительного, диуретического, гепатопротективного,

отхаркивающего и седативного средства. В экспериментальной медицине показана эффективность водных и спиртовых извлечений из надземной части будры плющевидной при заболеваниях желудочно-кишечного тракта, циррозе печени, заболеваниях мочевого пузыря, почек и при мастопатии (Е,Н. Трутнева, A.B. Ананичев, 1964). В настоящее время будра плющевидная включена в фармакопеи Франции, Китая, США, Болгарии, широко применяется в гомеопатии многих стран (Herbal Drugs and phytopharmaceuticals, 2004). Трава будры плющевидной входит в состав биологически активных добавок (БАД), используемых для профилактики заболеваний печени. Химический состав будры плющевидной изучен недостаточно и не дает представления о характере биологически активных веществ, отвечающих за столь разнообразное действие растения.

Будра плющевидная распространена по всей территории России (кроме Крайнего Севера), часто образует промысловые заросли..Однако, в силу того, что химический состав будры плющевидной изучен не достаточно, отсутствуют нормативные документы, регламентирующие качества сырья, в России она не используется в научной медицине.

Степень разработанности темы исследования. В результате проведенных научных исследований зарубежными учеными были изучены некоторые классы биологически активных веществ (эфирное масло, флавоноиды и фенолокислоты) будры плющевидной и определена в эксперименте их фармакологическая активность. Несмотря на применение её в народной медицине, в России отсутствуют нормативные документы,

регламентирующие подлинность и доброкачественность сырья будры

3

плющевидной. Кроме того, отсутствуют сведения о сырьевых запасах будры плющевидной и наличии препаратов отечественного производства на основе сырья этого растения.

Цель и задачи исследования. Целью работы является фармакогностическое изучение будры плющевидной как потенциального источника получения лекарственных средств, обладающих гепатопротекторным и антимикробным действием, и разработка нормативной документации на сырье (траву).

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

> провести фитохимический анализ будры плющевидной для выявления основных групп биологически активных веществ (БАВ);

г- выявить морфолого-анатомические диагностические признаки и установить числовые показатели качества для проведения стандартизации сырья травы будры плющевидной;

> изучить динамику накопления основных групп БАВ по фазам вегетации и органам растения с целью установления сроков заготовки сырья;

> определить сырьевые запасы будры плющевидной в Ставропольском крае;

> провести фармакологический скрининг извлечений из травы будры плющевидной;

^ разработать проекты нормативных документов (ФСГТ «Будры плющевидной трава») и инструкцию по сбору и сушке на данный вид сырья.

Научная новизна. Проведено фитохимическое исследование сырья -травы будры плющевидной, произрастающей на территории Ставропольского края, что позволило установить наличие и определить количественное содержание эфирного масла, флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, тритерпеновых соединений, органических кислот, дубильных веществ и полисахаридов.

Впервые изучен аминокислотный и минеральный состав травы будры плющевидной. Подобраны оптимальные условия для количественного

4

определения эфирного масла, изучена динамика его накопления по фазам вегетации и органам растения в свежем и сухом сырье.

Впервые методом хромато-масс-спектрометрии установлен компонентный состав эфирного масла травы будры плющевидной, произрастающей на территории Ставропольского края, идентифицировано 35 компонентов. Впервые обнаружены компоненты эфирного масла: хамазулен, гуайзулен, аристолон, а-азарон, цитронеллилгексаноат, 1,5-циклодекадиен, этил тетрадеканоат, р-ветивон, а-эпи-бизаболол, минтсульфид, гексагидрофарнезил.

Изучен состав фенольных соединений будры плющевидной. Методами бумажной, тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии обнаружено 16 соединений фенольной природы, среди которых впервые идентифицированы: эпикатехин, катехин, эпигалакатехингаллат, галловая кислота, дигидрокверцетин. Проведены исследования по стандартизации травы будры плющевидной. Предложена методика определения подлинности сырья с использованием ТСХ, подобраны оптимальные условия хроматографирования (система растворителей и способ детекции пятен веществ) в присутствии стандартного образца цинарозида. Оптимизированы методики спектрофотометрического определения суммы флавоноидов и экстрактивных веществ в траве будры плющевидной. Предложенная методика количественного определения флавоноидов в сырье валидирована по показателям: линейность, повторяемость, воспроизводимость и правильность.

Подобраны оптимальные условия для качественного обнаружения и разработана методика количественного определения кислоты аскорбиновой в сырье будры плющевидной методом планарной хроматографии с последующей денситометрической регистрацией аналитического сигнала.

Выявлена и охарактеризована совокупность микроскопических признаков (форма и характер клеток эпидермиса, наличие железистых волосков и эфирномасличных железок радиального типа, кроющих одноклеточных и

многоклеточных волосков), необходимых для идентификации сырья будры плющевидной.

На территории 3-х районов Ставропольского края (Андроповском, Георгиевском и Минераловодском) установлены типичные местообитания будры плющевидной, определены запасы и рассчитан объём возможных ежегодных заготовок сырья.

Предложен алгоритм определения запасов будры плющевидной с целью рационального использования выявленных зарослей на территории Ставропольского края с учетом его природно-климатических и экологических особенностей, включающий анализ их структуры, оценку основных параметров, особенности восстановления зарослей после проведения заготовок.

Установлено отсутствие острого токсического действия извлечений травы будры плющевидной. Доказана гепатопротекторная и антимикробная активность спиртового (70%) извлечения из сырья.

Теоретическая и практическая значимость.

Теоретическая значимость. Теоретическая значимость исследования заключается в расширении знаний о химическом составе травы будры плющевидной, произрастающей на территории Ставропольского края. Полученные данные о гепатопротекторном действии могут служить первым экспериментальным обоснованием перспективности использования исследованных извлечений из сырья будры плющевидной для разработки лекарственных средств.

Практическая значимость. С учетом основных требований, предъявляемых к определению подлинности и доброкачественности лекарственного растительного сырья, предложены оптимальные методики для качественного и количественного определения эфирного масла, флавоноидов в траве будры плющевидной. Рассчитан объём ежегодных заготовок на территории 3-х районов Ставропольского края. Определены оптимальные сроки заготовки сырья. Разработаны проект ФСП «Будры плющевидной трава» и Инструкция по сбору и сушке сырья, апробированные в Центре научно-

6

практической гомеопатии и традиционной медицины «Адонис» (акт внедрения от 25.05.2014 г.). По результатам исследований составлено информационное письмо «Методика количественного определения суммы флавоноидов в траве будры плющевидной (С1есЬота Ье(1егасеа Ь.)», которое внедрено и используется в научно-исследовательской работе и учебном процессе на кафедре фармацевтической химии и фармакогнозии ГБОУ ВПО СевероОсетинского государственного университета (акт внедрения от 09.06.2014 г.) и Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО специальность «фармация». Волгоградского государственного медицинского университета Минздрава России (акт внедрения от 12.05.2014 г.).

Методология и методы исследования. Основной методологической характеристикой исследования является выбор определенного объекта исследования на основе принципа филогенетического родства и системный подход к проведению фитохимического анализа и стандартизации нового вида растительного сырья - травы будры плющевидной, труды отечественных и зарубежных ученых. В процессе проведения фармакогностического исследования использованы фотохимический, макроскопический, микроскопический, товароведческий и полевой методы анализа, а также физико-химические и статистические методы анализа. Для выявления фармакологической активности использованы биологические методы анализа.

Положения, выносимые на защиту: У результаты фитохимического изучения БАВ травы будры плющевидной;

> методики анализа, показатели и нормы качества сырья будры плющевидной;

> результаты морфолого-анатомического и товароведческого анализа травы будры плющевидной;

> ресурсно-биологические исследования будры плющевидной в Ставропольском крае;

> результаты фармакологического скрининга спиртового извлечения из травы будры плющевидной.

Степень достоверности и апробация результатов. Полученные результаты диссертационных исследований статистически обработаны. Статистическая обработка результатов проводилась согласно требованиям ГФ XI с использованием функций программы Microsoft Exel 7.0 и «Биостатистика». Разработанные методики количественного определения валидированы. Объем проведенной работы подтверждается наличием значительного количества графического материала (таблицы, графики, рисунки).

Основные положения работы доложены на 67-ой, 68-ой и 69-ой научных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г. Пятигорск, Пятигорская ГФА 2012 г.; ПМФИ — филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава РФ, 2013 г.; 2014 г.). По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 7 в журналах, рекомендуемых ВАК Минобрнауки РФ.

Личный вклад автора. Автором самостоятельно определен выбор направления исследования, осуществлены сбор и анализ литературных данных. Автор непосредственно участвовал в постановке задач и во всех этапах фармакогностического анализа травы будры плющевидной, разработке методик количественного определения основных групп биологически активных веществ, установлении показателей качества и диагностических признаков сырья, а также изучении фармакологической активности спиртового извлечения из сырья. Более 85% исследований выполнено лично автором.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 174 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Объекты и методы исследования», 4 глав экспериментальной части, заключения, списка литературы и приложений. Список литературы включает в себя 170 источников, из них 69 на иностранных языках. В приложении содержатся материалы, подтверждающие практическую значимость проведенных исследований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Фармакогностическая характеристика и современное состояние изученности растений рода ОесИоша Ь.

В данной главе приводятся сведения на основе анализа источников литературы по ботанической и морфологической характеристике представителей рода 01есЬоша Ь., изученности химического состава растений рода С1есЬоша Ь., а также представлены результаты по биологической активности некоторых видов, используемых в странах Западной Европы и Китае.

Объекты и методы исследований

Объектом исследования является будра плющевидная, собранная в период с мая по сентябрь в 2011-2013 гг. на территории Ставропольского края в различные фазы вегетации.

В ходе проведения исследования травы будры плющевидной были использованы химические и физико-химические методы анализа: титриметрия, УФ спектрофотометрия, различные виды хроматографии: бумажная, тонкослойная (ТСХ), газожидкостная (ГЖХ), газожидкостная хромато-масс-спектрометрия, высокоэффективная жидкостная (ВЭЖХ), в том числе с денситометрическим детектированием.

Фитохимическое исследование травы будры илющевидной

Для количественного определения эфирного масла использовали свежее и высушенное сырье (метод 2 по ГФ XI, прибор Клевенджера, время перегонки 3 часа). Количественное содержание эфирного масла в анализируемых образцах составило от 0,10 до 0,18 % в свежем сырье (при влажности 74%), и от 0,06 до 0,14% в воздушно-сухом сырье.

Динамику накопления эфирного масла в траве будры плющевидной изучали по фазам вегетации и органам растения, в образцах сырья собранных в 3-х районах Ставропольского края в 2011-2013 гг. (таблица 1).

Таблица 1 -Динамика накопления эфирного масла по фазам вегетации и органам растения,%

Основные фазы вегетации Органы или часть растения будры плющевидной Сырье

Листья Соцветия Стебли Трава

Начало вегетации 0,02-0,03 - - -

Бутонизация 0,05-0,06 0,07-0,08 0,02-0,03 0,03-0,04

Начало цветения 0,08-0,09 0,12-0,13 0,02-0,03 0,08-0,09

Массовое цветение 0,10-0,11 0,16-0,17 0,03-0,04 0,14-0,15

Начало плодоношения 0,06-0,07 0,12-0,13 0,02-0,03 0,09-0,10

Массовое плодоношение 0,04-0,05 0,08-0,09 0,01-0,02 0,05-0,04

Установлено, что наибольшее содержание эфирного масла накапливается в

период массового цветения в соцветиях (0,16%) и в траве (0,14%).

Качественный состав эфирного масла, полученного методом исчерпывающей гидродистилляции из высушенного сырья будры плющевидной, устанавливали на хроматографе Agilent 7890 GC (USA). Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Компонентный состав эфирного масла в пересчете на воздушно-сухое сырье будры плющевидной

Время удерж., мин. Компонент Содержание, % Время удерж., мин. Компонент Содержание, %

21.09 Бицикл оэлемен 0,35 33.30 Бизаболол оксид А 3,20

22.92 7-эпи-сесквитуйен 0,46 33.66 Аристолон 5,12

25.22 Транс-бета-фарнезен 0,63 33.89 Бутил-2-этилгексилфталат 2,16

26.72 Гамма-кадинсн 0.60 34.090 Гуайазулен 2,00

28.15 (1Е,42)-гермакрен В 0,96 34.25 Бутил додеканоат 1,36

28.28 Минт оксид 0,80 34.46 Этил тетрадеканоат 3,86

28.60 Мегастигматриенон 0,90 34.58 Этил-альфа-бизаболол ацетат 4,16

29.91 Мегастигматриенон 2 0,94 34.78 Бета-ветивон 4.20

30.02 1,10-ди-эпи-ку бенол 1,23 35.58 Цитронеллилгексаноат 4,00

30.39 Тау-кадинол 2,16 35.73 Гексагидрофарнезил ацетон 6,10

30.53 Дельта-кадинол 1,22 36.59 Ди-изобутилфталат 6,12

30.75 Альфа-кадинол 2,01 37.73 Метил пальмитат 3.10

31.22 Кадален 1,32 38.63 Ди-н-бутилфталат 4.12

31.47 Альфа-азарон 1.32 38.98 Пальмитиновая кислота 12,16

31.61 Альфа-эпи-бизаболол 1.20 41.84 Гамма-пальмитолактон 1,13

32.56 (2Е, 6Е)-фарнезол 0,80 42.13 Олеиновая кислота 6,17

32.79 Хамазулен 2,13 42.84 1,5-циклодекадиен 4,11

33.01 Минтсульфид 1,63

В результате эксперимента установлено, что в эфирном масле травы будры плющевидной содержится 35 компонентов, впервые идентифицированы 11 соединений: хамазулен, гуайзулен, аристолон, а-азарон, цитронеллилгексаноат, 1,5-циклодекадиен, этил тетрадеканоат, р-ветивон, а-эпи-бизаболол, минтсульфид, гексагидрофарнезил.

Для идентификации фенольных соединений в траве будры плющевидной использовали метод бумажной и тонкослойной хроматографии. В результате было установлено, что наиболее четкое разделение БАВ травы будры плющевидной методом бумажной хроматографии удается достичь в системе растворителей БУВ (4:2:1). Методом хроматографии в присутствии достоверных образцов по значениям и окраске пятен предварительно обнаружены: рутин, кверцетин, галловая кислота, кофейная кислота и лютеолин-7-гликозид.

Для подтверждения результатов исследования фенольных соединений травы будры плющевидной также был использован метод ВЖЭХ. Результаты анализа представлены на рисунке 1.

Рисунок 1 -Хроматограмма спиртового (70%) извлечения из травы будры плющевидной (ВЭЖХ)

Экспериментально установлено наличие 16 соединений, из которых идентифицированы десять: галловая, кофейная кислоты, катехин, эпигаллокатехингаллат (ЭГКГ), эпикатехин, дигидрокверцетин, лютеолин,

лютеолин-7-гликозид, кверцетин, рутин. Доминирующими в количественном отношении являются: галловая кислота (22,16%), катехин (21,65%) и ЭГКГ (18,07%).

Разработана методика ТСХ-определения флавоноидов в траве будры плющевидной.

Для количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-гликозид использовали метод дифференциальной УФ спектрофотометрии, основанный на определении оптической плотности полученных комплексов флавоноидов с алюминия (III) хлоридом. При разработке методики изучено влияние различных условий экстрагирования сырья на выход флавоноидов (таблица 3).

Таблица 3 — Влияние условий экстрагирования сырья на содержание

суммы флавоноидов

Концентрация этилового спирта, % Время экстракции, мин Соотношение сырье: экстрагент г/мл Содержание суммы флавоноидов, %

96 30+30+30 1:30 1,22±0,02

70 30+30+30 1:30 1,84+0,01

50 30+30+30 1:30 1,60±0,01

Согласно полученным результатам наибольший выход флавоноидов из сырья экстрагируется из исследуемого сырья спиртом этиловым 70%, полнота экстракции достигается при использовании соотношения сырье-экстрагент 1:30 при трехкратной экстракции в течение 30 минут, степени измельченное™ сырья 1 мм. При этом установлено, что наиболее полно реакция комплексообразования протекает при взаимодействии с 2 мл 1% раствора алюминия (III) хлорида в течение 30 минут. Содержание суммы флавоноидов в траве будры плющевидной колеблется от 1,22% до 1,98%, на основании чего установлена норма содержания не менее 1,0%.

Разработанная методика была подвергнута валидационной оценке в соответствии с требованиями ОФС РФ «Валидация фармакопейных методов» по показателям: специфичность, линейность, сходимость, прецизионность и правильность (таблица 4).

Таблица 4 - Валидационные характеристики методики количественного определения флавоноидов в траве будры плющевидной

Валидационная характеристика Методика количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-гликозид

Специфичность специфична

Область линейной зависимости, уравнение, коэффициент регрессии 0,01541-0,03555г/мл у=31,8877х-0,3528 /"=0,997

Правильность ОТ=1,8950 ЛМЭ=1,89%

Прецизионность ЯЗО=2,6\%

В ходе проведенных исследований было выявлено, что предлагаемая методика специфична, имеет линейный характер и является правильной и прецизионной. Поэтому она может быть включена в разработанную нормативную документацию на траву будры плющевидной.

В таблице 5 приведены результаты изучения динамики накопления флавоноидов по фазам вегетации и органам растения.

Таблица 5—Динамика накопления суммы флавоноидов по фазам вегетации и органам растения в воздушно - сухом сырье травы будры плющевидной, %

Основные фазы вегетации Части растений будры плющевидной Сырье

Листья Соцветия Стебли Трава

Начало вегетации 0,64±0,01 - - -

Бутонизация 1,10±0,01 1,44±0,02 0.54±0,01 -

Начало цветения 1,35±0,02 2,15±0,04 0,32±0,01 1,46±0,02

Массовое цветение 1,42±0,02 1,84±0.03 0.48±0,01 1,75±0,03

Начало плодоношения 1,25±0,02 1,50±0,02 0,34±0,01 1,58±0,02

Массовое плодоношение 1,05±0,01 1,10±0,01 0,25±0,01 1,22±0,02

Данные, представленные в таблице 5, свидетельствуют о максимальном содержании суммы флавоноидов в траве будры плющевидной в фазу массового цветения (1,75%). Соцветия растения отличаются наибольшим содержанием флавоноидов в фазу начала цветения (до 2,15%).

Количественное определение суммы фенолкарбоновых кислот в траве будры плющевидной проводили спектрофотометрическим методом в пересчете

на галловую кислоту, при длине волны 278 нм. При этом содержание фенолкарбоновых кислот составило 2,14-2,43%.

Исследование фенолкарбоновых кислот травы будры плющевидной проводили также методом ВЭЖХ. Установлено, что их содержание составляет 0,61-0,65% в различных образцах сырья.

Для определения качественного состава тритерпеноидов в траве будры плющевидной использовали метод ТСХ. На хроматограмме в УФ свете наблюдали зоны адсорбции розово-вишневого цвета стандартных образцов (СО), с очень близкими значениями 0,24 — урсоловая кислота, 0,26 — олеаноловая кислота. В испытуемом извлечении отмечена зона адсорбции с Кг = 0,24, что идентично СО урсоловой кислоты и зоны с 11г=0,48; 0,54; 0,62; 0,76, имеющие фиолетовую и голубую флюоресценцию в УФ свете. Однако идентифицировать их не представилось возможным.

Для количественного определения тригерпеновых соединений использовали методику прямой спектрофотометрии. Содержание тритерпеновых соединений в траве будры плющевидной составляет 1,89±0,10%.

Идентификацию органических кислот в траве будры плющевидной проводили методом бумажной хроматографии. На хроматограмме обнаружено 5 зон адсорбции, 3 из которых соответствовали винной (1^=0,30-0,32), аскорбиновой (Я(=0,40-0,42) и яблочной (1^=0,73-0,75) кислотам. Вещество, имеющее значение 1^=0,54-0,56 идентифицировать не удалось.

Для качественной идентификации и количественного определения аскорбиновой кислоты применяли метод планарной хроматографии с последующей денситометрической регистрацией аналитического сигнала. В качестве подвижной фазы использовали систему н-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода (4:1:1). В высушенном сырье по результатам шести определений найдено аскорбиновой кислоты 1,62±0,19% (ЯБЮ = 11%), в свежем сырье в пересчёте на воздушно сухое (влажность 69 %) - 1,83±0,15% (ИБО =10,3%).

Количественное определение суммы дубильных веществ в траве будры плющевидной проводили методом перманганатометрии, описанным в ГФ XI. Содержание суммы дубильных веществ в траве будры плющевидной составило 3,38-3,67%.

Для определения аминокислотного состава травы будры плющевидной использовали метод ВЭЖХ с применением аминокислотного анализатора марки «ААА-339» (Чехия). Полученные данные свидетельствовали о наличии 15 аминокислот с суммарным количественным содержанием 5,81%. Из обнаруженных аминокислот 9 являются незаменимыми (треонин, валин, изолейцин, аргинин, метионин, лейцин, лизин, фенилаланин, гистидин) с суммарным содержанием 51,2% в сумме аминокислот. Доминирующими аминокислотами являются глутаминовая, аргинин, лейцин, аланин, аспарагиновая, глицин.

Макро- и микроэлементный состав определяли в испытательной лаборатории филиала ФГУ «Центр стандартизации, метрологии и сертификации» г. Ессентуки на спектрографе ИСП-28. В результате проведенных исследований установлено присутствие в траве будры плющевидной 35 элементов, среди которых основными по содержанию являются фосфор, титан, марганец, медь, цинк. Установлено, что содержание тяжелых металлов в траве будры плющевидной ниже предела обнаружения и соответствует требованиям допустимого их содержания, регламентированным Сан Пин 2.3.2.1078-01, что позволяет сделать вывод о безопасности данного вида сырья с точки зрения содержания токсичных элементов.

Разработка показателей и норм качества сырья будры плющевидной

Установлены анатомо-диагностические признаки.

Внешние признаки измельченного сырья: кусочки стеблей зеленого, зеленовато-коричневого цвета, листьев от светло- до темно-зеленого цвета, цветков синего, светло-фиолетового цвета, различной формы, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 5,0 мм. Запах сырья специфический. Вкус водного извлечения горьковатый.

Микроскопические признаки: стенки клеток эпидермиса листовой пластинки извилистые, особенно на нижней стороне. Тип устьичного аппарата-диацитный. Трихомы представлены железистыми волосками, эфирномасличными железками радиального типа, кроющими одноклеточными и многоклеточными волосками. Лист дорзовентрального типа: по расположению устьиц гипостоматический (рисунок 2, 3).

Рисунок 3 — Фрагменты нижней эпидермы листовой пластинки будры плющевидной

(ув. 160): 1 - устьица, 2 - одноклеточный волосок, 3 - железистый волосок, 4 - простой многоклеточный волосок, 5 - основные клетки эпидермы

На основании проведенных исследований по изучению основных групп

Рисунок 2 - Фрагмент верхней эпидермы листовой пластинки будры плющевидпой

(ув. 160).: 1 - железка, 2 - железистый волосок, 3 — простой многоклеточный волосок

БАВ, морфолого-анатомических исследований предложены показатели подлинности и нормы качества для сырья - «Будры плющевидной трава», которые положены в основу разработанной нормативной документации (таблица 6).

Таблица 6 - Показатели подлинности и нормы качества будры плющевидной травы

Основные показатели Методы анализа Нормы качества

1 2 3

Внешние признаки Измельченного сырья Визуально ГФ XI Кусочки стеблей зеленоватого, зеленовато-коричневого цвета, листьев от светло-зеленого до темно-зеленого цвета, цветков сине-фиолетового цвета. Запах сырья специфический. Вкус водного извлечения горьковатый

Микроскопия Микроскопия ГФ XI Соответствует анатомическим признакам

1 2 3

Подлинность: Флавоноиды Химические реакции: Цианидиновая проба: Красное окрашивание раствора

тех В системе растворителей: этилацетат-кислота муравьиная - вода (70:15:15) 115=0,98 соответствует СО лютеолин-7-гликозиду, допустимо наличие других зон с Яя =0,36 и 0,58

В системе растворителей: этилацетат-кислота муравьиная — вода (70:15:15) 1^=0,98 соответствует СО лютеолин-7-гликозиду, допустимо наличие других зон с Яя =0,36 и 0,58

Количественное определение - Сумма флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-гликозид - Экстрактивные вещества, извлекаемые 70%спиртом этиловым Дифференциальная спектрофотометрия ГФ XII Не менее 1,2% Не менее 25%

Влажность ГФ XII, ОФС 42-0087-08 Не более 10%

Зола общая ГФХИ Не более 10%

Зола, нерастворимая в 10% растворе кислоты хлористоводородной ГФХП Не более 2%

Органические примеси ГФ XI Не более 2%

Минеральные примеси ГФ XI Не более 1 %

Содержание частиц, изменивших окраску и других частей, не соответствующих описанию ГФ XI, Не более 5%

Микробиологическая чистота ГФ XII, ОФС 42-0067-07 Категория 4А

Срок годности - 2 года

Условия хранения - В сухом, проветриваемом, защищенном от света месте

Фармакологические исследования спиртового (70%) извлечения

из травы будры плющевидной

Для установления выраженности общетоксического действия проведено изучение «острой» токсичности по Керберу и гепатотоксичности по В.В. Гацура с использованием функционального теста. Согласно классификации токсичности веществ извлечения из травы будры плющевидной можно отнести к III классу токсичности.

Влияние извлечения из травы будры плющевидной на желчевыделение у здоровых белых крысах при однократном приеме извлечения приведено в таблице 7.

Таблица 7-Влияние спиртового (70%) извлечения из травы будры плющевидной на желчевыделение у здоровых крыс

Серии опытов Количество желчи за 3,5 часа опыта, мл Количество желчных кислот в желчи, мг% Количество холестерина в желчи, мг% Холято-холе-стериновый коэффициент

Интактные крысы 0,70±0,16 721,9±60,0 320,4±42,8 2,25

Контроль(вода очищенная) 0,68±0,06 912,5±65,4 507,8±40,4 1,79

Извлечение из травы будры 1,04±0,18 Рк<0,05 923,4± 124,2 Рк>0,05 581,1±47,2 Рк>0,05 1,57

Как видно из представленных данных, однократное введение извлечения в отличие от воды заметно увеличивает желчевыделение, повышая по сравнению с контролем выделение желчи на 52,9%. Изменения в содержании желчных кислот и холестерина в желчи не столь существенны, а величина холято-холестеринового коэффициента несколько снижается.

Изучение антимикробного действия извлечения из травы будры плющевидной проводили на 9 тест-культурах. Результаты микробиологического исследования показали, что спиртовое извлечение обладает бактериостатическим действием в отношении грамположительных бактерий рода Staphylococcus и грамотрицательных палочек Escherichia coli 675. В отношении энтеробактерий Salmonella gallinarum sp., спорообразующих палочек рода Bacillus subtilus L2, Pseudomonas aeruginosa sp. спиртовое извлечение обладает ярко выраженным бактерицидным действием. Это свидетельствует о широком спектре антибактериального действия изучаемого извлечения из травы будры плющевидной. Полученные данные по антибактериальному действию спиртового извлечения из травы будры свидетельствует о более широком спектре антибактериального действия, чем у препарата сравнения (сока каланхоэ), который подавляет рост только кокковой флоры, не оказывая влияния на рост бацилл, энтеробактерий и синегнойной палочки.

Ресурсно-биологическое исследование будры плющевидной в условиях Ставропольского края

В основе работы лежало экспедиционное обследование 3-х районов Ставропольского края, проводимое по маршрутам, составленным на основе изучения литературных и картографических данных. Экспедиции проводились в период с мая 2010 года по сентябрь 2013 года включительно. В таблице 8 приведены биометрические характеристики будры плющевидной.

Таблица 8 — Биометрические характеристики будры плющевидной в естественных условиях местообитания в Ставропольском крае

Характеристика местообитания Высота растений, см Число цветоносных побегов у особей Число листьев на 1 стебле Длина листа, см Число почек возобновления Масса одного растения, г

В лесу 27,2±0,79 5,11±0,16 22,0±0,96 3,20±0,08 5,30±0,40 27,32±1,30

На опушке 25,3±0,06 3,82±0,20 18,2±0,30 2,71 ±0,06 4,61±0,12 24,14±0,42

На берегу' ручьев 30,1±0,52 4,10±0,17 20,5±0,40 3,50±0,16 6,01±0,25 30,81±1,63

На каменистом склоне 18,1 ±0,75 2,22±0,05 14,8±0,25 1,82±0,08 7,32±0,18 18,70±0,08

В пойме ручья 32,5±0,38 6,10±0,22 32,4±0,30 3,70±0,18 5,42±0,98 37,11 ±0,96

Общая площадь зарослей травы будры плющевидной в исследованных ценопопуляциях на территории 3-х обследованных районов составила около 10 га, а рекомендуемый объем ежегодных заготовок — около 800 кг. Таким образом, территория Ставропольского края является перспективной для заготовки травы будры плющевидной.

Заключение

В рамках выполненной диссертационной работы проведено фармакогностическое изучение травы будры плющевидной, разработана методика количественного определение суммы флавоноидов, установлены числовые показатели и диагностические признаки сырья. Доказано, что 70% спиртовое извлечение будры плющевидной обладают гепатопротекторным и антимикробным действием.

Основные результаты экспериментального исследования будры плющевидной сводятся к следующим выводам:

1. Проведено фитохимическое исследование сырья травы будры плющевидной, произрастающей на территории Ставропольского края. Установлен качественный состав и определено количественное содержание основных групп БАВ.

В результате изучения эфирного масла травы будры плющевидной подобраны оптимальные условия его получения (время и условия перегонки); методом хромато-масс-спектрометрии установлен компонентный состав эфирного масла травы будры плющевидной, идентифицировано 35 компонентов, среди которых 11 обнаружены впервые: хамазулен, гуайазулен, аристолон, а-азарон, цитронеллилгексаноат, 1,5-циклодекадиен, этил тетрадеканоат, р-ветивон, а-эпи-бизаболол, минтсульфид, гексагидрофарнезил.

Методами бумажной, тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии в траве будры плющевидной были обнаружены соединения фенольной природы, которые в основном представлены флавоноидами (лютеолин, лютеолин-7-гликозид, рутин, кверцетин, дигидрокверцетин); дубильными веществами (катехин, эпигадакатехингаллат, эпикатехин), фенолкарбоновыми кислотами (галловая и кофейная).

2. Установлено количественное содержание некоторых групп БАВ в траве будры плющевидной: эфирного масла (до 0,16% - в соцветиях, 0,14% - в траве); флавоноидов от 2,75 до 2,98%; суммы дубильных (окисляемых) веществ - до 3,50%; органических кислот от 1,65 до 1,87%; тритерпеновых соединений в пересчете на кислоту урсоловую от 1,85 до 1,92%; фенолкарбоновых кислот до 2,43% (метод СФМ) и 0,65% (метод ВЭЖХ); полисахаридов - до 5,10% (ВРПС) и 1,41% (ПВ). Предложена методика определения подлинности сырья с использованием ТСХ, подобраны оптимальные условия хроматографирования (система растворителей и способ детекции пятен веществ) в присутствии стандартного образца лютеолин-7-гликозида (цинарозида). Разработана и валидирована методика количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-гликозид.

3. Изучена динамика накопления основных групп БАВ в траве будры плющевидной. Установлено, что содержание эфирного масла в свежесобранном сырье составляет от 0,01 до 0,18%, в высушенном сырье - от 0,01 до 0,16% и существенно зависит от фазы вегетации, а также места заготовки сырья

Изучена динамика накопления флавоноидов в будре плющевидной в зависимости от фазы вегетации и органа/части растения. Установлено, что максимально флавоноиды накапливаются в соцветиях (до 2,15%). В траве максимум содержания флавоноидов приходятся на фазу массового цветения (от 1,56 до 1,98%). Изучены и предложены числовые показатели травы будры плющевидной.

Нормирование качества сырья будры плющевидной травы предложено проводить по показателям: содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-гликозид и содержание экстрактивных веществ, извлекаемых 70% спиртом этиловым.

4. Определены основные диагностические признаки нового вида сырья будры плющевидной (цельное, измельченное, порошок). Установлена и охарактеризована совокупность микроскопических признаков (форма и характер клеток эпидермиса, наличие железистых волосков и эфирномасличных железок радиального типа, кроющих одноклеточных и многоклеточных волосков), необходимых для идентификации сырья будры плющевидной травы.

5. На территории 3-х районов Ставропольского края (Андроповском, Георгиевском и Минераловодском) установлены типичные местообитания будры плющевидной и определены запасы сырья, рассчитан объём возможных ежегодных заготовок. Предложен алгоритм рационального использования выявленных зарослей, включающий анализ их структуры, оценку основных параметров, особенности восстановления после проведения заготовок на территории Ставропольского края с учетом его природно-климатических и экологических особенностей.

6. Изучено влияние спиртового (70 %) извлечения из травы будры плющевидной на функциональное состояние печени и почек при токсическом поражении печени. Установлено отсутствие острого токсического действия извлечения травы будры плющевидной. Доказана гепатопротекторная и антимикробная активность спиртовых извлечений из сырья.

Полученные в ходе экспериментальной работы результаты представляют научный и практический интерес для разработки отечественного лекарственного средства, обладающего гепатопротекторным и антимикробным действием.

Разработаны проекты нормативных документов - ФСП «Будры плющевидной трава» и «Инструкция по сбору и сушке травы будры плющевидной».

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Василенко, Е.А. Некоторые результаты хроматографического исследования фенольных соединений в траве будры плющевидной/Е.А. Василенко// Фармакологическая коррекция процессов жизнедеятельности. Доклинические и клинические исследования новых лекарственных препаратов: материалы Всерос. молодеж. конф. — Уфа, 2012. - С. 23-25.

2. Василенко, Е.А. Трава будры плющевидной: определение аскорбиновой кислоты / Е.А. Василенко, Т.Д. Мезенова, О.И. // Фармация. - 2013. - №1. - С. 16-19.

3. Василенко, Е.А. Исследование фенольных соединений будры плющевидной (01есЬоша Ьес1егасеа Ь.), выращенной в условиях Северного Кавказа/ Е.А. Василенко, О.И.Попова // Научи, ведомости Белгородск. гос. ун-та.-2012,- № 16. - С.170-172.

4. Василенко, Е.А. Результаты фитохимического исследования травы будры плющевидной/ Е.А. Василенко, С.Г. Тираспольская, О.И. Попова//Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч.тр. — Пятигорск, 2013. - Вып. 68. С. 13-15.

5. Василенко, Е.А. Изменение печеночно-почечных взаимодействий при введении животным с токсическим гепатозом извлечений из травы будры плющевидной/ Е.А. Василенко, О.И. Попова, Ю.К. Василенко// Фармация.-2014,-№4.-С. 43-45.

6. Василенко, Е.А. Элементный состав травы будры плющевидной (01есЬоша Ьес1егасеае Ь.)/ Е.А. Василенко, О.И. Попова// Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2011. - Т. 13, № 1 (8). - с. 2034-2037.

7. Василенко, Е.А. Возможности использования травы будры плющевидной (01есЬота 11ес1егасеа Ь.) для получения лекарственных препаратов/ Е.А. Василенко, О.И. Попова// Известия Самарского научного центра Российской академии наук,- 2012.- Т.14, №5(3).- С. 697-699.

8. Василенко, Е.А. Морфолого-анатомическое изучение травы будры плющевидной (С1есЬоша Ьес1егасеа Ь.)/ Е.А. Василенко, О.И. Попова, Л.М. Елисеева// Человек и его здоровье: Курский науч.-практ. вестник.- Курск, 2013,-№3,-С. 96-101.

9. Василенко, Е.А. Идентификация и количественное определение флавоноидов в траве будры плющевидной/ Е.А. Василенко, О.И. Попова// Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2013.-Вып. 68. -С.15-18.

10. Василенко, Е.А. Ресурсоведческое изучение ценопопуляций будры плющевидной (С1есЬота Ьескгасеа Ь.) в трех районах Ставропольского края/ Е.А. Василенко, О.И. Попова// Разработка исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2012. - Вып.67,- С. 110-111.

11. Василенко, Е.А. Изучение гепатотропных свойств извлечений из травы будры плющевидной (С1есЬоша Ьес1егасеа Ь.)/ Е.А. Василенко// Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. — 2013. — № 3. — С. 25-27.

л

ВАСИЛЕНКО ЕВГЕНИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ БУДРЫ ПЛЮЩЕВИДНОЙ (СЬЕСНОМА НГЛЖКЛСЕА Ь.)

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати 15 октября 2014 г. Формат бумаги 60x84 1/16 Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № 2117

ПЯТИГОРСКИЙ МЕДИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ - ФИЛИАЛ ГОСУДАРСТВЕННОГО БЮДЖЕТНОГО ОБРАЗОВАТЕЛЬНОГО УЧРЕЖДЕНИЯ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

(357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)